KR102498763B1 - 여주 발효물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 여주 발효물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 여주 발효물 또는 이로부터 분리된 신규 화합물은 티로시나아제 저해 활성과 멜라닌 생합성 저해율이 우수하므로, 피부 미백 개선을 위한 화장료 또는 식품이나 멜라닌 색소 침착 질환의 치료를 위한 치료제의 소재로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

여주 발효물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물{Composition for improving skin whitening comprising fermented product of Momordica charantia or compound isolated therefrom as effective componenet}
본 발명은 여주 발효물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.
멜라닌은 머리카락 및 피부의 색상을 결정하는 주요 인자로, 자외선으로부터 피부세포를 보호하는 역할을 하지만 과도한 멜라닌의 축적은 주근깨 또는 기미 등과 같은 과다 색소 침착 현상을 유발한다. 표피층의 기저층(basal layer)에 존재하는 멜라닌 형성 세포는 멜라노솜이라고 불리는 특정한 구조를 가지고 있으며, 이곳에서 멜라닌 형성 효소(melanogenic enzyme)의 작용으로 인해 멜라닌이 생성된다. 멜라닌은 검은색 및 갈색계열의 유멜라닌(eumelanin)과 노란색 및 붉은계열의 페오멜라닌(pheomelanin)이 있으며, 멜라닌의 합성은 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 티로신(tyrosine)이 도파(DOPA) 및 도파 퀴논(DOPA quinone)으로 전환되면서 시작된다.
또한, TRP-2(tyrosinase-related protein 2)는 도파 크롬(DOPA chrome)을 5,6-디히드록시인돌-2-카복실산(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)으로, TRP-1은 인돌-5,6-퀴논-2-카복실산(indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid)으로 산화반응을 촉매하며, 유멜라닌 합성에 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-1 및 TRP-2가 관여하고 있다. 또한, 멜라닌 형성의 조절인자로 잘 알려진 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)는 나선-고리-나선-루신 지퍼(helix-loop-helixleucine zipper) 구조를 가진 전사인자로서 멜라닌 형성을 통해 흑화과정과 세포의 증식 및 생존을 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 멜라닌 생합성에 관여하는 인자로는 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone), 부신피질자극호르몬(adrenocorticotropic hormone), PGE2(prostaglandine E2) 등이 있으며, cAMP를 통해 멜라닌 합성을 조절하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 피부 미백과 관련하여 멜라닌 생성의 주요 인자들의 활성 저해와 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재 합성 항산화제로 사용되는 코직산, 비타민 유도체, 알부틴, BHT(dibutylated hydroxytoluene) 등은 가격이 저렴하고 항산화 활성이 우수하여 미백 효과를 나타내지만, 과다 사용하게 되면 질병을 유발하여 안전성에 문제점이 있는 것으로 보고되고 있어 사용량을 규제하고 있다. 따라서, 연구 수준의 발달 및 기술력 증가로 생화학적 효능을 가진 소재들을 개발하기 위해 국내외적으로 천연물로부터 기능성 성분의 소재를 발굴하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 한국공개특허 제2016-0016195호에 '여주 추출물로부터 분획되는 에틸 아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항노화용 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0094832호에 피부 노화 방지, 항산화, 피부 주름 개선 또는 피부 미백 효과가 있는 '여주 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 이를 위한 여주 열매 추출물의 제조 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 여주 열수추출물을 양송이 균사체로 발효시킨 '여주 발효물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 여주 열수추출물에 양송이 분쇄물의 여과액을 첨가하여 발효시킨 여주 발효물과 상기 여주 발효물의 분획물로부터 분리된 화합물(화학식 1 내지 3)이 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성과 멜라닌 생합성 저해율이 우수한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 또는 화학식 1 내지 3 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 여주 발효물;을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 또는 화학식 1 내지 3 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 여주 발효물;을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 또는 화학식 1 내지 3 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 여주 발효물;을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 여주 발효물 또는 이로부터 분리된 신규 화합물은 티로시나아제 저해 활성과 멜라닌 생합성 저해율이 우수하므로, 피부 미백 개선을 위한 화장료 또는 식품이나 멜라닌 색소 침착 질환의 치료를 위한 치료제의 소재로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 여주 열수추출물과 여주 발효물의 에틸아세테이트 분획물(EtOAc)을 대상으로 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 수행한 결과이다. 빨간색 화살표: EtOAc 분획물에서 분리된 APM-1 화합물(tR 11.6 min), APM-2 화합물(tR 9.2 min) 및 APM-4 화합물(tR 7.3 min).
