KR102500434B1 - 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브 - Google Patents

위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브 Download PDF

Info

Publication number
KR102500434B1
KR102500434B1 KR1020190121434A KR20190121434A KR102500434B1 KR 102500434 B1 KR102500434 B1 KR 102500434B1 KR 1020190121434 A KR1020190121434 A KR 1020190121434A KR 20190121434 A KR20190121434 A KR 20190121434A KR 102500434 B1 KR102500434 B1 KR 102500434B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
gastric cancer
protein
present
lgr5
Prior art date
Application number
KR1020190121434A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210039078A (ko
Inventor
박재명
최명규
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020190121434A priority Critical patent/KR102500434B1/ko
Publication of KR20210039078A publication Critical patent/KR20210039078A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102500434B1 publication Critical patent/KR102500434B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

본 발명은 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명의 표적 펩타이드는 위암세포주에 특이적으로 결합함에 따라 위암의 복강 전이 진단을 위한 임상 분석 및 내시경에서의 이미징 지표로서 사용될 수 있다.

Description

위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브{Peptide probe for diagnosing peritoneal carcinomatosis of gastric cancer}
본 발명은 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브에 관한 것이다.
위암은 주요 공중 위생 문제로, 서구 국가와 한국에서 세 번째로 흔한 암이다. 예후와 생존이 악성 병변의 크기와 단계와 관련되어 있기 때문에 위장관에서 조기 종양 병변의 검출은 치료에 필수적이다.
전-악성 병변의 내시경 선별 및 치료는 위암의 약 80%를 예방한다. 그러나 백색광 내시경 검사는 평가에서 최대 25%의 누락된 비율이 보고되었기 때문에 불완전한 기술이다. 또한, 악성 가능성이 없는 용종이 이익없이 치료되었으나, 환자에게는 추가적인 비용과 위험이 있었다. 내시경 검사가 부적절하다고 알려진 여러 예측변수가 있다. 여기에는 내시경 치료인의 환자 특성 또는 기술이 포함된다. 따라서, 이러한 문제를 극복하기 위해 다양한 첨단 기술이 시도되고있다.
분자 영상은 위장관 내시경 검사의 새로운 원칙으로 등장했다. 분자 이미징은 생체 시스템 내에서 세포 및 세포 내 수준에서 생물학적 과정의 시각화 및 측정으로 정의된다. 표적화된 분자 이미징은 표적 진단을 정량화할 수 있으며, 이는 질병의 진단 및 관리에 사용될 수있다. 현재의 표적화 리간드는 펩타이드, 앱타머, 단백질 또는 항체를 포함한다. 내시경 분자 영상화는 내시경 검사를 통한 분자 특성의 시각화로 정의될 수 있다. 이러한 혁신을 통해 종양 또는 이형성 병변을 찾을 수 있을뿐만 아니라 분자 특성과 특정 분자의 활동 및 종양 거동 및/또는 치료에 대한 반응에 영향을 미치는 생물학적 과정을 시각화할 수 있다. 침습적 치료 또는 감시를 위한 환자의 선택과 함께 점막 변경의 보다 정확한 분류를 위해 분자 이미징 기술이 개발되었다. 또한, 분자 및 기능적 영상 기술은 요법에 대한 새로운 표적 및 요법에 대한 반응에 접근할 새로운 전망을 식별할 수 있다. 내시경 진단의 미래는 바이오마커와 기술의 조합에 의해 영향을 받을 것이다.
Jeong Hoon Lee et al. The Lancet Gastroenterology % Hepatology, vol. 1(2), pp.147-155(2016.10.01)
본 발명의 목적은 파지 디스플레이에 의해 개발된 위암의 복강 전이를 진단할 수 있는 LGR5에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질 표적용 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 LGR5 단백질 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 검체로부터 분리된 생물학적 시료 및 상기 펩타이드를 접촉시켜 LGR5 단백질을 검출하고, 검출된 수준이 비-위암세포 대조군보다 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단하는 단계를 포함하는 위암의 복강 전이 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 검체로부터 분리된 생물학적 시료 및 상기 펩타이드를 접촉시켜 LGR5 단백질을 검출하고, 검출된 수준이 비-위암세포 대조군보다 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단하는 단계를 포함하는 위암의 복강 전이 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 펩타이드를 포함하는 위암에 특이적인 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드; 및 상기 펩타이드와 결합하는 약제학적 활성성분을 포함하는 위암의 복강 전이 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 표적 펩타이드는 위암세포 또는 위암줄기세포 마커에 특이적으로 결합함에 따라 위암의 복강 전이 진단, 약물 전달을 위한 임상 분석 및 내시경에서의 이미징 지표로서 사용될 수 있다.
