KR102503293B1 - Biomarker composition for diagnosing susceptibility to hepatotoxicity and diagnosing method using thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 약물로 인해 유도되는 간독성에 대한 민감성을 진단하기 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 간독성 민감성 예측 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2)를 유효성분으로 함유하는 간독성 민감성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
시스플라틴과 같은 약물에 의해 간독성이 유발된 개체의 약물 투여 전 간 조직에서 Dact2의 발현 수준이 대조군에 비해 감소되어 있음을 확인함에 따라, 상기 Dact2를 시스플라틴 투여 전 간 조직에서 개체의 시스플라틴에 의한 간독성 민감성을 미리 예측하기 위한 간독성 민감성 진단용 바이오마커로 제공될 수 있고, 이를 이용하여 약물 투여로 인해 유도될 수 있는 간독성을 약물 투여 전에 미리 효과적으로 예측할 수 있다. The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing sensitivity to drug-induced hepatotoxicity and a method for predicting hepatotoxicity sensitivity using the same, and more particularly, to a biomarker composition containing Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2) as an active ingredient A biomarker composition for diagnosing hepatotoxicity sensitivity is provided.
As it was confirmed that the expression level of Dact2 in the liver tissue of an individual whose hepatotoxicity was induced by a drug such as cisplatin was reduced compared to the control group before drug administration, the sensitivity of the Dact2 to cisplatin-induced hepatotoxicity in the liver tissue before cisplatin administration It can be provided as a biomarker for diagnosing hepatotoxicity sensitivity for predicting in advance, and using this, hepatotoxicity that can be induced by drug administration can be effectively predicted in advance before drug administration.
Description
본 발명은 약물로 인해 유도되는 간독성에 대한 민감성을 진단하기 위한 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 간독성 민감성 예측 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing sensitivity to drug-induced hepatotoxicity and a method for predicting hepatotoxicity sensitivity using the same.
간독성, 또는 간세포 독성은 약물 투여 등으로 인해 간이 손상된 상태를 의미한다. 간은 체내로 들어온 약물을 안전한 물질로 변환시켜 이에 대한 독성을 제거하는 역할을 하지만, 이러한 물질들이 체내로 과량 유입될 경우에는 간 독성이 일어날 수도 있다. 또한, 약물 이외에도 실험용이나 산업용으로 쓰이는 화학물질, 천연물 유래의 화합물, 약용식물 유래의 추출물도 간독성을 유발할 수 있다.Hepatotoxicity or hepatotoxicity refers to a state in which the liver is damaged due to drug administration or the like. The liver converts drugs that have entered the body into safe substances to remove toxicity, but liver toxicity may occur when these substances are introduced into the body in excess. In addition to drugs, chemicals used for laboratory or industrial purposes, compounds derived from natural products, and extracts derived from medicinal plants may also cause hepatotoxicity.
약물로 인해 유도된 간독성, 즉, 약인성 간손상(DILI, drug-induced liver injury)은 급성 간독성의 주요 원인이라고 할 수 있다. 약인성 간손상은 정도가 아주 약한 간독성에서부터 급성간부전증(acute liver failure)까지를 모두 포함할 수 있으며, 크게 내인성 간독성 및 특이체질성 간독성 현상으로 분류된다. 내인성 간독성은 주로 직접적인 약물 반응, 약물의 대사물에 대한 반응 등을 통해 유도되는 현상을 말하며, 특이체질성 간독성은 약물의 농도에 따라 유도되는 현상을 말한다.Drug-induced hepatotoxicity, that is, drug-induced liver injury (DILI, drug-induced liver injury) can be said to be the main cause of acute hepatotoxicity. Drug-induced liver damage may include everything from very mild hepatotoxicity to acute liver failure, and is largely classified into endogenous hepatotoxicity and idiosyncratic hepatotoxicity. Endogenous hepatotoxicity refers to a phenomenon induced mainly through a direct drug reaction or a reaction to a metabolite of a drug, and idiosyncratic hepatotoxicity refers to a phenomenon induced depending on the concentration of a drug.
