KR102507881B1 - 3 dimension microfluidic system and bio-controlled protein analytical method using of the same - Google Patents

3 dimension microfluidic system and bio-controlled protein analytical method using of the same Download PDF

Info

Publication number
KR102507881B1
KR102507881B1 KR1020210003152A KR20210003152A KR102507881B1 KR 102507881 B1 KR102507881 B1 KR 102507881B1 KR 1020210003152 A KR1020210003152 A KR 1020210003152A KR 20210003152 A KR20210003152 A KR 20210003152A KR 102507881 B1 KR102507881 B1 KR 102507881B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chamber
layer
washing
culture chamber
culture
Prior art date
Application number
KR1020210003152A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20220101289A (en
Inventor
강현욱
강동희
김나경
Original Assignee
전남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교산학협력단 filed Critical 전남대학교산학협력단
Priority to KR1020210003152A priority Critical patent/KR102507881B1/en
Publication of KR20220101289A publication Critical patent/KR20220101289A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102507881B1 publication Critical patent/KR102507881B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/14—Rotation or movement of the cells support, e.g. rotated hollow fibers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/20—Degassing; Venting; Bubble traps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M39/00—Means for cleaning the apparatus or avoiding unwanted deposits of microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명의 일 측면은 병원, 생체 유래물 분석기관과 같이 검체를 채취 및 분석 가능한 장소에서 임상시험을 목적으로 사용하는 3차원 미세유체 시스템을 제공하는 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 미세유체 시스템은, 배양챔버를 구비하고 중심에 결합구를 구비하는 배양챔버층, 상기 배양챔버의 외측에 연결되는 세척챔버를 구비하여 상기 배양챔버층에 결합되는 세척챔버층, 상기 배양챔버와 상기 세척챔버에 연결되는 미세채널들을 구비하는 미세채널층, 및 상기 결합구에 결합되어 회전력을 전달하는 회전축을 포함한다.One aspect of the present invention is to provide a three-dimensional microfluidic system that is used for the purpose of clinical trials in places where samples can be collected and analyzed, such as hospitals and biological products analysis institutions. A three-dimensional microfluidic system according to an embodiment of the present invention includes a culture chamber layer having a culture chamber and a coupler at the center, and a washing chamber connected to the outside of the culture chamber to be coupled to the culture chamber layer. It includes a washing chamber layer, a microchannel layer having microchannels connected to the culture chamber and the washing chamber, and a rotating shaft coupled to the coupler and transmitting rotational force.

Description

3차원 미세유체 시스템 및 이를 이용한 생체조절단백질의 분석방법 {3 DIMENSION MICROFLUIDIC SYSTEM AND BIO-CONTROLLED PROTEIN ANALYTICAL METHOD USING OF THE SAME}3D microfluidic system and method for analyzing bioregulatory proteins using the same

본 발명은 3차원 미세유체 시스템 및 이를 이용한 생체조절단백질의 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈관생성인자(VEGF)와 같은 극미량의 생체조절단백질 검출을 위한 랩온어디스크(Lab-On-a-Disk, LOD) 플랫폼 형식의 3차원 미세유체 시스템(Microfluidic system) 및 이를 이용한 생체조절단백질의 분석방법에 관한 것이다.The present invention relates to a three-dimensional microfluidic system and a method for analyzing bioregulatory proteins using the same, and more particularly, to a lab-on-a-disk (Lab-On-a -Disk, LOD) platform type 3-dimensional microfluidic system and analysis method of bioregulatory protein using it.

알려진 바에 따르면, 항원-항체 면역침강법(Enzyme-Linked Immunosorbent assay, ELISA)은 정밀한 수준으로 극미량의 생체조절단백질을 검출할 수 있지만 검출까지 많은 시간을 소요한다.As is well known, the Enzyme-Linked Immunosorbent assay (ELISA) can detect a very small amount of bioregulatory protein at a precise level, but it takes a long time to detect.

예를 들면, 2~3회 가량 수행되는 인큐베이션(Incubation) 과정에서, 항원 및 항체간 결합하는 과정뿐만 아니라 표지물질을 결합하는 과정에 시간이 소요되며, 각 과정당 1시간 ~ 2시간이 소요된다.For example, in the incubation process, which is performed 2 to 3 times, time is required for the process of binding the label as well as the process of binding between the antigen and antibody, and each process takes 1 to 2 hours. .

또한, 혈관생성인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)와 같이 눈에서 채취되는 생체 유래물은 채취량이 제한적이며, 많은 양의 시료 채취는 환자의 건강에 부담이 될 뿐만 아니라, 미량 채취 및 반복 측정으로 인하여 많은 제약이 있다.In addition, bioderived substances collected from the eye, such as vascular endothelial growth factor (VEGF), are limited in collection amount, and collecting large amounts of samples not only burdens the patient's health, There are many limitations because of this.

본 발명의 일 측면은 병원, 생체 유래물 분석기관과 같이 검체를 채취 및 분석 가능한 장소에서 임상시험을 목적으로 사용하는 3차원 미세유체 시스템 및 이를 이용한 생체조절단백질의 분석방법을 제공하는 것이다.One aspect of the present invention is to provide a three-dimensional microfluidic system used for the purpose of clinical trials in places where samples can be collected and analyzed, such as hospitals and biologically derived product analysis institutions, and a method for analyzing bioregulatory proteins using the same.

본 발명의 일 측면은 항원-항체 면역침강법(ELISA)을 미세유체 시스템에 적용하여, 사용되는 시료양을 1/10 수준으로 줄이고, 반응시간을 1시간 이내로 단축시켜서 저렴한 비용으로 생체조절단백질을 검출하는 3차원 미세유체 시스템 및 이를 이용한 생체조절단백질의 분석방법을 제공하는 것이다.One aspect of the present invention applies antigen-antibody immunoprecipitation (ELISA) to a microfluidic system, reduces the amount of sample used to 1/10 level, and shortens the reaction time to less than 1 hour to detect bioregulatory proteins at low cost. To provide a three-dimensional microfluidic system and a method for analyzing bioregulatory proteins using the same.

본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 미세유체 시스템은, 배양챔버를 구비하고 중심에 결합구를 구비하는 배양챔버층, 상기 배양챔버의 외측에 연결되는 세척챔버를 구비하여 상기 배양챔버층에 결합되는 세척챔버층, 상기 배양챔버와 상기 세척챔버에 연결되는 미세채널들을 구비하는 미세채널층, 및 상기 결합구에 결합되어 회전력을 전달하는 회전축을 포함한다.A three-dimensional microfluidic system according to an embodiment of the present invention includes a culture chamber layer having a culture chamber and a coupler at the center, and a washing chamber connected to the outside of the culture chamber to be coupled to the culture chamber layer. It includes a washing chamber layer, a microchannel layer having microchannels connected to the culture chamber and the washing chamber, and a rotating shaft coupled to the coupler and transmitting rotational force.