도 1은 파지 디스플레이에 의해 LGR5 단백질과 결합능이 랜덤 파지의 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 파지 디스플레이에 의해 LGR5 단백질과 결합능이 있는 24번 파지의 위암세포주 표적능에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 파지 디스플레이에 의해 LGR5 단백질과 결합능이 있는 24번 파지의 대장암세포주 표적능에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 파지 디스플레이에 의해 LGR5 단백질과 결합능이 있는 24번 파지에서 획득한 형광 표지 펩타이드의 위암세포주 결합능에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 파지 디스플레이에 의해 LGR5 단백질과 결합능이 있는 24번 파지에서 획득한 형광 표지 펩타이드의 위 및 대장암세포주 결합능에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 형광 표지된 24번 펩타이드의 위암세포주에 대한 결합능에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 경쟁적 저해능 확인을 위한 형광 표지된 24번 펩타이드 및 LGR5 항체의 위암세포주에 대한 결합능에 대한 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 위암 동물 모델에서 형광 표지된 24번 펩타이드의 체내 전달 여부를 확인한 IVIS 영상을 나타낸 것이다.
도 9는 위암 동물 모델에서 형광 표지된 24번 펩타이드 및 대조군 펩타이드의 장간막에 형성된 암과의 결합능을 보여주는 IVIS 영상이다.
도 10은 위암 동물 모델에서 형광 표지된 24번 펩타이드 및 대조군 펩타이드의 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 종양 조직과의 결합능을 보여주는 IVIS 영상이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질 표적용 펩타이드에 관한 것이다.
상기 펩타이드는 파지 디스플레이를 통해 위암세포 또는 위암줄기세포 마커로 알려져 있는 LGR5 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질"은 "폴리펩타이드(polypeptide)" 또는 "펩타이드(peptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 본 발명의 펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 및 이의 기능적 변이체를 포함하는 개념이다. "기능적 변이체"란 위암세포에 결합하는 본 발명의 펩타이드의 성질에는 영향을 미치지 않고 아미노산 위치에서 일부 아미노산의 치환이 발생된 모든 유사한 서열을 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 LGR5 단백질 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 펩타이드는 LGR5에 특이적으로 결합하므로 효소면역분석법(ELISA), 방사면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 방사면역확산법(Radial Immunodiffusion), 샌드위치 ELISA법, 웨스턴 블롯, 면역침전법, 면역조직화학염색법, 면역전기영동법, 오우크테로니 면역확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 면역형광법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR(surface plasmon resonance) 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 통해 LGR5 단백질을 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 펩타이드는 LGR5에 특이적으로 결합하므로 위의 장간막 또는 복강액에서 LGR5 단백질의 발현 수준을 탐지하여 정상세포 또는 비-위암세포 대비 발현 수준이 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다. 일 구체예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 AGS, MKN28, MKN45와 같은 위암세포주에는 훨씬 더 유의적으로 결합하나, 대장암세포주인 HT29, LOVO, DLD-1 세포에 대한 결합능을 확인하였으나 위암세포주와 같은 유의적인 차이는 없었다.
따라서, 본 발명의 펩타이드는 위암세포 또는 위암줄기세포를 표적으로 하는 프로브로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 위암의 복강 전이의 유무를 확인하는 것이다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 펩타이드일 수 있다.
