KR102517641B1 - 당지질 화합물 및 종양의 치료에서의 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 당지질 화합물 및 상기 당지질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 당지질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양을 치료하는데 사용하기 위한 상기 당지질 및 상기 당지질을 사용하여 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

당지질 화합물 및 종양의 치료에서의 그의 용도
본 발명은 신규 당지질 화합물 및 상기 당지질을 포함하는 제약 조성물 및 상기 당지질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양을 치료하는데 사용하기 위한 상기 당지질 및 상기 당지질을 사용하여 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
고형 종양을 갖는 암 환자에서의 주요 사망 원인은 다중 전이가 절제가능하지 않고/거나 임의의 요법에 불응성임에 따른 수술 후 암의 재발이다. 이들 환자의 대다수는 말기 암 질환을 갖는 것으로 간주된다. 어떤 치료도 이들에게 이용가능하지 않으므로, 이들 환자 중 다수는 전이성 종양 병변의 검출 후 수주 또는 몇 달 이내에 사망한다.
면역계가 종양 세포를 파괴되어야 하는 세포로서 검출하지 못하기 때문에 암 환자에서 종양이 발생한다. 많은 비율의 암 환자에서 종양 세포는 자가 종양 항원을 발현한다. 이들 자가 종양 항원은 보호성 항-종양 면역 반응을 도출할 수 있다. 항-종양 면역 반응의 발생을 유도하기 위해 종양 세포 또는 종양 세포 막은 항원 제시 세포에 의해 내재화되어야 한다. 그러나, 암 환자에서의 면역계는 "잠행" 방식으로의 종양의 초기 발생과 연관된, 종양 항원에 대한 "무지"를 나타내어, 항원 제시 세포에게 "보이지 않는다" (Pardoll D M. Clin. Immunol. 2000; 95:S44-49; 및 Dunn G P et al. Nat Immunol 2002; 3: 991-8).
추가로, 종양 미세환경 및 국부 시토카인 환경은 종종 면역 기능에 대해 억제성이고, 면역 세포 무반응 및 사멸을 활발히 유도할 수 있다 (Malmberg K J. Cancer Immunol. Immunother. 2004; 53: 879-92; Lugade A A et al. J. Immunol. 2005; 174: 7516-23). 이러한 전이성 종양 병변의 효과적인 치료는 다음 2종의 성분을 요구한다:
1. 시각적으로 또는 영상화 기술에 의해 검출되기에 충분히 큰 병변의 파괴, 및
2. 종양 항원에 대한 보호성 항-종양 면역 반응의 유도.
이러한 면역 반응은 시각적으로 검출될 수 없고 영상화에 의해 검출가능하지 않은 미세전이의 면역-매개된 검출, 퇴행 및/또는 파괴를 유발한다.
보호성 항-종양 면역 반응의 유도는 항원 제시 세포에 의한 종양 세포 또는 세포 막의 흡수 및 이들의 배액 림프절로의 수송을 요구하며, 여기서 항원 제시 세포는 종양 항원 분자를 프로세싱한다. 이들 종양 항원의 대다수는 개별 환자에 대해 특이적이다. 면역원성 종양 항원 펩티드는 각각 종양 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성화를 위해 부류 I 또는 부류 II MHC 분자와 회합되어 항원 제시 세포에 의해 제시된다. 이들 T 세포가 프로세싱 및 제시된 종양 항원 펩티드에 의해 활성화된 후에만, 이들 림프구가 증식하고, 림프절을 떠나, 신체에서 순환하여, 종양 항원을 발현하는 전이성 종양 세포를 찾아 파괴할 수 있다. 추가로, 이들이 활성화된 후에만, 헬퍼 T 세포가 종양 항원에 대한 항체를 생산하기 위해 B 세포에게 도움을 제공할 수 있다. 그러나, 종양 세포가 항원 제시 세포에게 "보이지 않도록" 자연적으로 진화하기 때문에, 발생하는 종양 전이는 통상적으로 전이하는 종양 세포가 심지어 림프절 내에서 증식할 수 있는 정도까지 면역계에 의해 무시된다. 따라서, 효과적인 항-종양 면역 반응을 도출하는 것은 항원 제시 세포에의 종양 세포의 효과적인 표적화를 요구한다.
필요한 것은 화합물이 종양 세포 막 내로 삽입되고 자연 발생 항체가 도입된 화합물과 상호작용하도록 하는 조건 하에서 화합물을 종양 내로 도입하기 위한 조성물 및 방법, 예컨대 비-외과적 또는 외과적 방법이다. 이러한 상호작용은 종양의 퇴행 및/또는 파괴 및 항원 제시 세포에의 종양 세포 및/또는 종양 세포 막의 표적화를 위한 국부 염증을 유도할 것으로 여겨진다. 이 과정은 숙주에서 시각적으로 또는 영상화에 의해 검출될 수 없고 따라서 절제에 의해 제거될 수 없는 미세전이에서 종양 항원을 발현하는 종양 세포에 대한 보호성 면역 반응을 도출할 것이다.
US 2006/251661은 천연 항-Gal 항체와 상호작용하는 종양 내의 α-Gal 에피토프의 국부 발현을 유도하는 천연 당지질 화합물을 종양 병변에 투여하는 방법을 기재한다.
따라서 종양에 대한 면역 반응을 활성화시키기 위해 종양 내로 직접 전달될 수 있는 대안적 당지질 화합물을 제공할 필요가 있다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다:
Figure 112018056150910-pct00001
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 종양의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면,
a) i) 세포 표면을 갖는 복수의 암 세포를 포함하는 적어도 1종의 종양을 포함하는 대상체; 및
ii) 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 제약 조성물
을 제공하는 단계; 및
b) 상기 당지질 또는 조성물을 종양 내로 도입하는 단계
를 포함하는, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 제공된다.
도 1: 본원 실시예 1에서 제조된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 (Galili-CMG2-DOPE)에 대한 항-Gal 동원 검정으로부터 수득된 데이터.
도 2: 본원 실시예 2에서 제조된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물 (Galili-T17 DOPE)에 대한 항-Gal 동원 검정으로부터 수득된 데이터.
도 3: 본원 실시예 1에서 제조된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물 (Galili-CMG2-DOPE)에 대한 보체 의존성 세포독성 검정으로부터 수득된 데이터.
도 4: 본원 실시예 2에서 제조된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물 (Galili-T17 DOPE)에 대한 보체 의존성 세포독성 검정으로부터 수득된 데이터.
도 5: 본원 실시예 3에서 제조된 바와 같은 화학식 (III)의 화합물 (GalNAc-Gal-GlcNAc-Ad-DOPE)에 대한 보체 의존성 세포독성 검정으로부터 수득된 데이터.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 상기에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 제공된다.
본원에 기재된 본 발명은 치료된 종양 내 종양 세포의 세포 막 내로 삽입될 수 있는 당지질 (즉, 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물)을 제공한다. 종양 병변 내 본 발명의 당지질의 존재는 대상체에 존재하는 천연 항-Gal 항체와 화학식 (I) 및 (II)의 화합물 (각각 실시예 1 및 2로서 본원에 기재된 바와 같이 제조됨)의 α-Gal 에피토프 사이의 상호작용에 의해 유도되는 면역 매개된 염증 과정에 의해 종양의 파괴 또는 퇴행을 유발하는 것으로 여겨진다. 더욱이, 이 치료는 치료된 종양을, 전이성 종양 세포의 면역 파괴에 의해 원격 전이의 발생을 방지하는 전신 보호성 항-종양 면역 반응을 도출하는 백신으로 전환시킨다.
α-Gal에 대한 항체에 추가로, 인간 혈청은 또한 다른 탄수화물에 대한 항체를 함유한다. 혈액형 A 유형 2 선형 트리사카라이드 (GalNAcα1-3-Gal-β1-4GlcNAc, GalNAc 에피토프)는 인간 혈청에서 천연 항체에 의해 인식될 수 있는 하나의 상기 글리칸이다 (von Gunten, S. et al. (2009) J. Allergy Clin. Immunol. 123, 1268-76.e15; 및 Bovin (2013) Biochemistry (Moscow) 78(7), 786-797). 이들 항체는 또한 GalNAc 에피토프를 함유하는 당지질로 표지된 종양 세포의 면역 사멸을 유도하는데 유용성을 가질 수 있다. 화학식 (III)의 당지질 화합물 (실시예 3으로서 본원에 기재된 바와 같이 제조됨)은 인간 혈청에 존재하는 항체가 이 당지질로 표지된 세포를 선택적으로 인식하여 표지된 세포의 보체 매개된 용해를 자극할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 합성된 GalNAc 에피토프를 함유하는 당지질이다.
본원에 기재된 본 발명은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로 지칭되며, α-Gal 또는 GalNAc 에피토프를 보유하여 따라서 "α-Gal 당지질" 또는 "GalNAc 당지질"로서도 지칭될 수 있는 특정 당지질의 종양내 전달을 포함하나 이에 제한되지는 않는 요법 치료 양식을 포함한다. α-Gal 또는 GalNAc 당지질은 치료된 병변 내 종양 세포의 세포 막의 외부 소엽 내로 삽입된다. 종양 병변 내 α-Gal 또는 GalNAc 당지질의 존재는 다음 2가지 목적을 달성한다:
1. 천연 항-Gal 또는 항-GalNAc 항체와 종양 세포 막에 삽입된 α-Gal 또는 GalNAc 당지질의 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프 사이의 상호작용에 의해 종양 병변 내에 유도되는 염증 과정에 의한 종양 병변의 면역 매개된 파괴; 및
2. 삽입된 α-Gal 또는 GalNAc 당지질을 갖고, 따라서 항-Gal 또는 항-GalNAc 항체에 계내 결합하는 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프를 발현하고, 이에 의해 치료된 종양 병변을 자가 종양 백신으로 전환시키는 종양 세포 및 종양 세포 막의 항원 제시 세포에 의한 효과적인 흡수.
본 발명의 메카니즘을 이해하는 것이 필요하지 않을지라도, 이 흡수는 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프를 발현하는 종양 세포 상 또는 내에 존재하는 종양 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 유발하는 것으로 여겨진다. 추가로 이 면역 반응은 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프를 발현하는 것이 아니라 종양 항원을 발현하는 전이성 종양 세포의 면역 매개된 파괴를 유발할 수 있는 것으로 여겨진다.
본 발명은 치료된 종양 내 세포 상의 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프의 발현을 유도하는 화합물을 주사 또는 임의의 다른 수단에 의해 종양 내로 투여하는 것을 고려한다. α-Gal 또는 GalNAc 당지질의 이러한 투여는 하기 목적을 달성한다:
1. α-Gal 또는 GalNAc 당지질의 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프에 대한 천연 항-Gal 또는 항-GalNAc 항체의 결합은 국부 보체 활성화를 유발하고, 이에 의해 C5a 및 C3a를 포함하나 이에 제한되지는 않는 화학주성 인자를 생성할 수 있다. 이들 화학주성 인자는 항원 제시 세포, 예컨대 비제한적으로 수지상 세포 및 대식세포의 종양 조직 내로의 광범위한 이동을 유도한다.
2. α-Gal 또는 GalNAc 당지질의 지질 꼬리는 치료된 병변 내 종양 세포 막 내로 자발적으로 삽입되어, 종양 세포 상의 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프의 발현을 유발할 것이다. 이들 에피토프에 대한 항-Gal 또는 항-GalNAc 결합은 종양 세포를 포함하는 종양의 퇴행 및/또는 파괴를 유도하는 것으로 여겨진다.
3. 항-Gal 또는 항-GalNAc에 의한 종양 세포 막의 옵소닌화는 종양 내로 이동하는 항원 제시 세포에 의한 효과적인 흡수를 위해 이들을 표적화한다. 이들 항원 제시 세포의 이동은 치료된 종양 내 α-Gal 또는 GalNAc 당지질에 대한 항-Gal 또는 항-GalNAc 결합 후 생성되는 화학주성 보체 절단 펩티드에 의해 지시된다.
임의의 특정한 메카니즘에 의해 얽매이지는 않지만, 종양 세포 막-결합된 항-Gal 또는 항-GalNAc IgG 분자의 Fc 부분은 항원 제시 세포 상의 Fc-감마 수용체 (FcγR)에 결합하여 항원 제시 세포에 의한 종양 세포의 흡수를 유도하는 것으로 여겨진다. 흡수에 대한 유사한 유도가 항-Gal 또는 항-GalNAc 결합 종양 세포 상의 보체 침착물의 C3b 성분과 항원 제시 세포 상의 C3b 수용체 사이의 상호작용의 결과로서 발생할 수 있다. 항원 제시 세포에의 종양 막의 이러한 항-Gal 또는 항-GalNAc 매개된 표적화는 배액 림프절로의 자가 종양 항원의 효과적인 수송 및 림프절 내 항원 제시 세포에 의한 면역원성 종양 항원 펩티드의 프로세싱 및 제시를 가능하게 한다.
따라서, α-Gal 또는 GalNAc 당지질의 종양내 주사는 치료된 종양 병변을 계내 자가 종양 백신으로 전환시키며, 이는 종양 항원을 면역계에 제공하여 보호성 항-종양 면역 반응을 도출한다. 이 면역 반응은 개별 종양 세포 또는 종양 세포의 소형 응집체 (즉, 예를 들어, 미세전이)의 파괴를 포함하는 종양 퇴행을 유도할 수 있다. 이들 미세전이는 통상적으로 시각적으로 또는 영상화에 의해 검출불가능하고, 통상적인 외과적 또는 방사선요법 기술에 의해 접근가능하지 않다 (즉, 이들은 그의 소형 크기 때문에 절제가능하지 않음). 따라서, 본 방법은 통상적으로 시각적으로 또는 영상화에 의해 검출불가능하고, 통상적인 외과적 및 방사선요법 기술에 의해 접근가능하지 않은 미세전이를 치료할 수 있다는 추가의 장점을 갖는다.
정의
본원에서 용어 "화학식 (I)의 화합물"에 대한 언급은 기능적 (F), 스페이서 (S) 및 지질 (L) 성분으로 이루어져 있으며 세포가 그의 표면 상에 기능적 (F) 성분을 디스플레이하도록 세포 막 내로 삽입되는데 사용될 수 있는 α-Gal 당지질의 구체적 예를 지칭한다. 화학식 (I)의 화합물의 기능적 (F) 성분은 다음의 트리사카라이드 기이다: Gal-α1-3-Gal-β1-4GlcNAc (즉, α-Gal 에피토프). 스페이서 (S) 성분은 2개의 CMG 기로 이루어져 있고, 지질 (L) 성분은 DOPE이다. 본원에서 화학식 (I)의 화합물에 대한 언급은 또한 "Galili-CMG2-DOPE" 및 "CMG"를 포함하며, 이들은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 화학식 (I)의 화합물의 구조는 상기에 제시된 바와 같다. 화학식 (I)의 화합물은 본원 실시예 1에 대해 기재된 상세한 합성 절차에 따라 제조될 수 있다.
본원에서 용어 "화학식 (II)의 화합물"에 대한 언급은 기능적 (F), 스페이서 (S) 및 지질 (L) 성분으로 이루어져 있으며 세포가 그의 표면 상에 기능적 (F) 성분을 디스플레이하도록 세포 막 내로 삽입되는데 사용될 수 있는 α-Gal 당지질의 구체적 예를 지칭한다. 화학식 (II)의 화합물의 기능적 (F) 성분은 다음의 트리사카라이드 기이다: Gal-α1-3-Gal-β1-4GlcNAc (즉, α-Gal 에피토프). 스페이서 (S) 성분은 T17 기로 이루어져 있고, 지질 (L) 성분은 DOPE이다. 본원에서 화학식 (II)의 화합물에 대한 언급은 또한 "Galili-T17 DOPE" 및 "T17"을 포함하며, 이들은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 화학식 (II)의 화합물의 구조는 상기에 제시된 바와 같다. 화학식 (II)의 화합물은 본원 실시예 2에 대해 기재된 상세한 합성 절차에 따라 제조될 수 있다. 화학식 (II)의 삼량체 화합물은 화학식 (II)a의 이량체 화합물의 불순물을 함유하는 것으로 여겨진다:
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따라서, 본원에서 용어 "화학식 (II)의 화합물", "Galili-T17 DOPE" 및 "T17"에 대한 언급은 화학식 (II) 및 (II)a의 화합물의 혼합물을 지칭한다.
본원에서 용어 "화학식 (III)의 화합물"에 대한 언급은 기능적 (F), 스페이서 (S) 및 지질 (L) 성분으로 이루어져 있으며 세포가 그의 표면 상에 기능적 (F) 성분을 디스플레이하도록 세포 막 내로 삽입되는데 사용될 수 있는 GalNAc 당지질의 구체적 예를 지칭한다. 화학식 (I)의 화합물의 기능적 (F) 성분은 다음의 트리사카라이드 기이다: GalNAcα1-3-Gal-β1-4GlcNAc (즉, GalNAc 에피토프). 스페이서 (S) 성분은 O(CH2)3NH 기를 포함하고, 지질 (L) 성분은 DOPE이다. 본원에서 화학식 (III)의 화합물에 대한 언급은 또한 "GalNAc-Gal-GlcNAc-Ad-DOPE" 및 "GalNAc"를 포함하며, 이들은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 화학식 (III)의 화합물의 구조는 상기에 제시된 바와 같다. 화학식 (III)의 화합물은 본원 실시예 3에 대해 기재된 상세한 합성 절차에 따라 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, 당지질 화합물은 화학식 (I)의 화합물로부터 선택된다. 대안적 실시양태에서, 당지질 화합물은 화학식 (II)의 화합물로부터 선택된다. 대안적 실시양태에서, 당지질 화합물은 화학식 (I) 및 (II)의 화합물로부터 선택된다. 대안적 실시양태에서, 당지질 화합물은 화학식 (III)의 화합물로부터 선택된다.
본원에서 용어 "DOPE"에 대한 언급은 화학 명칭 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 갖는 포스파티딜에탄올아민 (PE)을 지칭한다.
화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물은 염, 예를 들어 산 부가염 또는 특정 경우에 유기 및 무기 염기의 염, 예컨대 카르복실레이트, 술포네이트 및 포스페이트 염 형태로 존재할 수 있다. 모든 이러한 염은 본 발명의 범주 내에 있고, 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물에 대한 언급은 화합물의 염 형태를 포함한다.
본 발명의 염은 통상적인 화학적 방법, 예컨대 문헌 [Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002]에 기재된 방법에 의해 염기성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 염기 형태를 물 중에서 또는 유기 용매 중에서 또는 이들 둘의 혼합물 중에서 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로, 비수성 매질, 예컨대 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴이 사용된다.
산 부가염 (모노- 또는 디-염)은 무기 및 유기 둘 다인 매우 다양한 산을 사용하여 형성될 수 있다. 산 부가염의 예는 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산 (예를 들어 L-아스코르브산), L-아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+) 캄포르산, 캄포르-술폰산, (+)-(1S)-캄포르-10-술폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 시클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디술폰산, 에탄술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산, D-글루콘산, 글루쿠론산 (예를 들어 D-글루쿠론산), 글루탐산 (예를 들어 L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 할로겐화수소산 (예를 들어 브로민화수소산, 염산, 아이오딘화수소산), 이세티온산, 락트산 (예를 들어 (+)-L-락트산, (±)-DL-락트산), 락토비온산, 말레산, 말산, (-)-L-말산, 말론산, (±)-DL-만델산, 메탄술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, 나프탈렌-1,5-디술폰산, 1-히드록시-2-나프토산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 인산, 프로피온산, 피루브산, L-피로글루탐산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세바스산, 스테아르산, 숙신산, 황산, 탄닌산, (+)-L-타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔술폰산, 운데실렌산 및 발레르산, 뿐만 아니라 아실화 아미노산 및 양이온 교환 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 산을 사용하여 형성된 모노- 또는 디-염을 포함한다.
염의 하나의 특정한 군은 아세트산, 염산, 아이오딘화수소산, 인산, 질산, 황산, 시트르산, 락트산, 숙신산, 말레산, 말산, 이세티온산, 푸마르산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산 (메실레이트), 에탄술폰산, 나프탈렌술폰산, 발레르산, 아세트산, 프로판산, 부탄산, 말론산, 글루쿠론산 및 락토비온산으로부터 형성된 염으로 이루어진다. 하나의 특정한 염은 히드로클로라이드 염이다. 또 다른 특정한 염은 헤미술페이트 염으로서 또한 공지되어 있는 히드로겐술페이트 염이다. 추가 실시양태에서, 염은 나트륨 및 칼륨으로부터 선택되거나 또는 아민-반대-이온을 포함한다.
화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물이 아민 관능기를 함유하는 경우에, 이들은, 예를 들어 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 방법에 따른 알킬화제와의 반응에 의해 4급 암모늄 염을 형성할 수 있다. 이러한 4급 암모늄 화합물은 화학식 (I)의 범주 내에 있다.
본 발명의 화합물은 염이 형성되는 산의 pKa에 따라 단일 또는 다중 반대-이온을 함유할 수 있다. 예를 들어, 실시예 1은 4개의 산 기를 함유하고, 실시예 2는 20개의 산 기를 함유하며, 따라서, 각각의 이들 화합물은 다중 반대-이온을 함유하는데 매우 적합하다.
본 발명의 화합물의 염 형태는 전형적으로 제약상 허용되는 염이고, 제약상 허용되는 염의 예는 문헌 [Berge et al., 1977, "Pharmaceutically Acceptable Salts," J. Pharm. Sci., Vol. 66, pp. 1-19]에 논의되어 있다. 그러나, 제약상 허용되지 않는 염은 또한 중간체 형태로서 제조될 수 있으며, 이는 이어서 제약상 허용되는 염으로 전환될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물의 정제 또는 분리에 유용할 수 있는 이러한 비-제약상 허용되는 염 형태가 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
본원에 사용된 용어 "α-Gal 에피토프"는 Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R, Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-R을 포함하는 말단 구조를 갖는 임의의 분자 또는 분자의 부분, 또는 비-환원 말단에 말단 Galα1-3Gal을 갖는 임의의 탄수화물 쇄를 지칭한다. α-갈락토실 (또한 "알파-Gal" 또는 "α-Gal"로서 지칭됨) 에피토프, 즉, 갈락토실-알파-1,3-갈락토실-베타-1,4-N-아세틸글루코사민은 문헌 [Galili, U. and Avila, J.L., Alpha-Gal and Anti-Gal, Subcellular Biochemistry, Vol. 32, 1999]에 기재되어 있다. 이종이식 연구는 인간이 그 자체로 인간에서 통상적으로 발견되지 않지만 다른 동물 및 많은 미생물에서 발견되는 α-갈락토실 에피토프에 대한 면역 반응을 탑재하는 것으로 결정하였다.
