KR102509832B1 - Hydrogel composition capable of minimally invasive implantation based on polydisperse peptides having different structures and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 명세서는 상이한 두 구조의 다분산 펩타이드인 피브로인과 온도변화에 의한 졸-겔 상변이가 가능한 삼원공중합체 또는 가교결합된 히알루론산 하이드로겔 조성물을 이용하여 일반적으로 생의학 적용을 위한, 예를 들어 조직 유지 또는 확대를 위해 조직 빈 공간을 대체하기 위한 충전제로서, 또는 조직간의 유착을 방지하는 용도로서, 또는 조직 재생 및 재건을 보조하기 위한 지지체 개념으로 사용될 수 있는 혼합조성 물질에 관한 것이다.The present specification uses fibroin, which is a polydisperse peptide of two different structures, and a terpolymer capable of sol-gel phase transition by temperature change or a crosslinked hyaluronic acid hydrogel composition for biomedical applications, for example, tissue It relates to a mixed composition material that can be used as a filler to replace tissue voids for maintenance or expansion, or to prevent adhesion between tissues, or as a support concept to assist in tissue regeneration and reconstruction.
피부노화로 인한 연조직의 결손 및 외과적 절제 또는 선천적 결함으로부터의 조직 결함의 복원/확장/조직간의 유착방지는 최대한 정상 조직 범위에 가까운 크기/형태/형상을 유지하는 것을 목표로 설정해야한다. 현재 사용되어지는 연구 전략은 무지방 전이 및 인공 충전제를 사용하여 개발되고 있는 실정이다. Restoration/expansion/prevention of adhesion between tissue defects from soft tissue defects due to skin aging and surgical excision or congenital defects should be set with the goal of maintaining the size/shape/shape as close to the normal tissue range as possible. Currently used research strategies are being developed using fat-free transfers and artificial fillers.
예를들어 연조직 수복용의 경우 대표적으로 가교된 히알루론산, 콜라젠 및 폴리-엘-락틱액시드가 사용되고 있으며, 연조직 확대의 경우 가교된 히알루론산 및 생분해성고분자가 사용되고 있으며, 복강경 수술 후 조직간의 유착을 방지하는 경우 대표적으로 가교된 히알루론산 및 폴리-엘-락틱액시드 필름이 사용되고 있으며, 연골 수복의 경우 대표적으로 가교된 히알루론산이 대표적으로 사용되고 있다. For example, in the case of soft tissue restoration, cross-linked hyaluronic acid, collagen, and poly-L-lactic acid are typically used, and in the case of soft tissue augmentation, cross-linked hyaluronic acid and biodegradable polymers are used, and adhesion between tissues after laparoscopic surgery In the case of preventing this, cross-linked hyaluronic acid and poly-L-lactic acid film are typically used, and in the case of cartilage repair, cross-linked hyaluronic acid is typically used.
이러한 원료로 사용된 제품들은 비분해성 합성 제품에 비해 구형구축이 일어나지않는 장점을 가지고 있다. 그러나 시간이 지남에 따라 체내 분해 및 재흡수의 과정을 거쳐 시간이 지남에 따라 부피를 유지하는데 실패한다. Products used as these raw materials have the advantage of not causing spherical formation compared to non-degradable synthetic products. However, it fails to maintain its volume over time through the process of decomposition and reabsorption in the body over time.
히알루론은 안정적인 볼륨형성에는 탁월하지만 손실된 연조직(sofr tissue)의 효율적인 수복(repair)에는 의문점이 야기된다. 즉, 상기의 나열된 천연 혹은 합성 고분자제품은 조직성장에 유리한 환경을 보조적인 역할로 제시하지만 보다 근본적인 조직성장의 주된 역할을 하지 못한다.Hyaluron is excellent for stable volume formation, but questions arise about the efficient repair of lost soft tissue. That is, the natural or synthetic polymer products listed above present a favorable environment for tissue growth as an auxiliary role, but do not play a more fundamental role in tissue growth.
콜라겐은 연부 조직 확대 및 충전을 위한 주사가능한 물질로서 광범위하게 사용되고 있다. 동물 몸체의 주요 세포외 구조적 단백질인 콜라겐은 피부, 연골등과 같은 결합조직을 대체하거나 확대하기위해 이식 물질로 사용되고 있다. 또한, 콜라겐은 수년 동안 미용 목적으로 인체에 주사되거나 이식되어 왔다. 그러나 연조직 확대 및 충전, 유착방지막, 연골에서의 콜라겐의 사용은 비용이 많이 들 수 있고, 동종 혹은 이종간에서 추출하는 경우가 대부분을 차지하므로 간혹 체내 거부반응을 일으키는 문제가 발생한다. Collagen is widely used as an injectable material for soft tissue augmentation and filling. Collagen, a major extracellular structural protein of the animal body, is used as a graft material to replace or enlarge connective tissues such as skin and cartilage. Also, collagen has been injected or implanted into the human body for cosmetic purposes for many years. However, the use of collagen in soft tissue expansion and filling, anti-adhesion film, and cartilage can be expensive, and since most of the cases are extracted from the same or heterogeneous species, problems that cause rejection in the body sometimes occur.
이러한 상기의 문제점을 해결하기 위해 히알루론과 조직 수복(tissue reparing)에 보다 효과적인 물질 및 성분을 블랜딩하거나 화학적으로 결합시키는 연구가 활발히 진행되고 있지만 상품화는 미비한 실정이다.In order to solve the above problems, research on blending or chemically combining hyaluron with substances and components more effective for tissue reparing is being actively conducted, but commercialization is insufficient.
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 조직 수복(tissue reparing)에 보다 효과적인 조성물을 제공하고자 한다.In order to solve the above problems, the present inventors are trying to provide a more effective composition for tissue repair (tissue reparing).
본 발명자들은 손실된 연조직(sofr tissue)의 효율적인 수복(repair)을 위한, 보다 근본적인 조직성장의 주된 역할이 가능한, 또한, 조직간의 유착방지 역할에서도 봉합 주위의 빠른 조직재생 및 조직간의 유착을 방지하는 가드 역할이 가능하며, 단순 조직간의 가드역할에서 수동적인 역할이 아닌 보다 근본적으로 봉합부위에 유착을 방지하는 동시에 조직의 빠른 재생을 가능하게하는 수동적인 역할이 가능한 조성물을 제공하고자 한다.The present inventors are able to play a major role in more fundamental tissue growth for efficient repair of lost soft tissue (soft tissue), and also prevent rapid tissue regeneration around sutures and adhesion between tissues in the role of preventing adhesion between tissues It is intended to provide a composition capable of serving as a guard and, rather than a passive role in a simple guard role between tissues, more fundamentally preventing adhesion to a suture site and enabling rapid tissue regeneration.
본 발명자들은 최소 침습 절차로 투여될 수 있고, 신체가 점차적으로 부위를 거의 정상인 조직의 구조와 기능으로 리모델링하고 재생시키는 동안 부피 복원의 지속적인 유지를 제공할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.The present inventors seek to provide a composition that can be administered in a minimally invasive procedure and can provide sustained maintenance of volume restoration while the body gradually remodels and regenerates the site to a near-normal tissue structure and function.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.The object of the present invention is not limited to the object mentioned above. The objects of the present invention will become more apparent from the description that follows, and will be realized by means and combinations thereof set forth in the claims.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides the following composition.
본 발명에 따른 일측면은 적어도 부분적으로 소정의 기간 동안 복구 내지는 확대되는 조직에서 본래 부피의 적어도 일부를 유지할 수 있는, 주사주입 혹은 최소 침습 주입이 가능한 하이드로겔 조성물을 제공 한다.One aspect according to the present invention provides a hydrogel composition capable of injection injection or minimally invasive injection, capable of maintaining at least a portion of the original volume in a tissue that is at least partially repaired or enlarged for a predetermined period of time.
일 구현예에서, 상기 조성물은 구조적으로 서로 다른 피브로인 즉 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 분말/용액과 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자를 기반으로 하는 하이드로겔 조성물을 제공 한다. 상기 그러한 구조적으로 서로 다른 피브로인을 혼합사용된 하이드로겔은 조직의 빈 공간을 확대 및 복구를 위한 충전제, 또는 조직간의 가드역할을 하는 유착방지제로서, 가드 및 복구 또는 확대되는 타겟 부위에 최소 침습 절차로 사용될 수 있다. In one embodiment, the composition provides a hydrogel composition based on structurally different fibroin, that is, water-soluble alpha-herix structured fibroin powder/solution and water-insoluble beta-structured fibroin particles. The hydrogel mixed with such structurally different fibroin is a filler for expanding and repairing empty spaces in tissues, or an anti-adhesion agent that acts as a guard between tissues, and is a minimally invasive procedure for guarding and restoring or expanding target areas. can be used
본 발명에 따른 일측면은 구조적으로 상이한 두 종의 피브로인을 혼합사용하는 것을 포함하는, 타겟 부위의 조직을 복구 혹은 확대시키는데 사용하기 위해 주사가능한 하이드로겔 조성물을 제공한다.One aspect according to the present invention provides an injectable hydrogel composition for use in repairing or enlarging a tissue in a target area, including using a mixture of two structurally different types of fibroin.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔 조성물 중 최종적으로 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자는 적어도 소정의 기간동안(예를 들어 6주 이상) 복구 혹은 확대되는 조직 내에서 그의 원래 부피의 일부를 유지하여야 한다.In one embodiment, in the hydrogel composition, the finally water-insoluble beta-structured fibroin particles should maintain a portion of their original volume in the tissue to be repaired or enlarged for at least a predetermined period of time (eg, 6 weeks or more). do.
본 발명에 따른 일측면은 구조적으로 상이한 두 종의 피브로인을 혼합사용하는 것을 포함하는, 타겟 부위의 조직을 복구 혹은 확대시키는데 사용하기 위한 주사가능한 하이드로겔 조성물을 제공한다.One aspect according to the present invention provides an injectable hydrogel composition for use in repairing or enlarging a tissue of a target site, including using a mixture of two structurally different types of fibroin.
일 구혀예에서, 상기 하이드로겔 조성물 중 물에 가용성인 알파헤릭스구조의 피브로인 파우더/용액은 적어도 소정의 기간동안(예를 들어 6주 이하) 복구 혹은 확대되는 조직 내에서 조직재생효과를 유지하여야 한다.In one embodiment, the water-soluble alpha-helix structured fibroin powder / solution of the hydrogel composition should maintain the tissue regeneration effect in the tissue to be repaired or enlarged for at least a predetermined period (eg, 6 weeks or less) do.
본 발명에 따른 일측면은 구조적으로 상이한 두 종의 피브로인을 혼합사용하는 것을 포함하는, 또한 다른 한 측면은 타겟 부위의 조직과 조직사이의 유착을 방지하는데 사용하기 위한 주사가능한 하이드로겔 조성물이며, 적어도 소정의 기간동안(예를 들어 6주 이내) 봉합부위의 조직간 유착을 방지하기 위한 가드 역할을 하여야 한다.One aspect according to the present invention is an injectable hydrogel composition for use in preventing tissue-to-tissue adhesion in a target area, comprising using two types of fibroin that are structurally different, and at least It should serve as a guard to prevent adhesion between tissues at the suture site for a predetermined period of time (for example, within 6 weeks).
본 발명에 따른 일측면은, 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자는 적어도 6주, 적어도 3개월, 적어도 6개월 또는 그 초과 동안 그의 원래 부피의 일부를 유지할 수 있다.In one aspect according to the present invention, the water-insoluble beta-structured fibroin particles can retain part of their original volume for at least 6 weeks, at least 3 months, at least 6 months or more.
본 발명에 따른 일측면은, 물에 가용성인 알파헤릭스구조의 피브로인 파우더/용액은 적어도 6주 이내 조직 내에서 조직재생효과를 유지하여야 한다.In one aspect according to the present invention, the water-soluble alpha-helix structured fibroin powder/solution should maintain the tissue regeneration effect within the tissue within at least 6 weeks.
일 구현예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 구조적으로 상이한 두 종의 피브로인은 분자량 분별 컬럼을 통해 분해 및 용해도 특성을 조절함으로써 부분적으로 제어가 가능하다. In one embodiment, the hydrogel composition can be partially controlled by adjusting the dissolution and solubility characteristics of two structurally different fibroins through a molecular weight fractionation column.
본 발명에 따른 일측면은, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체는 타겟 부위 주입시 졸-겔 전이온도는 적어도 약 21도, 적어도 약 22도, 적어도 약 23도, 적어도 약 24도, 적어도 약 25도, 적어도 약 26도, 적어도 약 27도, 적어도 약 28도, 적어도 약 29도, 적어도 약 30도, 적어도 약 31도, 적어도 약 32도, 적어도 약 33도, 적어도 약 34도, 적어도 약 35도, 적어도 약 36도, 적어도 약 37도, 적어도 약 38도, 적어도 약 39도에서 겔로 전환되어 그의 원래 타겟 부위에 점착을 할수 있어야 한다.In one aspect according to the present invention, the polyethylene oxide (PEO) - polypropylene oxide (PPO) - polyethylene oxide (PEO) terpolymer has a sol-gel transition temperature of at least about 21 degrees, at least about 22 degrees, at least about 23 degrees, at least about 24 degrees, at least about 25 degrees, at least about 26 degrees, at least about 27 degrees, at least about 28 degrees, at least about 29 degrees, at least about 30 degrees, at least about 31 degrees, at least about 32 degrees, At least about 33 degrees, at least about 34 degrees, at least about 35 degrees, at least about 36 degrees, at least about 37 degrees, at least about 38 degrees, at least about 39 degrees, it should be able to convert to a gel and adhere to its original target site.
본 발명에 따른 일측면은, 타겟 조직의 베타구조 피브로인 입자의 용도 특성에 따라, 물에 불용성인 베타구조의 입자는 임의의 크기가 될 수 있도록 제공 한다. 상기 물에 불용성인 베타 구조의 피브로인 입자는 조직에 주사하기에 적합한 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공된 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자는 약 1㎛ 내지 100㎛의 크기를 가질 수 있다. One aspect according to the present invention provides the water-insoluble beta-structured particles to be of any size, depending on the use characteristics of the beta-structured fibroin particles in the target tissue. The water-insoluble beta-structured fibroin particles may have a size suitable for injection into a tissue. For example, the water-insoluble beta-structured fibroin particles provided in the present invention may have a size of about 1 μm to 100 μm.
본 발명에 따른 일측면은, 타겟 조직의 알파헤릭스구조 피브로인 파우더/용액의 용도 특성에 따라, 물에 가용성인 알파헤릭스구조 피브로인은 임의의 분자량이 될 수 있도록 한다. 혼합 사용 되어지는 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더/용액은 조직에 주사하기에 적합한 분자량을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공된 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인의 무게(Mw)분자량은 3,000Da 내지 10,000Da 의 분자량을 가질 수 있다. In one aspect according to the present invention, the water-soluble alpha-herix-structure fibroin can be of any molecular weight, depending on the characteristics of the use of the alpha-herix structure fibroin powder/solution of the target tissue. The alpha-herix structure fibroin powder/solution, which is soluble in water to be mixed and used, may have a molecular weight suitable for injection into a tissue. For example, the water-soluble alpha-herix structure fibroin provided in the present invention may have a molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 10,000 Da.
본 발명에 따른 일측면은, 타겟 조직의 베타 구조 피브로인 입자의 용도 특성에 따라서, 물에 불용성인 베타 구조 피브로인은 임의의 분자량이 될 수 있도록 한다. 혼합 사용 되어지는 물에 불용성인 베타 구조 피브로인 입자는 조직에 주사하기에 적합한 분자량을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공된 물에 불용성인 베타 구조 피브로인의 무게(Mw)분자량은 3,000Da 내지 100,000Da 의 분자량을 가질 수 있다.In one aspect according to the present invention, the beta structure fibroin, which is insoluble in water, can be of any molecular weight according to the use characteristics of the beta structure fibroin particles of the target tissue. Beta-structured fibroin particles that are insoluble in water to be mixed and used may have a molecular weight suitable for injection into a tissue. For example, the water-insoluble beta structure fibroin provided in the present invention may have a molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 100,000 Da.
실험예에서 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자는 부피를 축소시킴으로써 제조될 수 있다. 한 예로 고체 상태의 입자를 분말화, 파쇄, 밀링화, 절단 및 그의 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 당업계에서 인정된 다른 방법을 사용하여 제조될 수 있다.In the experimental example, beta-structured fibroin particles insoluble in water can be prepared by reducing the volume. For example, solid state particles may be powdered, crushed, milled, cut, and any method thereof. It can also be prepared using other methods recognized in the art.
본 발명에 따른 일측면에 있어서, 하이드로겔, 예를 들어 별도의 하이드로겔 및 구조적으로 상이한 두 종의 피브로인이 혼합된 하이드로겔을 더 포함할 수 있다.In one aspect according to the present invention, a hydrogel, for example, a separate hydrogel and a hydrogel in which two structurally different types of fibroin are mixed may be further included.
본 발명에 따른 일측면에 있어서, 본 발명에 기재된 조성물의 다양한 시험예는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 응용가능하다. In one aspect according to the present invention, various test examples of the composition described in the present invention can be applied by any method known in the art.
본 발명에 따른 일측면에 있어서, 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자는 유지 또는 확대되는 조직에 주입되기 전에 임의의 과정없이 바늘 또는 카테터를 통해 조직에 조입일 가능하도록 충분히 조절 가능하다.In one aspect according to the present invention, the water-insoluble beta-structured fibroin particles are sufficiently controllable to be inserted into the tissue through a needle or catheter without any process before being injected into the tissue to be maintained or enlarged.
본 발명에 기재된 조성물 및 응용방법에 의해 유지 또는 확대되는 조직은 피부, 유방 조직, 섬유성 조직, 결합 조직 및 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. Tissues maintained or enlarged by the compositions and methods of application described herein include, but are not limited to, skin, breast tissue, fibrous tissue, connective tissue, and any combination thereof.
본 발명은 구조적으로 상이한 두종의 피브로인을 혼합사용하여 주사주입이 가능한 하이드로겔 조성물을 제공한다. 상기 주사주입 장치는 임의의 종래의 시린지 또는 최소 침습의 투여 장치를 포함될 수 있다.The present invention provides a hydrogel composition that can be injected by mixing two structurally different types of fibroin. The injection device may include any conventional syringe or minimally invasive dispensing device.
본 발명의 일측면에 따라 제조된 하이드로겔 조성물은 연조직 수복에 사용 되어지는 더말필러인 히알루론산 분야에서 이들 제품의 단점을 개선한 서로 상이한 구조의 피브로인 혼합물과 가교된 히알루론산 또는 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드로 이루어진 삼원공중합체 조성물을 제공한다.The hydrogel composition prepared according to one aspect of the present invention is cross-linked hyaluronic acid or polyethylene oxide-polypropylene with a fibroin mixture of different structures that improves the disadvantages of these products in the field of hyaluronic acid, which is a dermal filler used for soft tissue repair. A terpolymer composition composed of oxide-polyethylene oxide is provided.
본 발명의 일측면에 따라 제조된 하이드로겔 조성물은 주입 시 세포 및 연조직의 다른 구성 요소의 생존 또는 성장을 촉진 혹은 최적의 환경을 지원할 수 있다.The hydrogel composition prepared according to one aspect of the present invention may promote survival or growth of cells and other components of soft tissue or support an optimal environment when injected.
본 발명의 일측면에 따라 제조된 하이드로겔 조성물은 안정적인 볼륨형성뿐만 아니라 손실된 연조직(sofr tissue)의 효율적인 수복(repair)에도 효과적이다. The hydrogel composition prepared according to one aspect of the present invention is effective for efficient repair of lost soft tissue as well as stable volume formation.
본 발명의 일측면에 따라 제조된 하이드로겔 조성물은 봉합된 주위의 조직과 조직간의 유착을 방지하는 혹은 최적의 환경을 지원할 수 있다.The hydrogel composition prepared according to one aspect of the present invention can prevent adhesion between tissues and tissues around the suture or support an optimal environment.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.The effects of the present invention are not limited to the effects mentioned above. It should be understood that the effects of the present invention include all effects that can be inferred from the following description.
도 1은 본 발명에 기재된 주사주입이 가능한 조성물의 하나 이상의 실시예의 예시적인 방법을 나타내었다. 구체적으로 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더, 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자 와 삼원공중합체 또는 가교된 히알루론산을 혼합하여 목적하는 하이드로겔을 형성할 수 있는 조성물 및 방법을 도시한 것이다.
도 2의 A는 알파구조의 피브로인 파우더와 베타구조의 피브로인 입자 혼합물에 무게평균 분자량(Mw) 2,000,000Da인 가교된 히알루론산 20mg/ml을 혼합하여 시험 동물의 진피에 주사주입 1개월 후 측정한 조직염색 사진이다. B는 알파구조의 피브로인 파우더와 베타구조의 피브로인 입자 혼합물에 무게평균 분자량(Mw) 2,000,000Da인 가교된 히알루론산 20mg/ml을 혼합하여 시험 동물의 진피에 주사주입 2개월 후 측정한 조직염색 사진이다. C는 알파구조의 피브로인 파우더와 베타구조의 피브로인 입자 혼합물에 무게평균 분자량(Mw) 2,000,000Da인 가교된 히알루론산 20mg/ml을 혼합하여 시험 동물의 진피에 주사주입 3개월 후 측정한 조직염색 확대 사진이다. D는 알파구조의 피브로인 파우더에 무게평균 분자량(Mw) 2,000,000Da인 가교된 히알루론산 20mg/ml을 혼합하여 시험 동물의 진피에 주사주입 1개월 후 측정한 조직염색 사진이다. E는 알파구조의 피브로인 파우더에 무게평균 분자량(Mw) 2,000,000Da인 가교된 히알루론산 20mg/ml을 혼합하여 시험 동물의 진피에 주사주입 2개월 후 측정한 조직염색 사진이다. F는 알파구조의 피브로인 파우더에 무게평균 분자량(Mw) 2,000,000Da인 가교된 히알루론산 20mg/ml을 혼합하여 시험 동물의 진피에 주사주입 3개월 후 측정한 조직염색 사진이다.