상기 진단용 조성물에는 본 발명의 펩타이드 이외에도 펩타이드 구조 또는 생리활성을 안정하게 유지시켜 주는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있으며, 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃가 유지된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명의 펩타이드가 위암 조직 또는 세포에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예: 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S), 발색단(chromophore), 바이오틴(biotin), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 자기공명영상조영제(예: 수퍼파라마그네틱 산화철(superparamagnetic iron oxides, SPIO), 울트라수퍼파라마그네틱 산화철(ultrasuperparamagnetic iron oxides, USPIO)) 등 일 수 있다. 유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 위암의 복강 전이를 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 복강 내 주사 후 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 위암의 복강 전이로 진단된다. 또한 검출가능한 표지로 방사선 물질을 이용하는 경우에는 양전자단층촬영(Positron emission tomography:PET)으로 펩타이드에 의한 방사능을 관찰하여 위암의 복강 전이를 진단할 수 있다. 이 경우에는 보다 민감하게 위암의 복강 전이의 진단 및 분자영상이 가능할 것이다.
따라서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 위암의 복강 전이 영상화용 조성물은 본 발명의 펩타이드를 함유하여 위암의 복강 전이를 영상화하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물은 반음영부를 영상화하거나 검출 및 정량하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에서, 상기 펩타이드는, 이에 한정되지는 않으나, 발색효소, 방사성동위원소, 발색단(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(superparamagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군 펩타이드와 본 발명의 형광 표지된 표적 펩타이드를 복강 내 주사를 통해 위암 동물 모델에 투여하고 장간막에 생성된 암과의 결합능을 비교한 결과, 형광 표지된 표적 펩타이드의 결합력이 대조군에 비해 훨씬 높았다. 장간막 외에 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 종양 조직을 따로 떼어 낸 후 IVIS 촬영을 진행한 결과, 대조군에서는 종양조직에서 형광 세기가 약하지만 표적 펩타이드를 처리한 종양조직에서는 형광값이 매우 높게 나타났다.
또한, 본 발명의 상기 위암의 복강 전이 진단용 조성물 또는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물은 키트 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 키트에는 상기한 바와 같은 발색효소 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 펩타이드가 포함될 수 있다.
본 발명의 키트에는 본 발명의 펩타이드 이외에 상기 펩타이드와 위암세포 또는 위암줄기세포의 결합 반응을 위한 적당한 완충용액 또는 배지 및 대조군 세포(정상세포, 대장암세포)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 펩타이드의 표지를 위한 검출가능한 표지가 추가로 키트에 포함될 수 있다. 양자택일적으로, 본 발명의 펩타이드에 대한 항체, 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등이 상기 키트에 추가로 포함될 수도 있다. 본 발명의 펩타이드에 대한 항체는 상기 기재한 바와 같이 당업계에 공지된 통상적인 항체의 제조방법에 따라 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 장간막 또는 복강액을 접촉시켜 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 위암세포 또는 위암줄기세포와 펩타이드의 결합을 관찰하여 위암의 복강 전이를 진단할 수 있다.
또한, 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 검체로부터 분리된 생물학적 시료 및 상기 펩타이드를 접촉시켜 LGR5 단백질을 검출하고, 검출된 수준이 비-위암세포 대조군보다 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단하는 단계를 포함하는 위암의 복강 전이 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 검체로부터 분리된 생물학적 시료 및 상기 펩타이드를 접촉시켜 LGR5 단백질을 검출하고, 검출된 수준이 비-위암세포 대조군보다 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단하는 단계를 포함하는 위암의 복강 전이 진단 방법을 제공한다.
상기 "검체"는 분석 대상 개체를 의미하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 분석 대상 개체에서 유래한 것으로, 바람직하게는, 장간막 또는 복강액일 수 있다. 상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "검출"은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하며, 상기 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한없이 수행될 수 있다.
상기 단백질 검출은, 본 발명에서 LGR5 단백질의 존재 여부 검출, 또는 상기 단백질 발현량의 증가 또는 감소를 확인하는 것을 포함하는 의미이다. 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로 본 발명에서 단백질 검출은 효소면역분석법(ELISA), 방사면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 방사면역확산법(Radial Immunodiffusion), 샌드위치 ELISA법, 웨스턴 블롯, 면역침전법, 면역조직화학염색법, 면역전기영동법, 오우크테로니 면역확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 면역형광법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR(surface plasmon resonance) 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의한 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드를 포함하는 위암에 특이적인 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 펩타이드는 위암 치료제와 같은 약물을 위암 조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 위암 치료제와 연결하여 위암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 위암 치료제가 위암세포 또는 위암줄기세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
상기 약물은 이에 한정되지는 않으나, 위암을 치료하는 약물로 허가 받은 약물일 수 있다.