본원에 사용된 용어 "GalNAc 에피토프"는 GalNAcα1-3-Gal-β1-4GlcNAc를 포함하는 말단 구조를 갖는 임의의 분자 또는 분자의 부분, 또는 비-환원 말단에 말단 GalNAcα1-3-Gal을 갖는 임의의 탄수화물 쇄를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "당지질"은 세라미드, 지방산 쇄 또는 임의의 다른 지질에 연결된 적어도 1개의 탄수화물 쇄를 갖는 임의의 분자를 지칭한다. 대안적으로, 당지질은 글리코스핑고지질로서 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항-Gal"은 α-Gal 에피토프에 결합하는 자연 발생 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항-GalNAc"는 GalNAc 에피토프에 결합하는 자연 발생 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제"는 α-Gal 에피토프를 합성할 수 있는 임의의 효소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항-Gal 결합 에피토프"는 생체내에서 또는 시험관내에서 천연 항-Gal 항체에 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항-GalNAc 결합 에피토프"는 생체내에서 또는 시험관내에서 천연 항-GalNAc 항체에 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "절제가능하지 않은"은 외과적으로 제거될 수 없는 기관 또는 신체 구조의 임의의 부분을 지칭한다. 예를 들어, "절제가능하지 않은 종양"은 전형적인 외과적 기술에 의해 물리적으로 도달불가능한 종양, 제거가 환자의 전체 암 질환 또는 웰빙을 개선시키지 않는 종양, 또는 제거가 생명유지 기관에 해로울 수 있는 종양일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "막-결합된"은 임의의 분자가 인지질 이중층에 안정하게 부착되거나 또는 그 내에 포매된 것을 지칭한다. 이러한 부착 또는 포매는 이온 결합, 공유 결합, 소수성 힘 또는 반 데르 발스 힘 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 힘을 수반할 수 있다. 예를 들어, 소수성 아미노산 영역을 포함하는 단백질은 그 자체를 인지질 이중층 막 내로 삽입할 수 있거나, 또는 지질 꼬리를 함유하는 분자는 그 자체를 세포의 인지질 이중층 내로 삽입하여 포매될 수 있다. 본 발명의 α-Gal 또는 GalNAc 함유 당지질의 지질 성분은 세포 표면 상에 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프를 디스플레이하는 종양을 생성하기 위해 종양의 세포 막 내로 삽입되는데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "하위세트"는 전체 군보다 수가 더 적은 특화된 군을 지칭한다. 예를 들어, 환자는 복수의 절제가능하지 않은 고형 종양을 제공할 수 있다. 이러한 복수 중에서, 한 하위세트는 비-외과적 기술에 의해 접근가능할 수 있는 반면에 또 다른 하위세트는 비-외과적 기술에 의해 접근가능하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "접근가능한"은 고형 종양을 비-외과적 기술에 의해 치료하는 임의의 능력을 지칭한다. 이러한 기술은 피부 내로의 주사 또는 내시경검사를 통한 주사, 기관지경검사, 방광경검사, 결장경검사, 복강경검사, 카테터삽입, 또는 로션, 연고 또는 분말에 의한 국소 적용을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 난소 고형 종양은 복강경검사에 의해 접근가능할 수 있다. 또 다른 예에서, 결장 고형 종양은 결장경검사에 의해 접근가능할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "도입하는"은 조직 내로 및 이후 상기 조직 내 세포 내로 화합물을 전달하는 임의의 방법을 지칭한다. 이러한 도입 방법은 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 바이오리스틱, 리포펙션, 및 관련 기술분야에 공지된 많은 상업적으로 입수가능한 DNA 벡터를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 화합물은 화합물이 생리학적 메카니즘 (즉, 예를 들어, 소수성 상호작용 또는 능동 수송)에 의해 세포 내로 혼입되도록 세포에 인접하여 배치될 수 있다. 하나의 도입 방법은 주사를 포함하며, 여기서 화합물은 주사된 조직 내 세포간 공간 내로 직접적으로 배치된다. 이러한 주사는 기관 부분, 성장물 (즉, 예를 들어, 고형 종양), 또는 체강이 "접근가능"할 때 가능할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "내로"는 세포 막을 통한 또는 세포 막 내의 분자의 성공적 침투를 지칭한다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 종양 세포가 형질감염되도록 하는 조건 하에서 고형 종양 세포 내로 도입될 수 있다. 또 다른 예에서, 당지질은 당지질이 세포의 인지질 이중층 막 내로 삽입되도록 하는 조건 하에서 종양 세포 내로 도입될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "퇴행", "크기가 적어도 부분적으로 감소된" 또는 "감소된"은 신체 성장물, 예컨대, 예를 들어 고형 종양의 축소를 지칭한다. 이러한 축소는 측정된 파라미터, 예컨대, 비제한적으로 직경, 질량 (즉, 중량) 또는 부피의 감소에 의해 결정될 수 있다. 축소는 결코 크기가 완전히 감소되는 것을 나타내는 것이 아니라, 단지 측정된 파라미터가 정량적으로 이전 결정치 미만인 것을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "파괴"는 신체 성장물, 예컨대, 예를 들어 고형 종양의 완전한 세포 파괴를 지칭한다. 이러한 파괴는 신체 성장물이 완전히 소화되어 신체로부터 제거되도록 하는 세포내 아폽토시스, 세포의 T 세포 매개된 사멸, 보체 매개된 세포용해 및/또는 대식세포 식세포작용을 수반할 수 있다. 용어 "종양의 파괴"는 진단 수단에 의해 더 이상 검출가능하지 않은 정도로의 종양의 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료하는", "치료" 및 "치료하다" 모두는 신체 성장물, 예컨대, 예를 들어 고형 종양의 크기의 적어도 부분적 감소 또는 크기의 감소를 유발하는 절차를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "모든 것보다 더 적은"은 군의 하위세트를 지칭한다. 본 발명의 한 실시양태와 관련하여, 환자에서의 모든 것보다 더 적은 종양의 치료가 고려된다. 다시 말해서, 한 실시양태에서, 모든 종양을 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프의 도입에 의해 (예를 들어 본 발명의 α-Gal 또는 GalNAc 함유 당지질의 도입에 의해) 치료하는 것은 필요하지 않으며; 오히려, 하위세트로의 도입이 모든 종양 (직접적으로 치료되지 않은 것 포함)에 대한 면역 반응을 유발한다. 이 방식으로, 본 발명자들은 복수의 신체 성장물, 예컨대, 예를 들어 고형 종양 전이의 집합적 축소를 달성할 수 있다. 이러한 축소는 측정된 파라미터, 예컨대, 비제한적으로 수의 감소에 의해 결정될 수 있다. 축소는 결코 파라미터가 0으로 감소되는 것을 나타내는 것이 아니라, 단지 측정된 파라미터가 정량적으로 이전 결정치 미만인 것을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "성장물"은 비정상적 증식을 나타내는 것으로 간주된 세포 종괴를 포함하는 임의의 조직 또는 기관을 지칭한다. 이러한 성장물은 암성, 비-암성, 악성 또는 비-악성일 수 있다. 성장물이 암을 포함하는 경우에, 그것은 종양일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "종양"은 세포의 비정상적 성장 또는 분열로부터 유발되는 조직의 비정상적 종괴를 지칭한다. 이러한 종양은 고형 (즉, 특히 기관, 조직 또는 선, 예컨대 복막, 간, 췌장, 폐, 방광, 전립선, 자궁, 자궁경부, 질, 유방, 피부, 뇌, 림프절, 두경부, 위, 장, 결장 또는 난소 상의 세포의 종괴) 또는 비-고형 (즉, 혈액에서 발생하는 액상 종양, 예컨대 백혈병)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 종양이 발생할 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체는 포유동물, 인간, 비-영장류 포유동물, 원원류 및 신세계 원숭이 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "분자"는 조성물의 모든 특성을 보유하고 1개 이상의 원자로 구성된 조성물의 가장 작은 입자를 지칭한다. 이들 1개 이상의 원자는 분자가 다른 분자와 상호작용하여 (즉, 이온성으로, 공유적으로, 비-공유적으로 등) 부착 및/또는 회합을 형성할 수 있도록 배열된다. 예를 들어, 분자는 항-Gal 또는 항-GalNAc 항체와의 상호작용을 위한 능력을 제공하도록 배열된 1개 이상의 원자를 가질 수 있다.
합성 절차
상기에 논의된 바와 같이, 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물에 대한 상세한 합성 절차가 각각 본원 실시예 1, 2 및 3에 기재된다.
따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면 실시예 1, 반응식 VI에 기재된 바와 같은 화학식 (21)의 화합물을 실시예 1, 반응식 VI에 기재된 바와 같은 화학식 (20)의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 전형적으로 적합한 염기, 예컨대 트리메틸아민의 사용을 포함하고, 적합한 반응 조건, 예컨대 실온에서 24시간 동안 교반에 적용된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면 실시예 2, 반응식 VII에 기재된 바와 같은 화학식 (28)의 화합물을 실시예 2, 반응식 VII에 기재된 바와 같은 화학식 (29)의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (II)의 화합물을 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 전형적으로 적합한 염기, 예컨대 트리메틸아민의 사용을 포함하고, 적합한 반응 조건, 예컨대 실온에서 24시간 동안 교반에 적용된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면 실시예 3, 반응식 III에 기재된 바와 같은 화학식 (5)의 화합물을 실시예 3, 반응식 III에 기재된 바와 같은 화학식 (8)의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (III)의 화합물을 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 전형적으로 적합한 염기, 예컨대 트리메틸아민의 사용을 포함하고, 적합한 반응 조건, 예컨대 실온에서 2시간 동안 교반에 적용된다.
천연 항-Gal 항체, α-Gal 에피토프, 및 이종이식편 거부
항-Gal은 혈청 이뮤노글로불린의 0.1-2%를 구성하는, 모든 인간에 존재할 수 있는 천연 항체인 것으로 여겨진다 (Bovin N.V., Biochemistry (Moscow), 2013; 78(7):786-797, Galili et al. J. Exp. Med. 1984; 160: 1519-31, 및 Hamadeh R M et al. Clin. Diagnos. Lab. Immunol. 1995; 2:125-31). 연구는 항-Gal 항체가 세포 표면 상의 α-Gal 에피토프 또는 유리 당지질 및 당단백질과 특이적으로 상호작용할 수 있다는 것을 나타내는 데이터를 제시하였다 (Galili U et al. J. Exp. Med. 1985, 162: 573-82, 및 Galili U. Springer Semin Immunopathol. 1993; 15: 155-171). 추가로 항-Gal 항체는 위장내 균총의 박테리아에 의한 항원 자극의 결과로서 일생에 걸쳐 생산될 수 있는 것으로 보고된다 (Galili U et al. Infect. Immun. 1988; 56: 1730-37).
α-Gal 에피토프는 비-영장류 포유동물, 원원류 및 신세계 원숭이에서의 세포의 골지체 내 글리코실화 효소 α1,3갈락토실트랜스퍼라제에 의해 당지질 및 당단백질 상에서 풍부하게 생-합성될 수 있다 (Galili U et al. Biol. Chem. 1988; 263; 17755-62). 대조적으로, 인간, 유인원 및 구세계 원숭이는 α-Gal 에피토프가 결여되어 있지만, 천연 항-Gal 항체를 매우 많은 양으로 생산한다 (Galili U et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84: 1369-73). 원숭이 및 유인원에서의 α1,3갈락토실트랜스퍼라제 위유전자의 서열에 기초하여, α1,3갈락토실트랜스퍼라제 유전자가 대략 2천만년 전에 조상 구세계 영장류에서 불활성화된 것으로 추정되었다 (Galili U, Swanson K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88: 7401-04). 이 진화적 사건은, 영장류에게 유해하고 α-Gal 에피토프를 발현한, 구세계 (즉, 현재 유럽, 아시아 및 아프리카)에 풍토성인 감염성 미생물제의 출현과 연관된 것으로 시사되었다. 영장류는, 단지 이들이 α1,3갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 불활성화 및 이에 따른 α-Gal 에피토프에 대한 면역 관용의 상실에 대한 선택적 압력 하에서 진화한 후에만 상기 추정 유해 미생물제에 대한 보호 항체로서 항-Gal을 생산할 수 있었다 (Galili U, Andrews P. J. Human Evolution 29:433-42, 1995).
천연 항-Gal 항체의 강한 보호 활성은 인간 및 원숭이에서 진화상 보존되었다. 이는 α-Gal 에피토프를 발현하는 돼지 기관을 사용한 이종이식 연구로부터 추론될 수 있다. 돼지를 포함한 다양한 포유동물의 세포는 α-Gal 에피토프를 발현하므로, 인간 또는 구세계 원숭이에 이식된 돼지로부터의 기관은 돼지 세포 상의 이들 에피토프에 대한 항-Gal 항체의 생체내 결합 때문에 거부된다 (Galili, U. Immunol. Today 1993, 14: 480-82). 인간 또는 구세계 원숭이 내로의 돼지 조직의 이식은 생체내 이식편 상의 α-Gal 에피토프에 대한 열렬한 항-Gal 결합 및 이후 이종이식편 거부의 유도를 가져온다. 혈관화 이종이식편 (예를 들어 돼지 심장)은 돼지 내피 세포 상의 α-Gal 에피토프에 대한 항-Gal 항체 분자 결합, 보체의 활성화, 내피 세포의 용해, 및 혈관상의 붕괴의 결과로서 대부분 30-60분 이내에 원숭이에서 신속한 거부 (초급성 거부로 불림)를 겪는다 (Collins B H et al. J. Immunol. 1995; 154: 5500-10). 추가로, 혈관외 영역 내 이종이식편 세포의 파괴 중 다수는 다양한 세포 상의 α-Gal 에피토프에 대한 항-Gal IgG 결합에 의해 매개된다. 이 결합은 과립구, 대식세포 및 NK 세포 상의 세포 결합된 Fcγ 수용체에 대한 항-Gal IgG의 Fc 부분의 결합 후에 항체 의존성 세포 매개된 세포용해 (ADCC)를 유발한다.
이종이식편의 항-Gal 매개된 파괴는 레서스 원숭이 (즉, 자연적으로 항-Gal 항체를 생산하는 원숭이) 내로 이식된 돼지 연골 (무혈관성 이종이식편 조직)을 사용하여 모니터링될 수 있었다. 연구는 돼지 조직에서의 α-Gal 에피토프에 대한 항-Gal의 결합이 2개월 이내에 조직의 점진적 파괴로 이어지는 광범위한 염증 반응의 유도를 가져온다는 것을 나타낸다 (Stone K R et al. Transplantation 1998, 65: 1577-83). 연골 세포 및 세포외 매트릭스 당단백질 상의 α-Gal 에피토프에 대한 항-Gal의 결합은 추가로 이들을 옵소닌화하고 (즉, 이들과의 면역 복합체를 형성하고), 따라서 항원 제시 세포 상의 Fcγ 수용체에 대한 면역-복합체화된 항-Gal의 Fc 부분의 결합에 의해 이들을 항원 제시 세포에 표적화한다. 항원 제시 세포는 이어서 이들 돼지 당단백질을 배액 림프절로 수송하며, 여기서 이들은 다중 돼지 제노펩디드에 특이적인 많은 T 세포를 활성화시킨다. 이들 활성화된 T 세포는 후속적으로 연골 이종이식편 이식물 내로 이동하고, 대략 80%의 침윤 단핵 세포를 포함한다. 이 염증 반응이 주로 α-Gal 에피토프와의 항-Gal 상호작용에 의해 매개된다는 것은 α-Gal 에피토프가 효소 처리 (예를 들어, 재조합 α-갈락토시다제를 사용함)에 의해 제거된 돼지 연골 이종이식편에 대한 면역 반응을 모니터링하는 것으로부터 추론될 수 있다. α-갈락토시다제는 연골 당단백질 상의 α-Gal 에피토프를 말단 α-갈락토실 단위의 절단 (가수분해)에 의해 파괴한다. 돼지 연골 당단백질 상의 α-Gal 에피토프의 부재 하에서는, 이종이식편에 대한 항-Gal 결합이 존재하지 않고, 따라서 이종당단백질의 효과적인 항원 제시 세포 매개된 수송도 발생하지 않는다. 이는 이종이식편에서 유의한 T 세포 침윤의 결여에 의해 나타난다.
본 발명은 α-Gal 에피토프를 디스플레이하도록 치료된 종양 병변의 퇴행 및/또는 파괴 및 항-Gal 항체에 의한 항원 제시 세포에의 종양 세포 막의 표적화에 대해, 돼지 연골 이종이식편 거부에서 입증된 천연 항-Gal 항체의 면역학적 잠재력을 이용하는 것을 고려한다. 이러한 치료는 종양 병변을 계내 자가 종양 백신으로 전환시키며, 이는 원숭이에서의 돼지 연골의 거부에서 관찰된 것과 유사한 메카니즘에 의해 전이성 종양 세포에 대한 전신 보호성 면역 반응을 도출할 것으로 여겨진다. 추가로 α-Gal 에피토프를 발현하는 종양 세포에 대한 항-Gal IgG 분자 결합은 치료된 병변에서의 종양 세포 상에서 발현되고 또한 전이성 종양 세포에서도 발현되는 자가 종양 항원에 대한 보호성 항-종양 면역 반응을 도출하기 위해 항원 제시 세포에 종양 세포 막을 표적화할 것으로 여겨진다.
제약 조성물
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 종양의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물이 제공된다.
한 실시양태에서, 종양은 고형 종양, 골수종 또는 림프종이다. 추가 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 대안적 실시양태에서, 종양은 비-고형 종양이다.
한 실시양태에서, 종양은 복막, 간, 췌장, 폐, 방광, 전립선, 자궁, 자궁경부, 질, 골수, 유방, 피부, 뇌, 림프절, 두경부, 위, 장, 결장, 신장, 고환 및 난소로부터 선택된 기관으로부터 기원하는 종양이다.
한 실시양태에서, 종양은 원발성 종양 및/또는 전이를 포함한다. 추가 실시양태에서, 종양은 원발성 종양을 포함한다. 대안적 실시양태에서, 종양은 속발성 종양을 포함한다.
한 실시양태에서, 종양은 흑색종, 육종, 신경교종 또는 암종 세포를 포함한다. 추가 실시양태에서, 종양은 흑색종 또는 암종 세포 또는 전이를 포함한다.
조성물은 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 당지질 화합물을 포함하는 수성 당지질 제제로서 제조될 수 있으며, 여기서 상기 제제는 당지질 미셀을 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물 추가적으로 1종 이상의 제약상 허용되는 담체(들), 희석제(들) 및/또는 부형제(들)를 포함한다. 담체, 희석제 및/또는 부형제는 조성물의 다른 성분과 상용성이고 그의 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 "제약상 허용되는" 것이어야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press; 22nd Edition; Allen, Loyd V. Ed. 2012, London, UK]에서 예시된 제약 제제의 측면을 인지할 것이다.
본 발명의 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 절차에 따라 화학식 (I), (II) 또는 (III)의 당지질 화합물을 표준 제약 담체 또는 희석제와 배합함으로써 제조될 수 있다. 이들 절차는 목적하는 제제에 적절한 것으로서 성분을 혼합, 과립화 및 압축 또는 용해시키는 것을 수반할 수 있다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 또한 데옥시콜레이트, 또는 세포 막 내로 당지질의 침투를 증가시킬 수 있는 다른 온화한 세제를 함유할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 임의의 경로에 의한 투여를 위해 제제화될 수 있고, 인간을 포함한 포유동물에 대한 경구, 국소 또는 비경구 투여에 적합한 형태인 것을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 조성물은 주사에 의한 투여를 위한 것이다. 대안적 실시양태에서, 조성물은 국소 적용, 예컨대 국소 연고, 국소 로션 또는 국소 용액이다.
한 실시양태에서, 조성물은 1회 용량 또는 다중 용량, 예컨대 다중 용량으로 투여된다. 추가 실시양태에서, 다중 용량은 동시에 (즉, 한번에) 투여된다. 추가의 대안적 실시양태에서, 다중 용량은 순차적으로 (즉, 예컨대 개별 치료 동안 2회 이상의 개별 경우로) 투여된다.
투여가 순차적 (즉, 개별 경우)일 때, 조성물은 투여 사이에 적합한 시간, 예를 들어 3일, 5일, 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 12개월이 경과하였을 때 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위해, 유체 단위 투여 형태는 조성물 및 멸균 비히클, 예컨대 물을 이용하여 제조된다. 용액의 제조에서는, 조성물이 주사용수 중에 용해되고, 여과-멸균된 후에, 적합한 바이알 또는 앰플 내로 충전되고 밀봉될 수 있다.
조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 로젠지, 크림 또는 액체 제제, 예컨대 경구 또는 멸균 비경구 용액 또는 현탁액 형태일 수 있다.
본 발명의 국소 제제는, 예를 들어 연고, 크림 또는 로션, 안연고 및 점안제 또는 점이제, 침투성 드레싱 및 에어로졸로서 제공될 수 있고, 적절한 통상적인 첨가제, 예컨대 연고 및 크림에서의 보존제 및 에몰리언트를 함유할 수 있다.
제제는 또한 상용성의 통상적인 담체, 예컨대 크림 또는 연고 베이스, 및 로션용 에탄올 또는 올레일 알콜을 함유할 수 있다.
조합물
본 발명의 화합물은 단독 치료제로서 투여될 수 있거나 또는 종양의 치료를 위한 1종 이상의 다른 화합물 (또는 요법)과의 조합 요법으로 투여될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
종양의 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 유리하게는 암 요법에서의 1종 이상의 다른 의약 작용제, 보다 특히 1종 이상의 항암제 또는 아주반트 (요법에서의 지지 작용제)와 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물과 함께 (공동으로이든지 또는 상이한 시간 간격으로이든지) 투여될 수 있는 다른 치료제 또는 치료의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
● 토포이소머라제 I 억제제;
● 항대사물;
● 튜불린 표적화제;
● DNA 결합제 및 토포이소머라제 II 억제제;
● 알킬화제;
● 모노클로날 항체;
● 항-호르몬;
● 신호 전달 억제제;
● 프로테아솜 억제제;
● DNA 메틸 트랜스퍼라제;
● 시토카인 및 레티노이드;
● 염색질 표적화 요법;
● 방사선요법; 및
● 다른 치료제 또는 예방제.
