KR102502749B1 - 간 전달 엔테카비어 프로드러그 뉴클레오티드 시클로 포스페이트 화합물 및 응용 - Google Patents

간 전달 엔테카비어 프로드러그 뉴클레오티드 시클로 포스페이트 화합물 및 응용 Download PDF

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Abstract

간 특이 적 전달 기술 (간 전달) (Liver Specific Delivery, LSD)에 기초한 엔테카비어 항 바이러스 프로드러그 뉴클레오티드시클로포스페이트 화합물 및 그의 적용이 개시되어있다. 구체적으로, 화학식 (I)의 화합물 및 이의 이성질체, 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물 및 대응되는 약학적 조성물이 개시된다. 또한, 본 발명의 화합물을 단독으로 또는 항 바이러스 약물, 특히 B형 간염 바이러스 (HBV)의 사용에서 다른 항 바이러스 약물과 함께 사용하는 것이 개시되어있다.
Figure 112020075469120-pct00054

Description

간 전달 엔테카비어 프로드러그 뉴클레오티드 시클로 포스페이트 화합물 및 응용
본 발명은 간 특이적 전달 기술 (간 전달) (Liver Specific Delivery (LSD))에 기반한 항 바이러스 프로드러그인 뉴클레오티드 시클로 포스페이트 화합물의 제조 및 응용, 또는 그 광학 이성질체, 수화물, 용매화물, 약학적으로 허용되는 염 및 약학 조성물에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV), D형 간염 바이러스(HDV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 등의 바이러스는 인류의 건강을 심각하게 위협하고 있다. B형 간염 바이러스로 예를 들면, B형 바이러스성 간염 (B형 간염)은 B형 간염 바이러스에 의해 발생하고, 간염증성 병변을 주요로 하며, 여러 장기 손상을 초래 할 수 있다. 세계보건기구(WTO)의 조사 결과에 따라, 전 세계적으로 만성 B형 간염 감염자가 약 2.4억 명이고, 해마다 약 78만명이 B형 간염 감염으로 사망하며, 그 중 65만 명이 만성 B형 간염에 의한 간경변과 간암으로 사망하고 13만명이 급성 B형 간염 감염으로 사망하는 것으로 추산된다. 이는 전 세계에 건강에 관한 중요한 문제로 되고있다.
항 B형 간염 바이러스 약물 중 가장 주요한 것은, 예를 들면, 아데포비어디피복실, 테노포비르(TDF)，테노포비르알라페나미드(TAF), 엔테카비어, 라미부딘, 텔비부딘 등의 뉴클레오티드류 약물이며, 그 작용 기전은 세포에서 트리포스페이트 대사생성물을 활성화시키고 바이러스의 DNA 중합 효소의 활성을 억제하며 바이러스 DNA의 합성을 방지하여 바이러스 복제를 억제하는 것이다.
항 B형 간염 바이러스에 대한 뉴클레오티드 화합물은 모노포스페이트가 있는 뉴클레오티드 유사체 및 모노포스페이트가 없는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 아데포비르 및 테노포비르와 같은 뉴클레오티드 유사체는 일반적으로 체내 모노포스페이트 생성물로 직접 대사 될 있는 아데포비어디피복실 및 테노포비르와 같은 포스페이트에스테르의 형태로 제조된다. 엔테카비어 등의 뉴클레오티드 유사체는 뉴클레오티드 유사체로서 직접 제조되며, 이는 한 단계의 인산화를 거쳐 체내에서 모노포스페이트 대사 생성물로 전환되어야 하며, 인산화 과정은 최종 활성 형태의 트리포스페이트 대사 생성물로의 전환에 대한 속도 제한 단계이며, 이는 간에서 유효 활성 성분이 낮아지게 한다. 현재 엔테카비어 모노포스페이트 에스테르 프로드러그가 아직 개발, 출시되고 있지 않다.
엔테카비어는 체외에서 항 바이러스 활성이 매우 강하고 (EC50=0.004μM) 기존의 뉴클레오티드류 약물 중에서도 활성이 가장 강한 화합물이며, 라미부딘에 내성을 가진 바이러스 주에 대해서도 매우 강한 저해 활성 (EC50=0.010-0.059μM)을 갖는다. 엔테카비어는 HBV 중합 효소 (Polymerase)의 세 종류의 활성을 모두 억제 할 수있다: 1) HBV 중합 효소의 개시과 시작, 2) 프리게놈 RNA의 rcDNA (이완된 고리형의 이중 가닥 DNA)의 음성 가닥 역전사 합성; 3) rcDNA 양성 가닥의 합성. 또한 엔테카비어의 내성 발생률이 매우 낮아 6년간 내성률이 1.2%이다. 이는 출시된 뉴클레오티드류 약물에서 엔테카비어는 항 바이러스 활성이 강하고, 내 약품성 장벽이 높다는 장점이 있는 것으로 나타났다.
그러나 임상적으로, 엔테카비어는 두통, 피로, 현기증, 메스꺼움 등의 부작용이 있는 것이 발견되어 이러한 부작용은 임상적인 사용을 제한하였다. 예를 들어, 바라크루드 (엔테카비어의 상품명) 1mg 규격은 라미부딘에 내성을 가진 환자에게만 권장하고 내성을 갖지 않는 환자에게 권장 사용량은 0.5mg이다.
본 발명은 간 특이적 전달 기술을 이용하고, 키나제 인산화 단계를 우회하여, 간에서 활성 성분의 농도를 성공적으로 증가시킨다.
고리형 포스페이트 에스테르에 의해 변형이 된 엔테카비어 프로드러그는 간에서 CYP3A 효소에 의해 대사되며 포스포 키나 없이 모노포스페이트 화합물을 생성한다. 구체적으로, 고리형 포스페이트 에스테르(4-아릴-2-옥소-1,3,2-디옥사포스포란) 전구체 구조는 우수한 간 특이적 전달 기능을 가지고 메커니즘이 매우 분명하며, 4-아릴 치환 위치는 간세포에서 시토크롬 P450 동위 효소 패밀리 중 CYP3A에 의해 특이적으로 촉매 되고 하이드록실기를 생성 한 다음, 개환되어 음전하 포스페이트 중간체를 생성하고, 해당 물질은 세포막을 통해 세포에 쉽게 존재하지 않는다. 포스포디에스테라제의 촉매 하에서, 가수 분해 후, 뉴클레오티드 모노포스페이트 유사체를 생성하기 위한 β-제거 반응, 뉴클레오티드키나제의 작용하에 생물학적 활성을 갖는 뉴클레오티드트리포스페이트 유사체를 계속 생성하는 동시에, 대사 부산물 아릴 비닐 케톤은 간 세포에서 항산화제 및 자유라디칼이 풍부한 글루타티온과 1,4-부가 반응을 생성 하여 제거 될 수 있으며, 아직까지 상기 부가 생성물은 부작용이 없는 것으로 보고되었다.
현재 임상적으로 응용할 수 있는 활성이 높고, 간 전달 특이성이 강하며 독성과 부작용이 낮은 엔테카비어 모노포스페이트 프로드러그가 아직 발견되지 않았다. 따라서 본 분야에서는 활성이 높고, 간 전달 특이성이 강하며 독성과 부작용이 낮은 등의 이점을 갖는 신규한 엔테카비어 프로드러그의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 항 바이러스 엔테카비어 모노포스페이트의 시클로 포스페이트 에스테르를 합성하고 그 방향족 치환기에 대해 더욱 개선하여 일련의 간 전달 작용을 갖는 프로드러그를 얻고 그 치료 효과가 더 높고, 독성과 부작용이 작아지도록 하였다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 화학식 I로 표시되는 화합물 또는 그 광학 이성질체, 약제 학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물을 제공한다.
Figure 112020075469120-pct00001
여기서,
R1은 각각 독립적으로 할로겐, 니트로기, 히드록시기, 아미노기, 시아노기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬아민기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 카르복실기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 에스테르기, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알카노일기, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알킬아미노기에서 선택되고, 여기서, 상기의 치환은 할로겐기, C1-C3 알킬기, C1-C3 할로겐알킬기, 니트로기, 히드록시기, 아미노기, 시아노기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기를 갖는 것을 말하고,
R2,R3은 각각 독립적으로 할로겐기(F 또는 C1)이며,
ｍ은 0, 1, 2 또는 3이다.