이러한 간독성을 유발시키는 물질로 사염화탄소(Carbon tetrachloride; CCl4), 알콜 및 갈락토사민(Galactosamine; GalN) 등이 대표적이며, 사염화탄소(CCl4)는 간에서 CYP2E1이라는 효소에 의해 자유 라디칼을 지닌 CCl3·와 산소와 반응한 CCl3OO·의 형태가 되며, 이 산물들은 산화적 스트레스를 유도하며 DNA의 손상을 야기한다. 또한, 간성상세포의 활성을 유도하는 VEGF, TGF-β1 신호전달물질에 의해 간섬유증이 유발될 수 있으며, NF-κB 신호전달로 시작해서 IFN-γ, TNF-α, IL-6와 같은 사이토카인을 발현해 세포자살이나, 염증반응을 유도한다.Carbon tetrachloride (CCl 4 ), alcohol, and galactosamine (GalN) are typical substances that cause hepatotoxicity . It reacts with · and oxygen to form CCl 3 OO·, and these products induce oxidative stress and cause DNA damage. In addition, hepatic fibrosis can be induced by VEGF and TGF-β1 signaling substances that induce hepatic stellate cell activity, and NF-κB signaling initiates cytotoxic activity such as IFN-γ, TNF-α, and IL-6. Cain is expressed to induce apoptosis or inflammatory response.
알콜은 간에 있는 효소인 ADH(alcohol dehydrogenase)에 의해 아세트알데하이드(acetaldehyde)로 분해되고 이때 NAD가 NADH로 환원되며, 높은 농도의 NADH는 지방산생산을 촉진하게 축적되어 지방간을 유래한다. 또한, 산화적 스트레스를 주어 IL-1, IL-6, IL-8등의 사이토카인을 분비해 염증 반응이나 세포사멸(apoptosis)을 일으킨다. 또한, 장에서 소화된 에탄올이 뿜는 내독소에 의해 간세포가 공격받으면 TNF-α같은 사이토카인을 분비해 간성상세포의 활성을 유도하고 간의 섬유화를 일으킨다.Alcohol is decomposed into acetaldehyde by ADH (alcohol dehydrogenase), an enzyme in the liver, and at this time, NAD is reduced to NADH, and high concentrations of NADH accumulate to promote fatty acid production, resulting in fatty liver. In addition, oxidative stress is applied to secrete cytokines such as IL-1, IL-6, and IL-8, causing inflammation or apoptosis. In addition, when hepatocytes are attacked by endotoxin released from ethanol digested in the intestine, they secrete cytokines such as TNF-α, induce the activity of hepatic stellate cells, and cause liver fibrosis.
갈락토사민(GalN)은 사이토크롬 p450과 같은 효소에 의해 산화되면 활성산소를 발생시킬 수 있는데, 이러한 산화적 스트레스를 받게 될 경우 IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 인자를 내보내 급성 간질환을 유발시킬 수 있으며, NF-κB, MAPK의 증가 또한 면역 반응으로 이어질 수 있어 PDCD4(programmed cell death 4) 단백질을 발현시키는 등 상기 두 가지 요인으로 인해 급성 간부전을 유발시킨다.Galactosamine (GalN) can generate reactive oxygen species when oxidized by enzymes such as cytochrome p450. When subjected to oxidative stress, factors such as IL-1β, IL-6, and TNF-α are released to produce acute It can cause liver disease, and an increase in NF-κB and MAPK can also lead to an immune response, resulting in acute liver failure due to the above two factors, such as the expression of programmed cell death 4 (PDCD4) protein.