항암제 또는 아주반트 (또는 그의 염)의 특정한 예는 하기 군 (i)-(xlvi), 및 임의로 군 (xlvii)로부터 선택된 작용제 중 어느 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
(i) 백금 화합물, 예를 들어 시스플라틴 (임의로 아미포스틴과 조합됨), 카르보플라틴 또는 옥살리플라틴;
(ii) 탁산 화합물, 예를 들어 파클리탁셀, 파클리탁셀 단백질 결합된 입자 (아브락산(Abraxane)™), 도세탁셀, 카바지탁셀 또는 라로탁셀;
(iii) 토포이소머라제 I 억제제, 예를 들어 캄프토테신 화합물, 예를 들어 캄프토테신, 이리노테칸(CPT11), SN-38, 또는 토포테칸;
(iv) 토포이소머라제 II 억제제, 예를 들어 항-종양 에피포도필로톡신 또는 포도필로톡신 유도체, 예를 들어 에토포시드 또는 테니포시드;
(v) 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈블라스틴, 빈크리스틴, 리포솜 빈크리스틴 (온코-TCS), 비노렐빈, 빈데신, 빈플루닌 또는 빈베시르;
(vi) 뉴클레오시드 유도체, 예를 들어 5-플루오로우라실 (5-FU, 임의로 류코보린과 조합됨), 겜시타빈, 카페시타빈, 테가푸르, UFT, S1, 클라드리빈, 시타라빈 (Ara-C, 시토신 아라비노시드), 플루다라빈, 클로파라빈, 또는 넬라라빈;
(vii) 항대사물, 예를 들어 클로파라빈, 아미노프테린, 또는 메토트렉세이트, 아자시티딘, 시타라빈, 플록수리딘, 펜토스타틴, 티오구아닌, 티오퓨린, 6-메르캅토퓨린, 또는 히드록시우레아 (히드록시카르바미드);
(viii) 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드 또는 니트로소우레아, 예를 들어 시클로포스파미드, 클로람부실, 카르무스틴 (BCNU), 벤다무스틴, 티오테파, 멜팔란, 트레오술판, 로무스틴 (CCNU), 알트레타민, 부술판, 다카르바진, 에스트라무스틴, 포테무스틴, 이포스파미드 (임의로 메스나와 조합됨), 피포브로만, 프로카르바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 우라실, 메클로레타민, 메틸시클로헥실클로로에틸니트로소우레아, 또는 니무스틴 (ACNU);
(ix) 안트라시클린, 안트라센디온 및 관련 약물, 예를 들어 다우노루비신, 독소루비신 (임의로 덱스라족산과 조합됨), 독소루비신의 리포솜 제제 (예를 들어, 케릭스(Caelyx)™, 미오세트(Myocet)™, 독실(Doxil)™), 이다루비신, 미톡산트론, 에피루비신, 암사크린, 또는 발루비신;
(x) 에포틸론, 예를 들어 익사베필론, 파투필론, BMS-310705, KOS-862 및 ZK-EPO, 에포틸론 A, 에포틸론 B, 데스옥시에포틸론 B (또한 에포틸론 D 또는 KOS-862로 공지됨), 아자-에포틸론 B (또한 BMS-247550으로 공지됨), 라울리말리드, 이소라울리말리드, 또는 루에테로빈;
(xi) DNA 메틸 트랜스퍼라제 억제제, 예를 들어 테모졸로미드, 아자시티딘 또는 데시타빈;
(xii) 항폴레이트제, 예를 들어 메토트렉세이트, 페메트렉세드 이나트륨, 또는 랄티트렉세드;
(xiii) 세포독성 항생제, 예를 들어 안티노마이신 D, 블레오마이신, 미토마이신 C, 닥티노마이신, 카르미노마이신, 다우노마이신, 레바미솔, 플리카마이신, 또는 미트라마이신;
(xiv) 튜불린-결합 작용제, 예를 들어 콤브레스타틴, 콜키신 또는 노코다졸;
(xv) 신호 전달 억제제, 예컨대 키나제 억제제 (예를 들어 EGFR (상피 성장 인자 수용체) 억제제, VEGFR (혈관 내피 성장 인자 수용체) 억제제, PDGFR (혈소판-유래 성장 인자 수용체) 억제제, MTKI (다중 표적 키나제 억제제), Raf 억제제, mTOR 억제제, 예를 들어 이마티닙 메실레이트, 에를로티닙, 게피티닙, 다사티닙, 라파티닙, 도보티닙, 악시티닙, 닐로티닙, 반데타닙, 바탈리닙, 파조파닙, 소라페닙, 수니티닙, 템시롤리무스, 에베롤리무스 (RAD 001), 또는 베무라페닙 (PLX4032/RG7204);
(xvi) 오로라 키나제 억제제, 예를 들어 AT9283, 바라세르팁 (AZD1152), TAK-901, MK0457 (VX680), 세니세르팁 (R-763), 다누세르팁 (PHA-739358), 알리세르팁 (MLN-8237), 또는 MP-470;
(xvii) CDK 억제제, 예를 들어 AT7519, 로스코비틴, 셀리시클립, 알보시딥 (플라보피리돌), 디나시클립 (SCH-727965), 7-히드록시-스타우로스포린 (UCN-01), JNJ-7706621, BMS-387032 (일명 SNS-032), PHA533533, PD332991, ZK-304709, 또는 AZD-5438;
(xviii) PKA/B 억제제 및 PKB (akt) 경로 억제제, 예를 들어 AT13148, AZ-5363, 세마포어, SF1126 및 MTOR 억제제, 예컨대 라파마이신 유사체, AP23841 및 AP23573, 칼모듈린 억제제 (포크헤드 전위 억제제), API-2/TCN (트리시리빈), RX-0201, 엔자스타우린 HCl (LY317615), NL-71-101, SR-13668, PX-316, 또는 KRX-0401 (페리포신/ NSC 639966);
(xix) Hsp90 억제제, 예를 들어 AT13387, 헤르비마이신, 겔다나마이신 (GA), 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신 (17-AAG), 예를 들어 NSC-330507, Kos-953 및 CNF-1010, 17-디메틸아미노에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신 히드로클로라이드 (17-DMAG), 예를 들어 NSC-707545 및 Kos-1022, NVP-AUY922 (VER-52296), NVP-BEP800, CNF-2024 (BIIB-021 경구 퓨린), 가네테스피브 (STA-9090), SNX-5422 (SC-102112) 또는 IPI-504;
(xx) 모노클로날 항체 (방사성동위원소, 독소 또는 다른 작용제에 비접합되거나 또는 접합됨), 항체 유도체 및 관련 작용제, 예컨대 항-CD, 항-VEGFR, 항-HER2 또는 항-EGFR 항체, 예를 들어 리툭시맙 (CD20), 오파투무맙 (CD20), 이브리투모맙 티욱세탄 (CD20), GA101 (CD20), 토시투모맙 (CD20), 에프라투주맙 (CD22), 린투주맙 (CD33), 겜투주맙 오조가미신 (CD33), 알렘투주맙 (CD52), 갈릭시맙 (CD80), 트라스투주맙 (HER2 항체), 페르투주맙 (HER2), 트라스투주맙-DM1 (HER2), 에르투막소맙 (HER2 및 CD3), 세툭시맙 (EGFR), 파니투무맙 (EGFR), 네시투무맙 (EGFR), 니모투주맙 (EGFR), 베바시주맙 (VEGF), 이필리무맙 (CTLA4), 카투막소맙 (EpCAM 및 CD3), 아바고보맙 (CA125), 파를레투주맙 (폴레이트 수용체), 엘로투주맙 (CS1), 데노수맙 (RANK 리간드), 피기투무맙 (IGF1R), CP751,871 (IGF1R), 마파투무맙 (TRAIL 수용체), metMAB (met), 미투모맙 (GD3 강글리오시드), 나프투모맙 에스타페나톡스 (5T4), 또는 실툭시맙 (IL6);
(xxi) 에스트로겐 수용체 길항제 또는 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM) 또는 에스트로겐 합성의 억제제, 예를 들어 타목시펜, 풀베스트란트, 토레미펜, 드롤록시펜, 파슬로덱스, 또는 랄록시펜;
(xxii) 아로마타제 억제제 및 관련 약물, 예컨대 엑세메스탄, 아나스트로졸, 레트라졸, 테스토락톤 아미노글루테티미드, 미토탄 또는 보로졸;
(xxiii) 항안드로겐 (즉, 안드로겐 수용체 길항제) 및 관련 작용제, 예를 들어 비칼루타미드, 닐루타미드, 플루타미드, 시프로테론, 또는 케토코나졸;
(xxiv) 호르몬 및 그의 유사체, 예컨대 메드록시프로게스테론, 디에틸스틸베스트롤 (일명 디에틸스틸보에스트롤) 또는 옥트레오티드;
(xxv) 스테로이드, 예를 들어 드로모스타놀론 프로피오네이트, 메게스트롤 아세테이트, 난드롤론 (데카노에이트, 펜프로피오네이트), 플루옥시메스테론 또는 고시폴;
(xxvi) 스테로이드성 시토크롬 P450 17알파-히드록실라제-17,20-리아제 억제제 (CYP17), 예를 들어 아비라테론;
(xxvii) 고나도트로핀 방출 호르몬 효능제 또는 길항제 (GnRA), 예를 들어 아바렐릭스, 고세렐린 아세테이트, 히스트렐린 아세테이트, 류프롤리드 아세테이트, 트립토렐린, 부세렐린, 또는 데슬로렐린;
(xxviii) 글루코코르티코이드, 예를 들어 프레드니손, 프레드니솔론, 덱사메타손;
(xxix) 분화제, 예컨대 레티노이드, 렉시노이드, 비타민 D 또는 레티노산 및 레티노산 대사 차단제 (RAMBA), 예를 들어 아큐탄, 알리트레티노인, 벡사로텐, 또는 트레티노인;
(xxx) 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예를 들어 티피파르닙;
(xxxi) 염색질 표적화 요법, 예컨대 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제, 예를 들어 부티르산나트륨, 수베로일아닐리드 히드록사미드 산 (SAHA), 뎁시펩티드 (FR 901228), 다시노스타트 (NVP-LAQ824), R306465/ JNJ-16241199, JNJ-26481585, 트리코스타틴 A, 보리노스타트, 클라미도신, A-173, JNJ-MGCD-0103, PXD-101, 또는 아피시딘;
(xxxii) 프로테아솜 억제제, 예를 들어 보르테조밉, 카르필조밉, CEP-18770, MLN-9708, 또는 ONX-0912;
(xxxiii) 광역학 약물, 예를 들어 포르피머 소듐 또는 테모포르핀;
(xxxiv) 해양 유기체-유래 항암제, 예컨대 트라벡티딘;
(xxxv) 예를 들어 베타 입자-방출 동위원소 (예를 들어, 아이오딘-131, 이트륨-90) 또는 알파 입자-방출 동위원소 (예를 들어, 비스무트-213 또는 악티늄-225)를 사용한 방사선면역요법을 위한 방사성표지된 약물, 예를 들어 이브리투모맙 또는 아이오딘 토시투모맙;
(xxxvi) 텔로머라제 억제제, 예를 들어 텔로메스타틴;
(xxxvii) 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 예를 들어 바티마스타트, 마리마스타트, 프리노스타트 또는 메타스타트;
(xxxviii) 재조합 인터페론 (예컨대 인터페론-γ 및 인터페론 α) 및 인터류킨 (예를 들어 인터류킨 2), 예를 들어 알데스류킨, 데니류킨 디프티톡스, 인터페론 알파 2a, 인터페론 알파 2b, 또는 페그인터페론 알파 2b;
(xxxix) 선택적 면역반응 조정제, 예를 들어 탈리도미드 또는 레날리도미드;
(xl) 치료 백신, 예컨대 시푸류셀-T (프로벤지) 또는 온코벡스;
(xli) 피시바닐, 로무르티드, 시조피란, 비룰리진 또는 티모신을 포함하는 시토카인-활성화제;
(xlii) 삼산화비소;
(xliii) G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)의 억제제, 예를 들어 아트라센탄;
(xliv) 효소, 예컨대 L-아스파라기나제, 페가스파르가제, 라스부리카제, 또는 페가데마제;
(xlv) DNA 복구 억제제, 예컨대 PARP 억제제, 예를 들어 올라파립, 벨리파립, 이니파립, INO-1001, AG-014699, 또는 ONO-2231;
(xlvi) 사멸 수용체 (예를 들어, TNF-관련 아폽토시스 유도 리간드 (TRAIL) 수용체)의 효능제, 예컨대 마파투무맙 (이전에 HGS-ETR1), 코나투무맙 (이전에 AMG 655), PRO95780, 렉사투무맙, 둘라네르민, CS-1008, 아포맙 또는 재조합 TRAIL 리간드, 예컨대 재조합 인간 TRAIL/Apo2 리간드;
(xlvii) 예방제 (부가물); 즉 화학요법제와 연관된 부작용의 일부를 감소 또는 완화시키는 작용제, 예를 들어
- 항구토제,
- 화학요법-연관 호중구감소증을 방지하거나 또는 그의 지속기간을 감소시키고, 감소된 수준의 혈소판, 적혈구 또는 백혈구로부터 발생하는 합병증을 방지하는 작용제, 예를 들어 인터류킨-11 (예를 들어, 오프렐베킨), 에리트로포이에틴 (EPO) 및 그의 유사체 (예를 들어, 다르베포에틴 알파), 콜로니-자극 인자 유사체, 예컨대 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) (예를 들어, 사르그라모스팀), 및 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 및 그의 유사체 (예를 들어, 필그라스팀, 페그필그라스팀),
- 골 재흡수를 억제하는 작용제, 예컨대 데노수맙 또는 비스포스포네이트, 예를 들어 졸레드로네이트, 졸레드론산, 파미드로네이트 및 이반드로네이트,
- 염증 반응을 억제하는 작용제, 예컨대 덱사메타손, 프레드니손, 및 프레드니솔론,
- 선단비대증 또는 다른 희귀한 호르몬-생성 종양을 갖는 환자에서 성장 호르몬 및 IGF-I (및 다른 호르몬)의 혈액 수준을 감소시키는데 사용되는 작용제, 예컨대 호르몬 소마토스타틴의 합성 형태, 예를 들어 옥트레오티드 아세테이트,
- 폴산의 수준을 감소시키는 약물에 대한 해독제, 예컨대 류코보린, 또는 폴산,
- 통증을 위한 작용제, 예를 들어 오피에이트, 예컨대 모르핀, 디아모르핀 및 펜타닐,
- 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID), 예컨대 COX-2 억제제, 예를 들어 셀레콕시브, 에토리콕시브 및 루미라콕시브,
- 점막염을 위한 작용제, 예를 들어 팔리페르민,
- 식욕부진, 악액질, 부종 또는 혈전색전성 에피소드를 포함한 부작용의 치료를 위한 작용제, 예컨대 메게스트롤 아세테이트.
하나의 특정한 실시양태에서, 제약 조성물은 추가적으로 1종 이상의 면역계 하향-조절의 전신 억제제를 포함한다. 적합한 면역계 하향-조절의 전신 억제제의 예는 US 2012/263677에 기재되어 있고, 항-CTLA-4, 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체를 포함한다.
추가 실시양태에서, 1종 이상의 면역계 하향-조절의 전신 억제제는 항-PD-1 항체로부터 선택된다.
추가 실시양태에서, 제약 조성물은 추가적으로 1종 이상의 면역계 상향-조절의 증진제를 포함한다. 적합한 면역계 상향-조절의 증진제의 예는 US 2012/263677에 기재되어 있고, 적합한 비-특이적 시토카인, 예컨대 인터류킨-1, -2, 또는 -6 (IL-1, IL-2 또는 IL-6) 및 알데스류킨; 인터페론-알파 또는 감마 (IFN-α 및 IFN-γ), 인터페론 알파-2b 및 PEG화 인터페론 (PEG화 인터페론 알파-2a 및 PEG화 인터페론 알파-2b 포함); 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF, 몰그라모스팀 또는 사르그라모스팀); 수지상 세포 백신 및 다른 동종 또는 자가 치료 암 백신, 예를 들어 GM-CSF를 코딩하는 종양용해 포진 바이러스를 함유하는 병변내 백신 (온코벡스(OncoVex)®) 또는 동종 MHC 부류 I 항원을 발현하도록 설계된 인간 백혈구 항원-B7 및 베타-2 마이크로글로불린 작용제를 코딩하는 플라스미드를 함유하는 병변내 백신 (알로벡틴-7(Allovectin-7)®); 및 특정 종양 항원에 대한 항체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 1종 이상의 면역계 상향-조절의 증진제는 IL-2 및 인터페론-감마로부터 선택된다.
본 발명의 조합물에 존재하는 각각의 화합물은 개별적으로 다양한 용량 스케줄로 및 상이한 경로를 통해 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 당지질 화합물은 종양에 직접적으로 투여되도록 의도되지만, 면역계 하향-조절의 전신 억제제, 예컨대 항-PD-1 항체는 전형적으로 전신으로, 즉 정맥내 주사에 의해 전달될 것이다. 이에 따라, 각각의 2종 이상의 작용제의 약량학은 상이할 수 있으며: 각각은 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 그 또는 그녀의 통상의 일반 지식을 통해, 사용되는 투여 요법 및 조합 요법을 알 것이다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 그의 기존 조합 요법에 따라 투여되는 1종 이상의 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다.
치료 방법
본 발명의 추가 측면에 따르면,
a) i) 세포 표면을 갖는 복수의 암 세포를 포함하는 적어도 1종의 종양을 포함하는 대상체; 및
ii) 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 제약 조성물
을 제공하는 단계; 및
b) 상기 당지질 또는 조성물을 종양 내로 도입하는 단계
를 포함하는, 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 당지질 또는 제약 조성물은 종양에 대한 면역 반응을 유도하고 이에 의해 종양을 치료한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
a) 적어도 1종의 종양을 포함하는 대상체에게 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 제약 조성물을 투여하여 적어도 1종의 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 단계
를 포함하는, 대상체에서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
a) 적어도 1종의 종양을 포함하는 대상체에게 유효량의 본원에 정의된 바와 같은 화학식 (I), (II) 및 (III)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 제약 조성물을 투여하여 적어도 1종의 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 단계
를 포함하며, 여기서 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 것은 종양의 감소를 유발하고 이에 의해 대상체에서 종양을 치료하는 것인,
대상체에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 조성물은 추가로 적어도 1종의 면역계 하향-조절의 전신 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 적어도 1종의 면역계 하향-조절의 전신 억제제는 항-CTLA-4, 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 방법은 종양의 크기가 감소될 때까지 1-5회 반복된다.
한 실시양태에서, 방법은 종양이 검출불가능할 때까지 1-5회 반복된다.
한 실시양태에서, 당지질 또는 제약 조성물은 원발성 종양 내로 주사되고, 원발성 종양으로부터 발생한 적어도 1종의 속발성 종양을 치료하는데 효과적인 면역 반응을 유도한다.
한 실시양태에서, 당지질 또는 제약 조성물은 원발성 종양 내로 주사되고, 원발성 종양으로부터 발생한 적어도 1종의 속발성 종양의 크기를 감소시키는데 효과적인 면역 반응을 유도한다.
한 실시양태에서, 방법은 추가로 종양에 대한 면역 반응을 유도한 후 종양의 외과적 제거를 포함한다.
한 실시양태에서, 방법은 추가로 당지질 또는 제약 조성물의 투여 후 종양의 외과적 제거를 포함한다.
한 실시양태에서, 종양의 외과적 제거는 당지질 또는 제약 조성물의 투여 후 약 1-21일 사이에 발생한다.
한 실시양태에서, 종양의 외과적 제거는 당지질 또는 제약 조성물의 투여 후 약 1-14일 사이에 발생한다.
한 실시양태에서, 종양의 외과적 제거는 당지질 또는 제약 조성물의 투여 후 약 1-7일 사이에 발생한다.
한 실시양태에서, 종양의 외과적 제거는 당지질 또는 제약 조성물의 투여 후 약 7-14일 사이에 발생한다.
한 실시양태에서, 종양의 외과적 제거는 당지질 또는 제약 조성물의 투여 후 약 14-21일 사이에 발생한다.
본 발명의 방법은 암 세포의 세포 표면 상에 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프를 디스플레이하기 위해 본 발명의 당지질 화합물의 투여를 가능하게 한다.
한 실시양태에서, 방법은 추가로 상기 종양 세포 상에 막-결합된 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프를 디스플레이하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
a) i) 내인성 항-Gal 또는 항-GalNAc 항체 및 복수의 절제가능하지 않은 종양을 갖는 대상체 (여기서 적어도 상기 종양의 하위세트는 직접 주사, 내시경검사, 기관지경검사, 방광경검사, 결장경검사, 복강경검사 및 카테터삽입에 의한 주사로 이루어진 군으로부터 선택된 절차를 통해 접근가능함), 및
ii) 본원에 정의된 바와 같은 당지질 화합물 또는 제약 조성물
을 제공하는 단계; 및
b) 상기 절차를 사용하여 상기 당지질 화합물 또는 조성물을 종양내로 주사하는 단계
를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법을 고려한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 당지질 화합물의 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프는 옵소닌화된다. 한 실시양태에서, 옵소닌화된 α-Gal 또는 GalNAc 에피토프는 항원 제시 세포에 종양 세포 및 세포 막을 표적화함으로써 상기 종양에 대한 자가 백신의 생산을 유도한다.
한 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 마우스이다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 대안적 실시양태에서, 대상체는 마우스이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
a) i) (1) α1,3갈락토실트랜스퍼라제 유전자가 결여되어 있고, (2) 항-Gal 항체를 가지며, (3) 세포 표면을 갖는 복수의 암 세포를 포함하는 적어도 1종의 종양을 포함하는 마우스; 및
ii) 화학식 (I) 및 (II)의 화합물로부터 선택된 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염
을 제공하는 단계; 및
b) 상기 당지질을 상기 종양 중 적어도 1종 내로 도입하여 암 세포의 세포 표면 상에 α-Gal 에피토프를 디스플레이하는 단계
를 포함하는, 마우스에서 본 발명의 당지질 화합물을 종양 내로 도입하는 방법을 제공한다.