R4은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 에스테르기, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알킬아미노기에서 선택되고, 여기서, 상기의 치환은 할로겐기, C1-C3 알킬기, C1-C3 할로겐알킬기, 니트로기, 히드록시기, 아미노기, 시아노기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기를 갖는 것을 말하고,
한편, 화학식 I 중, 기존 카이랄성 이외에, 기타 각 카이랄성 중심은 각각 R형 또는 S형이며,
다른 일 바람직한 예에서, R2는 Cl이고, R3는 F이며; 또는 R2는 Cl이고 R3는 Cl이며, 또는 R2는 F이고 R3는 Cl이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 광학 이성질체는 호변이성질체, 시스 트랜스 이성질체, 형태이성질체, 메조 화합물 및 거울상 이성질체 또는 부분 입체 이성질체 관계를 갖는 광학 이성질체를 포함한다.
다른 일 바람직한예에서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
Figure 112020075469120-pct00002
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화학식 I로 표시되는 화합물의 염은 화학식 I로 표시되는 화합물과 무기산 또는 유기산에 의해 형성된 약학적으로 허용 가능한 염이거나, 또는 화학식 I로 표시되는 화합물의 염은 화학식 I로 표시되는 화합물과 알칼리 반응에 의해 형성된 약학적으로 허용되는 염 일수 있다. 화학식 I 또는 그의 염으로 표시되는 화합물은 비정질 물질 또는 결정 일수 있다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, 의약 조성물을 제공하고, 상기 약학 조성물은 치료 유효량의 본 발명의 제1 측면에 기재된 화합물 또는 그 광학 이성질체, 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물 및 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체를 포함한다.
본 발명의 제3 측면에 따르면, 본 발명의 제1 측면에 기재된 화합물 또는 그 광학 이성질체, 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물의 용도를 제공하며, 이는 B형 간염 바이러스(HBV) 감염과 관련된 급성 또는 만성 질환을 치료 및/또는 예방하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 제4 측면에 따르면, 본 발명의 제1 측면에 기재된 화학식 I로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다.
Figure 112020075469120-pct00003
(i-a) 불활성 용매에서 화학식 II로 표시되는 화합물과 산, 염화아실, 할로알킬기와 반응하여 화학식 I로 표시되는 화합물을 형성하며, 화학식중, 각 기의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단계 (i-a)에서, 상기 시약은 디시클로헥실카르 보디이미드(DCC), 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는, DCC 및 트리에틸아민이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단계 (i-a) 중 상기 불활성 용매는 N,N-디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 N,N-디메틸포름아미드 및 디클로로메탄 용매이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단계 (i-a)의 반응 온도는 -0-100℃ (바람직하게는 25±5℃ 정도)이다.
다른 일 바람직한예에서, 상기 단계 (i-a)의 탈보호반응의 반응 시간은 0.5-24시간이며, 보다 바람직하게는 0.5-8시간이다.
Figure 112020075469120-pct00004
(i-b) 불활성 용매에서 화학식 IIa로 표시되는 화합물로 TBS를 제거하고 화학식 II로 표시되는 화합물을 형성한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단계 (i-b) 중 상기 TBS를 제거하는 시약은 TBAF, 빙초산, 희염산 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 염산 에탄올 용액 및 TBAF이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단계 (i-b) 중 상기 불활성 용매는 N,N-디메틸포름아미드, 테트라하이드로퓨란 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 테트라하이드로퓨란 용매이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단계 (i-b) 반응 온도는 -50-30℃ (바람직하게는 25±5℃ 정도)이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단계 (i-b)의 탈 보호 반응의 반응 시간은 0.5-6시간이며, 보다 바람직하게는 0.5-3시간이며, 더 바람직하게는 0.5-2시간이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화학식 IIa로 표시되는 화합물은 하기의 방법에 의해 제조된다.
Figure 112020075469120-pct00005
(i-c) 불활성 용매에서 화학식 Ic로 표시되는 화합물을 PA3001-3과 치환 되어 화학식 IIa로 표시되는 화합물을 얻는다,
다른 일 바람직한 예에서, 단계 (i-c)에서 상기 반응은 그리냐르시약의 존재하에서 진행되고, 보다 바람직하게는 상기의 그리냐르시약은 tert-부틸마그네슘클로라이드 (t-BuMgCl)로 이루어진 군에서 선택된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단계 (i-c)의 치환 반응은 -50-30℃에서 (바람직하게는 25±5℃ 정도)진행된다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단계 (i-c)의 치환 반응의 반응시간은 1-72시간이며, 보다 바람직하게는 3-48시간이며, 더 바람직하게는 6-24시간이다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 단계 (i-c)의 불활성 용매는 N,N-디메틸포름아미드, 테트라하이드로퓨란 또는 그 조합으로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 테트라하이드로퓨란 용매이다.
본 발명의 범위 내에서 본 발명의 상기 각 기술적 특징과 하기 (예를 들어, 실시예)에서 구체적으로 설명하는 각 기술적 특징은 서로 결합 할 수 있으며, 이를 통해 새로운 또는 바람직한 기술방안을 구성 할 수 있다. 편폭 제한 때문에 반복 설명은 생략하기로 한다.
도 1은 래트에 0.036mmol/kg PA3001, PA3002, PA3003, PA3004, PA3017 및 엔테카비어를 위장내 투여 한 후 모노포스페이트 활성 분자 ETVMP가 간에서의 농도-시간 히스토그램 (nmol/g, 몰 농도/조직 중량)을 나타낸다.
도 2는 래트에 0.036mmol/kg PA3001, PA3002, PA3003, PA3004, PA3017 및 엔테카비어를 위장내 투여 후 ETV가 간에서의 농도-시간 히스토그램 (nmol/g, 몰 농도/조직 중량)을 나타낸다.
도 3은 래트에 0.036mmol/kg PA3001, PA3002, PA3003, PA3004, PA3017 및 엔테카비어를 위장내 투여 한 후 모노포스페이트 활성 분자 ETVMP의 혈장에서의 농도-시간 히스토그램 (nmol/g, 몰 농도/조직 중량)을 나타낸다.
도 4는 래트에 0.036mmol/kg PA3001, PA3002, PA3003, PA3004, PA3017 및 엔테카비어를 위장내 투여 후 ETV의 혈장에서의 농도-시간 히스토그램 (nmol/g, 몰 농도/조직 중량)을 나타낸다.
도 5는 래트에 0.036mmol/kg PA3001, PA3002, PA3003, PA3004, PA3017 및 엔테카비어를 위장내 투여 한 후 모노포스페이트 활성 분자 ETVMP의 뇌수에서의 농도-시간 히스토그램 (nmol/g, 몰 농도/조직 중량)을 나타낸다.
도 6은 래트에 0.036mmol/kg PA3001, PA3002, PA3003, PA3004, PA3017 및 엔테카비어를 위장내 투여 후 ETV의 뇌수에서의 농도-시간 히스토그램 (nmol/g, 몰 농도/조직 중량)을 나타낸다.
주석 :
ETV: 엔테카비어, 2-아미노-9-[(1S,3S,4S)-4-히드록시-3-히드록시메틸-2-메틸렌시클로펜틸]-1,9-디하이드로-6H-퓨린-6-온 (CAS: 142217-69-4)
ETVMP: 2-아미노-9-((1S,3R,4S)-4-히드록시-3-(모노포스페이트메틸렌)-2-메틸레닐시클로펜틸)-3H-퓨린-6(9H)-온 (CAS: 1103994-53-1)
발명자는 장기간에 걸쳐 연구 검토를 거듭 한 결과, 대량의 화합물을 스크리닝하고 연구함으로써 일종 특정 구조를 갖는 화학식 I 및 화학식 II로 표시되는 화합물 (그 중, 벤젠고리 부분의 2위 및 5위는 특정 할로겐이다)은 놀랍게도 매우 우수한 항 바이러스 활성을 가지고 간 전달을 크게 향상시키며, 또한 독성과 부작용을 현저하게 줄일 수 있음을 처음 발견했다. 본 발명자들은 이상의 발견을 토대로 본 발명을 완성했다.