본 발명의 펩타이드와 상기 약물은 공유결합으로 연결될 수 있고, 특히, 링커(Linker)에 의해 연결될 수 있으나, 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드; 및 상기 펩타이드와 결합하는 약제학적 활성성분을 포함하는 위암의 복강 전이 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 펩타이드 단독 또는 펩타이드 및 이와 결합하는 위암 치료물질을 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 위암을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 약제는 종래 위암의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 위암을 치료하는 약물로 허가 받은 독시플루리딘(doxifluridine), 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 에토포사이드(etoposide), 테가푸르(tegafur), 우라실(uracil), 마이토마이신 C(mitomycin C), 에토포사이드(etoposide), 플루오로우라실(fluorouracil), 에피루비신(epirubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 이마티닙(imatinib), 수니티닙(sunitinib), 루코보린(leucovorin), 기메라실(gimeracil), 오테라실(oteracil), 카페시타빈(capecitabine), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 트라스투주맙(trastuzumab), 카페시타빈(capecitabine), 도세탁셀(docetaxel), 이리노테칸(irinotecan), 헵타플라틴(heptaplatin), 에피루비신(epirubicin), 라무시루맙(ramucirumab) 등일 수 있다.
본 발명의 펩타이드와 위암 치료물질의 결합은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있으며, 본 발명의 펩타이드와 위암 치료물질이 직접적으로 결합되거나 또는 매개체를 통하여 간접적으로 결합될 수도 있다. 아울러, 상기 결합은 생체 외에서 수행될 수도 있으나, 본 발명의 펩타이드 및 위암 치료물질은 개별적으로 투여되어 생체 내에서 결합될 수도 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드 또는 위암 치료물질은 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.
본 발명의 펩타이드가 위암세포에 결합되어 위암 치료물질이 적절하게 투여되었는지 여부를 용이하게 확인하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소 등으로 표지된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합되는 위암 치료물질의 양은 결합되는 약제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 위암세포에 충분히 전달되어, 유효한 효과를 보이는 양일 수 있다. 그러나, 약물은 그 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드를 약제와 결합시켜 위암을 치료하기 위한 용도에 따른 본 발명의 펩타이드의 적절한 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 본 발명에 의한 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드는 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 경구 투여 시에는 위장관 내 소화효소에 의한 분해를 방지하기 위하여 본 발명의 펩타이드를 L형 아미노산으로 구성하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비경구 투여로는 피하 주사, 근육내 주사, 정맥 주사 등이 있는데, 바람직하게는 복강내 주사일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 예를 들면, 주사제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington'sPharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 이외에도 본 발명의 조성물에는 일반적인 약학적 조성물에 통상적으로 첨가되는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 포함될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 사람이나 동물에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 주사제의 경우에는, 예컨대 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및/또는 안정화제를 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 약물 투여 방법으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브의 개발
(파지 디스플레이 및 타이터 검증)
LGR5 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 획득하기 위하여 phD.-7 TM phage display peptide library kit를 사용하였으며 이는 ER2738 strain인 대장균(E.coli)와 무작위적으로 결합할 수 있는 2×1013 개의 랜덤 펩타이드를 포함한다. 먼저 96-웰 플레이트에 인간 LGR5 재조합 단백질을 5 mg/mL의 농도로 코팅한 후, 비특이적 결합을 저해하기 위해 3% BSA로 1시간 블록킹을 진행하였다. 블록킹이 끝난 플레이트에 랜덤 라이브러리 펩타이드를 1 mL 처리한 후 1시간 결합시키고 붙지 않은 라이브러리를 제거하기 위하여 TTBS(pH 7.5) 용액으로 충분히 헹궈주었다. 이 후 특이적으로 결합된 라이브러리만 획득하기 위하여 0.2 M 글리신(pH 2.2) 용액을 1 mL 첨가한 후 볼텍싱을 충분히 해주었다. 중화를 위해 150 ㎕의 1 M tris-HCl(pH 9.1) 용액을 첨가하여 주었다. 충분히 중화시킨 후 이를 대장균(E.coli) 배양액과 혼합하여 4시간 동안 라이브러리의 양을 증폭시켰다. 증폭된 라이브러리는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 침지시키고 이는 다음 단백질 패닝의 라이브러리로 사용된다. 위와 같은 과정을 3회 거쳐 결과적으로 LGR5 재조합 단백질에 특이적으로 결합하는 라이브러리의 후보군을 도출하였다.