항원 제시 세포에의 자가 종양 백신의 항-Gal 표적화
α-Gal 에피토프는 종양 세포와 α-Gal 당지질과의 인큐베이션에 의해 종양 세포 막 내로 시험관내 삽입될 수 있는 것으로 제시되었다. 종양 세포 또는 종양 세포 막과 상기 α-Gal 당지질과의 공동-인큐베이션은 종양 세포 막 내로의 그의 자발적 시험관내 삽입 및 이들 세포 막 상에서의 α-Gal 에피토프의 발현을 유발한다. α1,3갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 사용한 다양한 분자 생물학 방법에 의해 α-Gal 에피토프를 발현하도록 조작된 종양 세포는 자가 종양 백신으로서 연구되었다. 그의 피내 주사 후, 천연 항-Gal IgG 항체는 백신접종 부위에서 백신접종 종양 세포 막 상의 α-Gal 에피토프에 계내 결합하고 백신을 항원 제시 세포에 표적화한다. 본 발명의 메카니즘을 이해하는 것이 필요하지 않을지라도, 항원 제시 세포 상의 Fcγ 수용체에 대한 복합체화된 항-Gal의 Fc 부분의 결합은 항원 제시 세포 내로의 옵소닌화된 백신접종 종양 세포 막의 효과적인 흡수를 유도하는 것으로 여겨진다. 따라서, 자가 종양의 특징화되지 않은 종양 항원은 또한 항원 제시 세포 내로 내재화된다. 백신접종 자가 종양 막의 배액 림프절로의 수송 후, 항원 제시 세포는 종양 특이적 세포독성 및 헬퍼 T 세포 (즉, 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포)의 활성화를 위해 종양 항원 펩티드를 프로세싱 및 제시한다.
α-Gal 에피토프를 발현하는 종양 백신의 효능에 대한 원리 증명은 α-Gal 에피토프를 발현하는 흑색종 세포로 면역화되었으며 동일하지만 α-Gal 에피토프가 결여된 흑색종 세포로 챌린지된 마우스 실험 모델에서의 연구에서 달성되었다 (LaTemple D C et al. Cancer Res. 1999, 59: 3417-23, 및 Deriy L et al. Cancer Gene Therapy 2005; 12: 528-39). 그러한 연구에 사용된 마우스는 α1,3갈락토실트랜스퍼라제 유전자에 대한 녹아웃 마우스였다 (즉, 이들 마우스는 α-Gal 에피토프가 결여되어 있으며 항-Gal 항체를 생산할 수 있음). α-Gal 에피토프를 발현하도록 조작된 흑색종 세포로 면역화된 마우스는 동일하지만 α-Gal 에피토프가 결여된 종양 세포로의 챌린지에 대해 효과적인 면역 보호를 디스플레이하였다. 대조적으로, α-Gal 에피토프가 결여된 종양 세포로 면역화된 마우스는 α-Gal 에피토프가 결여된 생 종양 세포로의 챌린지에 대해 보호성 면역 반응을 디스플레이하지 않았다.
종양 요법에서의 α-Gal 당지질
본 발명은 고형 종양 종괴를 갖는 환자의 치료를 고려한다. 본 발명의 특정한 실시양태는 환자 자신의 종양의 자가 종양 백신으로의 전환에 의해 개별 환자를 그 또는 그녀 자신의 종양 병변에 대해 면역화하는 것을 목표로 하는, 암 환자의 신규 면역요법 치료를 고려한다 (본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,879,675 참조). 예를 들어, '675 특허는 종양 세포 및/또는 세포 막의 시험관내 프로세싱을 교시한다. 이들 세포의 환자 내로의 주사 시에 백신은 항-Gal 항체에 의해 APC에 표적화되고, 자가 종양 항원에 대한 보호성 면역 반응을 도출한다. 그러나, 본 발명과 달리, '675 특허는 다음을 교시하지 않는다: i) 천연 항-Gal 항체에 의한 염증의 유도, 종양의 퇴행 및/또는 파괴를 위한 생체내 종양내 치료; 또는 ii) 암 환자 내 α-Gal 당지질의 종양내 주사 후 생체내 종양 세포 상의 α-Gal 에피토프의 디스플레이.
본 발명의 한 실시양태에서 α-Gal 당지질은 종양 세포를 포함하는 종양 병변 내로, 비-외과적 종양내 주사에 의해 (즉, 예를 들어, 내시경검사, 카테터삽입 등에 의해), 또는 α-Gal 당지질 또는 다양한 분자 상의 항-Gal 결합 에피토프의 종양 내로의 생체내 도입을 위한 임의의 다른 방법에 의해 전달될 수 있다.
화학요법 불응성 전이의 수술후 재발은 고형 종양을 갖는 환자에서 사망의 가장 흔한 원인인 것으로 여겨진다. 이러한 재발성 전이의 높은 발생률 (80%)은 췌장 및 난소 암종을 갖는 환자에서 보고되었고, 다른 고형 종양, 예컨대 흑색종 및 결장직장, 폐 및 유방 암종에서 다소 보다 적은 정도로 보고되었다. 이들 재발성 환자 중 다수는, 어떤 치료도 이들에게 이용가능하지 않기 때문에, 말기 질환을 갖는 것으로 간주되고, 이들은 전이의 검출 후 수주 또는 수개월 이내에 사망한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 모든 인간이 그의 이뮤노글로불린의 대략 1%로서 항-Gal 항체를 자연적으로 생산한다는 사실을 이용함으로써 종양 전이의 퇴행 및/또는 파괴를 위한 치료 방법을 고려한다. 항-Gal 항체의 면역학적 잠재력은 임의의 종양 병변을 퇴행 및/또는 파괴하고, 이들을 α-Gal 에피토프를 보유하는 당지질 (즉, 화학식 (I) 또는 (II)의 당지질 화합물)의 종양내 주사에 의해 계내 자가 종양 백신으로 전환시키는데 활용될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 본 발명은 치료된 종양 병변의 퇴행 및/또는 파괴를 유도할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 치료된 종양은 퇴행을 겪는다. 대안적 실시양태에서, 치료된 종양은 파괴된다.
추가 실시양태에서, 종양 (즉, α-Gal 에피토프를 디스플레이하고 있는 것)은 퇴행을 겪으며, 여기서 상기 종양은 흑색종 또는 기관 전이, 예컨대 간 전이로부터 선택된다. 추가의 대안적 실시양태에서, 종양 (즉, α-Gal 에피토프를 디스플레이하고 있는 것)은 파괴되며, 여기서 상기 종양은 흑색종 또는 기관 전이, 예컨대 간 전이로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 도입하는 단계는 치료된 종양의 자가 종양 백신으로의 전환의 결과로서 대상체에서 속발성 종양의 퇴행을 야기한다. 추가 실시양태에서, 상기 속발성 종양은 흑색종 또는 간 전이로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 도입하는 단계는 대상체에서 속발성 종양의 파괴를 야기한다. 추가 실시양태에서, 상기 속발성 종양은 흑색종 또는 간 전이로부터 선택된다.
많은 α-Gal 당지질은 종양 세포 막 내로 자발적으로 삽입될 것인데, 이는 α-Gal 당지질의 소수성 (즉, 친지성) 지질 꼬리가 물로 둘러싸인 미셀 코어와 비교하여 세포 막의 지질 이중층의 외부 소엽에 포매될 때 더 안정한 동적 형태로 존재하기 때문이다. 강글리오시드로 불리는 다른 유형의 당지질의 세포 막 내로의 자발적 삽입 (혼입)은 이전에 입증되었다 (Kanda S et al. J Biochem. (Tokyo). 1982; 91: 1707-18, 및 Spiegel S et al. J. Cell Biol. 1985; 100: 721-26). α-Gal 당지질의 종양 세포 막 내로의 삽입은 세포 막 표면 상의 α-Gal 에피토프의 신생 디스플레이를 유발하는 것으로 예상된다. α-Gal 에피토프 발현은 보체 매개된 세포용해 (CDC) 및 항체 의존성 세포 매개된 세포용해 (ADCC)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 이러한 메카니즘에 의해 종양 세포의 항-Gal 항체 매개된 퇴행 및/또는 파괴를 용이하게 할 수 있고, 또한 종양 괴사로 이어질 수 있다. 이어서, 항-Gal 옵소닌화된 종양 세포 막은 항원 제시 세포에 효과적으로 표적화될 것이고, 이에 의해 치료된 종양 병변은 자가 종양 백신으로 전환될 것이다. 이어서, 이 자가 백신은 면역계를 종양 항원에 대해 반응하도록 자극하여, 치료된 환자의 다른 종양 병변 및/또는 미세전이 내에서 이들 항원을 발현하는 종양 세포의 추가의 퇴행 및/또는 파괴를 유발할 것이다.
한 실시양태에서, 대상체는 이전에 종양을 외과적으로 제거하기 위해 치료되었다.
대안적 실시양태에서, 대상체는 이전에 종양을 외과적으로 제거하기 위해 치료되지 않았으며, 즉, 본원에 기재된 방법은 원발성 종양의 절제 전 수주간 신보조 요법으로서 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 당지질의 종양내 주사는 종양의 크기를 감소시키고, 치료된 종양을 자가 종양 백신으로 전환시킨다. 이러한 종양이 결국 절제될지라도, 그의 절제 전에 치료된 종양은 동일한 종양 항원을 디스플레이하는 미세전이에 대한 면역 반응을 도출할 것으로 여겨진다.
항-Gal 항체 종양 퇴행 및/또는 파괴의 메카니즘
본 발명의 메카니즘을 이해하는 것이 필요하지 않을지라도, 주사된 α-Gal 당지질에 의한 종양 병변 퇴행 및/또는 파괴는 생화학적 및 생리학적 기초를 포함할 수 있는 것으로 여겨진다.
한 실시양태에서, 방법은 종양내 염증을 유도하는 것을 추가로 포함한다.
종양내 주사는 종양 연관된 모세관의 국부 파열을 유발할 수 있고, 이에 의해 천연 항-Gal IgM 및 항-Gal IgG 항체 분자의 종양 내부에의 접근을 제공할 수 있다. 이어서, 항-Gal 항체는 α-Gal 당지질 미셀 상의 α-Gal 에피토프, 또는 개별 α-Gal 당지질 분자와 상호작용할 수 있을 것이고, 이에 의해 보체의 국부 활성화 및 보체 절단 화학주성 인자 C5a 및 C3a의 생성을 유도할 수 있을 것이다. 더욱이, C3b는 표적 세포 상에 공유적으로 침착된다. 이어서, 보체 활성화는 치료된 종양 병변 내에서 신생 생산된 C5a 및 C3a 화학주성 인자에 의해 지시된 종양내 과립구, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포 이동을 용이하게 하는 국부 염증 과정을 개시한다. 염증 과정은 추가로 내피 세포의 항-Gal 활성화를 야기하는 α-Gal 당지질의 세포 막 내로의 삽입의 결과로서 증폭될 수 있다 (Palmetshofer A et al. Transplantation. 1998; 65: 844-53; Palmetshofer A et al. Transplantation. 1998; 65: 971-8). 내피 세포 활성화 및 전체 종양 세포 손상은 추가의 염증유발 시토카인 및 케모카인의 국부 생산을 유발할 수 있다. 이들 국부로 분비된 시토카인 및 케모카인은 α-Gal 당지질이 주사된 병변 내로 대식세포, 수지상 세포의 추가의 이동 및 림프구의 후속 이동을 유도한다. 이 세포 이동은 항원 제시 세포 상 및 림프구 상의 염증유발 시토카인 및 케모카인에 대한 수용체에 의해 매개된다 (Cravens P D and Lipsky P E Immunol. Cell Biol. 2002; 80: 497-505). 이 염증 반응의 초기 유도는 면역계로 하여금 발생하는 종양 병변의 "잠행 성질"을 검출하는 그의 능력의 일반적 결여를 극복할 수 있게 한다. 이 염증은 또한 면역계로 하여금 국부 시토카인 환경에 의해 유도되는 고형 종양 병변 내의 면역억제 미세환경을 극복할 수 있게 하고, 정상적으로 림프구가 종양 내로 침투하는 것을 방지한다 (Malmberg K J. Cancer Immunol. Immunother. 2004; 53: 879-92; Lugade A A et al. J. Immunol. 2005; 174:7516-23).
종양 세포의 파괴는 세포 막 내로 삽입된 α-Gal 당지질에 대한 항-Gal 결합에 의해 발생한다. 종양 내로 주사된 α-Gal 당지질은 종양 세포 막의 인지질 이중층의 외부 소엽 내로 자발적으로 삽입될 수 있다. 삽입된 α-Gal 당지질 상의 α-Gal 에피토프에 대한 항-Gal IgM 및/또는 항-Gal IgG의 후속 결합은 보체 의존성 세포용해 (CDC)를 통한 치료된 종양의 퇴행 및/또는 파괴를 유도한다. 이들 α-Gal 에피토프에 대한 항-Gal IgG 분자의 결합은 또한 종양 세포의 항체 의존성 세포 세포용해 (ADCC)를 용이하게 한다.
한 실시양태에서, 종양은 보체 의존성 세포용해 (CDC)를 통한 퇴행 및/또는 파괴를 겪는다.
한 실시양태에서, 종양은 항체 의존성 세포 세포용해 (ADCC)를 통한 퇴행 및/또는 파괴를 겪는다.
보체 의존성 세포용해에서, (α-Gal 당지질 삽입으로 인해) α-Gal 에피토프를 발현하는 종양 세포에 대한 항-Gal IgG 및/또는 IgM 분자 결합은 보체계를 활성화시키는 것으로 여겨진다. 후속적으로, 보체 C5b-9 막 공격 복합체가 이 보체 활성화의 결과로서 형성되고, 이어서 종양 세포 막 내 "포크" 홀이 형성되어, 종양 세포 용해를 유발한다. 이 보체 의존성 세포용해는 돼지 내피 세포가 용해될 때 유사하게 발견되며, 이종이식편의 초급성 거부로 이어진다 (Collins B H et al. J. Immunol. 1995; 154: 5500-10,). ADCC에서 이펙터 세포는 과립구, 대식세포 및 NK 세포이다. 이들 세포는 항-Gal 유도된 염증 과정 때문에 병변으로 유인된다. 이들은 종양 세포 막 내로 삽입된 α-Gal 당지질에 결합된 항-Gal IgG 분자의 Fc 부분에 그의 Fcγ 수용체 (FcγR)를 통해 결합한다. 종양 세포에 부착되면, 이들 이펙터 세포는 막 접촉 영역 내로 그의 그랜자임 소포를 분비하여 종양 세포 막에 홀을 생성하고, 따라서 이들 종양 세포의 파괴를 유도한다. α-Gal 에피토프를 발현하는 세포의 ADCC 파괴를 유도하는데 있어서의 항-Gal IgG의 효능은 α-Gal 에피토프를 통해 항-Gal에 결합하는 이종이식편 돼지 세포로 입증되었다 (Galili, U. Immunol. Today 1993, 14: 480-82). 유사한 항-Gal 매개된 ADCC 과정은 종양 세포가 그의 세포 표면 막 상에 발현된 α-Gal 에피토프를 통해 항-Gal에 결합할 때 발생한다 (Tanemura M et al. J. Clin. Invest. 2000; 105: 301-10).
항원 제시 세포에 의한 종양 세포 막의 흡수는 화학요법 불응성 미세전이를 퇴행 및/또는 파괴하기 위해 자가 종양 항원에 대한 보호성 면역 반응의 유도를 가져올 수 있다. 막 삽입된 α-Gal 당지질 상의 α-Gal 에피토프에 결합된 항-Gal IgG 항체 또는 항-Gal 의존성 보체 활성화를 통해 표적 세포 상에 침착된 C3b는 종양 항원 (즉, 예를 들어, 종양 연관된 항원, TAA)을 발현하는 세포 막을 내재화하도록 항원 제시 세포를 자극한다. 이어서, 내재화된 종양 항원은 항원 제시 세포에 의해 치료된 종양 병변에서 배액 림프절로 수송될 수 있다. 이어서, 이들 종양 항원은 추가로 항원 제시 세포에 의해 프로세싱되고, 종양 특이적 T 세포를 활성화시키는 면역원성 종양 펩티드로서 제시될 수 있다. 이 과정은 전신 보호성 항-종양 면역 반응 (즉, 예를 들어, 자가 종양 백신)의 유도를 가져온다. 따라서, α-Gal 당지질이 주사된 종양 병변은 궁극적으로 계내 자가 종양 백신으로 전환되어 치료된 종양 병변에서의 것과 같은 종양 항원을 발현하는 미세전이에 대한 면역 반응을 도출한다.
임상 치료 양식으로서, 당지질은 피내 주사 (즉, 예를 들어, 흑색종 종양 내로); 내시경 주사 (즉, 예를 들어, 결장직장 장 전이 내로); 복강경 주사 (즉, 예를 들어, 복부 난소, 결장, 위, 간 또는 췌장 암종 전이 (예를 들어, 복막 상 또는 간 내의 것) 내로); 경피 영상화 유도 바늘 주사 (즉, 예를 들어, 폐 종양 내로); 기관지경 주사 (즉, 예를 들어, 폐 종양 내로); 결장경 주사; 또는 방광경 주사 (즉, 예를 들어, 방광 암종 내로)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방법에 의해 암 병변 내로 투여될 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 도입은 주사, 영상화 유도 주사, 내시경검사, 기관지경검사, 방광경검사, 결장경검사, 복강경검사 및 카테터삽입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 절차를 포함한다.
한 실시양태에서, 도입은 비-외과적 종양내 주사를 포함한다. 예를 들어, 도입은 피내 주사, 경피 영상화 유도 주사, 내시경 주사, 기관지경 주사, 방광경 주사, 결장경 주사 및 복강경 주사로부터 선택된 절차를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 당지질은 포스페이트 완충 염수 (PBS), 염수, 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 (GRAS) 다른 수용액 또는 다른 부형제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된 제약상 허용되는 용액 (즉, 멸균 용액) 중에서 주사된다. 한 실시양태에서, 당지질의 용액은 또한 데옥시콜레이트, 또는 세포 막 내로 당지질의 침투를 증가시킬 수 있는 다른 온화한 세제를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종양 절제 수술 전에 제공된 신보조 요법으로서 원발성 종양 내로의 본 발명의 당지질의 종양내 주사를 고려한다. 한 실시양태에서, 당지질에 의한 수술전 주사에 의해 유도된 신속한 염증 반응은 종양 병변 크기의 감소를 유발할 뿐만 아니라 그것을 계내 자가 종양 백신으로 전환시킨다. 본 발명의 메카니즘을 이해하는 것이 필요하지 않을지라도, 치료된 종양에 대한 면역 반응은 궁극적으로 원발성 종양의 외과적 절제 시에 검출가능하지 않은 미세전이의 면역 파괴를 유도하도록 도울 수 있는 것으로 여겨진다. 추가로, 수술전 투여는 전형적인 보조 요법 (즉, 예를 들어, 화학요법 및 방사선)에 대해 저항성을 가지며 원발성 종양과 같은 종양 항원을 발현하는 미세전이의 면역학적 파괴로 인해 질환의 재발을 예방하는데 도움이 될 수 있는 것으로 여겨진다. 이러한 신보조 요법은 직접적으로 또는 유도된 영상화나 임의의 다른 공지된 방법에 의해 주사될 수 있는 임의의 고형 종양 또는 림프종에 투여될 수 있다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 정의된 바와 같은 제약 조성물, 및 임의로 본원에 정의된 바와 같은 방법에 따라 키트를 사용하기 위한 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.
한 실시양태에서, 키트는 추가적으로 전달 장치, 예컨대 종양내 전달 장치를 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는, 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타내어진 것과 같이 본원에 참조로 포함되며, 이들은 인용된 간행물과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시 및 기재하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전에 그의 개시내용에 대한 것이며, 본 개시내용이 선행 개시내용에 의해 그러한 간행물보다 앞서있을 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기 실시예는 단지 본 발명의 실시양태의 예시적인 예로서 의도된다. 이들은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
물질 및 방법
아세톤, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올, o-크실렌, 톨루엔, 2-프로판올 및 o-크실렌은 킴메드 (러시아 연방)로부터의 것이었다. 아세토니트릴은 크리오크롬 (러시아 연방)으로부터의 것이었다. DMSO, DMF, CF3COOH, Et3N, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드는 머크 (독일)로부터의 것이었다. N-메틸모르폴린 (NMM), 2-말레이미도프로피온산 및 디숙시미딜카르보네이트는 플루카에 의해 공급되었다. 이미노디아세트산 디메틸 에스테르 히드로클로라이드는 레아크힘 (러시아 연방)으로부터의 것이었다. 테트라아민 (H2N-CH2)4C x 2H2SO4는 문헌 [Litherland and Mann (1938) The amino-derivatives of pentaerythritol Part I. Preparation Journal of the Chemical Society, 1588-95]에 기재된 바와 같이 합성하였다.
다우엑스 50X4-400 및 세파덱스 LH-20은 아머샴 바이오사이언시스 아베 (스웨텐)로부터의 것이었다. 실리카 겔 60은 머크 (독일)로부터의 것이었다. 박층 크로마토그래피는 7% H3PO4 침지 또는 닌히드린 후 탄화에 의한 검출을 동반하는 실리카 겔 60 F254 알루미늄 시트 (머크, 1.05554)를 사용하여 수행하였다.
1H NMR 스펙트럼은 참조로서 용매의 잔류 양성자의 신호를 사용하여 브루커 WM 500 MHz 기기 또는 브루커 DRX-500 분광계로 30℃에서 기록하였다 ([D6]DMSO, 2.500 ppm; [D2]H2O, 4.750 ppm; CD3OD).