상기 배양챔버층은 3D 프린팅 기법으로 제작되고, 상기 세척챔버층은 레이저 커팅으로 제작될 수 있다.The culture chamber layer may be manufactured by 3D printing, and the washing chamber layer may be manufactured by laser cutting.

상기 미세채널층은 상기 배양챔버층과 상기 세척챔버층 상에 결합되고, 상기 배양챔버에 시료를 공급하는 시료 주입구와 시료채널, 상기 배양챔버의 에어를 배출하는 에어밴트와 에어밴트채널, 및 상기 세척챔버에 세척완충액을 주입하는 세척완충액 주입구와 세척완충액채널을 구비할 수 있다.The microchannel layer is coupled to the culture chamber layer and the washing chamber layer, and includes a sample inlet and a sample channel for supplying a sample to the culture chamber, an air vent and an air vent channel for discharging air from the culture chamber, and the A washing buffer injection hole and a washing buffer channel for injecting a washing buffer into the washing chamber may be provided.

상기 세척챔버층은 상기 세척챔버에서 연장되는 연장부에 검출영역을 형성할 수 있다.The washing chamber layer may form a detection area at an extension extending from the washing chamber.

본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 미세유체 시스템은, 상기 미세체널층 상에 탑커버층을 구비하고, 상기 세척챔버층과 상기 미세채널층 하에 바텀커버층를 구비할 수 있다.The 3D microfluidic system according to an embodiment of the present invention may include a top cover layer on the microchannel layer, and a bottom cover layer under the washing chamber layer and the microchannel layer.

상기 배양챔버와 상기 세척챔버는 디스크 상에서 중심부와 외곽부에 각각 구비되어 직경 방향으로 연결되며, 상기 배양챔버는 중심부가 낮고 외곽부가 높아지며, 상기 세척챔버는 상기 배양챔버의 가장 높은 외곽부에 동일한 높이로 형성될 수 있다.The culture chamber and the washing chamber are respectively provided on the center and the outer part of the disk and are connected in the radial direction, the culture chamber has a low center and a high outer part, and the washing chamber has the same height as the highest outer part of the culture chamber. can be formed as

본 발명의 일 실시예에 따른 생체조절단백질의 분석방법은, 3차원 미세유체 시스템을 사용하며, 세척완충액(wash buffer solution)을 세척챔버에 주입하고, 마이크로 비드에 포획항체를 부착시킨 비드-포획항체(cAB-비드) 용액, VEGF-항원(VEGF)과 형광체-검출항체(dAB-형광체)의 용액으로 이루어지는 시료를 배양챔버에 주입하는 로딩단계, 제1시간 동안 3차원 미세유체 시스템의 제1가속과 정지를 통해서 cAB-비드가 상기 배양챔버의 바닥 비탈면을 따라 승강하면서 항원-항체 결합반응이 이뤄지면서, VEGF, dAB-형광체 및 cAB-비드가 서로 결합하는 배양단계, 상기 제1시간보다 짧은 제2시간 동안 상기 제1보다 높은 제2가속 후, 세척완충액에서 결합되지 못한 반응물들 dAB-형광체가 상기 배양챔버에 남고 cAB-비드가 검출영역의 연장부에 모으는 세척단계, 및 상기 연장부에 응집된 cAB-비드에 광소스를 조사하여 VEGF와 dAB-형광체와 결합된 형광체의 농도에 비례하는 형광 특성을 얻는 검출단계를 포함한다.The method for analyzing bioregulatory proteins according to an embodiment of the present invention uses a three-dimensional microfluidic system, injects a wash buffer solution into a washing chamber, and attaches a capture antibody to microbeads for bead-capture. A loading step of injecting a sample consisting of an antibody (cAB-bead) solution, a VEGF-antigen (VEGF) and a phosphor-detection antibody (dAB-phosphor) solution into the culture chamber, the first step of the three-dimensional microfluidic system for the first hour A culture step in which VEGF, dAB-phosphor, and cAB-beads bind to each other while the cAB-beads rise and fall along the bottom slope of the culture chamber through acceleration and stop, while the antigen-antibody binding reaction is performed, shorter than the first time After a second acceleration higher than the first for a second time, a washing step in which reactants dAB-phosphors that were not bound in the washing buffer remain in the culture chamber and cAB-beads are collected in the extension of the detection area, and in the extension and a detection step of irradiating the aggregated cAB-beads with a light source to obtain fluorescence characteristics proportional to the concentrations of VEGF and dAB-phosphor combined.

이와 같이 본 발명의 일 실시예는, 배양챔버의 배양챔버층, 세척챔버의 세척챔버층, 미세채널의 미세채널층 및 이들을 회전시키는 회전축을 구비하고, cAB-비드, VEGF과 dAB-형광체로 이루어지는 시료를 배양챔버에 주입하여, VEGF, dAB-형광체 및 cAB-비드를 서로 결합하고, cAB-비드를 검출영역의 연장부에 모아서, 응집된 cAB-비드에 광소스를 조사하여 VEGF와 dAB-형광체와 결합된 형광체의 농도에 비례하는 형광 특성 결과를 얻을 수 이있다.As such, one embodiment of the present invention is provided with a culture chamber layer of the culture chamber, a washing chamber layer of the washing chamber, a microchannel layer of the microchannel and a rotating shaft for rotating them, and composed of cAB-beads, VEGF and dAB-phosphor. Samples are injected into the culture chamber, VEGF, dAB-phosphor and cAB-beads are combined with each other, cAB-beads are collected at the extension of the detection area, and the aggregated cAB-beads are irradiated with a light source to detect VEGF and dAB-phosphor Fluorescence characteristics that are proportional to the concentration of the phosphor combined with can be obtained.

cAB-비드, 즉 마이크로 비드(microbead)를 이용하여 VEGF, dAB-형광체 및 cAB-비드의 결합시간을 극단적으로 줄이므로 항원-항체 결합반응에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.Since the binding time of VEGF, dAB-phosphor, and cAB-beads is extremely reduced using cAB-beads, that is, microbeads, the time required for antigen-antibody binding reaction can be shortened.