용어
본 발명에 사용되는 용어“C1-C6 알킬”은 1~6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬기, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert- 부틸, 또는 유사한 기를 말한다.
본 발명에 사용되는 용어“C2-C6 알카노일기”는“1~6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬기-카르보닐기”구조의 치환기, 예를 들면 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기 또는 유사한 기를 말한다.
본 발명에 사용되는 용어“C1-C6 알킬아민기”는 “1~6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄 알킬기-아민기”구조의 치환기, 예를 들어, 메틸아민기, 디메틸아민기, 에틸아민기, 프로필아민기, 디에틸아민기 또는 유사한 기를 말한다.
용어“할로겐”은 F, Cl, Br 및 I를 말한다.
본 발명에서 용어“함유”,“포함”또는“이루어진”는 각각의 성분이 본 발명의 화합물 또는 조성물에 함께 응용할 수 있는 것을 말한다. 따라서 용어“주로 ...으로 구성” 및 “...으로 구성하는”용어는“함유”에 포함된다.
본 발명에서 용어“약학적으로 허용되는”성분은 인간 및/또는 동물에 적용하여 과도한 부작용 (예를 들면, 독성, 자극 및 알레르기 반응)없이 합리적인 이익/위험 비율을 갖는 물질을 말한다.
본 발명에서 용어“유효량”은 목표질환 또는 상태를 치료, 완화 또는 예방하는 치료제의 양 혹은 검출 가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는 양을 말한다. 특정 대상에 대한 정확한 유효량은 해당 대상의 체형과 건강 상태, 병증의 성질과 정도 및 투여되는 치료제 및/또는 치료제의 조합에 따라 결정된다. 따라서 사전에 정확한 유효량을 지정하는 것은 무용하다. 그러나 지정된 상황에서, 임상의사는 일반적인 실험에 의해 유효량을 결정 할 수 있다.
본 발명에서 특별히 설명되지 않는 한, 용어“치환”은 기의 하나 이상의 수소 원자가 할로겐, C1-C3 알킬기, C1-C3 할로겐알킬기, 니트로기, 히드록시기, 아미노기, 시아노기로 이루어진 군에서 선택되는 치환기로 치환되는 것을 말한다.
특별히 설명되지 않는 한, 본 발명에서, 언급된 모든 화합물은 모든 가능한 광학 이성질체, 예를 들어 단일키랄화합물 또는 다른 키랄화합물의 혼합물(즉 라세미변형화합물)을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명에 기재된 모든 화합물 중, 각 키랄 탄소 원자는 R형 또는 S형 또는 R형과 S형의 혼합물 일 수 있다.
본 발명에 사용되는 용어“본 발명의 화합물”은 화학식 I 및 화학식 II로 표시되는 화합물을 말한다. 상기 용어는 또한 식 I 및 식 II로 표시되는 화합물의 여러가지 결정형, 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물을 포함한다.
본 발명에 사용되는 용어“약학적으로 허용되는 염”은 본 발명의 화합물 및 산 또는 염기와 의약품으로 적용되는 염을 말한다. 약학적으로 허용되는 염은 무기염과 유기염을 포함한다. 바람직한 염은 본 발명의 화합물과 산이 형성한 염이다. 염 형성에 적합한 산은 염산, 브롬화수소산, 불화수소산, 황산, 질산, 인산등의 무기산, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 젖산, 말릭산, 주석산, 구연산, 피크린산, 메탄술폰산, 벤젠메탄술폰산, 벤젠술폰산 등의 유기산 및 아스파르트산, 글루타민산 등의 산성 아미노산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 화합물은 물 또는 다양한 유기 용매로 결정화 또는 재결정화 될 수 있으며, 이 경우 다양한 용매화물이 형성 될 수 있다. 본 발명의 용매화물은 화학 양론의 수화물과 같은 용매화물을 포함할 수 있고, 또한 저압 승화 건조에 의해 제조 될 때 형성된 가변량의 물을 함유하는 화합물을 포함한다.
호변 이성질체, 형태이성질체, 메조 화합물 및 거울상 이성질체 또는 부분 입체 이성질체 관계를 갖는 광학 이성질체과 같은 다양한 열역학적으로 안정한 이성질체가 본 발명의 화합물을 제조 한 후에 존재할 수 있음을 이해해야한다. 상기 변형 된 형태는 본 발명의 개시 내용을 읽은 후 당업자에게 명백해 질 것이다.
화학식 I로 표시되는 화합물 및 그 제조
간 전달 메커니즘을 통해 간세포에서 항 바이러스 뉴클레오티드 약물을 방출 할 수 있는 고효율 및 저독성 간 전달 프로드러그를 제공하기 위해, 본 발명자들은 화학식 I의 화합물을 제조하였다.
Figure 112020075469120-pct00006
여기서,
R1은 각각 독립적으로 할로겐, 니트로기, 히드록시기, 아미노기, 시아노기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C1- C6 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬아민기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 카르복실기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 에스테르기, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알카노일기, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알킬아미노기에서 선택되고, 여기서, 상기의 치환은 할로겐기, C1-C3 알킬기, C1-C3 할로겐알킬기, 니트로기, 히드록시기, 아미노기, 시아노기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기를 갖는 것을 말하며,
ｍ은 0,1,2 또는 3이며,
R2, R3은 각각 독립적으로 할로겐기(F 또는 C1)이며,
R4은 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 C1-C6 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C1-C6 에스테르기, 치환 또는 비치환된 C2-C6 알카노일기에서 선택되고, 여기서, 상기의 치환은 할로겐기, C1-C3 알킬기, C1-C3 할로겐알킬기, 니트로기, 히드록시기, 아미노기, 시아노기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 치환기를 갖는 것을 말하며,
한편, 화학식 I 중 기존 카이랄성이외에, 기타 각 카이랄성 중심은 각각 R형 또는 S형이며,
상기 화합물은 일정한 항 바이러스 활성을 갖는 라세미체 또는 광학 이성질체 일 수 있다. 바람직하게는 상기 화학식 I의 화합물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는다.
Figure 112020075469120-pct00007
다른 일 바람직한 예에서, 상기의 P2와 인산 에스테르 고리 구조에서 4위의 방향족 기가 서로 시스 형이되고, 또한 P2은 R형이고, C4는 S형이다.
다른 일 바람직한 예에서, R2는 Cl이고, R3은 F이며; 또는 R2는 Cl이고, R3은 Cl이며; 또는 R2는 F이며, R3은 Cl이다.
다른 일 바람직한 예에서,상기 광학 이성질체는 호변이성질체, 시스 트랜스 이성질체, 형태이성질체, 메조 화합물 및 거울상 이성질체 또는 부분 입체 이성질체 관계를 갖는 광학 이성질체를 포함한다.
다른 일 바람직한 예에서, 상기 화합물은 하기의 화합물로부터 선택된다.
Figure 112020075469120-pct00008
화학식 I로 표시되는 화합물의 제조 방법은 다음과 같다.
테트라하이드로퓨란 용액에 PA3001-3 화합물을 첨가한 후 0℃에서 tert-부틸마그네슘클로라이드를 적가하여 30분간 반응시킨 후, 한번에 Ic로 표시되는 화합물을 넣고 밤새 반응시키고, 퀀칭하였으며 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 정제하여중간체 IIa를 획득하였다. IIa를 염산 에탄올 용액에 첨가하여 보호기 TBS를 제거하고, 화학식 II로 표시되는 화합물을 얻었다. II와 산, 염화 아실, 할로겐알킬기과 반응 시켜 화학식 I로 표시되는 화합물을 얻었다.
Figure 112020075469120-pct00009
그 중, 각 반응물은 시판되는 경로를 통해 구매할 수 있으며 또는, 시판되는 원료를 사용하여 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조 될 수 있다.