한편, 새로운 간독성 약물로 보고된 시스플라틴(Cisplatin)은 주로 고환암, 방광암, 난소암, 전립선암 등의 치료에 사용되는 1 세대 항암제로써 암세포와 일반세포 모두에 독성을 나타내는 것으로 보고되었다. 이러한 시스플라틴은 간에서 CYP2E1에 의해 대사가 이루어지면서 나오는 슈퍼옥사이드(superoxide) 같은 산화적 스트레스로 인해 DNA를 손상시키고, 미토콘드리아의 전자전달효소 1번 및 4번을 방해하여 ATP 생성을 저해한다. 또한, 미토콘드리아 막 전위의 감소로 칼슘이온의 섭취를 감소시키며, 항산화 기능의 이상을 초래해 독성을 유발한다. On the other hand, Cisplatin, reported as a new hepatotoxic drug, is a first-generation anticancer drug mainly used for the treatment of testicular cancer, bladder cancer, ovarian cancer, prostate cancer, etc., and has been reported to be toxic to both cancer cells and normal cells. Cisplatin damages DNA due to oxidative stress such as superoxide produced during metabolism by CYP2E1 in the liver, and inhibits ATP production by interfering with mitochondrial electron transfer enzymes No. 1 and No. 4. In addition, the decrease in mitochondrial membrane potential reduces the intake of calcium ions, and causes toxicity by causing an abnormality in antioxidant function.
더불어, 시스플라틴은 직접적으로는 DNA의 intra, interstrand의 구아닌(Guanine)에 붙어서 전사를 방해하여 세포자살을 유도하므로, 시스플라틴 약물 복용 전 약물에 대한 민감성을 나타낼 수 있는지 미리 예측할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.In addition, since cisplatin induces apoptosis by directly attaching to Guanine of intra and interstrand DNA and interfering with transcription, research on how to predict whether sensitivity to drugs can be shown before taking cisplatin drugs is needed. need.
본 발명의 목적은 개체의 약물에 대한 간독성 민감도를 예측할 수 있는 바이오마커 조성물을 제공하며, 이를 이용하여 약물 투여로 인해 유도될 수 있는 간독성을 약물 투여 전에 미리 예측함으로써, 약물 투여에 따른 간독성을 사전에 예방하기 위한 방법을 제공하고자 한다.An object of the present invention is to provide a biomarker composition capable of predicting hepatotoxicity sensitivity to a drug in an individual, and by using the same, hepatotoxicity that may be induced by drug administration is predicted before drug administration, thereby preventing hepatotoxicity due to drug administration in advance. We want to provide a way to prevent it.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2)를 유효성분으로 함유하는 간독성 민감성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing hepatotoxicity sensitivity containing Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2) as an active ingredient.
본 발명은 Dact2의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간독성 민감성 진단용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for diagnosing hepatotoxicity sensitivity comprising, as an active ingredient, an agent capable of measuring the expression level of Dact2.
또한, 본 발명은 약물 투여 전 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 수집하는 단계; 상기 수집된 시료 내 Dact2의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 Dact2 발현 수준을 대조군과 비교하여 감소 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 간독성 민감성 예측 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of collecting a biological sample separated from the subject before drug administration; Checking the expression level of Dact2 in the collected samples; and comparing the Dact2 expression level with a control group to determine the level of reduction.
본 발명에 따르면, 시스플라틴과 같은 약물에 의해 간독성이 유발된 개체의 약물 투여 전 간 조직에서 Dact2의 발현 수준이 대조군에 비해 감소되어 있음을 확인함에 따라, 상기 Dact2를 시스플라틴 투여 전 간 조직으로부터 개체의 시스플라틴에 의한 간독성 민감성을 미리 예측하기 위한 간독성 민감성 진단용 바이오마커로 제공될 수 있다.According to the present invention, as it was confirmed that the expression level of Dact2 in the liver tissue of an individual whose hepatotoxicity was induced by a drug such as cisplatin was reduced compared to the control group before drug administration, the Dact2 was extracted from the liver tissue before cisplatin administration to the individual. It can be provided as a biomarker for diagnosing hepatotoxicity sensitivity to predict hepatotoxicity sensitivity by cisplatin in advance.