도 3은 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더와 베타구조 피브로인 입자에 50mg/ml의 가교된 히알루론산을 혼합하여 주사 주입 1개월 후 주입 부위의 조직을 절개하여 H&E 염색을 시행한 후 조직을 관찰하였다. 시편은 체외이식편을 절반으로 절단하고, 10% 포르말린 중에 밤새 4℃에서 고정하였다. 그 후 OCT 동결 매질 중에 함입시키고, 10 마이크로미터 섹션으로 냉각편을 만들고, 오일 레드로 염색하였다. 그리고 헤마톡실린 및 에오신에 대한 표준 조직학적 방법에 따라 염색 및 가공하여 관찰한 연골 조직사진이다.
도 4는 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인 GFC 자료이다.
도 5는 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자(입자크기는 1㎛ 내지 100㎛)에 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인이 수용액(농도가 50mg/ml)상에서 코팅이된 자료이다.
도 6은 본 발명의 혼합 조성물의 분산 안정성을 확인하기위한 자료이며 A는 물에 가용성인 알파헤릭스구조 피브로인 파우더(50mg/ml), 평균 입자사이즈가 20㎛인 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자(50mg/ml)와 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) - 폴리프로필렌옥사이드 (PPO) - 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) 삼원공중합체 200mg/ml을 혼합하여 제타전위를 분석한 자료이며, B는 물에 가용성인 알 알파헤릭스구조 피브로인 파우더(50mg/ml), 평균 입자사이즈가 65㎛ 인 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자(50mg/ml)와 가교결합된 히알루론산 20mg/ml을 혼합하여 제타전위를 분석한 자료이다.
도 7은 무게평균분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,000Da이며, 다분산지수 (PDI)가 1.5 내지 2.0인 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더의 FTIR-ATR 자료이다. A는 최초 분광학분석 자료이며, B는 30일 후 측정한 분광학분석 자료이다.
도 8은 무게분자량(Mw)가 3,000Da 내지 100,000Da, 입자 크기가 1㎛ 내지 100㎛인 물에 불용성이며 베타구조 피브로인 입자의 SEM 자료이다. A는 비정형 입자이며, B는 구형입자 자료이다.
도 9는 물에 불용성인 무게평균분자량(Mw)가 3,000Da 내지 100,000Da이며, 다분산지수 (PDI)가 1.5 내지 2.0, 입자크기가 1㎛ 내지 100㎛인 물에 불용성인 베타 구조 피브로인 입자의 FTIR-ATR 자료이다. A는 최초 분광학분석 자료이며, B는 30일 후 측정한 분광학분석 자료이다.
도 10은 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더 50mg/ml, 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자 50mg/ml, 가교된 히알루론산 20mg/ml의 분광학적 분석 자료이다.
도 11은 무게평균 분자량(Mw) 3,500Da인 구조적으로 물에 가용성인 알파헤릭스 피브로인 50mg/ml, 무게평균 분자량(Mw) 10,000Da이며 입자평균사이즈가 1㎛ 내지 20㎛인 구조적으로 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자 50mg/ml, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체 200mg/ml을 혼합하여 유착방지용 하이드로겔을 복막 상처 부위에 도포 1개월 후 시험 동물을 절개하여 유착여부를 확인한 실험자료이다.
도 12는 하이드로겔의 모폴로지 분석 자료이다. A는 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더와 베타구조의 피브로인 입자에 가교된 히알루론산의 함량이 50mg/ml인 고밀도 하이드로겔의 SEM 자료. B는 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더와 베타구조의 피브로인 입자에 가교된 히알루론산의 함량이 20mg/ml인 저밀도 하이드로겔의 SEM 자료
도 13은 PEO-PPO-PEO 삼원공중합체 200mg/mg인 기본 용액에 서로다른 구조의 피브로인 단독 및 두종의 피브로인을 혼합한 혼합물의 조직학적 유효성을 평가한 자료로서 A와 B는 베타시트의 피브로인 입자를 혼합하였을 때 7일과 14일 후 조직학적 평가 자료이며, C 와 D는 알파헤릭스 구조 피브로인파우더와 베타 구조 피브로인 입자를 혼합하였을 때 7일과 14일 후 조직학적 평가 자료이다.1 shows an exemplary method of one or more embodiments of the injectable compositions described herein. Specifically, it shows a composition and method capable of forming a desired hydrogel by mixing water-soluble alpha-herix structured fibroin powder, water-insoluble beta-structured fibroin particles and terpolymer or crosslinked hyaluronic acid. will be.
2A is a tissue measured 1 month after injection into the dermis of a test animal by mixing 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid with a weight average molecular weight (Mw) of 2,000,000 Da in a mixture of alpha-structured fibroin powder and beta-structured fibroin particles It is a dyed picture. B is a tissue staining photograph measured 2 months after injection into the dermis of a test animal by mixing 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid with a weight average molecular weight (Mw) of 2,000,000 Da in a mixture of alpha-structured fibroin powder and beta-structured fibroin particles. . C is an enlarged photograph of tissue staining measured 3 months after injection into the dermis of a test animal by mixing 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid with a weight average molecular weight (Mw) of 2,000,000 Da in a mixture of alpha-structured fibroin powder and beta-structured fibroin particles. am. D is a photograph of tissue staining measured 1 month after injection into the dermis of a test animal by mixing 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid having a weight average molecular weight (Mw) of 2,000,000 Da with alpha-structure fibroin powder. E is a photograph of tissue staining measured 2 months after injection into the dermis of a test animal by mixing 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid having a weight average molecular weight (Mw) of 2,000,000 Da with alpha-structured fibroin powder. F is a tissue staining photograph measured 3 months after injection into the dermis of a test animal by mixing 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid having a weight average molecular weight (Mw) of 2,000,000 Da with alpha-structure fibroin powder.
3 is a mixture of 50 mg/ml cross-linked hyaluronic acid in alpha-herix structured fibroin powder and beta-structured fibroin particles, and after 1 month of injection, the tissue at the injection site was incised, H&E staining was performed, and the tissue was observed. Specimens were explants cut in half and fixed in 10% formalin overnight at 4°C. They were then embedded in OCT freezing medium, frozen pieces were made in 10 micron sections, and stained with Oil Red. And it is a picture of cartilage tissue observed after staining and processing according to standard histological methods for hematoxylin and eosin.
Figure 4 is a water-soluble alpha-herix structure fibroin GFC data.
5 is data in which water-insoluble beta-structured fibroin particles (particle size of 1 μm to 100 μm) are coated with water-soluble alpha-helix structured fibroin in an aqueous solution (concentration: 50 mg/ml).
6 is data for confirming the dispersion stability of the mixed composition of the present invention, A is water-soluble alpha-helix structure fibroin powder (50 mg / ml), water-insoluble beta structure fibroin particles having an average particle size of 20 μm (50mg/ml) and polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide (PEO) terpolymer 200mg/ml are analyzed for zeta potential analysis, and B is Al-alphahe, which is soluble in water. This is data analyzing zeta potential by mixing lix structure fibroin powder (50mg/ml), water-insoluble beta structure fibroin particles (50mg/ml) with an average particle size of 65㎛ and 20mg/ml cross-linked hyaluronic acid.
7 is FTIR-ATR data of water-soluble alpha-herix structured fibroin powder having a weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 10,000 Da and a polydispersity index (PDI) of 1.5 to 2.0. A is the initial spectroscopic analysis data, and B is the spectroscopic analysis data measured after 30 days.
8 is SEM data of beta structure fibroin particles insoluble in water having a weight molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 100,000 Da and a particle size of 1 μm to 100 μm. A is an atypical particle, and B is a spherical particle data.
9 is water-insoluble beta structure fibroin particles having a weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 100,000 Da, a polydispersity index (PDI) of 1.5 to 2.0, and a particle size of 1 μm to 100 μm. FTIR-ATR data. A is the initial spectroscopic analysis data, and B is the spectroscopic analysis data measured after 30 days.
10 is spectroscopic analysis data of 50 mg/ml of water-soluble alpha-herix structure fibroin powder, 50 mg/ml of water-insoluble beta structure fibroin particles, and 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid.
11 is 50 mg/ml of alpha-herix fibroin structurally soluble in water with a weight average molecular weight (Mw) of 3,500 Da, structurally insoluble in water with a weight average molecular weight (Mw) of 10,000 Da and an average particle size of 1 μm to 20 μm. 50 mg/ml of fibroin particles with in beta structure and 200 mg/ml of polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide (PEO) terpolymer were mixed and the anti-adhesion hydrogel was applied to the
12 is morphology analysis data of hydrogels. A is SEM data of high-density hydrogel with 50 mg/ml of hyaluronic acid cross-linked to alpha-herix structure fibroin powder and beta-structure fibroin particles. B is SEM data of alpha-herix structure fibroin powder and low-density hydrogel with 20 mg/ml hyaluronic acid content cross-linked to beta-structure fibroin particles
Figure 13 is a data for evaluating the histological effectiveness of a mixture of fibroin alone and two types of fibroin of different structures in a basic solution of 200 mg / mg of PEO-PPO-PEO terpolymer, and A and B are beta sheet fibroin particles are histological evaluation data after 7 days and 14 days when mixed, and C and D are histological evaluation data after 7 days and 14 days when alpha-helix structure fibroin powder and beta structure fibroin particles are mixed.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.Unless otherwise specified, all numbers, values and/or expressions expressing components, reaction conditions, or amounts of components used herein are intended to indicate that such numbers, among other things, are inherently different from the measurement taken to obtain such values. Since these are approximations that reflect uncertainty, they should be understood as being qualified by the term "about" in all cases. Also, when numerical ranges are disclosed herein, such ranges are contiguous and include all values from the minimum value of such range to the maximum value inclusive, unless otherwise indicated. Furthermore, where such ranges refer to integers, all integers from the minimum value to the maximum value inclusive are included unless otherwise indicated.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.In this specification, where ranges are stated for a variable, it will be understood that the variable includes all values within the stated range inclusive of the stated endpoints of the range. For example, a range of "5 to 10" includes values of 5, 6, 7, 8, 9, and 10, as well as any subrange of 6 to 10, 7 to 10, 6 to 9, 7 to 9, and the like. inclusive, as well as any value between integers that fall within the scope of the stated range, such as 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 to 8.5 and 6.5 to 9, and the like. Also, for example, the range of "10% to 30%" includes values such as 10%, 11%, 12%, 13%, etc., and all integers up to and including 30%, as well as values from 10% to 15%, 12% to 12%, etc. It will be understood to include any sub-range, such as 18%, 20% to 30%, and the like, as well as any value between reasonable integers within the scope of the stated range, such as 10.5%, 15.5%, 25.5%, and the like.
본 발명은의 타겟 적용 부위에서 조직을 유지 또는 확대시키기 위한 조성물 및 그의 함량을 제공하고자 한다. 본 발명의 명세서에 기재된 다양한 측면의 시험예에 의해 서로 상이한 구조의 피브로인 혼합물 및 그의 조성물의 주사가능한 하이드로겔 형태는 조직 유지, 조직 확대 또는 조직간의 유착을 방지되고, 소정의 기간동안 조직 유지 또는 확대되는 조직 내에서 그의 원래 부피의 적어도 일부를 유지할 수 있다. The present invention is intended to provide a composition and its content for maintaining or enlarging tissue at a target application site of. According to the test examples of various aspects described in the specification of the present invention, the injectable hydrogel form of the fibroin mixture and its composition having different structures from each other prevents tissue maintenance, tissue enlargement or adhesion between tissues, and maintains or enlarges tissue for a predetermined period of time. retains at least a portion of its original volume within the tissue.
또한 소정의 기간동안 봉합부위의 조직과 조직 경계내에서 그의 원래 부피를 대부분 상실하여 조직간의 유착방지를 할 수 있다. 그러나 주사주입이 가능한 본 발명에서 제시한 하이드로겔은 최소 침습 절차로 타겟 부위에 도입될 수 있으며, 숙련 진료의가 주사주입이 가능한 하이드로겔은 임의의 주입량은 대상 타겟의 조직 결함 크기에 맞도록 유연하게 주입 할 수 있다. In addition, it is possible to prevent adhesion between tissues by losing most of its original volume within the tissue of the sutured area and the tissue boundary for a predetermined period of time. However, the hydrogel presented in the present invention, which can be injected by injection, can be introduced into the target site with a minimally invasive procedure, and the hydrogel, which can be injected by a skilled practitioner, is flexible so that any injection amount can fit the size of the tissue defect of the target. can be injected
본 발명의 일측면은 조직의 충진, 재생, 복구, 확대, 수복 및 유착 방지를 위한 하이드로겔 조성물에 있어서, 상기 조성물은 물에 가용성이 피브로인 및 물에 불용성이 피브로인을 포함하는 피브로인 혼합물을 포함하는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.One aspect of the present invention is a hydrogel composition for filling, regenerating, repairing, expanding, restoring, and preventing adhesion of tissue, wherein the composition comprises a fibroin mixture comprising water-soluble fibroin and water-insoluble fibroin. , a hydrogel composition is provided.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 물에 가용성이 피브로인은 알파헬릭스 구조의 피브로인이며, 상기 물에 불용성이 피브로인은 베타시트 병풍구조의 피브로인인, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the water-soluble fibroin is an alpha-helix structured fibroin, and the water-insoluble fibroin is a beta sheet sheet structured fibroin, providing a hydrogel composition.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 알파헬릭스 구조의 피브로인은 중량평균분자량이 3,000 내지 10,000 Da 이며, 상기 베타시트 병풍구조의 피브로인은 중량평균분자량이 3,000 내지 100,000 Da 인, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the fibroin of the alpha-helix structure has a weight average molecular weight of 3,000 to 10,000 Da, and the fibroin of the beta sheet sheet structure has a weight average molecular weight of 3,000 to 100,000 Da. Provides a hydrogel composition.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 알파헬릭스 구조의 피브로인은 다분산지수(PDI)가 1.3 내지 2.3 이며, 전체 아미노산 서열에 대하여 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티브를 0.5 내지 5 mol로 포함하며, 상기 베타시트 병풍구조의 피브로인은 다분산지수(PDI)가 1.3 내지 2.3 이며, 전체 아미노산 서열에 대하여 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티브를 0.5 내지 5 mol로 포함하고, 입자 평균 크기가 1㎛ 내지 100㎛ 인, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the alpha-helix structured fibroin has a polydispersity index (PDI) of 1.3 to 2.3, and contains an Arg-Gly-Asp (RGD) motif of 0.5 to 5 mol with respect to the entire amino acid sequence, The fibroin of the beta sheet sheet structure has a polydispersity index (PDI) of 1.3 to 2.3, contains an Arg-Gly-Asp (RGD) motif of 0.5 to 5 mol with respect to the entire amino acid sequence, and has an average particle size of 1 μm to 100 μm, a hydrogel composition is provided.
본 발명의 일측면에 있어서, 하이드로겔 조성물 전체 1000 중량부에 대하여 상기 알파헬릭스 구조의 피브로인은 5 내지 50 중량부, 상기 베타시트 병풍구조의 피브로인은 1 내지 100 중량부로 포함되는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the hydrogel composition containing 5 to 50 parts by weight of the fibroin of the alpha helix structure and 1 to 100 parts by weight of the fibroin of the beta sheet sheet structure with respect to 1000 parts by weight of the total hydrogel composition to provide.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 알파헬릭스 구조의 피브로인 및 상기 베타시트 병풍구조의 피브로인은 1 : 0.1 내지 20의 중량비로 포함되는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the fibroin of the alpha-helix structure and the fibroin of the beta sheet sheet structure are included in a weight ratio of 1: 0.1 to 20, to provide a hydrogel composition.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 피브로인 혼합물은 제타전위가 10mv 이하인, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the fibroin mixture provides a hydrogel composition having a zeta potential of 10 mv or less.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 주사 주입이 가능한 형태인, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the composition provides a hydrogel composition in an injectable form.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 조성물은 조직 주입 후 적어도 1개월 이상 조직 내에서 조직 원래 부피의 적어도 30% 이상을 유지하는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In one aspect of the present invention, the composition provides a hydrogel composition that maintains at least 30% or more of the original volume of the tissue in the tissue for at least one month or more after tissue injection.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체를 더 포함하는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a hydrogel composition, in the composition according to one aspect of the present invention, further comprising a polyethylene oxide (PEO) - polypropylene oxide (PPO) - polyethylene oxide (PEO) terpolymer .
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 삼원공중합체는 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 단위체의 함량이 65 내지 85 몰% 이고, 중량평균분자량이 7500 내지 16000 g/mol 인, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, the terpolymer provides a hydrogel composition having a polyethylene oxide (PEO) unit content of 65 to 85 mol% and a weight average molecular weight of 7500 to 16000 g/mol.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 하이드로겔 조성물 전체 1000 중량부에 대하여 상기 삼원공중합체는 150 내지 300 중량부로 포함되는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, the hydrogel composition is provided in an amount of 150 to 300 parts by weight of the terpolymer based on 1000 parts by weight of the total hydrogel composition.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 조성물은 리도카인; 디-마니톨; 또는 리도카인과 디-마니톨;을 더 포함하는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the invention, the composition comprises lidocaine; d-mannitol; or lidocaine and di-mannitol; to provide a hydrogel composition further comprising.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 하이드로겔 조성물 전체 1000 중량부에 대하여 상기 리도카인은 2 내지 4 중량부, 상기 디-마니톨은 1 내지 50 중량부로 포함되는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, a hydrogel composition is provided, wherein 2 to 4 parts by weight of the lidocaine and 1 to 50 parts by weight of the di-mannitol are included, based on 1000 parts by weight of the total hydrogel composition.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 하이드로겔 조성물은 유착방지제 또는 연조직 충진용 필터로 사용되는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, the hydrogel composition provides a hydrogel composition used as an anti-adhesion agent or a soft tissue filling filter.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 하이드로겔 조성물은 연조직 주입시 졸에서 겔로 전이되는 온도 범위는 섭씨 21도 내지 39도에서 겔화가 이루어지는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, the hydrogel composition provides a hydrogel composition, characterized in that the gelation is performed at a temperature range of 21 degrees Celsius to 39 degrees Celsius in which the transition from sol to gel is performed when injected into the soft tissue.
본 발명의 또 하나의 측면은 상기 본 발명의 일측면에 따른 조성물에 있어서, 가교결합된 히알루론산을 더 포함하는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a hydrogel composition in the composition according to one aspect of the present invention, further comprising cross-linked hyaluronic acid.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 상기 가교결합된 히알루론산은 평균분자량이 400,000 내지 600,000 Da의 저분자량 히알루론산과 평균분자량이 1,700,000 내지 2,100,000 Da의 고분자량 히알루론산이 가교된 것인, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, the crosslinked hyaluronic acid is a hydrogel in which low molecular weight hyaluronic acid having an average molecular weight of 400,000 to 600,000 Da and high molecular weight hyaluronic acid having an average molecular weight of 1,700,000 to 2,100,000 Da are crosslinked. composition is provided.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 상기 저분자량 히알루론산과 고분자량 히알루론산은 10 내지 30 : 90 내지 70의 비율로 가교된 것인, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, the low molecular weight hyaluronic acid and the high molecular weight hyaluronic acid are cross-linked at a ratio of 10 to 30: 90 to 70 to provide a hydrogel composition.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 상기 가교결합된 히알루론산은 평균분자량이 1,700,000 내지 3,000,000 Da인, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, the cross-linked hyaluronic acid provides a hydrogel composition having an average molecular weight of 1,700,000 to 3,000,000 Da.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 하이드로겔 조성물 전체 1000 중량부에 대하여 상기 가교결할된 히알루론산은 20 내지 50 중량부로 포함되는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, the cross-linked hyaluronic acid is included in 20 to 50 parts by weight based on 1000 parts by weight of the total hydrogel composition, to provide a hydrogel composition.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 상기 조성물은 리도카인; 디-마니톨; 또는 리도카인과 디-마니톨;을 더 포함하는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the invention, the composition comprises lidocaine; d-mannitol; or lidocaine and di-mannitol; to provide a hydrogel composition further comprising.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 하이드로겔 조성물 전체 1000 중량부에 대하여 상기 리도카인은 2 내지 4 중량부, 상기 디-마니톨은 1 내지 50 중량부로 포함되는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, a hydrogel composition is provided, wherein 2 to 4 parts by weight of the lidocaine and 1 to 50 parts by weight of the di-mannitol are included, based on 1000 parts by weight of the total hydrogel composition.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 상기 하이드로겔 연골충진제 또는 연조직 충진용 필터로 사용되는, 하이드로겔 조성물을 제공한다.In another aspect of the present invention, it provides a hydrogel composition used as a filter for filling the hydrogel cartilage filler or soft tissue.
이하, 본 발명의 조성물 특성 및 목적에 따른 혼합비율에 대하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the mixing ratio according to the characteristics and purpose of the composition of the present invention will be described in detail.