약학 조성물 및 투여 방법
본 발명의 화합물은 B형 간염 바이러스에 대한 억제 활성이 우수하기 때문에 본 발명의 화합물 및 이의 여러가지 결정형, 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기염, 수화물 또는 용매화물 및 본 발명의 화합물을 주요 활성 성분으로 포함하는 약학 조성물은 B형 간염 바이러스에 의한 질환을 치료, 예방 및 완화하는데 적용 할 수 있다. 종래의 기술에 의하면, 본 발명의 화합물은 HBV, HCV, HIV 및 HCMV 등의 감염에 의한 질환을 치료하는데 적용 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 안전 유효량의 범위 내에서 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함한다. 여기에서“안전 유효량”은 심각한 부작용을 일으키지 않고 건강 상태를 현저하게 개선하는데 충분한 화합물의 양을 의미한다. 일반적으로 약학 조성물은 0.1-1000mg의 본 발명의 화합물/제를 함유하고, 더욱 바람직하게는 0.5~500mg의 본 발명의 화합물/약제를 함유한다. 보다 바람직하게는 상기의“약제”는 하나의 캡슐 또는 정제를 말한다.
“약학적으로 허용되는 담체”는 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전재 또는 젤 물질을 말하며, 사람에 적용하고 반드시 충분한 순도와 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 여기에서“상용성”이란 조성물의 각 성분끼리, 또는 본 발명의 화합물과 서로 혼합 할 수있되 화합물의 약물 효과를 현저하게 감소하지 않는 것을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체의 몇 가지 예로는 셀룰로오스 및 그 유도체 (예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 에틸셀룰로오스나트륨, 셀룰로오스아세테이트 등), 젤라틴, 활석, 고체 윤활제 (예를 들면, 스테아린산, 스테아린산마그네슘), 황산칼슘, 식물성 기름 (예를 들어, 콩기름, 참기름, 땅콩 기름, 올리브 기름 등), 폴리올 (예를 들어, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 만니톨, 소르비톨 등), 유화제 (예를 들어, 트윈®), 습윤제 (예를 들어, 로릴황산나트륨), 착색제, 향미제, 안정제, 산화방지제, 방부제, 발열성물질제거물 등을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 약학 조성물의 투여 방법은 특별히 한정되지 않고, 대표적인 투여 방법은 경구투여, 직장내투여, 비경구투여(정맥내, 근육내 또는 피하) 및 국소투여를 포함한다(이에 제한되지 않음). 가장 바람직한 투여 방법은 경구 투여이다.
경구 투여를 위한 고체 제형은 캡슐, 정제, 환제, 산제 및 과립제를 포함한다. 이러한 고체 제형에서 활성화합물은 적어도 하나의 통상적인 불활성 부형제 (또는 담체), 예컨대 구연산 또는 디칼슘포스페이트 또는 다음 성분과 혼합된다 : (a) 충전재 또는 상용화제, 예를 들면, 전분, 유당, 자당, 포도당, 만니톨 및 규산; (b) 점착제, 예를 들어, 히드록시메틸셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐피로리돈, 자당 및 아라비아 고무; (c) 보습제, 예를 들면, 글리세린; (d) 붕해제, 예를 들어, 한천, 탄산칼슘, 감자전분 또는 카사바전분, 알긴산, 일부 복합 규산염 및 탄산나트륨; (e) 용해지연제, 예를 들면, 파라핀; (f) 흡수 촉진제, 예를 들면, 제 4급 암모늄 화합물; (g) 습윤제, 예를 들어, 세탄올 및 글리세릴모노스테아레이트; (h) 흡착제, 예를 들어, 고령토; 및 (i) 윤활제, 예를 들면, 탈크, 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 고형 폴리에틸렌글리콜, 로릴황산나트륨 또는 이들의 혼합물. 캡슐, 정제 및 환제중, 제형은 완충제를 포함 할 수 있다.
정제, 설탕 알약, 캡슐, 환제 및 과립제와 같은 고체 제형은 코팅 및 쉘 재료, 예를 들어 케이싱 및 본 분야에서 공지 된 다른 재료에 의해 제조 될 수 있다. 이들은 불투명화제를 함유 할 수 있고, 이런 조성물 중 활성 화합물 또는 화합물의 방출은 소화관의 특정 부분에서 지연된 방식으로 방출 될 수 있다. 사용될 수 있는 매립 성분의 예는 중합체 물질 및 왁스 물질이다. 필요한 경우, 활성 화합물은 또한 상기 언급 된 부형제 중 하나 이상을 갖는 마이크로 캡슐 형태 일 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 제형으로는 약학적으로 허용되는 유액, 용액, 현탁액, 시럽 또는 팅크제일 수 있다. 액상 제형은 활성 화합물 이외에, 본 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 에탄올, 이소프로판올, 탄산에틸, 에틸아세테이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부탄디올, 디메틸포름아미드 및 오일, 특히 면실유, 땅콩 기름, 옥수수 배아 기름, 올리브 기름, 피마자 기름 및 참기름 또는 이들의 혼합물등을 포함할 수 있다.
조성물은 이러한 불활성 희석제 이외에 보조제, 예를 들면 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미료, 방취제와 향료를 포함할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물 이외에 현탁제, 예를 들어, 에톡실화이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌소르비톨 및 소르비탄에스테르, 미정질 셀룰로오스, 알루미늄메톡 시드 및 한천 또는 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있다.
비경구 주사를 위한 조성물은 생리학적으로 허용되는 무균의 물 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 유액 및 다시 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 용해하기 위한 무균 분말을 포함할 수 있다. 적절한 수분과 비수 담체, 희석제, 용매 또는 부형제로는 물, 에탄올, 폴리올 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다.
국소 투여를 위한 본 발명의 화합물의 제형은 연고제, 산제, 패치제, 분사제 및 흡입제를 포함할 수 있다. 활성 성분은 무균 조건 하에서 생리학적으로 허용되는 담체 및 임의의 방부제, 완충제 또는 필요에 따라 필요로 할 수 있는 추진제와 함께 혼합된다.
본 발명의 화합물은 단독 투여 될 수 있고, 또는 다른 약학적으로 허용되는 화합물과 병용하여 투여 할 수 있다.
약학 조성물을 사용시, 안전 유효량의 본 발명의 화합물을 치료가 필요한 포유 동물 (예를 들면, 사람)에 적용하는 것이고, 여기에서 투여시의 사용량은 약학적으로 허용되는 효과적인 투여 사용량이며, 60kg의 사람인 경우, 하루 투여 사용량은 통상적으로 0.2~1000mg, 바람직하게는 0.5~100mg이다. 물론 구체적인 사용량은 투여 경로, 환자의 건강 상태 등의 요소를 고려하여 정하여야하며, 숙련 된 의사들이 능력 범위에 있다.
본 발명은 주로 다음과 같은 장점을 포함한다.
(1) 간 전달성이 높다. 화합물이 간세포에서 시토크롬 P450 동위 효소 패밀리 중 CYP3A에만 특이적으로 촉매되어 활성 분자를 생성하고 해당 활성 분자는 대량의 음전하를 가지고 간 밖으로 쉽게 배출되지 않고, 다른 조직에서는 CYP3A 효소의 발현이 거의 보이지 않아, 간에서 활성 분자는 다른 조직보다 농도가 훨씬 높아, 이로 인해 간 전달 효과를 달성할 수 있다.
(2) 활성이 높다. 화합물이 간세포에서 시토크롬 P450 동위 효소 패밀리 중 CYP3A에만 특이적으로 촉매되어 활성 분자를 생성하고 해당 활성 분자는 대량의 음전하를 가지고 간 밖으로 쉽게 배출되지 않고, 경구 투여 흡수후, 간에서 먼저 대사되어(간 초회 통과 효과), 간에 더 많은 활성 분자가 축적되며 항 바이러스 활성도 크게 향상 될 수 있다.
(3) 독성과 부작용이 낮다. 같은 용량의 프로드러그는 간 이외의 조직에서 활성 분자로 대사되는 양이 매우 적기 때문에, 신장, 뇌 등 주요 장기에 대한 독성이 크게 감소될 수 있다.
이하, 구체적인 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위해서만 사용되며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아님을 이해해야한다. 이하의 실시예에서 구체적 조건이 명시되지 않은 실험 방법은 일반적인 조건에서 또는 제조업체에서 권장하는 조건에서 실시한다. 별도로 명시되지 않는 한, 백분율 및 부수는 중량으로 산출된다.