상기 바이오마커 조성물을 사용하여, 약물 투여로 인해 유도될 수 있는 간독성을 약물 투여 전에 미리 효과적으로 예측할 수 있다. By using the biomarker composition, hepatotoxicity that may be induced by drug administration can be effectively predicted before drug administration.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 민감군(susceptible group) 및 둔감군(resistant group)의 약물 투여 전 간 조직 내 Dact2 mRNA 발현량을 비교한 결과이다.1 is a comparison result of Dact2 mRNA expression level in liver tissue before drug administration in a susceptible group and a resistant group according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 발명자들은 개체마다 선천적으로 발현차이를 나타내는 간 조직의 유전자 중 약물에 의해 유발되는 간독성의 민감도와 관련이 높은 유전자가 있을 것으로 예상하고, 시스플라틴 투여 후 간독성이 나타난 실험동물과 시스플라틴 투여 후에도 간독성이 둔감하게 나타난 실험동물의 약물 투여 전 간 조직에서 유전자 발현 패턴을 확인한 결과, 간독성이 나타난 개체의 시스플라틴 투여 전 간 조직에서 Dact2의 발현 수준이 간독성이 둔감하게 나타난 개체의 발현 수준보다 낮은 것을 확인함에 따라, 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention predicted that there would be a gene that is related to the sensitivity of drug-induced hepatotoxicity among the genes in liver tissue that show congenital differences in expression for each individual, and experimental animals exhibiting hepatotoxicity after cisplatin administration and hepatotoxicity even after cisplatin administration As a result of confirming the gene expression pattern in the liver tissue of the insensitive experimental animal before drug administration, it was confirmed that the expression level of Dact2 in the liver tissue of the individual with liver toxicity before cisplatin administration was lower than that of the individual with insensitive liver toxicity. Accordingly, the present invention was completed.
본 발명은 Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2)를 유효성분으로 함유하는 간독성 민감성 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention provides a biomarker composition for diagnosing liver toxicity sensitivity containing Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2) as an active ingredient.
본 명세서에서, "Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2; NM_001107464)"는 염색체 6q27에 존재하며 DACT gene family에 속한다. 베타-카테닌(beta-catenin) 단백질에 직접적으로 붙어 핵으로 이동하는 것을 막아 윈트/베타-카테닌(Wnt/beta-catenin) 신호전달을 방해하는 것으로 알려져 있으며, Dishellved 라는 단백질을 분해(degradation)하여 beta-catenin 파괴 복합체의 형성을 좀 더 자유롭게 함으로써 Wnt/beta-catenin 신호전달을 방해한다. 또한, 대장암, 유방암, 간암 등의 환자 암세포주에서는 Dact2 유전자 부위가 메틸화(methylation)되어 발현이 잘되지 않아 Wnt/beta-catenin 신호전달을 증가시켜 암의 성장을 촉진시키므로, Dact2가 암의 진행을 억제하는 유전자로 알려져 있지만, 간독성 민감성 진단에 대해서는 보고된 바 없다.In the present specification, "Dact2 (dishevelled binding antagonist of beta catenin 2; NM_001107464)" exists on chromosome 6q27 and belongs to the DACT gene family. It is known to interfere with Wnt/beta-catenin signal transduction by directly attaching to beta-catenin protein and preventing it from moving to the nucleus. - Interfere with Wnt/beta-catenin signaling by freeing up the formation of catenin-destroying complexes. In addition, in patient cancer cell lines such as colorectal cancer, breast cancer, and liver cancer, Dact2 gene region is methylated and expression is not well expressed, and Wnt/beta-catenin signaling is increased to promote cancer growth, so Dact2 promotes cancer progression Although it is known as a gene that suppresses hepatotoxicity, there has been no report on the diagnosis of hepatotoxicity sensitivity.
상기 Dact2는 약물 투여 전, 간 조직에서 그 발현 주준을 확인하는 것일 수 있다.The expression level of Dact2 in liver tissue may be confirmed before drug administration.