cAB-비드, 즉 마이크로 비드는 3차원 미세유체 시스템의 배양챔버와 세척챔버 내부에서 원심력과 중력을 이용하여 움직임이 제어될 수 있으며, 이를 통해서 일 실시예는 항원-항체간 결합을 위한 환경을 효과적으로 조성할 수 있다.Movement of cAB-beads, that is, microbeads, can be controlled using centrifugal force and gravity inside the culture chamber and washing chamber of the three-dimensional microfluidic system, and through this, an embodiment effectively creates an environment for antigen-antibody binding. can be created.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 미세유체 시스템의 평면도이다.
도 2는 도 1의 Ⅱ부분을 확대한 부분 확대도이다.
도 3은 도 2의 Ⅲ-Ⅲ 선을 따른 단면도이다.
도 4는 혈관생성인자(VEGF) 검출을 위한 단순화 된 비드 기반 항원-항체 면역침강법(ELISA) 프로토콜의 회로도이다.
도 5, 도 6 및 도 7은 일 실시예의 3차원 미세유체 시스템에서 단면에 도시된 회로도이다.
도 8은 혈관생성인자(VEGF) 농도가 각각 1mL 당 0g, 1ng 및 1μg인 검출영역에서 형광체가 결합된 비드의 명시야 및 형광 이미지이다.
도 9는 혈관생성인자(VEGF) 농도의 변화에 따른 형광 강도를 도시한 그래프이다.
도 10은 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 개략도이며(도 10a), 적색 형광, 녹색 형광 및 웰 플레이트의 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 병합된 이미지이다(도 10b, 도 10c 도 10d).
도 11은 단순화 된 비드 기반 항원-항체 면역침강법(ELISA) 프로토콜에서 각각 100, 10 및 5μL 시료로 2시간 배양하는 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 형광 강도의 그래프이며(도 11a, 도 11b, 도 11c), 각 10μL 시료로 1시간 배양을 위한 비드상의 형광체가 결합된 VEGF의 형광 강도의 그래프이다.1 is a plan view of a 3D microfluidic system according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a partially enlarged view of part II of FIG. 1 .
FIG. 3 is a cross-sectional view along line III-III of FIG. 2 .
Figure 4 is a schematic diagram of a simplified bead-based antigen-antibody immunoprecipitation (ELISA) protocol for angiogenic factor (VEGF) detection.
5, 6 and 7 are circuit diagrams shown in cross section in a 3D microfluidic system according to an embodiment.
FIG. 8 shows bright field and fluorescence images of fluorescent-coupled beads in detection regions where VEGF concentrations are 0g, 1ng, and 1μg per 1mL, respectively.
9 is a graph showing fluorescence intensity according to changes in angiogenesis factor (VEGF) concentration.
FIG. 10 is a schematic diagram of VEGF bound to beads ( FIG. 10a ) and a merged image of red fluorescence, green fluorescence, and VEGF bound to beads in a well plate ( FIGS. 10b , 10c and 10d ).
11 is a graph of fluorescence intensity of VEGF conjugated with a fluorophore to beads incubated for 2 hours with 100, 10, and 5 μL samples, respectively, in a simplified bead-based antigen-antibody immunoprecipitation (ELISA) protocol (FIG. 11a, FIG. 11b, 11c), a graph of the fluorescence intensity of VEGF bound to a phosphor on a bead for 1 hour incubation with each 10 μL sample.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 붙였다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those skilled in the art can easily carry out the present invention. However, the present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments described herein. In order to clearly describe the present invention in the drawings, parts irrelevant to the description are omitted, and the same reference numerals are assigned to the same or similar components throughout the specification.

제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.Terms including ordinal numbers, such as first and second, may be used to describe various components, but the components are not limited by the terms. These terms are only used for the purpose of distinguishing one component from another.

어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.It is understood that when an element is referred to as being "connected" or "connected" to another element, it may be directly connected or connected to the other element, but other elements may exist in the middle. It should be. On the other hand, when an element is referred to as “directly connected” or “directly connected” to another element, it should be understood that no other element exists in the middle.

명세서 전체에서, "포함한다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification, the terms "comprise" or "have" are intended to indicate that there is a feature, number, step, operation, component, part, or combination thereof described in the specification, but that one or more other features are present. It should be understood that the presence or addition of numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof is not precluded. Therefore, when a certain component is said to "include", it means that it may further include other components, not excluding other components unless otherwise stated.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 미세유체 시스템의 평면도이고, 도 2는 도 1의 Ⅱ부분을 확대한 부분 확대도이며, 도 3은 도 2의 Ⅲ-Ⅲ 선을 따른 단면도이다.1 is a plan view of a three-dimensional microfluidic system according to an embodiment of the present invention, FIG. 2 is a partial enlarged view of part II of FIG. 1, and FIG. 3 is a cross-sectional view taken along line III-III of FIG. 2 .

도 1 내지 도 3을 참조하면, 일 실시예의 3차원 미세유체 시스템은, 배양챔버(11)를 구비하는 배양챔버층(10), 세척챔버(21)를 구비하는 세척챔버층(20), 배양챔버(11)와 세척챔버(21)에 연결되는 미세채널을 구비하는 미세채널층(30), 및 가속기(미도시)를 포함한다.1 to 3, the three-dimensional microfluidic system of one embodiment includes a culture chamber layer 10 including a culture chamber 11, a washing chamber layer 20 including a washing chamber 21, and culture It includes a chamber 11 and a microchannel layer 30 having microchannels connected to the washing chamber 21, and an accelerator (not shown).

배양챔버층(10)은 3D 프린팅 기법으로 제작되고, 세척챔버층(20)은 레이저 커팅으로 제작된다. 배양챔버층(10)은 3차원 미세유체 디스크의 중심부를 형성하고, 세척챔버층(20)은 배양챔버층(10)의 외측에 결합되어 3차원 미세유체 디스크의 외곽부를 형성한다.The culture chamber layer 10 is manufactured by 3D printing, and the washing chamber layer 20 is manufactured by laser cutting. The culture chamber layer 10 forms the central portion of the 3D microfluidic disk, and the washing chamber layer 20 is coupled to the outside of the culture chamber layer 10 to form the outer portion of the 3D microfluidic disk.

즉 배양챔버(11)와 세척챔버(21)는 디스크 상에서 중심부와 외곽부에 각각 구비되어 직경 방향으로 반경 범위 내에서 서로 연결된다. 배양챔버(11)와 세척챔버(21)의 연결은 디스크 상에서 원주 방향을 따라 설정된 각도의 간격으로 배치된다.That is, the culture chamber 11 and the washing chamber 21 are provided at the center and the outer portion of the disk, respectively, and are connected to each other within a radial range in the radial direction. The connection between the culture chamber 11 and the washing chamber 21 is arranged at intervals of a set angle along the circumferential direction on the disk.

배양챔버(11)는 중심부가 낮고 외곽부가 높아지는 구조로 형성된다. 세척챔버(21)는 배양챔버(11)의 가장 높은 외곽부에 동일한 높이로 형성되어 연결된다.The culture chamber 11 has a structure in which a central portion is low and an outer portion is elevated. The washing chamber 21 is formed at the same height as the highest outer portion of the culture chamber 11 and connected thereto.

