KR102486631B1 - Silica ferrite magnetic nanoparticles for the immobilization of enzyme, and preparation method thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 은(Ag) 이온, 이산화규소(SiO₂) 및 산화철 (Fe₂O₃)을 포함하며, 생체 분자와 Ag-생체 분자-SiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노입자를 형성하는, 생체 분자 고정을 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 녹차의 항균 활성 생체 분자를 사용하여 하이브리드 나노 구조체를 합성하는 방법을 구축함으로써, 녹차의 항균 활성과, 나노 구조체의 자성을 나타냄으로써 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노 구조체는 병원성 미생물에 대해 우수한 항균 활성을 나타내고. 재사용 가능한 항균 활성을 입증하였으며, 나아가 친환경 바이오 소재를 고정시켜 다양한 금속 나노 하이브리드 나노 구조체 생산에 이용될 수 있다.The present invention includes silver (Ag) ions, silicon dioxide (SiO ₂ ) and iron oxide (Fe ₂ O ₃ ), and forms biomolecules and Ag-biomolecule-SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid nanoparticles. The present invention relates to a composition for immobilizing molecules, and the present invention establishes a method for synthesizing a hybrid nanostructure using antibacterial active biomolecules of green tea, thereby exhibiting the antibacterial activity of green tea and the magnetism of the nanostructure to obtain Ag-BSiO ₂ - The Fe ₂ O ₃ hybrid nanostructure exhibits excellent antibacterial activity against pathogenic microorganisms. Reusable antibacterial activity has been demonstrated, and furthermore, it can be used for the production of various metal nano-hybrid nanostructures by fixing eco-friendly biomaterials.

Description

효소 고정을 위한 자성 나노입자 및 이의 제조방법{Silica ferrite magnetic nanoparticles for the immobilization of enzyme, and preparation method thereof}Magnetic nanoparticles for enzyme immobilization and preparation method thereof {Silica ferrite magnetic nanoparticles for the immobilization of enzyme, and preparation method thereof}

본 발명은 효소 고정을 위한 자성 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to magnetic nanoparticles for immobilizing enzymes and a method for preparing the same.

항생제가 발견된 이후 70 년 동안 조절되지 않은 사용으로 인해 현재에는 이용 가능한 기존 항생제에 반응하지 않는 항생제 내성 균주가 발생하여, 보건 부문의 주요 관심사가 되었다. 이에 따라 더 많은 차세대 항생제가 의학 분야에 도입되었으나 이러한 차세대 항생제를 사용하기에는 독성과 부작용이 우려된다. 지난 20 년 동안 대체 치료 방법이 연구되었고, 여러 유형의 나노 소재의 항균 활성이 인간 및 비인간 개체에 무독성인지 여부가 테스트되었다.In the 70 years since antibiotics were discovered, their uncontrolled use has resulted in antibiotic-resistant strains that do not respond to the existing antibiotics currently available, which has become a major concern of the health sector. As a result, more next-generation antibiotics have been introduced into the medical field, but toxicity and side effects are concerned about using these next-generation antibiotics. In the past 20 years, alternative treatment methods have been investigated and the antibacterial activity of several types of nanomaterials has been tested to determine whether they are non-toxic to human and non-human organisms.

은 나노입자(Silver nanoparticles, Ag NPs) 는 고대부터 알려진 항균 활성 효과로 인해 광범위하게 연구되어 왔다. 특히 광범위한 병원성 미생물에 대한 은 나노입자의 항균 활성에 관하여 자세한 연구가 수행되었으며, 은 나노입자(Ag NPs)는 활성 산소종을 통해 박테리아에 작용하는 은 이온(Ag⁺)을 방출함으로써 작용한다는 것이 입증되었다. 은 나노입자(Ag NP)의 항균 활성은 응집체 형성과 함께 감소하며, 여기서 은 나노입자는 부피가 큰 물질을 형성하여 작은 박테리아 및 바이러스에 작용하기 어렵게 된다. 또한 은 나노입자는 박테리아뿐만 아니라 포유류 세포에도 독성이 있어, 이는 은 나노입자의 치료적인 사용에서 문제점이 있다. 따라서 몇 가지 기능화 또는 고정화 과정을 사용하여 항균 효율을 높이고 환경으로 방출되기 전에 은 나노입자의 응집 및 독성을 방지할 수 있다. 최근에는 은 나노입자의 활성, 안정성 및 재사용 가능성을 유지하기 위한 이상적인 고정체를 구축하기 위하여 광범위한 연구가 진행 중이다.Silver nanoparticles (Ag NPs) have been extensively studied due to their antibacterial activity known since ancient times. In particular, detailed studies have been conducted on the antibacterial activity of silver nanoparticles against a wide range of pathogenic microorganisms, and it has been demonstrated that silver nanoparticles (Ag NPs) act by releasing silver ions (Ag ⁺ ) that act on bacteria through reactive oxygen species. It became. The antibacterial activity of silver nanoparticles (Ag NPs) decreases with the formation of aggregates, where the silver nanoparticles form a bulky material, making it difficult to act on small bacteria and viruses. In addition, silver nanoparticles are toxic to mammalian cells as well as bacteria, which is a problem in the therapeutic use of silver nanoparticles. Therefore, several functionalization or immobilization processes can be used to increase antibacterial efficiency and prevent aggregation and toxicity of silver nanoparticles before release into the environment. Recently, extensive research is being conducted to establish an ideal fixture for maintaining the activity, stability, and reusability of silver nanoparticles.