실시예 1 PA3001（비교예）
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00010
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3001-2의 합성:
화합물 엔테카비어 일 수화물 PA3001-1 (5.32g, 18mmol) 및 이미다졸 (8.0g, 117.6mmol)을 DMF(40ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 tert-부틸디메틸클로로실란 (TBSCl, 13.3g , 88mmol)을 천천히 첨가하였다. 질소 분위기 하에서, 반응물을 실온에서 밤새 교반 하였다. 반응 완료 후 천천히 물 (400mL)에 첨가해 15분간 교반하고 에틸아세테이트(3×150mL)로 추출하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: PE:EA(V:V)=1:3) 90%의 수율로 PA3001-2 (8.2g)를 얻었다.
단계2）화합물 PA3001-3의 합성:
화합물 PA3001-2 (2.5g, 4.9mmol)를 0.5%의 염산 에탄올 용액(50ml)에 용해시키고, 실온에서 0.5시간 동안 교반 한 직후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH=9로 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거하였다. 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: PE:EA:CH3OH(V:V)=30:150:4.5) 78%의 수율로 백색 고체 화합물 PA3001-3 (1.5g)을 얻었다.
단계3）화합물 PA3001-5의 합성:
화합물 PA3001-3 (484mg, 1.24mmol)을 무수테트라하이드로퓨란에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (4.9mL, 4.9mmol)을 적가하고 1시간 동안 교반한 후 PA3001-4 (633mg, 1.71mmol)을 첨가하여 실온에서 밤새 교반 하였다. 포화 염화암모늄 20mL를 첨가하여 퀀칭한 후 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하고, 포화 식염수로 세척하여 무수황산나트륨으로 건조하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 컬럼 크로마토 그래피로 정제하여 (DCM:MeOH(V:V)=20:1) 70%의 수율로 PA3001-5 (538g)를 얻었다.
단계4）화합물 PA3001의 합성:
화합물 PA3001-5 (270mg, 0.43mmol)를 2%의 염산 에탄올 용액 (10mL)에 첨가하여 실온에서 2시간 동안 교반 하였다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (2×50mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하였다. 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 70%의 수율로 연백색 고체 PA3001 (155mg)을 얻었다.
실시예 2 PA3002
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00011
단계1）화합물 PA3002-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (561mg, 1.4mmol)을 테트라하이드로퓨란 (30ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (5.6mL, 5.6mmol, 4.0eq)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 1시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하여 PA3002-1 (833mg, 2.1mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 65%의 수율로 백색 고체 PA3002-2 (600mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3002의 합성:
화합물 PA3002-2 (310mg, 0.48mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (15ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (2×60mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 66%의 수율로 연백색 고체 PA3002 (170mg)를 얻었다.
실시예 3 PA3003
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00012
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3003-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (900mg, 2.3mmol)을 테트라하이드로퓨란 (50ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (4.6mL, 4.6mmol)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 1시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3003-1 (1.17g, 3.5mmol)을 첨가하였다. 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×150mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=10:1) 64%의 수율로 백색 고체 PA3003-2 (700mg)을 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3003의 합성:
화합물 PA3003-2 (600mg, 1.02mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (15ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (2×100mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 41%의 수율로 연백색 고체 PA3003 (200mg)을 얻었다.
실시예 4 PA3004
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00013
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3004-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (677mg, 1.73mmol)을 테트라하이드로퓨란 (40ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (6.6mL, 6.6mmol)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 1시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3004-1 (970mg, 2.5mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×150mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 53%의 수율로 백색 고체인 PA3004-2 (580mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3004의 합성:
화합물 PA3004-2 (580mg, 0.91mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (15ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (2×80mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 52%의 수율로 연백색 고체 PA3004 (250mg)를 얻었다.
실시예 5 PA3005
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00014
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3005의 합성:
화합물 PA3004 (300mg, 0.57mmol)를 DMF (10ml)에 용해시키고 실온에서 DCC (352mg, 1.71mmol), 이소부티르산 (60mg, 0.68mmol) 및 촉매량의 DMAP (10mg)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화나트륨 수용액 (40mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×50mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 61%의 수율로 백색 고체인 PA3005 (206mg)를 얻었다.
실시예 6 PA3006
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00015
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3006-1의 합성:
화합물 PA3004 (200mg, 0.38mmol)를 DMF (10ml)에 용해시키고 실온에서 DCC (234mg, 1.14mmol), (S)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부티르산 (124mg, 0.68mmol) 및 촉매량의 DMAP (10mg)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화나트륨 수용액 (40mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×50mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 65%의 수율로 백색 고체인 PA3006-1 (180mg)를 얻었다.
단계2）화합물 PA3006의 합성:
화합물 PA3006-1 (180mg, 0.25mmol)을 트리플루오로아세트산 용액 (5ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 회전증발하여 트리플루오로아세트산을 제거한 후, 에틸아세테이트 40mL로 용해시켜 물 50mL를 넣고 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화시켰다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 50%의 수율로 연백색 고체 PA3006 (78mg)를 얻었다.
실시예 7 PA3007
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00016
실험 부분 :
단계 1) 화합물 PA3004 (200mg, 0.38mmol), DCC (235mg, 1.14mmol) 및 DMAP (5mg, 0.038mmol)를 N,N-디메틸포름아미드: 디클로로메탄 (V;V=1:1, 10ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 프로피온산 (45uL, 0.76mmol)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 밤새 교반 하였다. 반응액을 농축 한 후, 포화 염화나트륨 수용액 (10mL)을 첨가하고 에틸아세테이트 (3×30mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 칼럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 47%의 수율로 백색 고체인 PA3007 (105mg)을 얻었다.
실시예 8 PA3008
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00017
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3008-1의 합성:
화합물 PA3004 (500mg, 0.95mmol)를 피리딘 (5mL)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 N,N-디메틸포름아미드디메틸아세탈 (0.2mL, 1.9mmol)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액 실온에서 밤새 교반 하였다. 반응액을 농축하고 진공 탱크에서 건조하여 PA3008-1 조생성물 (510mg)을 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3008-2의 합성:
화합물 PA3008-1 (500mg, 0.86mmol)을 피리딘 (5mL)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 아이소프로필클로로폼산염(0.1mL, 0.86mmol)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 4h 교반 한 후 나머지 아이소프로필클로로폼산염(0.1mL, 0.86mmol)을 반응액에 천천히 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 밤새 교반 하였다. 반응액을 농축하고, 포화 염화나트륨 수용액 (10mL)을 첨가하고 에틸아세테이트 (3×30mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 칼럼을 통해 분리 정제 (용출 액 : DCM:MeOH(V:V)=50:1)하여 87%의 수율로 백색 고체인 PA3008-2 (520mg)를 얻었다.
단계3）목표화합물 PA3008의 합성:
화합물 PA3008-2 (200mg, 3.02mmol)를 9%의 염산 에탄올 용액 (10ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 16시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×300mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 65%의 수율로 연백색 고체 PA3008 (120mg)를 얻었다.
실시예 9 PA3009
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00018
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3009의 합성:
화합물 PA3004 (300mg, 0.57mmol)을 DMF (10ml)에 용해시키고 실온에서 DCC (352mg, 1.71mmol), 카프린산 (117mg, 0.68mmol) 및 촉매량의 DMAP (10mg)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화나트륨 수용액 (40mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×50mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 63%의 수율로 백색 고체인 PA3009 (243mg)를 얻었다.
실시예 10 PA3010
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00019
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3010-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (300mg, 0.77mmol)을 테트라하이드로퓨란 (5ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (2.7mL, 2.7mmol, 3.5eq)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 2시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3010-1 (370mg, 0.92mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL) 으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 66%의 수율로 백색 고체인 PA3010-2 (300mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3010의 합성:
화합물 PA3010-2 (300mg, 0.47mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (10ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 7.5 정도가 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×80mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 조생성물을 얻고 조생성물을 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 18%의 수율로 백색 고체인 PA3010 (45mg)을 얻었다.
실시예 11 PA3011
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00020
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3011-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (300mg, 0.77mmol)을 테트라하이드로퓨란 (5ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (2.7mL, 2.7mmol, 3.5eq)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 2시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3011-1 (0.37g, 0.99mmol, 1.3eq)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 65%의 수율로 백색 고체인 PA3011-2 (320mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3011의 합성:
화합물 PA3011-2 (0.32g, 0.5mmol)을 3.6%의 염산 에탄올 용액 (10ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 7.5 정도가 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×80mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 조생성물을 얻고 조생성물을 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 44%의 수율로 백색 고체인 PA3011 (115mg)을 얻었다.
실시예 12 PA3012
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00021
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3012-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (300mg, 0.77mmol)을 테트라하이드로퓨란 (5ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (2.7mL, 2.7mmol, 3.5eq)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 2시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3012-1 (446mg, 1.2mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL) 으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 66%의 수율로 백색 고체인 PA3012-2 (300mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3012의 합성:
화합물 PA3012-2 (300mg, 0.47mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (10ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 7.5 정도가 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×60mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1), 조생성물을 얻고 조생성물을 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 18%의 수율로 연백색 고체인 PA3012 (45mg)를 얻었다.
실시예 13 PA3013
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00022
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3013-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (300mg, 0.77mmol)을 테트라하이드로퓨란 (10ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (2.7mL, 2.7mmol, 3.5eq)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 2시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3013-2 (446mg, 1.2mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 71%의 수율로 백색 고체인 PA3013-2 (350mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3013의 합성:
화합물 PA3013-2 (350mg, 0.55mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (15ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (2×60mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하였다(용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1). 분취 플레이트 정제 (전개 용매: DCM:MeOH(V:V)=10:1) 및 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 7%의 수율로 연백색 고체인 PA3013 (20mg)을 얻었다.
실시예 14 PA3014
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00023
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3014-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (230mg, 0.58mmol)을 테트라하이드로퓨란 (20ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (1.75mL, 1.75mmol, 5.5eq)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 1시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3014-1 (0.27g, 0.69mmol, 1.3eq)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (20mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 79%의 수율로 백색 고체인 PA3014-2 (298mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3014의 합성:
화합물 PA3014-2 (298mg, 0.46mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (3.5ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (2×60mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 36%의 수율로 연백색 고체인 PA3014 (61mg)를 얻었다.
실시예 15 PA3016
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00024
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3016-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (230mg, 0.59mmol)을 테트라하이드로퓨란 (10ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (2.1mL, 2.1mmol, 3.5eq)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 2시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3016-1 (340mg, 0.88mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 66%의 수율로 백색 고체인 PA3016-2 (250mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3016의 합성:
화합물 PA3016-2 (250mg, 0.39mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (15ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (2×60mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하고 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1), Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 51%의 수율로 연백색 고체인 PA3016 (20mg)를 얻었다.
실시예 16 PA3017
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00025
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3017-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (300mg, 0.77mmol)을 테트라하이드로퓨란 (5ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (2.7mL, 2.7mmol, 3.5eq)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 2시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3017-1 (446mg, 1.2mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 66%의 수율로 백색 고체인 PA3017-2 (300mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3017의 합성:
화합물 PA3017-2 (300mg, 0.47mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (10ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 7.5 정도가 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×60mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 조생성물을 얻고 조생성물을 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 28%의 수율로 연백색 고체인 PA3017 (80mg)을 얻었다.
실시예 17 PA3018
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00026
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3018-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (391mg, 1.0mmol)을 테트라하이드로퓨란 (40ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (3.5mL, 3.5mmol)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 1시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3018-1 (371mg, 1.0mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×70mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 42%의 수율로 백색 고체인 PA3018-2 (262mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3018의 합성:
화합물 PA3018-2 (262mg, 0.42mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (10ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×60mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 45%의 수율로 백색 고체인 PA3018 (96mg)을 얻었다.
실시예 18 PA3019
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00027
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3019-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (200mg, 0.51mmol)을 테트라하이드로퓨란 (10ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (1.8mL, 1.8mmol)을 적가하였다. 적가 완료 후,반응액을 실온에서 1시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3019-1 (285mg, 0.77mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×150mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=10:1) 56%의 수율로 백색 고체인 PA3019-2 (180mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3019의 합성:
화합물 PA3019-2 (180mg, 0.29mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (15ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 13.5%의 수율로 연백색 고체인 PA3019 (20mg)를 얻었다.
실시예 19 PA3020
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00028
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3020-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (200mg, 0.52mmol)을 테트라하이드로퓨란 (5ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (1.8mL, 1.8mmol, 3.5eq)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 2시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3020-1 (190mg, 0.52mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (20mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×80mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 53%의 수율로 백색 고체인 PA3020-2 (170mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3020의 합성:
화합물 PA3020-2 (170mg, 0.27mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (10ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 7.5 정도가 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×60mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 조생성물을 얻고 조생성물을 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 18%의 수율로 연백색 고체인 PA3020 (25mg)를 얻었다.
실시예 20 PA3022
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00029
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3022-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (391mg, 1.0mmol)을 테트라하이드로퓨란 (40ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (3.5mL, 3.5mmol)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 1시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3022-1 (371mg, 1.0mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 38.5%의 수율로 백색 고체인 PA3022-2 (240mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3022의 합성:
화합물 PA3022-2 (240mg, 0.38mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (10ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×80mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 53%의 수율로 백색 고체인 PA3022 (103mg)를 얻었다.
실시예 21 PA3023
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00030
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3023-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (200mg, 0.51mmol)을 테트라하이드로퓨란 (10ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (1.8mL, 1.8mmol)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 1시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3023-1 (309mg, 0.77mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×150mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=10:1) 36%의 수율로 백색 고체인 PA3023-2 (120mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3023의 합성:
화합물 PA3023-2 (120mg, 0.18mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (15ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 22%의 수율로 연백색 고체인 PA3023 (22mg)을 얻었다.
실시예 22 PA3024
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00031
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3024-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (200mg, 0.52mmol)을 테트라하이드로퓨란 (5ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (1.8mL, 1.8mmol, 3.5eq)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 2시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3024-1 (200mg, 0.52mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (20mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×80mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 45%의 수율로 백색 고체인 PA3024-2 (150mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3024의 합성:
화합물 PA3024-2 (150mg, 0.23mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (10ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 7.5 정도가 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×60mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 조생성물을 얻고 조생성물을 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 65%의 수율로 연백색 고체인 PA3024 (80mg)를 얻었다.
실시예 23 PA3026
합성 경로 :
Figure 112020075469120-pct00032
실험 부분 :
단계1）화합물 PA3026-2의 합성:
화합물 PA3001-3 (391mg, 1.0mmol)을 테트라하이드로퓨란 (40ml)에 용해시키고 얼음 욕조에서 천천히 1M의 tert-부틸마그네슘클로라이드 용액 (3.5mL, 3.5mmol)을 적가하였다. 적가 완료 후, 반응액을 실온에서 1시간 동안 교반하고 다시 0℃로 냉각하고 PA3026-1 (402mg, 1.0mmol)을 첨가하였다. 다음, 반응액을 실온에서 밤새 교반하고, 포화 염화암모늄 수용액 (30mL)으로 반응을 퀀칭시키고 에틸아세테이트 (3×100mL)로 추출하였다. 무수 Na2SO4로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 실리카겔 크로마토 그래피 컬럼을 통해 분리 정제하여 (용리액: DCM:MeOH(V:V)=20:1) 15.3%의 수율로 백색 고체인 PA3026-2 (100mg)를 얻었다.
단계2）목표화합물 PA3026의 합성:
화합물 PA3026-2 (100mg, 0.15mmol)를 3.6%의 염산 에탄올 용액 (10ml)에 용해시키고 실온에서 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후, 포화 NaHCO3 용액으로 pH 값이 중성이 될 때까지 중화하고 회전증발하여 에탄올을 제거한 후, 에틸아세테이트 (3×60mL)로 추출하였다. 유기상을 포화 식염수로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과하였다. 스핀 건조하고 Combiflash 크로마토 그래피 컬럼을 통해 정제하여 32.5%의 수율로 백색 고체인 PA3026 (32mg)를 얻었다.
표 1 각 실시예에서 제조하여 획득한 화합물은 하기 표에 나타낸 바와 같다.
Figure 112020075469120-pct00033
Figure 112020075469120-pct00034
Figure 112020075469120-pct00035
Figure 112020075469120-pct00036
표 2 각 실시예에 제조하여 획득한 화합물의 NMR은 하기 표에 나타낸 바와 같다.
Figure 112020075469120-pct00037
Figure 112020075469120-pct00038
Figure 112020075469120-pct00039
실시예 24 체외에서 인간, 마우스 및 래트 간 마이크로솜 대사의 평가
측정 방법 :
1）시약 공급원
인간 간 마이크로솜 (HLM, Human Liver Microsomes)은 IVT (In Vitro Technologies)로부터 구입하였으며 상품 번호는 X008070이며, 로트 번호는 SSP이다. 래트 간 마이크로솜 (RLM, Rat Liver Microsomes)는 BD에서 구입하였으며, 로트 번호가 16298이다. 마우스 간 마이크로솜 (MLM, Mice Liver Microsomes)은 RILD 간 질환 연구 (상하이)유한회사에서 구입하였으며 로트 번호는 BQNI이다.
시험 화합물 PA3001, PA3002, PA3003, PA3004은 ZHEJIANG PALO ALTO PHARMACEUTICALS INC에서 합성되고, 메탄올 (국가 약품 시약)에 용해시켜 농도가 25mM인 보존액으로 제조하였다.
2）반응 과정
효소반응은 100mM의 KH2PO4 완충액 (pH 7.4)에서 실시하고, 시험 화합물 농도는 25μM이며, 인간 간 마이크로솜 농도가 2mg/ml이고, NADPH 농도가 2mM였다. 반응은 마지막에 첨가 된 NADPH에 의해 시작되고, 항온 진탕 수조에서 5min 반응시킨 직후 1.5배 체적의 메탄올을 첨가하여 반응을 중지시켰다.
3）시료 처리 및 분석 방법
Ｉ 시료 전처리 :
Eppendorf 테이블 원심 분리기를 이용하여 최대 회전 속도 13,600rpm으로 20분간 원심했다. 상층액을 취하고 질소 송풍기에 말린 후 다시 이동상 A (0.1% 포름산 v/v의 수용액)으로 용해시켰다.
Ⅱ액상 기울기:
Figure 112020075469120-pct00040
분석 컬럼: Waters, Acquity UPLC HSS T3 column
유속: 0.5ml/min
칼럼 온도: 40℃
III 질량 분석 조건
이온원: 전기 분무 이온원
이온 모드: 양이온 모드
모세관 전압: 3.0kV
온도: 500℃
탈용매가스유량: 100L/h
스캔 시간: 0.025s
CV (Cone Voltage): 40V
충돌 에너지: 18eV
Q1 (m/z): 358
Q3 (m/z): 152
표 3 체외 간 마이크로솜 대사 화합물이 모노포스페이트 생성물 ETVMP를 방출하는 속도
Figure 112020075469120-pct00041
주석: ND=Not Determined
결과 분석: 체외에서 화합물 PA3001, PA3003과 PA3004는 모두 인간, 래트, 마우스 간 마이크로솜에 의해 모노포스페이트 대사 생성물 ETVMP로 활성화 될 수 있으며, PA3002과 PA3004는 대조 화합물 PA3001보다 인간 간 마이크로솜에 의해 모노포스페이트 대사 생성물 ETVMP로 활성화되는 효율이 현저히 크고, 서로 다른 화합물의 전환율은 현저한 차이가 존재하며(표 3), 그중 PA3004는 모든 종에서 전환율이 가장 높았다.
실시예 25 체외에서 인간 간 마이크로솜 대사의 평가
측정 방법:
1) 시약 공급원
인간 간 마이크로솜 (HLM, Human Liver Microsomes)은 IVT (In Vitro Technologies)로부터 구입하였으며 상품 번호는 X008070이며, 로트 번호는 IQF이다.
시험 화합물 PA3001, PA3002, PA3003, PA3004, PA3010, PA3011, PA3012A, PA3013, PA3014, PA3016, PA3017, PA3018, PA3019, PA3020, PA3022, PA3023, PA3024, PA3026은 ZHEJIANG PALO ALTO PHARMACEUTICALS INC에서 합성되고, 메탄올 (국가 약품 시약)에 용해시켜 농도가 25mM인 보존액으로 제조하였다.
2）반응 과정
효소반응은 100mM의 KH2PO4 완충액 (pH 7.4)으로 하고, 시험 화합물 농도가 25μM이며, 인간 간 마이크로솜 농도가 2mg/ml이고, NADPH 농도가 2mM였다. 반응은 마지막에 첨가 된 NADPH에 의해 시작되고, 항온 진탕 수조에서 5min 반응시킨 직후 1.5배 체적의 메탄올을 첨가하여 반응을 정지시켰다.
3) 시료 처리 및 분석 방법
I 시료 전처리:
Eppendorf 테이블 원심 분리기를 이용하여 최대 회전 속도 13,600rpm으로 20분간 원심했다. 상층액을 취하고 질소 송풍기에 말린 후 다시 이동상 A (0.1% 포름산 v/v의 수용액)으로 용해시켰다.
Ⅱ액상 기울기:
Figure 112020075469120-pct00042
분석 컬럼: Waters, Acquity UPLC HSS T3 column
유속: 0.5ml/min
칼럼 온도: 40℃
III 질량 분석 조건
이온원: 전기 분무 이온원
이온 모드: 양이온 모드
모세관 전압: 3.0kV
온도: 500℃
탈용매가스유량: 100L/h
스캔 시간: 0.025s
CV (Cone Voltage): 40V
충돌 에너지: 18eV
Q1 (m/z): 358
Q3 (m/z): 152
표 4 체외에서 인간 간 마이크로솜 대사 화합물이 모노포스페이트 생성물 ETVMP을 방출하는 속도
Figure 112020075469120-pct00043
결과 분석: 체외에서 화합물은 모두 인간 간 마이크로솜에 의해 모노포스페이트 대사 생성물 ETVMP로 활성화되었다. 서로 다른 화합물의 전환율은 현저한 차이가 존재하고 (표 4), PA3017, PA3016, PA3004는 대조 화합물 PA3001 보다 인간 간 마이크로솜에 의해 모노포스페이트 대사 생성물 ETVMP로 활성화되는 효율이 현저히 크고, 각각 PA3001 전환 속도의 4.6 배, 3.0 배 및 1.5 배였다.
실시예 26 화합물조직 분포 실험
26.1 방법 :
26.1.1 동물 실험
Shanghai Sippe-Bk Lab Animal Co., Ltd.에서 체중이 180~300g인 수컷 SD 래트를 제공하였다. 수컷 동물을 3일 이상 환경에 적응시키고 실험 전날 밤 12시간 동안 금식하도록 하였으며 식수는 금지되지 않았다. PA3001, PA3002, PA3003, PA3004 및 엔테카비어의 용액 (Cremophor EL: 에탄올: 식염수=10:10:80, V/V/V)을 제조 하였다. 투여하기 전에 동물의 체중이 실험 요구에 맞는지 확인하고 래트 12마리 선택하여 각 그룹마다 2마리의 래트가 되도록 그룹을 나누었으며, 0.036mmol/kg 약액을 위장 내 투여 했다. 각각 0.5h, 1h, 3h, 6h, 12h 및 24h 경과 후 이산화탄소를 사용하여 래트를 안락사시킨 후 샘플을 채취하였다.
26.1.2. 모노포스페이트 및 탈인산화 ETVMP 및ETV 각각의 생물 시료의 함량 측정
시료 전처리
심장을 통해 혈액을 채취하여 헤파린 항 응고 튜브에 저장하고, 4℃에서 5분 동안 6000rpm으로 원심 분리하고, 상청혈장을 5배 체적의 10% 트리클로로아세트산 침전제(내부 표준 PMPA 함유, 농도 100ng/mL)에 즉시 첨가하여 혈장 샘플 용액을 획득 하였다. 얼음위에서 적당량의 래트 간 및 뇌수 샘플을 채취하여 호모지네이트 튜브에 넣고, 상기와 같이 즉시 5배 부피의 10% 트리클로로아세트산 침전제를 첨가하고, 균질화를 위해 각각의 호모디네이트 튜브마다 2개의 세라믹 비드를 첨가하여 조직호모지네이트 액 샘플을 얻었다.
생물 샘플을 100μL를 취하여 1.5 mL 시험관에 넣고 5min 원심 분리한다. 20 μL의 상청액을 취하고, 180μL의 물을 첨가하고 균일하게 섞이도록 한 후, LC-MS/MS 분석을 실시했다.