상기 간독성은 약물에 의해 유도되는 것일 수 있고, 바람직하게는 시스플라틴(cisplatin)에 의해 유도되는 것일 수 있다.The hepatotoxicity may be induced by a drug, preferably by cisplatin.
본 명세서에서, "바이오마커"란, 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표로서, 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 이의 변화 여부 등을 확인할 수 있는 물질로, 폴리펩타이드, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함할 수 있고, 이를 이용하여 본 발명과 같이 약물에 의한 간독성 민감성 여부를 진단할 수 있다.In the present specification, a "biomarker" is an index that can detect changes in the body, and is a substance that can determine the normal or pathological state of a living organism, whether or not there is a change thereof, such as a polypeptide, nucleic acid, lipid, glycolipid, glycoprotein , sugars (monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide, etc.), etc., and the like, and using this, as in the present invention, it is possible to diagnose whether or not hepatotoxicity is sensitive to drugs.
본 발명은 Dact2의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간독성 민감성 진단용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for diagnosing hepatotoxicity sensitivity comprising, as an active ingredient, an agent capable of measuring the expression level of Dact2.
상기 Dact2의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 Dact2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 Dact2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The agent capable of measuring the expression level of the Dact2 may be a primer or probe specifically binding to the Dact2 gene, an antibody, a peptide, an aptamer or a compound binding specifically to the Dact2 protein, but is not limited thereto no.
본 명세서에서, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 시점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA polymerase 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트(nucleotide triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. As used herein, a "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxl group, capable of forming base pairs with a complementary template and serving as a starting point for template strand copying. Refers to a short nucleic acid sequence. The primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleotide triphosphates in an appropriate buffer and temperature.
상기 프라이머는 상기 유전자에 특이적인 프라이머로, 통상적으로 7 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산일 수 있고, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 한, 추가의 특징을 혼입할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.The primer is a primer specific to the gene, and may be a sense and antisense nucleic acid having a sequence of usually 7 to 50 nucleotides, as long as the basic properties of the primer serving as the starting point of DNA synthesis are not changed. can be mixed. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be appropriately selected according to techniques known in the art.
본 명세서에서, "프로브(probe)"는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 되어있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 형성될 수 있다. 적절한 프로브 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.In the present specification, "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few bases to several hundred bases in length, which can specifically bind to mRNA, and is labeled with a specific mRNA. The presence or absence of and the expression level can be confirmed. The probe may be formed in the form of an oligonucleotide probe, a single strand DNA probe, a double strand DNA probe, an RNA probe, or the like. Appropriate probes and hybridization conditions can be appropriately selected according to techniques known in the art.
본 명세서에서, "항체(antibody)"는 당해 기술 분야에 공지된 용어로서, 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함될 수 있다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함될 수 있다.As used herein, "antibody" is a term known in the art and refers to a specific immunoglobulin directed against an antigenic site. The antibody in the present invention refers to an antibody that specifically binds to the protein, and the antibody can be prepared according to a conventional method in the art. The type of antibody includes polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, and all immunoglobulin antibodies may be included. The antibody is meant in its complete form with two full-length light chains and two full-length heavy chains. In addition, the antibody may also include a special antibody such as a humanized antibody.
본 명세서에서 "펩타이드(peptide)"는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있고, 열/화학 처리 시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물 전달 물질로 이용될 수 있다.In the present specification, "peptide" has the advantage of high binding force to a target substance, and does not undergo denaturation even during heat/chemical treatment. In addition, because of its small molecular size, it can be attached to other proteins and used as a fusion protein. Specifically, since it can be used by attaching it to a polymer protein chain, it can be used as a diagnostic kit and drug delivery material.
본 명세서에서 "앱타머(aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산 (DNA, RNA, 또는 변형 핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있어, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.In this specification, "aptamer" is a special kind of single-stranded nucleic acid (DNA, RNA, or modified nucleic acid) that has a stable tertiary structure and can bind to a target molecule with high affinity and specificity. It means a type of polynucleotide composed of. As described above, aptamers can specifically bind to antigenic substances in the same way as antibodies, but are composed of polynucleotides that are more stable than proteins, have a simple structure, and are easy to synthesize, so they can be used as replacements for antibodies. can
상기 키트는 프라이머 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 키트는 간독성 민감성 진단을 위한, 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치를 더 포함할 수 있다. The kit may be a primer kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit, but is not limited thereto. The kit may further include an antibody that optionally recognizes a marker for diagnosis of hepatotoxicity sensitivity, as well as one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for an assay method.
바람직하게는, 약물 투여 전 개체의 간 조직에서 발현 수준 변화가 나타난 Dact2 유전자 서열의 전부, 이의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 시스플라틴으로 인해 유도되는 간독성 예측용 마이크로어레이 칩이 제공될 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩은 약물 투여 전 간 조직에서 Dact2 유전자의 발현을 비교함으로써, 시스플라틴 투여로 인해 유도될 수 있는 간독성을 보다 유의 있고 정확하게 비교분석할 수 있다.Preferably, a microarray chip for predicting hepatotoxicity induced by cisplatin, in which oligonucleotides including all or part of the Dact2 gene sequence showing a change in expression level in the liver tissue of an individual before drug administration or oligonucleotides or complementary strand molecules thereof are integrated this can be provided. The microarray chip compares the expression of the Dact2 gene in liver tissue before drug administration, so that hepatotoxicity that can be induced by cisplatin administration can be compared and analyzed more significantly and accurately.
본 발명은 약물 투여 전 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 수집하는 단계; 상기 수집된 시료 내 Dact2의 발현 수준을 확인하는 단계; 및 상기 Dact2 발현 수준을 대조군과 비교하여 감소 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 간독성 민감성 예측 방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of collecting a biological sample separated from the subject before drug administration; Checking the expression level of Dact2 in the collected sample; and comparing the Dact2 expression level with a control group to determine the level of reduction.
상기 개체는 간독성이 발생할 수 있는 동물이라면 그 종류를 한정하지 않으나, 구체적으로 포유동물일 수 있고, 예를 들어 인간(Homo sapiens)일 수 있다.The subject is not limited to the type as long as it is an animal that can cause hepatotoxicity, but may specifically be a mammal, for example, a human (Homo sapiens).
상기 생물학적 시료는 약물 투여 전 개체 또는 대조군으로부터 분리된 것으로, 상기 단백질 또는 이의 유전자의 발현수준이 정상 대조군과 차이나는 뇨, 혈액, 세포 및 조직으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 간 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The biological sample is isolated from a subject or control group before drug administration, and may be selected from the group consisting of urine, blood, cells, and tissues in which the expression level of the protein or its gene is different from that of the normal control group, and more preferably liver It may be an organization, but is not limited thereto.
상기 유전자의 발현수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The expression level of the gene is next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase It may be measured through one or more methods selected from the group consisting of RNase protection assay (RPA), microarray, and northern blotting, but is not limited thereto.
또한, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준은 웨스턴 블랏(western blot), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역분석(radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(complement fixation assay) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the expression or activity level of the protein can be measured by western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, or okteroney. (Ouchterlony) At least one method selected from the group consisting of immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, and flow cytometry (FACS) It can be measured through, but is not limited thereto.
상기 Dact2 발현 수준이 대조군의 발현 수준보다 낮을 경우, 약물에 의한 간독성 민감도가 높은 것으로 예측할 수 있다.When the Dact2 expression level is lower than that of the control group, it can be predicted that hepatotoxicity sensitivity by the drug is high.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples will be described in detail to aid understanding of the present invention. However, the following examples are merely illustrative of the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.
<실시예 1> 간독성 민감도 예측을 위한 바이오마커 확인<Example 1> Identification of biomarkers for predicting hepatotoxicity sensitivity
SD rats (6주령, 수컷) 38마리를 시스플라틴(cisplatin) 투여 전 RNA를 추출하기 위해 마취한 뒤, 간의 한 엽을 선택해 조직을 소량 미리 채취해 동결 보존해 놓았다. 3주간의 회복기간을 가진 후, 시스플라틴 25mg/kg 농도로 생리식염수에 녹여서 복강 투여하였다. Thirty-eight SD rats (6-week-old, male) were anesthetized to extract RNA before cisplatin administration, and a small amount of tissue was pre-collected from a lobe of the liver and stored frozen. After a 3-week recovery period, cisplatin at a concentration of 25 mg/kg was dissolved in physiological saline and intraperitoneally administered.
투여 48시간 후에 부검하여 혈청분석 (ALT, AST, γ-GT)을 토대로 38마리 중 가장 간독성이 심한 민감군(susceptible group) 5마리와 간독성이 가장 약한 둔감군(resistant group) 5마리로 그룹화(grouping)하였다. 그 후 민감군과 둔감군의 미리 채취해둔 간 조직에서 RNA를 뽑고 RNA seq (Illumina Novaseq6000)를 수행하여 두 군간 본래의 유전자 발현 패턴을 비교 분석하였다 (Fold change 1.5 이상, p value 0.05 이하). Based on serological analysis (ALT, AST, γ-GT) after 48 hours of administration, 5 dogs with the most severe liver toxicity (susceptible group) and 5 animals with the least hepatotoxicity (resistant group) were grouped into 5 animals among 38 animals ( grouping). Thereafter, RNA was extracted from the liver tissue collected in advance from the sensitive and insensitive groups, and RNA seq (Illumina Novaseq6000) was performed to compare and analyze the original gene expression patterns between the two groups (fold change 1.5 or more, p value 0.05 or less).
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 둔감군(resistant group)에서 약물 투여 전 간 Dact2 mRNA의 발현량이 민감군(susceptible group)의 발현량에 비해 2.12배 높은 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 1, it was confirmed that the expression level of liver Dact2 mRNA in the resistant group before drug administration was 2.12 times higher than that in the susceptible group.
이 결과를 바탕으로 간에서 Dact2의 발현이 선천적으로 낮을 경우, 과량의 시스플라틴에 노출되면 간독성에 민감할 수 있는 것으로 판단할 수 있다.Based on this result, it can be judged that if the expression of Dact2 in the liver is congenitally low, exposure to excessive cisplatin can cause hepatotoxicity.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.Having described specific parts of the present invention in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. do. That is, the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (9)
상기 Dact2는,
약물 투여 전, 간 조직에서 발현 주준을 확인하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.According to claim 1,
The Dact2,
Prior to drug administration, a biomarker composition characterized by confirming the level of expression in liver tissue.
상기 Dact2의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는,
상기 Dact2 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 Dact2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.According to claim 5,
The agent capable of measuring the expression level of the Dact2 is,
A diagnostic kit comprising a primer or probe that specifically binds to the Dact2 gene, an antibody, peptide, aptamer, or compound that specifically binds to the Dact2 protein.
상기 수집된 시료 내 Dact2의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
상기 Dact2 발현 수준을 대조군과 비교하여 감소 수준을 확인하는 단계;를 포함하는 시스플라틴(cisplatin)에 의해 유발되는 간독성 민감성 예측 방법.Collecting a biological sample separated from the subject before drug administration;
Checking the expression level of Dact2 in the collected sample; and
A method for predicting sensitivity to hepatotoxicity induced by cisplatin, comprising: comparing the Dact2 expression level with a control group to determine the level of reduction.
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| Biomolecules & Therapeutics (2017) 25(2):112-121* |
| Chemical Research in Toxicology (2006) 19:1270-1283* |
| Free Radical Biology and Medicine (2020) 148:128-139 |
| Hepatology (2006) 43(3):618-631 |
| Hepatology (2013) 58:1953-1963* |
| HWANG 등, "A pre-dose biomarker Ccrn4l for predicting the susceptibility of cisplatin-induced hepatotoxictiy", 한국실험동물학회 학술발표대회 논문집, PS-B-023 (2020.7) |
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