KR102496064B1 - 전계효과 트랜지스터 센서의 게이트 전극 기능화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전계 효과 트랜지스터 센서(BS)의 게이트 전극(6)의 기능화 방법에 관한 것으로서,
- 상기 게이트 전극(6)의 표면(6F)상에 생물학적 인식 요소 층을 형성하는 단계
- 상기 생물학적 인식 요소 층(9)은 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질(항-HIg, 항-IgG, 항-IgM)의 자기 조립 구조(SAM)를 포함함 -;
- 생물학적 인식 요소(SAM)의 층을 공극을 채우고 자기 조립 구조(SAM)에서의 비특이적 결합을 방지하기위한 차단제를 함유하는 용액으로 처리하는 단계를 포함하며,
상기 생물학적 인식 요소 층(9)에 고정화된 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질은 0.1x10⁴μm-²와 10x10⁴μm-²사이, 바람직하게는 1x10⁴μm-²와 2x10⁴ μm-²사이인 밀도로 팩(pack)된다.
또한, 상기 방법에 따라 기능화된 FET 바이오 센서가 본원에서 개시된다.

Description

전계효과 트랜지스터 센서의 게이트 전극 기능화 방법

본 발명은 전계효과 트랜지스터 센서, 특히 바이오 센서에 대한 것이다.

특히 본 발명은 전계효과 트랜지스터 센서의 게이트 전극 기능화 방법을 특별히 개발함에 대한 것이다.

바이오 센서, 특히 전계효과 트랜지스터 바이오 센서 분야에서 신기술이 점점 더 민감하고 신뢰성 있는 검출을 가능하게 함으로써 질병의 초기 단계에서 바이오 마커를 검출 할 수 있는 감지 시스템을 찾고 있다.

그러나 지금까지 방법론적 접근법은 검출기의 감지 표면을 가능한 한 최대로 소형화하는 것이 진행 방법이라는 아이디어에 의해 주도되었다. 표지가 없는 단일 분자 검출은 크기 제약으로 인해 생물 수용체가 거의 존재하지 않거나 수용할 수 있는 나노 시스템을 통해 이루어졌다.

단일 DNA 검출은 단일 탄소 나노 튜브 전계효과 트랜지스터를 기반으로 한 바이오 센서로 수행되었다. 이 트랜지스터에서, DNA 프로브는 상보적인 DNA 표적의 존재에 의해 영향을 받는 나노 채널의 포인트 결함에 부착된다.

레이블 없는 단일 분자 검출은 속삭이는 갤러리 모드 마이크로 공동(microcavity)을 통해 수행되었다. 상기 감지는 금(gold) 나노 막대에서 생성된 플라즈몬 강화 필드(field)를 통해 발생하는데, 이는 나노 대상 종횡비, 오리엔테이션 및 표면 거칠기에 크게 좌우된다.

포스 분광기(force spectroscopies)(광학 및 자기 핀셋, 원자 포스 현미경) 또는 이온 채널 및 나노 기공을 기반으로 한 플랫폼은 나노 크기의 공간적 위치 파악을 위해 나노 도구에도 의존한다. 이러한 시스템은 본질적으로 매우 적은 생물학적 인식 요소와의 상호 작용을 위한 대규모(실제로는 매우 큰) 바이오 마커를 유입시킨다. 이로 인해 단일 결합 감지 이벤트가 발생할 가능성이 매우 높다. 단일 이벤트는 상호 작용에 관여하는 나노 표면의 상대적으로 큰 부분을 변화시킴에 따라 측정 가능하다.

많은 양의 생물학적 유체에 분산되어있는 단일 바이오 마커(즉, 매우 낮은 농도를 갖는 바이오 마커)를 실제로 감지하기 위해, 결합 이벤트 발생빈도가 매우 낮기 때문에 나노 센서가 몇 개의 바이오 마커를 실제로 검출하기 위해 비실용적으로 오랜 시간동안 기다려야 한다. 따라서, 상기 모든 검출 기술은 본질적으로 예를 들어 이른 시기에 바이오 마커 검출에 필요한 생물학적 관련 매체 내 리간드를 추적할 수 없으며, 이때의 리간드 농도는 극히 낮다.

이러한 나노 시스템은 검출 이벤트(그리고 관련 결과)의 낮은 재현성과 생산 확장성에 의해서도 여전히 제한을 받으며, 이들 둘 다 기술 플랫폼을 실제 임상 응용으로 옮기는 데 주요한 문제가 있다.

두두러진 것은, 생물학적 세포는 표면에 존재하는 거대한 수의 수용체를 통해 단일 분자 감도로 반 화학 물질을 해독할 수 있다. 이에 대한 예로는 난자(난세포)를 찾기 위해 난자에 상대적인 환경 신호를 물리적 탐지 한계까지 감지할 수 있는 정자 세포가 있다.

화학 유인 물질과 하나의 수용체 사이의 결합 현상은 발생원을 가리키는 증가하는 반 화학 물질 그레디언트를 향하여 세포 배향을 개시한다.

셀의 민감도가 높을수록 탐색 속도가 빨라진다. 정자 세포는 3-4 개의 리간드를 검출할 수 있지만, 단일 이온 채널 연결 수용체(예를들면: 니코틴성 아세틸콜린 수용체)는 화학적 신호를 검출 가능한 이온 전류로 전환시킬 수 있다.

주목할만하게, 화학 유인물질-수용체 상호작용 단면적이 충분히 높도록 하기 위해서는 세포 표면이 매우 많은 수의 조밀하게 팩(pack)된 수용체에 의해 덮여야만 한다.

의용전자(bioelectronics)는 인쇄 가능한 저비용 생산 전자 장치 및 전계효과 트랜지스터(FET)에서 가장 유망한 지침 중 하나이다. 크기가 μm에서 mm 크기의 이러한 장치는 인쇄 가능한 유기 반도체(OSCs)와같은 재료뿐만 아니라 인듐 갈륨 아연 산화물(IGZO), 탄소 나노 튜브 박막, 그라핀과 같은 금속 산화물을 기반으로한다. 그 중에서도 특히 유기 FET, 특히 전해질 게이팅 FET는 성능이 우수한 바이오 전자 FET(bio-FET) 센서로 작동하는 것으로 입증되었다. 선택성은 전자 인터페이스와 직접 결합된 기능적 생물학적 인식 요소의 층을 통합함으로써 달성된다.

이러한 생물학적 인터페이스에 대한 연구는 수용체 바이오 시스템의 구조 변화에 대한 통찰력을 제공하며, 라벨 없는, 민감한 선택적인 바이오 센싱 기술임을 입증했다. 전해질 게이트 센서는 피코 몰(

M)까지 검출 한계를 나타내며 센서 반응의 높은 반복성은 수백 번의 반복 측정에서 3-5%의 낮은 상대 표준 편차를 특징으로 한다. 해수에서 최대 10⁴회의 반복 측정이 매우 높은 반복성으로 성공적으로 수행되었다. 또한, 인간의 후각 수용체 2AG1로 변형된 그래핀 FET로 서브 펨토몰(

M, fM) 검출이 이루어졌다. 바이오-FET에서 일반적으로 사용되는 부피(100μL)를 고려할 때, 검출된 리간드의 수는 pM 농도에서

이고, fM 농도에서

이었으므로, 전자 라벨 없는 감지 기술은 여전히 단일 분자 검출과 매우 거리가 멀다.

본원발명의 목적

본 발명의 목적은 전술 한 기술적 단점을 극복하는 것이다. 특히, 본 발명은 극히 낮은 농도에서 바이오 마커 (예를 들면: 친 화성 리간드)를 검출할 수 있는 FET 바이오 센서 및 임상 스크리닝에서 바이오 마커의 조기 검출을 가능하게 하는 극소 단백질 검출 이벤트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 본원 발명과 관련하여 본 명세서의 기술적 개시의 필수적인 부분을 형성하는, 다음의 청구 범위의 주제를 형성한다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 전계효과 트랜지스터 센서의 게이트 전극의 기능화 방법에 의해 달성된다.

특히, 본 발명의 목적은 전계효과 트랜지스터 센서의 게이트 전극의 기능화 방법에 의해 달성되며, 상기 방법은,

상기 게이트 전극의 표면상에 생물학적 인식 요소 층을 형성하는 단계

- 상기 생물학적 인식 요소 층은 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질의 자기 조립 구조(self-assembled structure)를 포함함 -;

생물학적 인식 요소 층을 공극을 채우고 자기 조립 구조에서의 비특이적 결합을 방지하기 위한 차단제를 함유하는 용액으로 처리하는 단계를 포함하며,

상기 생물학적 인식 요소 층에 고정화된 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질은 0.1x10⁴μm-²와 10x10⁴μm-²사이, 바람직하게는 1x10⁴μm-²와 2x10⁴ μm-²사이인 밀도로 팩(pack)된다.

또한, 본 발명의 목적은 전계효과 트랜지스터 센서에 있어서,

- 소스 전극,

- 드레인 전극,

- 바람직하게는 금 접점 깍지형 패턴(interdigitated pattern of gold contacts)을 포함하는 FET 채널,

- 상기 깍지형 패턴 상에 배치된 반도체,

- 상기 방법에 따라 기능화된 표면을 갖는 게이트 전극을 포함하는 전계효과 트랜지스터 센서에 의해 달성된다.

본 발명의 특징 및 장점은 비 제한 실시 예로서 제공된 첨부 도면을 참조하여 다음에 설명된다.
도 1은 본 발명에 따른 방법에 의해 기능화될 수 있는 FET 바이오 센서를 도시한 개략적 입체도면.
도 1A는 도 1의 바이오 센서 서브 유닛의 개략적 도면.
도 1B는 본 발명에 따른 FET 바이오 센서 내 소스 및 드레인 전극의 예시적인 패턴을 도시한 도면.
도 1C는 도 1A의 서브 유닛에 상응하는 도 1B의 채널 영역 확대도.
도 2는 도 1의 FET 바이오 센서를 도시한 이차원 도면.
도 3은 특히 IgG 친화성 리간드(도 3A) 및 관련 네가티브 컨트롤 실험(도 3B)을 측정하기 위한, 본 발명에 따른 조합의 기능화 및 측정 단계를 도시하는 흐름도.
도 4는 상이한 감지 스테이지에서 게이트 표면의 대표적인 스캐닝 전자 현미경 사진과 함께 리간드 농도의 함수로서 상대적인 임계 전압 변화를 도시한 멀티플 플롯을 도시한 도면.
도 5는 배양 부피 V에 존재하는 N 개의 리간드에 노출시 임의의 리간드와 상호 작용하지 않은 결합 위치의 도메인을 발견하는 전체 확률과 특별히 관련된 확률 밀도 함수의 플롯을 도시한 도면. 여기서 감마 분포,

대 결합 위치의 수, x는 BSA 침전이 있거나 없는 항IgG SAM에 대한 용량 - 반응 곡선을 가장 잘 묘사한다.
도 6은 기능화된 게이트 표면의 대표적인 스캐닝 전자 현미경 사진과 함께, 본 발명에 따라 기능화된 바이오 센서의 투여량 - 응답 곡선, 즉 리간드 농도 (감지 신호)의 함수로서의 상대적인 전류 변화를 보여주는 비교 플롯.
도 7은 광학 현미경으로 보이는 결합에 의해 발생된 구역의 구조를 도시한 도면.

도 1을 참조하면, 기준 바이오 센서(BS)는 전체적으로 본 발명의 방법에 따라 기능화된 게이트 전극을 특징으로 하는 FET 바이오 센서를 나타낸다.

바이오 센서(BS)는 바람직하게는 Si/SiO₂로 만들어진 기판(1)을 포함한다. 기판(1)은 편평하고 비 전도성이다. 대안적으로 유리 슬라이드 또는 폴리이미드(Kapton®), 운모(2 차원 시트 또는 층 구조를 나타내는 필로 실리케이트), 폴리(에틸렌 2,6- 나프탈레이트) 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트와같은 가요성 플라스틱 기판이 사용될 수있다.

소스(S) 및 드레인(D) 전극은 포토 리소그래피에 의해 제조되고 각각 참조 번호 2 및 3으로 표시된 금 패드로서 제공된다. 소스(S) 및 드레인(D) 패드(그리고 깍지형 전극(interdigitated electrode))은 전자빔 증착된 금(50nm 두께)과 접착층 역할을 하는 사전에 증착된 티타늄 (50nm 두께)으로 정의된다. 대안적으로, 이들 패드는 전도성 잉크의 스크린 인쇄 또는 쉐도우 마스크를 통한 금 열 증발에 의해 형성될 수 있다. 설명 전반에 걸쳐, 소스 및 드레인 전극은 각각 "소스 패드" 및 "드레인 패드"로 지칭 될 수 있으며, 각각의 참조 번호 2 및 3과 관련하거나 관련하지 않을 수 있다.

소스 및 드레인 패드는 도 1a에 도시된 FET 채널을 정의하는 서로 깍지형 패턴의 금 전극(4)에 연결된다. 도 1b는 바람직한 실시 예의 일부 치수 값과 함께 깍지형 패턴의보다 상세한 표현을 제공하는 반면, 도 1c는 도 1b의 일부분의 확대도를 제공한다. 이하의 설명에서, 이러한 인터 디지탈 패턴은 흔히 "깍지형 S 및 D 패턴"으로 언급될 것이다.

바람직한 실시 예에서, 상호 깍지형 패턴(FET 채널)은 1280㎛ 폭(W, 등위전극 영역) 및 5㎛ 길이(L, 2개의 상이하게 바이어스된 영역을 분리하는 영역)이다. 바람직하게는, 깍지형 패턴은 금 패드(2, 3)와 유사하게 광 리소그래피로 또한 정해진다. 2개의 상이하게 바이어스된 영역(L)을 분리하는 영역은 5 내지 200㎛만큼 클 수 있고, 비례적으로 L 간격이 100μm보다 크면 인쇄 또는 스크린 마스크를 사용하여 맞물림 패턴을 정의할 수 있다.

상호 깍지형 S 및 D 패턴(4)은 그 위에 배치된 반도체(7)에 의해 추가로 커버된다.

바람직하게는, 반도체(7)는 유기성이며, 다음의 성질을 나타내는 소수성 폴리(3-헥실티오펜-2,5-디일) 또는 P3HT로 만들어진다: 위치 규칙성(regioregularity)>99%, 17.5 kDa g mol-1 평균 분자량. 0.2μm필터로 여과한 P3HT 용액(1,2-디클로로 벤젠 중 2.6 mg ml-1)을 20초간 2,000 rpm으로 스핀 코팅하였으며, 80℃에서 1시간 동안 어닐링 처리하였다. 바람직한 실시 예에서, 전체 반도체 면적은 6.5×10-³cm-²이다.

접촉 각이 103±3°로 높기 때문에 P3HT 표면은 매우 소수성이다. 선택적으로, 폴리[2,5-비스(3-테트라 데실티오펜-2-일) 티에노[3,2-b]티오펜](PBTTT-C14), 폴리(2,5-비스(3-헥사데실티오펜-2-일) 티에노[3,2-b]티오펜(pBTTT-C16), pBTTT-C14, 및 용액 처리된 펜타센, 그라핀 등이 반도체 재료(7)로 사용될 수 있다.

구체적으로 PBTTT-C14는 1,2-디클로로벤젠과 클로로포름의 혼합물(9:1 비율)에 용해(7mg/ml)될 수 있다. PBTTT-C14 용액은 7,000 r.p.m.으로 회전 증착할 수 있다. 60초간 120℃에서 10분간 어닐링 하였다.

FET 바이오 센서(BS)는 게이트 전극(6)을 더 포함하는데, 바람직한 실시 예에서 FET 채널 영역 위에 안정적으로 매달린 0.6cm²의 면적을 갖는 금 평판이다. 선택적으로, 게이트 전극(6)은 폴리이미드, 마이카, 폴리(에틸렌-2,6-나프탈레이트) 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트와같은 가요성 기판상에 뿐만 아니라 Si/SiO₂와같은 단단한 기판에 인쇄함으로써 Ti(50nm) 및 Au(50nm)의 열 증착 또는 전자 빔 증착에 의해 정의될 수 있다.

게이트 전극(6)은 도면에 도시된 FET에서 깍지형 S 및 D 패턴(4)을 덮는 반도체(7)에 노출되고 대면하는 표면(6F)(도 2)을 포함한다. 웰(11)은 깍지형 S 및 D 영역을 제한하도록 제공되며, 여기서, 웰(11)은 기능적으로 전해질 게이트 형 FET(EG-FET)인 바이오 센서(BS)를 동작시키고 감지 측정을 수행하기 위해 전해질로서 작용하는 순도 HPLC급 물로 채워진다. 희석된 염 용액이 또한 사용될 수 있다. 표면(6F)은 웰(11)을 향하고 그 안에 포함된 게이트 전해질에 노출된다.

본 발명에 따르면, 표면(6F)은 그 위에 생물학적 인식 요소(9)의 층을 형성함으로써 생체 기능화된다. 상기 생물학적 인식 요소 층(9)은 다음 중 하나를 포함한다:

하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질의 생물학적 자기 조립 구조와 화학적 자기 조립 구조의 복합체 - 생물학적 자기 조립 구조는 화학적 자기 조립 구조 상으로 화학적으로 그라프트됨 - , 또는

하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질의 생물학적 자기 조립 구조 - 생물학적 자기 조립 구조의 구조 단위는 그라프트하고자 하는 기판에 대한, 즉 게이트 전극(6)의 금 표면에 대한 그라프팅 특성을 나타내도록 처리됨 - .

바람직한 실시예에서, 생물학적 인식 요소 층(9)은 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질의 생물학적 자기 조립 단분자층(도면에서 생물학적 SAM, B_SAM) 및 화학적 자기 조립 단분자층(도면에서 화학 SAM, C_SAM)을 포함한다.

본원 발명에 따라, 상기 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

- 선택된 바이오-마커에 대한 하나 이상의 항체,

- 항-인간 면역 글로불린(항-hIG) 항체,

- 항-인간 면역 글로불린 G (항-IgG) 항체,

- 항-인간 면역 글로불린 M (항-IgM) 항체,

- 도파민, 키랄 냄새, DNA, 인간 당 단백질, 염증성 사이토카인, C-반응성 단백질에 대한 특이적 결합 쌍 형성 물질.

생물학적 자기 조립 구조만을 특징으로 하는 구체 예에서, 이에 한정되는 것은 아니지만 노출된 시스테인을 갖도록 수정된 단백질과 같은 금 표면(gold surface)에 자발적으로 부착할 수 있는 티올 기(thiol group)를 갖는 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질의 자기 조립 단분자층이 동일한 것이다. 포획 단백질의 직접적인 물리적 흡착도 고려될 수 있기도 하다.

바람직한 실시 예에서, 본 발명에 따른 게이트 전극 기능화 방법은 항-면역 글로불린 G(항-IgG, 선호됨) 또는 항-인간 면역 글로불린 M(항-IgM) 항체의 SAM 층 B_SAM이 전체 기능화될 게이트 전극(6)의 표면(6F)에 적용된 화학적 SAM 층(C_SAM) 상으로 특이적으로 그라프트된다. 분명히, 본 발명은 다른 특이적 결합 쌍 형성 물질(예를 들어, 표적 바이오마커를 위한 선택된 항체)로 실시될 수 있다.

단백질 SAM 침착 절차는 일반적으로 항체 만의 특성인 특이적 기능(예: 작용기)에 의존하지 않으므로 일반적이다. 이는 증착 방법을 상기한 모든 생물학적 종(모든 항체, PNA, 인간 당 단백질 또는 도파민, 키랄 냄새(odor), 염증성 사이토카인, C-반응성 단백질에 대한 단백질 수용체)으로 확장 가능한 증착 방법을 제공한다. 이것은 면역 측정을 위한 본질적으로 일반적인 플랫폼이다.

본 발명에 따르면, 생물학적 인식 요소 층(9)에 고정화된 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질(예를 들어, 항-hIg, 항-IgG, 항-IgM 및 또한 일반적으로 항체)(특히 생물학적 SAM에서)이 0.1x10⁴μm-²와 10x10⁴μm-²사이, 바람직하게는 1x10⁴μm-²와 2x10⁴ μm-²사이인 밀도로 팩(pack)된다.

바람직한 실시 예에서, 항-IgG의

까지는 0.6cm² 게이트 표면상에 고정화되고, μm²당 1.6x10⁴μm-²단백질의 밀도에 상응한다고 추정된다.

바람직한 실시 예에서, 게이트 전극(6)의 표면(6F)상의 화학적 SAM C_SAM은 먼저 다음과 같이 금 평판(gold plate)(게이트 전극(6))을 먼저 세척함에 의해 생산된다:

- 먼저 금 평판은 5분 동안 Bunsen을 태우고(플레임 어닐링되고) 그 후 20분 동안 [황산(H2SO4)(97% v/v) 및 과산화수소(H2O₂)(30% v/v) 3:1] v/v 내에서 침지된다. 상기 프레임 어닐링은 20분 동안 지속 될 수 있고, 피라니아에 담그면 10-30 분 동안 지속 될 수 있다.

- 그런 다음 평판을 10분 동안 끓는 물에 보관한 다음, 오존 클리너에서 10 분동안 처리된다.

대안으로, 게이트 전극 표면은 일반적으로 '전기 화학적 연마 (electrochemical polishing)'라고 불리는 순환 전압 측정법에 의해 연마될 수있다. 사이클릭-전압 전류법(voltametry) 연마는 전기 화학 분석기를 사용하여 세 전극 구성에서 수행될 수 있다.

Ag/AgCl 전극을 기준 전극으로 사용하여 0.5M 황산(H₂SO₄(97% v/v))을 전기 화학 셀의 전해질로 사용할 수 있다. 게이트 전극(6)은 표준 전극 홀더를 사용하여 용액에 보유된 작용 전극으로서 배치된다.

금 작용 전극(6)보다 약 10배 큰 비교적 넓은 면적의 백금 평판이 제어 전극으로 사용된다. 전위는 최소 30 사이클 동안 0V에서 +1.5V 사이에서 스캔된다. 스캔 속도는 0.1V/s로 유지된다. 모든 측정 전에, 전해질 용액은 새로운 용액으로 교체될 수 있으며, N2는 적어도 10분 동안 전해질을 통해 버블링되어 용존 산소 함량을 제거한다.

전기 화학적 연마 후, 게이트 전극(6)을 초순수 HPLC급 워터로 헹군 다음 에탄올로 완전히 헹구고, 기체 질소(N2) 스트림 하에서 건조시킨다.

선택적으로, 게이트 전극(6)은 Ti(50nm) 및 Au(50nm)의 열 증발 또는 전자 빔 증착뿐만 아니라, 폴리이미드, 운모, 폴리(에틸렌 2,6-나 프탈레이트) 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트와같은 유연한 기판뿐만 아니라 Si/SiO₂와같은 단단한 기판에 프린팅함에 의해서도 만들어질 수 있다. 이 게이트는 세척 절차가 필요 없으며 다음에서 설명하는 단계부터 시작하여 생체 기능화를 위해 직접 처리된다.

게이트 전극의 플레임(flame) 어닐링 또는 전기 화학적 연마 후에, 또는 직접 박막의 금으로 만들어진 게이트에 대해, 바람직한 실시 예에서, 화학적 SAM 층이 표면(9) 상에 증착된 카복실 작용기로 종결되는 알칸티올 층으로 만들어진 전구체에 의해 게이트 전극에 추가된다. 이 같은 목적으로, puriss. p.a. assay, ≥99.8% 등급 에탄올 중 10:1 비의 3-메르캅토프로피온산(3-MPA)와 11-메르캅토운데카논산(11-MUA)으로 이루어진 10 mM 용액이 준비되었다.

세척된 금 평판을 3-MPA 및 11-MUA 용액에 담갔다가 22℃에서 18시간 동안 일정한 기체 질소(N2) 흐름 하에서 암흑 상태(즉, 가시광선 및 자외선이 없는 상태)로 유지시켰다.

그러나 본 발명자들은 상기 바람직한 파라미터 이외에, 동일한 단계가 에탄올 중 10:1 내지 1:1 비의 3-메르캅토프로피온산(3-MPA)과 11-메르캅토운데카논산(11-MUA)으로 이루어진, 또는 3-메르캅토프로피온산만으로 이루어진 10mM 내지 100mM 농도를 갖는 용액으로 실시될 수 있고 또한 게이트 전극(6)을 15-24℃의 온도로 15-20시간 동안 침지시키는 것으로 구성될 수 있음을 관찰하였다.

강한 금-황 상호작용은 200 mM 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노 프로필)카르보디이미드(EDC) 및 50 mM 술포-N-하이드록시석신이미드(술포-NHS) 수용액에서 25℃ 온도로 2시간 동안 상기에서와같이 부분적으로 처리된 게이트 전극을 반응시킴에 의해 활성화되는, 카르복실기의 노출을 발생 시킨다.

다시한번, 본원 발명자들은 상기 바람직한 파라미터 이외에, 동일한 단계가 50mM 내지 250mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 50mM 내지 250mM 술포-N-하이드록시석신이미드(술포-NHS) 수용액에서 22 내지 26℃로 온도로 1 내지 2시간 동안 상기에서와 같이 부분적으로 처리된 게이트 전극을 반응시킴에 의해 실시될 수 있음을 관찰하였다. 술포-NHS 대신 N-하이드록시석신이미드(NHS) 수용액을 사용할 수 있다.

따라서, 바람직한 실시 태양에서 항-인간 면역 글로불린 G(항-IgG) 또는 항-인간 면역 글로불린 M(항-IgM) SAM 층(생물학적 SAM)은 게이트 전극(6)을 항체가 포함된 식염수(PBS) 용액에 25℃에서 2시간 동안 침지시킴에 의해, 화학적 SAM C_SAM, 특히 이전 단락에 기술된 화학적 활성화에 기인한 술포-NHS 또는 NHS 모이티스에 연결된 카르복시 기에 항체(특이적 결합 쌍 형성 물질)를 고정하여 생성된다.

본 발명에 따라, 인산염 완충 식염수(PBS) 용액은 비 제한적으로 예를 들어 항-IGI 또는 항-IGM과 같은 0.1 내지 1 mg ml-1의 항체, 그리고 5 내지 8 범위의 pH 및 10 mM 내지 200 mM 범위의 생리 학적으로 관련된 이온 강도를 갖는 5 내지 25 mM의 인산 완충액으로 이루어질 수있다.

바람직한 구체 예에서, 상기 용액은 0.7 μM(0.1mg ml-1)의 항체 그리고 10mM 인산염, KCl 2.7mM 및 7.4 Ph와 162 mM 이온 강도를 갖는 137 mM NaCl에 의해 제조된 PBS로 만들어진다.

그러나 다시 한번, 본원 발명자는 상기 바람직한 파라미터 이외에, 항-IGL 항체 또는 항-IGM 항체(일반적으로 다른 항체)를 포함하는 완충 용액 중에 게이트 전극(6)을 침지함으로써 동일한 단계가 실시될 수 있다는 것을 관찰하였다. 상기 완충 용액은 다음 중 하나를 포함한다:

- 둘베코(Dulbecco) 인산염 완충 식염수의 Na 인삼염 완충 용액(D-PBS, KCl: 2.7 mM, NaCl: 136 mM, KH2PO4: 1.5 mM, Na2HPO4: 8.1 mM)

- 인산 완충 용액 20 mM 및 pH 8

15 분 내지 3시간의 체류 시간 및 23 내지 26℃의 온도에서 수행된다.

또한, 항체 용액(예를 들면 항-IgG 또는 항-IgM)은 항체의 공급원에 따라 최적의 pH 및 이온 강도를 가져야 한다.

적합한 pH 값은 5 내지 9 범위이고 이온 세기는 10mM 내지 200mM이다.

본 발명에 따른 방법을 수행하는데 사용될 수있는 다른 완충제는 (원하는 pH 값에 따라): 트리스-HCl, 인산염, 구연산염, 이미다졸-Cl, PIPES, ACES MOPSO, BES, TES, MOPS, DIPSO, TAPSO, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, 트리신, 글리신, 바이신, HEPBS, TAPS, AMPD, 보레이트를 포함한다.

이온 강도는 항체가 게이트에 공유 결합하는 것을 방해하지 않는 그리고 항체의 본래의 형태를 방해하지 않는 임의의 염에 의해 조절될 수 있다. 일반적으로 사용되는 염은 NaCl 및 KCl이다.

선택적으로, 다음 프로토콜은 양호한 정도의 선택도를 갖는 바이오 센서 BS(특히 이 같은 물질이 EG-OFET로 구현되는 경우)를 부여할 다른 생물학적 인식 요소를 부착 시키는데 사용될 수 있다. 즉, 예를 들면:

- 도파민을 검출하기 위해 40℃에서 2시간 동안 1,4-디옥산 내에서 포화된 4-포르밀 페닐보론 산을 공유결합 고정화한 시스타민 1mM 수용액에서 얻은 SAM.

- 인터루킨-4를 검출하기 위해 5℃에서 1시간동안 IL4 단일 클론 항체(0.25mg/mL 항-IL-4)를 부착하기 위해 PBS(100 mM PBS, pH 7.4)에서 히스티딘 태그 단백질 G(5mg/mL)를 물리적 흡착.

- SAM 기능화: 22℃에서 18시간동안 어두운 곳에서 질소하에서 5% 아세트산을 함유하는 에탄올 중 3-메르캅토프로피온산(3-MPA)의 50 mM 용액. 활성화: 25℃에서 1시간동안 100 mM EDC 및 200 mM NHS 수용액. 카본과 같은 키랄 냄새를 검출하기 위해 냄새 물질 결합 단백질인 pOBP(20 mM Na 인산염 완충액(pH 8.0) 중 0.7mg ml-1)를 25℃에서 2시간 동안 공유결합 고정 시켰다.

- 공유결합 고정화: 0.1M NaCl에서 2시간 동안 Tris 완충액(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 부유 게이트 전극에서 티올 레이트된 ssDNA- 프로브(7 pmol/cm²)를 감소시켰다. NaCl이 없는 Tris로 씻어 낸다.

- SAM: 10-카르복시-1-데칸티올(헥산 내 1mM), 실온, 1시간. 에탄올과 물로 씻는다. 활성화: 5mM 술포-NHS, N, N'-디-이소 프로필-카르보디이미드(DIC, 40mM) 및 염화나트륨(500 mM)을 함유하는 5μl 2-모르폴리노-에탄-술폰산 완충액(MES, 100 mM, pH 6.0), 공유 결합 고정화: 전극 상에 탄산염 완충액(Na2CO3: 15 mM, NaHCO3: 35mM, pH 9.6) 5μl중 15 분간 스트렙 타비딘(500μg/ml). 물리적 흡착: D-PBS에 0.05wt. % 트윈 (Tween) 20, 0.1 중량% BSA, 15 분 침지.

- SAM: 5-카르복시-1-펜탄에티올. 활성화: 5MM 술포-NHS, DIC(40 mM), 15분을 포함하는 5μl 2-모르 폴리노-에탄-술폰산 완충액(MES, 100 mM, pH 5.5). 공유 고정화: 전극, 2시간, 실온에서 탄산염 완충 용액 (Na2CO3: 15 mM, NaHCO3: 35 mM, pH 9.6) 5μl 중 스트렙트아비딘(Streptavidin)(500 μg/ml). 물리적 흡착: 0.05wt. %트윈 (Tween) 20, 0.1중량% 인간 혈청 알부민 (HMS), 15분. 0.1wt % HSA PBS 용액, 30 분, 실온의 비오틴-테그 항-CgA 항체(30 μg/mL)에서 항온 처리(incubation).

일단 항-IgG 또는 항-IgM SAM B_SAM이 제자리에 놓이면 생체 기능화 층(9)을 "차단"할 필요가 있다, (이는 SAM이 만들어지는 특정 결합 쌍을 형성하는 모든 물질에 적용된다). 특히, 생물학적 인식 요소 층(9)은 하나 이상의 차단제를 함유하는 용액으로 처리되어 공극을 채우고 자기 조립 구조에서 비특이적 결합을 방지한다.

바람직한 구현 예에서, 이는 특히 모든 활성화된 카르복시 기와의 반응을 허용하기에 충분한 시간 동안(일반적으로 30분 ~ 몇 시간) 아민의 농축 용액에 의해 기능화된 화학 SAM 층의 미 반응 활성 카르복시 기의 포화를 통해 수행된다. 아민은 완충액(예: PBS 내 1M 에탄올아민)에 첨가제로 공급되거나 린스 완충액 자체(예: Tris)일 수 있다.

이를 위해, 바람직한 실시 태양에서 이 같은 목적으로 항-IgG 또는 항-IgM 층을 25℃에서 1시간 동안 PBS 중의 1M인 에탄올아민으로 처리한다.

마지막으로, 생체 기능화 게이트 전극(6), 특히 층(9)이 25℃에서 1시간동안 PBS 10mM 중의 1.5μM(0.1 mgml-1) BSA(소 혈청 알부민) 용액에 침지된다. 따라서, 바람직한 양태에서, 에탄올아민 및 BSA는 차단제로서 사용된다.

그러나 본 발명자는 차단 단계가 인산염 5 mM 내지 20 mM에 의해 구성된 pH=7.4인 완충액 중 0.05 내지 1mg ml-1 BSA용액에 생체 기능성 게이트 전극(6), 특히 층(9)을 30분 내지 2시간의 체류 시간 및 22℃ 내지 26℃의 온도에서 80mM 내지 350mM의 범위의 이온 세기에서 침지시킴으로써 실시될 수 있음을 관찰하였다.

선택적으로, 다른 차단제로는 듀벨코(Dulbecco) 인산염 완충 식염수(D-PBS, 1:1) 5 ㎕에 인간 혈청 알부민(0.01-3 % W) 트윈 20, 카제인 또는 1 mM 6-메르캅토 헥사놀(mercaptohexanol)(MCH), 2-아미노 에탄올(1M) KCl: 2.7 mM, NaCl: 136 mM, KH2PO4: 1.5 mM, Na2HPO4: 8.1 mM)을 포함한다. 이러한 용액에 대한 노출(체류 시간)은 15 분에서 3 시간까지 다양하다.

상기한 바와같은 "표면 차단" 단계는 일반적으로 비특이적 결합을 최소화하기 위해 수행된다. 본 발명자는 또한 본 발명에 따른 방법으로 수행될 때, 그러한 단계는 또한 바이오 센서 BS의 감도를 획기적으로 향상시킬 수 있음을 주목했다. "표면 차단"에 사용된 분자는 항-IgG 또는 항-IgM(또는 항체 단백질에 의해 일반적으로 더욱 많이)에 의해 완전히 덮이지 않는 게이트 전극 영역에 대한 생체 분자의 비특이적 흡착을 최소화한다. 또한 BSA는 생물학적으로 자체 조립 구조를위한 기계적 및 정전기 커플러 역할을한다.

기능화 방법의 종래 기술에있어서, 물리적으로 흡착된 BSA는 바이오 센서 반응의 특이성을 최대화하기 위해 사용되지만, 본 발명에 따른 방법에서, 하기 설명되는 바와 같이, 물리적으로 흡착된 BSA의 첨가는 바이오 센서 BS 감도를 현저히 향상시킨다.

본 발명에 따른 생체 기능화 방법의 상기 각 단계 사이에서, 게이트 전극(6)은 가능한 잔류물을 제거하기 위해 완전히 헹구어 졌다.

바람직한 실시 예에서, 센싱 측정은 도3의 흐름도(100)의 단계들의 시퀀스에 따라 IgG 또는 IgM 각각의 친화성 리간드를 선택적으로 검출하기 위해 항-IgG 또는 항-IgM 기능화된 게이트를 노출시킴으로써 수행된다. 이 같은 단계 시퀀스는 도 4의 플롯에 표시된 데이터를 발생시킨다.

도 3a의 측정 방법은 먼저 바이오 센서 BS를 안정화시키는 것을 고려한다. 게이트 전극은 반도체(7)의 표면으로부터 약 3-5 mm의 거리에 안정하게 놓인다. 또한, 300-1000μL HPLC 등급의 워터(water)를 웰(11)에 넣고 드레인 전류(채널 전류)

트레이스가 오버랩될 때까지 드레인-소스 간 전압

가 - 0.7V에서 게이트-소스 전압

를 - 0.1 내지 - 0.7V로 순환시킨다.

워터(water) 속의 SAM은 Debye 길이가 20-200 nm이므로 게이트 바이어스가 인가될 때 SAM 높이(약 20 nm)보다 크므로 충전된다. 이는 FET 검출이 BS에서 발생하는 정전기 및 용량성 변화를 추적할 수 있게한다. 특히, FET 임계 전압 시프트는 SAM 또는 게이트 전극 표면에 부착된 복합체와 관련된 고정된 쌍극자 모멘트의 존재를 정량적으로 설명할 수 있다.

다음으로, 단계(102)에서, 본 발명에 따른 방법으로 기능화된 게이트 전극(6)을 100μL PBS에 넣고 10분 동안 항온 처리하는 것이 고려된다. 항온 처리 시간은 1 ~ 30분까지 다양할 수 있다.

그 후, 단계(103)에서, 게이트 전극(6)을 HPLC 워터로 세척하여 임의의 PBS 잔류물을 제거한다.

그 후, 단계(104)에서, 게이트 전극(6)을 바이오 센서로 되돌려 놓고, 드레인 전류(채널 전류)

가 -0.1V와 -0.7V 사이의 게이트-소스 전압

로 바이오 센서 BS를 바이어스함으로써 측정된다. 소스 전압

는 -0.7V로 설정된다. 측정된 드레인 전류 대

(전송곡선)는 기준선 I0이다.

표준 FET 식(

포화 영역에서),

= (W/2L μFET Ci (

-

)²)에 따라, sqrt(

) 대

로부터,

및 μFET Ci에 대한 값을 추출하는 것이 가능하다. μFET는 반도체 전계효과 이동도(반도체에 따라

~ 10²cm²

의 범위 일수 있음)이며, Ci는 FET의 게이팅 커패시턴스이다. 반도체 안정화후 계면 트랩이 채워지면, 추출된

는 반도체의 게이트로 언급될 게이트의 일 함수를 정량화한다. 후자는 감지하는 동안 불변하므로,

의 변화는 게이트 SAM에서 발생하는 정전기 변화에 기인한다. 게이트 표면적(0.6cm²)이 채널 반도체의 표면적(0.006 cm²)보다 2 차원(two orders) 크기 때문에 본 발명에서는 커패시턴스 변화가 기대되지 않는다

게이트에 부착된 생물학적 SAM B_SAM과 반도체에 유도된 2 차원 FET 채널의 두께와 비유전 상수가 비슷하다는 점을 감안할 때 FET 채널의 커패시턴스는 시스템을 제어하는 일련의 커패시턴스 중 가장 낮다. 총 커패시턴스는 친화성 리간드와의 상호 작용시 바이오 센서에서 유도된 변화에 대하여 불변하며, 따라서 게이팅 커패시턴스 Ci는 고정된다. μFET(전계 효과로 인한 전하 캐리어 이동도)의 변화도 발생하지 않는다.

만 변경된다.

단계(105)에서 게이트 전극(6)은 6zM(

) 공칭 농도의 IgG (바이오 마커 또는 친화성 리간드) 또는 IgM(리간드)를 함유하는 100 μL PBS 보정 용액에 넣고, 10분간 항온 처리(incubated)된다.

다음으로, 단계(106)에서, 게이트 전극(6)은 워터로 세척되어 미반응 화학종을 제거한다.

다음으로, 단계(107)에서, 게이트 전극(6)을 바이오 센서로 되돌려 놓고, -0.1V와 -0.7V 사이의 게이트-소스 전압

로 바이오 센서 BS를 바이어스함으로써 드레인 전류(채널 전류)

가 다시 한번 측정되며, 드레인-소스 전압

는 -0.7V로 설정된다. 측정된

전류는 6 zM에서 신호 I이다.

단계(108)는 또한 66zM 내지 66fM의 공칭 농도로부터 모든 범위를 스위핑함으로써 단계(105 내지 107)를 반복하는 것을 염두에 둔 것이다. 이어서, 네가티브 컨트롤로서 비 결합 리간드를 사용하여 동일한 측정 세트를 반복한다. IgM은 항-IgM에 대한 비 결합 리간드인 반면, IgM은 항-IgG에 대한 비 결합 리간드(네가티브 컨트롤)이다.

단계(109)에서, 모든 데이터가 수집될 때, (전달 곡선으로부터 추출된)

의 상대적인 변화(

)가 측정되며, 이는 다음과 같이 정의된다.

상기 식은 주어진 농도에서의 정상의 임계전압 응답이다. 데이터는 도 4에 도시된다. 서로 다른 농도에서 친화도 리간드, IgG를 함유한 용액에서 항-IGI 기능화된 게이트의 항온 처리가 있게되면 문턱 전압

가 더욱 더 음의 전위로 이동한다. 동일한 농도 범위(데이터는 표시되지 않음)에서 IgM에 노출된 항-IgM에 대해서도 동일한 결과가 발생한다.

실제로 항-IgG 게이트가 IgM(항-IgI에 결합하지 않는 항체) 용액에서 항온 처리되거나 항-IgG 게이트가 각각 10분동안 노출된 PBS 용액에서 9회 항온 처리 될때 어떠한 반응도 기록되지 않는다. 항-IGM이 IgG에 노출되거나 항-IGM 게이트가 각 노출에서 10분 동안 PBS 용액에서 결과적으로 9회 항온 처리될 때도 반응이 관찰되지 않는다. 항-IGM에 관련된 데이터 및 모든 네가티브 컨트롤 실험과 관련된 데이터는 표시되지 않았다.

바이오 센서 BS는 60 + 24 젭토 몰(zeptomolar)(

M) 농도를 초과하는 농도에서 20% 이상의 상대적인

변화로 IgG에 대한 반응을 나타낸다. 이 공칭 농도 100μL에서 4 + 2 단백질을 발견할 확률은 68.3%이다.

전술한 실험적 증거는, 본 발명에 따라 기능화된 게이트 전극(6)을 특징으로하는 바이오 센서 BS가 게이트 전극이 밀리미터이고, 수조(

) 개의 항-IGI 수용체를 호스트한다.

도 3B에서도 도 3A와 동일한 과정이 구성되지만, 분석은 게이트 전극상에 고정화된 단백질에 대한 친화도 리간드가 아닌 표적 분자를 포함한다. 따라서 이것은 네가티브 컨트롤 실험, 즉 제로 응답을 발생시키는 실험이다(이 이유 때문에 참조 번호는 앞서 언급한 것과 동일하게 유지된다.)

도 6: 4 ±2 IgG 단백질까지 감지하는 BSA의 역할

패널(a)은 서로 다른 EG-OFET로 측정된

데이터 포인트를 수집하는 결합 곡선(실험 데이터는 표시되지 않음)의 다음 단락에서 설명한 모델링을 도시한다. 상단 커브는 농도가 9 차수에 걸쳐있는 IgG 리간드 용액에 노출된 완전 BSA 차단된 anti-IgG-SAM 게이트를 대표한다.

하부 곡선은 BSA(종래 기술의 바이오 센서)로 차단되지 않은 항-IgG 게이트 전극의, 동일한 농도 범위에서의 IgG에 대한 반응을 대표한다.

모델링된 모든 데이터는 다른 anti-IgG SAM 게이트 및 다른 P3HT OFET 장치에서 측정된 3회 반복 이상으로 평균되며, 재현성 오차 (표준 편차로 취함)가 최대 8.4%로 평균화된다. 블랭크 수준으로 취한 IgM 네가티브 컨트롤 분석의 상대적 전류 변화는 3.6±3.8%로 낮았다. 블랭크 신호의 평균과 블랭크 표준 편차의 10 배로 취해진 정량 한계 (LOQ)는 BSA가 있는 항-IgG 게이트의 경우 40zM이고 BSA가 없는 게이트의 경우

zM만큼 높다.

패널(b)와 패널(c)에서 전체 캘리브레이션 곡선을 측정한 후 BSA가 있거나 없는(w/o) 항i-IgG 게이트의 SEM 이미지(다른 배율 레벨) 패널(a)이 보고된다. 패널(d)에서,

zM의 농도가 될 때까지 IgM에 노출된 완전 BSA 차단 항 -IGL 게이트가 보고되었다. paned (e)와 (f)는 유일한 6 zM과 66 zM 농도에 대한 BSA 노출 여부에 따른 anti-IgG 게이트의 형태를 보고한다. 단지 4±2 리간드가 용액에 존재함에도 불구하고, BSA와 함께 항 -IgG는 수십 마이크로미터 범위에서 눈에 보이는 돌기 구조의 현저한 범위를 나타낸다.

도 6에서 도시된 모델²

0.6 cm²의 면적을 갖는 게이트에 부착된 항-IgG 항체의 경우 1012만큼 높을 수 있는 고도로 포장된(~10⁴μm-²) 결합 위치 수 n으로 균일하게 덮인 게이트를 고려해본다. 항-IgG SAM의 결함은 주어진 구조 변화가 자유롭게 전파될 수 있는 다수의 영역을 규정한다. BSA는 이러한 결함을 "차단"할 수 있으며, 주어진 도메인이 원래의 결함으로 규정된 경계를 넘어서 확장할 수 있게 해주는 정전기/기계 결합제로 작용할 수 있다. 결합 위치(항-IgG)와 상호 작용할 친화성 리간드(이 경우 IgG)의 수에 대한 확률이 포아송 분포를 따른다면, 실제로 상호작용할 k 리간드에 대한 확률은 다음과 같다:

(1)

여기서,

는 결합 위치당 평균 친화성 리간드 수이다. 공칭 농도 c(M)에서 항온 처리 용액의 부피 V에서 리간드의 수를 N으로 가정하면, 따라서:

(2)

NA는 아보가드로 수이다. 유사하게, 주어진 결합 위치가 임의의 리간드와 상호 작용하지 않을 확률은:

(3)

각 도메인은 크기에 따라 x개의 결합 위치가 있다고 가정할 수 있다. 이들 위치 각각과 k 개의 리간드가 상호 작용할 확률은 서로 독립적이며(즉, 결합 친화력은 비협조적임), 이들 도메인 중 어느 것도 k 리간드 중 어느 것과 상호 작용하지 않을 확률

은 각 위치가 비어 있어야할 확률의 결과에 의해 다음과 같이 제공된다:

(4)

각 도메인에서 결합 위치의 수, x가 확률 분포 함수

에 따라 분포된다면, 항온 처리 부피 V에 존재하는 N개의 리간드에 노출되면 어떤 리간드와도 상호 작용하지 않는 결합 위치의 도메인을 발견할 수 있는 전체 확률은 다음의 적분에 의해 평가될 수 있다.

(5)

상한선이 무한대로 합리적으로 근사화되고 하한선이 0으로 합계된다면 식 5에서 확률

는 주어진 도메인

의 결합 위치 수에 대한 분포 함수의 라플라스 변환이 된다. 이 근사값 하에서,

는 도메인 크기 분포 함수가 된다. 결국, 도메인이 적어도 하나의 리간드와 상호 작용할 확률은 다음과 같다:

(6)

각 데이터 포인트에서, ΔI/I는 적어도 하나의 IgG 리간드와의 접촉에 의해 구조적 전이(conformational transition)가 트리거된 항-IGL 도메인 수에 비례하며, 다음과 같다:

(7)

Asat는 ΔI/I 포화 값이다. 식(2)에 따라 c에서 ΔI/I의 의존성은 손실되지 않는다. l는 리간드 공칭 농도에 비례한다. 또한

는 l도메인에 설정된 실험 데이터 ΔI/I의 역 라플라스 변환으로부터 얻을 수 있다. 이것은 실제로 도 4의 데이터에 적합하도록 허용할 것이지만, 라플라스 변환의 인버젼은 바람직하지 않으며, 여러가지 다른 수치적 방법이 제안되었지만 (

, P., Dynamic Light Scattering에서의 데이터 분석: "The Method and Some Applications" Chapter 4, author Brown, W. Ed., Oxford Science Publications, Clarendon Press, Oxford, UK: 1993), 실험 데이터를 l에 맞추기 위한 모델 함수의 사용이 바람직하다.

에 대하여 특징적인 형태(b)와 스케일(K) 파라미터를 갖는 단일 모달 감마 분포를 가정 할 때(Weisstein, EW in CRC Simpson, Mathematics, Chapman & Hall / CRC, New York, 1999, 694.), 다음과 같은 결과가 있게 된다:

(8)

여기서

는 감마 함수이며, 평균값을 Kb로, 표준 편차를 bK2로 정의 할수 있다. 또한, 명확한 모드는 오직 b>1인 때만 존재하고, (b-1)K와 동일하다. 이와같은 가정의 이점은 두 가지이다: x 영역에서 이 분포는 대칭 및 비대칭 분포 모두를 기술할 수 있으며,

-도메인 에서 라플라스 변환은 다음과 같다:

(9)

따라서:

(10)

식 10은 실제로 실험 데이터를 매우 정확하게 설명한다. 매개 변수 K와 b의 최적 값으로부터 감마 분포는 적어도 하나의 리간드가 x와 x + dx (도 5) 사이에 포함된 일련의 결합 위치를 포함하는 도메인에서 상호 작용할 확률로 평가할 수 있다. BSA가 없으면 항-IgG SAM에서 생성된 도메인은 매우 작고 다 분산되며, 매우 작은 도메인(x~1을 중심으로 함)이 우세하다는 것이 분명하다. 반대로, BSA가 있으면 거의 단 분산 된 거대한 영역이 보인다.

도 5는 이와 관련하여 감마-분포,

, 대 결합 위치의 수를 도시하며, BSA 침전이 있거나 없는 항 IgG SAM에 대한 실험적 투여량-반응 곡선을 가장 잘 나타낸다.

기호들에 대한 설명 :

n = 전체 게이트상의 결합 위치 총 수. 현재 연구에서 항-IgG

k = 주어진 결합 위치와 실제로 상호 작용하는 리간드 (IgG)의 수 (항-IgG)

N = 주어진 공칭 농도 c를 갖는 용액의 항온 처리 부피 V에서 리간드의 수

c = 항온 처리액에서 리간드의 농도는 몰 농도 M으로 표시된다.

= 결합 위치당 리간드 수

x = 한 도메인 내 결합 위치

= 도메인 사이즈 분배 함수

이상의 설명에서 알 수 있듯이, 본 발명자는 이 같은 결과를 얻기 위해 항-IgG 화학적 그라프팅(chemical grafting) 후 전극에 BSA의 물리적 흡착량을 허용하는 단계를 관찰하였다. 친화성 리간드의 정량화는, 펨토 몰 영역(femto molar region)(데이터는 도시되지 않음)에서만, 즉 60 zM보다 높으며 최첨단 검출 수준과 비유할 수 있는 크기의 농도 범위에서, BSA로 처리되지 않은 항-IgG 게이트에서 가능함을 주목해야 한다.

실제로, 앵커링 기의 화학적 SAM이 게이트 전극(6)의 금 표면(6F) 상에 직접 그라프트되는 경우에도, 많은 다른 유사한 SAM과 유사하게, 안티-IUG SAM이 전극 표면을 완전히 덮지 않는 것으로 알려져있다. 생물학적 SAM에 남은 공극이 스폿을 생성하며, 여기서 비 특이적 결합이 발생할 수 있다. 적당한 양의 BSA (또는 다른 차단제)를 첨가하면 이러한 공극의 채움을 발생시키며, 이에 의해 비특이적 바이오 분자(검출될 친화도 리간드-바이오 마커-이외의) 물리적 흡착 효과를 최소화하며, 그렇지 않으면 상기 비특이적 바이오 분자는 바이오 센서 응답의 선택도를 제한할 것이다.

전술한 바와 같이, 이들 특징 및 특성은 바이오 센서 BS 감도를 향상시키고, 밀리미터 스케일 게이트 전극(6)으로 단백질을 거의 검출하지 못하게되며, 따라서 종래 기술에 따라 나노 미터 채널에 의존하는 것을 피하는데 사용되었다.

본 발명의 설명 서두에서 이미 개시된 바와 같이, 본원 발명자들은 정자 세포 또는 눈 막대 세포와같은 생물학적 세포의 관찰에 관한 그들의 연구를 기반으로 하였다. 이러한 세포는 대량의 포획 단백질 또는 광 검출기를 사용하여 물리적 검출 한계에서 반 화학 물질 또는 광자를 추적할 수 있다. 이러한 셀에 의해 수행되는 감지 과정의 중요 사항이 다음과 같이 요약될 수 있다:

- 단일 또는 극히 소수의 표적 단백질 또는 리간드(난자 또는 광자에 의해 방출된 반 화학 물질)가 세포 표면에 충돌한다. 수백만의 수용체가 그러한 표면에 살고 있기 때문에 이것은 가능한 과정이다.

- 구아니 릴시클라제(guanylyl cyclase)와같은 수용체는 가장 밀도가 높은 막 단백질 중 하나로 광 수용체(photoreceptors)(μm² 당 104 로돕신)에서 로돕신(rhodopsin)과 경쟁하는 정자 세포에 존재한다.

- 단일 또는 극소수의 수용체가 인식 과정에 관여하며, 결과적으로 수용체-리간드 복합체가 거의 형성되지 않아 정자 세포 또는 막대 세포 표면의 극소수의 국지화된 위치에서 구조적 변화를 일으키며 형성된다.

수백만 개의 고도로 팩(packed)된 수용된 수용체에 대해 2 ~ 6 개의 인식 이벤트가 포함되어서 정자 세포가 약한 신호를 반응하지 않는 수백만의 수용체에 의해 발생된 -소위- "배경 소음"으로부터 차별화하는 것을 불가능하게 만든다. 격리된 검출 이벤트 자체가 아니라면 효과를 증폭하는 프로세스를 생성하거나 트리거하지 않는다.

주목할만한 증거는 수용체가 들어있는 그러한 기능적 대형 생물학적 인터페이스가 환경적 신호를 물리적 검출 한계까지 감지하는 데 필수적인 전제 조건임을 입증한다.

사실 엄청난 수의 표면 제한 구아니릴 사이클라아제(guanylyl cyclase) 수용체가 정자 세포가 화학 유인 물질의 단일 분자를 추적할 수 있게하는 반면, 후각 신경 세포는 수용체가 막에 포장된 수용체에 의해 페로몬을 거의 추적하지 않으면서 단일 분자 반응을 생성할 수 있다. 망막에 부착된 막대 세포의 광 수용체와 같이 높은 밀도로 포장된 광 수용체는 단일 광자에도 반응한다. 사실 패치 형성의 효과는 게이트 표면의 매우 큰 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 망막의 막대의 경우 수십 마이크로미터 만큼 큰 크기의 패치가 측정되었다.

이것은 실제로 생물학적 세포뿐만 아니라 본 발명에 따른 방법에 의해 기능화된 게이트 전극에서도 일어나는 일이다: 인식 이벤트가 발생할 때 발생하는 변화(대부분은 큰 구조 변화)는 세포 표면(층(9)을 특징으로 하는 기능화된 게이트 표면(6F)) 매우 작은 영역으로부터 시작하여 가장 근접한 수용체로 확산함으로써, 하나의 단일 리간드의 인식 사건 직후에 신호가 퍼지면서 모두 다른 형태로 변화되는 수용체 패치를 생성한다.

본 발명에 따라 기능화된 게이트 전극(6)의 경우, BSA의 역할은 실제로 SAM 생물층을 매우 조밀하고 밀도를 높여서 수용체-리간드 복합체에 의해 유도된 변화가 퍼지게 하여 인접한 수용체의 큰 부분을 포함하게 하도록 한다.

특이적 결합 쌍 형성 물질(들)의 자기 조립 구조의 구조 단위는 BSA에 의해 기계적으로 그리고 정전기적으로 결합되어, 단일 생물학적 인식 사건에서 발생하는 변형(화학적 및/또는 구조적)의 증폭이 허용되고 증진되도록 한다.

감지 측정 전에 전극의 안정화 동안 또는 실제 감지 프로세스 동안 생체 기능화된 게이트 전극(6)에 인가된 바이어스는 또한 그러한 확산을 허용하는 기능화 된 표면층(즉, 표면(9)에 적용된 층)에 가능한 준 안정 상태를 발생시키는 역할을 한다.

이것은

-

특성, 즉 전류 변화로서 측정된 바이오 센서 임계 전압의 시프트로서 측정될 수 있는 게이트 일 함수의 변화를 생성한다. 실제로, EG-OFET 문턱 전압은 게이트가 점진적으로 더 높은 농도의 친화성 리간드 용액에서 항온 처리되기 때문에보다 더욱 음의 값으로 계속 이동한다. 이것은 게이트 필드와 반대 방향으로 향하는 점진적으로 더 큰 고정 쌍극자 모멘트가 층(9)에 설정된다는 것을 의미한다.

중요하게는, 본 명세서에 개시된 이론적 모델은 BSA가 존재하지 않을 때 IgG 친화성 리간드가 분석되는 바와 같이 BSA가 존재할 때 항-IgG SAM 내에 거의 모노 분산된 자이언트 도메인이 형성되는 것을 상정하며(도 4a 및 도 6B), 매우 작고 다 분산인 특징만이 도면에서 설명된다(도 6C). 도 4A 및 도 6B의 SEM 이미지는 실제로 BSA 차단 항-IGI SAM 센싱 IgG에서만 넓은 패치가 크기가 수십 마이크로미터이며 매우 치밀한 수상 돌기 구조로 넓게 덮여 있음을 현저하게 나타낸다.

이것은 또한 도 7A 내지 도 7C에서 보고된 현미경 이미지에 의해 입증된다. 특히 도 7A에서, 에탄올아민 및 BSA(완전히 차단된)로 처리하고 IgG PBS 용액(6, 6x10, 6x10², 6x10³, 6x10⁴,

및

zM)에서 각각 10분 동안 항온 처리된 캡톤 기판이 도시된다. 도 7B에서는, 에탄올 아민 및 BSA (완전히 차단된)로 처리된 금 평판 상의 항-IGL SAM이 6 zM 내지

zM 범위의 전체 검정 곡선에서 IgG를 감지하는 게이트로 사용된다. 도 7C에서, 에탄올 아민으로 처리된 금 평판 상의 항-IGI SAM은 6 zM 내지

zM 범위의 전체 검정 곡선(whole calibration curve)에서 IgG를 감지하기 위한 게이트로서 사용된다. 총 2개의 배율이 도 7A(50x) 및 도 7B, 7C (1000x)에 제공된다. 도 7A-7C의 수지상 구조의 관찰은, 필드 유도 전류를 반드시 측정하지 않고도 금속 게이트의 현미경 이미지를 간단히 검사함으로써 원근 분석이 가능하다.

언급할 가치가 있는 것은 본원에 기술된 바람직한 실시 예 및 항-IgG 기능화를 특징으로 하는 것이 몇 개의 항원의 정량화가 밀리미터 인쇄 가능한 EG-OFET로 어떻게 가능한지를 입증하는 모델 시스템으로 얻어질 수 있다는 것이다.

어쨌든, 본원에 기술된 방법은 게이트 전극의 기능화를 위해 고려된 특이적 결합 쌍 형성 물질에 관계없이 용이하게 적용될 수 있기 때문에, 이러한 방법은 질병에 대한 임상적으로 관련된 바이오 마커를 검출할 수 있는 복수의 면역 센싱 시스템의 배치를 제공한다. 그 중 조기 진단이 신체적인 한계에서 중요하다(종양에서와 같이).

실시예 - 재료 및 방법

재료: 평균 분자량이 17.5 kDa (g mol-1)인 폴리(3-헥실티오펜-2,5-디일), P3HT(Sigma-Aldrich, 위치 규칙성(regioregularity)>99%)가 추가 정제 없이 반도체로 사용됐다. 금 게이트 표면의 화학적 기능화를 위해 3-메르캅토프로피온산산(3-MPA), 11-메르캅토운데카논산(11-MUA), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시술포숙신이미드 나트륨 염(술포-NHS)가 Sigma-Aldrich에서 구입하여 더 이상 정제하지 않고 사용되었다. 항-인간 면역 글로불린 G(항-IgG)는 염소(동물)(분자량~144 kDa)에서 주로 생성되며 Fc 특이적 항체 친화성이고 인간 IgG(~150 kDa) 친화성 리간드와 인간 IgM (~ 950 kDa) 리간드가 인간 혈청에서 추출 되었다. 소 혈청 알부민(BSA)의 분자량은 66 kDa이다. 1차 및 2차 항체 모두와 BSA는 모두 Sigma-Aldrich에서 구입하여 즉시 사용했다. Sigma-Aldrich에서 구입한 워터(HPLC 등급)를 더 이상 정제하지 않고 사용했다.

전해질 게이트 (EG)-OFET 제조: 전자 빔 증착된 금 소스(S) 및 드레인(D) 깍지형 전극(50nm, 두께)이 Si/SiO₂ 기판 상에서 광 리소그래피로 만들어졌다. 이전에 증착된 티타늄 층(50nm)이 접착층 역할을 했다. 두 개의 다른 편향된 핑거 사이의 거리는 채널 길이(L = 5m)를 정의하는 반면, 모든 등 전위 핑거의 둘레는 채널 폭(W= 1280㎛)이다. OSC에의해 커버되는 트랜지스터 채널영역은

cm²이었다. 전극을 패터닝하기 전에 SiO₂ 표면을 극성이 증가하는 용매 (각각 아세톤 및 이소프로판올)의 초음파 욕조에서 각각 10분 동안 세정하였다. S 및 D 전극 정의 후, 0.2μm 필터로 여과한 P3HT 용액(1,2-디클로로 벤젠 중 2.6 mg ml-¹)을 20초간 2000 rpm으로 스핀 코팅 처리하고 80℃에서 1시간 동안 어닐링시켰다. P3HT 필름은 접촉각이 103±3°로 매우 높은 소수성 표면을 나타냈다. 폴리 디메틸 실록산 우물은 깍지형 채널 영역을 가로 질러 접착되고 워터(HPLC 등급) 300μL로 채워 졌다. 선택적으로 P3HT 표면 위에 6μL의 물방울이 분배됐다.

도 1A에 개략적으로 도시된 바와 같이, 게이트(G) 전극(6)으로 작용하는 금 평판(0.6cm² 면적 및 2㎛의 두께)은 전극 깍지형 영역(interdigitated area)에 대응하여 물 위에 안정하게 위치된다. 금 평판은 분젠 연소(Bunsen burn)(flame anneal)하여 5초간 처리한 후, 피라니아 용액(H₂SO₄및 H₂O₂, 3:1 v/v)에서 20분간 침지시켰다. 평판은 또한 10분 동안 끓는 물에 보관한 다음 오존 클리너에서 10분 동안 처리하였다.

게이트 생체 기능화 프로토콜: 금 표면 상의 화학적 SAM은 먼저, 카르복실 작용기로 종결되는 알칸티올 층을 증착시킴으로써 생성되었다. 이를 위해, puriss. p.a. assay, ≥99.8%의 에탄올 중 10:1 비의 3-MPA와 11-MUA로 이루어진 10 mM 용액을 제조하였다. 세척된 금 평판을 3-MPA 및 11-MUA 용액에 담그고 22℃에서 18 시간동안 일정한 N2 플럭스하에서 암실에 보관했다. 강한 금-황 상호 작용은 이후에 25℃에서 2시간 동안 200mM EDC 및 50mM 술포-NHS 수용액에서 활성화된 카르복실기를 노출시킨다.

이어서, 인산염 완충 식염수(PBS) 용액 중 항-IgG에 게이트를 25℃에서 2 시간 동안 침지시킴으로써, 화학적 활성화에 기인한 아미노 기에 항-IgG 항체를 고정시킴으로써 항-IGI SAM이 생성되었다. 용액은 7.4 pH 및 162 mM의 이온 강도에서 0.7 μM (0.1 mg ml-¹)의 항-IgG 및 10 mM(KCl 2.7 mM 및 137 mM NaCl)의 PBS로 구성되었다. 미 반응 술포-NHS 기를 포화시키기 위해 항-IgG SAM을 25℃에서 1 시간 동안 PBS 10mM 내 1M 에탄올아민으로 처리하였다. 마지막으로, 바이오 기능화 게이트는 25℃에서 1시간 동안 PBS 10 mM 내 1.5μM (0.1 mg ml-¹)BSA 용액에 침지되었다. 이 마지막 단계는 비특이적 결합을 최소화하기 위해 수행되지만, 가장 중요하게는 위에 논의된 민감도를 대폭 향상시키는 것이다. 생체 기능화 프로토콜의 각 단계 후에 게이트를 완전히 헹구어 가능한 잔류 물을 제거한다.

항-IgG 게이트 형태학 특성화: 상이한 기능화 단계에서의 게이트 토포그래피가 주사형 전자 현미경(SEM)에 의해 측정되었다. 베어 금(bare gold)과 항-IgG SAM의 이미지는 mod로 획득했다. Sigma, Carl Zeiss, Oberkochen, 독일. 현미경 사진은 2kV의 가속 전압과 30μm의 구경을 사용하여 인-렌즈 검출기(in-lens detector)로 얻었다. 에너지 분산형 분광분석(Energy dispersive spectroscopy)(EDS)은 Oxford Instruments EDS 액세서리(MOD INCAx-act)가 장착된 Zeiss 전계 방출 SEM(mod. Sigma)으로 수행되었다. 스펙트럼은 가속 전압 6 kV, 작동 거리 9.5 mm 및 직경 60 μm의 구멍으로 수집되었다. 조사한 시료 중 PBS 용액에서 나오는 염분 잔류물로 인한 표면 오염은 보이지 않았다. 이것은 모든 SEM 조사 이전에 표면이 순수로 완전히 헹궈 졌기 때문인 것으로 기대되었다. 센싱 측정: EG-OFET 전자 출력 곡선은 금 게이트 전극(6)을 전해질 게이팅 매체로서 기능하는 웰(11) 내의 물과 접촉시킴으로써 측정되었다.

OFET의 전류-전압 곡선은 실온에서 프로브 스테이션이 장착된 Agilent 4155C 또는 Keithley 4200-SCS 반도체 매개변수 분석기로 측정되었다. FET는 공통 소스 구성으로 테스트되었다. 통상적으로, 출력 특성에있어서, 드레인 전류(

)는 0 내지 -0.5V 범위의 상이한 게이트 전압(VG)에서의 드레인 전압(

)의 함수로서, 0.1V 단위로 측정되었다.

전달 특성의 경우, -0.4V의 일정한 드레인 전압에서 VG(-0.01V 단계로 -0.1V에서 -0.7V까지)의 함수로서 측정되었다. 전압 범위는 항-IgG SAM의 산화 분해 과정을 포함하는 전기 화학 프로세스와 관련된 게이트 누설 전류(IG)를 최소화하도록 조정되었다. 이러한 프로세스를 최소화하기 위해 IG는 항상

와 함께 수집되었으며 모든 곡선은 정방향 및 역방향 모드로 측정되어 히스테리시스의 발생을 증명한다.

감지 측정을 진행하기 전에

는 P3HT EG-OFET의 전달 곡선 측정을 사이클링하여 안정화되었으며, 마지막 전류 궤적이 정확하게 이전의 3개의 궤적을 재현할 때까지 완전하게 세척된 베어 금 평판 게이트로 구성된다. 이 과정에서 P3HT OSC의 낮은 이동도의 트랩 상태가 채워지고 안정된

값이 된다. 안정한 전달 곡선이 기록되며 기준으로 사용되었다. 완전히 차단된 항i-IgG SAM으로 기능화된 게이트는 PBS의 100μL에서 10분간 RT 및 암흑에서 항온 처리하였다. 게이트 전극(6)은 PBS로부터 제거하고, HPLC 물로 세척하고, EG-OFET 상에 장착하고 (새로운 금 특성을 대체 함) 새로운 전달 특성을 기록하였다. 이것은 I0 전류-베이스 라인으로 처리된다. 대조 실험(별도로 생체 기능화된 게이트에서 수행)으로서, 이 전류는 동일한 생체 기능화된 게이트의 PBS에서 10분 동안 연속 항온 처리한 후 9회 측정되었다. 첫 번째 트레이스와 비교했을 때 각 트레이스의 상대적인 변화는 1.2±0.1 % 정도로 낮다.

I0 기준선의 측정 후, 동일한 항-IgG 게이트를 침지시키고 공칭 농도가 6 내지

zM 범위인 리간드(IgG 또는 IgM)의 100㎕ PBS 용액에서 10분 동안 항온 처리(RT 및 암흑에서)된다. 포아송(Poisson)과 희석 오류를 모두 고려하여 농도 또는 100 μL로 채취 한 단백질의 수에 대한 오차를 평가한 결과가 Tab에 보고되어 있다. 3S.IgG가 항-IgG에 대한 친화성 리간드인 반면, 항-IgG와 선택적으로 상호작용하지 않는 것으로 알려진 IgM은 네가티브 컨트롤 실험에 사용되었다.

항온 처리(incubation) 시간은 항원 용액에 존재하는 IgG 또는 IgM 단백질이 항-IgG 층에 충돌하기에 충분한 시간을 허용하는 것으로 평가되었다. PBS 항온 처리에서 IgG에 대해

의 높은 확산 상수를 측정하여 10분간 0.4 mm에서 측정한 평균 제곱근 변위(root mean square displacement)를 얻었다. 이러한 현상은 게이트가 항균 처리 용액의 작은 부피에 침지되어 있을 때 대류 운동이 시작된다는 것을 고려하여 항온 처리 시간동안 게이트 표면에 단백질이 충돌하는 것이 합리적이도록 한다. 주목할 점은 주어진 PBS 용액에서 IgG, IgM 및 BSA 단백질이 표면 Z 전위 측정에 의해 입증된 것처럼 네가티브로 하전 된다는 것이다. 구체적으로, IgG:z-pot = -3.4±0.2mV; BSA:z-pot = -9.5±0.5 mV; IgM:z-pot = -2.3±0.2 mV.

IgG 또는 IgM PBS 용액에서 각 항온 처리 후, 생체 기능화된 게이트가 PBS 용액으로 철저히 세척하여 미 반응 리간드를 제거하고 추가로 IV 전달 곡선이 측정되어, 게이트 평판을 베이스 라인, IO의 측정에서와같이 항상 정확히 동일한 높이에 위치시키도록 주의했다.

측정된 전류는 주어진 농도에서 I 신호로 처리된다.

은 주어진 농도에서의 정규화된 전자 응답이며, 관련 용량-반응 곡선은 트랜스-컨덕턴스

를 최대화하는 VG 값에서 조사된 모든 농도에서 이들 데이터 포인트를 플로팅하여 얻어진다. 상기 트랜스-컨덕턴스

는 일반적으로 -0.3V ~ 0.4V 범위에 속한다. 하나의 유일한 항-IgG 게이트가 사용되어, 6에서

zM까지 9 단계의 전체 IgG 용량 곡선을 측정했다. 두 번째 항-IgG 게이트를 사용하여 IgM 투여량 곡선을 측정하였다. 전체 용량 반응 곡선을 측정한 후, 이전에 기준 전류 레벨을 측정하는 데 사용된 베어 금 게이트를 EG-OFET에 다시 배치하고 최종 전달 곡선을 기록한다.

전체 용량 반응 곡선의 측정 전과 후에, 베어 게이트에서 측정된 전류의 상대적 변화가 10% 이내에서만 허용 가능하다고 판단되었다. 이 같은 오류 수준은 데이터 세트를 유효하게 하고 다른 IgG 또는 IgM 리간드 농도에 노출되었을 때 측정된 전류의 변화가 항체-항원 상호 작용 및 가짜 효과에 기인한 것이 아니라는 것을 입증하는 데 사용되었다. 현재까지 IgG 대 항-IgG의 총 25개의 전체 보정 곡선이 동일한 수의 네가티브 컨트롤 실험(IgM 대 항-IgG)과 함께 측정되어 총 225개의 감지 곡선이 얻어졌다.

당연히, 본 발명의 원리는 동일하게 유지되지만, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 구성 및 실시 예의 세부 사항은 단지 예시로서 설명되고 도시된 것이며, 따라서 광범위하게 변화될 수 있다.

Claims (18)

1. 전계 효과 트랜지스터 센서(BS)의 게이트 전극(6)의 기능화 방법으로서,
   상기 게이트 전극(6)의 표면(6F)상에 생물학적 인식 요소 층(9)을 형성하는 단계 ― 상기 생물학적 인식 요소 층(9)은 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질의 자기 조립 구조(SAM)를 포함함 ― ,
   생물학적 인식 요소(SAM)의 층을 공극을 채우고 자기 조립 구조(SAM)에서의 비특이적 결합을 방지하기 위한 차단제를 함유하는 용액으로 처리하는 단계를 포함하며,
   상기 생물학적 인식 요소 층에 고정화된 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질은 0.1x10⁴μm-²와 10x10⁴μm-²사이인 밀도로 팩(pack)됨을 특징으로 하는 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질은,
   하나 이상의 항체,
   항-인간 면역 글로불린(항-hIG) 항체,
   항-인간 면역 글로불린 G (항-IgG) 항체,
   항-인간 면역 글로불린 M (항-IgM) 항체,
   도파민, 키랄 냄새, DNA, PNA, 인간 당단백질, 염증성 사이토카인, C-반응성 단백질에 대한 특이적 결합 쌍 형성 물질
   중 하나 이상을 포함하는, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
3. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기 차단제는 소 혈청 알부민(BSA)인, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 차단제는 소 혈청 알부민 용액인, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 차단제는 완충액 중의 소 혈청 알부민 용액인, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 완충액은 인산염 완충 식염수(PBS) 용액인, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 차단제는 5mM 내지 20mM 인산염 완충 식염수(PBS) 내 0.05 내지 1 mg ml-¹BSA 용액인, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
8. 제7항에 있어서, 생물학적 인식 요소 층을 처리하는 단계는 30분 내지 2시간의 체류 시간 동안 22 내지 26℃의 온도로 PBS 용액 중 소 혈청 알부민(BSA) 용액에 생물학적 인식 요소 층(9)을 침지시키는 단계를 포함하는, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생물학적 인식 요소 층(9)은 상기 하나 이상의 특이적 결합 쌍 형성 물질을 포함하는 생물학적 자기 조립 구조(B_SAM) 및 상기 생물학적 자기 조립 구조가 그라프트(graft)되는 화학적 자기 조립 구조(C_SAM)를 포함하는, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 화학적 자기 조립 구조(C_SAM) 및 생물학적 자기 조립 구조(B_SAM) 각각은 자기 조립 단분자층(self assembled monolayer)(SAM) 구조인, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
11. 제10항에 있어서, 화학적 자기 조립 단분자층(C_SAM)은 카르복실 작용기로 종결되는 알칸티올 층으로 이루어진 전구체에 의해 상기 게이트 전극(6)에 첨가되는, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 카르복실 작용기로 종결되는 알칸티올 층을
    a) 10:1 내지 1:1 비의 3-메르캅토프로피온산(3-MPA)과 11-메르캅토운데카논산(11-MUA), 또는
    b) 3-메르캅토프로피온산(3-MPA)
    으로 이루어진 용액 10 mM 내지 100 mM과 반응시키는 단계, 및
    게이트 전극(6)을 15 내지 20 시간의 체류 시간 동안 15 내지 24℃의 온도에서 침지시키는 단계를 포함하는, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
13. 제10항에 있어서, 상기 게이트 전극(6)은 50 mM 내지 250 mM의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 및 50 mM 내지 250 mM의 N-하이드록시 석신이미드(NHS) 수용액에서, 22℃ 내지 26℃에서 1-3시간의 체류 시간 동안 반응되는, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
14. 제10항에 있어서, 생물학적 자기 조립 단분자층(B_SAM)은 인산염 완충 식염수(PBS) 용액 중 1M 에탄올아민으로 25℃에서 1시간 동안 처리된 항-인간 면역 글로불린 G(항-IgG)의 자기 조립 단분자층(SAM)인, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 인식 요소 층은 상기 게이트 전극(6)의 상기 표면(6F) 상에 그라프트된(grafted) 생물학적 자기 조립 단분자층을 포함하는, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
16. 제15항에 있어서, 생물학적 자기 조립 단분자층은 특이적 결합 쌍 형성 물질로서 하나 이상의 단백질을 포함하고, 상기 하나 이상의 단백질은 상기 게이트 전극 표면(6F)과 반응성인 작용기를 나타내도록 변성되는, 게이트 전극(6)의 기능화 방법.
17. 전계 효과 트랜지스터 센서(BS)에 있어서,
    소스 전극(S),
    드레인 전극(D),
    금 접점 깍지형 패턴(4)을 포함하는 FET 채널,
    상기 깍지형 패턴(4)상에 배치된 반도체(7),
    제1항 또는 제2항의 방법에 따라 기능화된 표면(6F)을 갖는 게이트 전극(6)
    을 포함함을 특징으로 하는 전계 효과 트랜지스터 센서(BS).
18. 제17항에 있어서, 상기 트랜지스터 센서는 상기 FET 채널 및 상기 반도체(7)를 커버하는 게이트 전해질 포함의 웰(11)을 포함하는 전해질 게이트 형 트랜지스터이며, 상기 기능화된 표면(9)은 상기 웰(11) 내의 게이트 전해질에 노출됨을 특징으로 하는 전계 효과 트랜지스터 센서(BS).

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