자성 나노입자(Magnetic nanoparticle)는 외부 자기장에 의한 나노입자의 분리 및 효소의 안정성에 의해 나노 입자의 분리를 용이하게 하기 때문에, 은 나노입자의 사용 및 재사용 후에도 은 나노입자의 부작용을 줄일 수 있어 몇몇 나노 물질의 반복적인 적용하기 위한 운반체로 사용되었다.Since magnetic nanoparticles facilitate the separation of nanoparticles by an external magnetic field and the stability of enzymes, the side effects of silver nanoparticles can be reduced even after use and reuse, resulting in some It has been used as a carrier for repeated applications of nanomaterials.

여러 연구에서 이산화규소(실리카)(SiO₂)와 자성 나노입자를 고정하는 금속 나노입자의 합성을 위한 다양한 방법이 제시되고 있는데, 이러한 방법들은 시간이 많이 소요되며, 위험한 재료와 값비싼 기기와 함께 다루기 힘든 반응 과정이 필요하다.Various studies have suggested various methods for the synthesis of silicon dioxide (silica) (SiO ₂ ) and metal nanoparticles immobilizing magnetic nanoparticles, but these methods are time-consuming, with hazardous materials and expensive equipment. It requires an intractable reaction process.

예를 들어 은 나노실리카 나노입자는 72 시간 배양된 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)에서 추출한 단백질을 이용하여 합성되었으며, 방오 흡착제, 효과적인 물 소독 및 생물학적 오염 방지할 수 있음이 보고되었다. Kaloti 등은 매우 높은 온도를 적용하여 Ag-γ-Fe₂O₃ 나노 복합체의 형성을 위해 포도당을 사용하였다. Tzounis 등은 SiO₂ 나노스피어(nanosphere)의 기능화를 위해 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)을 사용했으며, 환원제로 나트륨 보로하이드라이드(sodium borohydride)를 사용하여 은 나노입자가 코팅되었다. 이 기술은 자성 나노 입자에 존재하는 실리카 층에 고정된 환원 분자가 Ag+ 이온의 환원에 사용되어 표면에 초미세 구형의 은 나노입자가 있는 금속-자성 하이브리드 나노 구조를 아주 짧은 반응 시간 내에 형성하는 첫 번째 보고서이다. 하이브리드 나노 구조 합성 방법의 주요 장점은 매우 복잡하고 비싸고 다루기 힘든 기능화 및 환원 반응 조건을 포함하는 과정을 최소화 할 수 있다.For example, silver nanosilica nanoparticles were synthesized using proteins extracted from Rhizopus oryzae cultured for 72 hours, and it has been reported that they can act as antifouling adsorbents, effectively disinfect water and prevent biological fouling. Kaloti et al. used glucose to form Ag-γ-Fe ₂ O ₃ nanocomposites by applying very high temperatures. Tzounis et al. used polyethyleneimine for functionalization of SiO ₂ nanospheres, and silver nanoparticles were coated using sodium borohydride as a reducing agent. This technology is the first to form a metal-magnetic hybrid nanostructure with ultra-fine spherical silver nanoparticles on the surface in a very short reaction time by using reduction molecules fixed on the silica layer present in magnetic nanoparticles to reduce Ag+ ions. This is the second report. The main advantage of the hybrid nanostructure synthesis method is that it can minimize the process involving highly complex, expensive and cumbersome functionalization and reduction reaction conditions.