도 2는 여주 열수추출물, 여주 발효물, 여주 발효물의 분획물(n-Hexane layer, EtOAc layer, n-BuOH layer, H2O layer) 또는 이로부터 분리된 화합물(APM-1, APM-2, APM-4)의 세포 독성을 확인한 결과이다. Arbutin(알부틴): 양성대조군.
도 3A는 여주 열수추출물, 여주 발효물 또는 여주 발효물의 분획물(n-Hexane layer, EtOAc layer, n-BuOH layer, H2O layer)의 세포 내 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성을 확인한 결과이고, 도 3B는 여주 발효물의 에틸아세테이트 분획물(EtOAc)로부터 분리된 APM-1(화학식 1), APM-2(화학식 2) 또는 APM-4(화학식 3) 화합물의 세포 내 티로시나아제 저해 활성을 확인한 결과이다. Nor: 자외선 비조사군(시료 무처리). Cont: 자외선 조사군(시료 무처리), α-MSH: 멜라닌 생성 촉진제(α-Melanocyte-stimulating hormone), Arbutin(알부틴): 양성대조군.
도 4A는 여주 열수추출물, 여주 발효물 또는 여주 발효물의 분획물(n-Hexane layer, EtOAc layer, n-BuOH layer, H2O layer)의 세포 내 멜라닌 생합성 저해율을 확인한 결과이고, 도 4B는 여주 발효물의 에틸아세테이트 분획물(EtOAc)로부터 분리된 APM-1(화학식 1), APM-2(화학식 2) 또는 APM-4(화학식 3) 화합물의 세포 내 멜라닌 생합성 저해율을 확인한 결과이다. Nor: 자외선 비조사군(시료 무처리). Cont: 자외선 조사군(시료 무처리), α-MSH: 멜라닌 생성 촉진제(α-Melanocyte-stimulating hormone), Arbutin(알부틴): 양성대조군.
도 5는 Melanoma 세포주인 B16F10 세포에 여주 발효물의 에틸아세테이트 분획물(EtOAc)로부터 분리된 APM-2(화학식 2) 화합물을 처리한 후 멜라닌 합성에 관여하는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), TRP-1(tyrosinase related protein 1), TRP2 및 Tyrosinase의 발현 수준을 확인한 결과이다. Nor: 자외선 비조사군(시료 무처리). Cont: 자외선 조사군(시료 무처리), α-MSH: 멜라닌 생성 촉진제(α-Melanocyte-stimulating hormone), Arbutin(알부틴): 양성대조군.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 또는 하기 화학식 1 내지 3 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 여주 발효물;을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
Figure 112021014081023-pat00001
Figure 112021014081023-pat00002
Figure 112021014081023-pat00003
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 여주 발효물로부터 분리된 것일 수 있고, 바람직하게는 여주 발효물의 에틸아세테이트 분획물(Ethly acetate, EtOA)로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니며, 다른 천연물로부터 추출하거나 합성하는 것이 얼마든지 가능하다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 C12H8O6의 분자식을 갖는 Monaspilosuslin 화합물이다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 여주 발효물은 여주 열수추출물을 양송이(Agaricus bisporus) 균사체로 발효시킨 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 양송이 균사체는 양송이 분쇄물과 증류수의 혼합물을 여과하여 수득한 여과액을 의미하는 것일 수 있고, 상기 여과액에는 폴리페놀 산화효소(polyphenol oxidase)가 포함되어 있다.
본 발명의 여주 발효물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 티로시나아제 저해 활성과 멜라닌 생합성 저해율이 우수하여 피부 미백 개선에 효과가 있다.
본 발명의 여주 발효물 또는 이의 분획물을 50~100 μg/㎖ 농도로 처리하거나, 여주 발효물의 분획물로부터 분리된 화합물(화학식 1 내지 3)을 20~30 uM 농도로 처리할 경우 세포 내 티로시나아제 저해 활성, 멜라닌 생합성 저해율, 멜라닌 합성에 관여하는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor), TRP-1(tyrosinase related protein 1), TRP2 및 Tyrosinase의 발현 수준을 감소시키는 효과가 우수하다.
본 명세서에서, 상기 "이의 허용 가능한 염"은 본 발명 화합물의 생물학적 특성을 유지하면서 독성을 나타내지 않거나 제약 용도로 부적절하지 않은 임의의 본 발명 화합물의 염을 나타낸다. 이러한 염은 당업계에 공지된 다양한 유기 및 무기 반대이온으로부터 유래할 수 있으며, 이들을 포함한다. 이러한 염으로는 유기 또는 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 술팜산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 프로피온산, 헥산산, 시클로 펜틸프로피온산, 글리콜산, 글루타르산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 소르브산, 아스코르브산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일)벤조산, 크르산, 신남산, 만델산, 프탈산, 라우르산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄-디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠 술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-톨루엔술폰산, 캄포르산, 캄포르술폰산, 4-메틸비시클로 [2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 테르트-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 시클로헥실술팜산, 퀸산 또는 뮤콘산 등과 형성된 산 부가염; 또는 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온(예를 들면, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온 또는 알루미늄 이온), 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속수산화물(예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 리튬, 아연 및 바륨 수산화물), 암모니아로 치환되거나, 또는 유기 염기, 예컨대 지방족, 지환족 또는 방향족 유기 아민, 예를 들면 암모니아, 메틸아민, 디메틸아민, 디에틸아민, 피콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 에틸렌디아민, 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린, N,N'-디벤질에틸렌-디아민, 클로로프로카인, 디에탄올아민, 프로카인, N-벤질페네틸아민, N-메틸글루카민 피페라진, 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 또는 테트라메틸암모늄 히드록시드와 배위 결합한 경우에 형성된 염 등을 포함할 수 있다.
또한, 염의 예로는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 또는 테트라알킬암모늄 염 등이 있으며, 화합물이 염기성 관능기를 함유하는 경우에는 비독성유기산 또는 무기산과의 염, 예컨대 히드로할라이드(예를 들면, 히드로클로라이드 또는 히드로브로마이드), 술페이트, 포스페이트, 술파메이트, 니트레이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 프로피오네이트, 헥사노에이트, 시클로펜틸프로피오네이트, 글리콜레이트, 글루타레이트, 루베이트, 락테이트, 말로네이트, 숙시네이트, 소르베이트, 아스코르베이트, 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르타레이트, 시트레이트, 벤조에이트, 3-(4-히드록시벤조일푸마레이트, 타르타레이트, 시트레이트, 벤조에이트, 3-(4-히드록시벤조일)벤조에이트, 피크레이트, 신나메이트, 만델레이트, 프탈레이트, 라우레이트, 메탄술포네이트 메실레이트), 에탄술포네이트, 1,2-에탄-디술포네이트, 2-히드록시에탄술포네이트, 벤젠술포네이트(베실레이트), 4-클로로벤젠술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 4-톨루엔술포네이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 4-메틸비시클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실레이트, 글루코헵토네이트, 3-페닐프로피오네이트, 트리메틸아세테이트, 테르트-부틸아세테이트, 라우릴 술페이트, 글루코네이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 히드록시나프토에이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 시클로헥실술파메이트, 퀴네이트 또는 뮤코네이트 염 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 파운데이션 및 스프레이 중에서 선택된 어느 하나의 제형인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 스킨, 스킨 소프트너, 스킨 토너, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징워터, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 담체와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 상기 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 상기 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 상기 화학식 1 내지 3 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 여주 발효물;을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 여주 발효물의 분획물에서 분리된 것으로, 여주 발효물 또는 이로부터 분리된 화합물은 상기 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 용어, '미백'이라 함은 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시키는 것을 말한다. 피부의 과다 색소 침착은 주근깨, 기미, 자외선 노출 후 과다 색소 침착, 염증 후 과다 색소 침착, 노인흑색점, 갈색반점 또는 검버섯 등을 포함한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 티로시나아제 저해 활성과 멜라닌 생합성 저해율이 우수한 본 발명의 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 여주 발효물을 유효성분으로 포함하고 있어, 피부 미백 개선에 효과가 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 이너뷰티 푸드(inner beauty food)의 형태로 섭취함으로써 더욱 우수한 효과를 갖는 장점을 가진다. 상기 이너뷰티는 '먹는 화장품 또는 뷰티 푸드'로 일컬어지는 푸드로, 피부에 좋은 여러 가지 성분을 몸속으로 흡수시켜 피부 체질을 건강하게 바꾸는 식품을 지칭하며, 피부 타입에 맞는 화장품을 고르듯 피부 컨디션과 라이프스타일을 고려해 개개인에게 맞는 이너뷰티 푸드를 선택하여 섭취할 수 있다. 전술한 화장료 조성물을 포함하는 화장품과 본 발명의 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 여주 발효물을 포함하는 이너뷰티 푸드를 혼용할 경우, 화장품만 사용하는 것에 비해 피부 미백 개선 효과가 월등히 높아져 더욱 효과적인 피부의 미백 개선 효과를 볼 수 있는 장점을 가진다.
본 발명의 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 여주 발효물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 본 발명의 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 여주 발효물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 상기 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예를 들어, 사과, 배, 포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토쥬스 등), 식혜 등을 포함한다.
본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 저해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 상기 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 상기 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 상기 화학식 1 내지 3 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 여주 발효물;을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 여주 발효물의 분획물에서 분리된 것으로, 여주 발효물 또는 이로부터 분리된 화합물은 상기 전술한 바와 같다.
본 명세서에서, 용어 "멜라닌 색소 과다 침착(hyperpigmentation)"은 피부 또는 손·발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 것을 의미한다. 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른흑피증(cyanic melasma), 약물 사용 후의 과다 색소 침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 또는 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 피부 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물이 멜라닌 색소 과다 침착 질환을 치료 또는 예방을 위해 적용되는 점을 감안하면, 피부에 국소적으로 도포되어 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 주사제, 크림, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효량의 화합물(상기 화학식 1 내지 3) 또는 상기 화합물을 포함하는 여주 발효물을 포함할 때 바람직한 피부 미백 개선 효과를 제공할 수 있다. 본 발명에 있어서, '유효량'이라 함은 색소 침착을 억제하는 효과를 나타낼 수 있는 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 여주 발효물의 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 여주 발효물의 유효량은 조성물이 제품화되는 형태, 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 여주 발효물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물 또는 상기 화합물을 포함하는 여주 발효물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 여주 발효물 제조
(주)두손애약초에서 구입한 건조된 여주 4.5 kg을 물 45 L에 침지하고 90℃에서 3시간 동안 추출한 후 저온감압농축하여 여주 열수추출물 농축액 1.5 kg을 수득하였다. 또한, 여주 열수추출물의 효소 반응을 위해 양송이(Agaricus bisporus) 40 g을 증류수 100 ㎖과 혼합하여 믹서기로 분쇄하고 5겹 거즈로 필터링하여 폴리페놀 산화효소(polyphenol oxidase)가 함유된 효소원을 제조하였다. 상기 제조된 효소원(60 ㎖)의 폴리페놀 산화효소 활성을 측정하기 위해 피로갈롤(pyrogallol)을 기질로 사용하여 산화 반응 후 생성되는 벤조트로폴론(benzotropolone)의 함량을 UV 분광광도계로 360 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 흡광도값이 0.78~0.79인 효소원을 여주 열수추출물의 효소 반응에 사용하였다. 흡광도는 효소원 1.5 ㎖을 200 mM 피로갈롤(in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2) 1.5 ㎖과 함께 석영셀에 넣고 5분 동안 산화 반응을 유도한 후 측정하였으며, Blank군에는 1.5 ㎖의 기질 용액과 증류수 1.5 ㎖을 첨가하여 측정하였다(Food Chemistry, 88, 2004, 69-77 및 BBRC, 130(2), 1985, 633-639 참고).
그 다음, 여주 열수추출물 농축액 15 g을 증류수 40 ㎖에 희석하고 효소원 60 ㎖과 함께 500 ㎖의 비커에 담은 후 교반기를 이용하여 상온에서 80분 동안 반응시킨 후 감압농축하여 여주 발효물을 제조하였다.
실시예 1. 여주 발효물로부터 화학식 1 내지 3의 화합물 분리
여주의 효소 반응 실험을 36회 반복 수행하였으며, 생산된 여주 발효물 750 g을 10% 메탄올(MeOH) 2 ℓ에 희석한 후 n-헥산(hexane, 2 ℓ×3회), 에틸아세테이트(EtOAc, 2 ℓ×3회) 및 n-부탄올(BuOH, 2 ℓ×3회)를 이용하여 분획하여 추출한 후 상기 각 용매별 분획물을 저온감압농축하고 건조시켜 n-hexane 분획물 0.2 g, EtOAc 분획물 3.3 g, n-BuOH 분획물 17.3 g 및 H2O 분획물 540.9 g을 얻었다.
그 다음, 티로시나아제 저해 활성과 멜라닌 생합성 저해율이 우수한 EtOAc 분획물의 가용부 2.3 g을 Toyopearl HW-40 column(2.5 cm i.d.×42 cm)을 이용하여 H2O/MeOH의 MeOH 함량을 높이면서 칼럼크로마토그래피를 수행하여 EMC01~EMC06 소분획을 얻었다. YMC Pack ODS A-302 column(4.6 cm i.d.×150 mm, 5 ㎛)을 충진제로 이용한 칼럼크로마토그래피를 수행하여 소분획물 EMC02 171.4 mg으로부터 APM-1(tR 11.6 min, 19.7 mg) 및 APM-2(tR 9.2 min, 16.3 mg) 화합물을 얻었으며, 상기와 같은 방법을 이용하여 소분획물 EMC01로부터 APM-4(tR 7.3 min, 13.4 mg)을 수득하였다(도 1). 이동상은 0.1% 포름산(formic acid, solvent A)과 아세토나이트릴(acetonitrile, solvent B)을 사용하였으며, 구배 용출(gradient elution)을 100% solvent A로 분석하여 30 min, 0% A; 100% B의 용매 조성으로 물질을 분석하였고, 이동상의 유속은 1.0 ㎖/min을 유지하여 280 nm에서 화합물을 검출하였다(표 1).
Figure 112021014081023-pat00004
실시예 2. 여주 발효물로부터 분리된 화학식 1 내지 3 화합물의 구조결정
상기 여주 발효물의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 화합물은 분광화학적 및 구조 분석을 통해 화학식 1로 표시되는 Monaspilosuslin 화합물과 화학식 2 및 3으로 표시되는 신규 화합물로 결정하였다.
2-1. 화학식 1(Monaspilosuslin)
화합물 1은 갈색 무결정형 분말상 형태로 화합물을 얻었으며, FABMS 측정 결과 m/z 323 [M+Na]+의 base peak를 확인하여 분자량을 추정하였다. 1H NMR 스펙트럼에서 trans-olefin에 해당하는 시그널이 δ 7.85 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8) 및 6.23 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7)이 측정되었고, 한 개의 이중결합에 해당하는 singlet proton이 δ 5.77 (1H, s, H-10)에서 관찰되었다. 또한 한 개의 oxygenated methine δ 4.09 (1H, m, H-3), 한 개의 hydroxymethyl기 δ 3.70 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-13), 3.63 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-13), 두 개의 methylene group δ 2.00 (1H, m, H-2), 1.80 (1H, m, H-4), 1.78 (1H, m, H-2), 1.77 (1H, m, H-4)이 관찰되었으며, 3개의 methyl기가 δ 1.96 (3H, s, H-14), 1.08 (3H, s, H-12), 0.86 (3H, s, H-11)에서 관찰되었다. 13C NMR 및 HSQC 스펙트럼에서 한 개의 carbonyl기가 δ 173.3 (C-15)에서 관찰되었고, trans-olefin, oxygenated methine, hydroxymethyl, methyl 등의 시그널이 관찰되었다. 1H-1H COSY, HMBC 및 NOESY 등의 2D NMR 측정결과 화합물 1은 Monascus pilosus 미생물을 이용하여 발효시킨 쌀에서 분리된 sequiterpene 화합물인 monaspilosuslin 화합물으로 구조 결정하였다.
2-2. 화학식 2(New)
화합물 2는 노란색의 무결정형 분말상 형태로 화합물을 수득하였으며, UV 스펙트럼에서 227 및 291 nm의 최대 흡광도를 나타내어 γ-lactone 골격임을 시사하였다. HRFABMS 스펙트럼에서 m/z 143.0344 [M+H]+의 base peak를 확인하여 분자량을 추정하였으며, 분자식은 C6H7O4로 확인하였다. 1H NMR 스펙트럼에서 한 개의 이중결합에 해당하는 proton 시그널이 δ 7.91 (1H, s, H-6)에서 관찰되었으며, 한 개의 methyl기가 δ 2.27 (3H, s, H-7)에서 관찰되었다. 13C NMR 및 HSQC 스펙트럼에서 한 개의 carbonyl carbon 시그널이 δ 168.5 (C-2)에서 관찰되었으며, 5개의 이중결합 carbon 시그널과 함께 한 개의 methyl기가 δ 13.8 (C-7)에서 관찰되었다. Key HMBC 스펙트럼에서 H-6이 C-4, 5와의 상관관계를 나타내었으며, H-7이 C-2, 3, 4와의 HMBC 상관관계를 나타내었다. 이상의 결과로 화합물 2는 기존에 보고되지 않은 신규 화합물로 확인하였으며, tetronic acid 유도체 화합물로 구조 결정하였다.
2-3. 화학식 3(New)
화합물 3은 역시 노란색의 무결정형 분말상 형태로 화합물을 수득하였으며, UV 스펙트럼에서 226 및 290 nm의 최대 흡광도를 나타내어 γ-lactone 골격임을 시사하였다. HRFABMS 스펙트럼에서 m/z 1145.0499 [M+H]+의 base peak를 확인하여 분자량을 추정하였으며, 분자식은 C6H9O4로 확인하였다. 1H NMR 스펙트럼에서 한 개의 oxygenated proton 시그널이 δ 4.18 (1H, dd, J = 9.6, 4.2 Hz, H-5)에서 관찰되었으며, 한 개의 hydroxymethyl기가 δ 4.32 (1H, dd, J = 11.4, 4.2 Hz, H-4), 4.09 (1H, dd, J = 11.4, 9.6 Hz, H-6), 한 개의 methyl기가 δ 1.98 (3H, s, H-7)에서 관찰되었다. 13C NMR 및 HSQC 스펙트럼에서 한 개의 carbonyl carbon 시그널이 δ 187.6 (C-2)에서 관찰되었으며, 2개의 이중결합 carbon 시그널과 한 개의 oxygenated carbon δ 67.5 (C-5), hydroxymethyl δ 71.4 (C-6)와 함께 한 개의 methyl기가 δ 14.8 (C-7)에서 관찰되었다. Key HMBC 스펙트럼에서 H-5이 C-2, 4, 6와의 상관관계를 나타내었으며, H-6이 C-4, 5, H-7이 C-2, 3, 4와의 HMBC 상관관계를 나타내었다. C-5 위치의 절대배열은 tetronic acid 유도체의 비선광도값과의 비교로 결정하였다. 화합물 3는 [α]D:-13.9(c 0.1, MeOH)로 측정되었 C-5의 절대배열은 S-배열로 확인하였으며, 화합물 3은 기존에 보고되지 않은 신규 화합물로 구조 결정하였다.
실시예 3. 세포 독성 확인
Melanoma 세포주인 B16F10 세포는 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% penicillin/streptomycin(100 U/㎖)을 첨가한 DMEM(Dulbeccos's Modified Eagle's Medium, Gibco, 미국)을 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에 적응시켜 계대 배양하였다. 상기 배양된 B16F10 세포를 96웰-플레이트(5×104 세포/웰)에 분주한 후 시료(여주 열수추출물, 여주 발효물, 여주 발효물의 분획물 또는 분획물로부터 분리된 화합물)를 농도별로 0.02 ㎖ 처리하고 4시간 동안 배양한 후 MTT 용액(5 mg/㎖) 0.02 ㎖을 처리하여 반응시켰다. 반응이 끝난 후 540 nm에서 ELISA plate reader(Tecan Austria GmBH, Grodig, Austria)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 여주 발효물, 여주 발효물의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물 모두 90% 이상의 높은 생존율을 보였고(도 2), 이를 통해 본 발명의 여주 발효물, 여주 발효물의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 세포 독성이 없음을 알 수 있었다.
실시예 3. B16F10 세포에서 티로시나아제 저해 활성 측정
세포 내 티로시나아제 저해 활성은 Hye-Jin Park et al.(J. Nat. Med., 2018, 72, 127-135)의 방법에 따라 L-DOPA를 기질로 이용하여 측정하였다. 양성 대조군으로는 알부틴(arbutin)을 사용하였다.
먼저, 여주 발효물과 이의 분획물의 세포 내 티로시나아제 저해 활성을 측정한 결과, α-MSH 처리군(Cont, 시료 무처리)은 α-MSH 무처리군(Nor, 시료 무처리)에 비해 티로시나아제 활성이 증가하였으나, 여주 열수추출물, 여주 발효물 또는 이의 n-Hexane 분획물, EtOAc 분획물 또는 n-BuOH 분획물을 전처리한 후 α-MSH를 처리한 실험군은 α-MSH 처리군에 비해 티로시나아제 활성이 감소하였다. 특히 여주 발효물 또는 이의 n-Hexane 분획물, EtOAc 분획물 또는 n-BuOH 분획물을 100 μg/㎖의 농도로 처리하면 여주 열수추출물에 비해 티로시나아제 활성이 현저히 감소하였고, 여주 발효물의 EtOAc 분획물 100 μg/㎖ 처리군의 세포 내 티로시나아제 저해 활성은 약 48%로 여주 발효물의 분획물 중에서 티로시나아제 저해 활성이 가장 우수하였다(도 3A).
또한, 여주 발효물의 에틸아세테이트 분획물에서 분리된 APM-1(화학식 1), APM-2(화학식 2) 또는 APM-4(화학식 3)의 세포 내 티로시나아제 저해 활성을 측정한 결과, α-MSH 처리군(Cont, 시료 무처리)은 α-MSH 무처리군(Nor, 시료 무처리)에 비해 티로시나아제 활성이 증가하였으나, APM-1, APM-2 또는 APM-4 화합물을 전처리한 후 α-MSH를 처리한 실험군은 α-MSH 처리군에 비해 티로시나아제 활성이 감소하였고, 특히 APM-2 또는 APM-4 화합물을 30 uM의 농도로 처리할 경우 각각 27%, 25% 정도의 티로시나아제 저해 활성을 보였으며, 알부틴 100 uM 처리군의 티로시나아제 저해 활성이 약 8%인 것과 비교했을 때 APM-2 또는 APM-4 화합물의 티로시나아제 저해 활성이 양성대조군에 비해 더 우수한 것을 알 수 있었다(도 3B).
실시예 4. B16F10 세포에서 멜라닌 생합성 저해율 측정
세포 내 멜라닌 생합성 저해율을 측정하기 위해 B16F10 세포를 12웰 플레이트에 1×106 세포/㎖가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후 시료를 1시간 동안 전처리하였다. 이후, 각 웰에 α-MSH(1 nM)를 처리하고 48시간 동안 배양하여 멜라닌 합성을 유도하였으며, 48시간 후 배지를 제거하고 PBS로 세척하고 원심분리하여 세포 펠렛(pellet)을 수득하였다. 1N NaOH에 DMSO가 10%(v/v)가 되도록 제조한 용액 200 ㎕를 멜라닌 세포 펠렛에 첨가하여 60℃에서 1시간 동안 용해시켰으며, 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 합성량은 α-MSH 단독 처리군 대비 백분율(%)로 표기하였다. 양성 대조군으로는 알부틴(arbutin)을 사용하였다.
먼저, 여주 발효물과 이의 분획물의 세포 내 멜라닌 생합성 저해율을 측정한 결과, α-MSH 처리군(Cont, 시료 무처리)은 α-MSH 무처리군(Nor, 시료 무처리)에 비해 멜라닌 합성량이 증가하였으나, 여주 발효물 또는 이의 EtOAc 분획물, n-BuOH 분획물을 전처리한 후 α-MSH를 처리한 실험군은 α-MSH 처리군에 비해 멜라닌 생성량이 감소하였고, 특히 여주 발효물 또는 이의 EtOAc 분획물, n-BuOH 분획물을 100 μg/㎖의 농도로 처리하면 여주 열수추출물에 비해 멜라닌 생성량이 현저히 감소한 것을 확인하였다. 여주 발효물의 EtOAc 분획물 100 μg/㎖ 처리군의 멜라닌 생합성 저해율은 약 56%로 여주 발효물의 분획물 중에서 멜라닌 생합성 저해율이 가장 높았으며, 알부틴 100 μg/㎖ 처리군의 멜라닌 생성량이 약 51%인 점과 비교했을 때 여주 발효물의 EtOAc 분획물은 양성대조군 보다 멜라닌 생합성을 저해시키는 효과가 더 우수함을 알 수 있었다(도 4A).
또한, 여주 발효물의 에틸아세테이트 분획물에서 분리된 APM-1(화학식 1), APM-2(화학식 2) 또는 APM-4(화학식 3)의 세포 내 멜라닌 생합성 저해율을 측정한 결과, α-MSH 처리군(Cont, 시료 무처리)은 α-MSH 무처리군(Nor, 시료 무처리)에 비해 멜라닌 합성량이 증가하였으나, APM-1, APM-2 또는 APM-4 화합물을 전처리한 후 α-MSH를 처리한 실험군은 α-MSH 처리군에 비해 멜라닌 생성량이 감소하였고, 특히 APM-2 화합물을 30 uM의 농도로 처리할 경우 멜라닌 생합성 저해율이 약 30%로, 양성 대조군에 비해 멜라닌 생합성 저해율이 우수한 것을 확인하였다(도 4B).
실시예 5. 멜라닌 생합성 관련 인자들의 발현 저해 활성 측정
MITF(microphthalmia-associated transcription factor)는 멜라닌 합성 과정에서 중요한 전사조절인자로, 멜라닌 합성 효소인 TRP-1(tyrosinase related protein 1), TRP2 및 티로시나아제의 전사를 촉진시키는 역할을 한다.
본 발명의 APM-2(화학식 2) 화합물이 미백 관련 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2 및 티로시나아제의 발현량에 미치는 영향을 알아보기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 구체적으로, B16F10 세포 현탁액을 100 mm 배양 용기(2×104 세포/웰)에 분주한 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 α-MSH(1 nM/㎖)를 처리하고 APM-2 화합물을 농도별(10 uM, 20 uM)로 처리한 배지로 48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척하였다. 용해 버퍼(lysis buffer) 100 ㎕로 용해시키고 4℃, 12,000 rpm 조건으로 20분간 원심분리하여 상층액만 수득하였다. 상기 수득한 상층액은 브래드 포드 어세이(Bradford assay)로 정량하였으며, 20 ㎕의 단백질을 10%의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(polyacryamide gel)에 로딩하고 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 트랜스퍼하고, 실온에서 블로킹 버퍼(5% skim milk in TBST)로 1시간 동안 반응시킨 후 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하였다. 세척이 끝나고 MITF(Santacruz, 1:1000), TRP-1(Santacruz, 1:1000), TRP-2(Santacruz, 1:1000), tyrosinase(Santacruz, 1:1000) 또는 ß-actin(Santacruz 1:1000)의 1차 항체를 이용하여 4℃에서 밤새 반응시킨 후, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 mouse anti-rabbit IgG HRP 또는 bovine anti-goat IgG HRP의 2차 항체를 이용하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 2차 항체 반응이 끝나고 3회 세척한 다음, 암실에서 ECL(Amersham Pharmacia)용액으로 반응시키고 LAS4000 chemiluminescence detection system(Fuji)을 이용하여 밴드를 확인하였다.
그 결과, α-MSH 처리군(Cont, 시료 무처리)은 α-MSH 무처리군(Nor, 시료 무처리)에 비해 MITF, TRP-1, TRP-2 및 Tyrosinase 발현량이 증가하였으나, 10 uM 또는 20 uM 농도의 APM-2를 전처리한 후 α-MSH를 처리한 경우 α-MSH 단독 처리에 비해 MITF, TRP-1, TRP-2 및 Tyrosinase 발현량이 감소한 것을 확인하였다. 특히 20 uM 농도의 APM-2를 처리할 경우 MITF, TRP-1, TRP-2 및 Tyrosinase 발현량이 각각 36%, 57%, 43%, 26% 정도 저해된 것을 확인하였다(도 5).
상기 결과를 통해, 본 발명의 여주 발효물, 여주 발효물의 분획물 또는 이로부터 분리된 화학식 1 내지 3의 화합물은 세포 내 티로시아나제 저해 활성과 멜라닌 생합성 저해율이 우수하고, 멜라닌 합성 효소인 TRP-1, TRP2 및 Tyrosinase 발현을 저해시킬 수 있으므로, 피부 미백 개선에 효과가 있을 것으로 예상되었다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 및 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112022117864814-pat00005

    [화학식 2]
    Figure 112022117864814-pat00006

    [화학식 3]
    Figure 112022117864814-pat00007
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 여주 발효물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  3. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 및 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 건강기능식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112022117864814-pat00008

    [화학식 2]
    Figure 112022117864814-pat00009

    [화학식 3]
    Figure 112022117864814-pat00010
  4. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 및 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112022117864814-pat00011

    [화학식 2]
    Figure 112022117864814-pat00012

    [화학식 3]
    Figure 112022117864814-pat00013
  5. 제4항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광색소반, 푸른흑피증(cyanic melasma), 약물 사용 후의 과다색소침착, 임신성 갈색반(gravidic chloasma), 또는 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착인 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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