실시예 1: 화학식 (I)의 화합물 "Galili-CMG2-DOPE"의 제조
3-트리플루오로아세트아미도프로필-3,4-디-O-아세틸-2,6-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실-(1→3)-2,4-디-O-아세틸-6-O-벤질-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-2-아세트아미도-3-O-아세틸-6-O-벤질-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 (3)의 제조 (반응식 I)
글리코실 수용자 (3-트리플루오로아세트아미도프로필)-2-아세트아미도-3-O-아세틸-6-O-벤질-2-데옥시-4-O-(2,4-디-O-아세틸-6-O-벤질-β-D-갈락토피라노실)-β-D-글루코피라노시드 (2)를 [Pazynina et al. (2008)]의 간행물에 개시된 방법에 따라 제조하였다. 글리코실 수용자 2 (500 mg, 0.59 mmol), 티오갈락토피라노시드 1 (576 mg, 1.18 mmol), NIS (267 mg, 1.18 mmol), 무수 CH2Cl2 (25 ml) 및 분자체 4 Å (500 mg)의 혼합물을 Ar의 분위기 하에 -45℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서 무수 CH2Cl2 (0.5 ml) 중 TfOH (21 μl, 0.236 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -45℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 온도를 4시간에 걸쳐 -20℃로 증가시켰다. 혼합물을 -20℃에서 밤새 유지하였다. 이어서, 추가량의 티오갈락토피라노시드 1 (144 mg, 0.295 mmol), NIS (66 mg, 0.295 mmol) 및 TfOH (5 μl, 0.06 mmol)를 첨가하고, 교반을 -20℃에서 2시간 동안 유지한 후에, 실온으로 천천히 가온되도록 하였다 (1시간). 이어서, Na2S2O3의 포화 수용액을 첨가하고, 혼합물을 여과하였다. 여과물을 CHCl3 (300 ml)으로 희석하고, H2O (2 x 100 ml)로 세척하고, 목화 울을 통한 여과에 의해 건조시키고, 농축시켰다. LH-20 상의 겔 여과 (CHCl3-MeOH)에 의해 생성물 3 (600 mg, 80%)을 백색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR (700 MHz, CDCl3, 특징적인 신호), δ, ppm: 1.78-1.82 (m, 4H, CHCHC, OC(O)CH3), 1.84-1.90 (m, 1H, CHCHC), 1.91, 1.94, 1.97, 1.98, 2.06 (5 s, 5x3H, 4 OC(O)CH3, NH(O)CH3), 3.23-3.30(m, 1H, NCHH), 3.59-3.65 (m, 1H, NCHH), 4.05 (m, 1H, H-2I), 4.33 (d, 1H, J1,2 7.55, H-1I), 4.40 (d, 1H, J 12.04, PhCHH), 4.42 (d, 1H, J1,2 8.07, H-1II), 4.45 (d, 1H, J 11.92, PhCHH), 4.48 (d, 1H, J 12.00, PhCHH), 4.50 (d, 1H, J 12.00, PhCHH), 4.52 (d, 1H, J 12.04, PhCHH), 4.54 (d, 1H, J 12.00, PhCHH), 4.57 (d, 1H, J 12.00, PhCHH), 4.64(d, 1H, J 11.92, PhCHH), 4.99 (dd
Figure 112018056150910-pct00003
t, 1H, J 8.24, H-2II), 5.08-5.13 (m, 2H, H-3I, H-3III), 5.23 (d, 1H, J1,2 3.31, H-1III), 5.46 (d, 1H, J3,4 2.25, H-4II), 5.54 (d, 1H, J3,4 3.11, H-4III), 7.20-7.40 (m, 20H, ArH); 7.49-7.54 (m, 1H, NHC(O)CF3). Rf 0.4 (PhCH3-AcOEt, 1:2).
3-아미노프로필-α-D-갈락토피라노실-(1→3)-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 (5)의 제조 (반응식 I)
생성물 3 (252 mg, 0.198 mmol)을 젬플렌에 따라 탈아세틸화하고 (8시간, 40℃), AcOH로 중화시키고, 농축시켰다. 수득된 생성물의 TLC (CH3Cl-MeOH, 10:1) 분석은 다음 2개의 반점을 나타냈다: Rf 0.45를 갖는 주요 반점, 및 트리플루오로아세틸의 부분 손실의 지표인 출발 라인 상의 또 다른 것 (닌히드린 양성 반점). 따라서, 생성물을 1시간 동안 MeOH (10 ml) 중 CF3COOMe (0.1 ml) 및 Et3N (0.01 ml)을 사용한 처리에 의해 N-트리플루오로아세틸화하고, 농축시키고, 실리카 겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피 (CHCl3-MeOH, 15:1)에 적용하여 생성물 4를 백색 발포체 (163 mg, 77%)로서 수득하였다, Rf 0.45 (CH3Cl-MeOH, 10:1). 생성물 4를 가수소분해 (200 mg Pd/C, 10 ml MeOH, 2시간)에 적용하고, 여과하고, N-탈플루오로아세틸화하고 (5% Et3N/ H2O, 3시간), 농축시켰다. 다우엑스 50X4-400 상에서의 양이온-교환 크로마토그래피 (H+) (5% 수성 암모니아로 용리됨)에 의해 생성물 5 (90 mg, 98%)를 백색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR (D2O, 특징적인 신호), δ, ppm: 1.94-1.98 (m, 2H, CCH2C), 2.07 (s, 3H, NHC(O)CH3), 3.11 (m, J 6.92, 2H, NCH2), 4.54 및 4.56 (2d, 2H, J1,2 8.06, J1,2 7.87, H-1I 및 H-1II), 5.16 (d, 1H, J1,2 3.87, H-1III). Rf 0.3 (EtOH-BuOH-Py-H2O-AcOH; 100:10:10:10:3).
반응식 I
Figure 112018056150910-pct00004
{[2-(2-tert-부톡시카르보닐아미노-아세틸아미노)-아세틸]-메톡시카르보닐메틸-아미노}-아세트산 메틸 에스테르 (8)의 제조 (반응식 II)
N-메틸모르폴린 (11.0 ml, 0.1 mol)을 150 ml 메틸렌 클로라이드 중 Boc-글리실-글리신 (23.2 g, 0.1 mol)의 교반 현탁액에 첨가하고, 용액을 -15℃로 냉각시키고, 이소부틸 클로로포르메이트 (13.64 g, 0.1 mol)를 10분 동안 첨가하였다. 이어서, 1-히드록시벤조트리아졸 및 50 ml DMF 중 (메톡시카르보닐메틸아미노)-아세트산 메틸 에스테르 (7) (16.1 g, 0.1 mol)의 용액을 동일한 온도에서 반응 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 30분 동안, 이어서 주위 온도에서 2시간 동안 교반하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 메틸렌 클로라이드 200 ml 중에 용해시키고, 100 ml 0.5 M HCl 및 200 ml 2% 수성 NaHCO3으로 세척하였다. 용매를 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 실리카 겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피 (CHCl3 중 3% MeOH)에 의해 정제하여 순수한 목적 화합물 (34.08 g, 91%)을 무색 유리로서 수득하였다. TLC: Rf = 0.40 (CHCl3 중 5% MeOH), Rf=0.49 (7:1 (v/v) 클로로포름/메탄올).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃) δ, ppm: 7.826 (t, J=5.1 Hz, 1H; NHCO), 6.979 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.348 및 4.095 (s, 2H; NCH 2COO), 3.969 (d, J=5.1 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.689 및 3.621 (s, 3H; OCH 3), 3.559 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 1.380 (s, 9H; C(CH3)3). Rf 0.49 (7:1 (v/v) 클로로포름/메탄올).
{[2-(2-tert-부톡시카르보닐아미노-아세틸아미노)-아세틸]-메톡시카르보닐메틸-아미노}-아세트산 (9)의 제조 (반응식 II)
0.2 M 수성 NaOH (325 ml)를 메탄올 (325 ml) 중 {[2-(2-tert-부톡시카르보닐아미노-아세틸아미노)-아세틸]-메톡시카르보닐메틸-아미노}-아세트산 메틸 에스테르 (8)(24.42 g, 65.12 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 주위 온도에서 15분 동안 유지하고, 아세트산 (5 ml)으로 산성화시키고, 증발 건조시켰다. 실리카 겔 상에서의 잔류물의 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 - 에틸 아세테이트 1:1)에 의해 Na-염으로서의 목적 화합물 (20.44 g)을 수득하고, 이를 메탄올/물/피리딘 혼합물 (20:10:1, 350 ml) 중에 용해시키고, 이온-교환 칼럼 (다우엑스 50X4-400, 피리딘 형태, 300 ml)을 통과시켜 Na 양이온을 제거하였다. 칼럼을 동일한 혼합물로 세척하고, 용리액을 증발시키고, 진공 하에 건조시켜 순수한 목적 화합물 (20.15 g, 86%)을 백색 고체로서 수득하였다. TLC: Rf= 0.47 (iPrOH/ 에틸 아세테이트/물 4:3:1).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃), N-카르복시메틸글리신 단위의 시스- 및 트랜스-이형태체의 혼합물 약 3:1. 주요 이형태체; δ, ppm: 7.717 (t, J=5 Hz, 1H; NHCO), 7.024 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.051 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 3.928 (d, J=5 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.786 (s, 2H; NCH 2COOH), 3.616 (s, 3H; OCH 3), 3.563 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 1.381 (s, 9H; C(CH3)3) ppm; 부차 이형태체, δ = 7.766 (t, J=5 Hz, 1H; NHCO), 7.015 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.288 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 3.928 (d, J=5 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.858 (s, 2H; NCH 2COOH), 3.676 (s, 3H; OCH 3), 3.563 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 1.381 (s, 9H; C(CH3)3). Rf 0.47 (4:3:1 (v/v/v) i-PrOH/에틸 아세테이트/물).
{[2-(2-tert-부톡시카르보닐아미노-아세틸아미노)-아세틸]-메톡시카르보닐메틸-아미노}-아세트산 N-옥시숙신이미드 에스테르 (Boc-Gly2(MCM)GlyOSu)(10)의 제조 (반응식 II)
N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (14.03 g, 68.10 mmol)를 DMF (210 ml) 중 {[2-(2-tert-부톡시카르보닐아미노-아세틸아미노)-아세틸]-메톡시카르보닐메틸-아미노}-아세트산 (26.40 g, 73.13 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (8.70 g, 75.65 mmol)의 빙냉 교반 용액에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안, 이어서 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 침전된 N,N'-디시클로헥실우레아를 여과해내고, DMF (80 ml)로 세척하였다. 여과물 및 세척물을 농축시키고, 잔류물을 Et2O (500 ml)와 함께 1시간 동안 교반하였다. 에테르 추출물을 경사분리하고, 잔류물을 농축시켜 목적 화합물을 백색 발포체 (32.57 g, 97%)로서 수득하였다. TLC: Rf = 0.71 (아세톤/아세트산 40:1).
1H NMR (500 MHz, DMSO[D6], 30℃), N-카르복시메틸글리신 단위의 시스- 및 트랜스-이형태체의 혼합물 약 3:2.
주요 이형태체; δ, ppm: 7.896 (t, J=5.1 Hz, 1H; NHCO), 6.972 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.533 (s, 2H; NCH 2COON), 4.399 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 3.997 (d, J=5.1 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.695 (s, 3H; OCH 3), 3.566 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 1.380 (s, 9H; C(CH3)3).
부차 이형태체; δ, ppm: 7.882 (t, J=5.1 Hz, 1H; NHCO), 6.963 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.924 (s, 2H; NCH 2COON), 4.133 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 4.034 (d, J=5.1 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.632 (s, 3H; OCH 3), 3.572 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 1.380 (s, 9H; C(CH3)3).
Rf 0.71 (40:1 (v/v) 아세톤/아세트산).
반응식 II
Figure 112018056150910-pct00005
CMG(2) 디아민 (16)의 제조 (반응식 III 및 IV)
DMSO (5 ml) 중 에틸렌디아민 (11) (808 mg, 13.47 mmol) 및 Et3N (1.87 ml, 13.5 mmol)의 용액을 DMSO (50 ml) 중 Boc-Gly2-(MCM)Gly-OSu (10) (15.42 g, 33.68 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 30분 동안 교반하고, 아세트산 (1.2 ml)으로 산성화시킨 다음, 세파덱스 LH-20 칼럼 (칼럼 부피 1200 ml, 용리액 - MeOH/물 2:1 + 0.2% AcOH)으로 분획화하였다. 화합물 Boc2MCMG (12)를 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 농축시켰다. 생성물을 추가적으로 용리액으로서 2-프로판올/에틸 아세테이트/물 (2:6:1)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 Boc2MCMG (12)를 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켜 목적 Boc2MCMG (12)를 무색 발포체 (8.41 g, 84%)로서 수득하였다. TLC: Rf= 0.48 (iPrOH/ 에틸 아세테이트/물 2:3:1).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃), 이형태체의 혼합물 ~3:2: 8.166, 8.125, 7.917 및 7.895 (m, 총 2H; 2 CONHCH2), 7.793 (m, 2H; NHCH2CH2NH), 7.001 (br. t, 2H; 2 NHCOO), 4.277-3.893 (총 12H; 2 CH2COO, 4 NCH2CO), 3.690 및 3.635 (s, 총 6H; 2 COOCH3), 3.567 (d, J=5.8 Hz, 4H; 2 CH 2NHCOO), 3.131 (m, 4H; NHCH 2CH 2NH), 1.379 (s, 18H; 2 C(CH3)3) ppm.
MS, m/z: 769 [M+Na], 785 [M+K].
트리플루오로아세트산 (25 ml)을 메틸렌 클로라이드 (25 ml) 중 Boc2MCMG (12) (4.88 g, 6.535 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 용액을 주위 온도에서 1시간 동안 유지하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 무수 MeOH (50 ml)로 3회 증발시킨 다음, 잔류물을 Et2O (100 ml)로 3회 추출하여 미량의 트리플루오로아세트산을 제거하였다. 생성된 침전물 (백색 고체로서임)을 건조시켜 MCMG (13) 5.06 g (~100%)을 비스-트리플루오로아세트산 염으로서 수득하였다. TLC: Rf= 0.23 (에탄올/물/피리딘/아세트산 5:1:1:1).
1H NMR (500 MHz, D2O, 30℃), 이형태체의 혼합물 ~5:4: 4.400-4.098 (총 12H; 2 CH2COO, 4 NCH2CO), 3.917 (s, 4H; 2 COCH 2NH2), 3.829 및 3.781 (s, 총 6H; 2 COOCH3), 3.394 (m, 4H; NHCH 2CH 2NH) ppm.
MS, m/z: 547 [M+H], 569 [M+Na], 585 [M+K].
DMSO (17 ml) 중 Boc-Gly2-(MCM)Gly-OSu (10) (7.79 g, 16.994 mmol)의 용액 및 Et3N (2.83 ml, 20.4 mmol)을 DMSO (13 ml) 중 MCMG (13) (5.06 g, 6.796 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 교반한 후 아세트산 (4.0 ml)을 사용하여 산성화시키고, 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피 (칼럼 부피 1200 ml, 용리액 - MeOH/물 2:1 + 0.2% AcOH)로 분획화하였다. 순수한 Boc2MCMG (14)를 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켜 목적 Boc2MCMG (14)를 무색 발포체 (8.14 g, 97%)로서 수득하였다. TLC: Rf= 0.25 (iPrOH/ 에틸 아세테이트/물 2:3:1).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃), 이형태체의 혼합물: 8.393-7.887 (총 6H; 6 CONHCH2), 7.775 (m, 2H; NHCH2CH2NH), 6.996 (br. t, 2H; 2 NHCOO), 4.299-3.730 (총 28H; 4 CH2COO, 10 NCH2CO), 3.691 및 3.633 (s, 총 12H; 4 COOCH3), 3.564 (d, J=5.8 Hz, 4H; 2 CH 2NHCOO), 3.129 (m, 4H; NHCH 2CH 2NH), 1.380 (s, 18H; 2 C(CH3)3) ppm.
MS, m/z: 1256 [M+Na], 1271 [M+K].
Boc2MCMG (14) (606 mg, 0.491 mmol)를 CF3COOH (2 ml) 중에 용해시키고, 용액을 실온에서 30분 동안 유지하였다. 트리플루오로아세트산을 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 Et2O로 3회 추출 (Et2O 25 ml에 의한 연화처리, 이어서 여과)하여 잔류 CF3COOH를 제거하고, 수득된 백색 분말을 진공 하에 건조시켰다. 분말을 물 4 mL 중에 용해시킨 다음, 동결-건조시켰다. MCMG (15) (TFA 염)의 수율은 정량적으로 추정하였다 (실제 중량은 수화물의 안정성으로 인해 이론치보다 ~ 10% 더 컸음). TLC: Rf = 0.21 (에탄올/물/피리딘/아세트산 5:1:1:1).
1H NMR (500 MHz, [D2]H2O, 30℃), 이형태체의 혼합물: 4.430-4.014 (총 28H; 4 CH2COO, 10 NCH2CO), 3.911 (s, 4H; 2 COCH 2NH2), 3.823 및 3.772 (s, 총 12H; 4 COOCH3), 3.386의 (m, 4H; NHCH 2CH 2NH) ppm.
MS, m/z: 1034 [M+H], 1056 [M+Na].
물 (20 mL) 중 MCMG (15) (~0.49 mmol)의 용액에, Et3N (0.5 mL)을 첨가하고, 용액을 실온에서 15시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시키고, 잔류물을 세파덱스 LH-20 칼럼 상에서 탈염시켰다 (2종의 방법):
방법 A. 잔류물을 물 (3 ml) 중에 용해시키고, 용액을 세파덱스 LH-20 칼럼 (칼럼 부피 250 mL, 용리액 - MeOH/물 1:1 + 0.05 M 피리딘 아세테이트) 상에서 탈염시켰다. 염으로 오염된 CMG (16)를 함유하는 분획을 개별적으로 합하고, 증발시키고, 잔류물을 다시 탈염시켰다. 순수한 CMG (16)를 함유하는 합한 분획을 ~4 ml 부피로 증발시키고, 동결 건조시켰다. CMG (16) (내부 염)의 수율은 431 mg (90%)이었다.
방법 B. 잔류물을 물 (3 ml) 중에 용해시키고, 용액을 세파덱스 LH-20 칼럼 (칼럼 부피 250 mL, 용리액 - MeOH/물 1:1 + 1% 진한 수성 NH3) 상에서 탈염시켰다. 순수한 CMG (16)를 함유하는 분획을 ~4 ml 부피로 증발시키고, 동결 건조시켰다. 잔류물 (CMG의 암모니아 염 (16))을 iPrOH/물 1:1 혼합물 (10 mL) 중에 용해시키고, Et3N (0.2 mL)을 첨가하고, 용액을 증발 건조시켰다. 이 절차를 2회 반복하고; 잔류물을 물 4 mL 중에 용해시키고, 동결-건조시켰다. CMG (16)의 디-Et3N 염의 수율은 549 mg (95%)이었다.
TLC: Rf = 0.50 (iPrOH/MeOH/아세토니트릴/물 4:3:3:4 + 3% 진한 수성 NH3), 또는 Rf = 0.43 (iPrOH/EtOH/MeOH/물 1:1:1:1, 0.75M NH3).
CMG (16) 내부 염의 1H NMR (500 MHz, [D2]H2O, 30℃), 이형태체의 혼합물: 4.328-4.006 (총 28H; 4 CH2COO, 10 NCH2CO), 3.907 (s, 4H; 2 COCH 2NH2), 3.381 (m, 4H; NHCH 2CH 2NH) ppm.
MS, m/z: 977 [M+H], 999 [M+Na], 1015 [M+K].
반응식 III
Figure 112018056150910-pct00006
반응식 IV
Figure 112018056150910-pct00007
H2N-CMG(16)-DOPE (20)의 제조 (반응식 V)
i-PrOH/물 혼합물 (i-PrOH/물 3:2, 10 mL) 중 CMG (16) (425 mg, 0.435 mmol의 내부 염)의 강하게 교반된 용액에, NaHCO3의 1 M 수성 용액 (0.435 mL, 0.435 mmol) 및 이어서 디클로로에탄 (0.4 mL) 중 DOPE-Ad-OSu (16) (211 mg, 0.218 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, AcOH 0.2 mL로 산성화시키고, 35℃에서 최소 부피로 증발시켰다. 고체 잔류물을 진공 하에 건조시킨 다음 (고체 발포체), CHCl3/MeOH 혼합물로 완전히 추출하였다 (CHCl3/MeOH 4:1, 수회, 10 mL, TLC 제어). 추출된 잔류물은 미반응 CMG(2) 및 염으로 이루어졌다 (CMG (16)의 약 50%를 CMG (16) 합성에 기재된 절차에 따라 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 후 분획 및 잔류물 합한 것의 탈염에 의해 회수하였다.). 합한 CHCl3/MeOH 추출물 (CMG (16)-Ad-DOPE 아민, DOPE-Ad- CMG (16)-Ad-DOPE, N-옥시숙신이미드 및 일부 CMG (16)의 용액)을 진공 하에 증발시키고, 건조시켰다. 수득된 혼합물을 실리카 겔 칼럼 (2.8 x 33 cm, CHCl3/MeOH 5:1 중 실리카 겔 ~ 200 mL) 상에서 분리하였다. 혼합물을 MeOH/CHCl3/물 혼합물 (MeOH/CHCl3/물 6:3:1 + 0.5%의 피리딘)로 칼럼 상에 배치하고, 성분을 단계적 삼원 구배로 용리시켰다: MeOH/CHCl3/물 조성물 6:3:1에서 6:2:1로, 이어서 6:2:2로 (모두 0.5%의 피리딘 포함). DOPE-Ad-CMG(16)-Ad-DOPE를 먼저 용리시키고 (Rf = 0.75, MeOH/CHCl3/물 3:1:1), 이어서 목적 DOPE-Ad-CMG(16) 아민을 용리시키고 (Rf = 0.63, MeOH/CHCl3/물 3:1:1), 마지막으로 CMG (16)를 용리시켰다 (Rf = 0.31, MeOH/CHCl3/물 3:1:1). 순수한 CMG(16)-Ad-DOPE 아민 (20)을 함유하는 분획을 합하고, 증발 건조시켰다. 임의의 저분자량 불순물 및 가용화된 실리카 겔을 제거하기 위해, 잔류물을 iPrOH/물 1:2 혼합물 (2 mL) 중에 용해시키고, 세파덱스 LH-20 칼럼 (칼럼 부피 130 mL, 용리액 - iPrOH/물 1:2 + 0.25%의 피리딘)에 통과시켰다. 순수한 CMG(16)-Ad-DOPE 아민 (20)을 함유하는 분획을 합하고, 증발 (~ 20%의 2-프로판올을 첨가하여 발포를 방지하였음) 건조시키고, 잔류물을 물 (~4 mL) 중에 용해시키고, 동결-건조시켰다. CMG(16)-Ad-DOPE 아민 (20)의 수율은 270 mg (DOPE-Ad-OSu에 대해 68% 또는 CMG(16)에 대해 34%)이었다.
1H NMR (500 MHz, [D2]H2O/[D4]CH3OH 2:1, 30℃): 5.505 (m, 4H; 2 CH2CH=CHCH2), 5.476 (m, 1H; OCH2CHCH2O), 4.626 (dd, Jgem=11.6 Hz, 1H; OCHCHCH2O), 4.461-4.084 (총 37H; 4 CH2COO, 11 NCH2CO, OCHCHCH 2O, OCH2CH2N), 4.002 (s, 2H; COCH 2NH2), 3.573 (m, 4H; NHCH 2CH 2NH), 2.536-2.463 (m, 총 8H; 4 CH2CO), 2.197 (m, 8H; 2 CH 2CH=CHCH 2), 1.807 (m, 8H; 4 CH 2CH2CO), 1.480 (m, 40H; 20 CH2), 1.063 (~t, J
Figure 112018056150910-pct00008
6 Hz, 6H; 2 CH3) ppm.
MS, m/z: 1831 [M+H].