미세채널층(30)은 배양챔버층(10)과 세척챔버층(20) 상에 결합된다. 미세채널층(30)은 배양챔버(11)에 시료를 공급하는 시료 주입구(311)와 시료채널(312), 배양챔버(11)의 에어를 배출하는 에어밴트(321)와 에어밴트채널(322), 및 세척챔버(21)에 세척완충액을 주입하는 세척완충액 주입구(331)와 세척완충액채널(332)을 구비한다. The microchannel layer 30 is coupled on the culture chamber layer 10 and the washing chamber layer 20 . The microchannel layer 30 includes a sample inlet 311 and a sample channel 312 for supplying samples to the culture chamber 11, an air vent 321 and an air vent channel 322 for discharging air from the culture chamber 11. ), and a washing buffer injection port 331 and a washing buffer channel 332 for injecting the washing buffer into the washing chamber 21 .

따라서 미세채널층(30)의 시료 주입구(311)와 시료채널(312)로 시료를 배양챔버(11)에 공급할 수 있고, 미세채널층(30)의 에어밴트(321)로 배양챔버(11)에 시료 주입시 배양챔버(11) 내의 에어를 배출할 수 있으며, 미세채널층(30)의 세척완충액 주입구(331)와 세척완충액채널(332)로 세척완충액을 세척챔버(21)로 공급할 수 있다.Therefore, the sample can be supplied to the culture chamber 11 through the sample inlet 311 and the sample channel 312 of the microchannel layer 30, and the air vent 321 of the microchannel layer 30 can supply the culture chamber 11 When a sample is injected, air in the culture chamber 11 can be discharged, and the washing buffer can be supplied to the washing chamber 21 through the washing buffer inlet 331 and the washing buffer channel 332 of the microchannel layer 30. .

시료 주입구(311)와 시료채널(312)은 시료를 배양챔버(11)에서 경사진 높은 곳에 공급하며, 체척완충액 주입구(331)와 세척완충액채널(332)은 세척완충액을 배양챔버(11)로 부터 먼 위치의 세척챔버(21)에 공급한다.The sample inlet 311 and the sample channel 312 supply the sample to a high inclined place in the culture chamber 11, and the washing buffer inlet 331 and the washing buffer channel 332 supply the washing buffer to the culture chamber 11. is supplied to the washing chamber 21 located far from the

한편, 세척챔버층(20)은 세척챔버(21)에서 연장되는 연장부(211)에 검출영역(22)을 형성한다. 세척완충액채널(332)은 세척챔버(21)에서 연장부(211)의 경계선에 연결된다.Meanwhile, the washing chamber layer 20 forms the detection area 22 in the extension part 211 extending from the washing chamber 21 . The washing buffer channel 332 is connected to the boundary of the extension part 211 in the washing chamber 21 .

검출영역(22)은 연장부(211)의 상하측에서 세척챔버층(20)의 일부를 제거하므로 연장부(211)의 벽을 얇게 형성한다. 따라서 검출영역(22)에 출구광소스를 조사할 때, 연장부(211) 내의 물질에 따라 광노출 및 형광방출의 검출이 가능하게 된다. In the detection area 22, a portion of the washing chamber layer 20 is removed from the upper and lower sides of the extension part 211, so that the wall of the extension part 211 is made thin. Accordingly, when the detection region 22 is irradiated with the exit light source, light exposure and fluorescence emission can be detected according to the material in the extension 211 .

3차원 미세유체 시스템은 미세체널층(30) 상에 탑커버층(40)을 구비하고, 세척챔버층(20)과 미세채널층(30) 하에 바텀커버층(50)을 구비한다. 즉 3차원 미세유체 시스템은 바텀커버층(50), 배양챔버층(10)과 세척챔버층(20), 미세채널층(30) 및 탑커버층(40)을 순차적으로 적층하여 형성된다.The three-dimensional microfluidic system includes a top cover layer 40 on the microchannel layer 30, and a bottom cover layer 50 under the washing chamber layer 20 and the microchannel layer 30. That is, the three-dimensional microfluidic system is formed by sequentially stacking the bottom cover layer 50, the culture chamber layer 10, the washing chamber layer 20, the microchannel layer 30, and the top cover layer 40.

배양챔버층(10)은 중심에 결합구(13)를 구비한다. 따라서 가속기의 회전축(61)이 결합구(13)에 결합되며, 이를 위하여, 배양챔버층(10)의 하부 및 상부에 구비되는 바텀커버층(50), 미세채널층(30) 및 탑커버층(40)은 결합구(13)에 대응하는 관통구들(53, 33, 43)을 구비한다. 회전축(61)은 이 관통구들(53, 33, 43)을 관통하여 결합구(13)에 결합되어 3차원 미세유체 시스템을 가속 회전시킬 수 있다.The culture chamber layer 10 has a coupler 13 at its center. Therefore, the rotation shaft 61 of the accelerator is coupled to the coupler 13, and for this purpose, the bottom cover layer 50, the microchannel layer 30, and the top cover layer provided on the lower and upper portions of the culture chamber layer 10 (40) has through-holes (53, 33, 43) corresponding to the coupler (13). The rotating shaft 61 passes through the through-holes 53, 33, and 43 and is coupled to the coupler 13 to accelerate rotation of the 3D microfluidic system.

예를 들면, 일 실시예의 3차원 미세유체 시스템에 사용되는 시료(reagents)는 마이크로 비드에 포획항체를 부착시킨 비드-포획항체(이하 cAB-비드) 용액, VEGF-항원(antigen)(이하 VEGF) 및 형광체-검출항체(Fluorescence-detection antibody)(이하 dAB-형광체)의 3가지이다. 이 시료들의 혼합, 분리 및 유동을 위하여 세척완충액(wash buffer solution)이 세척챔버(21)로 주입되어 사용된다.For example, the reagents used in the 3D microfluidic system of one embodiment include a bead-capture antibody (hereinafter cAB-bead) solution in which capture antibody is attached to microbeads, a VEGF-antigen (hereinafter VEGF) and fluorescence-detection antibody (hereinafter referred to as dAB-fluor). For mixing, separation and flow of these samples, a wash buffer solution is injected into the washing chamber 21 and used.

cAB-비드는 마이크로 비드(microbead) 표면상에 VEGF-포획항체(capture antibody, cAB)를 부착시켜, 단위 부피당 포획항체(cAB)의 농도를 극대화시켰다. 따라서 부착 가능한 VEGF-항원(VEGF), 즉 VEGF의 양이 증가하게 된다.cAB-beads maximized the concentration of capture antibody (cAB) per unit volume by attaching VEGF-capture antibody (cAB) on the surface of microbeads. Therefore, the amount of attachable VEGF-antigen (VEGF), that is, VEGF is increased.

따라서 일 실시예의 3차원 미세유체 시스템은 종래의 ELISA에서 사용된 시료(reagents)의 양을 1/10 수준으로 줄였으며, 반응시간 또한 기존 6시간에서 1시간으로 단축시켰다. Therefore, the three-dimensional microfluidic system of one embodiment reduced the amount of reagents used in the conventional ELISA to 1/10 level, and also shortened the reaction time from 6 hours to 1 hour.

또한, 일 실시예의 3차원 미세유체 시스템은 VEGF뿐만 아니라, 체내에 미량 존재하는 생체조절단백질을 정량적으로 분석할 때, 빠르고 낮은 가격으로 분석할 수 있다.In addition, the 3D microfluidic system of one embodiment can quantitatively analyze not only VEGF, but also bioregulatory proteins present in a small amount in the body, quickly and at a low price.

이하에서는 일 실시예의 3차원 미세유체 시스템을 사용하는 항체 면역침강법(Enzyme-Linked Immunosorbent assay, ELISA) 및 생체조절단백질의 분석방법에 대하여 설명한다.Hereinafter, an antibody immunoprecipitation method (Enzyme-Linked Immunosorbent assay, ELISA) using a three-dimensional microfluidic system and a method for analyzing bioregulatory proteins will be described.

도 4는 혈관생성인자(VEGF) 검출을 위한 단순화 된 비드 기반 항원-항체 면역침강법(ELISA) 프로토콜의 회로도이다. 도 4를 참조하면, ELISA 프로토콜의 회로도는 시료를 준비하는 로딩단계(Reagents Preparation), 배양단계(Incubation), 세척단계(Washing), 및 검출단계(Detection)를 포함한다.Figure 4 is a schematic diagram of a simplified bead-based antigen-antibody immunoprecipitation (ELISA) protocol for angiogenic factor (VEGF) detection. Referring to FIG. 4, the circuit diagram of the ELISA protocol includes a loading step for preparing a sample (Reagents Preparation), an incubation step (Incubation), a washing step (Washing), and a detection step (Detection).

즉, 로딩단계(Reagents Preparation)를 거친 시료들은 배양단계(Incubation)에서 시료들간의 생물학적 분석이 수행된다. 결합되지 않은 dAb-형광체(dAB)는 cAB-비드의 침강을 통해서 세척단계(Washing)에서 제거된다. dAb-형광체(dAB)는 검출단계(Detection)에서 형광 신호로 측정된다.That is, samples that have gone through the loading step (Reagents Preparation) are subjected to biological analysis between samples in the incubation step. Unbound dAb-phosphor (dAB) is removed in the washing step through sedimentation of cAB-beads. dAb-fluorophore (dAB) is measured as a fluorescence signal in the detection step (Detection).

도 5, 도 6 및 도 7은 일 실시예의 3차원 미세유체 시스템에서 단면에 도시된 회로도이다. 도 5 내지 도 7을 참조하면, 3차원 미세유체 시스템의 회로도, 즉 일 실시예에 따른 생체조절단백질의 분석방법은 로딩단계(도 5), 배양단계(도 6), 세척단계(도 6의 마지막 도면) 및 검출단계(도 7)를 포함한다. 5, 6 and 7 are circuit diagrams shown in cross section in a 3D microfluidic system according to an embodiment. 5 to 7, the circuit diagram of the 3D microfluidic system, that is, the method for analyzing bioregulatory proteins according to an embodiment, includes a loading step (FIG. 5), a culturing step (FIG. 6), and a washing step (FIG. 6 last figure) and detection step (Fig. 7).

로딩단계(도 5)는 3차원 미세유체 시스템(도 5a 상태)을 사용하며, 세척완충액 주입구(331)와 세척완충액채널(332)을 통하여 세척완충액(wash buffer solution)을 세척챔버(21)에 주입하고(도 5b), 시료 주입구(311)와 시료채널(312)을 통하여 마이크로 비드에 포획항체를 부착시킨 비드-포획항체(이하 AB-비드) 용액을 배양챔버(11)에 주입하고(도 5c), VEGF-항원(이하 VEGF)과 형광체-검출항체(이하 dAB-형광체)의 용액을 배양챔버(11)에 주입한다. cAB-비드, VEGF 및 dAB-형광체 용액으로 이루어지는 시료를 배양챔버(11)에 주입한다(도 5b, 도 5c, 도 5d).The loading step (FIG. 5) uses a three-dimensional microfluidic system (FIG. 5A), and the wash buffer solution is supplied to the wash chamber 21 through the wash buffer inlet 331 and the wash buffer channel 332. (FIG. 5B), and a bead-capture antibody (hereinafter referred to as AB-bead) solution in which the capture antibody is attached to microbeads is injected into the culture chamber 11 through the sample inlet 311 and the sample channel 312 (FIG. 5B). 5c), a solution of a VEGF-antigen (hereinafter referred to as VEGF) and a phosphor-detection antibody (hereinafter referred to as dAB-phosphor) is injected into the culture chamber (11). A sample consisting of cAB-beads, VEGF, and dAB-phosphor solution is injected into the culture chamber 11 (FIGS. 5b, 5c, and 5d).

배양단계(도 6a, 도 6b)는 제1시간 동안 3차원 미세유체 시스템의 제1가속과 정지를 통해서 cAB-비드가 배양챔버(11)의 바닥 비탈면을 따라 세척챔버(21)에 승강하면서 항원-항체 결합반응이 이뤄지면서, VEGF, dAB-형광체 및 cAB-비드가 서로 결합한다.In the culturing step (FIGS. 6a and 6b), the cAB-beads ascend and descend along the bottom slope of the culture chamber 11 into the washing chamber 21 through the first acceleration and stop of the three-dimensional microfluidic system for the first hour. -As the antibody binding reaction takes place, VEGF, dAB-fluor and cAB-beads bind to each other.

일례로써, 260rpm으로 10초 동안 가속하여 cAB-비드가 상승하고(도 6a), 10초 동안 정지하여 cAB-비드가 하강한다(도 6b) 이를 1시간 동안 반복한다.As an example, the cAB-bead rises by accelerating at 260 rpm for 10 seconds (Fig. 6a), and the cAB-bead descends by stopping for 10 seconds (Fig. 6b), and this is repeated for 1 hour.

세척단계(도 6c)는 제1시간보다 짧은 제2시간 동안 제1보다 높은 제2가속 후, 세척완충액에서 결합되지 못한 반응물들 dAB-형광체가 배양챔버(11)에 남고 cAB-비드가 세척챔버(21)에 연장되는 검출영역(22)의 연장부(211)에 모아진다.In the washing step (FIG. 6c), after a second acceleration higher than the first for a second time shorter than the first time, reactants dAB-phosphors that were not bound in the washing buffer remain in the incubation chamber 11 and cAB-beads remain in the washing chamber 11. It is collected in the extension 211 of the detection area 22 extending to (21).

일례로써, 5000rpm으로 1분 동안 가속하여 연장부(211)에 cAB-비드를 모은다. 5000rpm으로 가속되면, 밀도가 1.2 g/cm3인 세척완충액에서 결합되지 못한 반응물들 dAB-형광체는 배양챔버(11)에 남는다. cAB-비드는 VEGF의 결합 여부에 상관없이 높은 밀도(1.3 g/cm3)로 인해 연장부(211)에 모이게 된다.As an example, accelerating at 5000 rpm for 1 minute collects the cAB-beads in the extension 211 . When accelerated to 5000 rpm, reactants dAB-phosphors that were not bound in the wash buffer having a density of 1.2 g/cm 3 remain in the incubation chamber 11 . The cAB-beads gather at the extension part 211 due to their high density (1.3 g/cm 3 ) regardless of whether VEGF is bound.

검출단계(도 7)는 연장부(211)에 응집된 cAB-비드에 광소스를 조사하여 VEGF와 dAB-형광체와 결합된 형광체의 농도에 비례하는 형광 특성 분석 결과(도 8 및 도 9 참조)를 얻는다.In the detection step (FIG. 7), the cAB-beads aggregated in the extension 211 are irradiated with a light source, and the fluorescence characteristics are analyzed in proportion to the concentrations of the phosphor combined with VEGF and dAB-phosphor (see FIGS. 8 and 9) get

일례로써, 연장부(211)에 응집된 cAB-비드는 VEGF와 결합된 dAB-형광체 농도에 비례하여 검출량을 얻을 수 있게 한다.As an example, cAB-beads aggregated in the extension part 211 enable a detection amount to be obtained in proportion to the concentration of dAB-phosphor combined with VEGF.

도 8은 혈관생성인자(VEGF) 농도가 각각 1mL 당 0g, 1ng 및 1μg인 검출영역에서 형광체가 결합된 비드의 명시야 및 형광 이미지이며, 도 9는 혈관생성인자(VEGF) 농도의 변화에 따른 형광 강도를 도시한 그래프이다. 도 8 및 도 9를 참조하면, 혈관생성인자(VEGF) 농도의 변화(1mL 당 0g, 1ng 및 1μg)에 따른 형광 강도를 얻을 수 있다.8 is a bright field and fluorescence image of fluorescent-coupled beads in the detection area where the concentration of angiogenic factor (VEGF) is 0g, 1ng, and 1μg per 1mL, respectively, and FIG. It is a graph showing fluorescence intensity. Referring to FIGS. 8 and 9 , fluorescence intensities according to changes in angiogenic factor (VEGF) concentration (0g, 1ng, and 1μg per 1mL) can be obtained.

즉, 혈관생성인자(VEGF) 농도가 0g/1mL일 때, 형광 강도가 0.22 형광면적비(Af/Ab), 혈관생성인자(VEGF) 농도가 1ng/1mL일 때, 형광 강도가 0.3 형광면적비(Af/Ab), 혈관생성인자(VEGF) 농도가 1μg/1mL일 때, 형광 강도가 0.78 형광면적비(Af/Ab)로 나타났다.That is, when the angiogenic factor (VEGF) concentration is 0 g / 1 mL, the fluorescence intensity is 0.22 fluorescence area ratio (Af / Ab), and when the angiogenic factor (VEGF) concentration is 1 ng / 1 mL, the fluorescence intensity is 0.3 fluorescence area ratio (Af /Ab), when the angiogenic factor (VEGF) concentration was 1μg/1mL, the fluorescence intensity was 0.78 fluorescence area ratio (Af/Ab).

도 10은 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 개략도이며(도 10a), 적색 형광, 녹색 형광 및 웰 플레이트의 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 병합된 이미지이다(도 10b, 도 10c 도 10d).FIG. 10 is a schematic diagram of VEGF bound to beads ( FIG. 10a ) and a merged image of red fluorescence, green fluorescence, and VEGF bound to beads in a well plate ( FIGS. 10b , 10c and 10d ).

도 11은 단순화 된 비드 기반 항원-항체 면역침강법(ELISA) 프로토콜에서 각각 100, 10 및 5μL 시료로 2시간 배양하는 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 형광 강도의 그래프이며(도 11a, 도 11b, 도 11c), 각 10μL 시료로 1시간 배양을 위한 비드상의 형광체가 결합된 VEGF의 형광 강도의 그래프이다.11 is a graph of fluorescence intensity of VEGF conjugated with a fluorophore to beads incubated for 2 hours with 100, 10, and 5 μL samples, respectively, in a simplified bead-based antigen-antibody immunoprecipitation (ELISA) protocol (FIG. 11a, FIG. 11b, 11c), a graph of the fluorescence intensity of VEGF bound to a phosphor on a bead for 1 hour incubation with each 10 μL sample.

도 11을 참조하면, 단순화 된 비드 기반 항원-항체 면역침강법(ELISA) 프로토콜에서 각 시료로 설정 시간 배양하는 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 형광 강도를 얻을 수 있음을 알 수 있다.Referring to FIG. 11 , it can be seen that in the simplified bead-based antigen-antibody immunoprecipitation (ELISA) protocol, the fluorescence intensity of VEGF bound to a fluorescent bead incubated with each sample for a set time can be obtained.

도 11a에서, 혈관생성인자(VEGF) 농도가 1mL 당 0g, 1ng 및 1μg인 100μL 시료로 2시간 배양하는 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 형광 강도가 40, 48, 49(a.u.)로 나타났다.In FIG. 11a, the fluorescence intensities of VEGF conjugated with the phosphors to the beads incubated for 2 hours with 100 μL samples having concentrations of 0 g, 1 ng, and 1 μg per 1 mL were 40, 48, and 49 (a.u.).

도 11b에서, 혈관생성인자(VEGF) 농도가 1mL 당 0g, 1ng 및 1μg인 10μL 시료로 2시간 배양하는 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 형광 강도가 26, 28, 36(a.u.)으로 나타났다.In FIG. 11B, the fluorescence intensities of VEGF conjugated to the beads incubated for 2 hours with 10 μL samples having concentrations of 0 g, 1 ng, and 1 μg per 1 mL of VEGF were 26, 28, and 36 (a.u.).

도 11d에서, 혈관생성인자(VEGF) 농도가 1mL 당 0g, 1ng 및 1μg인 5μL 시료로 2시간 배양하는 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 형광 강도가 27, 32, 35(a.u.)로 나타났다.In FIG. 11D, the fluorescence intensities of VEGF conjugated with phosphors to the beads incubated for 2 hours with 5 μL samples having concentrations of 0 g, 1 ng, and 1 μg per 1 mL were 27, 32, and 35 (a.u.).

도 11d에서, 혈관생성인자(VEGF) 농도가 1mL 당 0g, 1ng 및 1μg인 10μL 시료로 1시간 배양하는 비드에 형광체가 결합된 VEGF의 형광 강도가 18, 24, 28(a.u.)로 나타났다.In FIG. 11D, the fluorescence intensities of VEGF conjugated with the phosphors to the beads incubated for 1 hour with 10 μL samples having concentrations of 0 g, 1 ng, and 1 μg per 1 mL were 18, 24, and 28 (a.u.).