본 발명의 베타구조의 피브로인 입자는 당업계에서 인정된 다른 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를들어 약 9.3몰의 리튬브로마이드수용액에 용해 또는 칼슘클로라이드, 에탄올, 물의 혼합용액에 용해시켜 수용액을 제조한 후 투석막을 사용하여 40 내지 60 mg/ml의 순수 피브로인 수용액을 취하는 방식이 당업계에 명시되어있다. The beta-structured fibroin particles of the present invention can be prepared using other methods recognized in the art. For example, a method in which an aqueous solution is prepared by dissolving about 9.3 moles of lithium bromide in an aqueous solution or a mixed solution of calcium chloride, ethanol, and water, and then using a dialysis membrane to obtain a 40 to 60 mg/ml pure fibroin aqueous solution is known in the art. It is stated.
본 발명의 베타구조의 피브로인 입자를 안정적이게 획득하기 위해 상기의 방식에서 수득한 순수 피브로인 수용액을 이온 컬럼을 통해 분자량을 선별하여 사용할 수 있다. In order to stably obtain the beta-structured fibroin particles of the present invention, the pure fibroin aqueous solution obtained in the above method may be used after selecting the molecular weight through an ion column.
일부 시험에서, 베타구조의 피브로인 입자는 목적하는 특성에 따라 임의의 무게평균 분자량(Mw)을 갖도록 설정될 수 있다. 예를 들어 일부 시험예에서 베타구조의 피브로인 입자의 무게평균 분자량(Mw)은 적어도 약 3,000 Da, 적어도 약 4,000 Da, 적어도 약 5,000 Da, 적어도 약 6,000 Da, 적어도 약 7,000 Da, 적어도 약 8,000 Da, 적어도 약 9,000 Da, 적어도 약 10,000 Da, 적어도 약 20,000 Da, 적어도 약 30,000 Da, 적어도 약 40,000 Da, 적어도 약 50,000 Da, 적어도 약 60,000 Da, 적어도 약 70,000 Da, 적어도 약 80,000 Da, 적어도 약 90,000 Da, 적어도 약 100,000 Da을 가질 수 있다. In some tests, the beta-structured fibroin particles can be set to have any weight average molecular weight (Mw) depending on the desired properties. For example, in some test examples, the weight average molecular weight (Mw) of the beta-structured fibroin particles is at least about 3,000 Da, at least about 4,000 Da, at least about 5,000 Da, at least about 6,000 Da, at least about 7,000 Da, at least about 8,000 Da, at least about 9,000 Da, at least about 10,000 Da, at least about 20,000 Da, at least about 30,000 Da, at least about 40,000 Da, at least about 50,000 Da, at least about 60,000 Da, at least about 70,000 Da, at least about 80,000 Da, at least about 90,000 Da, It may have at least about 100,000 Da.
상기의 무게평균 분자량(Mw)을 갖는 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자의 다분산지수(PDI)는 적어도 약 1.5, 적어도 약 1.6, 적어도 약 1.7, 적어도 약 1.8, 적어도 약 1.9, 적어도 약 2.0을 가질 수 있다. 또한 상기 본 발명의 베타 구조의 피브로인 입자는 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티브롤 적어도 약 0.5 내지 5mol%를 전체 아미노산 서열중 함유 하는 조성물을 취득할 수 있다.The polydispersity index (PDI) of the water-insoluble beta structure fibroin particles having the weight average molecular weight (Mw) is at least about 1.5, at least about 1.6, at least about 1.7, at least about 1.8, at least about 1.9, at least about 2.0 can have In addition, the beta-structured fibroin particles of the present invention can obtain a composition containing at least about 0.5 to 5 mol% of the RGD (Arg-Gly-Asp) motif in the entire amino acid sequence.
상기의 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자는 적어도 약 99몰 백분율, 적어도 약 99몰 백분율이상의 구조적으로 베타시트를 가질 수 있다. The water-insoluble beta-structured fibroin particles may have at least about 99 mole percent, or at least about 99 mole percent, of beta sheets structurally.
상기 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자는 목적하는 특성에 따라 임의의 크기를 갖도록 설정될 수 있다. 또한 본 발명의 베타구조의 피브로인 입자는 임의의 방법에 의해서 제조 가능하다. 한 예로 고체 상태의 입자를 분말화, 파쇄, 밀링화, 절단 및 그의 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 당업계에서 인정된 다른 방법을 사용하여 제조될 수 있다.The water-insoluble beta structure fibroin particles may be set to have an arbitrary size according to desired properties. In addition, the beta-structured fibroin particles of the present invention can be prepared by any method. For example, solid state particles may be powdered, crushed, milled, cut, and any method thereof. It can also be prepared using other methods recognized in the art.
입자의 임의의 형상, 예를들어 원형, 타원형 또는 다각형을 갖도록 조성될 수 있다. 베타구조의 피브로인 입자는 목적하는 특성에 따라 적어도 약 1㎛ 내지 100㎛의 범위내에서 조정가능하다. It can be formulated to have any shape of particle, for example circular, elliptical or polygonal. Beta-structured fibroin particles can be adjusted within a range of at least about 1 μm to 100 μm depending on desired properties.
본 발명의 사용되는 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자는 임의의 형상, 예를 들어 구형 형상, 다각형 형상, 타원형 형상으로 조정될 수 있다. 베타구조의 피브로인 입자와 관련하여 사용된 바와 같이, 본 발명에서 사용된 용어 “입자” 혹은 “베타구조의 피브로인 입자”는 임의의 형상, 예를 들어 이로 제한되는 것은 아니지만, 구형 형상, 다각형 형상 또는 타원형 형상의 입자를 지칭한다. 입자의 크기는 수많은 인자, 예를들어 비제한적으로, 조직의 유지 및 확대시키고자 하는 타겟부위의 조직 크기 및 목적하는 특성에의해 달라질 수 있다. The water-insoluble beta-structured fibroin particles used in the present invention can be adjusted to any shape, for example, a spherical shape, a polygonal shape, or an elliptical shape. As used in reference to beta-structured fibroin particles, the term "particle" or "beta-structured fibroin particles" as used herein refers to any shape, including but not limited to, spherical shape, polygonal shape or Refers to elliptical shaped particles. The size of the particles can vary depending on a number of factors including, but not limited to, the tissue size and desired properties of the target site to which tissue is to be maintained or enlarged.
일부 실시예에서 입자의 크기는 적어도 약 1㎛ 내지 20㎛, 적어도 약 20㎛ 내지 40㎛, 적어도 약 40㎛ 내지 60㎛, 적어도 약 60㎛ 내지 80㎛, 적어도 약 80㎛ 내지 100㎛, 적어도 약 1㎛ 내지 100㎛의 크기를 가질수 있다. 베타구조의 피브로인 입자는 본질적으로 임의의 변형(예를 들어 물리적인 압축등)없이도 바늘 및 카테터를 통해 혼합 하이드로겔이 조직내로 전달될 수 있을 정도로 작을 수 있다. In some embodiments, the particle size is at least about 1 μm to 20 μm, at least about 20 μm to 40 μm, at least about 40 μm to 60 μm, at least about 60 μm to 80 μm, at least about 80 μm to 100 μm, at least about It may have a size of 1 μm to 100 μm. Beta-structured fibroin particles can be small enough to allow the mixed hydrogel to be delivered into tissues through needles and catheters without essentially any deformation (eg, physical compression, etc.).
일부 실시예에서, 본 발명에 사용되는 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자의 함량은 조직의 유지 및 확대시키고자 하는 타겟부위의 조직 크기 및 목적에 따라 그 함량을 달리할 수 있다. 일부 실시예에서는 입자의 크기는 적어도 약 1㎛ 내지 20㎛일 때, 전체 조성물의 1mg/ml 내지 100mg/ml, 적어도 약 20㎛ 내지 40㎛일 때, 전체 조성물의 1mg/ml 내지 100mg/ml, 적어도 약 40㎛ 내지 60㎛일 때, 전체 조성물의 1mg/ml 내지 100mg/ml, 적어도 약 60㎛ 내지 80㎛일 때, 전체 조성물의 1mg/ml 내지 100mg/ml, 적어도 약 80㎛ 내지 100㎛일 때, 전체 조성물의 1mg/ml 내지 100mg/ml, 적어도 약 1㎛ 내지 100㎛일 때, 전체 조성물의 1mg/ml 내지 100mg/ml의 함량을 사용할 수 있다.In some embodiments, the content of the water-insoluble beta-structured fibroin particles used in the present invention may vary depending on the tissue size and purpose of the target site to be maintained and enlarged. In some embodiments, the particle size ranges from 1 mg/ml to 100 mg/ml of the total composition when the size is at least about 1 μm to 20 μm, from 1 mg/ml to 100 mg/ml of the total composition when the size is at least about 20 μm to 40 μm, 1 mg/ml to 100 mg/ml of the total composition when at least about 40 μm to 60 μm, 1 mg/ml to 100 mg/ml of the total composition when at least about 60 μm to 80 μm, at least about 80 μm to 100 μm When the total composition is 1 mg/ml to 100 mg/ml, at least about 1 μm to 100 μm, an amount of 1 mg/ml to 100 mg/ml of the total composition may be used.
본 발명에 사용되는 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 상기의 물에 가용성인 알파헤릭스구조 피브로인 파우더는 적어도 약 99몰 백분율, 적어도 약 99몰 백분율이상의 구조적으로 알파헤릭스를 가질 수 있다. The water-soluble alpha-herix structure fibroin powder used in the present invention may have at least about 99 mole percent, at least about 99 mole percent or more of alpha-herix structurally. there is.
상기 물에 가용성인 알파헤릭스구조 피브로인 입자는 목적하는 특성에 따라 임의의 분자량을 갖도록 설정될 수 있다. 또한 본 발명의 알파헤릭스구조의 피브로인 파우더는 임의의 방법에 의해서 제조 가능하다. 한 예로 고체 상태의 피브로인섬유를 칼슘클로라이드-알코올-물 혼합물 혹은 9.3몰 리튬브로마이드 수용액 및 그의 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 당업계에서 인정된 다른 방법을 사용하여 제조될 수 있다.The water-soluble alpha-helix structured fibroin particles may be set to have an arbitrary molecular weight depending on desired properties. In addition, the alpha-helix structured fibroin powder of the present invention can be produced by any method. For example, solid-state fibroin fibers may be prepared by a calcium chloride-alcohol-water mixture or a 9.3 mol lithium bromide aqueous solution and any method thereof. It can also be prepared using other methods recognized in the art.
본 발명에 사용되는 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 당업계에서 인정된 방법에 의해 제조된 재생피브로인 수용액을 고성능 이온 칼럼을 통해 원하는 분자량을 취할 수 있다. 상기 본발명에서 사용되는 재생피브로인 수용액의 농도는 칼럼통과전 40mg/ml 내지 60mg/ml의 순수 피브로인 수용액을 사용하여 원하는 분자량을 선별하여 사용하여야 본 발명의 약 99몰 백분율의 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더를 취득할 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티브롤 적어도 약 0.5 내지 5mol%를 전체 아미노산 서열중 함유 하는 조성물을 취득할 수 있다.The water-soluble alpha-herix structured fibroin powder used in the present invention can obtain a desired molecular weight by passing an aqueous regenerated fibroin solution prepared by a method recognized in the art through a high-performance ion column. The concentration of the regenerated fibroin aqueous solution used in the present invention should be used after selecting a desired molecular weight using a pure fibroin aqueous solution of 40 mg/ml to 60 mg/ml before passing through the column. A fibroin powder having a rick structure can be obtained. In addition, the alpha-herix structure fibroin powder of the present invention can obtain a composition containing at least about 0.5 to 5 mol% of the RGD (Arg-Gly-Asp) motif in the entire amino acid sequence.
일부 시험에서, 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 목적하는 특성에 따라 임의의 무게평균 분자량(Mw)을 갖도록 설정될 수 있다. 예를 들어 일부 시험예에서 알파헤릭스 구조의 피브로인 입자의 무게평균 분자량(Mw)은 적어도 약 3,000 Da, 적어도 약 4,000 Da, 적어도 약 5,000 Da, 적어도 약 6,000 Da, 적어도 약 7,000 Da, 적어도 약 8,000 Da, 적어도 약 9,000 Da, 적어도 약 10,000 Da를 가질 수 있다. In some tests, the alpha-herix structured fibroin powder, which is soluble in water, can be set to have any weight average molecular weight (Mw) depending on the desired properties. For example, in some test examples, the weight average molecular weight (Mw) of the alpha-herix-structured fibroin particles is at least about 3,000 Da, at least about 4,000 Da, at least about 5,000 Da, at least about 6,000 Da, at least about 7,000 Da, at least about 8,000 Da, at least about 9,000 Da, at least about 10,000 Da.
상기의 무게평균 분자량(Mw)을 갖는 물에 가용성인 알파헤릭스구조 피브로인 파우더의 다분산지수(PDI)는 적어도 약 1.5, 적어도 약 1.6, 적어도 약 1.7, 적어도 약 1.8, 적어도 약 1.9, 적어도 약 2.0을 가질 수 있다. The polydispersity index (PDI) of the water-soluble alpha-helix structured fibroin powder having the above weight average molecular weight (Mw) is at least about 1.5, at least about 1.6, at least about 1.7, at least about 1.8, at least about 1.9, at least about You can have 2.0.
본 발명의 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더/용액을 안정적이게 획득하기 위해 상기의 방식에서 수득한 순수 피브로인 수용액을 이온 컬럼을 통해 최소 3,000Da 내지 10,000Da 무게평균 분자량을 선별하여 사용할 수 있다. In order to stably obtain the water-soluble alpha-herix structured fibroin powder/solution of the present invention, the pure fibroin aqueous solution obtained in the above method can be used by selecting a weight average molecular weight of at least 3,000 Da to 10,000 Da through an ion column. there is.
본 발명의 사용되는 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 임의의 형상, 예를 들어 고체상태의 파우더 및 희석된 용액으로 조정될 수 있다. 알파 헤릭스 구조의 피브로인 파우더와 관련하여 사용된 바와 같이, 본 발명에서 사용된 용어 “파우더”, “용액” 혹은 “알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더/용액”는 임의의 형상, 예를 들어 이로 제한되는 것은 아니지만, 물에가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인을 지칭한다. 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인은 수많은 인자, 예를들어 비제한적으로, 조직의 유지 및 확대시키고자 하는 타겟부위의 조직 크기 및 목적하는 특성에의해 그 함량이 달라질 수 있다. The water-soluble alpha-herix structured fibroin powder used in the present invention can be adjusted into any shape, for example, a solid-state powder or a diluted solution. As used in reference to alpha-herix structured fibroin powder, the terms "powder", "solution" or "alpha-herix structured fibroin powder/solution" as used herein refer to any shape, e.g., limited thereto. Although not necessarily, it refers to alpha-herix structure fibroin that is soluble in water. The water-soluble alpha-herix structural fibroin content can vary depending on a number of factors, such as, but not limited to, tissue size and desired characteristics of a target site to be maintained and enlarged.
일부 실시예에서는 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인의 함량은 총 하이드로겔 부피의 적어도 약 5 mg/ml, 적어도 약 10 mg/ml, 적어도 약 15 mg/ml, 적어도 약 20 mg/ml, 적어도 약 25 mg/ml, 적어도 약 30mg/ml, 적어도 약 35 mg/ml, 적어도 약 40 mg/ml, 적어도 약 45 mg/ml, 적어도 약 45 mg/ml, 적어도 약 50 mg/ml의 함량을 사용할 수 있다.In some embodiments, the content of water-soluble alpha-herix structured fibroin is at least about 5 mg/ml, at least about 10 mg/ml, at least about 15 mg/ml, at least about 20 mg/ml, at least about 25 mg/ml, at least about 30 mg/ml, at least about 35 mg/ml, at least about 40 mg/ml, at least about 45 mg/ml, at least about 45 mg/ml, at least about 50 mg/ml can be used
본 발명의 상기 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 적어도 약 1개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 12개월 적어도 약 24개월, 적어도 약 36개월 혹은 그 이상에서도 섭씨 0도 내지는 40도상에서 적어도 약 99몰 백분율, 적어도 약 99몰 백분율이상의 구조적으로 알파헤릭스를 가질 수 있다.The water-soluble alpha-herix structure fibroin powder of the present invention is at least about 1 month, at least about 3 months, at least about 6 months, at least about 12 months, at least about 24 months, at least about 36 months or more at 0 degrees Celsius It may have at least about 99 mole percent, and at least about 99 mole percent or more structurally alpha-helix in degrees to 40 degrees.
본 발명에서는 구조적으로 상이한 두 종의 피브로인은 임의의 비율로 분해되도록 조정될 수 있다. 일부 실시예에서 구조적으로 상이한 두 종의 피브로인은 임의의 소정 기간에 걸쳐, 예를 들어 수주, 수개월 또는 수년 동안 그의 원래 부피의 적어도 일부를 분해하도록 조정될 수 있다. 일부 실시예에서 구조적으로 상이한 두 종의 피브로인은 예를 들어 약 6주 내지 12주, 적어도 약 12주 내지 24주, 적어도 약 24주 내지 48주, 적어도 약 48주 내지 60주, 적어도 60주 내지 120주, 적어도 약 120주 내지 240주, 또는 그 초과되는 기간내에서 그의 원래 부피의 50% 이하 (예를 들어, 최초 투입 부피의 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 그 미만)가 분해되도록 조정될 수 있다. In the present invention, two structurally different species of fibroin can be adjusted to degrade at any rate. In some embodiments, two structurally different species of fibroin may be tuned to degrade at least a portion of their original volume over any given period of time, for example weeks, months or years. In some embodiments, the two structurally different species of fibroin are, for example, about 6 to 12 weeks, at least about 12 to 24 weeks, at least about 24 to 48 weeks, at least about 48 to 60 weeks, at least about 60 to 60 weeks. degrades no more than 50% (e.g., no more than 40%, no more than 30%, no more than 20% or less of the original input volume) of its original volume within 120 weeks, at least about 120 to 240 weeks, or longer can be adjusted so that
본 발명은 실온조건에서 졸 상태로 존재하고, 생체내에서 겔 상태로 변환되는 특성을 가지고 있으므로 주사제로 제조하여 쉽게 생체에 주입이 가능하다. 또한, 생체 내에서는 겔 상태로 변환되는 특성을 가지고 있으므로 원하는 조직 부위에 점착되어 겔 상태로 안정하게 장시간 체류하는 것이 가능하다. 이로써 타겟 조직에 점착되어 있는 겔에 의해 상처와 조직이 원천적으로 분리되어 조직간의 유착을 방지하거나, 또는 피부에 볼륨감을 부여하는 것이 가능하다. Since the present invention exists in a sol state at room temperature and has a property of being converted into a gel state in vivo, it can be prepared as an injection and easily injected into a living body. In addition, since it has a property of being converted into a gel state in vivo, it is possible to adhere to a desired tissue site and stay in a gel state stably for a long time. As a result, it is possible to prevent adhesion between tissues by fundamentally separating wounds and tissues by the gel adhered to the target tissue, or to impart a sense of volume to the skin.
본 발명의 일측면에서 적용되기에 최적합한 하이드로겔은 전체 조성물 중 삼원공중합 함량은 150mg/ml 내지 300mg/ml인 조건에서 측정한 저임계 용액온도가 섭씨 21도 내지 39도인 하이드로겔이다.The hydrogel most suitable for application in one aspect of the present invention is a hydrogel having a low critical solution temperature of 21 to 39 degrees Celsius measured under the condition that the terpolymer content in the entire composition is 150 mg / ml to 300 mg / ml.
본 발명에서는 하이드로겔의 저임계 용액온도를 PEO-PPO-PEO 삼원공중합체의 PEO 단위체 함량과 중량평균 분자량을 통하여 조절가능하다.In the present invention, the low-critical solution temperature of the hydrogel can be controlled through the PEO unit content and weight average molecular weight of the PEO-PPO-PEO terpolymer.
본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드 삼원공중합체는 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 단위체의 함량이 65 내지 85 몰% 이고, 중량평균분자량이 7,500 내지 16,000 g/mol 인 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체 150mg/ml 내지 300mg/ml로 이루어진 혼합물을 대상 목적에 따라 농도의 조정이 가능하다. The polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide terpolymer used in the present invention has a polyethylene oxide (PEO) unit content of 65 to 85 mol% and a weight average molecular weight of 7,500 to 16,000 g/mol Phosphorus Polyethylene Oxide (PEO) - Polypropylene Oxide (PPO) - Polyethylene Oxide (PEO) Terpolymer 150 mg / ml to 300 mg / ml of a mixture can be adjusted in concentration according to the target purpose.
본 발명의 사용되는 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드 삼원공중합체는 타겟 부위의 조직 크기 및 목적하는 특성에 의해 그 함량이 달라질 수 있다. The content of the polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide terpolymer used in the present invention may vary depending on the tissue size and desired characteristics of the target site.