Galili-CMG(2)-DOPE (22)의 제조 (반응식 VI)
건조 DMSO (6 mL) 중 화합물 21 (66 mg, 0.079 mmol)의 교반 용액에 15 μl Et3N 및 분말 H2N-CMG(2)-DOPE (20) (95 mg, 0.0495 mmol)을 3 부분으로 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한 다음, 칼럼 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, i-PrOH-H2O, 1:2, 0.5 v% Py, 0.25 v% AcOH)에 적용하여 조 화합물 22를 Py-염 형태로 수득하고; 화합물을 물로부터 2회 동결건조시킨 다음, 10 ml 물 중에 다시 용해시키고, 화합물 22를 Na-염 형태로 수득하기 위해 pH 6.5가 되도록 NaHCO3의 수용액 (50 mM)을 첨가하고, 용액을 동결건조로 처리하였다. 화합물 22 (Na-염)의 수율은 114 mg (NH2-CMG2-DE를 기준으로 86%)이었다, Rf 0.6 (i-PrOH-MeOH-MeCN-H2O, 4:3:6:4). 1H NMR (도 4) (700 MHz, D2O-CD3OD, 1:1 (v/v), 40℃; 선택된 신호) δ, ppm: 1.05 (t, J 7.03 Hz, 6H; 2 CH 3 ), 1.40-1.58 (m, 40H; 20 CH 2 ), 1.73-1.87 (m, 12H; 2x-COCH2CH 2CH 2CH2CO 및 2x -COCH2CH 2-), 1.90-1.99 (m, 2H; OCH2CH 2CH2N), 2.15-2.25 (m, 11H; 2x -CH 2CH=CHCH 2-, NHC(O)CH 3 ), 2.39-2.59 (2m, 총 12H, 2x-COCH2CH 2CH 2CH2CO- 및 2x-COCH2CH 2-) 4.63 (dd, 1H, J 2.51, J 12.20, C(O)OCHHCHOCH2O-), 4.67 및 4.69 (2dx1H, J1,2 7.81, J1,2 7.95, H-1I, H-1II), 5.30 (d, 1H, J1,2 3.88, H-1III), 5.42-5.46 (m, 1H, -OCH2-CHO-CH2O-), 5.49-5.59 (m, 4H, 2x-CH=CH-); MALDI TOF 질량-스펙트럼, M/Z: 2567 (M+Na); 2583 (M+K); 2589 (MNa+Na); 2605 (MNa+K); 2611 (MNa2+Na).
반응식 V
Figure 112018056150910-pct00009
반응식 VI
Figure 112018056150910-pct00010
실시예 2
화학식 (II)의 화합물 "Galili-T17 DOPE"의 제조
3-트리플루오로아세트아미도프로필-3,4-디-O-아세틸-2,6-디-O-벤질-α-D-갈락토피라노실-(1→3)-2,4-디-O-아세틸-6-O-벤질-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-2-아세트아미도-3-O-아세틸-6-O-벤질-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 (3)의 제조 (반응식 I)
글리코실 수용자 (3-트리플루오로아세트아미도프로필)-2-아세트아미도-3-O-아세틸-6-O-벤질-2-데옥시-4-O-(2,4-디-O-아세틸-6-O-벤질-β-D-갈락토피라노실)-β-D-글루코피라노시드 (2)를 [Pazynina et al. (2008) Russian Journal of Bioorganic Chemistry　34(5),　625-631]의 간행물에 개시된 방법에 따라 제조하였다. 글리코실 수용자 2 (500 mg, 0.59 mmol), 티오갈락토피라노시드 1 (576 mg, 1.18 mmol), NIS (267 mg, 1.18 mmol), 무수 CH2Cl2 (25 ml) 및 분자체 4 Å (500 mg)의 혼합물을 Ar의 분위기 하에 -45℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 무수 CH2Cl2 (0.5 ml) 중 TfOH (21 μl, 0.236 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -45℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 온도를 4시간에 걸쳐 -20℃로 증가시켰다. 혼합물을 -20℃에서 밤새 유지하였다. 이어서, 추가량의 티오갈락토피라노시드 1 (144 mg, 0.295 mmol), NIS (66 mg, 0.295 mmol) 및 TfOH (5 μl, 0.06 mmol)를 첨가하고, 교반을 -20℃에서 2시간 동안 유지한 후에 실온으로 천천히 가온되도록 하였다 (1시간). 이어서, Na2S2O3의 포화 수용액을 첨가하고, 혼합물을 여과하였다. 여과물을 CHCl3 (300 ml)으로 희석하고, H2O (2 x 100 ml)로 세척하고, 목화 울을 통한 여과에 의해 건조시키고, 농축시켰다. LH-20 상에서의 겔 여과 (CHCl3-MeOH)에 의해 생성물 3 (600 mg, 80%)을 백색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR (700 MHz, CDCl3, 특징적인 신호), δ, ppm: 1.78-1.82 (m, 4H, CHCHC, OC(O)CH3), 1.84-1.90 (m, 1H, CHCHC), 1.91, 1.94, 1.97, 1.98, 2.06 (5 s, 5x3H, 4 OC(O)CH3, NH(O)CH3), 3.23-3.30(m, 1H, NCHH), 3.59-3.65 (m, 1H, NCHH), 4.05 (m, 1H, H-2I), 4.33 (d, 1H, J1,2 7.55, H-1I), 4.40 (d, 1H, J 12.04, PhCHH), 4.42 (d, 1H, J1,2 8.07, H-1II), 4.45 (d, 1H, J 11.92, PhCHH), 4.48 (d, 1H, J 12.00, PhCHH), 4.50 (d, 1H, J 12.00, PhCHH), 4.52 (d, 1H, J 12.04, PhCHH), 4.54 (d, 1H, J 12.00, PhCHH), 4.57 (d, 1H, J 12.00, PhCHH), 4.64(d, 1H, J 11.92, PhCHH), 4.99 (dd
Figure 112018056150910-pct00011
t, 1H, J 8.24, H-2II), 5.08-5.13 (m, 2H, H-3I, H-3III), 5.23 (d, 1H, J1,2 3.31, H-1III), 5.46 (d, 1H, J3,4 2.25, H-4II), 5.54 (d, 1H, J3,4 3.11, H-4III), 7.20-7.40 (m, 20H, ArH); 7.49-7.54 (m, 1H, NHC(O)CF3). Rf 0.4 (PhCH3-AcOEt, 1:2).
3-아미노프로필-α-d-갈락토피라노실-(1→3)-β-d-갈락토피라노실-(1→4)-2-아세트아미도-2-데옥시-β-d-글루코피라노시드 (5)의 제조 (반응식 I)
생성물 3 (252 mg, 0.198 mmol)을 젬플렌에 따라 탈아세틸화하고 (8시간, 40℃), AcOH로 중화시키고, 농축시켰다. 수득된 생성물의 TLC (CH3Cl-MeOH, 10:1) 분석은 다음 2개의 반점을 나타냈다: Rf 0.45를 갖는 주요 반점, 및 트리플루오로아세틸의 부분 손실의 지표인 출발 라인 상의 또 다른 것 (닌히드린 양성 반점). 따라서, 생성물을 1시간 동안 MeOH (10 ml) 중 CF3COOMe (0.1 ml) 및 Et3N (0.01 ml)을 사용한 처리에 의해 N-트리플루오로아세틸화하고, 농축시키고, 실리카 겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피 (CHCl3-MeOH, 15:1)에 적용하여 생성물 4를 백색 발포체 (163 mg, 77%)로서 수득하였다, Rf 0.45 (CH3Cl-MeOH, 10:1). 생성물 4를 가수소분해 (200 mg Pd/C, 10 ml MeOH, 2시간)에 적용하고, 여과하고, N-탈플루오로아세틸화하고 (5% Et3N/ H2O, 3시간), 농축시켰다. 다우엑스 50X4-400 상의 양이온-교환 크로마토그래피 (H+) (5% 수성 암모니아로 용리됨)에 의해 생성물 5 (90 mg, 98%)를 백색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR (D2O, 특징적인 신호), δ, ppm: 1.94-1.98 (m, 2H, CCH2C), 2.07 (s, 3H, NHC(O)CH3), 3.11 (m, J 6.92, 2H, NCH2), 4.54 및 4.56 (2d, 2H, J1,2 8.06, J1,2 7.87, H-1I 및 H-1II), 5.16 (d, 1H, J1,2 3.87, H-1III). Rf 0.3 (EtOH-BuOH-Py-H2O-AcOH; 100:10:10:10:3).
반응식 I
Figure 112018056150910-pct00012
(CF3COOH·H-Gly2-NHCH2)4C (9)의 제조 (반응식 II)
테트라아민 (H2N-CH2)4C (7)를 [Litherland and Mann (1938) The amino-derivatives of pentaerythritol Part I. Preparation Journal of the Chemical Society, 1588-95]의 간행물에 개시된 방법에 따라 합성하였다. 1M 수성 NaHCO3 (18.2 ml) 및 i-PrOH (9 ml)의 혼합물 중 테트라아민 7 (500 mg, 1.52 mmol)의 교반 용액에, Boc-GlyGlyNos (6) (4012 mg, 12.18 mmol)를 첨가하였다 (CO2 발생, 발포). 반응 혼합물을 30분 동안 교반한 다음, 1M 수성 NaHCO3 6 ml를 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. (Boc-Gly2-HNCH2)4C (8)의 침전물을 여과하고, 메탄올/물 혼합물 (1:1, 20 ml)로 완전히 세척하고, 진공 하에 건조시켰다. 수율 1470 mg (98%), 백색 고체였다.
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃) δ, ppm: 8.491 (t, J=5.6 Hz, 1H; NHCO),7.784 (t, J=6.6 Hz, 1H; C-CH2-NHCO), 6.858 (t, J=6 Hz, 1H; NHCOO), 3.696 (d, J=5.6 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.675 (d, J=6 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 2.685 (d, J=6.6 Hz, 2H; C-CH 2NH), 1.375 (s, 9H; C(CH3)3.
(Boc-Gly2-HNCH2)4C (8) (1450 mg, 1.466 mmol)를 CF3COOH (5 ml) 중에 용해시키고, 용액을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 트리플루오로아세트산을 진공 하에 제거하고, 잔류물을 (CH3CH2)2O로 3회 추출 (30분 동안 (CH3CH2)2O 30 ml와 함께 약한 교반, 이어서 경사분리)하여 잔류 CF3COOH를 제거하였다. 고체 잔류물을 진공 하에 건조시키고, 물의 최소 부피 중에 용해시키고, 세파덱스 LH-20 칼럼에 통과시키고, 물로 용리시켰다. 생성물 9를 함유하는 분획을 합하고, 약 5 ml로 증발시키고, 동결 건조시켰다. 수율 1424 mg (93%), 백색 고체였다. TLC: Rf 0.5 (에탄올/진한 NH3; 2:1 (v/v)).
1H NMR (500 MHz, [D2]H2O, 30℃) δ, ppm: 4.028 (s, 2H; COCH 2NH), 3.972 (s, 2H; COCH 2NH), 2.960 (s, 2H; C-CH 2NH).
반응식 II
Figure 112018056150910-pct00013
{[2-(2-tert-부톡시카르보닐아미노-아세틸아미노)-아세틸]-메톡시카르보닐메틸-아미노}-아세트산 메틸 에스테르 (11)의 제조 (반응식 III)
DMF (15 ml) 중 (메톡시카르보닐메틸-아미노)-아세트산 메틸 에스테르 히드로클로라이드 (10) (988 mg, 5 mmol)의 교반 용액에 Boc-GlyGlyNos (6) (3293 mg, 10 mmol)를 첨가하고, (CH3CH2)3N (3475 μL, 25 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, o-크실렌 (70 ml)으로 희석하고, 증발시켰다. 실리카 겔 상에서의 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (톨루엔 중에 팩킹되고, 에틸 아세테이트로 용리됨)에 의해 조 생성물을 생성하였다. 조 생성물을 클로로포름 중에 용해시키고, 물, 0.5 M NaHCO3 및 포화 KCl로 순차적으로 세척하였다. 클로로포름 추출물을 증발시키고, 생성물을 실리카 겔 칼럼 상에서 정제하였다 (클로로포름 중에 팩킹되고, 15:1 (v/v) 클로로포름/메탄올로 용리됨). 분획을 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켜 생성물 11의 무색 농후한 시럽을 수득하였다. 수율 1785 mg, (95%). TLC: Rf=0.49 (7:1 (v/v) 클로로포름/메탄올).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃) δ, ppm: 7.826 (t, J=5.1 Hz, 1H; NHCO), 6.979 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.348 및 4.095 (s, 2H; NCH 2COO), 3.969 (d, J=5.1 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.689 및 3.621 (s, 3H; OCH 3), 3.559 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 1.380 (s, 9H; C(CH3)3).
{[2-(2-tert-부톡시카르보닐아미노-아세틸아미노)-아세틸]-메톡시카르보닐메틸-아미노}-아세트산 (12)의 제조 (반응식 III)
메탄올 (25 ml) 중 11 (1760 mg, 4.69 mmol)의 교반 용액에, 0.2 M 수성 NaOH (23.5 ml)를 첨가하고, 용액을 실온에서 5분 동안 유지하였다. 이어서, 용액을 아세트산 (0.6 ml)으로 산성화시키고, 증발 건조시켰다. 실리카 겔 상에서의 잔류물의 칼럼 크로마토그래피 (에틸 아세테이트 중에 팩킹되고, 2:3:1 (v/v/v) i-PrOH/에틸 아세테이트/물로 용리됨)에 의해 회수된 11 (63 mg, 3.4%) 및 목적 화합물 12 (1320 mg)를 생성하였다. 이어서, 중간체 생성물을 메탄올/물/피리딘 혼합물 (20:10:1, 30 ml) 중에 용해시키고, 이온 교환 칼럼 (다우엑스 50X4-400, 피리딘 형태, 5 ml)에 통과시켜 잔류 나트륨 양이온을 제거하였다. 이어서, 칼럼을 동일한 용매 혼합물로 세척하고, 용리액을 증발시키고, 잔류물을 클로로포름/벤젠 혼합물 (1:1, 50 ml) 중에 용해시킨 다음, 증발시키고, 진공 하에 건조시켰다. 생성물 12의 수율은 1250 mg (74%), 백색 고체였다. TLC: Rf 0.47 (4:3:1 (v/v/v) i-PrOH/에틸 아세테이트/물).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃), N-카르복시메틸글리신 단위의 시스- 및 트랜스- 이형태체의 혼합물 약 3:1. 주요 이형태체; δ, ppm: 7.717 (t, J=5 Hz, 1H; NHCO), 7.024 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.051 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 3.928 (d, J=5 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.786 (s, 2H; NCH 2COOH), 3.616 (s, 3H; OCH 3), 3.563 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 1.381 (s, 9H; C(CH3)3) ppm; 부차 이형태체, δ = 7.766 (t, J=5 Hz, 1H; NHCO), 7.015 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.288 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 3.928 (d, J=5 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.858 (s, 2H; NCH 2COOH), 3.676 (s, 3H; OCH 3), 3.563 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 1.381 (s, 9H; C(CH3)3).
{[2-(2-tert-부톡시카르보닐아미노-아세틸아미노)-아세틸]-메톡시카르보닐메틸-아미노}-아세트산 N-옥시숙신이미드 에스테르 (Boc-Gly2(MCMGly)Nos) (13)의 제조 (반응식 III)
DMF (10 ml) 중 12 (1200 mg, 3.32 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (420 mg, 3.65 mmol)의 빙냉 교반 용액에 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (754 mg, 3.65 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안, 이어서 실온에서 2시간 동안 교반하였다. N,N'-디시클로헥실우레아의 침전물을 여과해내고, DMF (5 ml)로 세척하고, 여과물을 최소 부피로 증발시켰다. 이어서, 잔류물을 (CH3CH2)2O (50 ml)와 함께 1시간 동안 교반하고, 에테르 추출물을 경사분리에 의해 제거하였다. 잔류물을 진공 하에 건조시켜 에스테르 13 (1400 mg, 92%)을 백색 발포체로서 수득하였다. TLC: Rf 0.71 (40:1 (v/v) 아세톤/아세트산).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃), N-카르복시메틸글리신 단위의 시스- 및 트랜스- 이형태체의 혼합물 약 3:2.
주요 이형태체; δ, ppm: 7.896 (t, J=5.1 Hz, 1H; NHCO), 6.972 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.533 (s, 2H; NCH 2COON), 4.399 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 3.997 (d, J=5.1 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.695 (s, 3H; OCH 3), 3.566 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 1.380 (s, 9H; C(CH3)3).
부차 이형태체; δ, ppm: 7.882 (t, J=5.1 Hz, 1H; NHCO), 6.963 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.924 (s, 2H; NCH 2COON), 4.133 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 4.034 (d, J=5.1 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.632 (s, 3H; OCH 3), 3.572 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 1.380 (s, 9H; C(CH3)3).
에스테르 11 (1380 mg)을 DMSO 중에 용해시켜 6 ml의 부피를 제공하고, 0.5 M 용액으로서 사용하였다 (-18℃에서 저장됨).
반응식 III
Figure 112018056150910-pct00014
{CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]Gly2-NHCH2}4C (15)의 제조 (반응식 IV)
DMSO (2 ml) 중 (CF3COOH·H-Gly2-HNCH2)4C (9) (277 mg, 0.265 mmol)의 교반 용액에, 에스테르 11 (1.591 mmol, DMSO 중 0.5 M 용액 3.18 ml) 및 (CH3CH2)3N (295 μL, 2.121 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 150 μL AcOH로 산성화시키고, 용매를 진공 하게 제거하였다 (동결 건조). 잔류물을 (CH3CH2)2O로 3회 추출하였다 (30분 동안 (CH3CH2)2O 20 ml와 함께 약한 교반, 이어서 경사분리). 고체 잔류물을 아세톤의 최소 부피 중에 용해시키고, 실리카 겔 칼럼 상에서 분획화하였다 (아세톤 중에 팩킹되고, 아세톤, 20:2:1 (v/v/v) 아세톤/메탄올/물 및 15:2:1 (v/v/v) 아세톤/메탄올/물로 용리됨). 선택된 분획을 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켰다. 순수한 {Boc-[Gly2(MCMGly)]Gly2-NHCH2}4C (14)의 수율은 351 mg (68%), 백색 고체였다. TLC: Rf 0.38 (15:2:1 (v/v/v) 아세톤/메탄올/물).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃), 쇄 중 N-카르복시메틸글리신 단위의 시스- 및 트랜스- 이형태체의 혼합물 약 3:2.
주요 이형태체; δ, ppm: 8.593 (t, J=5 Hz, 1H; NHCO), 8.335 (t, J=5.4 Hz, 1H; NHCO), 7.821 (t, J=6.4 Hz, 1H; C-CH2-NHCO), 7.786 (t, J=5.1 Hz, 1H; NHCO), 6.993 (t, J=6 Hz, 1H; NHCOO), 4.139 (s, 2H; NCH 2CO), 4.074 (s, 2H; NCH 2COO(CH3)), 3.985 (d, J=5 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.887 (d, J=5.4 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.726 (d, J=5.1 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.634 (s, 3H; OCH 3), 3.567 (d, J=6 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 2.686 (넓은 d, J=6.4 Hz, 2H; C-CH 2NH), 1.379 (s, 9H; C(CH3)3).
부차 이형태체; δ, ppm: 8.511 (t, J=5 Hz, 1H; NHCO), 8.158 (t, J=5.4 Hz, 1H; NHCO), 7.821 (t, J=6.4 Hz, 1H; C-CH2-NHCO), 7.786 (t, J=5.1 Hz, 1H; NHCO), 6.993 (t, J=6 Hz, 1H; NHCOO), 4.292 (s, 2H; NCH 2CO), 3.998 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 3.954 (d, J=5 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.826 (d, J=5.4 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.715 (d, J=5.1 Hz, 2H; COCH 2NH), 3.692 (s, 3H; OCH 3), 3.567 (d, J=6 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 2.686 (넓은 d, J=6.4 Hz, 2H; C-CH 2NH), 1.379 (s, 9H; C(CH3)3).
{Boc-[Gly2(MCMGly)]Gly2-NHCH2}4C (14) (330 mg, 0.168 mmol)를 CF3COOH (2 ml) 중에 용해시키고, 용액을 실온에서 40분 동안 유지하였다. 트리플루오로아세트산을 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 (CH3CH2)2O로 3회 추출 (30분 동안 (CH3CH2)2O 20 ml와 함께 약한 교반, 이어서 경사분리)하여 잔류 CF3COOH를 제거한 다음, 진공 하에 건조시켰다. {CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]Gly2-NHCH2}4C (15)의 수율은 337 mg (99%), 백색 고체였다.
1H NMR (500 MHz, [D2]H2O, 30℃), 쇄 중 N-카르복시메틸글리신 단위의 시스- 및 트랜스- 이형태체의 혼합물 약 11:10.
주요 이형태체; δ, ppm: 4.370 (s, 2H; NCH 2CO), 4.265 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 4.215 (s, 2H; COCH 2NH), 4.138 (s, 2H; COCH 2NH), 3.968 (s, 2H; COCH 2NH), 3.919 (s, 2H; COCH 2NH2 +), 3.775 (s, 3H; OCH 3), 2.914 (s, 2H; C-CH 2NH).
부차 이형태체; δ, ppm: 4.431 (s, 2H; NCH 2CO), 4.241 (s, 2H; NCH 2COOCH3), 4.239 (s, 2H; COCH 2NH), 4.074 (s, 2H; COCH 2NH), 3.960 (s, 2H; COCH 2NH), 3.919 (s, 2H; COCH 2NH2 +), 3.829 (s, 3H; OCH 3), 2.914 (s, 2H; C-CH 2NH).
반응식 IV
Figure 112018056150910-pct00015
{CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]2Gly2-NHCH2}4C의 제조 (반응식 V)
DMSO (2 ml) 중 (CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]Gly2-HNCH2)4C (15) (272 mg, 0.135 mmol)의 교반 용액에, 에스테르 (13) (0.809 mmol, DMSO 중 0.5 M 용액 1.62 ml) 및 (CH3CH2)3N (112 μL, 0.809 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 70 μL AcOH로 산성화시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다 (동결 건조). 잔류물을 (CH3CH2)2O로 3회 추출하였다 (30분 동안 (CH3CH2)2O 15 ml와 함께 약한 교반, 이어서 경사분리). 고체 잔류물을 7:1 (v/v) 아세톤/메탄올 혼합물의 최소 부피 중에 용해시키고, 실리카 겔 칼럼 상에서 분획화하였다 (아세톤 중에 팩킹되고, 7:1 (v/v) 아세톤/메탄올, 10:2:1 (v/v/v), 9:2:1 (v/v/v), 8:2:1 (v/v/v) 아세톤/메탄올/물로 용리됨). 선택된 분획을 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켰다. 순수한 {Boc-[Gly2(MCMGly)]2Gly2-NHCH2}4C (16)의 수율은 279 mg (71%), 백색 고체였다. TLC: Rf 0.42 (8:2:1 (v/v/v) 아세톤/메탄올/물).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃), 쇄당 2개의 N-카르복시메틸-글리신 단위에 의한 이형태체의 혼합물, δ, ppm: 8.604, 8.519, 8.397, 8.388, 8.346, 8.211, 8.200, 8.167, 8.034, 8.024, 7.925, 7.912, 7.819 및 7.773 (t, 6H; 6 NHCO), 6.992 (t, J=5.9 Hz, 1H; NHCOO), 4.302-3.723 (18H; 2 NCH 2CO, 2 NCH 2COOCH3, 5 COCH 2NH), 3.692, 3.689 및 3.632 (s, 6H; 2 OCH 3), 3.566 (d, J=5.9 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 2.686 (넓은 d, 2H; C-CH 2NH), 1.380 (s, 9H; C(CH3)3).