크로마토 그래피 조건
LC-MS/MS-AJ (Triple Quad 5500, AB SCIEX)이 샘플의 분석에 사용되었다. 크로마토 그래피 컬럼: Acquity UPLC HSS T3 (2.1×50mm, 1.8μm); 칼럼 온도: 40℃; 유속: 0.5mL/min. 이동상 A: 0.1% 포름산 수용액; 이동상 B: 아세토 니트릴 용액. 샘플 분리는 기울기 용리를 채용하였으며 프로세스는 표 5에 나타난 바와 같다.
표 5 ETVMP 및 ETV의 액상 기울기 용리 조건
Figure 112020075469120-pct00044
질량 분석 조건
이온원은 전기 분무 이온원(Turbo Ionspray)이며, 양이온 모드; 모세관 전압이 3.0kV이고, 온도가 500℃; 탈 용매 기류 1000L/h; 스캔 시간, CV, 충돌 에너지 및 정량 분석을 위한 이온 반응은 하기 표 6에 나타난 바와 같다.
표 6 ETVMP 및 ETV의 질량 분석 조건
Figure 112020075469120-pct00045
주석: ETVMP 샘플의 실온 온도 안정성이 좋지 않았기 때문에 얼음위에서 진행하여야 하며 즉시 침전제를 추가하여야 한다.
26.1.3. 데이터 분석
각 화합물의 대사 생성물의 간에서의 농도에 대응되는 시간을 막대 그래프로 작성했다. ETVMP 및 ETV의 조직농도-시간 곡선하면적 (AUC0-t)은 WinNonLin6.2.1 (Pharsight, CA) 비구획모델중의 대수-선형 사다리꼴법에 의해 피팅하여 산출되었다.
26.2 실험 결과
PA3001, PA3002, PA3003, PA3004, PA3017 및 엔테카비어가 ETVMP 및 ETV를 방출 한 결과를 정리하여 표 7에 나타낸다.
표 7 래트에 0.036mmol/kg PA3001, PA3002, PA3003, PA3004 및 엔테카비어를 위내 투여 한 후 24시간 이내에 모노포스페이트 대사 생성물 ETVMP 및 탈 인산 대사 생성물 ETV의 간, 뇌수 및 혈장에서 노출양 (AUC0-24h, h·nmol/g 농도/조직 중량)
Figure 112020075469120-pct00046
N. D.=Not detectable, 검출되지 않았다.(대응되는 기관 또는 조직에서의 농도가 5nmol/g 또는 5nmol/mL보다 낮은 것을 의미한다.)
26.2.1 대사 생성물의 간, 혈장 및 뇌수 조직에서의 분포
SD 래트에 0.036mmol/kg 시약을 위장 내 투여 한 후, 간 조직 분포의 결과에 따르면, PA3001, PA3002, PA3003, PA3004과 PA3017 의해 대사되어 배출 된 B형 간염 바이러스를 억제하는 효소의 활성 분자 ETVMP는 대응되는 시점의 ETV보다 약간 낮거나 같은 수준 (도 1)이지만, PA3001, PA3002, PA3003, PA3004과 PA3017 간에서의 탈 인산 대사 생성물 ETV는 ETV보다 현저히 낮다(도 2). 이는, 프로드러그에 의해 대사되어 생성 된 ETVMP가 대사를 ETV로 역전시키기 쉽지 않아서, 프로드러그 약물 효과를 보장한다는 것을 보여준다. 화학식 II로 표시되는 화합물은 간에서 CYP3A4로부터 모노포스페이트 생성물 ETVMP를 직접 효소적으로 방출하고, ETV의 모노포스페이트는 속도 제한 단계로 전환되고, ETVMP는 대사를 ETV로 역전시키기 쉽지 않다. 따라서 화학식 II로 표시되는 화합물은 활성 대사 생성물의 간에서의 분포 비율을 향상시키고, 대사 생성물의 혈장, 뇌수 등의 조직에서의 분포 비율을 줄일 수 있다.
SD 래트에 0.036mmol/kg 시약을 위장 내 투여 한 후, 혈액 및 뇌수 분포의 결과는 PA3001, PA3002, PA3003, PA3004과 PA3017 의해 대사되어 방출 된 ETVMP 및 ETV는 대응되는 시점의 ETV보다 훨씬 낮은 (도 3, 도 4, 도 5와 도 6) 것을 보여 주었다. 따라서 ETV는 혈액 뇌 장벽을 통과 할 수 있고, ETV 자체와 그 대사 생성물 ETVMP은 신경 독성을 일으키는 활성 분자이며, 확립 된 LC-MS/MS 검출 방법 (검출 한계가 LOD=5nmol/g 또는 5nmol/mL)을 이용하여 PA3004과 PA3017을 경구 투여한 래트의 뇌 샘플에서 이러한 활성 분자를 검출하지 못하였다(표 7). 혈액에서 PA3004과 PA3017이 방출 된 ETVMP은 각각 ETV의 16.4%와 14.5%이며, 방출 된 ETV는 각각 ETV의 2.3%와 1.8%이며, 동시에, 비교예 PA3001보다 낮았다.
간에서의 ETVMP과 혈액의 ETV의 AUC 비율 (간 타겟 인덱스)에 의해 화합물의 간 타켓성을 나타내고 PA3004과 PA3017 간 타겟 인덱스는 각각 15.52과 15.47이며, PA3001 및 ETV (간 타겟 인덱스는 각각 12.46 및 0.51)보다 훨씬 컸다. 이러한 결과는 동일한 용량하에서 ETV와 비교하여, 간 전달 기의 변형이 혈액 및 뇌에서 활성 분자 ETVMP 및 ETV의 분포를 현저히 감소 시킨다는 것을 나타낸다. PA3017과 PA3014는 임상적으로 ETV 의한 일반적인 부작용, 예를 들면 두통, 피로, 현기증, 메스꺼움 등을 개선시킬 수 있다.
이상과 같이, 본 발명에 따른 화학식 I 및 화학식 II로 표시되는 화합물은 높은 활성 및 높은 간 전달 조직 특이성을 가지고 있기 때문에 치료에 필요한 용량이 더 낮고 더 높은 안전성 및 낮은 독성과 부작용을 가지고 있다.
본 발명에서 언급 된 모든 문헌은 본 발명에서 참조로 원용되고 각 문헌은 단독으로 참조로 인용된다. 또한, 본 발명의 상기 내용을 읽은 후 당업자는 본 발명에 다양한 변경이나 수정을 가할 수 있으며 이와 동일 형태도 본 출원의 첨부 된 특허 청구 범위에 의해 정의되는 범위 안에 있다는 것을 이해하여야 한다.

Claims (10)

  1. 식 PA3004로 표시되는 화합물 또는 그 광학 이성질체, 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물에 있어서,
    식 PA3004는
    Figure 112022135436246-pct00061
    인 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 그 광학 이성질체, 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 식 PA3004로 표시되는 화합물의 염은 식 PA3004로 표시되는 화합물과 무기산 또는 유기산에 의해 형성된 약학적으로 허용 가능한 염이거나, 또는
    상기 식 PA3004로 표시되는 화합물의 염은 식 PA3004로 표시되는 화합물과 알칼리 반응에 의해 형성된 약학적으로 허용되는 염이며,
    상기 식 PA3004로 표시되는 화합물 또는 그의 염은 비정질 물질인 것을 특징으로 하는,
    화합물 또는 그 광학 이성질체, 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물.
  3. 삭제
  4. 제1항의 화합물 또는 그 광학 이성질체, 약학적으로 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물을 포함하는, B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한, 약학 조성물.
  5. 제1항의 화합물의 제조 방법에 있어서,
    이하 단계를 포함하고,
    Figure 112022135436246-pct00062

    (i-b) 불활성 용매에서, 식 PA3004-2로 표시되는 화합물로 TBS를 제거하고, 식 PA3004로 표시되는 화합물을 형성하고;
    여기에서, 상기 식 PA3004-2로 표시되는 화합물은 아래의 방법으로 제조되고,
    Figure 112022135436246-pct00063

    (i-c) 불활성 용매에서, 식 PA3004-3으로 표시되는 화합물을 PA3004-1과 치환되어 식 PA3004-2로 표시되는 화합물을 얻는 것을 특징으로 하는, 화합물의 제조 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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  9. 삭제
  10. 삭제
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