KR102487298B1 - Nanoparicles comprising enzyme-based gold nanocluster and Preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 본 발명은 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 안정성 및 센싱의 민감도를 향상시킬 수 있는 나노입자 및 이의 제조방법에 대한 것이다.The present invention relates to nanoparticles composed of enzyme-based gold nano-clusters and a method for manufacturing the same. Particles and methods for their preparation.
Description
본 발명은 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 본 발명은 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 안정성 및 센싱의 민감도를 향상시킬 수 있는 나노입자 및 이의 제조방법에 대한 것이다.The present invention relates to nanoparticles composed of enzyme-based gold nano-clusters and a method for manufacturing the same. Particles and methods for their preparation.
인체 내에 존재하는 생리활성물질을 센서를 이용하여 측정하고자 하는 기술이 최근 각광받고 있다. 센서를 이용하여 측정하고자 하는 대표적인 생리활성물질로 과산화수소와 글루코오스를 들 수 있는데, 상기 과산화수소는 인체 내에서 세포 성장, 세포 사멸 등 생리학적 과정에서 중요한 역할을 수행하나, 인체 내에서 과산화수소가 고농도로 존재하는 경우, 세포 손상, 암 등의 원인이 되기도 하며, 혈액 내 글루코오스는 우리 몸에서 중요한 역할을 하나 혈당이 높거나 낮을 경우 신체에 영향을 주어 당뇨병 등의 질병을 일으킬 수 있다. 이에 따라, 하기 특허문헌 기재된 바와 같은 과산화수소 측정용 센서, 글루코오스 측정용 센서가 개발되고 있다.BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] A technique for measuring physiologically active substances present in the human body using a sensor has recently been in the limelight. Representative physiologically active substances to be measured using sensors include hydrogen peroxide and glucose. Hydrogen peroxide plays an important role in physiological processes such as cell growth and cell death in the human body, but hydrogen peroxide exists in high concentrations in the human body In this case, it can cause cell damage, cancer, etc., and glucose in the blood plays an important role in our body, but high or low blood sugar can affect the body and cause diseases such as diabetes. Accordingly, a sensor for measuring hydrogen peroxide and a sensor for measuring glucose, as described in the following patent documents, have been developed.
<특허문헌><Patent Document>
1. 특허 제10-1823114호(2018. 01. 23. 등록) "과산화수소 검출 센서 및 이를 이용한 과산화수소 검출 방법"1. Patent No. 10-1823114 (registered on January 23, 2018) "Hydrogen peroxide detection sensor and hydrogen peroxide detection method using the same"
2. 특허 제10-1450385호(2014. 10. 06. 등록) "글루코오스 농도 측정용 바이오센서 및 그 제조방법"2. Patent No. 10-1450385 (registered on October 6, 2014) "Biosensor for measuring glucose concentration and its manufacturing method"
하지만, 종래의 과산화수소 측정용 센서, 글루코오스 측정용 센서 등은 센싱의 민감도가 낮은 문제가 있다.However, conventional sensors for measuring hydrogen peroxide, sensors for measuring glucose, etc. have a problem of low sensing sensitivity.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,The present invention has been made to solve the above problems,
본 발명은 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 높은 민감도 및 향상된 안정성을 가지는 과산화수소 측정용 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.An object of the present invention is to provide nanoparticles for measuring hydrogen peroxide having high sensitivity and improved stability, which are formed by combining protein-gold nanoclusters and peroxidase-gold nanoclusters, and a manufacturing method thereof.
또한, 본 발명은 단백질-금나노클러스터, 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 높은 민감도 및 향상된 안정성을 가지는 글루코오스 측정용 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.In addition, the present invention provides nanoparticles for measuring glucose with high sensitivity and improved stability, which are formed by combining protein-gold nanoclusters, peroxidase-gold nanoclusters, and glucose oxidase-gold nanoclusters, and a method for manufacturing the same. There is a purpose.
본 발병은 앞서 본 목적을 달성하기 위하여 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해 구현된다.The present invention is implemented by an embodiment having the following configuration in order to achieve the above object.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자는 단백질-금나노클러스터와, 상기 단백질-금나노클러스터에 결합된 효소-금나노클러스터를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to one embodiment of the present invention, nanoparticles according to the present invention are characterized in that they include protein-gold nanoclusters and enzyme-gold nanoclusters coupled to the protein-gold nanoclusters.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자에 있어서 상기 효소-금나노클러스터는 과산화효소-금나노클러스터를 포함하며, 상기 단백질-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질을 포함하고, 상기 과산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 과산화효소를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, in the nanoparticles according to the present invention, the enzyme-gold nanoclusters include peroxidase-gold nanoclusters, and the protein-gold nanoclusters include gold nanoclusters and the gold nanoclusters The peroxidase-gold nano-clusters include gold nano-clusters and a peroxidase surrounding the gold nano-clusters.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자는 상기 단백질-금나노클러스터와 상기 과산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성되며, 구형의 형태를 가지고, 과산화수소와 반응 시 형광 세기가 변화하는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, the nanoparticles according to the present invention are formed by aggregating the protein-gold nanoclusters and the peroxidase-gold nanoclusters, have a spherical shape, and have a fluorescence intensity when reacted with hydrogen peroxide. characterized by change.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자에 있어서 상기 단백질은 알부민이 사용되는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, in the nanoparticles according to the present invention, the protein is characterized in that albumin is used.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자에 있어서 상기 효소-금나노클러스터는 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스터를 포함하며, 상기 단백질-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질을 포함하고, 상기 과산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 과산화효소를 포함하며, 상기 글루코오스산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와 상기 금나노클러스터를 에워싸는 글루코오스 산화효소를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, in the nanoparticles according to the present invention, the enzyme-gold nanoclusters include peroxidase-gold nanoclusters and glucose oxidase-gold nanoclusters, and the protein-gold nanoclusters It includes gold nano-clusters and proteins surrounding the gold nano-clusters, wherein the peroxidase-gold nano-clusters include gold nano-clusters and a peroxidase surrounding the gold nano-clusters, wherein the glucose oxidase-gold nano-clusters It is characterized by comprising gold nano-clusters and a glucose oxidase surrounding the gold nano-clusters.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자는 상기 단백질-금나노클러스터, 상기 과산화효소-금나노클러스터 및 상기 글루코오스산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성되며, 구형의 형태를 가지고, 글루코오스 측정을 위해 사용되는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, the nanoparticles according to the present invention are formed by aggregating the protein-gold nanoclusters, the peroxidase-gold nanoclusters, and the glucose oxidase-gold nanoclusters, and have a spherical shape It is characterized in that it is used for measuring glucose.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자와 TMB 용액을 혼합한 혼합용액에 글루코오스를 첨가하면, 글루코오스 존재 및 그 양에 따라 혼합용액의 색상이 변화하는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, when glucose is added to a mixed solution in which the nanoparticles according to the present invention and the TMB solution are mixed, the color of the mixed solution changes depending on the presence and amount of glucose.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 글루코오스 측정용 센서는 금속 전극과, 링커에 의해 상기 금속 전극에 결합된 글루코오스 측정용 나노입자를 포함하며, 상기 글루코오스 측정용 나노입자는 제5항의 나노입자가 사용되는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, the sensor for measuring glucose according to the present invention includes a metal electrode and nanoparticles for measuring glucose bonded to the metal electrode by a linker, wherein the nanoparticles for measuring glucose include a fifth It is characterized in that the nanoparticles of claim are used.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법은 단백질-금나노클러스터와, 효소-금나노클러스터를 섞어 혼합용액을 준비하는 혼합용액준비단계와, 탈용매화를 통해 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 입자가 형성되도록 에탄올을 포함하는 탈용매화 용액을 혼합용액에 첨가하여 반응시키는 탈용매화단계와, 상기 탈용매화단계에서 형성된 입자를 가교시켜 견고한 형태를 가지도록 탈용매화단계 후 추가적으로 가교제를 첨가하는 가교단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, the method for producing nanoparticles according to the present invention includes a mixed solution preparation step of preparing a mixed solution by mixing protein-gold nanoclusters and enzyme-gold nanoclusters, and protein through desolvation. -Desolvation step of adding a desolvation solution containing ethanol to the mixed solution so that gold nanoclusters and enzyme-gold nanoclusters are aggregated to form particles, and reacting thereto; It is characterized in that it comprises a crosslinking step of additionally adding a crosslinking agent after the desolvation step.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법에 있어서 상기 혼합용액준비단계에서는 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터가 혼합되는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, in the method for producing nanoparticles according to the present invention, in the step of preparing a mixed solution, protein-gold nanoclusters and peroxidase-gold nanoclusters are mixed.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법에 있어서 상기 혼합용액준비단계에서는 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터와, 글루코오스산화효소-금나노클러스가 혼합되는 것을 특징으로 한다.According to another embodiment of the present invention, in the method for producing nanoparticles according to the present invention, in the step of preparing the mixed solution, protein-gold nanoclusters, peroxidase-gold nanoclusters, and glucose oxidase-gold nanoclusters are characterized by mixing.