아웃풋 검증은 최종적으로 도출된 라이브러리를 적정 농도로 희석한 후 isopropyl b-D-1 thiogalactopyranoside(IPTG)와 X-gal 제한 효소가 포함된 배지에 도말함으로써 진행된다. 단백질 패닝의 경우 아웃풋의 범위는 102에서 105 내로 나타났다.
(ELISA 분석)
Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 분석을 위해 96-웰 플레이트에 5 mg/mL의 농도로 LGR5 단백질과 BSA로 코팅한 후 블록킹을 진행하고 이 후 랜덤으로 선택된 48개의 파지를 각각 처리하였다. 처리 24시간 이후 충분히 헹궈주고 항-M13 항체-HRP를 100 ㎕씩 처리하였다. 반응하지 않은 항체를 제거하기 위해 헹궈주고 반응 용액으로 TMB를 15 분간 처리하였다. 이후 색의 변화를 관찰하고 충분히 반응이 이뤄졌다고 생각되면 반응정지액으로 H2SO4 용액을 처리하였다. 이후 420 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
(펩타이드 시퀀싱 및 합성)
총 3회의 단백질 패닝의 마지막 아웃풋 라이브러리에서 48개의 콜로니를 무작위적으로 뽑아 대장균(E.coli)을 이용하여 농도를 증폭시킨 후 ssDNA를 획득하기 위하여 요오드 완충용액(iodide buffer)을 이용하여 용출시켰다. 이 후 250 ㎕의 100% 에탄올을 추가하고 20분간 상온에서 반응시킨 후 14,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 70% 에탄올로 DNA 펠렛을 헹궈주었다. 마지막으로 증류수에 용출시켜준 후 시퀀싱하였다. 시퀀싱에 사용되는 가이드 프라이머는 5‘ - CCC TCA TAG TTA GC TAA C- 3’ (-96 gⅢ) 와 5‘ - GTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C - 3’ (-28 gⅢ) 가 사용된다. 이 후 ExPASy의 translate tool 과 reverse complement bioinformatics tool을 이용하여 최종 펩타이드 서열을 확인하였다.
최종 확인된 펩타이드 서열은 IPQILSI 서열의 7-mer 서열로 확인되었으며 Peptron Co.에 의뢰하여 합성하였다. 이후 인 비트로 및 인 비보 실험을 위하여 펩타이드의 N-말단에 Fluorescein isothiocyanate(FITC)와 cyanine 5.5(cy5.5) dye를 결합시켰으며 HPLC를 통해 순도 95% 이상의 펩타이드를 선택적으로 사용하였다.
(세포 배양 및 세포 결합능 확인)
본 발명에서 사용된 세포는 인간 위암세포로서 AGS, MKN28, MKN45 가 사용되었으며 추가적인 검증을 위하여 대장암 세포인 LoVo, HT29, SW480, DLD-1 세포가 사용되었다. 비교를 위해 대조군 세포로 CCD841 대장 섬유아세포를 선택하였으며 이는 MEM 배지에서 배양하였으며 나머지 세포는 RPMI 배지를 이용하였다. 이 후 LGR5 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 각 위암 및 대장암 세포로의 결합력을 확인하기 위하여 면역화학염색 및 유세포 분석을 진행하였다.
먼저 세포를 8-웰 챔버 슬라이드에 적당한 수로 씨딩한 후 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 비특이적 결합을 막기 위해 3% BSA를 처리하고 이 후 FITC가 라벨링 된 펩타이드를 10 μM 의 농도로 각 웰에 1시간 가량 처리해주었다. 이 후 0.05% PBST(Triton X-100)로 충분히 헹궈준 후 핵 염색을 위해 DAPI 추가 염색을 진행하고 마운팅하였다. 슬라이드는 약 200배의 배율로 현미경을 통해 관찰되었으며 각 세포 간의 형광 노출 시간은 동일하게 진행하였다. 동일한 원리로 고정시키지 않은 세포의 결합력을 확인하기 위해 유세포 분석을 추가로 진행하였다. 세포를 트립신 처리로 떼어낸 후 원심분리하여 펩타이드를 처리하기 용이하게 준비한다. 각 세포에 3% BSA로 블록킹 후 10 μM FITC가 표지된 펩타이드를 10 μM의 농도로 처리하여 배양하였다. 이 후 원심분리하고 1% BSA에 용출시킨 후 유세포 분석기를 통해 분석하였다.