일부 실시예에서는 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드 삼원공중합체는 물이 포함된 전체 조성물에 적어도 약 150mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 37±2도에서 겔화되며, 적어도 약 160mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 36±2도에서 겔화되며, 적어도 약 170mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 35±2도에서 겔화되며, 적어도 약 180mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 35±2도에서 겔화되며, 적어도 약 190mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 34±2도에서 겔화되며, 적어도 약 200mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 33±2도에서 겔화되며, 적어도 약 210mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 32±2도에서 겔화되며, 적어도 약 220mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 31±2도에서 겔화되며, 적어도 약 230mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 30±2도에서 겔화되며, 적어도 약 240mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 29±2도에서 겔화되며, 적어도 약 250mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 28±2도에서 겔화되며, 적어도 약 260mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 27±2도에서 겔화되며, 적어도 약 270mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 26±2도에서 겔화되며, 적어도 약 280mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 25±2도에서 겔화되며, 적어도 약 290mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 24±2도에서 겔화되며, 적어도 약 300mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 23±2도에서 겔화가 이루어져 특정 범위 조직에 사용 목적에 따라 조정 될 수 있다.In some embodiments, the polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide terpolymer has a sol-gel transition temperature of at least about 150 mg/ml to the total composition with water and gels at 37 ± 2 degrees Celsius. At least about 160 mg / ml, the sol-gel transition temperature is gelated at 36 ± 2 degrees Celsius, when at least about 170 mg / ml, the sol-gel transition temperature is gelated at 35 ± 2 degrees Celsius, and at least about 180 mg / ml ml at a sol-gel transition temperature of 35±2 degrees Celsius, at least about 190 mg/ml at a sol-gel transition temperature of 34±2 degrees Celsius, and at least about 200 mg/ml of a sol-gel. The sol-gel transition temperature is gelation at 33 ± 2 degrees Celsius at least about 210 mg/ml, the sol-gel transition temperature is gelation at 32 ± 2 degrees Celsius when at least about 220 mg/ml, and the sol-gel transition temperature is 31 ± 2 degrees Celsius at least about 220 mg/ml. 2 degrees Celsius, at least about 230 mg/ml, a sol-gel transition temperature of 30 ± 2 degrees Celsius, and at least about 240 mg/ml, a sol-gel transition temperature of 29 ± 2 degrees Celsius; At least about 250 mg/ml the sol-gel transition temperature gels at 28 ± 2 degrees Celsius, when at least about 260 mg/ml the sol-gel transition temperature gels at 27 ± 2 degrees Celsius, and at least about 270 mg/ml days. When the sol-gel transition temperature is gelled at 26 ± 2 degrees Celsius, the sol-gel transition temperature when at least about 280 mg / ml is gelled at 25 ± 2 degrees Celsius, and the sol-gel transition temperature when at least about 290 mg / ml is gelated at 24 ± 2 degrees Celsius, and when at least about 300 mg/ml, the sol-gel transition temperature is gelated at 23 ± 2 degrees Celsius and can be adjusted according to the purpose of use for a specific range of tissues.
본 발명에 두 구조의 피브로인과 히알루론산을 혼합하여 조직내 주입 가능한 주사제로 제조하여 쉽게 생체에 주입이 가능하다. 또한, 원하는 조직 부위에 점탄성이 증가되어 장시간 체류하는 것이 가능하다. In the present invention, fibroin and hyaluronic acid of the two structures are mixed to prepare an intra-tissue injectable injection, so that it can be easily injected into the living body. In addition, it is possible to stay in the desired tissue site for a long time with increased viscoelasticity.
본 발명에 혼합되는 가교된 히알루론산은 본 명세서에서 하기의 공정 프로세스는 각각의 실험예에 해당할 수 있다.The cross-linked hyaluronic acid mixed in the present invention may correspond to each experimental example in the following process.
본 발명의 실시예에서 저분자량 및 고분자 히알루론산 조성물을 제조하는 단계의 히알루론의 투입량은, pH 12 내지 14의 강 알칼리 수용액 에서 상기의 히알루론 농도는 적어도 약 80mg/ml, 적어도 약 90mg/ml, 적어도 약 100mg/ml, 적어도 약 110mg/ml, 적어도 약 120mg/ml, 적어도 약 130mg/ml, 적어도 약 140mg/ml, 적어도 약 150mg/ml을 사용하여 히알루론산을 가교 할 수 있다. In an embodiment of the present invention, the input amount of hyaluron in the step of preparing the low molecular weight and high molecular weight hyaluronic acid composition is at least about 80 mg/ml, at least about 90 mg/ml in a strong alkaline aqueous solution of pH 12 to 14. , at least about 100 mg/ml, at least about 110 mg/ml, at least about 120 mg/ml, at least about 130 mg/ml, at least about 140 mg/ml, at least about 150 mg/ml may be used to crosslink hyaluronic acid.
일 구현예에서, 저분자량의 히알루론산 분자량은 적어도 약 400,000Da 내지 500,000Da, 적어도 500,000Da 내지 600,000Da를 사용할 수 있다.In one embodiment, the molecular weight of low molecular weight hyaluronic acid may be at least about 400,000 Da to 500,000 Da, or at least 500,000 Da to 600,000 Da.
일 구현예에서, 고분자량의 히알루론산 분자량은 적어도 약 1,700,000Da 내지 1,800,000Da, 적어도 약 1,800,000Da 내지 1,900,000Da, 적어도 약 1,900,000 내지 2,000,000Da, 적어도 약 2,000,000Da 내지 2,100,000Da을 사용하여 가교 결합 할 수 있다.In one embodiment, the high molecular weight hyaluronic acid molecular weight can be crosslinked using at least about 1,700,000 Da to 1,800,000 Da, at least about 1,800,000 Da to 1,900,000 Da, at least about 1,900,000 to 2,000,000 Da, at least about 2,000,000 Da to 2,100,000 Da. .
상기 본 발명의 저분자량 대비 고분자량 히알루론산 비율은 적어도 약 10 대 90, 적어도 약 20 대 80, 적어도 약 30 대 70으로 혼합 하여 가교 결할 할 수 있다.The ratio of the high molecular weight hyaluronic acid to the low molecular weight of the present invention may be crosslinked by mixing at least about 10:90, at least about 20:80, and at least about 30:70.
상기 본 발명의 가교제 함량은 적어도 약 30㎕/ml , 적어도 약 40㎕/ml, 적어도 약 50㎕/ml, 적어도 약 60㎕/ml, 적어도 약 70㎕/ml, 적어도 약 80㎕/ml, 적어도 약 90㎕/ml, 적어도 약 100㎕/ml을 사용하여 가교 결합 할 수 있다.The crosslinking agent content of the present invention is at least about 30 μl / ml, at least about 40 μl / ml, at least about 50 μl / ml, at least about 60 μl / ml, at least about 70 μl / ml, at least about 80 μl / ml, at least About 90 μl/ml, or at least about 100 μl/ml can be used for cross-linking.
본 발명에서 구조적으로 상이한 두 종의 피브로인과 혼합되는 가교된 히알루론산의 함량은 전체 조성물대비 적어도 약 20mg/ml, 적어도 약 30mg/ml, 적어도 약 40mg/ml, 적어도 약 50mg/ml의 함량을 포함하여 사용 할 수 있다.In the present invention, the content of cross-linked hyaluronic acid mixed with two structurally different fibroins is at least about 20 mg/ml, at least about 30 mg/ml, at least about 40 mg/ml, and at least about 50 mg/ml based on the total composition. and can be used.
본 발명의 하이드로겔 혼합물에 보조제를 첨가하여 사용할 수 있다.An adjuvant may be added to the hydrogel mixture of the present invention for use.
상기 보조제는 리도카인, 디 마니톨을 첨가하여 사용할 수 있다.The adjuvant may be used by adding lidocaine or dimanitol.
상기 보조제인 리도카인 함유량은 전체 조성물의 2mg/ml 내지 4mg/ml을 사용할 수 있으며, 디 마니톨 함유량은 전체 조성물의 1mg/ml 내지 50mg/ml의 농도를 포함하여 사용 할 수 있다.The content of lidocaine as the adjuvant may be used in a concentration of 2 mg/ml to 4 mg/ml of the total composition, and the content of dimanitol may be used including a concentration of 1 mg/ml to 50 mg/ml of the total composition.
이하, 본 발명의 다양한 구현예에 대하여 설명한다.Hereinafter, various embodiments of the present invention will be described.
1. 조직의 충진 또는 재생을 목적으로 구조적으로 상이한 피브로인, 99%이상 물에 가용성인 나선형의 알파헤릭스 구조 피브로인과 99%이상 물에 불용성인 병풍구조의 베타시트 구조 피브로인을 혼합하여 사용하는 것을 특징으로하는 조성물1. For the purpose of tissue filling or regeneration, structurally different fibroin, 99% or more water-soluble helical alpha-herix structure fibroin and 99% or more water insoluble sheet structure beta-sheet structure fibroin are mixed and used. Composition characterized by
2. 충진 또는 확대되는 조직에 구조적으로 상이한 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더 와 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자의 혼합물, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체 및 보조 첨가제인 리도카인, 디-마니톨을 포함하는 조성물을 주사 주입이 가능한 것을 포함하며, 여기서 하이드로겔 조성물의 일부는 적어도 1개월 동안 조직 내에서 그의 원래 부피의 적어도 30%이상을 유지하기 위한 조성물. 2. A mixture of water-soluble alpha-herix structured fibroin powder and water-insoluble beta-structured fibroin particles, which are structurally different in the tissue to be filled or expanded, polyethylene oxide (PEO) - polypropylene oxide (PPO) - polyethylene oxide (PEO) terpolymers and co-excipients lidocaine, di-mannitol, wherein a portion of the hydrogel composition is at least 30% of its original volume in the tissue for at least 1 month. A composition for maintaining ideals.
3. 충진 또는 확대되는 조직에 구조적으로 상이한 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더 와 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자의 혼합물, 가교결합된 히알루론산 하이드로겔 및 보조첨가제인 리도카인, 디-마니톨을 포함하는 조성물을 주사 주입이 가능한 것을 포함하며, 여기서 하이드로겔 조성물의 일부는 적어도 3개월 동안 조직 내에서 그의 원래 부피의 적어도 30%이상을 유지하기 위한 조성물.3. A mixture of water-soluble alpha-herix structured fibroin powder and water-insoluble beta-structured fibroin particles, cross-linked hyaluronic acid hydrogel, and auxiliary additives lidocaine and di- A composition comprising an injectable composition comprising mannitol, wherein a portion of the hydrogel composition retains at least 30% of its original volume in a tissue for at least 3 months.
4. 상기 2. 또는 3.에 있어서, 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더, 베타 구조의 피브로인 입자는 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티브를 0.5 내지 5mol%를 전체 아미노산 서열중 함유 하는 조성물. 4. The composition according to 2. or 3. above, wherein the alpha-helix structured fibroin powder and beta-structured fibroin particles contain 0.5 to 5 mol% of the RGD (Arg-Gly-Asp) motif in the total amino acid sequence.
5. 상기 2.에 있어서, 본 발명에 제조시 혼합해서 사용 되어지는 피브로인은 구조적으로 각각 파우더는 99몰%이상 알파헤릭스, 입자는 99몰%이상 베타구조로 이루어진 것을 혼합 사용하는것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.5. In the above 2., the fibroin used in combination during manufacture in the present invention is structurally composed of 99 mol% or more of the alpha-helix powder and 99 mol% or more of the beta structure of the particles. A hydrogel composition to do.
6. 상기 5.에 있어서, 본 발명에 제조시 사용되는 피브로인 파우더의 무게 분자량(Mw)은 3,000Da 내지 10,000Da를 가지며 다분산지수(PDI)가 1.5 내지 2.0을 가지는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물. 6. In the above 5., the weight molecular weight (Mw) of the fibroin powder used in the manufacture of the present invention is 3,000 Da to 10,000 Da, and the polydispersity index (PDI) is 1.5 to 2.0 Hydrogel composition, characterized in that it has .
7. 상기 2.에 있어서, 본 발명에 제조시 사용되는 피브로인 파우더의 함량은 전체 조성물의 5mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.7. The hydrogel composition according to 2. above, wherein the content of the fibroin powder used in the preparation of the present invention is 5 mg/ml to 50 mg/ml of the total composition.
8. 상기 2.에 있어서, 본 발명의 제조시 사용되는 피브로인 입자의 형태는 비정형 내지 구형을 가지며, 입자 평균 크기는 1㎛ 내지 100㎛이며, 피브로인 입자의 함량은 전체 조성물의 1mg/ml 내지 100mg/ml을 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.8. In the above 2., the shape of the fibroin particles used in the preparation of the present invention has an irregular to spherical shape, the average particle size is 1 μm to 100 μm, and the content of the fibroin particles is 1 mg / ml to 100 mg of the total composition Hydrogel composition characterized in that / ml is used.
9. 상기 5.에 있어서, 본 발명에 제조시 사용되는 피브로인 입자의 무게 분자량(Mw)는 3 000Da 내지 100 000Da를 가지며 다분산지수(PDI)가 1.5 내지 2.0을 가지는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.9. The hydrogel composition according to 5 above, wherein the weight molecular weight (Mw) of the fibroin particles used in the preparation of the present invention is 3 000 Da to 100 000 Da and the polydispersity index (PDI) is 1.5 to 2.0. .
10. 상기 5.에 있어서, 본 발명에 제조시 혼합해서 사용 되어지는 피브로인은 구조적으로 각각 파우더는 99몰%이상 알파헤릭스인 용액상태와 입자는 99몰%이상 병풍구조로 이루어진 것을 혼합하였을 때 제타전위가 10mv이하이며, 중심부는 피브로인 입자이고 입자 외각은 피브로인 파우더 용액이 코팅되어있는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.10. In the above 5., when the fibroin mixed and used in the production of the present invention is structurally mixed with a solution state in which the powder is 99 mol% or more of alpha-helix and the particles are 99 mol% or more of a sheet structure A hydrogel composition characterized in that the zeta potential is 10 mv or less, the center is a fibroin particle, and the outside of the particle has a structure in which a fibroin powder solution is coated.
11. 상기 2.에 있어서, 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드 삼원공중합체는 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 단위체의 함량이 65 내지 85 몰% 이고, 중량평균분자량이 7500 내지 16000 g/mol 인 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체는 전체 조성물 중 차지하는 함량이 150mg/ml 내지 300mg/ml로 이루어진 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.11. In the above 2., the polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide terpolymer has a polyethylene oxide (PEO) unit content of 65 to 85 mol% and a weight average molecular weight of 7500 to 16000 Polyethylene oxide (PEO) - polypropylene oxide (PPO) - polyethylene oxide (PEO) terpolymer in g / mol is a hydrogel, characterized by using a mixture consisting of 150 mg / ml to 300 mg / ml in the total composition. gel composition.
12. 상기 2.에 있어서, 본 발명의 조성물에 혼합되는 보조제인 리도카인은 전체 하이드로겔 조성물의 2mg/ml 내지 4mg/ml, 디-마니톨은 전체 하이드로겔 조성물의 1mg/ml 내지 50mg/ml를 혼합 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.12. In the above 2., the adjuvant mixed in the composition of the present invention, lidocaine is 2mg/ml to 4mg/ml of the total hydrogel composition, and di-mannitol is 1mg/ml to 50mg/ml of the total hydrogel composition. Hydrogel composition, characterized in that mixed use.
13. 상기 2.에 있어서, 본 발명의 조성물을 사용하여 연조직 복구 및 확대의 목적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.13. The hydrogel composition according to 2. above, characterized in that the composition of the present invention is used for the purpose of soft tissue repair and enlargement.
14. 상기 2.에 있어서, 본 발명의 혼합 조성물을 사용하여 연조직 주입시 졸에서 겔로 전이되는 온도 범위는 섭씨 21도 내지 39도에서 겔화가 이루어지는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.14. The hydrogel composition according to 2. above, characterized in that the gelation occurs at 21 to 39 degrees Celsius when the mixture composition of the present invention is injected into the soft tissue.
15. 상기 2.에 있어서, 본 발명의 조성물을 사용하여 조직간의 유착을 방지하는 목적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.15. The hydrogel composition according to 2. above, characterized in that the composition of the present invention is used for the purpose of preventing adhesion between tissues.
16. 상기 3.에 있어서, 본 발명에 제조시 혼합해서 사용 되어지는 피브로인은 구조적으로 각각 파우더는 99몰%이상 알파헤릭스, 입자는 99몰%이상 병풍구조 이루어진 것을 혼합 사용하는 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.16. In the above 3., the fibroin mixed and used in the manufacture of the present invention is structurally composed of 99 mol% or more of alpha-helix powder and 99 mol% or more of the folding screen structure, respectively. gel composition.
17. 상기 16.에 있어서, 본 발명에 제조시 사용되는 피브로인 파우더의 무게 분자량(Mw)은 3 000Da 내지 10 000Da를 가지며 다분산지수(PDI)가 1.5 내지 2.0을 가지는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물. 17. The hydrogel composition according to 16 above, wherein the weight molecular weight (Mw) of the fibroin powder used in the preparation of the present invention is 3 000 Da to 10 000 Da and the polydispersity index (PDI) is 1.5 to 2.0. .
18. 상기 16.에 있어서, 본 발명에 제조시 사용되는 피브로인 파우더의 함량은 전체 조성물의 5mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.18. The hydrogel composition according to 16. above, wherein the content of the fibroin powder used in the preparation of the present invention is 5 mg/ml to 50 mg/ml of the total composition.
19. 상기 3.에 있어서, 본 발명의 제조시 사용되는 피브로인 입자의 형태는 비정형 내지 구형을 가지며, 입자 평균 크기는 1㎛ 내지 100㎛이며, 피브로인 입자의 함량은 전체 조성물의 1mg/ml 내지 100mg/ml을 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.19. In the above 3., the shape of the fibroin particles used in the preparation of the present invention has an irregular to spherical shape, the average particle size is 1 μm to 100 μm, and the content of the fibroin particles is 1 mg / ml to 100 mg of the total composition Hydrogel composition characterized in that / ml is used.
20. 상기 16.에 있어서, 본 발명에 제조시 사용되는 피브로인 입자의 무게 분자량(Mw)는 3 000Da 내지 100 000Da를 가지며 다분산지수(PDI)가 1.5 내지 2.0을 가지는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.20. The hydrogel composition according to 16 above, wherein the weight molecular weight (Mw) of the fibroin particles used in the preparation of the present invention is 3 000 Da to 100 000 Da and the polydispersity index (PDI) is 1.5 to 2.0. .
21. 상기 16.에 있어서, 본 발명에 제조시 혼합해서 사용 되어지는 피브로인은 구조적으로 각각 파우더는 99몰%이상 알파헤릭스인 용액상태와 입자는 99몰%이상 병풍구조로 이루어진 것을 혼합하였을 때 제타전위가 10mv이하이며, 중심부는 피브로인 입자이고 입자 외각은 피브로인 파우더 용액이 코팅되어있는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.21. In the above 16., the fibroin used in mixing in the manufacture of the present invention is structurally composed of 99 mol% or more of the alpha-helix powder and 99 mol% or more of the particles having a sheet structure. A hydrogel composition characterized in that the zeta potential is 10 mv or less, the center is a fibroin particle, and the outside of the particle has a structure in which a fibroin powder solution is coated.
22. 상기 3.에 있어서, 본 발명에 제조시 혼합해서 사용 되어지는 히알루론산은 히알루론산 평균분자량이 400 000Da 내지 600 000Da와 1 700 000Da 내지 2 100 000Da인 히알루론산을 저분자 히알루론산과 고분자량의 히알루론산의 비율을 1 대 9 내지 3 대 7을 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.22. In the above 3., the hyaluronic acid used in mixing in the production of the present invention is hyaluronic acid having an average molecular weight of 400 000Da to 600 000Da and 1 700 000Da to 2 100 000Da of low molecular weight hyaluronic acid and high molecular weight hyaluronic acid. A hydrogel composition characterized in that the ratio of hyaluronic acid is mixed and used in a ratio of 1 to 9 to 3 to 7.
23. 상기 22.에 있어서, 본 발명에 제조시 히알루론산의 가교제인 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르의 농도는 히알루론산 기준 30㎕/g 내지 100㎕/g 을 사용하며, 수용액 대비 히알루론산 농도는 80mg/ml 내지 150mg/ml로 가교하여 혼합 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.23. In the above 22., the concentration of 1,4-butanediol diglycidyl ether, which is a crosslinking agent for hyaluronic acid, used in the present invention is 30 μl / g to 100 μl / g based on hyaluronic acid, hyaluronic acid compared to aqueous solution A hydrogel composition characterized in that the concentration of ronic acid is crosslinked at 80 mg / ml to 150 mg / ml and used in combination.
24. 상기 3.에 있어서, 본 발명에 제조시 혼합 되어지는 가교된 히알루론산의 전체 함량은 20mg/ml 내지 50mg/ml을 유지하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.24. The hydrogel composition according to 3. above, wherein the total content of the cross-linked hyaluronic acid mixed during preparation according to the present invention is maintained at 20 mg/ml to 50 mg/ml.
25. 상기3.에 있어서, 본 발명의 조성물에 혼합되는 보조제인 리도카인은 전체 하이드로겔의 중량대비 2mg/ml 내지 4mg/ml, 디-마니톨은 전체 하이드로겔 조성물의 1mg/ml 내지 50mg/ml를 혼합 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.25. In the above 3., lidocaine, which is an adjuvant mixed in the composition of the present invention, is 2 mg/ml to 4 mg/ml based on the weight of the total hydrogel, and di-mannitol is 1 mg/ml to 50 mg/ml based on the total weight of the hydrogel composition. A hydrogel composition characterized in that the mixed use.
26. 상기 3.에 있어서, 본 발명의 조성물을 사용하여 연조직 복구 및 확대의 목적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.26. The hydrogel composition according to 3. above, characterized in that the composition of the present invention is used for the purpose of soft tissue repair and enlargement.
27. 상기 3.에 있어서, 본 발명의 조성물을 사용하여 연골조직 복구 및 수복을 목적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물.27. The hydrogel composition according to 3. above, characterized in that the composition of the present invention is used for the purpose of repairing and restoring cartilage tissue.
이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 설명한다.Hereinafter, various aspects of the present invention will be described.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “주사주입이 가능한 하이드로겔 유착방지제”는 일반적으로 최소 침습 절차를 사용하여 봉합된 조직 부위에 체강 또는 해부학적 개구부를 통해 대상체의 신체로 들어가서 수행되는 절차를 거쳐 침투 및 주입된 하이드로겔 조성물은 체내 온도에 의해 점착이 되어 조직간의 가드 역할을 하여 조직의 유착을 방지한다.As used herein, the term “injectable hydrogel anti-adhesion agent” generally refers to a procedure performed by entering the body of a subject through a body cavity or an anatomical opening to a tissue site that is sutured using a minimally invasive procedure. The infiltrated and injected hydrogel composition becomes sticky by body temperature and acts as a guard between tissues to prevent tissue adhesion.
본 발명의 일측면은 주사주입이 가능한 하이드로겔 유착방지제를 제공한다. One aspect of the present invention provides a hydrogel anti-adhesion agent capable of injection.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 하이드로겔 유착방지제는 피브로인 및 PEO-PPO-PEO의 삼원 공중합체를 포함한다.In one aspect of the present invention, the hydrogel anti-adhesion agent includes a terpolymer of fibroin and PEO-PPO-PEO.
일 구현예에 있어서, 상기 피브로인은 구조적으로 물에 가용성인 99몰% 이상의 알파헤릭스 구조의 피브로인 및 조직적으로 물에 불용성인 99몰% 이상의 베타구조의 피브로인을 포함한다.In one embodiment, the fibroin includes 99 mol% or more of alpha-herix structure fibroin that is structurally soluble in water and 99 mol% or more of beta-structure fibroin that is structurally insoluble in water.
일 실시예에서, 주사주입이 가능한 하이드로겔 유착방지제는 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,000Da이며, 구조적으로 물에 가용성인 99몰% 이상의 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 전체 조성물 대비 5mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하며, 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 100,000Da 이며, 구조적으로 물에 불용성인 99몰% 이상의 베타구조의 피브로인 입자 평균크기가 1㎛ 내지 40㎛ 범위의 입자를 전체 조성물 대비 1mg/ml 내지 100mg/ml를 사용하며, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 단위체 함량이 65몰% 내지 85몰%이고, 중량평균분자량(Mw) 가 7,500g/mol 내지 16,000g/mol인 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체는 전체 조성물대비 150mg/ml 내지 300mg/ml을 포함하는 조성물을 제공한다.In one embodiment, the injectable hydrogel anti-adhesion agent has a weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 10,000 Da, and the fibroin powder having a structurally water-soluble alpha-herix structure of 99 mol% or more is 5 mg relative to the total composition. /ml to 50mg/ml, a weight average molecular weight (Mw) of 3,000Da to 100,000Da, structurally insoluble in water, 99 mol% or more beta-structured fibroin particles with an average size ranging from 1㎛ to 40㎛ Polyethylene having a polyethylene oxide (PEO) unit content of 65 mol% to 85 mol% and a weight average molecular weight (Mw) of 7,500 g / mol to 16,000 g / mol, using 1 mg / ml to 100 mg / ml relative to the total composition Oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide (PEO) terpolymer provides a composition containing 150 mg/ml to 300 mg/ml relative to the total composition.
일 실시예에서 상기 제조된 조성물은 섭씨 21도 내지 섭씨 39도에서 졸-겔 전이가 일어나는 동시에 상기의 조성물의 복합 작용에 의해 조직간의 유착을 방지하는 역할을 한다.In one embodiment, the prepared composition serves to prevent adhesion between tissues by a complex action of the composition while the sol-gel transition occurs at 21 degrees Celsius to 39 degrees Celsius.
보다 구체적으로, 일 실시예에서, 주사주입이 가능한 하이드로겔 유착방지제는 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,000Da이며, 구조적으로 물에 가용성인 99몰% 이상의 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 전체 조성물 대비 5mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하며, 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 100,000Da 이며, 구조적으로 물에 불용성인 99몰% 이상의 베타구조의 피브로인 입자 평균크기가 10㎛ 내지 20㎛ 범위의 입자를 전체 조성물 대비 5mg/ml 내지 50mg/ml를 사용하며, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 단위체 함량이 65몰% 내지 85몰%이고, 중량평균분자량(Mw) 가 7,500g/mol 내지 16,000g/mol인 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체는 전체 조성물대비 150mg/ml 내지 300mg/ml을 포함하는 조성물을 제공한다. More specifically, in one embodiment, the injectable hydrogel anti-adhesion agent has a weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 10,000 Da, and a 99 mol% or more alpha-herix structure fibroin powder that is structurally soluble in water 5mg/ml to 50mg/ml is used relative to the total composition, the weight average molecular weight (Mw) is 3,000Da to 100,000Da, and the average size of fibroin particles having a beta structure of 99 mol% or more, which is structurally insoluble in water, is 10㎛ to 20 Particles in the range of ㎛ are used at 5 mg / ml to 50 mg / ml compared to the total composition, the polyethylene oxide (PEO) unit content is 65 mol% to 85 mol%, and the weight average molecular weight (Mw) is 7,500 g / mol to 16,000 g / mol of the polyethylene oxide (PEO) -polypropylene oxide (PPO) -polyethylene oxide (PEO) terpolymer provides a composition containing 150 mg / ml to 300 mg / ml relative to the total composition.
일 실시예에서 상기 제조된 조성물은 섭씨 21도 내지 섭씨 39도에서 졸-겔 전이가 일어나며, 보조첨가제인 리도카인은 전체 조성물 대비 2mg/ml 내지 4mg/ml, 디 마니톨은 전체 조성물 대비 1mg/ml 내지 50mg/ml을 사용한 하이드로겔 혼합물로써 상기의 조성물의 복합 작용에 의해 조직간의 유착을 방지하는 역할을 한다.In one embodiment, the prepared composition undergoes sol-gel transition at 21 degrees Celsius to 39 degrees Celsius, and the auxiliary additive lidocaine is 2 mg / ml to 4 mg / ml, compared to the total composition Dimanitol is 1 mg / ml to 50 mg/ml of the hydrogel mixture, which serves to prevent adhesion between tissues by the combined action of the above composition.
본 발명에서 명기된 상기의 조성물은 조직간의 유착을 방지하는 목적으로 사용될 수 있다.The above composition specified in the present invention may be used for the purpose of preventing adhesion between tissues.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 “주사가능한 조성물”은 일반적으로 최소침습 절차를 사용하여 타겟 조직으로 전달 또는 투여될 수 있는 조성물을 가르킨다. As used herein, the term “injectable composition” generally refers to a composition that can be delivered or administered to a target tissue using minimally invasive procedures.
일부 시험예에서 주사가능한 조성물은 주사에 의해 조직으로 투여 또는 전달될수 있다. 또한 바늘, 캐뉼라 및 튜브, 예를 들어 카테터의 삽입을 통해 타겟 조직으로 전달될 수 있다.In some test instances, an injectable composition may be administered or delivered to a tissue by injection. It may also be delivered to the target tissue through insertion of needles, cannulas, and tubes, such as catheters.
본 발명의 일측면은 주사가능한 조성물을 제공하고자 한다.One aspect of the present invention is to provide an injectable composition.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 주사가능한 조성물은 피브로인 혼합물 및 PEO-PPO-PEO 삼원공중합체를 포함한다.In one aspect of the present invention, the injectable composition comprises a fibroin mixture and a PEO-PPO-PEO terpolymer.
일 실시예에서, 상기 주사가능한 조성물은 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,000Da이며, 구조적으로 물에 가용성인 99몰% 이상의 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 전체 조성물 대비 5mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하며, 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 100,000Da 이며, 구조적으로 물에 불용성인 99몰% 이상의 베타구조의 피브로인 입자 평균크기가 40㎛ 내지 100㎛범위의 입자를 전체 조성물 대비 1mg/ml 내지 100mg/ml를 사용하며, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 단위체 함량이 65몰% 내지 85몰%이고, 중량평균분자량(Mw) 가 7,500g/mol 내지 16,000g/mol인 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체는 전체 조성물대비 150mg/ml 내지 300mg/ml을 포함한 조성물을 제공한다. 상기 제조된 조성물은 섭씨 21도 내지 섭씨 39도에서 졸-겔 전이가 일어나는 동시에 상기의 조성물의 복합 작용에 의해 타겟 조직의 유지 및 확대 역할을 한다.In one embodiment, the injectable composition has a weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 10,000 Da, and the fibroin powder having a structurally water-soluble alpha-herix structure of 99 mol% or more is 5 mg/ml to 50 mg relative to the total composition. / ml, weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 100,000 Da, structurally insoluble in water, 99 mol% or more beta-structured fibroin particles with an average size in the range of 40 μm to 100 μm compared to the total composition Polyethylene oxide (PEO) using 1 mg/ml to 100 mg/ml, having a polyethylene oxide (PEO) unit content of 65 mol% to 85 mol%, and a weight average molecular weight (Mw) of 7,500 g/mol to 16,000 g/mol -Polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide (PEO) terpolymer provides a composition including 150 mg/ml to 300 mg/ml relative to the total composition. The prepared composition plays a role in maintaining and expanding the target tissue by the complex action of the composition at the same time as the sol-gel transition occurs at 21 degrees Celsius to 39 degrees Celsius.
보다 구체적으로, 일 실시예에서, 상기 주사가능한 조성물은 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,000Da이며, 구조적으로 물에 가용성인 99몰% 이상의 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 전체 조성물 대비 5mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하며, 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,0000Da 이며, 구조적으로 물에 불용성인 99몰% 이상의 베타구조의 피브로인 입자 평균크기가 40㎛ 내지 75㎛범위의 입자를 전체 조성물 대비 5mg/ml 내지 50mg/ml를 사용하며, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 단위체 함량이 65몰% 내지 85몰%이고, 중량평균분자량(Mw) 가 7,500g/mol 내지 16,000g/mol인 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체는 전체 조성물대비 150mg/ml 내지 300mg/ml을 사용하여 제조된 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 섭씨 21도 내지 섭씨 39도에서 졸-겔 전이가 일어나며, 보조첨가제인 리도카인은 전체 조성물 대비 2mg/ml 중량백분율 내지 4mg/ml 중량백분율, 디 마니톨은 전체 조성물 대비 1mg/ml 내지 50mg/ml을 사용한 하이드로겔 혼합물로써 상기의 조성물의 복합 작용에 의해 타겟 조직의 유지 및 확대 역할을 한다.More specifically, in one embodiment, the injectable composition has a weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 10,000 Da, and 99 mol% or more of alpha-herix structured fibroin powder, which is structurally soluble in water, is 5 mg relative to the total composition. /ml to 50mg/ml is used, the weight average molecular weight (Mw) is 3,000Da to 10,0000Da, and the average size of fibroin particles having a beta structure of 99 mol% or more, which is structurally insoluble in water, is in the range of 40㎛ to 75㎛ The particles are used in an amount of 5 mg / ml to 50 mg / ml relative to the total composition, the polyethylene oxide (PEO) unit content is 65 mol% to 85 mol%, and the weight average molecular weight (Mw) is 7,500 g / mol to 16,000 g / mol Polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide (PEO) terpolymer provides a composition prepared by using 150 mg/ml to 300 mg/ml relative to the total composition. The composition undergoes sol-gel transition at 21 degrees Celsius to 39 degrees Celsius, and the auxiliary additive, lidocaine, is 2 mg/ml to 4 mg/ml weight percentage, based on the total composition, and Dimanitol is 1 mg/ml to 50 mg relative to the total composition It is a hydrogel mixture using / ml and plays a role in maintaining and expanding the target tissue by the complex action of the above composition.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 주사가능한 조성물은 피브로인 혼합물 및 가교결합된 히알루론산을 포함한다.In one aspect of the invention, the injectable composition comprises a mixture of fibroin and cross-linked hyaluronic acid.
일 구현예에 있어서, 상기 히알루론산은 저분자량 히알루론산과 고분자량 히알루론산이 서로 가교된 히알루론산이다.In one embodiment, the hyaluronic acid is hyaluronic acid in which low molecular weight hyaluronic acid and high molecular weight hyaluronic acid are crosslinked with each other.
일 실시예에서, 상기 주사가능한 조성물은 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,000Da이며, 구조적으로 물에 가용성인 99몰% 이상의 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 전체 조성물 대비 5mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하며, 무게 평균 분자량(Mw)가 3 000Da 내지 100 000Da 이며, 구조적으로 물에 불용성인 99몰% 이상의 베타구조의 피브로인 입자는 평균 크기 1㎛ 내지 40㎛범위의 입자를 전체 조성물 대비 1mg/ml 내지 100mg/ml를 사용하며, 히알루론산 평균분자량이 400,000Da 내지 600,000Da인 저분자량 히알루론산과 평균분자량이 1,700,000Da 내지 2,100,000Da인 고분자량 히알루론산을 1~3 : 9 ~7의 중량비율로 혼합하여 가교된 히알루론산 겔이며, 가교된 히알루론산의 평균 무게 분자량(Mw)는 1,700,000Da 내지 3,000,000Da이며, 가교된 히알루론산의 전체 조성물중 함량은 20mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물이다. 상기의 조성물의 복합 작용에 의해 타겟 조직의 유지 및 확대 역할을 한다.In one embodiment, the injectable composition has a weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 10,000 Da, and the fibroin powder having a structurally water-soluble alpha-herix structure of 99 mol% or more is 5 mg/ml to 50 mg relative to the total composition. /ml, the weight average molecular weight (Mw) is 3 000 Da to 100 000 Da, and the fibroin particles of a beta structure of 99 mol% or more, which are structurally insoluble in water, have an average size of 1 μm to 40 μm, compared to the total composition. Using 1mg/ml to 100mg/ml, low molecular weight hyaluronic acid with an average molecular weight of 400,000Da to 600,000Da and high molecular weight hyaluronic acid with an average molecular weight of 1,700,000Da to 2,100,000Da were mixed in a weight ratio of 1 to 3:9 to 7 It is a cross-linked hyaluronic acid gel by mixing in a ratio, the average weight molecular weight (Mw) of the cross-linked hyaluronic acid is 1,700,000 Da to 3,000,000 Da, and the content of the cross-linked hyaluronic acid in the total composition is 20 mg / ml to 50 mg / ml It is a hydrogel composition characterized in that. It plays a role in maintaining and expanding the target tissue by the complex action of the above composition.
보다 구체적으로, 일 실시예에서, 상기 주사가능한 조성물은 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,000Da이며, 구조적으로 물에 가용성인 99몰% 이상의 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 전체 조성물 대비 5mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하며, 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,0000Da 이며, 구조적으로 물에 불용성인 99몰% 이상의 베타구조의 피브로인 입자 평균 크기는 40㎛ 내지 100㎛를 전체 조성물 대비 1mg/ml 내지 100mg/ml 사용하며, 히알루론산 평균분자량이 400,000Da 내지 600,000Da인 저분자량 히알루론산과 평균분자량이 1,700,000Da 내지 2,100,000Da인 고분자량 히알루론산을 1~3 : 9~7의 중량비율로 혼합하여 가교된 히알루론산 겔이며, 가교된 히알루론산의 평균 무게 분자량(Mw)는 1,700,000Da 내지 3,000,000Da이며, 가교된 히알루론산의 전체 조성물중 함량은 20mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔 조성물이다. 상기의 조성물의 복합 작용에 의해 타겟 조직의 유지 및 확대 역할을 한다.More specifically, in one embodiment, the injectable composition has a weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 10,000 Da, and 99 mol% or more of alpha-herix structured fibroin powder, which is structurally soluble in water, is 5 mg relative to the total composition. /ml to 50mg/ml is used, the weight average molecular weight (Mw) is 3,000Da to 10,0000Da, and the average size of fibroin particles having a beta structure of 99 mol% or more, which is structurally insoluble in water, is 40㎛ to 100㎛ 1mg/ml to 100mg/ml is used relative to the composition, and a low molecular weight hyaluronic acid having an average molecular weight of 400,000Da to 600,000Da and a high molecular weight hyaluronic acid having an average molecular weight of 1,700,000Da to 2,100,000Da are used in a ratio of 1 to 3: 9 to 7 It is a cross-linked hyaluronic acid gel by mixing in a weight ratio, and the average weight molecular weight (Mw) of the cross-linked hyaluronic acid is 1,700,000 Da to 3,000,000 Da, and the content of the cross-linked hyaluronic acid in the total composition is 20 mg/ml to 50 mg/ml. It is a hydrogel composition characterized in that. It plays a role in maintaining and expanding the target tissue by the complex action of the above composition.
일 실시예에서, 상기 주사가능한 조성물은 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,000Da이며, 구조적으로 물에 가용성인 99몰% 이상의 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 전체 조성물 대비 5mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하며, 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 100,000Da 이며, 구조적으로 물에 불용성인 99몰% 이상의 베타구조의 피브로인 입자 평균 크기는 1㎛ 내지 40㎛를 전체 조성물 대비 1mg/ml 내지 100mg/ml 사용하며, 히알루론산 평균분자량이 400,000Da 내지 600,000Da인 저분자량의 히알루론산과 평균분자량이 1,700,000Da 내지 2,100,000Da인 고분자량의 히알루론산을 1~3 : 9 ~7의 중량비율로 혼합하여 가교된 히알루론산 겔이며, 가교된 히알루론산의 평균 무게 분자량(Mw)는 1,700,000Da 내지 3,000,000Da이며, 가교된 히알루론산의 전체 조성물중 함량은 20mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하며, 보조첨가제인 리도카인은 전체 조성물 대비 2mg/ml 내지 4mg/ml, 디 마니톨은 전체 조성물 대비 1mg/ml 내지 50mg/ml 을 포함하는 하이드로겔 혼합물로써 상기의 조성물의 복합 작용에 의해 타겟 조직의 유지 및 확대 역할을 한다.In one embodiment, the injectable composition has a weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 10,000 Da, and the fibroin powder having a structurally water-soluble alpha-herix structure of 99 mol% or more is 5 mg/ml to 50 mg relative to the total composition. / ml is used, the weight average molecular weight (Mw) is 3,000 Da to 100,000 Da, and the average size of the fibroin particles having a beta structure of 99 mol% or more, which is structurally insoluble in water, is 1 μm to 40 μm, 1 mg / ml relative to the total composition to 100 mg/ml, and a low molecular weight hyaluronic acid having an average molecular weight of 400,000 Da to 600,000 Da and a high molecular weight hyaluronic acid having an average molecular weight of 1,700,000 Da to 2,100,000 Da are used in a weight ratio of 1 to 3: 9 to 7. It is a cross-linked hyaluronic acid gel by mixing, the average weight molecular weight (Mw) of the cross-linked hyaluronic acid is 1,700,000 Da to 3,000,000 Da, and the content of the cross-linked hyaluronic acid in the total composition is 20 mg / ml to 50 mg / ml, A hydrogel mixture containing 2 mg/ml to 4 mg/ml of lidocaine as an additive and 1 mg/ml to 50 mg/ml of dimanitol based on the total composition, maintaining and expanding the target tissue by the combined action of the above compositions play a role
일 실시예에서, 상기 주사가능한 조성물은 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 10,000Da이며, 구조적으로 물에 가용성인 99몰% 이상의 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 전체 조성물 대비 5mg/ml 내지 50mg/ml을 사용하며, 무게 평균 분자량(Mw)가 3,000Da 내지 100,000Da 이며, 구조적으로 물에 불용성인 99몰% 이상의 베타구조의 피브로인 입자 평균 크기는 40㎛ 내지 100㎛를 전체 조성물 대비 1mg/ml 내지 100mg/ml 사용하며, 히알루론산 평균분자량이 400,000Da 내지 600,000Da인 저분자량 히알루론산과 평균분자량이 1,700,000Da 내지 2,100,000Da인 고분자량 히알루론산을 1~3 : 9~7의 중량비율로 혼합하여 가교된 히알루론산 겔이며, 가교된 히알루론산의 평균 무게 분자량(Mw)는 1,700,000Da 내지 3,000,000Da이며, 가교된 히알루론산의 전체 조성물중 함량은 20mg/ml 내지 50mg/ml을 포함하며, 보조첨가제인 리도카인은 전체 조성물 대비 2mg/ml 내지 4mg/ml, 디 마니톨은 전체 조성물 대비 1mg/ml 내지 50mg/ml 을 포함한 하이드로겔 혼합물로써 상기의 조성물의 복합 작용에 의해 타겟 조직의 유지 및 확대 역할을 한다. In one embodiment, the injectable composition has a weight average molecular weight (Mw) of 3,000 Da to 10,000 Da, and the fibroin powder having a structurally water-soluble alpha-herix structure of 99 mol% or more is 5 mg/ml to 50 mg relative to the total composition. /ml is used, the weight average molecular weight (Mw) is 3,000 Da to 100,000 Da, and the average size of the fibroin particles having a beta structure of 99 mol% or more, which is structurally insoluble in water, is 40 μm to 100 μm, 1 mg / ml relative to the total composition to 100 mg/ml, and mixing low molecular weight hyaluronic acid with an average molecular weight of 400,000 Da to 600,000 Da and high molecular weight hyaluronic acid with an average molecular weight of 1,700,000 Da to 2,100,000 Da at a weight ratio of 1 to 3: 9 to 7 It is a cross-linked hyaluronic acid gel, the average weight molecular weight (Mw) of the cross-linked hyaluronic acid is 1,700,000 Da to 3,000,000 Da, the content of the cross-linked hyaluronic acid in the total composition is 20 mg / ml to 50 mg / ml, and the auxiliary additive It is a hydrogel mixture containing 2 mg/ml to 4 mg/ml of lidocaine and 1 mg/ml to 50 mg/ml of dimanitol relative to the total composition, and plays a role in maintaining and expanding target tissue by the combined action of the above compositions .
상기의 조성물은 연조직 및 연골부위의 유지 및 확대를 목적으로 사용할 수 있다.The above composition can be used for the purpose of maintaining and expanding soft tissues and cartilage parts.
이하, 구체적인 제조예 및 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through specific manufacturing examples and examples. The following preparation examples and examples are only examples to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
제조예 1Preparation Example 1
무게평균 분자량(Mw) 3,500Da인 구조적으로 물에 가용성인 알파헤릭스 피브로인 50mg/ml를 멸균수 750mg/ml과 상온에서 완전 용해과정을 거친 후 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체 200mg/ml을 상온에서 최종 혼합하여 유착방지용 하이드로겔을 제조하였다.After completely dissolving 50mg/ml of water-soluble alpha-herix fibroin with a weight average molecular weight (Mw) of 3,500Da in 750mg/ml of sterile water at room temperature, polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)- 200 mg/ml of polyethylene oxide (PEO) terpolymer was finally mixed at room temperature to prepare an anti-adhesion hydrogel.
본 제조예 1에서 사용된 알파헤릭스 구조의 피브로인은 가잠견에서 세리신을 제거한 후 기존 문헌에 공개된 방식대로 칼슘클로라이드,에탄올,물의 혼합용액에 2시간 재가용화한 후 1차 투석작업을 거친 용액의 농도를 40mg/ml로 조정한다. 그 후 5,000RCF 이상의 원심력을 이용하여 불순물을 제거한 후 이온컬럼을 통해 3회 이상 무게 평균 분자량 3,500Da이고, PDI 1.90, RGD 0.6mol인 용액을 선별 후 -80℃, 48시간 동결 및 -0.5Torr, -45℃, 24시간 동결건조하여 알파헤릭스 구조의 피브로인을 수득하여 사용하였다.The alpha-herix structured fibroin used in Preparation Example 1 was re-solubilized in a mixed solution of calcium chloride, ethanol, and water for 2 hours according to the method disclosed in the existing literature after removing sericin from the dog, and then subjected to the first dialysis operation. Adjust the concentration to 40 mg/ml. Then, after removing impurities using a centrifugal force of 5,000 RCF or more, a solution having a weight average molecular weight of 3,500 Da, PDI of 1.90, and RGD of 0.6 mol was selected through an ion column three or more times, and then frozen at -80 ° C for 48 hours and -0.5 Torr, After freeze-drying at -45°C for 24 hours, fibroin having an alpha-herix structure was obtained and used.
제조예 2Preparation Example 2
무게평균 분자량(Mw) 3,500Da인 구조적으로 물에 가용성인 알파헤릭스 피브로인 50mg/ml, , 무게평균 분자량(Mw) 10,000Da이며 입자평균사이즈가 20㎛인 구조적으로 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자 50mg/ml을 멸균수 700mg/ml과 상온에서 완전 용해 및 분산과정을 거친 후 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체 200mg/ml을 상온에서 최종 혼합하여 유착방지용 하이드로겔을 제조하였다.50mg/ml of structurally water-soluble alpha-herix fibroin with a weight average molecular weight (Mw) of 3,500Da, structurally water-insoluble beta-structured fibroin with a weight average molecular weight (Mw) of 10,000Da and an average particle size of 20㎛ After completely dissolving and dispersing 50mg/ml of particles with 700mg/ml of sterile water at room temperature, 200mg/ml of polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide (PEO) terpolymer was finally mixed at room temperature. Thus, an anti-adhesion hydrogel was prepared.
본 제조예 2에서 사용된 알파헤릭스 구조의 피브로인은 가잠견에서 세리신을 제거한 후 기존 문헌에 공개된 방식대로 칼슘클로라이드,에탄올,물의 혼합용액에 2시간 재가용화한 후 1차 투석작업을 거친 용액의 농도를 40mg/ml로 조정한다. 그 후 5,000RCF 이상의 원심력을 이용하여 불순물을 제거한 후 이온컬럼을 통해 3회 이상 무게 평균 분자량 3,500Da이고, PDI 1.90, RGD 0.6mol인 용액을 선별 후 -80℃, 48시간 동결 및 -0.5Torr, -45℃, 24시간 동결건조하여 알파헤릭스 구조의 피브로인을 수득하여 사용하였다.The alpha-herix fibroin used in Preparation Example 2 was re-solubilized in a mixed solution of calcium chloride, ethanol, and water for 2 hours according to the method disclosed in the literature after removing sericin from the dog, and then subjected to the first dialysis operation. Adjust the concentration to 40 mg/ml. Then, after removing impurities using a centrifugal force of 5,000 RCF or more, a solution having a weight average molecular weight of 3,500 Da, PDI of 1.90, and RGD of 0.6 mol was selected through an ion column three or more times, and then frozen at -80 ° C for 48 hours and -0.5 Torr, After freeze-drying at -45°C for 24 hours, fibroin having an alpha-herix structure was obtained and used.
본 제조예 2에서 사용된 베타 구조의 피브로인은 기존 문헌에 공개된 방식대로 칼슘클로라이드, 에탄올, 물의 혼합용액에 재가용화한 후 투석작업을 거친 용액의 농도를 40mg/ml로 조정한다. 그 후 5,000RCF 이상의 원심력을 이용하여 불순물을 제거한 후 이온컬럼을 통해 3회 이상 분자량 100,000Da 이하의 경쇄 및 중쇄가 혼합된 피브로인을 추출한다. 추출된 용액의 피브로인 농도를 5중량 백분율로 조정한 후 메탄올에 한시간 침전,세척과정을 거쳐 -80℃에서 12시간 동결 및 -0.5Torr, -45℃, 24시간 동결건조 후 기존의 방식대로 입자를 분채 선별하여 PDI 1.5, RGD 1.2mol 이며, 전체 조성의 99몰% 이상 베타구조의 피브로인 입자를 수득하여 사용하였다. The beta-structured fibroin used in Preparation Example 2 was re-solubilized in a mixed solution of calcium chloride, ethanol, and water according to the method disclosed in the existing literature, and then the concentration of the solution subjected to dialysis was adjusted to 40 mg/ml. Thereafter, impurities are removed using a centrifugal force of 5,000 RCF or more, and then fibroin in which light chains and heavy chains with a molecular weight of 100,000 Da or less are mixed is extracted three or more times through an ion column. After adjusting the fibroin concentration of the extracted solution to 5% by weight, precipitation in methanol for one hour, washing, freezing at -80 ° C for 12 hours, -0.5 Torr, -45 ° C, after lyophilization for 24 hours, the particles were prepared in the conventional way By screening the powder, PDI 1.5, RGD 1.2 mol, and 99 mol% or more of the total composition of the beta-structured fibroin particles were obtained and used.
제조예 3Preparation Example 3
무게평균 분자량(Mw) 3,500Da인 구조적으로 물에 가용성인 알파헤릭스 피브로인 50mg/ml, 무게평균 분자량(Mw) 2,000,000Da인 가교된 히알루론산 20mg/ml을 혼합하여 연조직 유지 및 확대용 하이드로겔을 제조하였다.By mixing 50 mg/ml of water-soluble alpha-herix fibroin with a weight average molecular weight (Mw) of 3,500 Da and 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid with a weight average molecular weight (Mw) of 2,000,000 Da, a hydrogel for maintaining and enlarging soft tissues manufactured.
본 제조예 3에서 사용된 알파헤릭스 구조의 피브로인은 가잠견에서 세리신을 제거한 후 기존 문헌에 공개된 방식대로 칼슘클로라이드,에탄올,물의 혼합용액에 2시간 재가용화한 후 1차 투석작업을 거친 용액의 농도를 40mg/ml로 조정한다. 그 후 5,000RCF 이상의 원심력을 이용하여 불순물을 제거한 후 이온컬럼을 통해 3회 이상 무게 평균 분자량 3,500Da이고, PDI 1.90, RGD 0.6mol인 용액을 선별 후 -80℃, 48시간 동결 및 -0.5Torr, -45℃, 24시간 동결건조하여 알파헤릭스 구조의 피브로인을 수득하여 사용하였다.The alpha-herix fibroin used in Preparation Example 3 was re-solubilized in a mixed solution of calcium chloride, ethanol, and water for 2 hours according to the method disclosed in the existing literature after removing sericin from the dog, and then subjected to the first dialysis operation. Adjust the concentration to 40 mg/ml. Then, after removing impurities using a centrifugal force of 5,000 RCF or more, a solution having a weight average molecular weight of 3,500 Da, PDI of 1.90, and RGD of 0.6 mol was selected through an ion column three or more times, and then frozen at -80 ° C for 48 hours and -0.5 Torr, After freeze-drying at -45°C for 24 hours, fibroin having an alpha-herix structure was obtained and used.
본 제조예 3에서 사용된 히알루론산은 IV 0.25㎥/㎏이며, 무게평균 분자량이 500,000Da인 상대적으로 저분자인 히알루론산과 IV 2.9㎥/㎏이며, 무게평균 분자량이 1,900,000Da인 상대적으로 고분자인 히알루론산을 무게 비율 3 대 7로 혼합한 후, 두종의 히알루론산 혼합 농도를 10 중량백분율로 제조한다. 혼합 용액의 pH는 13을 유지하며, 가교제는 부타디올디글리시딜에테르(BDDE) 50㎕/㎖, 가교온도는 20℃, 가교시간은 48시간의 조건에서 가교반응을 진행한다. 가교된 히알루론산은 0.1M의 염산을 사용하여 pH 7.0로 조정한다. 그리고 PBS를 사용하여 중화 및 세척을 진행한다. 최종적으로 가교된 히알루론산의 분자량은 2,000,000Da이며, 멸균수를 이용하여 가교된 히알루론산 20mg/ml, 알파헤릭스 구조의 피브로인 50mg/ml로 조정 후 최종 하이드로겔을 수득하여 사용하였다.The hyaluronic acid used in this Preparation Example 3 is a relatively low molecular weight hyaluronic acid having an IV of 0.25m3/kg and a weight average molecular weight of 500,000Da and a relatively high molecular weight hyaluronic acid having an IV of 2.9m3/kg and a weight average molecular weight of 1,900,000Da. After mixing the Lonic acid at a weight ratio of 3 to 7, a mixed concentration of the two types of hyaluronic acid was prepared at a weight percentage of 10. The pH of the mixed solution is maintained at 13, the crosslinking reaction is carried out under the conditions of 50 μl/ml of butadiol diglycidyl ether (BDDE) as a crosslinking agent, a crosslinking temperature of 20° C., and a crosslinking time of 48 hours. The cross-linked hyaluronic acid is adjusted to pH 7.0 using 0.1 M hydrochloric acid. Then, neutralization and washing are performed using PBS. The molecular weight of the final crosslinked hyaluronic acid is 2,000,000 Da, and the final hydrogel was obtained and used after adjusting to 20mg/ml of crosslinked hyaluronic acid and 50mg/ml of alpha-herix fibroin using sterile water.
제조예 4Production Example 4
무게평균 분자량(Mw) 3 500Da인 구조적으로 물에 가용성인 알파헤릭스 피브로인 50mg/ml, 무게평균 분자량(Mw) 10,000Da이며 입자평균사이즈가 40㎛ 인 구조적으로 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자 50mg/ml, 무게평균 분자량(Mw) 2,000,000Da인 가교된 히알루론산 20mg/ml을 혼합하여 연조직 유지 및 확대용 하이드로겔을 제조하였다.50mg/ml of structurally water-soluble alpha-herix fibroin with a weight average molecular weight (Mw) of 3 500Da, structurally water-insoluble beta-structured fibroin particles with a weight average molecular weight (Mw) of 10,000Da and an average particle size of 40㎛ A hydrogel for maintaining and enlarging soft tissues was prepared by mixing 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid having a weight average molecular weight (Mw) of 2,000,000 Da.
본 제조예 4에서 사용된 알파헤릭스 구조의 피브로인은 가잠견에서 세리신을 제거한 후 기존 문헌에 공개된 방식대로 칼슘클로라이드,에탄올,물의 혼합용액에 2시간 재가용화한 후 1차 투석작업을 거친 용액의 농도를 40mg/ml로 조정한다. 그 후 5,000RCF 이상의 원심력을 이용하여 불순물을 제거한 후 이온컬럼을 통해 3회 이상 무게 평균 분자량 3,500Da이고, PDI 1.90, RGD 0.6mol인 용액을 선별 후 -80℃, 48시간 동결 및 -0.5Torr, -45℃, 24시간 동결건조하여 알파헤릭스 구조의 피브로인을 수득하여 사용하였다.The alpha-herix fibroin used in Preparation Example 4 was re-solubilized in a mixed solution of calcium chloride, ethanol, and water for 2 hours according to the method disclosed in the existing literature after removing sericin from the dog, and then subjected to the first dialysis operation. Adjust the concentration to 40 mg/ml. Then, after removing impurities using a centrifugal force of 5,000 RCF or more, a solution having a weight average molecular weight of 3,500 Da, PDI of 1.90, and RGD of 0.6 mol was selected through an ion column three or more times, and then frozen at -80 ° C for 48 hours and -0.5 Torr, After freeze-drying at -45°C for 24 hours, fibroin having an alpha-herix structure was obtained and used.
본 제조예 4에서 사용된 베타 구조의 피브로인은 기존 문헌에 공개된 방식대로 칼슘클로라이드, 에탄올, 물의 혼합용액에 재가용화한 후 투석작업을 거친 용액의 농도를 40mg/ml로 조정한다. 그 후 5,000RCF 이상의 원심력을 이용하여 불순물을 제거한 후 이온컬럼을 통해 3회 이상 분자량 100,000Da 이하의 경쇄 및 중쇄가 혼합된 피브로인을 추출한다. 추출된 용액의 피브로인 농도를 5중량 백분율로 조정한 후 메탄올에 한시간 침전,세척과정을 거쳐 -80℃에서 12시간 동결 및 -0.5Torr, -45℃, 24시간 동결건조 후 기존의 방식대로 입자를 분채 선별하여 PDI 1.5, RGD 1.2mol 이며, 전체 조성의 99몰% 이상 베타구조의 피브로인 입자를 수득하여 사용하였다. The beta-structured fibroin used in Preparation Example 4 was re-solubilized in a mixed solution of calcium chloride, ethanol, and water as disclosed in the literature, and then the concentration of the solution subjected to dialysis was adjusted to 40 mg/ml. Thereafter, impurities are removed using a centrifugal force of 5,000 RCF or more, and then fibroin in which light chains and heavy chains with a molecular weight of 100,000 Da or less are mixed is extracted three or more times through an ion column. After adjusting the fibroin concentration of the extracted solution to 5% by weight, precipitation in methanol for one hour, washing, freezing at -80 ° C for 12 hours, -0.5 Torr, -45 ° C, after lyophilization for 24 hours, the particles were prepared in the conventional way By screening the powder, PDI 1.5, RGD 1.2 mol, and 99 mol% or more of the total composition of the beta-structured fibroin particles were obtained and used.
본 제조예 4에서 사용된 히알루론산은 IV 0.25㎥/㎏이며, 무게평균 분자량이 500,000Da인 상대적으로 저분자인 히알루론산과 IV 2.9㎥/㎏이며, 무게평균 분자량이 1,900,000Da인 상대적으로 고분자인 히알루론산을 무게 비율 3 대 7로 혼합한 후, 두종의 히알루론산 혼합 농도를 10 중량백분율로 제조한다. 그리고 , 무게평균 분자량(Mw) 10,000Da이며 입자평균사이즈가 40㎛ 인 베타시트 피브로인 입자 50mg/ml 을 추가 혼합한다. 혼합 용액의 pH는 13을 유지하며, 가교제는 부타디올디글리시딜에테르(BDDE) 50㎕/㎖, 가교온도는 20℃, 가교시간은 48시간의 조건에서 가교반응을 진행한다. 가교된 히알루론산은 0.1M의 염산을 사용하여 pH 7.0로 조정한다. 그리고 PBS를 사용하여 중화 및 세척을 진행한다. 최종적으로 가교된 히알루론산의 분자량은 2,000,000Da이며, 멸균수를 이용하여 가교된 히알루론산 20mg/ml, 알파헤릭스 구조의 피브로인 50mg/ml로 조정 후 최종 하이드로겔을 수득하여 사용하였다.The hyaluronic acid used in this Preparation Example 4 is a relatively low molecular weight hyaluronic acid having an IV of 0.25 m3/kg and a weight average molecular weight of 500,000 Da, and a relatively high molecular weight hyaluronic acid having an IV of 2.9 m3/kg and a weight average molecular weight of 1,900,000 Da. After mixing the Lonic acid at a weight ratio of 3 to 7, a mixed concentration of the two types of hyaluronic acid was prepared at a weight percentage of 10. Then, 50 mg/ml of beta sheet fibroin particles having a weight average molecular weight (Mw) of 10,000 Da and an average particle size of 40 μm were further mixed. The pH of the mixed solution is maintained at 13, the crosslinking reaction is carried out under the conditions of 50 μl/ml of butadiol diglycidyl ether (BDDE) as a crosslinking agent, a crosslinking temperature of 20° C., and a crosslinking time of 48 hours. The cross-linked hyaluronic acid is adjusted to pH 7.0 using 0.1 M hydrochloric acid. Then, neutralization and washing are performed using PBS. The molecular weight of the final crosslinked hyaluronic acid is 2,000,000 Da, and the final hydrogel was obtained and used after adjusting to 20mg/ml of crosslinked hyaluronic acid and 50mg/ml of alpha-herix fibroin using sterile water.
실시예 1(알파헤릭스 구조 피브로인 추출)Example 1 (extraction of alpha-herix structured fibroin)
구조적으로 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더는 기존 문헌에 공개된 방식대로 칼슘클로라이드,에탄올,물의 혼합용액 내지 고농도의 리튬브로마이드 수용액에 재가용화한 후 투석작업을 거친 용액의 농도를 40mg/ml로 조정한다. 그 후 5,000RCF 이상의 원심력을 이용하여 불순물을 제거한 후 이온컬럼을 통해 3회 이상의 분리하여 평균 무게 분자량이 3,000 내지 4,500Da이며, PDI 1.90, RGD 0.6mol인 알파헤릭스 구조의 피브로인을 추출한다.Fibroin powder with a structurally water-soluble alpha-herix structure is re-solubilized in a mixed solution of calcium chloride, ethanol, and water or in a high-concentration aqueous solution of lithium bromide as disclosed in the existing literature, and then subjected to dialysis to a concentration of 40 mg/day. Adjust in ml. Then, impurities are removed using a centrifugal force of 5,000 RCF or more, and then separated three or more times through an ion column to extract fibroin having an average weight molecular weight of 3,000 to 4,500 Da, PDI 1.90, and RGD 0.6 mol of an alpha-herix structure.
실시예 2(베타구조 피브로인 제조)Example 2 (preparation of beta structure fibroin)
베타 구조의 피브로인은 칼슘클로라이드, 에탄올, 물의 혼합용액에 재가용화한 후 투석작업을 거친 용액의 농도를 40mg/ml로 조정한다. 그 후 5,000RCF 이상의 원심력을 이용하여 불순물을 제거한 후 재가용된 피브로인 용액중 랜덤 코일의 제거를 위해 이온컬럼을 이용하여 3회 이상 컬럼에 통과시킨 후 무게 평균 분자량이 3,000Da 내지 100,000Da의 경쇄 및 중쇄가 혼합된 피브로인을 추출한다. Beta-structured fibroin is re-solubilized in a mixed solution of calcium chloride, ethanol, and water, and then the concentration of the solution subjected to dialysis is adjusted to 40 mg/ml. Thereafter, impurities are removed using centrifugal force of 5,000 RCF or more, and then passed through the column three or more times using an ion column to remove random coils in the re-dissolved fibroin solution, and then a light chain having a weight average molecular weight of 3,000 Da to 100,000 Da and Fibroin with heavy chains is extracted.
추출된 용액의 피브로인 농도를 5중량 백분율로 조정한 후 폴리에틸렌글리콜이 5중량 백분율로 용해된 메탄올에 한시간 침전, 세척과정을 거쳐 -80℃에서 12시간 동결 및 -0.5Torr, -45℃, 24시간 동결건조 후 기존의 방식대로 입자를 1㎛ 내지 100㎛의 크기로 분채 선별하여 사용하였다. 최종 베타구조의 피브로인 입자는 PDI 1.5, RGD 1.2mol 이며, 전체 조성의 99몰% 이상 베타구조의 피브로인을 나타낸다. After adjusting the fibroin concentration of the extracted solution to 5% by weight, precipitation in methanol in which polyethylene glycol was dissolved in 5% by weight for one hour, followed by washing, freezing at -80 ° C for 12 hours and -0.5 Torr, -45 ° C, 24 hours After lyophilization, the particles were screened and used in a size range of 1 μm to 100 μm in the conventional manner. The final beta-structured fibroin particles have PDI 1.5 and RGD 1.2mol, and represent 99 mol% or more of beta-structured fibroin of the total composition.
실시예 3 : 가교된 히알루론산의 제조Example 3: Preparation of cross-linked hyaluronic acid
가교된 히알루론산의 제조는 IV 0.25㎥/㎏이며, 무게평균 분자량이 500,000Da인 상대적으로 저분자인 히알루론산과 IV 2.9㎥/㎏이며, 무게평균 분자량이 1,900,000Da인 상대적으로 고분자인 히알루론산을 무게 비율 3 대 7로 혼합한 후, 두종의 히알루론산 혼합 농도를 10 중량백분율로 1차 혼합 제조한다. 그리고 혼합 용액의 pH는 13을 유지하며, 가교제는 부타디올디글리시딜에테르(BDDE)을 사용하며, 가교제의 양은 히알루론산총 무게 함량대비 그람당 50㎕/㎖를 사용하며, 가교온도는 20℃, 가교시간은 48시간의 조건에서 가교반응을 진행한다. 가교된 히알루론산은 0.1노르말의 묽은염산을 사용하여 pH 7.0로 조정한다. 그리고 ⅹ1 PBS를 사용하여 중화 및 세척을 진행한다. 최종적으로 가교된 히알루론산의 분자량은 2,000,000Da이며, 멸균수를 이용하여 가교된 히알루론산의 함량은 60mg/ml이며, 각각의 사용 범위에따라 멸균수를 투입하여 최종 히알루론산의 함량을 20mg/ml 내지 50mg/ml로 조정하여 사용한다. In the preparation of cross-linked hyaluronic acid, relatively low molecular weight hyaluronic acid with an IV of 0.25 m3/kg and a weight average molecular weight of 500,000 Da and relatively high molecular weight hyaluronic acid with an IV of 2.9 m3/kg and a weight average molecular weight of 1,900,000 Da are weighed. After mixing at a ratio of 3 to 7, a primary mixing of the two types of hyaluronic acids at a mixed concentration of 10% by weight is prepared. In addition, the pH of the mixed solution is maintained at 13, butadiol diglycidyl ether (BDDE) is used as the crosslinking agent, the amount of the crosslinking agent is 50 μl/ml per gram based on the total weight of hyaluronic acid, and the crosslinking temperature is 20 ℃, the crosslinking time proceeds the crosslinking reaction under the conditions of 48 hours. The cross-linked hyaluronic acid is adjusted to pH 7.0 using dilute hydrochloric acid at 0.1 normal. Then, neutralization and washing are performed using ⅹ1 PBS. The molecular weight of the final cross-linked hyaluronic acid is 2,000,000 Da, and the content of cross-linked hyaluronic acid using sterilized water is 60 mg/ml. It is used after adjusting to 50 mg/ml.
실시예 4 : 실시예 1 에서 취득한 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더 50mg/ml, 실시예 2 에서 취득한 베타구조 피브로인 입자(평균 입자 크기 20㎛) 1mg/ml, 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) - 폴리프로필렌옥사이드 (PPO) - 폴리프로필렌옥사이드 (PEO) 150mg/ml 혼합조성물 Example 4 : 50 mg/ml of alpha-herix structure fibroin powder obtained in Example 1, 1 mg/ml of beta-structure fibroin particles (average particle size of 20 μm) obtained in Example 2, polyethylene oxide (PEO) - polypropylene oxide (PPO) ) - Polypropylene oxide (PEO) 150mg / ml mixed composition
실시예 5 : 실시예 4의 조성물중 실시예 3 에서 취득한 베타구조 피브로인 입자 (평균입자 크기 75㎛) 50mg/ml, 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) - 폴리프로필렌옥사이드 (PPO) - 폴리프로필렌옥사이드 (PEO) 삼원공중합체 함량이 150mg/ml 혼합조성물 Example 5 : 50 mg/ml of beta structure fibroin particles (average particle size 75 μm) obtained in Example 3 in the composition of Example 4, polyethylene oxide (PEO) - polypropylene oxide (PPO) - polypropylene oxide (PEO) ternary Mixed composition with a copolymer content of 150 mg/ml
실시예 6 : 실시예 5의 조성물중 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) - 폴리프로필렌옥사이드 (PPO) - 폴리프로필렌옥사이드 (PEO) 삼원공중합체 함량이 150mg/ml 혼합조성물 Example 6 : Polyethylene oxide (PEO) - polypropylene oxide (PPO) - polypropylene oxide (PEO) terpolymer content in the composition of Example 5 is 150 mg / ml mixed composition
실시예 7 : 실시예 6 의 조성물 중 리도카인 함량이 전체 조성물 중 2mg/ml 의 혼합조성물 Example 7 : Mixed composition in which the lidocaine content in the composition of Example 6 was 2 mg/ml in the total composition
실시예 8 : 실시예 7의 조성물 중 디 마니톨의 함량이 전체 조성물 중 50mg/ml의 혼합조성물 Example 8 : A mixed composition in which the content of dimanitol in the composition of Example 7 is 50 mg/ml in the total composition
실시예 9 : 실시예 1 에서 취득한 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더 50mg/ml, 실시예 2 에서 취득한 베타구조 피브로인 입자(입자 크기 1㎛ 내지 20㎛) 1mg/ml, 가교된 히알루론산의 함량이 20mg/ml 혼합조성물 Example 9 : 50 mg/ml of the alpha-herix structured fibroin powder obtained in Example 1, 1 mg/ml of beta-structured fibroin particles (particle size of 1 μm to 20 μm) obtained in Example 2, and 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid ml mixed composition
실시예 10 : 실시예 9의 조성물중 실시예 2 에서 취득한 베타구조 피브로인 입자 (평균입자 크기가 65㎛) 50mg/ml, 가교된 히알루론산의 함량이 20mg/ml 혼합조성물 Example 10 : A mixed composition containing 50 mg/ml of beta-structured fibroin particles (average particle size of 65 μm) and 20 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid obtained in Example 2 among the compositions of Example 9
실시예 11 : 실시예 10의 조성물중 가교된 히알루론산의 함량이 50mg/ml 혼합조성물 Example 11 : Mixed composition in which the content of cross-linked hyaluronic acid in the composition of Example 10 is 50 mg/ml
실시예 12 : 실시예 11의 조성물 중 리도카인 함량이 전체 조성물 중 2mg/ml의 혼합조성물 Example 12 : A mixed composition in which the lidocaine content in the composition of Example 11 is 2 mg/ml in the total composition
실시예 13 : 실시예 12의 조성물 중 디 마니톨의 함량이 전체 조성물 중 50mg/ml의 혼합조성물 Example 13 : Mixed composition in which the content of dimanitol in the composition of Example 12 is 50 mg/ml in the total composition
이하, 구체적인 시험예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 시험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through specific test examples. The following test examples are merely examples to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
시험예 1Test Example 1 : 알파헤릭스 구조의 피브로인 및 알파헤릭스 구조의 피브로인과 베타구조의 피브로인 혼합물의 조직 유착 방지 시험: Tissue adhesion prevention test of alpha-herix structure fibroin and alpha-herix structure fibroin and beta structure fibroin mixture
본 시험은 제조예 1과 제조예 2의 혼합물의 유착 방지력을 비교 시험하였다.In this test, the anti-adhesion ability of the mixtures of Preparation Example 1 and Preparation Example 2 was compared and tested.
본 발명의 하이드로겔이 생체내에서 존재여부 및 조직에 유착되는지에 대해 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 동물실험을 실시하였다.In order to confirm whether the hydrogel of the present invention exists in vivo and adheres to tissues, animal experiments were conducted as follows.
실험동물은 생후 2개월 된 수컷의 뉴질랜드산 화이트 토끼를 사용하였다. 실험동물을 에틸에테르에 마취 후 복부를 절개하고, 복벽의 표피부분에 1 세제곱 센티미터의 상처를 만들고 맹장에 표피가 살짝 벗겨질 정도의 상처를 수술기구를 이용하여 형성시켰다. As the experimental animal, a 2-month-old male New Zealand white rabbit was used. After anesthetizing the experimental animal with ethyl ether, the abdomen was incised, a 1 cubic centimeter wound was made on the epidermal portion of the abdominal wall, and a wound was formed on the cecum using a surgical instrument to the extent that the epidermis was slightly peeled off.
그런 다음, 대조군으로는 PEO - PPO - PEO 삼원공중합체 200mg/ml을 사용하였다. 상기 대조군은 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 단위체 평균 함량이 70몰% 이고, 중량평균분자량(Mw) 가 16,000g/mol 인 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체를 사용하였다. 상기 대조군과 실험군인 상기 제조예 1 및 제조예 2에서 제조한 하이드로겔을 상처부위에 두배 가량의 영역에 도포하고 봉합하였다. 7일 후 수술 부위를 재 절개하여 하이드로겔의 존재여부 및 조직의 유착여부를 판단하였다.Then, as a control group, 200 mg/ml of PEO-PPO-PEO terpolymer was used. The control group is a polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide (PEO) terpolymer having an average content of polyethylene oxide (PEO) units of 70 mol% and a weight average molecular weight (Mw) of 16,000 g/mol. was used. The hydrogels prepared in Preparation Examples 1 and 2, which are the control group and the experimental group, were applied to an area twice as large as the wound and sutured. After 7 days, the surgical site was re-incised to determine the presence of hydrogel and tissue adhesion.
시험 결과는 Hooker score 및 Knightly score 로 판단하였다.Test results were judged by Hooker score and Knightly score.
대조군인 PEO - PPO- PEO 삼원공중합체 200mg/ml로 처리한 군에서는 Hooker score 2.98±0.97 및 Knightly scor 3.89±0.95 이며, 실험군인 제조예 1의 Hooker score 1.24±0.74 및 Knightly scor 1.27±0.75, 제조예 2의 Hooker score 0.70±0.86 및 Knightly scor 1.01±0.65를 나타내었다. Hooker score 2.98 ± 0.97 and Knightly score 3.89 ± 0.95 in the control group treated with 200 mg / ml of PEO-PPO-PEO terpolymer, and Hooker score 1.24 ± 0.74 and Knightly score 1.27 ± 0.75 in Preparation Example 1, the experimental group Hooker score of Example 2 was 0.70 ± 0.86 and Knightly score 1.01 ± 0.65.
따라서 시험의 결과 대조군에 비해 실험군에서 유착이 거의 발생하지 않았으며, 서로다른 두 종의 피브로인을 혼합 하이드로겔(도 11)을 사용하였을 때 수치상으로 더 나은 결과가 확인되었다.Therefore, as a result of the test, adhesion hardly occurred in the experimental group compared to the control group, and numerically better results were confirmed when two different types of fibroin were used as a mixed hydrogel (FIG. 11).
시험예 2 : 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더 및 상기 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더와 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자 혼합물의 in vivo상에서의 유효성 실험.Test Example 2: In vivo efficacy test of water-soluble alpha-herix structure fibroin powder and mixture of the alpha-herix structure fibroin powder and water-insoluble beta structure fibroin particles.
본 시험은 조직 유효성을 시험한 결과이다.This test is the result of testing tissue effectiveness.
시험군 1은 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더 50mg/ml, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체 200mg/ml의 혼합 하이드로겔을 준비하였다.
시험군 2는 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더 50mg/ml, 40㎛ 내지 70㎛ 이며, 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자 50mg/ml, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체 200mg/ml의 혼합 하이드로겔을 준비하였다.
상기 A 및 B를 생후 2개월 된 수컷의 뉴질랜드산 화이트 토끼의 진피조직에 0.5ml 주사주입 후 7일, 14일 후 조직학적 평가를 하였다. Histological evaluation was performed 7 days and 14 days after 0.5 ml injection of A and B into the dermal tissue of a 2-month-old male New Zealand white rabbit.
실험 결과는 도 13과 같았다.The experimental results were as shown in FIG. 13 .
도 13에서와 같이 알파헤릭스구조의 피브로인 파우더와 베타구조의 피브로인 입자를 혼합 사용하였을 때 조직 재생효과는 적어도 약 20%이상 베타구조의 피브로인 입자대비 더 효과적임을 입증하였다.As shown in FIG. 13, it was proved that the tissue regeneration effect was at least about 20% more effective than the beta-structured fibroin particles when alpha-helix structured fibroin powder and beta-structured fibroin particles were mixed and used.
시험예 3 : 알파헤릭스 구조의 피브로인 및 상기 알파헤릭스 구조의 피브로인과 베타구조의 피브로인 혼합물의 연조직 유지 및 확대 시험 Test Example 3: Soft tissue maintenance and expansion test of alpha-herix structure fibroin and the alpha-herix structure fibroin and beta structure fibroin mixture
본 시험은 제조예 3과 제조예 4의 혼합물의 연조직 유지 및 확대를 비교 시험하였다.In this test, soft tissue maintenance and expansion of the mixtures of Preparation Example 3 and Preparation Example 4 were compared and tested.
실험동물은 생후 2개월 된 수컷의 뉴질랜드산 화이트 토끼를 사용하였다. 실험동물을 에틸에테르에 마취 후 복부 부위에 표피와 진피사이에 27G의 니들을 통해 제조예 3 및 제조예 4를 각각 0.5ml씩 주입하였다. As the experimental animal, a 2-month-old male New Zealand white rabbit was used. After anesthetizing the experimental animals with ethyl ether, 0.5 ml of each of Preparation Examples 3 and 4 were injected into the abdominal region between the epidermis and the dermis through a 27G needle.
1개월, 2개월, 3개월 후 주입 부위의 조직을 절개하여 H&E 염색을 시행한 후 조직을 관찰하였다. 시편은 체외이식편을 절반으로 절단하고, 10% 포르말린 중에 밤새 4℃에서 고정하였다. 그 후 OCT 동결 매질 중에 함입시키고, 10 마이크로미터 섹션으로 냉각편을 만들고, 오일 레드로 염색하였다. 그리고 헤마톡실린 및 에오신에 대한 표준 조직학적 방법에 따라 염색 및 가공하여 관찰하였다. After 1 month, 2 months, and 3 months, the tissue at the injection site was incised, H&E staining was performed, and the tissue was observed. Specimens were explants cut in half and fixed in 10% formalin overnight at 4°C. They were then embedded in OCT freezing medium, frozen pieces were made in 10 micron sections, and stained with Oil Red. Then, they were stained and processed according to standard histological methods for hematoxylin and eosin, and observed.
실험결과는 도 2와 같았다.The experimental results were the same as in FIG. 2 .
관찰결과 제조예 4에서 조직의 성장이 뚜렷이 확인되었으며(도 2의 A,B,C ), 제조예 3의 결과(도 2의 D, E, F)는 1개월 후 의 조직사진에서는 제조예 3과 유효성에서 비슷한 결과가 발생하였지만 2 내지 3개월에서는 뚜렷한 조직 재생의 차이가 발생하였다.As a result of the observation, tissue growth was clearly confirmed in Preparation Example 4 (A, B, C in FIG. 2), and the results of Preparation Example 3 (D, E, F in FIG. 2) showed that Preparation Example 3 Similar results were obtained in terms of efficacy and effectiveness, but there was a clear difference in tissue regeneration at 2 to 3 months.
시험예 4 : in vitro 상에서의 세포 생존력 시험Test Example 4: Cell viability test in vitro
본 시험에서는 연골세포가 calcein-AM(Ca-AM) 및 사멸된 세포로 염색되는 L/D(live/dead) 분석기법을 사용하여 1일, 3일, 7일에 평가하였다.In this test, chondrocytes were evaluated on the 1st, 3rd and 7th days using the L/D (live/dead) assay, in which chondrocytes are stained with calcein-AM (Ca-AM) and dead cells.
시료는 제조예 4에서 히알루론산 농도가 20mg/ml (이하 '저밀도'로 지칭)와 히알루론산 농도가 50mg/ml (이하 '고밀도'로 지칭)인 하이드로 겔을 동결 건조하여 겔 디스크를 제작하여 (높이 2mm, 직경 4mm)를 PBS로 세척 및 팽윤시킨 후 암전된 상태에서 온도17℃, 5% CO2 조건하에서 인큐베이터에서 배양하였다. 그리고 LSM510 레이져 스캐닝 현미경을 통해 측정하였다. The sample was prepared by freeze-drying a hydrogel having a hyaluronic acid concentration of 20 mg/ml (hereinafter referred to as 'low density') and a hyaluronic acid concentration of 50 mg/ml (hereinafter referred to as 'high density') in Preparation Example 4 to prepare a gel disk ( 2 mm in height and 4 mm in diameter) were washed and swollen with PBS, and then cultured in an incubator in the dark at a temperature of 17° C. and 5% CO2. And it was measured through an LSM510 laser scanning microscope.
시험 결과는 세포가 함유된 하이드로겔에서 연골 형성 배지의 연골 세포 생존율은 저밀도 하이드로겔과 고밀도 하이드로겔에서 1일에 93%에서 7일에 86%로 동일하게 감소했다. 이러한 현상은 하이드로 겔에서 연골 세포 생존력에 대한 TGF-β1의 영향으로 예상되어지며, 생존 세포의 비율이 세포 배양 배지 조성과 배양 기간에 영향을 받지 않는다는 것을 알 수 있다. 또한, 저밀도 및 고밀도 하이드로겔에서 연골 세포가 연골 세포 탈분화의 시작을 나타낼 수 있는 섬유 아세포와 유사한 형태를 닮은 길쭉한 것처럼 보임 확인 하였다.The test results showed that the viability of chondrocytes in the chondrogenic medium in the cell-containing hydrogel decreased equally from 93% at 1 day to 86% at 7 days in low- and high-density hydrogels. This phenomenon is expected due to the effect of TGF-β1 on the viability of chondrocytes in the hydrogel, and it can be seen that the percentage of viable cells is not affected by the composition of the cell culture medium and the culture period. In addition, it was confirmed that the chondrocytes in the low-density and high-density hydrogels appeared elongated resembling a fibroblast-like morphology, which could indicate the beginning of chondrocyte dedifferentiation.
시험예 5 : 알파헤릭스 구조의 피브로인과 베타구조의 피브로인 혼합물의 연골조직 재생 유효성 시험 Test Example 5: Cartilage tissue regeneration efficacy test of a mixture of alpha-herix-structured fibroin and beta-structured fibroin
본 시험에서는 알파헤릭스 구조의 피브로인과 베타구조의 피브로인 혼합물 (시험예 4의 '고밀도 하이드로겔')을 사용하여 시험하였다. 실험동물은 생후 6개월 된 수컷의 뉴질랜드산 화이트 토끼를 사용하였다. 실험동물을 에틸에테르에 마취 후 관절 부위에 18G의 니들을 통해 0.1ml 주입하였다. In this test, a mixture of alpha-herix-structured fibroin and beta-structured fibroin ('high-density hydrogel' in Test Example 4) was used. As the experimental animal, a 6-month-old male New Zealand white rabbit was used. After anesthetizing the experimental animal with ethyl ether, 0.1ml was injected into the joint through an 18G needle.
1개월 후 주입 부위의 조직을 절개하여 H&E 염색을 시행한 후 조직을 관찰하였다. 시편은 체외이식편을 절반으로 절단하고, 10% 포르말린 중에 밤새 4℃에서 고정하였다. 그 후 OCT 동결 매질 중에 함입시키고, 10 마이크로미터 섹션으로 냉각편을 만들고, 오일 레드로 염색하였다. 그리고 헤마톡실린 및 에오신에 대한 표준 조직학적 방법에 따라 염색 및 가공하여 관찰하였다. 관찰결과 시험예 4의 in vitro상에서와 유사하게 나타났다.After 1 month, the tissue at the injection site was incised, H&E stained, and the tissue was observed. Specimens were explants cut in half and fixed in 10% formalin overnight at 4°C. They were then embedded in OCT freezing medium, frozen pieces were made in 10 micron sections, and stained with Oil Red. Then, they were stained and processed according to standard histological methods for hematoxylin and eosin, and observed. Observation results were similar to those of Test Example 4 in vitro.
실험 결과는 도 3과 같았다.The experimental results were as shown in FIG. 3 .
따라서, 본 시험에서 연골재생의 효과(도3)를 부분적으로 관찰이 되었다.Therefore, in this test, the effect of cartilage regeneration (FIG. 3) was partially observed.
시험예 6 : 고밀도 하이드로겔의 구조분석Test Example 6: Structural analysis of high-density hydrogel
본 시험에서는 알파헤릭스 구조의 피브로인과 베타구조의 피브로인 혼합물 (시험예 4의 '고밀도 하이드로겔')을 사용하여 FTIR-ATR을 측정하였다.In this test, FTIR-ATR was measured using a mixture of alpha-herix-structured fibroin and beta-structured fibroin ('high-density hydrogel' in Test Example 4).
본 시험에서는 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더 50mg/ml, 베타구조의 피브로인 입자 50mg/ml, 가교된 히알루론산 50mg/ml을 혼합한 후 화학적 이동이 일어났는지 여부를 측정하는 자료로서, 도 10에서 보듯이 알파헤릭스 구조의 피브로인 피크과 베타구조의 피브로인 피크가 동시에 공존함을 확인하였다.In this test, 50 mg/ml of alpha-herix structure fibroin powder, 50 mg/ml of beta structure fibroin particles, and 50 mg/ml of cross-linked hyaluronic acid are mixed, and then the data are measured to determine whether or not chemical shift has occurred, as shown in FIG. 10. It was confirmed that the fibroin peak of the alpha-herix structure and the fibroin peak of the beta structure coexisted at the same time.
시험예 7 : 가교된 히알루론산의 함량에 따른 모폴로지 분석Test Example 7: Morphological analysis according to the content of cross-linked hyaluronic acid
시험예 4 에서 주입된 고밀도 및 저밀도 하이드로겔의 모폴로지를 분석한 자료이다.This is data analyzing the morphology of the high-density and low-density hydrogels injected in Test Example 4.
본 시험은 본 발명에서 제시한 범위 (물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인 50mg/ml, 물에 불용성인 베타구조의 피브로인 입자 50mg/ml) 내에서 가교된 히알루론산의 함량(각각 20mg/ml, 50mg/ml)에 따른 하이드로 겔의 모폴로지 자료이다.In this test, the content of cross-linked hyaluronic acid (each 20 mg/ml) within the range presented in the present invention (water-soluble alpha-
실험 결과는 도 12와 같았다.The experimental results were as shown in FIG. 12 .
도 12에서 보듯이 상이한 두 구조의 피브로인은 모폴로지 특성에 크게 관여하지 않지만 가교된 히알루론산의 함유량이 증가할수록 겔 밀도 및 하이드로겔의 네트워크 구조는 매우 촘촘히 연결된 모폴로지 특성을 보인다. As shown in FIG. 12, the fibroin of the two different structures is not significantly involved in the morphological properties, but as the content of cross-linked hyaluronic acid increases, the gel density and the network structure of the hydrogel show very closely connected morphological properties.
시험예 8 : 피브로인의 분자량 분포 측정Test Example 8: Measurement of molecular weight distribution of fibroin
분자량 분포를 측정하기 위해 동결건조된 시편(PDI 1.90, RGD 0.6mol인 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더)을 물에에 첨가하여 4M 수용액을 제조한 후 Fast Protein Liquid Chromatography(FPLC) (AKTA Purifier, Amersham Biosciences)로 측정 하였다. 칼럼은 superdex 200 10/300히를 사용하였고, 유량속도는 0.5ml/min 으로 하였다.To measure the molecular weight distribution, lyophilized specimens (PDI 1.90, RGD 0.6 mol alpha-herix fibroin powder) were added to water to prepare a 4M aqueous solution, followed by Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) (AKTA Purifier, Amersham) Biosciences). A
실험 결과는 도 4와 같았다.The experimental results were as shown in FIG. 4 .
도 4에서 보듯이 수용액 상태의 피브로인은 heavy chain의 펩타이드로부터 칼럼의 분획한계 이하까지 넓은 범위의 분자량 분포를 가지는 것을 확인하였다 As shown in Figure 4, it was confirmed that fibroin in aqueous solution had a wide range of molecular weight distribution from heavy chain peptides to less than the fractionation limit of the column.
수용액 상태의 피브로인이 에멀젼을 형성하고 직경 100 내지 200nm의 마이쉘(micelle) 구조를 형성 하여 거대단백질의 분자를 형성한다.Fibroin in an aqueous solution forms an emulsion and forms a micelle structure with a diameter of 100 to 200 nm to form macroprotein molecules.
상기의 분석 자료를 토대로 기존의 분자쇄가 서로 뭉쳐서 단백질 콜로이드를 형성하는 것을 억제하는 동시에 서로 연결되는 3차원적 망상구조를 형성하는 분산계의 반고형 겔 형성을 억제하여 보다 안정화된 피브로인을 확인하였다.Based on the above analysis data, more stabilized fibroin was confirmed by suppressing the formation of protein colloids by suppressing the existing molecular chains aggregating with each other and suppressing the formation of semi-solid gels in the dispersion system forming a three-dimensional network structure connected to each other.
시험예 9 : 알파헤릭스 구조의 피브로인 파우더의 안정성 분석Test Example 9: Stability analysis of alpha-herix structured fibroin powder
본 시험은 알파헤릭스 구조 피브로인이 30일까지 상온에서 보관하였을때 피브로인의 화학적 이동을 검증하는 자료이다.This test is data verifying the chemical shift of fibroin when alpha-herix structure fibroin is stored at room temperature for up to 30 days.
알파헤릭스 구조 피브로인은 평균 무게 분자량이 3,500Da이며, PDI 1.90, RGD 0.6mol를 사용하였다.The alpha-herix structure fibroin has an average weight molecular weight of 3,500 Da, and PDI 1.90 and RGD 0.6 mol were used.
실험 결과는 도 7 과 같았다.The experimental results were as shown in FIG. 7 .
amide I, amide II 및 amide III 에서 보듯이 amide I 진동은 CO 스트레칭을 나타내는 반면, amide Ⅱ 진동은 NH 결합의 굴곡을 나타낸다. CN 스트레칭은 amide Ⅲ 진동이 연관되어있다. NH 변형과 CN 신축 진동의 조합에 알파헤릭스 구조 및 베타구조의 피브로인의 chemical shift는 나타나지 않았다. 즉, 결론적으로 두 구조의 피브로인 즉 본원에서 사용된 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더 및 베타구조 피브로인 입자는 화학적 이동이 일어나지 않았다.As shown for amide I, amide II and amide III, amide I vibrations represent CO stretching, whereas amide II vibrations represent bending of N-H bonds. CN stretching is associated with amide III oscillations. In the combination of NH deformation and CN stretching vibration, no chemical shift of alpha-herix structure and beta-structure fibroin was observed. That is, in conclusion, the two structures of fibroin, that is, the alpha-herix structure fibroin powder and the beta structure fibroin particles used herein, did not undergo chemical migration.
시험예 10 : 삼원공중합체 함량에 따른 LCST 분석Test Example 10: LCST analysis according to terpolymer content
본 시험은 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더 50mg/ml, 입자크기가 40㎛ 내지 70㎛ 이며, 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자 50mg/ml, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체 농도에 따른 LCST를 측정한 자료로서 기존의 농도에 따른 순수 삼원공중합체의 LCST와 비교하여 실험하였다. 시험방법은 브록필드 점도계를 사용하여 삼원공중합체의 각각의 농도에따라 측정하였다.In this test, 50 mg/ml of water-soluble alpha-herix structure fibroin powder, 50 mg/ml of water-insoluble beta structure fibroin particles with a particle size of 40 to 70 μm, and polyethylene oxide (PEO) - polypropylene oxide (PPO) ) - As the data obtained by measuring the LCST according to the concentration of polyethylene oxide (PEO) terpolymer, it was compared with the LCST of the pure terpolymer according to the existing concentration. The test method was measured according to each concentration of the terpolymer using a Brockfield viscometer.
먼저 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인 파우더 50mg/ml, 입자크기가 40㎛ 내지 70㎛ 이며, 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자 50mg/ml, 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체의 혼합물 중 삼원공중합체의 농도를 150mg/ml, 170mg/ml, 180mg/ml, 190mg/ml, 200mg/ml, 210mg/ml, 220mg/ml, 230mg/ml, 240mg/ml, 250mg/ml, 260mg/ml, 270mg/ml, 280mg/ml, 290mg/ml 및 300mg/ml 으로 조절하였다.First, water-soluble alpha-herix structure fibroin powder 50mg/ml,
실험 결과Experiment result
삼원공중합체의 농도가 150mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 37±2도에서 겔화되며, 160mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 36±2도에서 겔화되며, 170mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 35±2도에서 겔화되며, 180mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 35±2도에서 겔화되며, 190mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 34±2도에서 겔화되며, 200 mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 33±2도에서 겔화되며, 210mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 32±2도에서 겔화되며, 220mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 31±2도에서 겔화되며, 230mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 30±2도에서 겔화되며, 240mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 29±2도에서 겔화되며, 250mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 28±2도에서 겔화되며, 260mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 27±2도에서 겔화되며, 270mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 26±2도에서 겔화되며, 280mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 25±2도에서 겔화되며, 290mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 24±2도에서 겔화되며, 300mg/ml 일 때 졸-겔 전이온도는 섭씨 23±2도에서 겔화가 이루어 졌다. When the concentration of the terpolymer is 150mg/ml, the sol-gel transition temperature is gelated at 37±2 degrees Celsius, and when the concentration of the terpolymer is 160mg/ml, the sol-gel transition temperature is gelated at 36±2 degrees Celsius, and at 170mg/ml day The sol-gel transition temperature is gelation at 35±2 degrees Celsius, the sol-gel transition temperature is gelation at 35±2 degrees Celsius at 180mg/ml, and the sol-gel transition temperature is 34±2 degrees Celsius at 190mg/ml It gels at 2 degrees Celsius, and at 200 mg/ml, the sol-gel transition temperature gels at 33 ± 2 degrees Celsius, and at 210 mg/ml, the sol-gel transition temperature gelates at 32 ± 2 degrees Celsius, and at 220 mg/ml When , the sol-gel transition temperature is gelated at 31±2 degrees Celsius, at 230mg/ml, the sol-gel transition temperature is gelated at 30±2 degrees Celsius, and at 240mg/ml, the sol-gel transition temperature is 29 degrees Celsius. It gels at ±2 degrees Celsius, and at 250mg/ml, the sol-gel transition temperature gels at 28±2 degrees Celsius, and at 260mg/ml, the sol-gel transition temperature gelates at 27±2 degrees Celsius, and at 270mg/ml When , the sol-gel transition temperature is gelated at 26±2 degrees Celsius, at 280mg/ml, the sol-gel transition temperature is gelated at 25±2 degrees Celsius, and at 290mg/ml, the sol-gel transition temperature is 24 degrees Celsius. Gelation occurred at ± 2 degrees Celsius, and the sol-gel transition temperature at 300 mg/ml was 23 ± 2 degrees Celsius.
그러나 순수 삼원공중합체는 상기의 각각의 농도 대비 LCST가 섭씨 2도 내지 3도 정도 하강하여 측정되었다.However, the pure terpolymer was measured with a drop of about 2 to 3 degrees Celsius in LCST compared to the respective concentrations.
결과적으로 물에 가용성인 알파헤릭스 구조 피브로인은 혼합 하이드로겔 내에서 삼원공중합체의 LCST에 부분적으로 영향을 줌을 시험을 통해 알 수 있다.As a result, it can be seen through the test that alpha-herix structured fibroin, which is soluble in water, partially affects the LCST of the terpolymer in the mixed hydrogel.
시험예 11 : 두 종류의 혼합물에(알파헤릭스 구조의 피브로인과 PEO-PPO-PEO삼원공중합체, 알파헤릭스 구조의 피브로인과 가교된 히알루론산) 사용된 베타시트 구조 피브로인 입자의 제타전위 분석Test Example 11: Analysis of zeta potential of beta sheet structured fibroin particles used in two types of mixtures (alpha-herix structure fibroin and PEO-PPO-PEO terpolymer, alpha-herix structure fibroin and cross-linked hyaluronic acid)
본 시험은 물에 불용성인 베타시트 구조 피브로인 입자의 하이드로겔 내부의 분산안정성을 실험한 결과이다.This test is the result of testing the dispersion stability of water-insoluble beta-sheet structured fibroin particles inside the hydrogel.
물에 가용성인 알파헤릭스구조 피브로인 파우더(50mg/ml), 평균 입자사이즈가 20㎛ 인 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자(50mg/ml)와 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) - 폴리프로필렌옥사이드 (PPO) - 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) 삼원공중합체 200mg/ml을 혼합하여 제타전위를 분석하였다. Water-soluble alpha-helix structured fibroin powder (50mg/ml), water-insoluble beta-structured fibroin particles (50mg/ml) with an average particle size of 20㎛ and polyethylene oxide (PEO) - polypropylene oxide (PPO) - Zeta potential was analyzed by mixing 200 mg/ml of polyethylene oxide (PEO) terpolymer.
물에 가용성인 알파헤릭스구조 피브로인 파우더(50mg/ml), 평균 입자사이즈가 65㎛ 인 물에 불용성인 베타구조 피브로인 입자(50mg/ml)와 가교결합된 히알루론산 20mg/ml을 혼합하여 제타전위를 분석하였다.Water-soluble alpha-herix structure fibroin powder (50mg/ml), water-insoluble beta structure fibroin particles (50mg/ml) with an average particle size of 65㎛ and cross-linked hyaluronic acid 20mg/ml were mixed to increase zeta potential was analyzed.
실험 결과는 도 6과 같았다.The experimental results were as shown in FIG. 6 .
상기의 시험에서 결과적으로 물에 불용성인 베타시트 구조의 피브로인 입자는 물에 가용성인 알파헤릭스 구조의 피브로인과 삼원공중합체(도 6의 A) 내지 가교된 히알루론산(도 6의 B)에 의해 하이드로겔 내부에서 응집현상이 발생하지 않음을 확인할 수 있다. 즉 본 발명에서 제시된 주사주입시 주사실린저와 니즐 사이에 병목현상이 발생되지 않아 타겟내 주입시 원활한 주사주입이 가능함을 나타낸다.As a result of the above test, the water-insoluble beta-sheet structured fibroin particles are formed by water-soluble alpha-helix structured fibroin and terpolymer (FIG. 6A) or cross-linked hyaluronic acid (FIG. 6B). It can be confirmed that no aggregation occurs inside the hydrogel. That is, during the injection presented in the present invention, the bottleneck phenomenon does not occur between the syringe and the needle, indicating that smooth injection is possible during injection into the target.
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.Although the embodiments of the present invention have been described with reference to the accompanying drawings, those skilled in the art can implement the present invention in other specific forms without changing its technical spirit or essential features. You will understand that there is Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.
Claims (24)
물에 가용성인 피브로인 및 물에 불용성인 피브로인을 포함하는 피브로인 혼합물을 포함하고,
상기 물에 가용성이 피브로인은 알파헬릭스 구조의 피브로인이며, 상기 물에 불용성이 피브로인은 베타시트 병풍구조의 피브로인이며,
상기 알파헬릭스 구조의 피브로인은 중량평균분자량이 3,000 내지 10,000 Da 이며,
상기 베타시트 병풍구조의 피브로인은 중량평균분자량이 3,000 내지 100,000 Da 이고,
상기 알파헬릭스 구조의 피브로인은 다분산지수(PDI)가 1.3 내지 2.3 이며, 전체 아미노산 서열에 대하여 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티브를 0.5 내지 5 mol로 포함하며,
상기 베타시트 병풍구조의 피브로인은 다분산지수(PDI)가 1.3 내지 2.3 이며, 전체 아미노산 서열에 대하여 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티브를 0.5 내지 5 mol로 포함하고, 입자 평균 크기가 1㎛ 내지 100㎛ 인,
하이드로겔 조성물.
In the hydrogel composition for filling, regenerating, repairing, expanding, restoring or preventing adhesion of tissue, the composition
A fibroin mixture comprising water-soluble fibroin and water-insoluble fibroin,
The water-soluble fibroin is alpha-helix structured fibroin, and the water-insoluble fibroin is beta sheet sheet structured fibroin,
The alpha-helix structured fibroin has a weight average molecular weight of 3,000 to 10,000 Da,
The fibroin of the beta sheet sheet structure has a weight average molecular weight of 3,000 to 100,000 Da,
The alpha-helix structured fibroin has a polydispersity index (PDI) of 1.3 to 2.3 and contains an Arg-Gly-Asp (RGD) motif of 0.5 to 5 mol with respect to the entire amino acid sequence,
The fibroin of the beta sheet sheet structure has a polydispersity index (PDI) of 1.3 to 2.3, contains an Arg-Gly-Asp (RGD) motif of 0.5 to 5 mol with respect to the entire amino acid sequence, and has an average particle size of 1 μm to 100 μm phosphorus,
hydrogel composition.
하이드로겔 조성물 전체 1000 중량부에 대하여
상기 알파헬릭스 구조의 피브로인은 5 내지 50 중량부,
상기 베타시트 병풍구조의 피브로인은 1 내지 100 중량부로 포함되는,
하이드로겔 조성물.
According to claim 1,
Based on 1000 parts by weight of the entire hydrogel composition
The alpha-helix structured fibroin is 5 to 50 parts by weight,
Fibroin of the beta sheet sheet structure is included in 1 to 100 parts by weight,
hydrogel composition.
상기 알파헬릭스 구조의 피브로인 및 상기 베타시트 병풍구조의 피브로인은 1 : 0.1 내지 20의 중량비로 포함되는, 하이드로겔 조성물.
According to claim 5
Fibroin of the alpha-helix structure and fibroin of the beta sheet sheet structure are included in a weight ratio of 1: 0.1 to 20, the hydrogel composition.
상기 피브로인 혼합물은 제타전위가 10mv 이하인, 하이드로겔 조성물.
According to claim 1,
The fibroin mixture has a zeta potential of 10 mv or less, the hydrogel composition.
상기 조성물은 주사 주입이 가능한 형태인, 하이드로겔 조성물.
According to claim 1,
The composition is a hydrogel composition in the form of an injection injection possible.
상기 조성물은 조직 주입 후 적어도 1개월 이상 조직 내에서 조직 원래 부피의 적어도 30% 이상을 유지하는, 하이드로겔 조성물.
According to claim 1,
The composition is a hydrogel composition that maintains at least 30% or more of the original volume of the tissue in the tissue for at least one month or more after tissue injection.
상기 조성물은 폴리에틸렌옥사이드(PEO) - 폴리프로필렌옥사이드(PPO) - 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 삼원공중합체를 더 포함하는, 하이드로겔 조성물.
The method of any one of claims 1 and 5 to 9,
The composition further comprises a polyethylene oxide (PEO) - polypropylene oxide (PPO) - polyethylene oxide (PEO) terpolymer, the hydrogel composition.
상기 삼원공중합체는 폴리에틸렌옥사이드(PEO) 단위체의 함량이 65 내지 85 몰% 이고, 중량평균분자량이 7500 내지 16000 g/mol 인, 하이드로겔 조성물.
According to claim 10,
The terpolymer has a polyethylene oxide (PEO) unit content of 65 to 85 mol%, and a weight average molecular weight of 7500 to 16000 g / mol, the hydrogel composition.
하이드로겔 조성물 전체 1000 중량부에 대하여
상기 삼원공중합체는 150 내지 300 중량부로 포함되는, 하이드로겔 조성물.
According to claim 10.
Based on 1000 parts by weight of the entire hydrogel composition
The terpolymer is contained in 150 to 300 parts by weight, the hydrogel composition.
상기 조성물은 리도카인; 디-마니톨; 또는 리도카인과 디-마니톨;을 더 포함하는, 하이드로겔 조성물.
According to claim 10,
The composition comprises lidocaine; d-mannitol; or lidocaine and di-mannitol; further comprising a hydrogel composition.
하이드로겔 조성물 전체 1000 중량부에 대하여
상기 리도카인은 2 내지 4 중량부,
상기 디-마니톨은 1 내지 50 중량부로 포함되는, 하이드로겔 조성물.
According to claim 13,
Based on 1000 parts by weight of the entire hydrogel composition
The lidocaine is 2 to 4 parts by weight,
The di-mannitol is contained in 1 to 50 parts by weight, the hydrogel composition.
상기 하이드로겔 조성물은 유착방지제 또는 연조직 충진용 필터로 사용되는, 하이드로겔 조성물.
According to claim 10.
The hydrogel composition is used as an anti-adhesion agent or a soft tissue filling filter.
상기 하이드로겔 조성물은 연조직 주입시 졸에서 겔로 전이되는 온도 범위는 섭씨 21도 내지 39도에서 겔화가 이루어지는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 조성물.
According to claim 10.
The hydrogel composition is a hydrogel composition, characterized in that the gelation is performed at a temperature range of 21 degrees Celsius to 39 degrees Celsius in which the transition from sol to gel is performed during soft tissue injection.
상기 조성물은 가교결합된 히알루론산을 포함하는, 하이드로겔 조성물.
The method of any one of claims 1 and 5 to 9,
Wherein the composition comprises cross-linked hyaluronic acid.
상기 가교결합된 히알루론산은 평균분자량이 400,000 내지 600,000 Da의 저분자량 히알루론산과 평균분자량이 1,700,000 내지 2,100,000 Da의 고분자량 히알루론산이 가교된 것인, 하이드로겔 조성물.
According to claim 17,
The crosslinked hyaluronic acid is a hydrogel composition in which low molecular weight hyaluronic acid having an average molecular weight of 400,000 to 600,000 Da and high molecular weight hyaluronic acid having an average molecular weight of 1,700,000 to 2,100,000 Da are crosslinked.
상기 저분자량 히알루론산과 고분자량 히알루론산은 10 내지 30 : 90 내지 70의 중량비로 가교된 것인, 하이드로겔 조성물.
According to claim 18,
The low molecular weight hyaluronic acid and the high molecular weight hyaluronic acid are crosslinked in a weight ratio of 10 to 30: 90 to 70, the hydrogel composition.
상기 가교결합된 히알루론산은 평균분자량이 1,700,000 내지 3,000,000 Da인, 하이드로겔 조성물.
According to claim 17,
The cross-linked hyaluronic acid has an average molecular weight of 1,700,000 to 3,000,000 Da, the hydrogel composition.
하이드로겔 조성물 전체 1000 중량부에 대하여
상기 가교결합된 히알루론산은 20 내지 50 중량부로 포함되는, 하이드로겔 조성물.
According to claim 17,
Based on 1000 parts by weight of the entire hydrogel composition
The cross-linked hyaluronic acid is contained in 20 to 50 parts by weight, the hydrogel composition.
상기 조성물은 리도카인; 디-마니톨; 또는 리도카인과 디-마니톨;을 더 포함하는, 하이드로겔 조성물.
According to claim 17,
The composition comprises lidocaine; d-mannitol; or lidocaine and di-mannitol; further comprising a hydrogel composition.
하이드로겔 조성물 전체 1000 중량부에 대하여
상기 리도카인은 2 내지 4 중량부,
상기 디-마니톨은 1 내지 50 중량부로 포함되는, 하이드로겔 조성물.
23. The method of claim 22,
Based on 1000 parts by weight of the entire hydrogel composition
The lidocaine is 2 to 4 parts by weight,
The di-mannitol is contained in 1 to 50 parts by weight, the hydrogel composition.
상기 하이드로겔은 연골충진제 또는 연조직 충진용 필터로 사용되는, 하이드로겔 조성물.
According to claim 17,
The hydrogel is used as a filter for filling cartilage fillers or soft tissue, the hydrogel composition.
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