일 실시예는 기존의 ELISA 기법과 비교할 때, 배양단계에서 일괄적으로 시료를 주입하고 결합시킨다. 이때 결합하는 배양과정에서 VEGF의 농도에 따른 선형성이 변화되는지 확인할 필요가 있다. 이를 위하여, 도 10 및 도 11과 같이 시료의 체적과 반응시간에 따른 특성을 확인하였으며, 조건에 따른 편차는 있었으나, 선형성의 변함없음이 확인되었다.Compared to conventional ELISA techniques, in one embodiment, samples are injected and combined in batches in the culturing step. At this time, it is necessary to confirm whether the linearity changes according to the concentration of VEGF during the binding culture process. To this end, the characteristics according to the volume and reaction time of the sample were confirmed as shown in Figs.

마이크로 비드를 이용한 랩온어디스크(LOD) 플랫폼에서의 ELISA 기법은 상기 결과를 토대로 충분히 선형성을 확보하였으며, 배양단계를 극대화시키기 위해 마이크로 비드의 움직임을 3차원 미세유체 시스템의 회전 조절을 통하여 제어하였다. 이러한 과정을 통해서 짧은 시간에도 시료들간의 결합을 극대화시킬 수 있었으며, 형광 측정을 통해 이러한 결과를 얻을 수 있었다.The ELISA technique on the Lab-on-a-Disk (LOD) platform using microbeads secured sufficient linearity based on the above results, and the movement of the microbeads was controlled through rotation control of a three-dimensional microfluidic system to maximize the culture step. Through this process, it was possible to maximize the binding between the samples in a short time, and this result was obtained through fluorescence measurement.

ELISA 기법을 수행하기 위한 여러 장비들이 없이도, 일 실시예의 3차원 미세유체 시스템으로 VEGF 농도에 따른 형광 세기 분석 결과를 얻을 수 있었다. 결과적으로, VEGF 뿐만 아니라 생체조절단백질 검출을 위해 저비용으로 짧은 시간 동안의 분석이 임상에서도 사용 가능하다.Fluorescence intensity analysis results according to VEGF concentrations could be obtained with the three-dimensional microfluidic system of one embodiment without various equipment for performing the ELISA technique. As a result, low-cost and short-time analysis for detecting bioregulatory proteins as well as VEGF can be used clinically.

이상을 통해 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 청구범위와 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.Although the preferred embodiments of the present invention have been described above, the present invention is not limited thereto, and various modifications and implementations are possible within the scope of the claims and the detailed description of the invention and the accompanying drawings, and this is also the present invention. It is natural to fall within the scope of

10: 배양챔버층 11: 배양챔버
13: 결합구 20: 세척챔버층
21: 세척챔버 22: 검출영역
30: 미세채널층 33: 관통구
40: 탑커버층 43: 관통구
50: 바텀커버층 53: 관통구
211: 연장부 311: 시료 주입구
312: 시료채널 321: 에어밴트
322: 에어밴트채널 331: 세척완충액 주입구
332: 세척완충액채널10: culture chamber layer 11: culture chamber
13: coupler 20: washing chamber layer
21: washing chamber 22: detection area
30: microchannel layer 33: through hole
40: top cover layer 43: through hole
50: bottom cover layer 53: through hole
211: extension 311: sample inlet
312: sample channel 321: air vent
322: air vent channel 331: washing buffer inlet
332: washing buffer channel

Claims (7)

배양챔버를 구비하고 중심에 결합구를 구비하는 배양챔버층;
상기 배양챔버의 외측에 연결되는 세척챔버를 구비하여 상기 배양챔버층에 결합되는 세척챔버층;
상기 배양챔버와 상기 세척챔버에 연결되는 미세채널들을 구비하는 미세채널층; 및
상기 결합구에 결합되어 회전력을 전달하는 회전축
을 포함하며,
상기 미세채널층은
상기 배양챔버층과 상기 세척챔버층 상에 결합되고,
상기 배양챔버에 시료를 공급하는 시료 주입구와 시료채널,
상기 배양챔버의 에어를 배출하는 에어밴트와 에어밴트채널, 및
상기 세척챔버에 세척완충액을 주입하는 세척완충액 주입구와 세척완충액채널을 구비하는, 3차원 미세유체 시스템.A culture chamber layer having a culture chamber and having a coupler at the center;
a washing chamber layer having a washing chamber connected to the outside of the culture chamber and coupled to the culture chamber layer;
a microchannel layer having microchannels connected to the culturing chamber and the washing chamber; and
A rotational shaft coupled to the coupler and transmitting rotational force
Including,
The microchannel layer is
coupled on the culture chamber layer and the washing chamber layer;
A sample inlet and a sample channel for supplying a sample to the culture chamber;
An air vent and an air vent channel for discharging air from the culture chamber, and
A three-dimensional microfluidic system comprising a washing buffer injection port and a washing buffer channel for injecting a washing buffer into the washing chamber. 제1항에 있어서,
상기 배양챔버층은 3D 프린팅 기법으로 제작되고,
상기 세척챔버층은 레이저 커팅으로 제작되는, 3차원 미세유체 시스템.According to claim 1,
The culture chamber layer is manufactured by 3D printing technique,
The washing chamber layer is manufactured by laser cutting, a three-dimensional microfluidic system. 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 세척챔버층은
상기 세척챔버에서 연장되는 연장부에 검출영역을 형성하는, 3차원 미세유체 시스템.According to claim 1,
The washing chamber layer is
A three-dimensional microfluidic system forming a detection area on an extension extending from the washing chamber. 배양챔버를 구비하고 중심에 결합구를 구비하는 배양챔버층;
상기 배양챔버의 외측에 연결되는 세척챔버를 구비하여 상기 배양챔버층에 결합되는 세척챔버층;
상기 배양챔버와 상기 세척챔버에 연결되는 미세채널들을 구비하는 미세채널층; 및
상기 결합구에 결합되어 회전력을 전달하는 회전축
을 포함하며,
상기 미세채널층 상에 탑커버층을 구비하고,
상기 세척챔버층과 상기 미세채널층 하에 바텀커버층를 구비하는, 3차원 미세유체 시스템.A culture chamber layer having a culture chamber and having a coupler at the center;
a washing chamber layer having a washing chamber connected to the outside of the culture chamber and coupled to the culture chamber layer;
a microchannel layer having microchannels connected to the culturing chamber and the washing chamber; and
A rotational shaft coupled to the coupler and transmitting rotational force
Including,
A top cover layer is provided on the microchannel layer,
A three-dimensional microfluidic system comprising a bottom cover layer under the washing chamber layer and the microchannel layer. 배양챔버를 구비하고 중심에 결합구를 구비하는 배양챔버층;
상기 배양챔버의 외측에 연결되는 세척챔버를 구비하여 상기 배양챔버층에 결합되는 세척챔버층;
상기 배양챔버와 상기 세척챔버에 연결되는 미세채널들을 구비하는 미세채널층; 및
상기 결합구에 결합되어 회전력을 전달하는 회전축
을 포함하며,
상기 배양챔버와 상기 세척챔버는
디스크 상에서 중심부와 외곽부에 각각 구비되어 직경 방향으로 연결되며,
상기 배양챔버는
중심부가 낮고 외곽부가 높아지며,
상기 세척챔버는
상기 배양챔버의 가장 높은 외곽부에 동일한 높이로 형성되는, 3차원 미세유체 시스템.A culture chamber layer having a culture chamber and having a coupler at the center;
a washing chamber layer having a washing chamber connected to the outside of the culture chamber and coupled to the culture chamber layer;
a microchannel layer having microchannels connected to the culturing chamber and the washing chamber; and
A rotational shaft coupled to the coupler and transmitting rotational force
Including,
The culture chamber and the washing chamber
On the disk, the central part and the outer part are respectively provided and connected in the radial direction,
The culture chamber
The center is low and the periphery is high,
The cleaning chamber
A three-dimensional microfluidic system formed at the same height as the highest outer portion of the culture chamber. 3차원 미세유체 시스템을 사용하며, 세척완충액(wash buffer solution)을 세척챔버에 주입하고, 마이크로 비드에 포획항체를 부착시킨 비드-포획항체(cAB-비드) 용액, VEGF-항원(VEGF)과 형광체-검출항체(dAB-형광체)의 용액으로 이루어지는 시료를 배양챔버에 주입하는 로딩단계;
제1시간 동안 3차원 미세유체 시스템의 제1가속과 정지를 통해서 cAB-비드가 상기 배양챔버의 바닥 비탈면을 따라 승강하면서 항원-항체 결합반응이 이뤄지면서, VEGF, dAB-형광체 및 cAB-비드가 서로 결합하는 배양단계;
상기 제1시간보다 짧은 제2시간 동안 상기 제1보다 높은 제2가속 후, 세척완충액에서 결합되지 못한 반응물들 dAB-형광체가 상기 배양챔버에 남고 cAB-비드가 검출영역의 연장부에 모으는 세척단계; 및
상기 연장부에 응집된 cAB-비드에 광소스를 조사하여 VEGF와 dAB-형광체와 결합된 형광체의 농도에 비례하는 형광 특성을 얻는 검출단계
를 포함하는 생체조절단백질의 분석방법.