(펩타이드의 경쟁적 저해)
본 발명의 펩타이드와 기존 개발된 LGR5 항체의 세포 결합 세기를 비교하기 위해 경쟁적 저해능을 진행하였다. 위암세포주인 MKN45 세포주를 8웰 챔버에 씨딩한 후 4% 파라포름알데히드로 24시간 고정시킨 후 FITC가 표지된 펩타이드, 기존 LGR5 항체, 펩타이드와 항체를 섞어서 각각 처리하였다. 이 후 분석을 위해 형광현미경을 통해 200배의 배율로 확인하였다.
대조군 펩타이드는 2008년 nature medicine 에 게재된 Thomas D Wang 교신저자의 논문(https://www.nature.com/articles/nm1692)에서 사용된 대조군 펩타이드인 QLMRPPV 서열을 사용하였다.
(위암 복강 전이 동물 모델)
인 비트로 실험 데이터를 기반으로 더 나아가 인 비보에서의 펩타이드의 결합능을 확인하기 위해 위암세포주로 복강 전이 모델을 만들었으며 8주령의 수컷 Balb/c nude 마우스를 사용하였다. 먼저 GFP-MKN45 세포를 각 마우스에 1×107 의 세포수가 되도록 1×PBS에 희석한 후 복강을 통해 주입해주었으며 약 2주 이후 위암 복강 전이 모델을 확립하였다. GFP-MKN45 세포는 가톨릭대학교 임향숙 교수팀에서 제공받아 사용되었으며 이 후 동물실험은 가톨릭대학교 실험동물센터의 관리 하에 진행되었고 AAALAC 가이드라인을 준수하여 진행하였다.
(동물 모델 이미징)
본 발명의 펩타이드의 표적능을 확인하기 위해 완성된 위암 복강 전이 모델에 cy5.5가 표지된 펩타이드를 주입한 후 형광을 측정하였다. 총 2개의 그룹으로 진행되었으며 본 발명의 펩타이드를 복강 주입해준 그룹(n=5)과 대조군 그룹(n=4, 1마리는 실험 도중 몸무게의 급격한 감소로 안락사 진행)으로 구성하였다. 펩타이드는 10 μM 농도로 1 mL의 1×PBS에 희석한 후 복강 주사를 통해 주입하였으며 1시간 동안 체내 반응 후 이미징 분석을 실시하였다. 480 nm에서 520 nm의 파장대의 형광(green)을 통해 마우스 체내 GFP-MKN45 세포의 복강 내 분포 및 종양 형성 정도를 확인하였으며 620 nm에서 680 nm의 파장대(red)의 형광으로 각 펩타이드의 표적능을 추가로 확인하였다. 이 후 안락사를 진행하여 마우스의 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 장간막, 종양 조직에서의 펩타이드 형광분포를 확인하였다. 이미징 촬영은 각 장기에 비특이적으로 결합된 펩타이드의 제거를 위해 1×PBS로 충분한 세척 과정을 거친 후 진행하였다.
<실험예 1> ELISA 결과
파지 디스플레이를 통해 획득한 총 48개의 랜덤 파지 중 LGR5 단백질에 결합능이 높은 파지를 선택적으로 분리하기 위하여 ELISA를 진행하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 총 4개의 파지가 LGR5 단백질에 대한 결합능이 높게 나타났으며 본 발명은 그중에서 24번 파지를 선택하여 추후 실험에 사용하였다. 나머지 파지 후보군인 16번, 22번과 23번 파지에 대한 실험도 추가적으로 진행되었으나 이 후 다른 실험 결과에서 24번 파지의 결과에 미치지 못하여 최종적인 후보군에서 제외되었다.