본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.The present invention can obtain the following effects by the above embodiment.
본 발명은 과산화수소 측정용 나노입자가 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 안정성을 향상시키면서도 높은 민감도로 과산화수소를 센싱할 수 있는 효과가 있다.In the present invention, since the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide are formed by combining protein-gold nanoclusters and peroxidase-gold nanoclusters, there is an effect of sensing hydrogen peroxide with high sensitivity while improving stability.
또한, 본 발명은 글루코오스 측정용 나노입자가 단백질-금나노클러스터, 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스터가 뭉쳐 형성되어, 안정성을 향상시키면서도 높은 민감도로 글루코오스를 센싱할 수 있는 효과가 있다.In addition, in the present invention, the nanoparticles for measuring glucose are formed by combining protein-gold nanoclusters, peroxidase-gold nanoclusters, and glucose oxidase-gold nanoclusters, thereby improving stability and having the effect of sensing glucose with high sensitivity there is
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 제조과정을 설명하기 위한 참고도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 형광 변화를 설명하기 위한 참고도.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 글루코오스 측정용 나노입자의 제조과정을 설명하기 위한 참고도.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서 및 이를 이용한 전기화학적 실험 방법을 설명하기 위한 참고도.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 TEM 이미지.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 DLS 분석 결과를 나타내는 그래프.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자를 일광 및 자외선에서 촬영한 결과를 나타내는 이미지.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 흡수 파장과 방출 파장을 나타내는 그래프.
도 9는은 본 발명의 다른 실시예에 따른 글루코오스 측정용 나노입자의 TEM 이미지.
도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 글루코오스 측정용 나노입자의 DLS 분석 결과를 나타내는 그래프.
도 11은 본 발명의 다른 실시예에 따른 글루코오스 측정용 나노입자를 자외선에서 촬영한 결과를 나타내는 이미지.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자가 과산화수소와 반응하여 형광세기가 변화함을 확인하기 위한 그래프.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자가 과산화수소와 반응하여 형광세기가 변화함을 확인하기 위한, 과산화수소 측정용 나노입자를 자외선에서 촬영한 결과를 나타내는 이미지.
도 14 및 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자가 과산화수소와 반응하여 형광세기가 변화함을 확인하기 위한, 과산화수소 농도에 따른 형광 세기 감소율을 나타내는 그래프.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 과산화수소 측정용 나노입자의 선택적 과산화수소 검출 결과를 나타내는 촬영 이미지.
도 17 및 18은 본 발명의 다른 실시예에 따른 글루코오스 측정용 나노입자와 TMB 용액을 이용하여 글루코오스를 측정할 수 있음을 확인하기 위한 혼합용액을 촬영한 결과를 나타내는 이미지.
도 19는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 SEM 이미지.
도 20은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 AFM 이미지.
도 21 내지 22는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 CV 측정 결과를 나타내는 그래프.
도 23은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 글루코오스 농도에 따른 환원 피크 전류 값의 선형화 결과를 나타내는 그래프.
도 24 및 25는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 amperometric i-t 측정결과를 나타내는 그래프.
도 26은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 선택적 글루코오스 검출결과를 나타내는 그래프.
도 27은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 센서의 실제 샘플에서 글루코오스 검출 결과를 나타내는 그래프.1 is a reference diagram for explaining a manufacturing process of nanoparticles for measuring hydrogen peroxide according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is a reference diagram for explaining the fluorescence change of nanoparticles for measuring hydrogen peroxide according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a reference diagram for explaining the manufacturing process of the nanoparticles for measuring glucose according to another embodiment of the present invention.
4 is a reference diagram for explaining a sensor and an electrochemical experiment method using the same according to another embodiment of the present invention.
5 is a TEM image of nanoparticles for measuring hydrogen peroxide according to an embodiment of the present invention.
Figure 6 is a graph showing the results of DLS analysis of nanoparticles for measuring hydrogen peroxide according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 is an image showing the results of photographing the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide according to an embodiment of the present invention in sunlight and ultraviolet light.
8 is a graph showing absorption wavelength and emission wavelength of nanoparticles for measuring hydrogen peroxide according to an embodiment of the present invention.
9 is a TEM image of nanoparticles for measuring glucose according to another embodiment of the present invention.
10 is a graph showing the results of DLS analysis of nanoparticles for measuring glucose according to another embodiment of the present invention.
11 is an image showing the result of photographing nanoparticles for measuring glucose according to another embodiment of the present invention in ultraviolet light.
Figure 12 is a graph for confirming that the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide according to an embodiment of the present invention react with hydrogen peroxide to change the fluorescence intensity.
13 is an image showing the result of photographing the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide in ultraviolet light to confirm that the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide according to an embodiment of the present invention react with hydrogen peroxide to change the fluorescence intensity.
14 and 15 are graphs showing the fluorescence intensity decrease rate according to the hydrogen peroxide concentration, for confirming that the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide according to an embodiment of the present invention react with hydrogen peroxide to change fluorescence intensity.
16 is a photographic image showing the result of selective hydrogen peroxide detection of nanoparticles for measuring hydrogen peroxide according to an embodiment of the present invention.
17 and 18 are images showing the results of photographing a mixed solution for confirming that glucose can be measured using nanoparticles for measuring glucose and a TMB solution according to another embodiment of the present invention.
19 is a SEM image of a sensor according to another embodiment of the present invention.
20 is an AFM image of a sensor according to another embodiment of the present invention.
21 and 22 are graphs showing CV measurement results of a sensor according to another embodiment of the present invention.
23 is a graph showing linearization results of reduction peak current values according to glucose concentrations of a sensor according to another embodiment of the present invention.
24 and 25 are graphs showing amperometric it measurement results of a sensor according to another embodiment of the present invention.
26 is a graph showing selective glucose detection results of a sensor according to another embodiment of the present invention.
27 is a graph showing glucose detection results in actual samples of a sensor according to another embodiment of the present invention.
이하에서는 본 발명에 따른 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자 및 이의 제조방법을 첨부된 도면을 참조하여 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Hereinafter, nanoparticles composed of enzyme-based gold nano-clusters and a manufacturing method thereof according to the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. Unless there is a special definition, all terms in this specification are the same as the general meaning of the term understood by a person skilled in the art to which the present invention belongs, and if it conflicts with the meaning of the term used in this specification, the present invention Follow the definitions used in the specification. In addition, detailed descriptions of well-known functions and configurations that may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention will be omitted. Throughout the specification, when a part "includes" a certain component, it means that it may further include other components without excluding other components unless otherwise stated.
본 발명의 일 실시예는 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자에 대한 것으로, 상기 나노입자는 단백질-금나노클러스터와, 상기 단백질-금나노클러스터에 결합된 효소-금나노클러스터를 포함한다. 종래 금나노클러스터는 일반적인 금 나노입자와 달리 수 십개의 금 원자들이 뭉쳐 대략 2nm 이하의 크기로 형성되는 물질인데, 불연속적인 에너지 준위를 가지는 분자와 같은 성질을 가져 형광을 띄게 된다. 다만, 상기 금나노클러스터는 불안정한 성질을 가지므로, 본 발명에서는 단백질(효소 포함)을 이용하여 금나노클러스터를 안정화시킨, 단백질-금나노클러스터, 효소-금나노클러스터를 제조하고 이를 이용하여 상기 나노입자를 제조하게 된다. 효소를 이용하여 금나노클러스터를 안정화시킨 효소-금나노클러스터는 효소의 성질, 형광적인 성질 및 전도성을 모두 가지게 되며, 효소가 아니라 알부민과 같은 일반 단백질을 이용하여 금나노클러스터를 안정화시킨 단백질-금나노클러스터 역시 효소와 같은 촉매의 성질을 가지고 형광적인 성질 및 전도성을 가지게 된다.One embodiment of the present invention relates to nanoparticles composed of enzyme-based gold nanoclusters, wherein the nanoparticles include protein-gold nanoclusters and enzyme-gold nanoclusters coupled to the protein-gold nanoclusters. Conventional gold nanoclusters, unlike general gold nanoparticles, are materials formed by aggregating dozens of gold atoms to a size of about 2 nm or less, and have the same properties as molecules with discontinuous energy levels and emit fluorescence. However, since the gold nano-clusters have unstable properties, in the present invention, protein-gold nano-clusters and enzyme-gold nano-clusters are prepared by stabilizing the gold nano-clusters using proteins (including enzymes), and using them to prepare the nano-gold nano-clusters. produce particles. Enzyme-gold nanoclusters stabilized with gold nanoclusters using enzymes have properties of enzymes, fluorescence properties and conductivity. Nanoclusters also have catalytic properties like enzymes, and have fluorescent properties and conductivity.
상기 단백질-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질을 포함한다. 상기 단백질은 효소가 아닌 일반 단백질이 사용될 수 있으며, 예컨대 응집성을 가져 자기 결합체를 형성할 수 있는 단백질, 시스테인, 티로신 등의 잔기를 포함하는 단백질 등이 사용될 수 있으며, 구체적으로 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 오브알부민(ovalbumin) 등의 알부민, 리소자임 등이 사용될 수 있다. 상기 단백질-금나노클러스터는 종래의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 예컨대 단백질 용액 및 금 이온을 함유한 용액을 혼합하고, 상기 단백질 내로 침투한 금 이온(Au3+)을 환원시키기 위해 알카리 수용액을 추가로 혼합하고 반응시켜 형성할 수 있다. 위의 과정에서 금 이온과 단백질에 존재하는 잔기의 결합에 의해 단백질 내에 복수 개의 금 이온이 위치하게 되며, Au3+가 Au1+로 환원되며, 알카리 수용액에 의해 일부 Au1+이 Au0로 환원되어 금나노클러스터를 단백질이 에워싸는 형태의 단백질-금나노클러스터가 형성되게 된다.The protein-gold nanoclusters include gold nanoclusters and proteins surrounding the gold nanoclusters. As the protein, a general protein other than an enzyme may be used. For example, a protein capable of forming a self-assembly with cohesiveness, a protein containing residues such as cysteine and tyrosine, and the like may be used. Specifically, human serum albumin, bovine serum Albumin such as albumin and ovalbumin, lysozyme, and the like may be used. The protein-gold nanoclusters can be prepared by a conventional method. For example, a protein solution and a solution containing gold ions are mixed, and an alkaline aqueous solution is added to reduce gold ions (Au 3+ ) penetrating into the protein. It can be further mixed and reacted to form. In the above process, a plurality of gold ions are located in the protein by the combination of gold ions and residues present in the protein, Au 3+ is reduced to Au 1+ , and some Au 1+ is converted to Au 0 by aqueous alkali solution. It is reduced to form protein-gold nanoclusters in a form in which proteins surround the gold nanoclusters.
상기 효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 효소를 포함한다. 상기 효소는 다양한 효소가 사용될 수 있으며, 상기 효소 역시 단백질임으로 일반 단백질 용액 대신에 효소 용액을 사용하는 것을 제외하고 다른 조건을 단백질-금나노클러스터 제조방법과 동일하게 하여 효소-금나노클러스터를 제조할 수 있다. 상기 효소-금나노클러스터는 한 종류 또는 다른 종류의 복수 개의 효소-금나노클러스터가 사용될 수 있는데, 도 1 및 2에 도시된 바와 같이 과산화효소-금나노클러스터를 사용한 경우, 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성된 과산화수소 측정용 나노입자는 구형을 형태를 가지며, 과산화수소가 존재하지 않을 시에는 형광이 발현되나 과산화수소와 반응 시에는 형광의 세기가 줄어들어 과산화수소를 측정하기 위한 형광센서에 이용될 수 있다. 또한, 도 3 및 4에 도시된 바와 같이, 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스를 사용한 경우, 단백질-금나노클러스터, 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성된 글루코오스 측정용 나노입자는 구형을 형태를 가지며, 상기 나노입자를 전극에 결합시켜 전기화학적 센서를 구성하는 경우, 글루코오스 존재 및 양에 따라 변화하는 전기적 신호를 얻을 수 있어, 글루코오스를 측정하기 위한 전기화학적 센서에 이용될 수 있다. 또한, 글루코오스 측정용 나노입자와, 글루코오스 및 TMB 용액을 혼합하면, 글루코오스 측정용 나노입자는 글루코오스를 과산화수소와, 글루콘산(gluconic acid)으로 전환시키고, 상기 과산화수소는 상기 글루코오스 측정용 나노입자에 의해 물로 환원되고 동시에 TMB는 산화되므로 푸른 색으로 색상이 변하게 된다. 즉, 글루코오스의 농도가 높을수록, 글루코오스 측정용 나노입자, 글루코오스 및 TMB의 혼합용액의 색상이 더욱 푸르게 된다.The enzyme-gold nanoclusters include gold nanoclusters and enzymes surrounding the gold nanoclusters. Various enzymes can be used as the enzyme, and since the enzyme is also a protein, the enzyme-gold nanocluster can be prepared by using the same conditions as the protein-gold nanocluster manufacturing method except for using an enzyme solution instead of a general protein solution. can A plurality of enzyme-gold nanoclusters of one type or another type may be used as the enzyme-gold nanocluster. As shown in FIGS. 1 and 2, when the peroxidase-gold nanocluster is used, the protein-gold nanocluster and , The nanoparticles for measuring hydrogen peroxide formed by combining peroxidase-gold nanoclusters have a spherical shape, and when hydrogen peroxide does not exist, fluorescence is expressed. can be used for sensors. In addition, as shown in FIGS. 3 and 4, in the case of using peroxidase-gold nanoclusters and glucose oxidase-gold nanoclusters, protein-gold nanoclusters, peroxidase-gold nanoclusters and glucose oxidase-gold nanoclusters The nanoparticles for measuring glucose formed by clustering together have a spherical shape, and when the nanoparticles are coupled to an electrode to form an electrochemical sensor, an electrical signal that changes depending on the presence and amount of glucose can be obtained, It can be used in electrochemical sensors to measure In addition, when the glucose measurement nanoparticles, glucose and TMB solution are mixed, the glucose measurement nanoparticles convert glucose into hydrogen peroxide and gluconic acid, and the hydrogen peroxide is converted into water by the glucose measurement nanoparticles. It is reduced and TMB is oxidized at the same time, so the color changes to blue. That is, the higher the concentration of glucose, the bluer the color of the mixed solution of the nanoparticles for measuring glucose, glucose and TMB.
본 발명의 다른 실시예는 도 4에 도시된 바와 같이 금속 전극과, 링커에 의해 상기 금속 전극에 결합된 글루코오스 측정용 나노입자를 포함하는 글루코오스 측정용 센서에 대한 것이다.Another embodiment of the present invention relates to a sensor for measuring glucose including a metal electrode and nanoparticles for measuring glucose bonded to the metal electrode by a linker, as shown in FIG. 4 .
본 발명의 또 다른 실시예는 효소 기반 금나노 클러스터로 구성된 나노입자의 제조방법에 대한 것으로, 상기 나노입자의 제조방법은 주형으로 사용되는 단백질-금나노클러스터와, 효소-금나노클러스터를 섞어 혼합용액을 준비하는 혼합용액준비단계와, 탈용매화를 통해 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 입자가 형성되도록 에탄올을 포함하는 탈용매화 용액을 혼합용액에 첨가하여 반응시키는 탈용매화단계와, 상기 탈용매화단계에서 형성된 입자를 가교시켜 견고한 형태를 가지도록 탈용매화단계 후 추가적으로 가교제를 첨가하는 가교단계 등을 포함한다.Another embodiment of the present invention relates to a method for manufacturing nanoparticles composed of enzyme-based gold nano-clusters, in which protein-gold nano-clusters used as templates and enzyme-gold nano-clusters are mixed and mixed. A mixed solution preparation step of preparing a solution, and a desolvation step of reacting by adding a desolvation solution containing ethanol to the mixed solution so that protein-gold nanoclusters and enzyme-gold nanoclusters aggregate through desolvation to form particles; , a crosslinking step of additionally adding a crosslinking agent after the desolvation step to crosslink the particles formed in the desolvation step to have a solid shape, and the like.
상기 혼합용액준비단계는 주형으로 사용되는 단백질-금나노클러스터와, 효소-금나노클러스터를 섞어 혼합용액을 준비하는 단계로, 상기 효소-금나노클러스터는 한 종류 또는 다른 종류의 복수 개의 효소-금나노클러스터가 사용될 수 있는데, 도 1에 도시된 바와 같이 과산화효소-금나노클러스터를 사용하는 경우, 상기 제조방법을 통해 과산화수소 측정용 나노입자를 제조할 수 있고, 도 3에 도시된 바와 같이, 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스를 사용하는 경우, 글루코오스 측정용 나노입자를 제조할 수 있다.The mixed solution preparation step is a step of preparing a mixed solution by mixing protein-gold nanoclusters used as templates and enzyme-gold nanoclusters, wherein the enzyme-gold nanoclusters are a plurality of enzymes-gold of one type or another type. Nanoclusters may be used. As shown in FIG. 1, when using peroxidase-gold nanoclusters, nanoparticles for measuring hydrogen peroxide can be prepared through the above manufacturing method, and as shown in FIG. 3, peroxidation In the case of using the enzyme-gold nanocluster and the glucose oxidase-gold nanocluster, it is possible to prepare nanoparticles for measuring glucose.
상기 탈용매화단계는 탈용매화를 통해 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 입자가 형성되도록 에탄올을 포함하는 탈용매화 용액을 혼합용액에 첨가하여 반응시키는 단계로, 에탄올을 포함하는 탈용매화 용액을 혼합용액에 첨가하여 탈용매화를 통해 단백질 및 효소가 일정한 모양과 크기로 뭉치도록 하여, 단백질-금나노클러스터와 효소-금나노클러스터가 뭉쳐 입자가 형성되도록 한다. 상기 탈용매화 용액은 에탄올 이외에 아세토니트릴을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 탈용매화 용액은 혼합용액에 한꺼번에 혼합되는 것이 아니라 한 방울씩 첨가되는 것이 바람직하다.The desolvation step is a step of reacting by adding a desolvation solution containing ethanol to the mixed solution so that protein-gold nanoclusters and enzyme-gold nanoclusters are aggregated to form particles through desolvation. The solution is added to the mixed solution so that proteins and enzymes are aggregated in a certain shape and size through desolvation, so that protein-gold nanoclusters and enzyme-gold nanoclusters are aggregated to form particles. The desolvation solution may further include acetonitrile in addition to ethanol, and the desolvation solution is preferably added dropwise to the mixed solution rather than being mixed at once.
상기 가교단계는 상기 탈용매화단계에서 형성된 입자를 가교시켜 견고한 형태를 가지도록 탈용매화단계 후 추가적으로 가교제를 첨가하는 단계로, 탈용매화 용액 첨가후 혼합용액이 색이 불투명하게 바뀌면 가교제가 첨가되어 뭉친 단백질 및 효소들 간의 아민기가 가교되도록 하여, 상기 탈용매화단계에서 형성된 입자가 견고한 형태를 가지도록 한다. 상기 가교제는, 예컨대 글루타르알데하히드가 사용될 수 있다. 상기 가교단계를 수행한 내용물을 원심분리를 진행하여 불순물을 제거하여 나노입자를 수득할 수 있게 된다.The crosslinking step is a step of additionally adding a crosslinking agent after the desolvation step to crosslink the particles formed in the desolvation step to have a solid shape. and amine groups between the enzymes are cross-linked so that the particles formed in the desolvation step have a solid shape. The cross-linking agent, for example, glutaraldehyde may be used. Nanoparticles can be obtained by removing impurities by centrifuging the contents after the crosslinking step.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these are only for explaining the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited thereto.
<실시예 1> 단백질-금나노클러스터의 제조<Example 1> Preparation of protein-gold nanoclusters
1. 알부민-금나노클러스터의 제조1. Preparation of albumin-gold nanoclusters
소혈청알부민(bovine serum albumin)를 3차 증류수에 녹여 BSA 용액(100mg/mL)을 준비하고, 3차 증류수에 녹인 HAuCl4 용액(10mM) 0.5mL를 상기 BSA 용액 0.5mL에 섞은 후, BSA 내부로 침투하여 Au3+로된 금 이온을 Au0로 환원시키기 위해 수산화나트륨(1M) 10ul를 추가로 넣고, 24시간 동안 37℃에서 900RPM으로 섞어주며 반응시켜, 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질(알부민)을 포함하는 알부민-금나노클러스터(BSA-AuNC)를 제조하였다.BSA solution (100mg/mL) was prepared by dissolving bovine serum albumin in tertiary distilled water, and 0.5mL of HAuCl 4 solution (10mM) dissolved in tertiary distilled water was mixed with 0.5mL of the BSA solution. 10ul of sodium hydroxide (1M) was additionally added to infiltrate into Au 3+ to reduce the gold ions made of Au 0 to
2. 과산화효소-금나노클러스터의 제조2. Preparation of peroxidase-gold nanoclusters
BSA 대신에 홍당무과산화효소(HRP)를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 1과 동일하게 하여, 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질(과산화효소)은 포함하는 과산화효소-금나노클러스터(HRP-AuNC)를 제조하였다.Except for using horseradish peroxidase (HRP) instead of BSA, other conditions were the same as in Example 1-1, and gold nanoclusters and a peroxidase containing protein (peroxidase) surrounding the gold nanoclusters- Gold nanoclusters (HRP-AuNC) were prepared.
3. 글루코오스산화효소-금나노클러스터의 제조3. Preparation of glucose oxidase-gold nanoclusters
BSA 대신에 글루코오스 산화효소(GOx)를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 1과 동일하게 하여, 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질(글루코오스산화효소)을 포함하는 글루코오스산화효소-금나노클러스터(GOx-AuNC)를 제조하였다.Except for using glucose oxidase (GOx) instead of BSA, other conditions were the same as in Example 1-1, glucose oxidation including gold nanoclusters and proteins (glucose oxidase) surrounding the gold nanoclusters Enzyme-gold nanoclusters (GOx-AuNC) were prepared.
<실시예 2> 센싱용 나노입자의 제조<Example 2> Preparation of nanoparticles for sensing
1. 하기에서는 실시예 1에서 제조된 BSA-AuNC, HRP-AuNC 및 GOx-AuNC를 이용하여 센싱용 나노입자를 제조하였다.1. In the following, nanoparticles for sensing were prepared using BSA-AuNC, HRP-AuNC, and GOx-AuNC prepared in Example 1.
2. BSA-AuNC 100uL와 HRP-AuNC 10uL를 섞어 혼합 용액을 준비하고(14℃ 온도로 고정), 상기 혼합 용액의 탈용매화(desolvation)를 발생시켜 단백질이 일정한 모양과 크기로 뭉치도록 하기 위해 Acetonitrile과 Ethanol을 4 대 1의 비율로 섞은 용액 300uL를 상기 혼합 용액에 천천히 섞고, 상기 혼합 용액의 색이 불투명하게 바뀌면 뭉친 단백질간의 Amine기의 Cross-linking이 이루어지도록 하기 위해 1% Glutaraldehyde 40ul를 넣어 12시간 동안 900RPM 조건으로 반응시킨다. 이후, 원심 분리를 통해 입자화되지 않은 단백질을 제거하여 BSA-AuNC와 HRP-AuNC가 뭉쳐서 형성된 과산화수소 측정용 나노입자(HPNP)를 얻었다.2. Prepare a mixed solution by mixing 100uL of BSA-AuNC and 10uL of HRP-AuNC (fixed at 14°C), and acetonitrile to cause desolvation of the mixed solution so that the proteins aggregate in a certain shape and size. 300uL of a mixture of Ethanol and Ethanol at a ratio of 4:1 was slowly mixed with the mixed solution, and when the color of the mixed solution changed to opaque, 40ul of 1% Glutaraldehyde was added to cross-link the amine groups between the aggregated proteins. React under 900 RPM conditions for a period of time. Subsequently, non-particulated proteins were removed by centrifugation to obtain nanoparticles for measuring hydrogen peroxide (HPNP) formed by aggregating BSA-AuNC and HRP-AuNC.
3. BSA-AuNC와 HRP-AuNC 대신에 BSA-AuNC 50uL, HRP-AuNC 10uL 및 GOx-AuNC 50uL를 섞어 혼합 용액을 준비하고, Acetonitrile과 Ethanol을 4 대 1의 비율로 섞은 용액 200uL를 사용한 것을 제외하고는, 다른 조건을 실시예 2의 2와 동일하게 하여, BSA-AuNC, HRP-AuNC 및 GOx-AuNC가 뭉쳐서 형성된 글루코오스 측정용 나노입자(GNP)를 얻었다.3. Instead of BSA-AuNC and HRP-AuNC, 50uL of BSA-AuNC, 10uL of HRP-AuNC, and 50uL of GOx-AuNC were mixed to prepare a mixed solution, except that 200uL of a solution mixed with Acetonitrile and Ethanol at a ratio of 4:1 was used. Then, the other conditions were the same as 2 of Example 2, to obtain nanoparticles (GNP) for measuring glucose formed by aggregating BSA-AuNC, HRP-AuNC and GOx-AuNC.
<실시예 3> 센싱용 나노입자의 특성 확인<Example 3> Confirmation of characteristics of nanoparticles for sensing
1. 실시예 2의 2에서 제조된 과산화수소 측정용 나노입자를 TEM으로 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었고, 상기 과산화수소 측정용 나노입자에 대해 DLS 분석을 실시하여 그 결과를 도 6에 나타내었고, 상기 과산화수소 측정용 나노입자를 일광 및 자외선에서 촬영하여 그 결과를 도 7에 나타내었으며(도 7에서 왼쪽 사진이 일광에서 나노입자를 촬영한 것이고, 오른쪽 사진이 자외선에서 나노입자를 촬영한 것임), 상기 과산화수소 측정용 나노입자의 흡수 파장과 방출 파장을 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.1. The nanoparticles for measuring hydrogen peroxide prepared in 2 of Example 2 were confirmed by TEM, and the results are shown in FIG. 5, and DLS analysis was performed on the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide, and the results were shown in FIG. , The nanoparticles for measuring hydrogen peroxide were photographed in sunlight and ultraviolet light, and the results are shown in FIG. 7 (in FIG. 7, the left picture is the nanoparticle taken in daylight, and the right picture is the nanoparticle taken under ultraviolet light) , The absorption wavelength and the emission wavelength of the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide were confirmed, and the results are shown in FIG. 8.
2. 실시예 2의 3에서 제조된 글루코오스 측정용 나노입자를 TEM으로 확인하여 그 결과를 도 9에 나타내었고, 상기 글루코오스 측정용 나노입자에 대해 DLS 분석을 실시하여 그 결과를 도 10에 나타내었고, 상기 글루코오스 측정용 나노입자를 자외선에서 촬영하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. 상기 복합효소입자(CENP)는 BSA-AuNC, HRP-AuNC 및 GOx-AuNC 대신에 BSA, HRP 및 GOx를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 2의 3과 동일하여 하여 형성하였다.2. The nanoparticles for measuring glucose prepared in 3 of Example 2 were confirmed by TEM, and the results are shown in FIG. 9, and the DLS analysis was performed on the nanoparticles for measuring glucose, and the results were shown in FIG. , The nanoparticles for glucose measurement were photographed under ultraviolet light, and the results are shown in FIG. 11. The complex enzyme particle (CENP) was formed in the same manner as in Example 2-3, except that BSA, HRP, and GOx were used instead of BSA-AuNC, HRP-AuNC, and GOx-AuNC.
3. 도 5 및 6을 보면 과산화수소 측정용 나노입자는 구형의 형태를 가지며 나노 사이즈를 가짐을 알 수 있고, 도 7을 보면 과산화수소 측정용 나노입자는 형광 특성을 가지며, 도 8을 보면 과산화수소 측정용 나노입자는 흡수 파장의 피크가 248nm이며 방출 파장의 피크가 720nm임을 알 수 있다.3. Referring to FIGS. 5 and 6, it can be seen that the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide have a spherical shape and have a nano size. Referring to FIG. 7, the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide have fluorescence characteristics. It can be seen that the nanoparticles have an absorption wavelength peak of 248 nm and an emission wavelength peak of 720 nm.
4. 도 9 및 10을 보면 글루코오스 측정용 나노입자는 구형의 형태를 가지며 나노 사이즈를 가짐을 알 수 있고, 도 11을 보면 글루코오스 측정용 나노입자는 형광 특성을 가지나, BSA, HRP 및 GOx를 포함하는 복합효소입자는 형광 특성을 가지지 않음을 알 수 있다.4. Referring to FIGS. 9 and 10, it can be seen that the nanoparticles for measuring glucose have a spherical shape and have a nano size. Referring to FIG. 11, the nanoparticles for measuring glucose have fluorescence characteristics, but contain BSA, HRP and GOx It can be seen that the complex enzyme particles that do not have fluorescent properties.
<실시예 4> 과산화수소 측정용 나노입자를 이용한 과산화수소 측정<Example 4> Hydrogen peroxide measurement using nanoparticles for hydrogen peroxide measurement
1. 과산화효소입자(ENP), HPNP, 100mM의 과산화수소가 혼합된 HPNP에 대하여, 흡수 파장 248nm 및 방출 파장 720nm으로 하여 형광 세기를 측정하여 도 12에 나타내었고, HPNP, 100mM의 과산화수소가 혼합된 HPNP를 자외선 하에서 사진 촬영하여 그 결과를 도 13에 나타내었고(도 13에서 A가 HPNP를 촬영한 것이고, 오른쪽 사진이 100mM의 과산화수소가 혼합된 HPNP를 촬영한 것임), BSA-AuNC, HRP-AuNC 및 HPNP 각각에 대하여 혼합되는 과산화수소의 농도를 달리하여, 흡수 파장 248nm 및 방출 파장 720nm으로 하여 형광 세기를 측정하고 형광 세기 감소율을 계산하여 그 결과를 도 14 및 15에 나타내었다. 상기 과산화효소입자(ENP)는 BSA-AuNC, HRP-AuNC 및 GOx-AuNC 대신에 BSA 및 HRP를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 2의 3과 동일하게 하여 형성하였다.1. Fluorescence intensity was measured at an absorption wavelength of 248 nm and an emission wavelength of 720 nm for HPNP mixed with peroxidase particles (ENP), HPNP, and 100 mM hydrogen peroxide, and shown in FIG. was photographed under ultraviolet light, and the results are shown in FIG. 13 (in FIG. 13, A is a photograph of HPNP, and the photograph on the right is a photograph of HPNP mixed with 100 mM hydrogen peroxide), BSA-AuNC, HRP-AuNC and By varying the concentration of hydrogen peroxide mixed with respect to each HPNP, the fluorescence intensity was measured at an absorption wavelength of 248 nm and an emission wavelength of 720 nm, and the fluorescence intensity decrease rate was calculated, and the results are shown in FIGS. 14 and 15 . The peroxidase particles (ENP) were formed in the same manner as in Example 2-3, except that BSA and HRP were used instead of BSA-AuNC, HRP-AuNC, and GOx-AuNC.
2. 도 12 및 13을 보면, 과산화효소입자는 형광 세기가 0에 가까워 형광 성질을 가지는 입자가 아님을 알 수 있고, HPNP는 형광 세기가 8000 정도인데 100mM의 과산화수소를 첨가하면 형광의 세기가 3000 정도로 낮아지는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 14 및 15를 보면, BSA-AuNC의 검출 한계가 10μM이고, HRP-AuNC의 검출 한계가 1μM인데 반해, HPNP의 검출 한계는 10nM임을 알 수 있고, HPNP가 BSA-AuNC와 HRP-AuNC에 비해서 과산화수소의 저농도에서 감소율이 크다는 것을 알 수 있다.2. Referring to FIGS. 12 and 13, it can be seen that the fluorescence intensity of the peroxidase particles is close to 0, so it is not a particle having fluorescence properties, and the fluorescence intensity of HPNP is about 8000. It can be seen that it decreases to a certain extent. 14 and 15, it can be seen that the detection limit of BSA-AuNC is 10 μM and the detection limit of HRP-AuNC is 1 μM, whereas the detection limit of HPNP is 10 nM, and that HPNP is BSA-AuNC and HRP-AuNC. It can be seen that the reduction rate is large at low concentrations of hydrogen peroxide compared to .
<실시예 5> 과산화수소 측정용 나노입자의 선택성 확인<Example 5> Confirmation of selectivity of nanoparticles for measuring hydrogen peroxide
1. 과산화수소 측정용 나노입자에 ZnCl2, KCl, MgCl2, gulcose, GSH(glutathione), Vc(ascorbic acid), H2O2를 혼합하고, 자외선 하에서 사진 촬영하여 그 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 Blank는 HPNP에 다른 용액들과 농도를 동일하게 하기 위해 같은 양의 3차 증류수를 혼합한 경우를 의미한다.1. ZnCl 2 , KCl, MgCl 2 , gulcose, GSH (glutathione), Vc (ascorbic acid), and H 2 O 2 were mixed with nanoparticles for measuring hydrogen peroxide, and photographs were taken under ultraviolet light, and the results are shown in FIG. 16 . In FIG. 16, Blank means a case in which the same amount of tertiary distilled water is mixed with HPNP to make the concentration equal to that of other solutions.
2. 도 16을 보면, Blank의 형광과 비교해볼 때, Zn2+, K+, Mg2+, glucose, glutathione(GSH), ascorbic acid(Vc)은 형광 변화가 없는데, 과산화수소는 형광이 변화하여, 상기 과산화수소 측정용 나노입자는 과산화수소에 대하여 선택성을 가짐을 알 수 있다.2. Referring to FIG. 16, compared to the fluorescence of Blank, Zn 2+ , K + , Mg 2+ , glucose, glutathione (GSH), and ascorbic acid (Vc) do not change in fluorescence, but hydrogen peroxide changes in fluorescence , it can be seen that the nanoparticles for measuring hydrogen peroxide have selectivity for hydrogen peroxide.
<실시예 6> 클루코오스 측정용 나노입자를 이용한 글루코오스의 측정<Example 6> Measurement of glucose using nanoparticles for measuring glucose
1. 글루코오스 측정용 나노입자, PBS 및 TMB 용액을 혼합한 후, 농도를 달리하는 글루코오스를 첨가하여 반응시킨 후 디지털 카메라로 촬영하여 그 결과를 도 17 및 18에 나타내었다. 도 17의 (a)는 글루코오스가 혼합되지 않은 경우의 이미지이며, 도 17의 (b)는 2mM의 글루코오스가 혼합된 경우의 이미지이고, 도 18의 (a)는 글루코오스가 혼합되지 않은 경우의 이미지이며, 도 18의 (b)는 100uM의 글루코오스가 혼합된 경우의 이미지이다.1. After mixing the nanoparticles for measuring glucose, PBS, and TMB solutions, glucose of different concentrations was added and reacted, and then photographed with a digital camera, and the results are shown in FIGS. 17 and 18. Figure 17 (a) is an image when glucose is not mixed, Figure 17 (b) is an image when 2mM glucose is mixed, Figure 18 (a) is an image when glucose is not mixed 18(b) is an image when 100 uM glucose is mixed.
2. 도 17 및 18을 보면, 글루코오스가 추가로 혼합되는 경우 색상이 변화함을 알 수 있으며, 글루코오스가 첨가되는 양이 많을수록 더욱 푸른색을 뜀을 알 수 있다.2. Referring to FIGS. 17 and 18, it can be seen that the color changes when glucose is additionally mixed, and the more the amount of glucose added, the more blue it becomes.
<실시예 7> 글루코오스 측정용 전기화학적 센서의 제조<Example 7> Preparation of electrochemical sensor for measuring glucose
1. 황산과 과산화수소를 7:3의 비율로 섞어 세척 용액을 준비하고, 금기판(1×1.5cm)을 세척 용액에 담궈 불순물을 제거하고, 70% 에탄올 및 3차수 순으로 세척하고 건조하였다.1. A washing solution was prepared by mixing sulfuric acid and hydrogen peroxide at a ratio of 7:3, and the taboo plate (1×1.5 cm) was immersed in the washing solution to remove impurities, washed with 70% ethanol and three times, and dried.
2. 이후, chemical linker인 Cysteamine(7.7mg/ml in 100% EtOH) 200uL를 금기판에 도포하고, 반응하지 않은 링커를 제거하기 위해 2시간 뒤 에탄올을 이용하여 금기판을 세척하고, 1% glutaraldehyde 용액을 금기판 표면에 뿌린 후, 10분 뒤 3차수를 이용해 금기판을 세척 후, 실시예 2의 3에서 제조된 GNP 100uL를 금기판 위에 도포하고, 8시간 이상 반응 시킨 후, 3차수를 이용하여 금기판을 세척하여 금기판에 GNP가 고정된 글루코오스 측정용 센서 1을 준비하였다. 도 19는 GNP 고정 전(a) 및 후(b)의 금 기판의 주사전자현미경(SEM) 이미지이고, 도 20은 GNP 고정 전(a) 및 후(b)의 금 기판의 원자력현미경(AFM) 이미지인데, 도 19 및 20을 보면, 금기판 위에 나노입자가 잘 올라가 있음을 확인할 수 있다.2. Then, 200uL of Cysteamine (7.7mg/ml in 100% EtOH), a chemical linker, was applied to the taboo plate, and after 2 hours, the taboo plate was washed with ethanol to remove the unreacted linker, and 1% glutaraldehyde was added. After spraying the solution on the surface of the taboo plate, after 10 minutes, wash the taboo board with 3rd water, apply 100uL of GNP prepared in Example 2-3 on the taboo board, react for more than 8 hours, and then use 3rd water Then, the gold plate was washed to prepare
3. GNP 대신에 HRP-AuNC를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 7의 2과 동일하게 하여 HRP-AuNC가 고정된 센서 2를 제조하였다.3. HRP-AuNC immobilized
4. GNP 대신에 GOx-AuNC를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 7의 2과 동일하게 하여 GOx-AuNC가 고정된 센서 3을 제조하였다.4. Except for using GOx-AuNC instead of GNP, other conditions were the same as Example 7-2, and GOx-AuNC immobilized
5. GNP 대신에 CENP를 사용한 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 7의 2과 동일하게 하여 CENP가 고정된 센서 4를 제조하였다.5. Except for using CENP instead of GNP, other conditions were the same as in Example 7-2, and CENP-immobilized
<실시예 8> 센서의 전기화학적 특성 확인<Example 8> Checking the electrochemical characteristics of the sensor
1. Cyclic voltammetry 측정1. Cyclic voltammetry measurement
(1) 순환전압전류법(Cyclic voltammetry)을 통해 실시예 7에서 제조된 센서 1 내지 4의 전기화학적 특성을 분석하여 그 결과를 도 21 내지 23에 나타내었다. 상기 CV 실험에서는 CHI-660e 장치를 이용하였으며, PBS를 전해질로 하는 삼전극 시스템이 사용되었고, 센서 1 내지 4 각각이 워킹 전극으로, Ag/AgCl 전극을 레퍼런스 전극으로, 백금 전극을 카운터 전극으로 각각 사용하였다. 도 21은 글루코오스 1uM을 넣었을 때 센서 1 내지 3의 CV 그래프를 나타내며, 도 22는 글루코오스 1uM을 넣었을 때 센서 1 및 4의 CV 그래프를 나타내고, 도 23은 -0.55V에서 글루코오스 농도에 따른 환원 피크 전류 값의 선형화 결과를 나타내는 그래프이다.(1) The electrochemical characteristics of the
(2) 도 21 내지 23을 보면, 센서 1을 사용하는 경우 클루코오스 센싱의 민감도를 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.(2) Referring to FIGS. 21 to 23 , it can be seen that the sensitivity of glucose sensing can be improved when
2. I-t curve Amperometry 측정2. I-t curve Amperometry measurement
(1) 글루코오스의 농도별 실시간 반응을 확인하기 위해 I-t Amperometry법을 실시하였으며, 상기 실험에서는 PBS를 전해질로 하는 삼전극 시스템이 사용되었고, 센서 1이 워킹 전극으로, Ag/AgCl 전극이 레퍼런스 전극으로, 백금 전극이 카운터 전극으로 각각 사용되고, -0.55V의 potential, 0.1초의 sampling interval 및 5×106(A/V)의 sensitivity로 진행되었다. 각 시간별로 Glucose 최종농도가 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320nM이 되도록 준비된 글루코오스 용액을 10ul씩 넣고, amperometric i-t curve 데이터를 얻어 그 결과를 도 24 및 25에 나타내었다. 또한, 센서 1의 선택성을 확인하기 위해 5mL의 PBS를 챔버에 넣은 후 최종 농도가 100nM이 되도록 Glucose, Ascorbic acid(AA) 및 Uric acid(UA) 50ul를 순차적으로 넣고 amperometric i-t curve 데이터를 얻어 그 결과를 도 26에 나타내었다. 또한, 실제 샘플에서 센서 1의 글루코오스 측정 능력을 확인하기 위하여, serum 용액과, 최종 농도가 100nM이 되도록 glucose가 섞인 serum 용액을 번갈아 가며 50ul씩 넣고, amperometric i-t curve 데이터를 얻어 그 결과를 도 27에 나타내었다.(1) The It Amperometry method was performed to confirm the real-time response of each concentration of glucose. In the above experiment, a three-electrode system using PBS as an electrolyte was used, and
(2) 도 24 및 25를 보면 센서 1을 이용하여 극미량의 glucose의 측정이 가능함을 알 수 있고, 도 26를 보면 다른 물질과 함께 글루코오스가 존재하여도 글루코오스에만 선택적으로 amperometric 반응을 나타내는 것을 확인할 수 있고, 도 27을 보면 사람의 혈액 샘플에서 오직 글루코오스에만 amperometric 반응을 나타내는 것을 확인할 수 있어, 센서 1이 높은 민감도를 가지고 글루코오스를 선택적으로 센싱할 수 있음을 알 수 있다.(2) Looking at FIGS. 24 and 25, it can be seen that it is possible to measure a very small amount of
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.In the above, the applicant has described the preferred embodiments of the present invention, but these embodiments are only one embodiment of implementing the technical idea of the present invention, and any changes or modifications are the same as those of the present invention as long as they implement the technical idea of the present invention. should be construed as falling within the scope.
Claims (11)
상기 효소-금나노클러스터는 과산화효소-금나노클러스터를 포함하며,
상기 단백질-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질을 포함하고,
상기 과산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 과산화효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.According to claim 1,
The enzyme-gold nanoclusters include peroxidase-gold nanoclusters,
The protein-gold nanoclusters include gold nanoclusters and proteins surrounding the gold nanoclusters,
The nanoparticles, characterized in that the peroxidase-gold nano-clusters include gold nano-clusters and peroxidase surrounding the gold nano-clusters.
상기 나노입자는 상기 단백질-금나노클러스터와 상기 과산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성되며, 구형의 형태를 가지고, 과산화수소와 반응 시 형광 세기가 변화하는 것을 특징으로 하는 나노입자.According to claim 2,
The nanoparticles are characterized in that the protein-gold nanoclusters and the peroxidase-gold nanoclusters are formed by aggregating each other, have a spherical shape, and change fluorescence intensity when reacting with hydrogen peroxide.
상기 단백질은 알부민이 사용되는 것을 특징으로 하는 나노입자.According to claim 3,
The protein is nanoparticles, characterized in that albumin is used.
상기 효소-금나노클러스터는 과산화효소-금나노클러스터 및 글루코오스산화효소-금나노클러스터를 포함하며,
상기 단백질-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 단백질을 포함하고,
상기 과산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와, 상기 금나노클러스터를 에워싸는 과산화효소를 포함하며,
상기 글루코오스산화효소-금나노클러스터는 금나노클러스터와 상기 금나노클러스터를 에워싸는 글루코오스 산화효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.According to claim 1,
The enzyme-gold nanoclusters include peroxidase-gold nanoclusters and glucose oxidase-gold nanoclusters,
The protein-gold nanoclusters include gold nanoclusters and proteins surrounding the gold nanoclusters,
The peroxidase-gold nanoclusters include gold nanoclusters and peroxidase surrounding the gold nanoclusters,
The glucose oxidase-gold nanoclusters are nanoparticles, characterized in that they include gold nanoclusters and glucose oxidase surrounding the gold nanoclusters.
상기 나노입자는 상기 단백질-금나노클러스터, 상기 과산화효소-금나노클러스터 및 상기 글루코오스산화효소-금나노클러스터가 서로 뭉쳐 형성되며, 구형의 형태를 가지고, 글루코오스 측정을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 나노입자.According to claim 5,
The nanoparticles are formed by aggregating the protein-gold nanoclusters, the peroxidase-gold nanoclusters, and the glucose oxidase-gold nanoclusters, have a spherical shape, and are used for measuring glucose. particle.
상기 나노입자와 TMB 용액을 혼합한 혼합용액에 글루코오스를 첨가하면, 글루코오스 존재 및 그 양에 따라 혼합용액의 색상이 변화하는 것을 특징으로 하는 나노입자.According to claim 6,
When glucose is added to the mixed solution of the nanoparticles and the TMB solution, the color of the mixed solution changes depending on the presence and amount of glucose.
상기 글루코오스 측정용 나노입자는 제6항의 나노입자가 사용되는 것을 특징으로 하는 글루코오스 측정용 센서.It includes a metal electrode and nanoparticles for measuring glucose bound to the metal electrode by a linker,
A sensor for measuring glucose, characterized in that the nanoparticles of claim 6 are used as the nanoparticles for measuring glucose.
상기 혼합용액준비단계에서는 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터가 혼합되는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.According to claim 9,
In the mixed solution preparation step, the protein-gold nanoclusters and the peroxidase-gold nanoclusters are mixed.
상기 혼합용액준비단계에서는 단백질-금나노클러스터와, 과산화효소-금나노클러스터와, 글루코오스산화효소-금나노클러스가 혼합되는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.According to claim 9
In the mixed solution preparation step, protein-gold nanoclusters, peroxidase-gold nanoclusters, and glucose oxidase-gold nanoclusters are mixed.
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| Langmuir.,34:2774-2783(2018.2.12.) |
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