{Boc-[Gly2(MCMGly)]2Gly2-NHCH2}4C (16) (269 mg, 91.65 μmol)를 CF3COOH (2 ml) 중에 용해시키고, 용액을 실온에서 40분 동안 유지하였다. 트리플루오로아세트산을 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 (CH3CH2)2O로 3회 추출 (30분 동안 (CH3CH2)2O 15 ml와 함께 약한 교반, 이어서 경사분리)하여 잔류 CF3COOH를 제거한 다음, 진공 하에 건조시켰다. {CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]2Gly2-NHCH2}4C의 수율은 270 mg (98%), 백색 고체였다.
1H NMR (500 MHz, [D2]H2O, 30℃), 쇄당 2개의 N-카르복시메틸-글리신 단위에 의한 이형태체의 혼합물, δ, ppm: 4.441-3.963 (단일선, 18H; 2 NCH 2CO, 2 NCH 2COOCH3, 5 COCH 2NH), 3.920 (s, 2H; COCH 2NH2 +), 3.833, 3.824, 3.780 및 3.773 (s, 6H; 2 OCH 3), 2.918 (s, 2H; C-CH 2NH).
{CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]3Gly2-NHCH2}4C의 제조 (반응식 V)
DMSO (2 ml) 중 (CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]2Gly2-HNCH2)4C (175 mg, 58.5 μmol)의 교반 용액에, 에스테르 13 (0.351 mmol, DMSO 중 0.5 M 용액 0.702 ml) 및 (CH3CH2)3N (49 μL, 0.351 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 30 μL AcOH로 산성화시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다 (동결 건조). 잔류물을 1:1 (v/v) 아세토니트릴/물의 혼합물의 최소 부피 중에 용해시키고, 세파덱스 LH-20 칼럼 상에서 분획화하였다 (1:1 (v/v) 아세토니트릴/물로 용리됨). 선택된 분획을 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켰다. 순수한 {Boc-[Gly2(MCMGly)]3Gly2-NHCH2}4C의 수율은 279 mg (71%), 백색 고체였다. TLC: Rf 0.42 (8:2:1 (v/v/v) 아세톤/메탄올/물). {Boc-[Gly2(MCMGly)]3Gly2-NHCH2}4C를 함유하는 분획을 합하고, 약 2 ml 부피로 증발시키고, 동결 건조시켰다. 초기 수율은 215 mg (94%)이었다. 실리카 겔 칼럼 상에서의 추가의 정제 (아세토니트릴 중에 팩킹되고, 4:5:2 (v/v/v) i-PrOH/아세토니트릴/물로 용리됨)에 의해 Boc-[Gly2(MCMGly)]3Gly2-NHCH2}4C 169 mg (수율 74%, 백색 고체)을 수득하였다. TLC: Rf 0.45 (4:5:2 (v/v/v) i-PrOH/아세토니트릴/물).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃), 쇄당 3개의 N-카르복시메틸-글리신 단위에 의한 이형태체의 혼합물, δ, ppm: 8.594-7.772 (삼중선, 함께 8H; 8 NHCO), 6.989 (t, J=5.6 Hz, 1H; NHCOO), 4.303-3.722 (26H; 3 NCH 2CO, 3 NCH 2COOCH3, 7 COCH 2NH), 3.692 및 3.632 (s, 9H; 3 OCH 3), 3.565 (d, J=5.6 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 2.687 (넓은 d, 2H; C-CH 2NH), 1.380 (s, 9H; C (CH3)3).
{Boc-[Gly2(MCMGly)]3Gly2-NHCH2}4C (146 mg, 37.36 μmol)를 CF3COOH (1 ml) 중에 용해시키고, 용액을 실온에서 40분 동안 유지하였다. 트리플루오로아세트산을 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 (CH3CH2)2O로 3회 추출 (30분 동안 (CH3CH2)2O 10 ml와 함께 약한 교반, 이어서 경사분리)하여 잔류 CF3COOH를 제거한 다음, 진공 하에 건조시켰다. {CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]3Gly2-NHCH2}4C의 수율은 147 mg (99%), 백색 고체였다.
1H NMR (500 MHz, [D2]H2O, 30℃), 쇄당 3개의 N-카르복시메틸-글리신 단위에 의한 이형태체의 혼합물, δ, ppm: 4.446-3.964 (단일선, 26H; 3 NCH 2CO, 3 NCH 2COOCH3, 7 COCH 2NH), 3.924 (s, 2H; COCH 2NH2 +), 3.836, 3.828, 3.824, 3.783, 3.778 및 3.773 (s, 9H; 3 OCH 3), 2.919 (s, 2H; C-CH 2NH).
{CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]4Gly2-NHCH2}4C의 제조 (반응식 V)
DMSO (1 ml) 중 (CF3COOH·H-Gly2(MCMGly)]3-HNCH2)4C (68 mg, 17.16 μmol)의 교반 용액에, 에스테르 13 (0.137 mmol, DMSO 중 0.5 M 용액 0.275 ml) 및 (CH3CH2)3N (14.3 μL, 0.103 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 100 μL AcOH로 산성화시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다 (동결 건조). 잔류물을 1:1 (v/v) 아세토니트릴/물의 혼합물 (0.25% AcOH)의 최소 부피 중에 용해시키고, 세파덱스 LH-20 칼럼 상에서 분획화하였다 (1:1 (v/v) 아세토니트릴/물 (0.25% AcOH)을 사용하여 용리됨). {Boc-[Gly2(MCMGly)]4Gly2-NHCH2}4C를 함유하는 분획을 합하고, 약 2 ml 부피로 증발시키고, 동결 건조시켰다. 수율은 81 mg (96%), 백색 고체였다. TLC: Rf 0.24 (4:5:2 (v/v/v) i-PrOH/아세토니트릴/물).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃), 쇄당 4개의 N-카르복시메틸-글리신 단위에 의한 이형태체의 혼합물, δ, ppm: 8.590-7.773 (삼중선, 10H; 10 NHCO), 6.989 (t, J=5.6 Hz, 1H; NHCOO), 4.303-3.722 (34H; 4 NCH 2CO, 4 NCH 2COOCH3, 9 COCH 2NH), 3.691 및 3.631 (s, 12H; 4 OCH 3), 3.565 (d, J=5.6 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 2.684 (넓은 d, 2H; C-CH 2NH), 1.379 (s, 9H; C(CH3)3).
{Boc-[Gly2(MCMGly)]4Gly2-NHCH2}4C (74 mg, 15.16 μmol)를 CF3COOH (1 ml) 중에 용해시키고, 용액을 실온에서 40분 동안 유지하였다. 트리플루오로아세트산을 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 (CH3CH2)2O로 3회 추출 (30분 동안 (CH3CH2)2O 10 ml와 함께 약한 교반, 이어서 경사분리)하여 잔류 CF3COOH를 제거한 다음, 진공 하에 건조시켰다. {CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]4Gly2-NHCH2}4C의 수율은 72 mg (96%), 백색 고체였다.
1H NMR (500 MHz, [D2]H2O, 30℃), 쇄당 4개의 N-카르복시메틸-글리신 단위에 의한 이형태체의 혼합물, δ, ppm: 4.446-3.964 (단일선, 34H; 4 NCH 2CO, 4 NCH 2COOCH3, 9 COCH 2NH), 3.925 (s, 2H; COCH 2NH2 +), 3.836, 3.829, 3.827, 3.822, 3.783, 3.779, 3.777 및 3.772 (s, 12H; 4 OCH 3), 2.919 (s, 2H; C-CH 2NH).
{CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]5Gly2-NHCH2}4C (23)의 제조 (반응식 V)
DMSO (1 ml) 중 (CF3COOH·H-Gly2(MCMGly)]4-HNCH2)4C (16.8 mg, 3.403 μmol)의 교반 용액에, 에스테르 13 (27.2 μmol, DMSO 중 0.5 M 용액 63 μl) 및 (CH3CH2)3N (3 μl, 21.6 μmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 100 μL AcOH로 산성화시키고, 용매를 진공 하에 제거하였다 (동결 건조). 잔류물을 1:1 (v/v) 아세토니트릴/물의 혼합물 (0.25% AcOH)의 최소 부피 중에 용해시키고, 세파덱스 LH-20 칼럼 상에서 분획화하였다 (1:1 (v/v) 아세토니트릴/물 (0.25% AcOH)로 용리됨). {Boc-[Gly2(MCMGly)]5Gly2-NHCH2}4C (22)를 함유하는 분획을 합하고, 약 1 ml 부피로 증발시키고, 동결 건조시켰다. 수율은 19 mg (95%), 백색 고체였다. TLC: Rf 0.15 (4:3:2 (v/v/v) i-PrOH/아세토니트릴/물).
1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO, 30℃), 쇄당 5개의 N-카르복시메틸-글리신 단위에 의한 이형태체의 혼합물, δ, ppm: 8.595-7.772 (삼중선, 12H; 12 NHCO), 6.989 (t, J=5.6 Hz, 1H; NHCOO), 4.303-3.723 (42H; 5 NCH 2CO, 5 NCH 2COOCH3, 11 COCH 2NH), 3.692 및 3.631 (s, 15H; 5 OCH 3), 3.565 (d, J=5.6 Hz, 2H; COCH 2NHCOO), 2.686 (넓은 d, 2H; C-CH 2NH), 1.380 (s, 9H; C(CH3)3).
{Boc-[Gly2(MCMGly)]5Gly2-NHCH2}4C (22) (19 mg, 3.25 μmol)를 CF3COOH (0.5 ml) 중에 용해시키고, 용액을 실온에서 40분 동안 유지하였다. 트리플루오로아세트산을 진공 하에 증발시키고, 잔류물을 (CH3CH2)2O로 3회 추출 (30분 동안 (CH3CH2)2O 5 ml와 함께 약한 교반, 이어서 경사분리)하여 잔류 CF3COOH를 제거한 다음, 진공 하에 건조시켰다. {CF3COOH·H-[Gly2(MCMGly)]5Gly2-NHCH2}4C (23)의 수율은 20 mg (99%), 백색 고체였다.
1H NMR (500 MHz, [D2]H2O, 30℃), 쇄당 5개의 N-카르복시메틸-글리신 단위에 의한 이형태체의 혼합물, δ, ppm: 4.446-3.965 (단일선, 42H; 5 NCH 2CO, 5 NCH 2COOCH3, 11 COCH 2NH), 3.924 (s, 2H; COCH 2NH2 +), 3.835, 3.829, 3.827, 3.825, 3.823, 3.783, 3.779, 3.777 및 3.773 (s, 15H; 5 OCH 3), 2.919 (s, 2H; C-CH 2NH).
[CF3COOH·H-(Gly2CMGly)5Gly2-NHCH2]4C, Et3N-염 (24)의 제조 (반응식 V)
물 (26 mL) 중 생성물 23 (463 mg, 0.07835 mmol)의 용액에, Et3N (523 μL, 3.761 mmol)을 첨가하고, 용액을 실온에서 18시간 동안 유지하였다. 증발시킨 후, 잔류물을 진공 하에 동결-건조시켰다. 생성물 24의 수율은 587 mg (98%), 백색 고체였다. TLC: Rf 0.39 (1:2:1 (v/v/v) CHCl3/MeOH/물).
1H NMR (600 MHz, [D2]H2O, 30℃) δ, ppm: 4.309-3.919 (176 H; 20 NCH 2CO, 20 NCH 2COOH, 48 COCH 2NH), 3.226 (q, 120 H, J = 7.3 Hz; 60 NCH 2CH3), 2.964 (넓은 s, 8 H; 4 C-CH 2NH), 1.305 (t, 180 H, J = 7.3 Hz; 60 NCH2CH 3).
MALDI TOF 질량-스펙트럼, M/Z: 5174, M+H; 5196, M+Na.
반응식 V
Figure 112018056150910-pct00016
활성화된 1,2-O-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민 (DE-Ad-OSu)(27)의 제조 (반응식 VI)
건조 N,N-디메틸포름아미드 (1.5 ml) 중 비스(N-히드록시숙신이미딜) 아디페이트 (25) (70 mg, 205 μmol)의 용액에, 클로로포름 (1.5 ml) 중 1,2-O-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민 (7) (40 μmol)을 첨가하고, 이어서 트리에틸아민 (7 μl)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 유지한 다음, 아세트산으로 중화시키고, 진공 하에 부분적으로 농축시켰다. 잔류물의 칼럼 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, 1:1 클로로포름-메탄올, 0.2% 아세트산)에 의해 생성물 27 (37 mg, 95%)을 무색 시럽으로서 수득하였다.
반응식 VI
Figure 112018056150910-pct00017
1H NMR (CDCl3/CD3OD, 2:1) 5.5 (m, 4H, 2x(-CH=CH-), 5.39 (m, 1H, -OCH2-CHO-CH2O-), 4.58 (dd, 1H, J=3.67, J=11.98, -CCOOHCH-CHO-CH2O-), 4.34 (dd, 1H, J=6.61, J=11.98, -CCOOHCH-CHO-CH2O-), 4.26 (m, 2H, PO-CH 2 -CH2-NH2), 4.18 (m, 2H, -CH 2 -OP), 3,62 (m, 2H, PO-CH2-CH 2 -NH2), 3.00 (s, 4H, ONSuc), 2.8 (m, 2H, -CH 2 -CO (Ad), 2.50 (m, 4H, 2x(-CH 2 -CO), 2.42 (m, 2H, -CH 2 -CO (Ad), 2.17 (m, 8H, 2x(-CH 2 -CH=CH-CH 2 -), 1.93 (m, 4H, COCH2CH 2 CH 2 CH2CO), 1.78 (m, 4H, 2x(COCH2CH 2 -), 1,43, 1.47 (2 bs, 40H, 20 CH2), 1.04 (m, 6H, 2 CH3). Rf 0.5 (클로로포름-메탄올-물, 6:3:0.5.
[H-(Gly2CMGly)5Gly2-NHCH2]3[DE-CO(CH2)4CO-(Gly2CMGly)5Gly2-NHCH2]C, Na, Et3N-염 (28)의 제조 (반응식 VI)
물/2-프로판올 혼합물 (16 mL, 2:3) 중 생성물 24 (522 mg, 0.06821 mmol)의 교반 용액에 1M NaHCO3 (547 μL, 0.547 mmol) 및 디클로로에탄 (368 μL) 중 DE-Ad-OSu (27) (66.1 mg, 0.06821 mmol)의 용액을 첨가하고, 용액을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. AcOH (94 μL)를 사용한 산성화 후, 용액을 증발시키고, 잔류물을 진공 하에 건조시켰다. 건조된 혼합물을 물/MeOH (15:1) 3 mL 중에 용해시키고, C18 역상 칼럼 (75% MeOH에 이어서 물/MeOH 15:1로 세척되는 ~45 mL의 상) 상에 놓았다. 물질을 물/MeOH (15:1 - 50 mL; 9:1 - 50 mL; 7.5:2.5 - 50 mL; 1:1 - 50 mL; 2.5:7.5 - 100 mL)로 순차적으로 용리시켰다. 미반응 24를 물/MeOH 15:1로 용리시키고 (NMR 데이터에 의한 Na 염, 116 mg, 30.8%의 회수율), 물/MeOH 9:1로 용리시켰다 (NMR 데이터에 의한 Et3N 염, 63 mg, 13.6%의 회수율). 목적 (H-CMG5)3C(CMG5-Ad-DE) (28)를 물/MeOH 1:1로 용리시켰다. 순수한 동결-건조된 생성물 28의 수율은 135 mg ((24)에 대해 25.5%), 백색 고체였다. TLC (1:2:1 (v/v/v) MeOH/에틸 아세테이트/물): 24 Rf 0.06; 28 Rf 0.17.
(H-CMG5)3C(CMG5-Ad-DE) Na1(Et3N)20 (28): 1H NMR (700 MHz, [D2]H2O/[D4]CH3OH 2:1 (v/v), 30℃) δ, ppm: 5.561 (m, 4 H; DE의 2 시스 CH=CH), 5.454 (m, 1 H; DE의 OCH2-CH(OCO)CH2O), 4.629 (dd, 1 H, J = 12.3 Hz / 2 Hz; DE의 OCH2-CH(OCO)CHOCO), 4.462-4.057 (181 H; 20 NCH 2CO, 20 NCH 2COOH, 48 COCH 2NH, DE의 OCH 2-CH(OCO)CHOCO, DE의 OCH 2CH2NH), 3.597 (t, 2 H, J= 5 Hz; DE의 OCH2CH 2NH), 3.226 (q, 102 H, J = 7.3 Hz; 51 NCH 2CH3), 3.099 (넓은 s, 8 H; 4 C-CH 2NH), 2.557, 2.532, 2.522 및 2.456 (삼중선, 총 8 H; 4 CO-CH 2CH2), 2.203 (~dd, 8 H, J = 12 Hz / 5.8 Hz; DE의 2 CH 2-CH=CH-CH 2), 1.807 및 1.783 (다중선, 8 H; 4 CO-CH2CH 2), 1.526 및 1.475 (중첩 m 및 t, 총 193 H; m, DE의 20 CH2; t, J = 7.3 Hz, 51 NCH2CH 3), 1.063 (t, 6 H, J = 7 Hz; DE의 2 CH3).
MALDI TOF 질량-스펙트럼, M/Z: 6028, M+H; 6050, M+Na.
반응식 VII
Figure 112018056150910-pct00018
Galili-T-17-DE (30)의 제조 (반응식 VII)
H2O (0.75 ml) 중 화합물 28 (4.3 mg, 5 μmol) 및 Et3N (0.5 μl)을 1.5시간 동안 3 부분으로 건조 DMSO (0.3 mL) 중 화합물 29 (5 mg, 6 μmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한 다음, 칼럼 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, MeOH-H2O, 3:7)로 처리하여 조 생성물 30을 수득하였다. 생성물을 물로부터 동결건조시키고, 잔류물을 물 3 ml 중에 용해시키고, pH 6.5가 되도록 NaHCO3의 수용액 (10 mM)을 첨가하고, 용액을 동결건조시켜 3.7 mg의 화합물 30을 Na-염으로서 수득하였다.
1H NMR (700 MHz, D2O/CD3OD, 2:1 (v/v), 선택된 화학적 이동) δ, ppm: 1.06 (t, J 7.03 Hz, DE의 CH 3 ), 1.28-1.61 (m, DE의 CH 2 ), 1.71-1.88 (m, -COCH2CH 2CH 2CH2CO 및 -COCH2CH 2-), 1.90-1.99 (m, OCH2CH 2CH2N), 2.13-2.27 (m, -CH 2CH=CHCH 2-, NHC(O)CH 3 ), 2.35-2.58 (m, COCH2CH 2CH 2CH2CO- 및 -COCH2CH 2-), 2.93-3.24 (넓은 s, 8 H; 4 C-CH 2NH), 4.63 (dd, J 2.49, J 12.32, C(O)OCHHCHOCH2O-), 4.67 및 4.70 (2d, J1,2 7.81, J1,2 7.95, H-1I, H-1II), 5.30 (d, J1,2 3.92, H-1III), 5.42-5.47 (m, -OCH2-CHO-CH2O-), 5.52-5.58 (m, 4H, 2x-CH=CH-). MALDI TOF 질량-스펙트럼, M/Z: 8188 (M+Na); 8204 (M+K); 8226 (MNa+K).
실시예 3
화학식 (III)의 화합물 "GalNAc-Gal-GlcNAc-Ad-DOPE"의 제조
3-아미노프로필 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노실-(1→3)-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-2-아세트아미도-2-데옥시-β-D-글루코피라노시드 (5)의 제조 (반응식 I)
글리코실 클로라이드 3,4,6-트리-O-아세틸-2-아지도-2-데스옥시-β-D-갈락토피라노실클로라이드 (1)를 [Paulsen et al. (1978) Darstellung selektiv blockierter 2-azido-2-desoxy-d-gluco-und-d-galactophyranosylhalogenide: Reaktivitaet und 13C-NMR-Spektren Carbohydrate Research, 64, 339-364]의 간행물에 개시된 방법에 따라 제조하였다. 글리코실 수용자 (3-트리플루오로아세트아미도프로필)-2-아세트아미도-3-O-아세틸-6-O-벤질-2-데옥시-4-O-(2,4-디-O-아세틸-6-O-벤질-β-D-갈락토피라노실)-β-D-글루코피라노시드 (2)를 [Pazynina et al. (2008) Russian Journal of Bioorganic Chemistry　34(5),　625-631]의 간행물에 개시된 방법에 따라 제조하였다.
건조 디클로로메탄 (20 ml) 중 글리코실 수용자 (420 mg, 0.5 mmol), 은 트리플레이트 (257 mg, 1.0 mmol), 테트라메틸우레아 (120 μl, 1.0 mmol) 및 새로이 하소된 분자체 4 Å의 용액을 실온에서 암흑 하에 30분 동안 교반하였다. 또 다른 부분의 체 4 Å을 첨가하고, 건조 디클로로메탄 (3 ml) 중 글리코실 클로라이드 (350 mg, 1.0 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 메탄올 (4 x 10 ml)로 세척한 다음, 용매를 증발시켰다. 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피 (클로로포름 중 5-7% 이소프로판올로 용리됨)에 의해 407 mg (70%)의 생성물 3을 아노머의 혼합물로서 수득하였다 (1H NMR 분광법에 의해 결정된 바와 같은 α/β=3.0).
메탄올 (30 ml) 중 생성물 3 (407 mg, 0.352 mmol)의 용액을 16시간 동안 400 mg 10% Pd/C 상의 가수소분해에 적용하였다. 이어서, 수지를 여과해내고, 메탄올 (4 x 10 ml)로 세척하고, 생성물을 진공 하에 농축시켰다. 건조 잔류물을 2:1 피리딘-아세트산 무수물 혼합물 (6 ml)로 20℃에서 16시간 동안 아세틸화하였으며, 시약은 톨루엔과 함께 공증발되었다. 실리카 겔 상에서의 2개의 크로마토그래피 단계 (에틸 아세테이트 중 10% 이소프로판올 및 클로로포름 중 5-10% 메탄올로 용리됨)에 의해 생성물 4 160 mg (42%) 및 생성물 4β 39 mg (10%)을 수득하였다.
메탄올 (200 μl) 중 2 M 소듐 메틸레이트의 용액을 건조 메탄올 (4 ml) 중 생성물 4 (160 mg, 0.149 mmol)의 용액에 첨가하였다. 용액을 1시간 후에 증발시키고, 4 ml 물을 첨가하고, 용액을 16시간 동안 유지한 후에 다우엑스-H+ 칼럼 상에서 크로마토그래피하였다 (1 M 암모니아로 용리됨). 용리액을 증발시키고, 동결건조시켜 3-아미노프로필트리사카라이드 (5) 87.2 mg (91%)을 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼을 브루커 바이오스핀 게엠베하 분광계 상에 303K에서 기록하였다. 특징적인 양성자에 대한 화학적 이동 (δ)은 참조로서 HOD (4.750), CHCl3 (δ 7.270)을 사용하여 ppm으로 제공된다. 커플링 상수 (J)는 Hz로 제공된다. 1H NMR 스펙트럼에서의 신호를 스핀-스핀 탈커플링 기술 (이중 공명) 및 2D-1H,1H-COSY 실험을 사용하여 배정하였다.
광회전 값을 디지털 편광계 퍼킨 엘머 341 상에서 25℃에서 측정하였다.
질량 스펙트럼을 MALDI-TOF 비젼-2000 분광계 상에 매트릭스로서 디히드록시벤조산을 사용하여 등록하였다.
4: 1H-NMR (700 MHz, CDCl3): 1.759-1.834 (m, 1H, CH sp); 1.853-1.927 (m, 1H, CH sp); 1.972, 1.986, 1.996, 2.046, 2.053, 2.087, 2.106, 2.115, 2.130, 2.224 (10s, 10x3H, COCH3); 3.222-3.276 (m, 1H, NCH sp); 3.544-3.583 (m, 1H, OCH sp); 3.591-3.661 (m, 2H, NCH sp, H-5a); 3.764 (dd
Figure 112018056150910-pct00019
t, 1H, H-4a, J 8.8); 3.787 (dd, 1H, H-3b, J3,4 3.7, J2,3 9.9); 3.836 (br. t, 1H, H-5b, J 7.3); 3.882-3.920 (m, 1H, OCH sp); 3.950 (dd, 1H, H-6'c, J6',6'' 10.6, J5,6' 5.2); 4.009 (ddd, 1H, H-2a, J1,2 7.9, J2,3 10.0, J2,NH 9.0); 4.076-4.188 (m, 5H, H-6'a, H-6'b, H-6"b, H-5c, H-6"c); 4.415 (d, 1H, H-1a, J1,2 7.9); 4.443 (d, 1H, H-1b, J1,2 7.9); 4.529 (dd, 1H, H-6"a, J6',6'' 12.0, J5,6" 2.5); 4.548 (ddd, 1H, H-2c, J1,2 3.4, J2,3 11.6, J2,NH 9.4); 4.893 (dd, 1H, H-3c, J3,4 3.1, J2,3 11.6); 5.021 (d, 1H, H-1c, J1,2 3.4); 5.039-5.075 (m, 2H, H-3a, H-2b); 5.339 (dd
Figure 112018056150910-pct00020
d, 1H, H-4b, J 2.9); 5.359 (dd, 1H, H-4c, J3,4 2.7, J4,5 0.9); 5.810 (d, 1H, NHAc a, J2,NH 9.0); 6.184 (d, 1H, NHAc c, J2,NH 9.4); 7.310-7.413 (m, 1H, NHCOCF3 sp). Rf 0.31 (EtOAc-iPrOH, 10:1). MS, m/z [C43H60N3F3O25]H+ 계산치: 1076.35, 실측치 1076.
4β: 1H-NMR (700 MHz, CDCl3): 1.766-1.832 (m, 1H, CH sp); 1.850-1.908 (m, 1H, CH sp); 1.923, 1.969, 1.982, 2.059, 2.071, 2.099 (2), 2.120, 2.136, 2.148 (10s, 10x3H, COCH3); 3.230-3.289 (m, 1H, NCH sp); 3.521 (ddd, 1H, H-2c, J1,2 8.2, J2,3 11.2, J2,NH 7.8); 3.548-3.591 (m, 1H, OCH sp); 3.591-3.648 (m, 2H, NCH sp, H-5a); 3.743 (dd
Figure 112018056150910-pct00021
t, 1H, H-4a, J 8.6); 3.795 (br. t, 1H, H-5b, J 6.5); 3.852 (dd, 1H, H-3b, J3,4 3.6, J2,3 9.9); 3.873-3.923 (m, 2H, H-5c, OCH sp); 4.002 (ddd, 1H, H-2a, J1,2 8.0, J2,3 9.5, J2,NH 8.9); 4.039 (dd, 1H, H-6'b, J6',6'' 11.6, J5,6' 6.9); 4.087-4.144 (m, 3H, H-6'a, H-6"b, H-6'c); 4.160 (dd, 1H, H-6"c, J6',6'' 11.2, J5,6" 6.0); 4.409, 4.417 (2d
Figure 112018056150910-pct00022
t, 2x1H, H-1a, H-1b, J 7.6); 4.519 (dd, 1H, H-6"a, J6',6'' 11.8, J5,6" 2.5); 4.992 (d, 1H, H-1c, J1,2 8.2); 5.043 (dd, 1H, H-3a, J3,4 8.6, J2,3 9.5); 5.066 (dd, 1H, H-2b, J1,2 8.0, J2,3 9.8); 5.350 (dd
Figure 112018056150910-pct00023
d, 1H, H-4c, J 3.2); 5.372 (dd
Figure 112018056150910-pct00024
d, 1H, H-4b, J 3.4); 5.399 (d, 1H, NHAc c, J2,NH 7.8); 5.449 (dd, 1H, H-3c, J3,4 3.4, J2,3 11.3); 5.856 (d, 1H, NHAc a, J2,NH 8.9); 7.361-7.466 (m, 1H, NHCOCF3 sp). Rf 0.24 (EtOAc-iPrOH, 10:1). MS, m/z [C43H60N3F3O25]H+ 계산치: 1076.35, 실측치 1076.
5: 1H-NMR (700 MHz, D2O): 1.924-2.002 (m, 2H, CH2 sp); 2.060, 2.064 (2s, 2x3H, NCOCH3); 3.102 (m
Figure 112018056150910-pct00025
t, 2H, NCH2 sp, J 6.8); 3.592-3.644 (m, 1H, H-5a); 3.655 (dd, 1H, H-2b, J1,2 7.9, J2,3 9.9); 3.702 (br. dd, 1H, H-5b, J5,6' 3.8, J5,6" 8.2, J4,5≤ 1); 3.713-3.815 (m, 9H); 3.846 (dd, 1H, H-6'a, J6',6'' 12.3, J5,6' 5.3); 3.984-4.062 (m, 4H, OCH sp, H-6"a, H-4b, H-3c); 4.123 (dd
Figure 112018056150910-pct00026
d, 1H, H-4c, J 2.9); 4.206 (br. t, 1H, H-5c, J 6.3); 4.248 (dd, 1H, H-2c, J1,2 3.6, J2,3 11.0); 4.542 (2d
Figure 112018056150910-pct00027
t, 2H, H-1a, H-1b, J 7.4); 5.100 (d, 1H, H-1c, J1,2 3.5). Rf 0.55 (MeOH-1M aq. Py·AcOH, 5:1). MS, m/z [C25H45N3O16]H+ 계산치: 644.28; 실측치 644. [α]546 nm +128 (c 0.3; MeCN-H2O, 1:1).
5β: 1H-NMR (700 MHz, D2O): 1.938-1.991 (m, 2H, CH2 sp); 2.055, 2.062 (2s, 2x3H, NCOCH3); 3.100 (m
Figure 112018056150910-pct00028
t, 2H, NCH2 sp, J 6.9); 3.610 (dd, 1H, H-2b, J1,2 7.9, J2,3 9.9); 3.603-3.636 (m, 1H, H-5a); 3.682 (br. dd, 1H, H-5b, J5,6' 4.9, J5,6" 7.8, J4,5 ≤1); 3.693-3.826 (m, 11H); 3.842 (dd, 1H, H-6'a, J6',6'' 12.1, J5,6' 5.2); 3.934-3.972 (m, 2H, H-4b, H-2c); 4.012 (dd, 1H, H-6"a, J6',6'' 12.2, J5,6" 2.0); 4.023-4.057 (m, 1H, OCH sp); 4.175 (dd
Figure 112018056150910-pct00029
d, 1H, H-4c, J 2.9); 4.478 (d, 1H, H-1b, J1,2 7.9); 4.531 (d, 1H, H-1a, J1,2 8.1); 4.638 (d, 1H, H-1c, J1,2 8.4). Rf 0.48 (MeOH-1M aq. Py·AcOH, 5:1). MS, m/z [C25H45N3O16]H+ 계산치: 644.28; 실측치 644. [α]546 nm +6 (c 0.3; MeCN-H2O, 1:1).
반응식 I
Figure 112018056150910-pct00030
활성화된 1,2-O-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민 (DOPE-Ad-ONSu)(8)의 제조 (반응식 II)
건조 N,N-디메틸포름아미드 (1.5 ml) 중 비스(N-히드록시숙신이미딜) 아디페이트 (6) (70 mg, 205 μmol)의 용액에, 클로로포름 (1.5 ml) 중 1,2-O-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민 (7) (40 μmol)을 첨가하고, 이어서 트리에틸아민 (7 μl)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 유지한 다음, 아세트산으로 중화시키고, 진공 하에 부분적으로 농축시켰다. 잔류물의 칼럼 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, 1:1 클로로포름-메탄올, 0.2% 아세트산)에 의해 생성물 8 (37 mg, 95%)을 무색 시럽으로서 수득하였다.
1H NMR 스펙트럼을 브루커 DRX-500 분광계 상에서 획득하였다. 화학적 이동은 CD3OD에 비해 ppm (δ)으로 제공된다. TLC는 물 중 8%의 인산을 사용하여 염색하고 이어서 200℃ 초과에서 가열함으로써 검출된 화합물을 사용하여 실리카 겔 60 F254 플레이트 (머크) 상에서 수행하였다.
8: 1H NMR (CDCl3/CD3OD, 2:1) 5.5 (m, 4H, 2x(-CH=CH-), 5.39 (m, 1H, -OCH2-CHO-CH2O-), 4.58 (dd, 1H, J=3.67, J=11.98, -CCOOHCH-CHO-CH2O-), 4.34 (dd, 1H, J=6.61, J=11.98, -CCOOHCH-CHO-CH2O-), 4.26 (m, 2H, PO-CH 2 -CH2-NH2), 4.18 (m, 2H, -CH 2 -OP), 3,62 (m, 2H, PO-CH2-CH 2 -NH2), 3.00 (s, 4H, ONSuc), 2.8 (m, 2H, -CH 2 -CO (Ad), 2.50 (m, 4H, 2x(-CH 2 -CO), 2.42 (m, 2H, -CH 2 -CO (Ad), 2.17 (m, 8H, 2x(-CH 2 -CH=CH-CH 2 -), 1.93 (m, 4H, COCH2CH 2 CH 2 CH2CO), 1.78 (m, 4H, 2x(COCH2CH 2 -), 1,43, 1.47 (2 bs, 40H, 20 CH2), 1.04 (m, 6H, 2 CH3). Rf 0.5 (클로로포름-메탄올-물, 6:3:0.5.
반응식 II
Figure 112018056150910-pct00031
GalNAcα1-3Galβ1-4GlcNAc-Ad-DOPE (9)의 제조 (반응식 III)
N,N-디메틸포름아미드 (1 ml) 중 생성물 8 (33 μmol)의 용액에, 30 μmol의 3-아미노프로필트리사카라이드 5 및 5 μl의 트리에틸아민 (Et3N)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 실리카 겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2-EtOH-H2O; 6:5:1)에 의해 구축물 9의 81% 수율을 수득하였다.
9: 1H NMR (700 MHz, CDCl3-CD3OD, 1:1 v/v, 선택됨), δ, ppm: 1.05 (t, 6H, J 7.05, 2 CH 3 ), 1.39 -1.55 (m, 40H, 20 CH 2 ), 1.75-1.84 (m, 8H, COCH2CH 2CH 2CH2CO 및 2x COCH2CH 2-), 1.84-1.96 (m, 2H, O-CH2CH 2CH2-NH), 2.15-2.22 (m, 14H, 2x(-CH 2-CH=CH-CH 2-), 2x NHC(O)CH 3), 2.34-2.46 (m, 4H, 2x-CH 2-CO), 2.36-2.44 (m, 4H, 2x-CH 2-CO), 3.29-3.34 (m, 1H, -CH2-CHH-NH), 4.17-4.20 (m, 2H, -CHO-CH 2OP-), 4.34-4.39 (m, 2H, -CH2OPO-CH 2 -CH2), 4.57 (d, 1H, J1,2 8.39, H-1I), 4.50 (dd, 1H, J 3.78, J 10.82, -C(O)OCHHCHOCH2O-), 4.58- 4.61 (m, 2H, H-1II, C(O)OCHHCHOCH2O-), 5.15 (d, 1H, J1,2 3.76, H-1III), 5.38-5.42 (m, 1H, -OCH2-CHO-CH2O-), 5.47-5.53 (m, 4H, 2x-CH=CH-). Rf 0.5 (CH2Cl2-EtOH-H2O; 6:5:1).
반응식 III
Figure 112018056150910-pct00032
생물학적 데이터
항-Gal 동원 검정
CHO-K1 세포를 세포 배양 플라스크로부터 수거하고, 계수하고, 5 x 106개 세포/ml의 세포 밀도로 PBS 중에 재현탁시켰다. 각각의 당지질을 9개의 1.5 ml 원심분리 튜브에 걸쳐 연속적으로 PBS 중에 희석하여 튜브 내 최종 부피가 100 μl이도록 하였다. 각각의 튜브에, 100 μl의 CHO-K1 세포 현탁액을 첨가하고, 튜브를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후에 세포를 400 g에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 500 μl의 PBS+0.1% BSA 중에 재현탁시켰다. 이를 2회 더 반복하여 세포를 세척하였다. 최종 세척 후 세포를 PBS+0.1% BSA 중에 1:8로 희석된 모노클로날 항-Gal IgG1 100 μl 중에 재현탁시켰다. 튜브를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 후 세포를 400 g에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 500 μl의 PBS+0.1% BSA 중에 재현탁시켰다. 이를 2회 더 반복하여 세포를 세척하였다. 최종 세척 후 세포를 100 μl의 FITC-접합된 마우스 항-인간 IgG (바이오레전드) 중에 재현탁시키고, 튜브를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 후 세포를 400 g에서 3분 동안 원심분리에 의해 펠릿화하고, 500 μl의 PBS+0.1% BSA 중에 재현탁시켰다. 이를 2회 더 반복하여 세포를 세척하였다. 최종 세척 후 세포를 2.5 μl의 7-AAD (바이오레전드)를 함유하는 200 μl의 PBS+0.1% BSA 중에 재현탁시켰다. 얼음 상에서 5분 인큐베이션 후 세포를 시토믹스 FC500 유동 세포측정기 (베크만 쿨터) 상에서 분석하였다. 사멸 세포는 분석에서 제외하였다.
본원 실시예 1 (Galili-CMG2-DOPE) 및 실시예 2 (Galili-T17 DOPE)로서 제조된 바와 같은 화합물을 항-gal 동원 검정에서 시험하였으며, 결과는 도 1 및 2에서 볼 수 있다. 이들 결과는 단일 알파-Gal 당과 분자의 단일 지질 부분 사이에 CMG 스페이서를 갖는 알파-Gal 당지질인 본원 실시예 1 (Galili-CMG2-DOPE)로서 제조된 바와 같은 화합물이 CHO-K1 세포의 형질 막 내로 혼입되고 항-Gal 항체에 의한 인식을 위해 알파-Gal 에피토프를 제시한다는 것을 입증한다 (도 1 참조). 결과는 또한 분지형 CMG 링커에 의해 2 또는 3개의 알파-Gal 당에 부착된 단일 지질 부분을 갖는 당지질의 혼합물인 본원 실시예 2 (Galili-T17 DOPE)로서 제조된 바와 같은 화합물이 CHO-K1 세포의 형질 막 내로 혼입되고 등가 농도의 실시예 1의 단일 알파-Gal 분자보다 더 많은 항-Gal 항체를 동원한다는 것을 입증한다.
보체 의존성 세포독성 검정
CHO-K1 세포를 세포 배양 플라스크로부터 수거하고, 계수하고, 5 x 106개 세포/ml의 세포 밀도로 PBS 중에 재현탁시켰다. 각각의 당지질을 9개의 1.5 ml 원심분리 튜브에 걸쳐 연속적으로 PBS 중에 희석하여 튜브 내 최종 부피가 100 μl이도록 하였다. 각각의 튜브에, 100 μl의 CHO-K1 세포 현탁액을 첨가하고, 튜브를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후에 튜브를 얼음 상에 5분 동안 배치한 다음, 세포를 500 μl의 빙냉 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 최종 부피 250 μl의 빙냉 PBS 중에 재현탁시키고, 50 μl 분취물을 96 웰 플레이트의 이중 웰로 옮겼다. 세포를 함유하는 각각의 웰에 50 μl의 100% 정상 또는 열-불활성화된 (56℃에서 30분) 인간 혈청 보체 (이노베이티브 리서치)를 첨가하여 인간 혈청의 최종 농도가 50%이도록 하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이 후 세포 생존율을 엔비전 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머) 상에서 판독되는 셀타이터-글로 시약 (프로메가)을 사용하여 측정하였다.
본원 실시예 1 (Galili-CMG2-DOPE), 실시예 2 (Galili-T17 DOPE) 및 실시예 3 (GalNAc-Gal-GlcNAc-Ad-DOPE)으로서 제조된 바와 같은 화합물을 보체 의존성 세포독성 검정에서 시험하였으며, 결과는 하기 표 1 및 도 3 내지 5에서 볼 수 있다.
표 1: 보체 의존성 세포독성 검정의 결과
Figure 112018056150910-pct00033
이들 결과는 본원 실시예 1 (Galili-CMG2-DOPE; 즉, 단일 알파-Gal CMG 분자)로서 제조된 바와 같은 화합물로 표지된 CHO-K1 세포가 인간 혈청 보체에 의해 용해된다는 것을 입증한다 (도 3 참조). 결과는 또한 본원 실시예 2 (Galili-T17 DOPE; 즉, 이량체/삼량체 알파-Gal 분자)로서 제조된 바와 같은 화합물로 표지된 CHO-K1 세포가 동일한 농도의 단일 알파-Gal 분자 (즉, 본원 실시예 1 (Galili-CMG2-DOPE)로서 제조된 바와 같은 화합물)와 함께 인큐베이션된 세포보다 인간 혈청 보체에 의한 용해에 보다 감수성이라는 것을 입증한다. 결과는 또한 본원 실시예 3 (GalNAc-Gal-GlcNAc-Ad-DOPE; 즉, GalNAc 알파 당 항원을 갖는 당지질 분자)으로서 제조된 바와 같은 화합물로 표지된 CHO-K1 세포가 인간 혈청 보체에 의해 용해된다는 것을 입증한다.

Claims (23)

  1. 화학식 (II)의 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure 112022123092814-pct00040
  2. 제1항에 정의된 바와 같은 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 종양의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 종양이 고형 종양, 골수종 또는 림프종인 제약 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 종양이 복막, 간, 췌장, 폐, 방광, 전립선, 자궁, 자궁경부, 질, 골수, 유방, 피부, 뇌, 림프절, 두경부, 위, 장, 결장, 신장, 고환 및 난소로부터 선택된 기관으로부터 기원하는 종양인 제약 조성물.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 종양이 원발성 종양 또는 전이를 포함하는 것인 제약 조성물.
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 종양이 흑색종, 육종, 신경교종 또는 암종 세포를 포함하는 것인 제약 조성물.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 주사에 의한 투여를 위한 제약 조성물.
  8. 제2항 또는 제3항에 있어서, 1회 용량 또는 다중 용량으로 투여되는 제약 조성물.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 국소 적용인 제약 조성물.
  10. 제2항 또는 제3항에 있어서, 국소 연고, 국소 로션 또는 국소 용액인 제약 조성물.
  11. 제2항 또는 제3항에 있어서, 제약상 허용되는 담체(들), 희석제(들) 및 부형제(들)로부터 선택되는 1종 이상을 추가적으로 포함하는 제약 조성물.
  12. 제2항 또는 제3항에 있어서, 1종 이상의 면역계 하향-조절의 전신 억제제로부터 선택되는 1종 이상의 추가의 치료제를 추가적으로 포함하는 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제가 1종 이상의 항-CTLA-4, 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체를 포함하는 것인 제약 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제가 항-PD-1 항체를 포함하는 것인 제약 조성물.
  15. 제1항에 정의된 바와 같은 당지질 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 세포 표면을 갖는 복수의 암 세포를 포함하는 적어도 1종의 종양을 포함하는 대상체에서 종양을 치료하기 위한 제약 조성물이며,
    a) i) 상기 대상체, 및
    ii) 상기 제약 조성물
    을 제공하는 단계, 및
    b) 상기 제약 조성물을 종양 내로 도입하는 단계
    를 포함하는 방법에 사용되는 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 대상체가 인간 또는 마우스인 제약 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 대상체가 인간인 제약 조성물.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 도입하는 단계가 주사, 영상화 유도 주사, 내시경검사, 기관지경검사, 방광경검사, 결장경검사, 복강경검사 및 카테터삽입으로부터 선택된 절차를 포함하는 것인 제약 조성물.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 방법이
    종양내 염증을 유도하는 단계
    를 추가적으로 포함하는 것인 제약 조성물.
  20. 제15항 또는 제16항에 있어서, 대상체가 이전에 종양을 외과적으로 제거하는 치료를 받았던 것인 제약 조성물.
  21. 제15항 또는 제16항에 있어서, 대상체가 이전에 종양 제거 치료를 받지 않은 것인 제약 조성물.
  22. 제15항 또는 제16항에 있어서, 종양이 퇴행을 겪거나 또는 파괴되는 것인 제약 조성물.
  23. 제15항 또는 제16항에 있어서, 도입하는 단계가 대상체에서 속발성 종양의 퇴행 또는 파괴를 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
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