<실험예 2> 면역화학염색 결과
선택된 24번 파지의 위암세포에 대한 표적능을 육안으로 확인하기 위하여 면역화학염색을 실시하였다. 위암세포로는 AGS, MKN28, MKN45를 사용하였으며 대조군세포로 CCD18Co 대장 섬유아세포를 사용하였다.
그 결과, 도 2 및 3에 나타난 바와 같이, CCD18Co 세포에는 높게 결합하지 않으나 AGS, MKN28, MKN45와 같은 위암세포주에는 훨씬 더 유의적으로 결합하는 것을 확인하였다. 추가로 대장암에 대한 반응성을 확인하기 위하여 대장암세포주인 HT29, LOVO, DLD-1 세포에 대한 결합능을 확인하였으나 위암세포주와 같은 유의적인 차이는 없었다.
이후 24번 파지의 DNA 서열을 근거로 펩타이드 합성을 진행하였으며 N-말단에 FITC를 표지하였다. FITC가 표지된 합성 펩타이드의 결합능을 면역화학염색을 통해 확인하였으며 마찬가지로 위암세포주에 처리하였을 때 대조군 세포보다 유의적으로 결합하는 것을 확인하였다. 또한, 대조군 펩타이드의 결합능을 확인하였으나 이는 모든 위암세포주와 대장암세포주에서 유의적인 변화가 없는 것을 확인할 수 있었으며 이를 근거로 동물실험에도 같은 대조군 펩타이드로 동일하게 사용하였다(도 4 및 도 5).
<실험예 3> 유세포 분석
표지된 펩타이드의 위암세포주에 대한 결합력을 한 번 더 확인하고자 유세포 분석을 실시하였으며 이는 세포를 고정시키지 않고 살아있는 상태로 진행되었다. 대조군 세포인 CCD841 세포와 위암세포주인 AGS, MKN28, MKN45에 합성된 펩타이드를 10 μM의 농도로 처리하여 펩타이드와 결합된 세포의 수를 계수하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 훨씬 더 많은 세포가 형광이 표지된 표적 펩타이드와 결합한 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> 경쟁적 저해능 확인 결과
표적 펩타이드와 기존에 사용되는 LGR5 항체간의 결합성 차이를 확인하기 위해 면역화학염색을 진행하였다. 표적 펩타이드만 처리한 그룹과 항체만 처리한 그룹, 그리고 펩타이드와 항체를 섞은 후 함께 처리한 그룹으로 나누어 진행하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 항체보다 표적 펩타이드가 MKN45 위암세포주에 먼저 선점적으로 결합하여 항체의 결합능이 떨어지는 것을 확인하였다.
<실험예 5> 인 비보 실험 결과
마우스 체내에서의 종양 생성 및 표적 펩타이드의 결합능을 확인하기 위하여 위암 복강 전이 모델을 확립하였다. GFP-MKN45 세포주를 복강에 주입한 후 종양 생성을 유도하고 이 후 표적 펩타이드 및 대조군 펩타이드를 복강 내 주입함으로써 펩타이드 간 종양으로의 결합능을 in vivo imaging system(IVIS)을 통해서 비교하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, GFP-MKN45 세포의 주입을 통해 복강 내 종양 생성이 잘 되었음을 확인하였고 cy5.5가 표지된 펩타이드의 주입 또한 복강 내로 잘 전달되었음을 확인하였다.
대조군 펩타이드와 표적 펩타이드의 체내 주입 후 장간막에 생성된 암과의 결합능을 비교하였다. 각 마우스 마다 장간막을 채취한 후 비특이적인 결합을 제거하기 위해 1×PBS로 충분히 헹궈준 후 IVIS 촬영을 진행하였다. 그 결과, 표적 펩타이드의 결합력이 대조군에 비해 훨씬 높은 것을 확인하였다(도 9).
장간막 외에 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 종양 조직을 따로 떼어 낸 후 IVIS 촬영을 진행하였다. 그 결과, 대조군에서는 종양조직에서 형광 세기가 약하지만 표적 펩타이드를 처리한 종양조직에서는 형광값이 매우 높게 나타났다(도 10).
이러한 결과를 바탕으로 본 발명의 표적 펩타이드가 위암세포주에 특이적으로 결합함에 따라 향후 임상 분석 및 내시경에서의 이미징 지표로서 사용될 수 있는 가능성을 확인하였다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Peptide probe for diagnosing peritoneal carcinomatosis of gastric cancer <130> P19U11C0510 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide probe of LGR5 protein <400> 1 Ile Pro Gln Ile Leu Ser Ile 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control peptide probe <400> 2 Gln Leu Met Arg Pro Pro Val 1 5 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 96 gIII primer <400> 3 ccctcatagt tagctaac 18 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28 gIII primer <400> 4 gtatgggatt ttgctaaaca ac 22

Claims (10)

  1. 삭제
  2. SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어진 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질 표적용 펩타이드를 포함하는 LGR5 단백질 검출용 조성물.
  3. SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어진 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질 표적용 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 진단용 조성물.
  4. SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어진 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질 표적용 펩타이드를 포함하는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 발색단(chromophore), 발광물질, 형광물질, 상자성입자(superparamagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것인, 포함하는 위암의 복강 전이 영상화용 조성물.
  6. 검체로부터 분리된 생물학적 시료 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어진 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질 표적용 펩타이드를 접촉시켜 LGR5 단백질을 검출하고, 검출된 수준이 비-위암세포 대조군보다 높은 경우 위암의 복강 전이로 진단하는 단계를 포함하는 위암의 복강 전이 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    생물학적 시료는 장간막 및 복강액을 포함하는, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    단백질 검출은 효소면역분석법(ELISA), 방사면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 방사면역확산법(Radial Immunodiffusion), 샌드위치 ELISA법, 웨스턴 블롯, 면역침전법, 면역조직화학염색법, 면역전기영동법, 오우크테로니 면역확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 면역형광법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법, SPR(surface plasmon resonance) 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의한 것인, 방법.
  9. 삭제
  10. SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어진 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질 표적용 펩타이드; 및
    상기 펩타이드와 결합하는 약제학적 활성성분을 포함하는 위암의 복강 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물.
KR1020190121434A 2019-10-01 2019-10-01 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브 KR102500434B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190121434A KR102500434B1 (ko) 2019-10-01 2019-10-01 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190121434A KR102500434B1 (ko) 2019-10-01 2019-10-01 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210039078A KR20210039078A (ko) 2021-04-09
KR102500434B1 true KR102500434B1 (ko) 2023-02-16

Family

ID=75444203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190121434A KR102500434B1 (ko) 2019-10-01 2019-10-01 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102500434B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022240157A1 (ko) * 2021-05-11 2022-11-17 가톨릭대학교 산학협력단 암 특이적인 폴리펩티드 및 이의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017526618A (ja) 2014-06-11 2017-09-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ＬｇＲ５抗体及びその使用
WO2017161414A1 (en) 2016-03-22 2017-09-28 Bionomics Limited Administration of an anti-lgr5 monoclonal antibody

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106536556B (zh) * 2014-04-04 2020-02-07 生态学有限公司 结合lgr5的人源化抗体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017526618A (ja) 2014-06-11 2017-09-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ＬｇＲ５抗体及びその使用
WO2017161414A1 (en) 2016-03-22 2017-09-28 Bionomics Limited Administration of an anti-lgr5 monoclonal antibody

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI Reference Sequence: WP_034351957.1, sulfotransferase [Comamonas thiooxydans](2018.11.09.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210039078A (ko) 2021-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10124077B2 (en) Plectin-1 targeted agents for detection and treatment of pancreatic ductal adenocarcinoma
US7910693B2 (en) Prostate cancer diagnosis and treatment
US20220175977A1 (en) Compounds and methods for the detection of trpv-6 cancers and drug delivery
US9486545B2 (en) Method of screening for colon cancer using biomarkers
TWI494566B (zh) 膀胱癌特異性配體肽
Guan et al. Polyethylene glycol-conjugated HER2-targeted peptides as a nuclear imaging probe for HER2-overexpressed gastric cancer detection in vivo
KR102500434B1 (ko) 위암의 복강 전이 진단용 펩타이드 프로브
EP3611181A1 (en) Atp1a1-targeting polypeptide and use
KR101757176B1 (ko) 대장암 검출을 위한 펩타이드 프로브
EP4075141A2 (en) Method for predicting reactivity to drug targeting bcl2 family protein

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant