KR102494749B1 - 암 치료용 cage 저해제에 대한 반응자 특성화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CAGE 저해제이자 신규한 올리고펩티드 AQTGTGKT의 아날로그 화합물 및 상기 화합물에 대한 반응자 특성화 방법으로서, 상기 화합물이 CAGE을 과발현하는 암에서 우수한 항암 효과를 발휘함을 확인하여 완성된 것이다. 상기 화합물은 항체에 비해 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고, 조직 내에 침투가 용이하다는 점에 더하여 암 세포의 증식 억제 효과가 더욱 뛰어날 뿐만 아니라, 인간의 혈액 내에서 안정적으로 존재할 수 있으므로 유용한 항암제로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 특히 CAGE 발현 수준 측정에 기반한 동반 진단 방법을 통해 본 발명의 화합물에 대한 반응자를 선별할 수 있으므로 상기 화합물의 항암 효과를 극대화하는 동시에 의료비 절감 효과를 달성할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 항암 치료를 위한 CAGE 저해제에 대한 반응자 특성화 방법 및 상기 반응자에게 사용하기 위한 AQTGTGKT의 아날로그 화합물 등에 관한 것이다.
현재 암의 조기 진단법의 개발 및 새로운 항암 요법의 지속적인 개발로 인하여 암의 치료 효과가 향상되고 있음에도 불구하고, 암은 아직도 우리나라 사망 원인 중 제1, 2위를 다투는 중요한 질환이다. 현재 사용되고 있는 항암제의 대부분은 화학요법에 의한 것으로 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료의 문제점으로 지적되고 있다.
기존의 항암제는 암 세포뿐만 아니라, 정상 조직에도 침투하여 정상 세포의 기능 및 활성에 손상을 입히기 때문에, 골수 기능 저하, 위장장애, 탈모증 등의 부작용을 유발하기도 하고, 장기간 화학 요법에 따른 항암제에 대한 다약제 저항성을 보이는 등 암 치료의 커다란 문제점을 보인다. 따라서, 기존 항암제의 이러한 심각한 문제점을 해결할 수 있는 혁신적인 항암제의 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 종양 세포의 특이적 종양 항원을 표적으로 하는 항체의 개발이 이루어지고 있으나, 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문제점이 있다. 반면, 펩티드(peptide)의 경우 분자량이 작아 항체와는 다르게 면역반응 우려가 적고, 조직 내 침투가 용이한 장점이 있으며, 종양 항원을 표적으로 하는 펩티드 기반 항암제는 종양에 선택적으로 작용할 수 있기 때문에 정상세포에 손상을 입히는 등의 부작용이 거의 없을 것으로 기대되고 있다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고 매우 제한적인 암종에만 사용되고 있으며, 특히 인간에게 투여 직후 짧은 시간 내에 분해되어 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있었다.
상기 문제점을 해결하기 위한 방법으로 펩티드를 아미드화(amidation), 에스터화(esterification), 아실화(acylation), 아세틸화(acetylation), 페길화 (PEGylation), 고리화(cyclization) 또는 알킬화(alkylation) 등에 의해 변형시킴으로써 수율의 향상, 생체 내 활성의 증가, 수용체에 대한 펩티드의 친화성 증가, 단백질의 분해 지연 등을 꾀할 수 있으나, 상기 변형에 의하더라도 원하는 효과가 향상되는 것은 보장되지 않으며, 오히려 펩티드가 본래 가지고 있던 생체 내 활성을 잃어버리거나 예기치 못한 부작용이 발생할 수 있는 위험이 있다. 따라서 이러한 부정적 효과를 최소화함과 동시에 목적하는 효과를 극대화하기 위한 펩티드의 변형에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
아울러 최근에는 환자에게 더욱 맞춤화된 치료 방법을 선택하게 할 수 있는 동반 진단에 대한 관심이 높아지고 있다. 동반 진단은 특정 약물에 대한 환자의 치료 반응을 미리 예측하기 위한 분자진단기법의 일종을 말한다. 즉, 동일한 항암제라도 환자 개개인의 유전적 특성에 따라 치료 효과 또는 반응이 달라질 수 있는데, 동반 진단은 기존의 분석기법과 달리 특정 약물과 진단을 연계하여 해당 약물에 대한 환자의 반응성을 미리 예측할 수 있으므로 약물 투여 전 치료 효과를 보일 수 있는 환자를 선별하는 임상적 근거가 되고 있다. 동반 진단은 특히 환자의 치료제 반응성을 예상할 수 있을 뿐만 아니라, 불필요한 항암제 투여를 방지하여 항암제 과용에 따른 부작용 등을 크게 줄이고 의료비를 절감할 수 있는 이점이 있으므로 동반 진단을 개발 및 적용하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나 특정 항암제에 대해 반응성을 갖는 환자의 특성을 선별하여 정립하는 것은 기술적으로 여전히 많은 어려움이 뒤따르고 있으며, 효과적인 항암제 및 이에 최적화된 동반 진단 방법은 아직까지 발굴되지 않은 실정이다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위한 예의 연구 결과 완성된 것으로서, 본 발명자들은 AQTGTGKT 펩티드의 아미드화(amidation)된 아날로그 화합물이 우수한 항암 효과 및 증가된 반감기를 가지는 것을 확인하였으며, 특히 CAGE를 과발현 하는 암세포주에서 상기 AQTGTGKT 아날로그 화합물이 뛰어난 항암 효과를 보이는 것을 확인하여 완성된 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 항암 치료를 위한 CAGE 저해제에 대한 반응자 특성화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자의 판정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자의 판정용 키트를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 항암 치료를 위한 CAGE 저해제에 대한 반응자 특성화 방법으로서,
상기 방법은 하기 단계를 포함하고:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CAGE의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 CAGE의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, CAGE 저해제에 대한 반응자로 판정하는 단계,
상기 CAGE 저해제는 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에 있어서,
R1은 수소; 치환 또는 비치환된 페닐기; 치환 또는 비치환된 나프틸기; 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C3의 알킬기이다.
또한, 본 발명은 CAGE의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자의 판정용 조성물로서,
상기 CAGE 저해제는 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 R1은 하기 화학식 2 내지 5로 표시되는 화합물 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 3에 있어서,
R2는 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 또는 페닐기이고;
R3은 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 페닐기, C1 내지 C3의 알콕시기, 모르포릴기, 또는 CF3이고;
R4는 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 페닐기, C1 내지 C6의 알콕시기, 또는 OCF3이며;
R5는 수소 또는 메틸기이고;
상기 화학식 4에 있어서,
R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 C1 내지 C3의 알킬기이며,
상기 화학식 5에 있어서,
R8은 CX이고, x는 0 내지 3의 정수이고,
X가 1 이상일 때 R9 및 R10은 각각 독립적으로 H, C1 내지 C6의 알킬기, 또는 페닐기이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 (S1) 단계에서 CAGE의 발현 수준과 함께 ATG5, ATG12, Beclin 1, 및 LC3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 추가로 측정할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 암은 EGFR 돌연변이가 일어난 암일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 암은 폐암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 편평상피성 폐암, 비편평상피성 폐암, 대장암, 교모세포종, 유방암, 신경교종, 위암, 두경부암, 수모세포종, 췌장암, 척삭종, 별아악성 뇌교종, 별아교세포종, 비강암, 흑색종, 자궁내막암, 신경내분비암, 원발성 복막암, 핍지교종, 후두 편평세포암종, 후두암, 요로상피세포암종, 식도 편평세포암종, 식도암, 핍지교성상세포종, 산재적 내재성 뇌교종, 나팔관암, 간담도암, 구인두암, 구인두 편평세포암종, 구강암, 구강 편평세포암종, 난소암, 쓸개관암, 암육종, 간세포암종, 난소상피암, 침샘암, 위장관간질종양, 신경모세포종, 횡문근육종, 포도막흑색종, 원시 신경외배엽종양, 뇌수막종, 항문 편평세포암종, 뇌실막세포종, 하인두 편평세포암종, 비인두암, 및 뇌하수체암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체, 및 진공흡입생검 검체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 대조군은 정상인 또는 상기 CAGE 저해제에 대한 비반응자로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 CAGE의 발현 수준은 CAGE 단백질 수준이고, 상기 CAGE 단백질 수준은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 CAGE의 발현 수준은 CAGE mRNA 발현 수준이고, 상기 mRNA 발현 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 (northern blotting), 서던 블랏팅 (southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및 RNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 ATG5, ATG12, Beclin 1, 및 LC3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 CAGE의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 암 환자를 CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자로 판정하기 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, CAGE의 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자의 판정용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 키트는 하기의 단계를 포함하는 동반진단 방법이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(S1) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CAGE의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 CAGE의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자로 판정하는 단계.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 CAGE 저해제에 대한 반응자로 판정된 개체에게 본 발명에 따른 CAGE 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 CAGE 저해제에 대한 반응자로 판정된 개체를 위한 CAGE 저해제의 암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 CAGE 저해제에 대한 반응자로 판정된 개체를 위한 항암제의 제조를 위한 CAGE의 용도를 제공한다.
본 발명은 CAGE 저해제이자 신규한 올리고펩티드 AQTGTGKT의 아날로그 화합물 및 상기 화합물에 대한 반응자 특성화 방법으로서, 상기 화합물이 CAGE을 과발현하는 암에서 우수한 항암 효과를 발휘함을 확인하여 완성된 것이다. 상기 화합물은 항체에 비해 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고, 조직 내에 침투가 용이하다는 점에 더하여 암 세포의 증식 억제 효과가 더욱 뛰어날 뿐만 아니라, 인간의 혈액 내에서 안정적으로 존재할 수 있으므로 유용한 항암제로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 특히 CAGE 발현 수준 측정에 기반한 동반 진단 방법을 통해 본 발명의 화합물에 대한 반응자를 선별할 수 있으므로 상기 화합물의 항암 효과를 극대화하는 동시에 의료비 절감 효과를 달성할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1 내지 도 7은 본 발명에 따른 화합물을 동정하고, 화합물의 구조 확인을 위한 UPLC-MS(상단) 및 1H NMR(하단) 결과를 나타낸 도로서, 도 1은 4-PhPh-AQTGTGKT, 도 2는 Ac-AQTGTGKT, 도 3은 3-PhPh-AQTGTGKT, 도 4는 4-MeOPh-AQTGTGKT, 도 5는 2-PhPh-AQTGTGKT, 도 6은 Ph-AQTGTGKT, 도 7은 Naphthyl-AQTGTGKT의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 CAGE 비과발현 암세포주인 H23의 정상 또는 혈청 결핍 환경에서 CAGE 및 오토파지 관련 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 CAGE 비과발현 암세포주인 A549의 정상 또는 혈청 결핍 환경에서 CAGE 및 오토파지 관련 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 CAGE 과발현 암세포주인 H1975의 정상 또는 혈청 결핍 환경에서 CAGE 및 오토파지 관련 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 CAGE 과발현 암세포주인 H1299의 정상 또는 혈청 결핍 환경에서 CAGE 및 오토파지 관련 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 CAGE 비과발현 암세포주인 H23에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 CAGE 비과발현 암세포주인 A549에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 CAGE 과발현 암세포주인 H1975에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; 이하 동일).
도 15는 CAGE 과발현 암세포주인 H1299에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 CAGE 비과발현 암세포주인 H23의 정상 또는 혈청 결핍 환경에서 CAGE 및 오토파지 관련 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 CAGE 비과발현 암세포주인 A549의 정상 또는 혈청 결핍 환경에서 CAGE 및 오토파지 관련 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 CAGE 과발현 암세포주인 H1975의 정상 또는 혈청 결핍 환경에서 CAGE 및 오토파지 관련 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 CAGE 과발현 암세포주인 H1299의 정상 또는 혈청 결핍 환경에서 CAGE 및 오토파지 관련 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 CAGE 비과발현 암세포주인 H23에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 CAGE 비과발현 암세포주인 A549에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 CAGE 과발현 암세포주인 H1975에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; 이하 동일).
도 15는 CAGE 과발현 암세포주인 H1299에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명은 항암 치료를 위한 CAGE 저해제에 대한 반응자 특성화 방법으로서, AQTGTGKT 펩티드의 아미드화된 아날로그 화합물이 우수한 항암 효과 및 증가된 반감기를 가지는 것을 확인하고, 특히 CAGE를 과발현 하는 암세포주에서 상기 AQTGTGKT 아날로그 화합물이 뛰어난 항암 효과를 보이는 것을 확인하여 완성된 것이다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 CAGE 저해제인 AQTGTGKT 아날로그를 제조 및 동정한 후 각 화합물의 구조를 확인하였다 (실시예 1).
본 발명의 다른 실시예에서는 암세포주의 단백질 수준을 비교한 결과, 일부 암세포주는 CAGE를 과발현하고 특히 혈청 결핍시 CAGE 및 오토파지 관련 단백질들의 수준이 크게 증가하는 반면, 기타 암세포주는 혈청 결핍과 무관하게 CAGE의 발현량이 매우 저조한 것을 확인하여, CAGE 과발현 세포주와 CAGE 비과발현 세포주로 분류하였다 (실시예 2).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 CAGE 과발현 세포주와 CAGE 비과발현 세포주에 AQTGTGKT 아날로그 화합물을 각각 처리한 후 세포 활성을 비교한 결과, AQTGTGKT 아날로그 화합물이 CAGE 과발현 세포주에서 매우 뛰어난 항암 효과를 발휘하는 것을 확인하였다 (실시예 3).
이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.
본 발명은 항암 치료를 위한 CAGE 저해제에 대한 반응자 특성화 방법으로서,
상기 방법은 하기 단계를 포함하고:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CAGE의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 CAGE의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, CAGE 저해제에 대한 반응자로 판정하는 단계,
상기 CAGE 저해제는 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는, 방법을 제공한다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에 있어서,
R1은 수소; 치환 또는 비치환된 페닐기; 치환 또는 비치환된 나프틸기; 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C3의 알킬기이다.
이 때, 상기 일반식에서, A는 알라닌 (alanine)이고, Q는 글루타민 (glutamine)이고, T는 트레오닌 (threonine)이고, G는 글라이신 (glysine)이고, K는 라이신 (lysine)이다.
바람직하게는, 상기 R1은 하기 화학식 2 내지 5로 표시되는 화합물 중 어느 하나일 수 있다:
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 3에 있어서,
R2는 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 또는 페닐기이고;
R3은 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 페닐기, C1 내지 C3의 알콕시기, 모르포릴기, 또는 CF3이고;
R4는 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 페닐기, C1 내지 C6의 알콕시기, 또는 OCF3이며;
R5는 수소 또는 메틸기이고;
상기 화학식 4에 있어서,
R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 C1 내지 C3의 알킬기이며,
상기 화학식 5에 있어서,
R8은 CX이고, x는 0 내지 3의 정수이고,
X가 1 이상일 때 R9 및 R10은 각각 독립적으로 H, C1 내지 C6의 알킬기, 또는 페닐기이다.
가장 바람직하게는, 상기 X는 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 및 
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
본 발명에 있어서, 항암 치료를 위한 CAGE 저해제에 대한 반응자 특성화 방법이란 본 발명에 따른 CAGE 저해제 (AQTGTGKT 올리고펩티드 아날로그)에 대한 개체의 치료 반응성 여부를 판정하기 위한 방법으로서, 암 환자에서 암을 개선, 예방, 및/또는 치료하기 위해 CAGE 저해제를 적용 (투여)할지 여부를 판단하기 위한 동반 진단 방법을 의미한다. 따라서, 상기 CAGE 저해제에 대한 반응자 특성화 방법에 따라 본 발명에 따른 CAGE 저해제의 반응자로 판정된 개체는 상기 CAGE 저해제 투여시 암 치료 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 항암 치료를 위한 CAGE 저해제에 대한 반응자 특성화 방법은 in vitro에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 "CAGE (Cancer-associated gene protein, 또는 Cancer/testis antigen)"는 정상인에서는 고환 특이적으로 발현되지만 암 환자의 경우 다양한 암 조직에서 발현되는 것으로 알려진 단백질이다. 그러나 본 발명자들은 암의 구체적인 유형별로 CAGE의 발현량이 상이한 것을 확인하였으며, CAGE를 과발현하는 암세포의 경우 본 발명에 따른 화합물 AQTGTGKT의 아날로그 처리하였을 때 CAGE를 발현하지 않는 암세포에 비해 세포 활성이 크게 감소하는 것을 확인하였다. CAGE는 공지된 단백질로서 구체적인 정보는 공공 단백질 데이터베이스 UniProt에서 등록번호 Q86TM3로 확인할 수 있다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 "투여"란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "예방"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "올리고펩티드"는 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형(linear)의 분자를 의미한다. 본 발명의 올리고펩티드는 분자·생물학적인 방법과 함께 당업계에 공지된 화학적 합성 방법(예를 들어, 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques))에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명에 따른 화합물의 범위에는 이의 약학적으로 허용 가능한 염도 포함될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제점이나 합병증 없이 이득/위험 비가 합리적이어서 대상체(예: 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 건전한 의학적 판단의 범주 이내인 화합물을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염 및 약학적으로 허용 가능한 금속염을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 화합물의 범위에는 본 발명의 화합물과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 갖는 생물학적 기능 균등물이 포함될 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하 및 크기 등에 기초하여 이루어질 수 있다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 알라닌과 글라이신은 유사한 크기를 가지고; 라이신은 양전하를 띤 잔기이며; 글루타민과 트레오닌은 전하를 띠지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 알라닌과 글라이신; 그리고 글루타민과 트레오닌은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 다음과 같이 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인 (+2.5); 메싸이오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루탐산 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파트산 (-3.5); 아스파라진 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파트산(+3.0±1); 글루탐산 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라진 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메싸이오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 아이소류신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 상기 일반식으로 표시되는 화합물의 아미노산 서열(AQTGTGKT)의 단백질은 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 62.5%의 상동성, 보다 바람직하게는 75% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 87.5% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물에서, 상기 X가 
인 경우, 인간 혈액 내에서의 반감기는 20분 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 반감기는 예를 들어 20분 내지 30분, 21분 내지 30분, 22분 내지 30분, 23분 내지 30분, 24분 내지 30분, 25분 내지 30분, 26분 내지 30분, 27분 내지 30분, 28분 내지 30분, 29분 내지 30분, 20분 내지 29분, 21분 내지 29분, 21분 내지 28분, 21분 내지 27분, 21분 내지 26분, 21분 내지 25분, 21분 내지 24분, 21분 내지 23분, 21분 내지 22분, 22분 내지 30분, 22분 내지 28분, 22분 내지 26분, 22분 내지 24분, 23분 내지 30분, 23분 내지 28분, 23분 내지 26분, 23분 내지 24분, 24분 내지 30분, 24분 내지 27분, 25분 내지 30분, 25분 내지 27분, 26분 내지 30분, 26분 내지 28분, 27분 내지 30분, 27분 내지 29분, 28분 내지 30분, 28분 내지 29분 또는 29분 내지 30분 등일 수 있다. 또한, 상기 반감기는 AQTGTGKT의 반감기와 비교하여 1900% 내지 2900% 증가한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 증가 비율은 예를 들어 1900% 내지 2700%, 2000% 내지 2700%, 2100% 내지 2700%, 2200% 내지 2700%, 2300% 내지 2700%, 2400% 내지 2700%, 2500% 내지 2700%, 2600% 내지 2700%, 1900% 내지 2600%, 2000% 내지 2600%, 2100% 내지 2600%, 2100% 내지 2500%, 2100% 내지 2400%, 2100% 내지 2300%, 2100% 내지 2200%, 2200% 내지 2700%, 2200% 내지 2600%, 2200% 내지 2500%, 2200% 내지 2400%, 2200% 내지 2300%, 2300% 내지 2700%, 2300% 내지 2500%, 2400% 내지 2700%, 2400% 내지 2600%, 또는 2500% 내지 2700% 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물에서, 상기 X가 
, 
, 
, 
, 및 
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 경우, 인간 혈액 내에서의 반감기는 45분 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 반감기는 예를 들어 45분 내지 70분, 46분 내지 70분, 47분 내지 70분, 48분 내지 70분, 49분 내지 70분, 50분 내지 70분, 51분 내지 70분, 53분 내지 70분, 55분 내지 70분, 57분 내지 70분, 59분 내지 70분, 65분 내지 70분, 45분 내지 65분, 50분 내지 65분, 55분 내지 65분, 60분 내지 65분, 45분 내지 60분, 50분 내지 60분, 55분 내지 60분, 45분 내지 55분, 50분 내지 55분, 또는 60분 내지 70분 등일 수 있다. 또한, 상기 반감기는 AQTGTGKT의 반감기와 비교하여 4400% 내지 6900% 증가한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 증가 비율은 예를 들어 4400% 내지 6900%, 4500% 내지 6900%, 4600% 내지 6900%, 4700% 내지 6900%, 4800% 내지 6900%, 4900% 내지 6900%, 5000% 내지 6900%, 5100% 내지 6900%, 5200% 내지 6900%, 5300% 내지 6900%, 5400% 내지 6900%, 5500% 내지 6900%, 5600% 내지 6900%, 5700% 내지 6900%, 5800% 내지 6900%, 5900% 내지 6900%, 6000% 내지 6900%, 6100% 내지 6900%, 6200% 내지 6900%, 6300% 내지 6900%, 6400% 내지 6900%, 6500% 내지 6900%, 6600% 내지 6900%, 6700% 내지 6900%, 6800% 내지 6900%, 4400% 내지 6500%, 4500% 내지 6500%, 4700% 내지 6500%, 5000% 내지 6500%, 5200% 내지 6500%, 5500% 내지 6500%, 5700% 내지 6500%, 6000% 내지 6500%, 6300% 내지 6500%, 4400% 내지 6000%, 4600% 내지 6000%, 4800% 내지 6000%, 5000% 내지 6000%, 5500% 내지 6000%, 4400% 내지 5500%, 4700% 내지 5500%, 5000% 내지 5500%, 5200% 내지 5500%, 4400% 내지 5000%, 4800% 내지 5000%, 4400% 내지 4700%, 또는 4500% 내지 4700% 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물에서, 상기 X가 
인 경우, 인간 혈액 내에서의 반감기는 100분 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 반감기는 예를 들어 100분 내지 150분, 102분 내지 150분, 103분 내지 150분, 104분 내지 150분, 105분 내지 150분, 106분 내지 150분, 107분 내지 150분, 108분 내지 150분, 109분 내지 150분, 110분 내지 150분, 111분 내지 150분, 112분 내지 150분, 115분 내지 150분, 117분 내지 150분, 120분 내지 150분, 123분 내지 150분, 125분 내지 150분, 127분 내지 150분, 130분 내지 150분, 132분 내지 150분, 135분 내지 150분, 137분 내지 150분, 140분 내지 150분, 142분 내지 150분, 145분 내지 150분, 147분 내지 150분, 148분 내지 150분, 100분 내지 140분, 102분 내지 140분, 104분 내지 140분, 106분 내지 140분, 108분 내지 140분, 120분 내지 140분, 125분 내지 140분, 130분 내지 140분, 135분 내지 140분, 100분 내지 130분, 102분 내지 130분, 105 내지 130분, 110분 내지 130분, 115분 내지 130분, 120분 내지 130분, 125분 내지 130분, 100분 내지 120분, 105분 내지 120분, 110분 내지 120분, 115분 내지 120분, 100분 내지 110분, 105분 내지 110분, 또는 100분 내지 105분 등일 수 있다. 또한, 상기 반감기는 AQTGTGKT의 반감기와 비교하여 9900% 내지 14900% 증가한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 증가 비율은 예를 들어 9900% 내지 14900%, 10000% 내지 14900%, 10100% 내지 14900%, 10200% 내지 14900%, 10300% 내지 14900%, 10400% 내지 14900%, 10500% 내지 14900%, 10700% 내지 14900%, 11000% 내지 14900%, 11500% 내지 14900%, 12000% 내지 14900%, 12500% 내지 14900%, 13000% 내지 14900%, 13500% 내지 14900%, 14000% 내지 14900%, 14500% 내지 14900%, 9900% 내지 12000%, 10000% 내지 12000%, 10200% 내지 12000%, 10500% 내지 12000%, 10700% 내지 12000%, 11000% 내지 12000%, 11500% 내지 12000%, 11700% 내지 12000%, 9900% 내지 11000%, 10000% 내지 11000%, 또는 9900% 내지 10000% 등일 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 선택될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 약학적 조성물은 0.001 내지 1000 mg/kg, 0.01 내지 100 mg/kg, 0.01 내지 10 mg/kg, 0.1 내지 10 mg/kg 또는 0.1 내지 1 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여, 비강 내 투여, 경기관지 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일일 투여량은 하루 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 (S1) 단계에서 CAGE의 발현 수준과 함께 ATG5, ATG12, Beclin 1, 및 LC3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 추가로 측정하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 (S1) 단계에서 측정된 CAGE; 및 ATG5, ATG12, Beclin 1, 및/또는 LC3의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, CAGE 저해제에 대한 반응자로 판정할 수 있다.
ATG5 (Autophage related protein 5), ATG12 (Autophage related protein 12), Beclin 1, 및 LC3 (Microtubule-associated protein light chain 3)는 오토파지 관련 인자들로, 본 발명에 있어서 "오토파지 (autophagy)"란 세포 소기관 손상, 비정사적인 단백질의 존재, 및 영양 결핍을 포함한 다양한 스트레스 조건에서 발생하는 세포 내 분해 기작으로, 불필요하거나 기능하지 않는 세포 구성 성분이 자연적으로 분해되는 것을 지칭한다. 오토파지는 종양 억제 및 촉진 모두와 관련이 있으므로, 암에서의 오토파지의 정확한 기작을 밝히기 위한 연구가 필요하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 CAGE를 과발현 하는 암세포는 혈청 결핍 조건에서 오토파지 마커들의 발현이 크게 증가하는 것을 확인하였으며, 상기 유형의 암세포에서 본 발명에 따른 CAGE 저해제가 뛰어난 항암 효과를 발휘하는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 CAGE 저해제는 암의 예방 또는 치료에 사용된다. 본 발명의 CAGE 저해제가 적용될 수 있는 암은 폐암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 편평상피성 폐암, 비편평상피성 폐암, 대장암, 교모세포종, 유방암, 신경교종, 위암, 두경부암, 수모세포종, 췌장암, 척삭종, 별아악성 뇌교종, 별아교세포종, 비강암, 흑색종, 자궁내막암, 신경내분비암, 원발성 복막암, 핍지교종, 후두 편평세포암종, 후두암, 요로상피세포암종, 식도 편평세포암종, 식도암, 핍지교성상세포종, 산재적 내재성 뇌교종, 나팔관암, 간담도암, 구인두암, 구인두 편평세포암종, 구강암, 구강 편평세포암종, 난소암, 쓸개관암, 암육종, 간세포암종, 난소상피암, 침샘암, 위장관간질종양, 신경모세포종, 횡문근육종, 포도막흑색종, 원시 신경외배엽종양, 뇌수막종, 항문 편평세포암종, 뇌실막세포종, 하인두 편평세포암종, 비인두암, 및 뇌하수체암 등으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 EGFR (Epidermal growth factor receptor) 돌연변이가 일어난 암일 수 있다. EGFR은 세포외 단백질 리간드인 표피성장인자 (Epidermal growth factor) 패밀리의 수용체로 기능하는 막관통 단백질이다. EGFR 신호전달의 결핍은 알츠파이머와 같은 질환과 관련이 있는 반면, 과잉의 EGFR 신호전달은 종양을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 일부 암 유형에서 EGFR의 발현 또는 활성 돌연변이가 특징적으로 나타난다.
본 발명에 있어서 "생물학적 시료"란 CAGE 저해제에 대한 반응성을 예측하고자 하는 피검체로부터 채취된 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 시료는 액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체, 및 진공흡입생검 검체 등으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 생물학적 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 상기 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데, 예를 들어 환자로부터 수득한 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
본 발명에 있어서, "대조군 (control)"은 정상인 또는 상기 CAGE 저해제에 대한 비반응자로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 "피검체"는 인간을 포함한 포유류일 수 있으며, 암을 앓거나 앓는 것으로 의심되는 개체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "측정"은 목적하는 물질 (본 발명의 경우 CAGE 유전자의 mRNA 또는 단백질)의 존재 (발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 즉, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것 (즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법 (분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 단백질 검출은 콜라겐 단백질의 존재 여부의 검출, 또는 상기 단백질 수준의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "분석"은 바람직하게는 "측정"을 의미하는 것일 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있으며, 바람직하게는 정량적인 측정이 수행되는 것일 수 있다.
CAGE의 단백질 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 단백질 측정 방법에 의한 것이라면 특별한 제한은 없으나, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS, 및/또는 단백질칩 등의 방법에 의해 측정할 수 있다.
CAGE의 mRNA 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 mRNA 측정 방법에 의한 것이라면 특별한 제한은 없으나, PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및/또는 RNA 칩 등의 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "수준이 증가되어 있다"는 것은, 검출되지 않던 것이 검출된 것, 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 검출량이 많아지는 것을 의미한다. 예를 들어, 수준이 "증가"되어 있다는 것은, 실험군의 수준이 대조군의 그것에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높은, 및/또는 0.5배, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배 또는 그 이상 높은 것을 의미한다. 구체적으로는, 대조군의 그것에 비해 1 내지 1.5배, 1.5 내지 2배, 2 내지 2.5배, 2.5 내지 3배, 3 내지 3.5배, 3.5 내지 4배, 4 내지 4.5배, 4.5 내지 5배, 5 내지 5.5배, 5.5 내지 6배, 6 내지 6.5배, 6.5 내지 7배, 7 내지 7.5배, 7.5 내지 8배, 8 내지 8.5배, 8.5 내지 9배, 9 내지 9.5배, 9.5 내지 10배, 또는 10배 이상 증가한 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대 의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.
또한, 본 발명은 CAGE의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자의 판정용 조성물로서,
상기 CAGE 저해제는 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물에 의해 CAGE의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 것으로 확인된 암 환자는 본 발명에 따른 CAGE 저해제의 반응자, 즉, 암 치료를 위해 CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자로 판정될 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 조성물은 ATG5, ATG12, Beclin 1, 및 LC3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물이 mRNA의 수준을 측정하기 위한 것인 경우에 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다. 상기 콜라겐 유전자들의 mRNA에 특이적인 프라이머 세트 또는 프로브를 포함하는 본 발명의 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용함으로써 피검체에서 상기 단백질 마커들의 mRNA의 수준을 측정할 수 있다.
상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 모든 기능적 등가물을 포함한다. 또한 프라이머 또는 프로브는 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명의 조성물이 단백질의 수준을 측정하기 위한 것인 경우에 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 본 발명 단백질에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 본 발명 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머 (aptamer)"는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CAGE 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 본 발명의 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체 (본 발명에서는 피검체로부터 수득한 생물학적 시료)에서 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, CAGE의 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자의 판정용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, "키트 (kit)"란 특히 조직 또는 세포 시료 내에 포함되어 있는 CAGE의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하여 두경부암의 예후를 예측할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 상기 유전자들의 발현량을 측정할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 따라서, 본 발명의 키트에는 표적 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머 세트, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 하기의 단계를 포함하는 동반진단 방법이 기재된 설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
(S1) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CAGE의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 CAGE의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자로 판정하는 단계.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험 방법
1. 면역블롯 (Immunoblot)
암세포별 CAGE 단백질 수준을 확인하기 위해 용해 버퍼 (lysis buffer) (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 10% (v/v) 글리세롤, 50 mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol), 0.01% (w/v) 브롬페놀 블루 (bromphenol blue), 10 mM NaF, 1% (v/v) 프로테아제 저해제, 및 1 mM 소듐 오소바나데이트 (sodium orthovanadate)를 함유함)를 이용해 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 5분간 끓인 후 시료별로 10% SDS-PAGE에 웰당 20 μg 단백질을 로딩하여 전기영동을 수행했다. 전기영동을 마친 후 단백질을 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼 (transfer)하였다. 상기 멤브레인을 2% BSA를 함유한 블로킹 (blocking) 용액 (0.1% Tween-20을 함유한 TBS 용액)에서 30분간 블로킹하고, 목적 단백질에 특이적인 1차 항체를 처리하여 4 ℃에서 밤새 인큐베이션했다. 1차 항체가 결합된 멤브레인을 세척한 후, 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase)가 결합되어 있는 2차 항체를 실온에서 1시간 처리하였다. 면역블롯팅을 마친 멤브레인의 단백질 밴드는 화학형광 화학발광면역 측정법으로 검출하였다.
2. 혈청 결핍 (serum starvation)
영양분을 제한하는 환경에서의 단백질 활성 변화를 확인하기 위해 혈청 결핍 스트레스를 가했다. 정상적인 세포배양 조건은 10% FBS (Fetal bovine serum)가 첨가된 완전배지에서 세포를 배양한다. 일반적으로 오토파지 활성과 관련된 단백질의 활성을 평가하기 위하여 혈청 또는 glucose 또는 아미노산을 제한하는 방법 중 하나를 선택하여 사용한다. 본 발명에서는 오토파지 활성에 중요한 역할을 하는 Beclin 1 단백질 인산화의 변화를 평가하기 위하여 배지내의 혈청 농도가 0.5%일 때 가장 적합한 것을 확인하였고, 이 조건을 혈청 결핍 조건으로 하여 이후 실험에 적용하였다.
3. MTT(tetrazolium) 분석
본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그 화합물을 암 세포주에 처리한 후 MTT 분석을 통해 세포의 증식 정도를 측정하였다. 구체적으로, 정상적인 조건 (10% FBS)에서 배양중인 세포를 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 50 ml 원심분리용 튜브에 회수했다. 회수된 세포를 1x PBS로 2번 세척한 뒤, 세척된 세포에 0.5% FBS가 첨가된 배지로 현탁했다. 96-well 플레이트에 각 well 당 5 × 103개 세포/100 μl 세포를 분주하고, 24시간 동안 배양한 후 본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그 7종을 각각 도입하였다. 72시간 경과 후 CellTiter-96® (Promega Co., 미국) 시약을 각 well 당 10 μl씩 첨가하고 5% CO2, 37℃에서 반응시켰다. 3시간 경과 후 분광광도계 (spectrophotometer; SPECTROstarNano, BMG)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 1: AQTGTGKT 아날로그 (analogs)의 제조
1.1. 반응 일반
모든 반응은 달리 언급되지 않는 한 추가 반응 없이 상업적으로 판매되는 물질 및 시약을 사용하여 수행하였다. 반응들은 실리카겔 플레이트 (Keiselgel 60 F254, Merck) 및/또는 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC) 상의 박막 크로마토그래피 (TLC)에 의해 모니터링 하였다. TLC 플레이트 상의 반점의 가시화는 UV 광에 의해 그리고 과망간산 칼륨 및/또는 닌하이드린에서 TLC 플레이트를 염색하고 히트건 (heat gun)으로 탄화시킴으로써 달성되었다. 모든 생성물은 1H NMR 및/또는 UPLC-MS를 사용하여 특정하였다.
1.2. Boc/OBn-TG의 합성
먼저 작용기가 벤질로 보호된 TG를 하기의 반응식 1에 따라 합성하였다. 이하 각 반응식에서 화합물 하기에 병기한 아라비아 숫자(n)에 따라 화합물 n으로 지칭하기로 한다.
[반응식 1]
구체적으로, BocThr(OBn)OH (화합물 1; 25.0 g, 80.8 mmol, 1.0 당량) 및 NOSu (9.77 g, 84.8 mmol, 1.05 당량)를 다이클로로메탄 (150 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 불활성 대기하에 두었다. 그 후, 상기 혼합물에 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드 (16.3 g, 84.8 mmol, 1.05 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 20시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 NH4Cl(포화 수성)로 세척하고 상을 분리하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조시키고 감압하에 농축하여 생성물로서 담황색 오일 (35.7 g, >100% 수율, 정량 수율을 가정)의 화합물 2를 수득하였다.
상기 화합물 2 BocThr(OBn)OSu (32.8 g, 80.8 mmol, 1.0 당량)를 1,4-다이옥세인 (200 mL)에 용해시키고, 증류수 (100 mL) 중의 글라이신 나트륨 염 수화물 용액을 한번에 첨가하였다. 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 및 시트르산(포화 수성)으로 분획하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에서 농축하였다. 조 물질을 물 (0.1% 포름산) 용리액 중 30-70% 아세토 나이트릴 (0.1% 포름산)으로 C18 (400 g) 컬럼에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고, 에틸 아세테이트 및 NaHCO3(포화 수성)으로 분획하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에 생성물로서 담황색 검 (21.9 g, 74% 수율)의 화합물 3을 수득하였다.
1.3. CBz/OBn/CO
2
Bn-KT의 합성
OH 작용기가 벤질로 보호된 KT를 하기의 반응식 2에 따라 합성하였다.
[반응식 2]
구체적으로, BocLys(CBz)OH (화합물 4; 27.0 g, 70.9 mmol, 1.0 당량) 및 NOSu (9.80 g, 85.1 mmol, 1.2 당량)를 다이클로로메탄 (128 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 불활성 대기하에 두었다. 그 후, 상기 혼합물에 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸 카보다이이미드 하이드로 클로라이드 (16.3 g, 85.1 mmol, 1.05 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 20시간 동안 교반하였다. 이이서 혼합물을 NH4Cl (포화 수성)로 세척하고 상을 분리하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고 감압하에 농축하여 생성물로서 옅은 황색 오일 (36.7 g, >100% 수율, 정량 수율로 가정)의 화합물 5를 수득하였다.
이어서, 상기 화합물 5 (BocLys(Cbz)OSu; 36.7 g, 70.9 mmol, 1.0 당량) 및 Thr(OBn)OBn.HCl (25.0 g, 74.4 mmol, 1.05 당량)을 실온에서 1,4-다이옥세인 (477 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 증류수 (326 mL) 중 NaHCO3 (6.85 g, 81.5 mmol, 1.15 당량)의 용액을 첨가하였다. 이 후 생성된 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 10% 시트르산 (수성) 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에서 농축하여 생성물로서 황색의 유성 고체 55.9 g (>100% 수율, 정량적 수율로 가정)의 화합물 6을 수득하였다.
마지막으로, 상기 화합물 6 (BocLys(Cbz)Thr(OBn)OBn; 55.9 g, 70.9 mmol, 1.00 당량)을 1,4-다이옥세인 (360 mL)에 용해시키고 1,4-다이옥세인 (177 mL) 중 4N HCl을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후 NaHCO3의 포화 수용액을 pH 값이 8이 될 때까지 첨가하였다. 상기 용액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 생성된 유기 용액을 Na2SO4 상에서 건조시킨 후 여과한 다음 감압하에서 농축하여 생성물로서 황색 유성 고체(38.7 g, 97% 수율)의 화합물 7을 수득하였다.
1.4. CBz/OBn/OBn/CO
2
Bn-TGKT의 합성
상기 1.2. 및 1.3.에서 합성한 TG와 KT를 하기의 반응식 3에 따라 결합하여 TGKT를 합성하였다.
[반응식 3]
보다 구체적으로, 다이클로로메탄 (50 mL) 중 BocThr(OBn)GlyOH(화합물 3; 5.61 g, 15.3 mmol, 1.00 당량) 및 화합물 8(Lys(Cbz)Thr(OBn)OBn; 10.0 g, 15.3 mmol, 1.0 당량) 용액에, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (5.90 mL, 33.7 mmol, 2.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 교반하고 HATU (7.00 g, 18.4 mmol, 1.20 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, NH4Cl (포화 수성)으로 세척하고, 이어서 NaHCO3 (포화 수성)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에 농축하여 생성물로서 옅은 주황색 오일성 고체 (25.0 g, >100% 수율, 정량 수율로 가정)의 화합물 9를 수득하였다.
상기 수득한 BocThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 9; 이전 단계로부터 취한 13.9 g, 15.3 mmol, 1.0 당량)를 질소하에 실온에서 1,4-다이옥세인 (150 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,4-다이옥세인 (20 mL) 중의 4N HCl을 첨가하였다. 상기 혼합물은 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 농축하고 물 (0.1% 포름산) 용리액 중 20% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산)을 사용하여 C18 (400 g) 컬럼에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고 동결 건조시켰다. 생성된 분말은 NaHCO3 (포화 수성) 및 다이클로로메탄에 용해시키고 15분 동안 교반하였다. 층을 분리시키고 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시킨 후 여과한 다음 감압하에 농축시켜 생성물로서 무색 검 (10.9 g, 88% 수율)의 화합물 10을 수득하였다.
1.5. CBz/OBn/OBn/OBn/CO
2
Bn-TGTGKT의 합성
상기 1.2. 및 1.4.에서 합성한 TG(화합물 3)와 TGKT(화합물 10)를 하기의 반응식 4에 따라 결합하여 벤질로 보호된 TGTGKT를 합성하였다.
[반응식 4]
보다 구체적으로, 다이클로로메탄 (100mL) 중의 BocThr(OBn)GlyOH (화합물 3; 5.10 g, 14.0 mmol, 1.05 당량) 및 BocThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn) OBn(화합물 10; 10.8 g, 13.3 mmol, 1.0 당량) 용액에 N,N-다이아이소프로필에틸 아민 (5.10 mL, 29.3 mmol, 2.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 교반하고 HATU (5.60 g, 14.7 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반하고, NH4Cl(포화 수성) 및 NaHCO3(포화 수성)로 세척하였다. 유기층을 감압하에서 농축하여 생성물로서 담황색 검 (21.4 g, >100% 수율, 정량 수율을 가정)의 화합물 11을 수득하였다.
이어서, 상기 수득한 화합물 11 (BocThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn; 이전 단계에서 취한 15.4g, 13.3mmol, 1.00 당량)을 질소하의 실온에서 1,4-다이옥세인 (150 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,4-다이옥세인 (50 mL) 중 4N HCl을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 농축하고 물 (0.1% 포름산) 용리액 중 20% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산)을 사용하여 C18 (120 g) 컬럼에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고, 절반의 부피로 농축한 후 NaHCO3 (포화 수성) 및 에틸 아세테이트로 분획하였다. 층을 분리하고 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축하여 생성물로서 회백색 고체 (14.6 g, >100% 수율, 정량 수율을 가정)의 화합물 12를 수득하였다.
1.6. CBz/OBn/OBn/OBn/CO
2
Bn-QTGTGKT의 합성
상기 1.5.에서 합성한 화합물 12(TGTGKT)에 하기 반응식 5에 따라 Q를 추가로 결합하여 화합물 14(QTGTGKT)를 합성하였다.
[반응식 5]
보다 구체적으로, 에틸 아세테이트 (150 mL) 및 N,N-다이메틸포름아마이드 (25 mL) 중 Thr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 12; 12.7 g, 12.0 mmol, 1.0 당량) 및 BocGlnOH (3.25 g, 13.2 mmol, 1.1 당량)의 용액에 N,N-다이아이소 프로필에틸아민 (4.60 mL, 26.4 mmol, 2.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 교반하고 HATU (5.47 g, 14.4 mmol, 1.20 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음, NH4Cl (포화 수성)로 세척하였다. 유기층을 다이클로로메탄으로 추가 추출하였다. 이어서 유기층을 합하고 감압하에 농축시켰다. 조 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 20-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배를 사용하여 400 g C18 컬럼으로 정제하였다. 원하는 분획을 합한 후, 에틸 아세테이트 및 NaHCO3 (포화 수성) 용액으로 분획하였다. 유기층을 농축시키고, 동결 건조 공정에 의해 잔류수를 제거하였다. 합한 분획으로 총 12.9 g (89% 총 수율)의 화합물 13을 수득하였다.
상기 수득한 화합물 13 (BocGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn) OBn; 7.00 g, 5.40 mmol, 1.00 당량)을 질소하에 실온에서 1,4-다이옥세인 (150 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,4-다이옥세인 (43.5 mL) 중 4N HCl을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 농축하고 물/ 아세토나이트릴 (2/1) 용액을 사용하여 동결 건조시켰다. 최종적으로 담황색 분말 (6.36 g, 96% 수율)의 화합물 14를 분리하였다.
1.7. AQTGTGKT 아날로그의 합성
4-PhPh-AQTGTGKT를 제외한 나머지 6 종의 아날로그는 상기 반응식 5의 최종 생성물인 화합물 14 및 하기 반응식 6의 생성물인 화합물 17n을 하기 반응식 7에 따라 결합시켜 합성하였다.
[반응식 6]
[반응식 7]
상기 반응식 7에 따라 순도 90% 이상의 3-PhPh-AQTGTGKT 2.9 mg, 순도 89%의 4-MeOPh-AQTGTGKT 7.0 mg, 순도 95% 이상의 2-PhPh-AQTGTGKT 22.7 mg, 순도 90% 이상의 Ph-AQTGTGKT 23.2 mg, 및 순도 85%의 Naphthyl-AQTGTGKT 23.2 mg을 최종적으로 수득하였다.
이하, 각각의 아날로그 합성 과정에 대하여 구체적으로 설명한다.
1.7.1. 3-PhPh-AQTGTGKT의 합성
3-PhPh-AQTGTGKT(화합물 19-1)는 하기 반응식 8에 따라 수득한 화합물 17-1을 상기 화합물 14와 반응식 9에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 3-PhPh-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 8]
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 [1,1'-바이페닐]-3-카복실산 (297 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물은 25 g 컬럼에서 헵테인 중의 2-40% 에틸 아세테이트 구배로 정제하여 무색 고체 (493 mg, 91% 수율)의 화합물 16-1 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (49 mg)를 메탄올 (30 mL) 중의 화합물 16-1(3-PhPh-AlaOBn; 493 mg, 1.37 mmol) 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물은 셀라이트 패드를 통해 여과시키고, 메탄올 및 에틸 아세테이트로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 거품 (337 mg, 91% 수율)의 화합물 17-1을 수득하고, 이를 하기 반응식 9에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 9]
보다 구체적으로, N, N-다이아이소프로필에틸아민 (97.0 μL, 0.556 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 및 3-PhPh-AlaOH (화합물 17-1; 68.0 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 현탁액에 HATU (106 mg, 0.278 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 NaHCO3 (포화 수성)로 세척하였다. 유기물을 감압하에서 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 40-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60g C18 컬럼으로 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (140 mg, 38% 수율)의 화합물 18-1을 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (85.0 mg)를 2M 염산(수성, 0.5 mL) 및 2-프로판올 (10 mL) 중의 3-PhPh-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-1; 85.0 mg, 59.1 μmol) 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 4.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축하고, 잔류물을 동결 건조하였다. 그 후 물 (0.1% 포름산) 중의 5-50% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산)을 사용하여 60 g C18 컬럼에서 물질을 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (2.9 mg, 5% 수율)의 목적 화합물 19-1을 수득하였다.
화합물 19-1(3-PhPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ = 8.01-7.99 (m, 1H), 7.86-7.82 (m, 1H), 7.75-7.66 (m, 3H), 7.55 (t, J 7.7 Hz, 1H), 7.49 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.43-7.38 (m, 1H), 4.48-4.24 (m, 5H), 4.23-4.12 (m, 3H), 4.09 (d, J 3.8 Hz, 1H), 4.00- 3.96 (m, 2H), 3.88 (s, 2H), 2.90 (t, J 7.4Hz, 2H), 2.35 (t, J 7.5Hz, 2H), 2.15-2.06 (m, 1H), 2.03-1.91 (m , 1H), 1.84-1.72 (m, 1H), 1.70-1.52 (m, 3H), 1.45 (d, J 7.2Hz, 3H), 1.40-1.24 (m, 2H), 1.15-1.05 (m, 9H) , 16 exchangeable protons not visible.
1.7.2. 4-MeOPh-AQTGTGKT의 합성
4-MeOPh-AQTGTGKT(화합물 19-2)는 하기 반응식 10에 따라 수득한 화합물 17-2를 상기 화합물 14와 반응식 11에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 4-MeOPh-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 10]
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (425 mg, 1.97 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (715 μL, 4.11 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (937 mg, 2.46 mmol, 1.5 당량) 및 4-메톡시벤조산 (250 mg, 1.64 mmol, 1 당량)을 첨가하고 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 15-50% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼 상에서 정제하여 무색 고체 (360 mg, 70% 수율)의 화합물 16-2를 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (18 mg)를 메탄올 (15 mL) 중의 4-OMePh-AlaOBn (화합물 16-2; 180 mg, 0.574 mmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 110시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 오일 (128 mg, 100% 수율)의 화합물 17-2를 수득하고, 이를 하기 반응식 11에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 11]
보다 구체적으로, N, N-다이아이소프로필에틸아민 (63.0 μL, 0.360 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys (Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 14; 200 mg, 0.164 mmol, 1 당량) 및 4-OMePh-AlaOH (화합물 17-2; 36.6 mg, 0.164 mmol, 1 당량)의 현탁액에 HATU (74.5 mg, 0.196 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 64시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 메탄올로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 물로 세척하였다. 유기물을 감압하에서 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 50-95% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (113 mg, 50% 수율)의 화합물 18-2를 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (100 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 4-OMePh-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-2; 108 mg, 77.6 μmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-30% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배를 사용하여 30g C18 컬럼에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (7.0 mg, 10% 수율)의 화합물 19-2를 수득하였다.
화합물 19-2(4-MeOPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ = 7.76-7.71 (m, 2H), 7.02-6.98 (m, 2H), 4.42-4.28 (m, 5H), 4.24-4.13 (m, 3H), 4.09 (d, J 3.9 Hz, 1H), 4.01-3.96 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.91 (t, J 7.4 Hz, 2H), 2.34 (t, J 7.6 Hz, 2H), 2.14-2.06 (m, 1H), 2.00-1.91 (m, 1H), 1.85-1.75 (m, 1H), 1.71-1.54 (m, 3H), 1.42 (d, J 7.2 Hz, 3H), 1.40-1.25 (m, 3H), 1.16-1.07 (m, 8H), 16 exchangeable protons not visible.
1.7.3. 2-PhPh-AQTGTGKT의 합성
2-PhPh-AQTGTGKT(화합물 19-3)는 하기 반응식 12에 따라 수득한 화합물 17-3을 상기 화합물 14와 반응식 13에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 2-PhPh-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 12]
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 [1,1'-바이페닐]-2-카복실산 (297 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척 하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 2-40% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼에서 정제하여 무색 오일 (416 mg, 77% 수율)의 화합물 16-3을 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (42 mg)를 메탄올 (20 mL) 중 2-PhPh-AlaOBn (화합물 16-3; 416 mg, 1.16 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 18시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 오일 (308 mg, 99% 수율)의 화합물 17-3을 수득하고, 이를 하기 반응식 13에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 13]
보다 구체적으로, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (63.0 μL, 0.360 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 14; 200 mg, 0.164 mmol, 1 당량) 및 2-PhPh-AlaOH (화합물 17-3; 44.2 mg, 0.164 mmol, 1 당량)의 현탁액에 HATU (74.5 mg, 0.196 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 64시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 메탄올로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 물로 세척하였다. 유기층을 감압하에 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 50-95% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60 g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (115 mg, 49% 수율)의 화합물 18-3을 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (100 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 2-PhPh-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-3; 110 mg, 76.5 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조하였다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-50% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 30 g C18 컬럼에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (22.7 mg, 31% 수율)의 화합물 19-3을 수득하였다.
화합물 19-3(2-PhPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ = 7.56-7.48 (m, 2H), 7.44-7.33 (m, 7H), 4.38-4.26 (m, 4H), 4.25-4.13 (m, 4H), 4.08 (d, J 3.9 Hz, 1H), 4.00-3.96 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 2.91 (t, J 7.5 Hz, 2H), 2.25 (t, J 7.5 Hz, 2H), 2.09-2.01 (m, 1H), 1.93-1.77 (m, 2H), 1.72-1.56 (m, 3H), 1.41-1.29 (m, 2H), 1.18 (d, J 7.2 Hz, 3H), 1.12 (d, J 5.6 Hz, 6H), 1.08 (d, J 6.4 Hz, 3H), 16 exchangeable protons not visible.
1.7.4. Ph-AQTGTGKT의 합성
Ph-AQTGTGKT(화합물 19-4)는 하기 반응식 14에 따라 수득한 화합물 17-4을 상기 화합물 14와 반응식 15에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 Ph-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 14]
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5 분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 벤조산 (183 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 2-50% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼에서 정제하여 무색 오일 (375 mg, 88% 수율)의 화합물 16-4를 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (38 mg)를 메탄올 (30 mL) 중 Ph-Ala-OBn (화합물 16-4; 375 mg, 1.32 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 유리 (glass; 254 mg, 99% 수율)의 화합물 17-4를 수득하고, 이를 하기 반응식 15에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 15]
보다 구체적으로, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (97.0 μL, 0.556 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메탄 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr (OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 및 Ph-Ala-OH (화합물 17-4; 49.0 mg, 0.253 mmol, 1 당량)의 현탁액에 HATU (106 mg, 0.278 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 NaHCO3 (포화 수성)로 세척하였다. 유기물을 감압하에 농축하고 수득한 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 40-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60 g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (200 mg, 58%)의 화합물 18-4를 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (110 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 Ph-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-4; 110 mg, 80.8 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-50% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배를 사용하여 60 g C18 컬럼에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (23.2 mg, 33% 수율)의 화합물 19-4를 수득하였다.
화합물 19-4(Ph-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ = 7.74-7.70 (m, 2H), 7.58-7.53 (m, 1H), 7.48-7.43 (m, 2H), 4.45-4.34 (m, 3H), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.25-4.14 (m, 3H), 4.11 (d, J 3.8 Hz, 1H), 4.00-3.96 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 2.91 (t, J 7.4 Hz, 2H), 2.34 (t, J 7.6 Hz, 2H), 2.14-2.06 (m, 1H), 2.01-1.91 (m, 1H), 1.85-1.76 (m, 1H), 1.71-1.56 (m, 3H), 1.43 (d, J 7.3 Hz, 3H), 1.40-1.30 (m, 2H), 1.16-1.07 (m, 9H), 16 exchangeable protons not visible.
1.7.5. Naphthyl-AQTGTGKT의 합성
Naphthyl-AQTGTGKT(화합물 19-5)는 하기 반응식 16에 따라 수득한 화합물 17-5를 상기 화합물 14와 반응식 17에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 Naphthyl-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 16]
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 2- 나프토산 (258 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 2-40% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼에서 정제하여 무색 고체 (385 mg, 77% 수율)의 화합물 16-5를 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (39 mg)를 메탄올 (20 mL) 중 2-Naphthyl-AlaOBn (화합물 16-5; 385 mg, 1.15 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 고체 (266 mg, 95% 수율)의 화합물 17-5를 수득하고, 이를 하기 반응식 17에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 17]
보다 구체적으로, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (97.0 μL, 0.556 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 및 2-Naphthyl-Ala-OH (화합물 17-5; 61.0 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 현탁액에 HATU (106 mg, 0.278 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 (포화 수성) NaHCO3로 세척하였다. 수득한 유기층을 감압하에 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 40-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60 g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (230 mg, 64% 수율)의 화합물 18-5를 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (101 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 2-Naphthyl-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-5; 101 mg, 71.5 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-40% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 30 g C18 컬럼상에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (23.2 mg, 33% 수율)의 화합물 19-5를 수득하였다.
화합물 19-5(Naphthyl-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ = 8.32 (s, 1H), 8.01-7.90 (m, 3H), 7.79-7.73 (m, 1H), 7.64-7.55 (m, 2H), 4.51-3.70 (m, 13H), 2.96-2.81 (m, 2H), 2.39-2.30 (m, 2H), 2.18-2.04 (m, 1H), 2.03-1.93 (m, 1H), 1.85-1.72 (m, 1H), 1.71-1.53 (m, 3H), 1.50-1.43 (m, 3H), 1.39-1.24 (m, 2H), 1.19-1.04 (m, 9H), 16 exchangeable protons not visible.
1.8. Ac-AQTGTGKT의 합성
Ac-AQTGTGKT(화합물 19-6)는 하기 반응식 18에 따라 수행되어 최종 목적 화합물인 Ac-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 18]
보다 구체적으로, N, N-다이아이소프로필에틸아민 (94.0 μL, 0.540 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (30 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.245 mmol, 1 당량) 및 Ac-Ala-OH (32.1 mg, 0.245 mmol, 1 당량)의 현탁액에 HATU (112 mg, 0.294 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 14시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 (포화 수성) NH4Cl, NaHCO3 및 물로 세척하였다. 유기층을 감압하에 농축하고, 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 50-95% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배에서 60 g C18 컬럼으로 정제하였다. 원하는 분획을 합하고 동결 건조하여 무색 고체 (104 mg, 33% 수율)의 화합물 18-6을 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (10 mg)를 2M 염산(수성, 0.19 mL) 및 2-프로판올 (5 mL) 중의 Ac-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-6; 33 mg, 25 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 14시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 물에 용해시킨 다음 동결 건조하였다. 상기 건조된 물질을 메탄올 중 0.5M 암모니아로 용리시키면서 500 mg SCX-2 카트리지에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고 감압하에 농축한 다음 동결 건조하여 무색 고체 (7.6 mg, 37% 수율)의 화합물 19-6을 수득하였다.
화합물 19-6(Ac-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ = 4.40-4.33 (m, 2H), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.24-4.12 (m, 4H), 4.08 (d, J 4.0 Hz, 1H), 4.03-3.88 (m, 4H), 2.92 (t, J 7.2 Hz, 2H), 2.32 (t, J 7.8 Hz, 2H), 2.15-2.02 (m, 1H), 1.99-1.88 (m, 4H), 1.86-1.76 (m, 1H), 1.74-1.55 (m, 3H), 1.45-1.31 (m, 2H), 1.29 (t, J 7.4 Hz, 2H), 1.20-1.06 (m, 10H), 16 exchangeable protons not visible.
1.9. 4-PhPh-AQTGTGKT의 합성
1.9.1. QTGTGKT 중간체의 합성
4-PhPh-AQTGTGKT 합성을 위한 중간체 QTGTGKT는 하기 반응식 19 내지 반응식 23에 따라 합성하였다:
[반응식 19]
[반응식 20]
[반응식 21]
[반응식 22]
[반응식 23]
상기 반응식 19 내지 반응식 23은 상기 반응식 1 내지 반응식 5와 벤질 보호기 유무 여부를 제외하고는 거의 유사한 과정으로서, 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
1.9.2. 4-PhPh-AQTGTGKT의 합성
상기 반응식 23에서 수득한 화합물 31은 하기 반응식 24에서 합성된 알라닌 유도체와 반응식 25에 따라 결합되어 최종 생성물 4-PhPh-AQTGTGKT를 수득하였다.
[반응식 24]
[반응식 25]
상기 반응식 24 및 반응식 25 또한 전술한 반응식과 거의 유사한 과정에 의해 진행되었는바 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 최종적으로 무색 고체 (583 mg, 68% 수율)의 화합물 36을 수득하였다.
화합물 36(4-PhPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ = 7.85 (d, J 8.8 Hz, 2H), 7.77 (d, J 8.8 Hz, 2H), 7.70 (d, J 7.2 Hz, 2H), 7.49 (t, J 7.2 Hz, 2H), 7.42 (t, J 7.1 Hz, 1H), 4.34-4.04 (m, 6H), 4.07 (d, J 3.6 Hz, 1H), 3.93 (d, J 2.0 Hz, 2H), 2.82 (t, J 7.0 Hz, 2H), 1.82-1.67 (m, 1H), 1.66-1.55 (m, 1H), 1.54-1.44 (m, 2H), 1.37-1.22 (m, 2H), 1.18 (d, J 6.4 Hz, 3H), 1.06 (t, J 6.5 Hz, 3H), 10 exchangeable protons not visible.
1.10. 화합물 확인
상기 제법에 의해 수득한 AQTGTGKT 아날로그 7종은 1H NMR 및 UPLC-MS(ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry) 기법으로 분석하여 화학 구조를 확인하였다. 분석 결과는 도 1 내지 도 7에 나타내었으며, 상기 화합물들을 포함한 전체 AQTGTGKT 아날로그는 표 1에 정리하였다.
| 이름 | 화학식 |
| AQTGTGKT |
 |
| 4-PhPh-AQTGTGKT |
 |
| Ac-AQTGTGKT |
 |
| 3-PhPh-AQTGTGKT |
 |
| 4-MeOPh-AQTGTGKT |
 |
| 2-PhPh-AQTGTGKT |
 |
| Ph-AQTGTGKT |
 |
| Naphthyl-AQTGTGKT |
 |
| 2,4,6-MePh- AQTGTGKT |
 |
| 1-MeOCF3Ph- AQTGTGKT |
 |
| 4-MorPh- AQTGTGKT |
 |
| PhMeMeC- AQTGTGKT |
 |
| 4-CF3Ph- AQTGTGKT |
 |
| Ph3C- AQTGTGKT |
 |
실시예 2. 암세포주의 CAGE 및 오토파지 관련 유전자 발현 확인
암세포주의 CAGE 및 오토파지 (autophagy) 관련 유전자들의 발현 수준에 따른 AQTGTGKT 아날로그의 항암 효과 확인을 확인하기 위해, 암세포주별로 CAGE 및 오토파지 관련 유전자 (BECN1, ATG5, LC3 등)의 발현을 확인하였다.
먼저, 세포에 완전 배지 (complete media)를 처리하여 혈청 (serum)이 충분히 공급된 환경에서 암세포를 배양한 후 24시간이 지났을 때 배지를 혈청이 0.5% 함유된 제한 배지로 교체하여 혈청 결핍 (serum starvation) 스트레스를 가했다. 48시간이 지난 후 세포를 거둬 총 단백질 (total protein)을 추출한 후 항-CAGE 항체 및 오토파지 마커 (ATG5, Beclin 1, LC3 등) 항체를 이용하여 면역블롯을 수행했다. 그 결과, 암세포주 중 H23 및 A549 세포주는 정상 환경과 혈청 결핍 환경 모두에서 CAGE의 발현이 나타나지 않았으며, 특히 H23 세포주의 경우 혈청 결핍에도 불구하고 오토파지 관련 유전자들의 발현에 큰 변화가 없는 것으로 나타났다 (도 8 및 도 9). 반면, H1975 및 H1299 세포주의 경우 정상 환경에서도 CAGE를 상대적으로 높은 수준으로 발현하였으며, 혈청 결핍을 가하였을 때 CAGE의 발현이 더 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 10 및 도 11). 또한, 혈청 결핍을 가하였을 때 오토파지의 가장 주요한 마커인 LC3의 발현이 H1299 세포주에서 크게 증가하였으며, H1975 세포주 역시 LC3와 함께 ATG5 및 BECN1의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
상기 실험 결과로부터 구체적인 암 종류에 따라 CAGE의 발현 수준이 상이하다는 것을 확인하였으며, H1975 및 H1299 세포주를 CAGE 과발현 세포주로, H23 및 A549 세포주를 CAGE 비과발현 세포주로 설정하여 후속 실험을 진행하였다.
실시예 2. AQTGTGKT 아날로그의 항암 효과 확인
상기 실험 방법에서 기술한 MTT 분석 방법에 따라 CAGE 과발현 세포주 및 CAGE 비과발현 세포주에 7종의 아미드화(amidation) AQTGTGKT 아날로그를 72시간 동안 처리한 후 아날로그의 세포 독성을 비교하였다. H1975의 경우 AQTGTGKT 아날로그를 각각 10 μM 농도로 처리하였으며, H1299는 500 μM 농도로, H23은 500 μM 농도로, A549는 500 μM 농도로 AQTGTGKT 아날로그를 각각 처리하였다.
그 결과, CAGE 비과발현 세포주인 H23 세포주는 AQTGTGKT 아날로그를 처리하더라도 대조군 (control)과 비교하여 세포의 활성에 유의미한 변화가 없었으며, 오히려 4-PhPh-AQTGTGKT와 같은 일부 아날로그를 처리한 H23 세포주의 경우 대조군에 비해 세포 활성이 다소 증가한 듯한 양상을 나타냈다 (도 12). 마찬가지로 또 다른 CAGE 비과발현 세포주인 A549 세포주 역시 AQTGTGKT 아날로그를 처리한 군과 대조군 사이에 세포 활성의 유의미한 변화가 관찰되지 않았다 (도 13).
반면 CAGE 과발현 세포주인 H1975 세포주의 경우 AQTGTGKT 아날로그 (Ac-AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 4-MeOPh-AQTGTGKT, 또는 2-PhPh-AQTGTGKT)를 처리하였을 때 대조군에 비해 세포 활성이 유의미하게 감소하였으며, 특히 Ac-AQTGTGKT는 약 19%의 세포 활성 억제 효과를, 3-PhPh-AQTGTGKT는 약 35%의 높은 세포 활성 억제 효과를 보이는 것으로 나타났다 (도 14).
또 다른 CAGE 과발현 세포주인 H1299 세포주의 경우 대조군에 비해 AQTGTGKT 아날로그를 처리한 모든 군에서 세포 활성이 크게 감소한 것으로 나타났다 (도 15). 구체적으로, 4-PhPh-AQTGTGKT 처리군은 세포 활성이 약 21% 감소하였고, Ac-AQTGTGKT 처리군은 세포 활성이 약 15% 감소하였으며, 3-PhPh-AQTGTGKT는 약 25%, 4-MeOPh-AQTGTGKT는 약 22%, 2-PhPh-AQTGTGKT는 약 29%, Ph-AQTGTGKT는 약 27%, Naphthyl-AQTGTGKT는 약 24%의 세포 활성 억제 효과를 나타냈다.
상기 결과는 AQTGTGKT의 아미드화 아날로그가 CAGE를 과발현하지 않는 암세포에 비해 CAGE 과발현 암세포주에서 더욱 뛰어난 항암 효과를 발휘한다는 것을 보여주는 것이다.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명자들은 본 발명에 따른 AQTGTGKT의 아미드화 아날로그가 CAGE를 과발현하는 암세포주에서 뛰어난 항암 효과를 보이는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 암환자에서 CAGE의 발현 수준 측정을 통해 CAGE 저해제에 대한 반응성을 미리 예측함으로써 항암 치료를 위한 CAGE 투여 여부를 결정하는 동반 진단으로 활용될 것으로 기대되며, 본 발명을 통해 환자에게 보다 맞춤화된 항암 치료를 제공하고 과도한 의료 비용을 절감할 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (20)
- 항암 치료를 위한 CAGE 저해제에 대한 반응자 특성화 방법으로서,
상기 방법은 하기 단계를 포함하고:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CAGE의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 CAGE의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, CAGE 저해제에 대한 반응자로 판정하는 단계,
상기 CAGE 저해제는 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는, 방법:
[화학식 1]
상기 화학식 1에 있어서,
R1은 수소; 치환 또는 비치환된 페닐기; 치환 또는 비치환된 나프틸기; 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C3의 알킬기이다.
- 제1항에 있어서,
상기 R1은 하기 화학식 2 내지 5로 표시되는 화합물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 방법:
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 3에 있어서,
R2는 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 또는 페닐기이고;
R3은 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 페닐기, C1 내지 C3의 알콕시기, 모르포릴기, 또는 CF3이고;
R4는 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 페닐기, C1 내지 C6의 알콕시기, 또는 OCF3이며;
R5는 수소 또는 메틸기이고;
상기 화학식 4에 있어서,
R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 C1 내지 C3의 알킬기이며,
상기 화학식 5에 있어서,
R8은 CX이고, x는 0 내지 3의 정수이고,
X가 1 이상일 때 R9 및 R10은 각각 독립적으로 H, C1 내지 C6의 알킬기, 또는 페닐기이다.
- 제1항에 있어서,
상기 방법은 상기 (S1) 단계에서 CAGE의 발현 수준과 함께 ATG5, ATG12, Beclin 1, 및 LC3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 추가로 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 암은 EGFR 돌연변이가 일어난 암인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 암은 폐암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 편평상피성 폐암, 비편평상피성 폐암, 대장암, 교모세포종, 유방암, 신경교종, 위암, 두경부암, 수모세포종, 췌장암, 척삭종, 별아악성 뇌교종, 별아교세포종, 비강암, 흑색종, 자궁내막암, 신경내분비암, 원발성 복막암, 핍지교종, 후두 편평세포암종, 후두암, 요로상피세포암종, 식도 편평세포암종, 식도암, 핍지교성상세포종, 산재적 내재성 뇌교종, 나팔관암, 간담도암, 구인두암, 구인두 편평세포암종, 구강암, 구강 편평세포암종, 난소암, 쓸개관암, 암육종, 간세포암종, 난소상피암, 침샘암, 위장관간질종양, 신경모세포종, 횡문근육종, 포도막흑색종, 원시 신경외배엽종양, 뇌수막종, 항문 편평세포암종, 뇌실막세포종, 하인두 편평세포암종, 비인두암, 및 뇌하수체암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체, 및 진공흡입생검 검체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 대조군은 정상인 또는 상기 CAGE 저해제에 대한 비반응자로부터 분리된 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 CAGE의 발현 수준은 CAGE 단백질 수준이고, 상기 CAGE 단백질 수준은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 CAGE의 발현 수준은 CAGE mRNA 발현 수준이고, 상기 mRNA 발현 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 (northern blotting), 서던 블랏팅 (southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및 RNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- CAGE의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자의 판정용 조성물로서,
상기 CAGE 저해제는 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는, 조성물:
[화학식 1]
상기 화학식 1에 있어서,
R1은 수소; 치환 또는 비치환된 페닐기; 치환 또는 비치환된 나프틸기; 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C3의 알킬기이다.
- 제10항에 있어서,
상기 R1은 하기 화학식 2 내지 5로 표시되는 화합물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조성물:
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 화학식 3에 있어서,
R2는 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 또는 페닐기이고;
R3은 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 페닐기, C1 내지 C3의 알콕시기, 모르포릴기, 또는 CF3이고;
R4는 수소, C1 내지 C6의 알킬기, 페닐기, C1 내지 C6의 알콕시기, 또는 OCF3이며;
R5는 수소 또는 메틸기이고;
상기 화학식 4에 있어서,
R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 C1 내지 C3의 알킬기이며,
상기 화학식 5에 있어서,
R8은 CX이고, x는 0 내지 3의 정수이고,
X가 1 이상일 때 R9 및 R10은 각각 독립적으로 H, C1 내지 C6의 알킬기, 또는 페닐기이다.
- 제10항에 있어서,
상기 조성물은 ATG5, ATG12, Beclin 1, 및 LC3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 조성물은 CAGE의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 암 환자를 CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자로 판정하기 위한 것인, 조성물.
- 제13항에 있어서,
상기 대조군은 정상인 또는 CAGE의 저해제에 대한 비반응자의 CAGE 발현 수준인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 암은 EGFR 돌연변이가 일어난 암인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 암은 폐암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 편평상피성 폐암, 비편평상피성 폐암, 대장암, 교모세포종, 유방암, 신경교종, 위암, 두경부암, 수모세포종, 췌장암, 척삭종, 별아악성 뇌교종, 별아교세포종, 비강암, 흑색종, 자궁내막암, 신경내분비암, 원발성 복막암, 핍지교종, 후두 편평세포암종, 후두암, 요로상피세포암종, 식도 편평세포암종, 식도암, 핍지교성상세포종, 산재적 내재성 뇌교종, 나팔관암, 간담도암, 구인두암, 구인두 편평세포암종, 구강암, 구강 편평세포암종, 난소암, 쓸개관암, 암육종, 간세포암종, 난소상피암, 침샘암, 위장관간질종양, 신경모세포종, 횡문근육종, 포도막흑색종, 원시 신경외배엽종양, 뇌수막종, 항문 편평세포암종, 뇌실막세포종, 하인두 편평세포암종, 비인두암, 및 뇌하수체암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, CAGE의 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자의 판정용 키트.
- 제19항에 있어서,
상기 키트는 하기의 단계를 포함하는 동반진단 방법이 기재된 설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트:
(S1) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CAGE의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 CAGE의 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, CAGE 저해제의 투여를 필요로 하는 암 환자로 판정하는 단계.
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