A three-dimensional microfluidic system is used, a wash buffer solution is injected into the wash chamber, and a bead-capture antibody (cAB-bead) solution, VEGF-antigen (VEGF) and phosphor are attached to the microbeads - A loading step of injecting a sample consisting of a solution of the detection antibody (dAB-fluor) into the culture chamber;
During the first hour, the cAB-beads rise and fall along the bottom slope of the culture chamber through the first acceleration and stop of the three-dimensional microfluidic system, and the antigen-antibody binding reaction takes place, while VEGF, dAB-phosphor and cAB-beads Cultivating step of combining with each other;
After a second acceleration higher than the first for a second time shorter than the first time, a washing step in which unbound reactants dAB-phosphors in the washing buffer remain in the incubation chamber and cAB-beads are collected in the extension of the detection area. ; and
A detection step in which the cAB-beads aggregated in the extension are irradiated with a light source to obtain fluorescence characteristics proportional to the concentrations of the phosphor combined with VEGF and dAB-phosphor.
A method for analyzing bioregulatory proteins comprising a.
KR1020210003152A 2021-01-11 2021-01-11 3 dimension microfluidic system and bio-controlled protein analytical method using of the same KR102507881B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210003152A KR102507881B1 (en) 2021-01-11 2021-01-11 3 dimension microfluidic system and bio-controlled protein analytical method using of the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210003152A KR102507881B1 (en) 2021-01-11 2021-01-11 3 dimension microfluidic system and bio-controlled protein analytical method using of the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220101289A KR20220101289A (en) 2022-07-19
KR102507881B1 true KR102507881B1 (en) 2023-03-07

Family

ID=82606991

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210003152A KR102507881B1 (en) 2021-01-11 2021-01-11 3 dimension microfluidic system and bio-controlled protein analytical method using of the same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102507881B1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190119618A1 (en) * 2016-03-30 2019-04-25 EMULATE, Inc. Devices, systems and methods for inhibiting invasion and metasases of cancer

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130126350A (en) * 2012-05-11 2013-11-20 한국과학기술원 Pcr pretreatment chip, pcr pretreatment method using the same, pcr apparatus and method using the same
WO2017069563A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 울산과학기술원 Dna purifying apparatus and dna purifying method

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190119618A1 (en) * 2016-03-30 2019-04-25 EMULATE, Inc. Devices, systems and methods for inhibiting invasion and metasases of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220101289A (en) 2022-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9164091B2 (en) Centrifugal micro-fluidic device and method for detecting analytes from liquid specimen
CN107121396B (en) Method for detecting an analyte
JP6878742B2 (en) Assay system
US10859571B2 (en) Method and a system for quantitative or qualitative determination of a target component
US8722419B2 (en) Flow cytometry methods and immunodiagnostics with mass sensitive readout
US20110124128A1 (en) Centrifugal Force Based Microfluidic System And Method For The Automated Analysis of Samples
US20220168735A1 (en) Point of Care Concentration Analyzer
JPH09504615A (en) Devices for use in analyte detection assays
JPH08507148A (en) Solid-phase chemical cascade immunoassay and affinity assay
US20140004539A1 (en) Systems and methods for multiplex solution assays
CN105823880A (en) Biochip for expanding detection range by utilizing hook effect and detection method thereof
CN103959064A (en) Methods for measuring amount of antigen in sample
CN205280728U (en) Serum mark detecting system
US8741218B2 (en) Automatic analyzer
CN205650213U (en) Myoglobin quantitative determination's magnetic particle chemiluminescence micro -fluidic chip
EP3120155B1 (en) Instrument and method for detection and quantification of biomarkers
KR102507881B1 (en) 3 dimension microfluidic system and bio-controlled protein analytical method using of the same
US11226331B2 (en) Controls for implementing multiplex analysis methods
JP4233382B2 (en) Immunoassay method, immunoassay device, and immunoassay reagent
EP3616779A1 (en) Specimen processing method, specimen processing apparatus, non-transitory computer-readable storage medium, and specimen processing cartridge
US20240077478A1 (en) System for rapid analysis of a capillary blood sample from a subject, intended for detecting the presence of at least one analyte in said capillary blood sample
CN113454462A (en) Solid-phase reaction chip and measurement method using the same
CN117825719A (en) Protein composition for diagnosis of eosinophilic granulomatous polyangiitis
CZ387199A3 (en) Analyte immuno-assay method

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant