KR102501177B1 - 신규한 락토바실러스 플란타럼 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법 - Google Patents

신규한 락토바실러스 플란타럼 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 패오니플로린을 벤조산(benzoic acid)으로 전환시키는 생물전환능을 나타내는 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주는 패오니플로린을 벤조산으로 전환하는 생물전환능이 매우 우수하기 때문에, 다양한 정신질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신규한 락토바실러스 플란타럼 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법{A novel Lactobacillus plantarum strain and method for paeoniflorin-biotransforming using the same}
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 패오니플로린을 벤조산(benzoic acid)으로 전환시키는 생물전환능을 나타내는 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법에 관한 것이다.
패오니플로린(Paeoniflorin)은 한약재명으로 작약으로 불리는 함박꽃과의 여러해살이 식물인 함박꽃(Paeonia lactiflora Pall.)의 뿌리에서 추출된 배당체(Tetrahedron 25(9):1825-38)이다.
패오니플로린의 효능에 대해서는 난소의 안드로젠 생산을 억제한다는 보고, 허혈 증상이 있는 쥐모델에서 말초 신경과 뇌의 염증반응을 저해하여 뇌졸중에 대한 뇌신경 보호작용과 미세교세포의 활성화를 선택적으로 억제함으로써 모르핀에 대한 내성을 약화시킨다는 보고를 비롯하여 항당뇨 및 항정신질환과 같은 대사증후군 예방 효과가 있다는 것이 알려져 있다.
하지만, 패오니플로린의 이와 같은 활성은 생리학적으로 유효한 효과를 나타내기에는 충분하지 못하다는 한계가 있었다.
이에 본 발명자들은 작약 추출물을 대사 또는 개량함으로써 작약의 지표물질인 패오니플로린의 생리활성이 향상된 새로운 전환체를 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 김치로부터 분리된 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum) LN180054(KCTC18841P)로 작약 추출물을 발효시키는 경우 패오니플로린이 벤조산(benzoic acid)으로 전환된다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 기탁번호 KCTC18841P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) LN180054 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) LN180054 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 벤조산(benzoic acid)으로 전환하는 생물 전환용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 패오니플로린(paeoniflorin)을 포함하는 조성물에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 균주 또는 이의 배양액을 접종하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 수득물을 배양하여 발효시키는 단계를 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 벤조산(benzoic acid)으로 전환하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 작약의 발효물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 작약의 발효물을 유효성분으로 포함하는 정신질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 작약의 발효물을 유효성분으로 포함하는 정신질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 기탁번호 KCTC18841P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) LN180054 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) LN180054 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 벤조산(benzoic acid)으로 전환하는 생물 전환용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 패오니플로린(paeoniflorin)을 포함하는 조성물에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 균주 또는 이의 배양액을 접종하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 수득물을 배양하여 발효시키는 단계를 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 벤조산(benzoic acid)으로 전환하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 작약의 발효물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 작약의 발효물을 유효성분으로 포함하는 정신질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 작약의 발효물을 유효성분으로 포함하는 정신질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KCTC18841P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) LN180054 균주를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주는 패오니플로린(paeoniflorin) 생물전환능을 나타내는 것을 특징한다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주는 패오니플로린(paeoniflorin)을 벤조산으로 전환시키는 생물전환능을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
[서열번호 1]
tcattaatttgagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagcttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaaggtgggacagatgattagggtgaagtcgtaacaaggtagccgtaggagaacctgcggctggatcacctcctttcta
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주는 그 출처가 제한되지 않으나, 발효식품으로부터 분리된 것일 수 있으며, 예를 들어 김치, 된장, 고추장, 간장, 치즈, 젓갈 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 김치에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 패오니플로린의 생리활성을 향상시킬 수 있는 생물전환능을 나타내는 미생물을 탐색하기 위하여, 김치로부터 미생물을 순수 분리하고 이들의 작약 추출물 발효능을 평가하였다. 그 결과, 김치로부터 분리된 균주들 중에서 락토바실러스 플란타럼 균주를 접종한 작약 추출물에서 특이적으로 패오니플로린이 감소하는 것으로 확인되었으며, 보다 구체적으로는 패오니플로린이 벤조산으로 전환되는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 패오니플로린을 벤조산으로 전환하는 활성을 나타내는 락토바실러스 플란타럼 균주의 genome 서열을 분석해 본 결과, L. plantraum subsp. plantarum strain IDCC3501과 99.98%, L. plantraum subsp. plantarum strain nF1와 99.92%의 상동성을 지님을 확인하였으며, 다음으로 L. plantraum subsp. plantarum strain WCFS1T와 99.21%, L. plantraum subsp. plantarum strain CGMCC 1.557T와 99.11%의 상동성을 지님을 확인하였고, 상기 신규한 균주를 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) LN180054으로 명명하고 2020년 8월 31일자로 한국생명공학연구원에 기탁하였다(KCTC18841P).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 동정된 신균주인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) LN180054으로 발효한 작약 추출물의 발효물은 패오니플로린의 함량이 낮고 벤조산의 함량이 현저하게 높은 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 상기 신균주는 벤조산의 함량이 증가된 작약 추출물의 발효물을 제조하거나, 패오니플로린을 벤조산으로 생물전환하는 용도로 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 락토바실러스 플란타럼 LN180054의 배양물을 제공한다.
본 발명에서 용어 '배양'이란 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에서는 '발효'를 포함하는 개념이다.
상기 '락토바실러스 플란타럼 LN180054'의 균체는 배양 배지로부터 수득된 생균 그 자체뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 유산균에 대한 임의의 가공형태를 포함하는 것으로 예를 들어 균체 파쇄물, 건조물, 동결물 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 용어 '배양물' 또는 '배양액'은 '발효물'을 포함하는 의미이며, 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등의 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다.
본 발명은 또한 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 패오니플로린을 벤조산으로 전환하는 생물 전환용 조성물을 제공한다.
본 발명의 균주 또는 이의 배양액은, 본 발명의 조성물에 10 내지 20 중량부로 포함되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배양액은 본 발명의 균주를 배양한 배양원액 및 상기 균주를 제거한 배양 상등액을 희석하는 것을 포함하는 것이 바람직하며, 구체적으로 0.5 내지 500 배로 희석하여 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 배양액의 조성은 통상의 락토바실러스 플란타럼 균주의 성장과 유지에 필요한 영양 성분뿐만 아니라, 락토바실러스 플란타럼 균주의 생장에 상승적으로 작용하는 것으로 공지된 모든 성분을 추가적으로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 (a) 패오니플로린(paeoniflorin)을 포함하는 조성물에 상기 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주 또는 이의 배양액을 접종하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 수득물을 배양하여 발효시키는 단계를 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 벤조산(benzoic acid)으로 전환하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 패오니플로린을 포함하는 조성물은 패오니플로린을 포함하는 원물의 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 작약(Paeonia lactiflora) 또는 작약속 (Paeonia) 식물의 분말, 엑기스 또는 추출물일 수 있다. 배양을 용이하게 하기 위하여 바람직하게는 패오니플로린을 포함하는 조성물은 액상일 수 있다.
본 명세서에서 상기 '작약'은 학명 Paeonia lactiflora를 가지는 식물의 뿌리, 바람직하게는 약재로 사용되는 Paeonia lactiflora의 뿌리를 의미하는 것이다. 약재로서의 작약은 Paeoniae Radix 또는 Peony root라고 불리기도 하며, 보다 상세하게는 약용부위로 사용되는 작약 Paeonia lactiflora Pallas 또는 기타동속근연식물 (작약과 Paeoniaceae)의 뿌리를 나타낸다.
본 발명에서 상기 작약 추출물은 당업계에 공지된 용매 추출법에 의해 추출된 것일 수 있다. 추출 용매로는 이에 제한되지는 않으나, 물, 탄소수 1(C1) 내지 6개(C6)의 저급 알콜, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 탄소수 1(C1) 내지 6개(C6)의 저급 알콜은 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올일 수 있고, 유기용매는 이에 제한되지는 않으나, 아세톤, 에틸아세테이드, n-핵산, 디에틸에테르, 아세톤, 벤젠일 수 있다. 바람직하게는 물 또는 탄소수 1 내지 6개의 알콜 또는 이의 혼합용매로 추출할 수 있고, 더 바람직하게는 물, 에탄올 또는 주정일 수 있다. 알콜에는 흡습성 등 물리화학적 성질을 반영하기 위하여 소량의 물(예를 들어, 95% 에탄올, 99% 에탄올의 형태)이 첨가된 형태일 수도 있다.
추출온도 및 시간은 활성성분의 추출의 목적이 달성되는 한 특별히 제한되지는 않으나, 30℃ 내지 121℃에서 10분 내지 12시간 동안 추출된 것일 수 있다. 추출시 활성성분의 추출을 용이하게 하기 위하여 가압하여 추출할 수도 있다. 한편, 추출은 이산화탄소 등 적절한 용매를 사용하여 초임계 추출 또는 아임계 추출에 의할 수도 있다.
상기 (a) 단계에서 접종하는 균주의 양은 1 x 108 내지 1 x 1011의 균주를 조성물 자체 또는 조성물이 포함된 배지에 첨가하거나 전배양된 균주 배양액을 1 내지 5%(v/v)정도로 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주 또는 이의 배양액의 접종 후의 (b)단계의 배양은 당업계에 공지된 유산균 배양방법에 의할 수 있다. 예를 들면, 상기 발효는 10 내지 45℃ 및 pH 3 내지 9의 조건에서 10시간 이상 배양하는 방법에 의해서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
아울러, 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지 또는 유성분을 이용한 유청배지, 탈지유 배지 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 배양물 생산을 위한 배지에서 상기 탄소원으로 이용 가능한 것은, 글루코스, 수크로스, 말토스, 프럭토스, 락토스, 자일로스, 갈락토스, 아라비노스 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 바람직하게는 수크로스, 프럭토스, 글루코스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 보다 바람직하게는 글루코스이다. 본 발명의 배양물 생산을 위한 배지에서 상기 질소원으로 이용 가능한 것은, 효모 추출물, 소이톤(soytone), 펩톤, 비프 추출물(beef extract), 트립톤, 카시톤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 바람직하게는 효모 추출물, 펩톤, 트립톤 및 소이톤으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 보다 바람직하게는 효모 추출물 또는 소이톤이다.
유산균의 배양 및 발효는 당업계에 알려진 밀크 포함 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions)에 개시되어 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 방법에 따르면 패오니플로린이 벤조산으로 전환되는 것으로 결과적으로 패오니플로린이 감소된다.
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 제조된 작약의 발효물을 제공한다.
상기 작약의 발효물은 작약(Paeonia lactiflora)의 분말, 엑기스 또는 추출물의 발효물일 수 있으며, 작약의 분말, 엑기스 또는 추출물에 포함된 패오니플로린이 벤조산으로 전환되어 패오니플로린의 함량은 낮거나 없고, 벤조산의 함량이 증가되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주에 의해 발효된 작약 추출물의 발효물은 작약 추출물과 비교해 현저히 향상된 항-정신질환 효과를 나타내는 것으로 확인되어 정신질환 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 작약의 발효물을 유효성분으로 포함하는 정신질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 정신질환은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD), 자폐증, 스트레스, 불안장애, 외상 후 스트레스 장애, 조현병, 공황장애 및 우울증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 정신질환 치료를 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여 경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양, 즉 정신질환을 예방하거나 증상을 완화하고 치료하기 충분한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.01 내지 1000㎎/㎏의 범위로 투여될 수 있으며, 바람직하게는, 약 1 내지 100mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하, 직장, 또는 췌장 내 투여일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 가장 바람직하게는 경구적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우, 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화할 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강 흡입제 등의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다.
또한, 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류(예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나, 정신질환 치료의 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 작약 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 정신질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다.
상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 건강식품으로는 작약 추출물의 유산균 발효물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 작약 추출물의 발효물과 정신질환에 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 작약 추출물의 발효물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 작약 추출물의 발효물물을 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 작약 추출물의 발효물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.1 내지 90 중량%이다. 더 바람직하게는, 본 발명의 작약 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물은 특히, 정신질환에 효과가 있는 것으로 알려진 활성 성분과 함께 혼합하여 건강기능식품 또는 식이보충제의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명이 제공하는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) LN180054 균주는 패오니플로린을 벤조산(benzoic acid)로 전환하는 생물전환능이 매우 우수하기 때문에, 다양한 정신질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 작약 추출물(상부 패널) 또는 작약 추출물의 락토바실러스 플란타럼 LN180054 발효물(하부 패널)의 HPLC 프로파일을 나타낸 도면이다.
도 2는 작약 추출물의 락토바실러스 플란타럼 LN180054 발효물에서 생물전환된 화합물을 분리하고 정제하는 과정을 나타낸 공정도이다.
도 3은 패오니플로린(a)과 벤조산(b)의 LC/MS 데이터를 나타낸 도면이다.
도 4는 패오니플로린이 생물전환되어 생성된 화합물(벤조산)의 구조를 NMR 데이터에 기반하여 확인한 결과이다.
도 5는 작약 추출물 발효 균주의 다른 관련 종과의 관계를 보여주는 16S rRNA 유전자 서열의 비교 분석으로 구성된 계통 발생 트리를 나타낸 도면이다.
도 6은 Lactobacillus plantarum subsp. 10종의 plantarum genomes의 ANI(average nucleotide identity)의 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 락토바실러스 플란타럼 LN180054 균주와 다른 락토바실러스 플란타럼 균주의 게놈을 비교하여 분석한 도면이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 김치로부터 식물성 유산균 분리
다양한 김치원으로부터 멸균수를 이용하여 균주를 단계적으로 희석하여 MRS 배지에 도말하여 28도에서 2일 배양 후, 형태학적 특징을 이용하여 유산균을 분리하였다. 이후 균주 동정을 위해 16S rRNA 서열을 분석하였으며 분리된 균주는 20% 글리세롤을 이용하여 -70도에 보관하였다. 총 분리 균주는 Lactobacillus spp., Pediococcus spp., Weissella spp., Leuconostoc spp., Enterococcus spp.의 5 속을 포함하는 총 200 균주였다.
실시예 2: 작약 물질전환 활성 균주 탐색
작약 내 지표성분의 생물전환 활성을 가진 균주의 탐색을 위해 작약 건조 중량 1g에 10배의 (w/v) 물을 첨가하여 121도에서 15분간 멸균하여 분리균을 2 X 109 CFU/ml 농도로 접종하여 28도 배양실에서 48시간 정치배양 하였다. 이 후 이 상등액을 50% 에탄올로 추출하여 TSK-GEL ODS-100V 5㎛ column (4.6mm×15cm)을 이용한 HPLC를 통해 UV 235nm, 15~100% methanol gradient 조건 하에서 크로마토그램 변화를 분석하였다.
그 결과 200 균주 중 일부 균주들에서 특이적으로 15.1분대 paeoniflorin로 예상되는 지표 물질이 줄어들고 17.5분에서 기존 관찰되는 물질의 피크가 증가된 것을 확인하였다(도 1).
실시예 3: 생물전환 물질 동정
상기 균주들에 의해 전환된 물질의 구조 동정을 위해 다음과 같은 방법으로 물질을 순수 분리하였다(도 2).
LC-MS, NMR로 구조 분석을 수행한 결과, 작약 내 15.1분대 피크는 이전 연구에서 확인된 바와 같이 paeoniflorin로 재차 확인되었으며, 17.5분대 피크는 동일 방법으로 분석 결과 분자량 122.12의 벤조산(benzoic acid)으로 동정되었다(표 1, 도 3 및 도 4).
Figure 112020098384198-pat00001
실시예 4: 계통분류학적 분석
5속의 200 균주 중 10주의 L. plantarum 만이 선택적으로 패오니플로린을 생물전환 시킨다는 것을 확인하였다(도 5).
그 중 가장 우수한 전환능을 나타낸 균주는 작약 추출물의 발효물에서 64% 이상의 전환율을 나타냈고, 작약 1g의 건조중량 당 11.4 mg의 paeoniflorin을 7.3 mg 벤조산으로 생물 전환시켰으며, 이는 기존 작약 내 4.3 mg의 벤조산에 비해 2.7배 증가된 수준이었다(도 1).
상기 생물전환 활성을 보인 10주 모두 16s rRNA 서열을 통해 분류학적으로 L. plantarum ATCC 14922T와 근연종임을 확인하였다. 이에, 생물 전환율이 가장 우수한 락토바실러스 플란타럼 균주에 대한 전체 게놈 서열 분석을 수행하였다.
Genome 서열 분석 결과, 가장 우수한 생물 전환능을 나타낸 락토바실러스 플란타럼 균주의 genome size는 3,242,696bp로 G+C content는 44.52% 였다. 3,157개의 protein coding sequence를 포함하고 있으며, 5개의 16S rRNA genes, 5개의 23S rRNA genes, 6개의 5S rRNA genes, 68개의 tRNA genes을 가지고 있었다(결과 미도시).
또한 7,221bp의 플라스미드를 보유하고 있었다. 근연종과의 genome sequence 비교 결과 L. plantraum subsp. plantarum strain IDCC3501과 99.98%, L. plantraum subsp. plantarum strain nF1와 99.92%의 상동성을 지님을 확인하였으며, 다음으로 L. plantraum subsp. plantarum strain WCFS1T와 99.21%, L. plantraum subsp. plantarum strain CGMCC 1.557T와 99.11%의 상동성을 지님을 확인하였다(도 6 및 도 7).
이에, 상기 동정된 신균주를 락토바실러스 플란타럼 LN180054으로 명명하고 이를 2020년 8월 31일자로 한국생명공학연구원에 기탁하였다(기탁번호 KCTC18841P).
본 발명이 제공하는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) LN180054 균주는 패오니플로린을 벤조산(benzoic acid)로 전환하는 생물전환능이 매우 우수하기 때문에, 다양한 정신질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.
한국생명공학연구원 KCTC18841P 20200831
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A novel Lactobacillus plantarum strain and method for paeoniflorin-biotransforming using the same <130> NP20-0032 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1574 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA sequence of Lactobacillus plantarum LN180054 <400> 1 tcattaattt gagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat 60 gcaagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca tttgagtgag 120 tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata acacctggaa 180 acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagcttgaa agatggcttc 240 ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta acggctcacc 300 atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg 360 cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg 420 agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt taaagaagaa 480 catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact 540 acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta 600 aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt 660 gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt 720 gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg 780 acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccataccg 840 taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt 900 aagcattccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc 960 cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct 1020 tgacatacta tgcaaatcta agagattaga cgttcccttc ggggacatgg atacaggtgg 1080 tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1140 cccttattat cagttgccag cattaagttg ggcactctgg tgagactgcc ggtgacaaac 1200 cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1260 gctacaatgg atggtacaac gagttgcgaa ctcgcgagag taagctaatc tcttaaagcc 1320 attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc 1380 gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1440 atgagagttt gtaacaccca aagtcggtgg ggtaaccttt taggaaccag ccgcctaagg 1500 tgggacagat gattagggtg aagtcgtaac aaggtagccg taggagaacc tgcggctgga 1560 tcacctcctt tcta 1574

Claims (12)

  1. 기탁번호 KCTC18841P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) LN180054 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 패오니플로린(paeoniflorin)의 생물전환능을 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 패오니플로린(paeoniflorin)을 벤조산(benzoic acid)으로 전환시키는 생물전환능을 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 벤조산(benzoic acid)으로 전환하는 생물 전환용 조성물.
  6. (a) 패오니플로린(paeoniflorin)을 포함하는 조성물에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 균주 또는 이의 배양액을 접종하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 수득물을 배양하여 발효시키는 단계를 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 벤조산(benzoic acid)으로 전환하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 패오니플로린을 포함하는 조성물은 작약(Paeonia lactiflora)의 분말, 엑기스 또는 추출물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 발효는 10 내지 45℃ 및 pH 3 내지 9에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항의 방법에 따라 제조된 작약의 발효물.
  10. 제9항에 따른 작약의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 불안장애, 외상 후 스트레스 장애, 조현병, 공황장애 및 우울증으로 이루어진 군에서 선택되는 정신질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 삭제
  12. 제9항에 따른 작약의 발효물을 유효성분으로 포함하는, 불안장애, 외상 후 스트레스 장애, 조현병, 공황장애 및 우울증으로 이루어진 군에서 선택되는 정신질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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