이에 본 발명자들은 효소를 고정하기 위하여 연구하던 중, 녹차나무(Camellia sinensis) 잎에서 추출된 추출물에서 생체분자를 포집하고, 생체 분자가 포집된 SiO₂-Fe₂O₃ 나노입자(NP)를 구성하고, 항균 활성 다기능 하이브리드 구조체를 형성하기 위하여 은 나노입자(Ag NP)의 초고속 형성할 수 있는 사용하는 새로운 친환경 방법을 하이브리드 나노 구조체를 개발하고, 생체 분자를 안정적이고 효율적으로 고정시켜 재사용 가능한 항균 활성이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors collected biomolecules from the extract extracted from the leaves of Camellia sinensis while studying to fix the enzyme, and composed SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles (NP) in which the biomolecules were collected. In order to form a multifunctional hybrid structure with antibacterial activity, a new eco-friendly method using ultra-fast formation of silver nanoparticles (Ag NPs) is developed, and biomolecules are stably and efficiently fixed to achieve reusable antibacterial activity. The present invention was completed by confirming that there is.

본 발명의 목적은 항균 활성을 갖는 생체 분자와 Ag-생체 분자-SiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노입자를 형성하는, 생체 분자 고정을 위한 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a composition for immobilizing biomolecules in which biomolecules having antibacterial activity and Ag-biomolecule-SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid nanoparticles are formed.

본 발명의 다른 목적은 Ag-생체 분자-SiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드를 포함하는, 은/생체 분자-실리카 페라이트 복합체 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a silver/biomolecule-silica ferrite composite composition comprising an Ag-biomolecule-SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 은(Ag) 이온, 이산화규소(SiO₂) 및 산화철 (Fe₂O₃)을 포함하며, 생체 분자와 Ag-생체 분자-SiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노입자를 형성하는, 생체 분자 고정을 위한 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention includes silver (Ag) ions, silicon dioxide (SiO ₂ ) and iron oxide (Fe ₂ O ₃ ), and a biomolecule and Ag-biomolecule-SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid A composition for immobilizing biomolecules forming nanoparticles is provided.

또한, 본 발명은 항균 활성을 갖는 생체 분자가 고정화된 Ag-생체 분자-SiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드를 포함하는, 은/생체 분자-실리카 페라이트 복합체 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a silver/biomolecule-silica ferrite composite composition comprising an Ag-biomolecule-SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid on which biomolecules having antibacterial activity are immobilized.

본 발명은 녹차의 항균 활성 생체 분자를 사용하여 하이브리드 나노 구조체를 합성하는 방법을 구축함으로써, 녹차의 항균 활성과, 나노 구조체의 자성을 나타냄으로써 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노 구조체는 병원성 미생물에 대해 우수한 항균 활성을 나타내고. 재사용 가능한 항균 활성을 보임으로써, 친환경 바이오 소재를 고정시켜 다양한 금속 나노 하이브리드 나노 구조체 생산에 이용될 수 있다.The present invention establishes a method for synthesizing a hybrid nanostructure using antibacterial active biomolecules of green tea, thereby exhibiting the antibacterial activity of green tea and the magnetism of the nanostructure, so that the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid nanostructure is pathogenic. It exhibits excellent antibacterial activity against microorganisms. By showing reusable antibacterial activity, it can be used to produce various metal nano-hybrid nanostructures by immobilizing eco-friendly biomaterials.

도 1은 은 이온과 생체분자로 포집된 SiO₂-Fe₂O₃ 기반 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노 구조 합성 방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 (A, B) Fe₂O₃ 나노 스피어 및 (C, D) BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 스피어의 HR-TEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 3은 (A) Fe₂O₃ 나노입자, BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자, Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 UV 가시광 분석. (B) XRD 분석. (C) γ-Fe₂O₃ 나노입자, BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자 및, Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 자화 곡선을 나타낸 도이다.
도 4는 (A, B, C) HR-TEM 이미지, (D) EDS 스펙트럼 분석, (E) Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 원소 매핑 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 다양한 농도의 (A) S. aureus, (B) E. coli의 성장 곡선 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 다양한 농도의 나노 하이브리드에 24 시간 노출시의 (A) S. aureus 및 (B) E. coli의 배양 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 (A) S. aureus 및 (B) E. coli에 대한 20 μg mL^-1 농도 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 재사용 가능한 항균 효과를 측정한 결과를 나타낸 도이다.1 is a diagram schematically illustrating a method for synthesizing a SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ -based Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid nanostructure in which silver ions and biomolecules are captured.
2 is a diagram showing HR-TEM images of (A, B) Fe ₂ O ₃ nanospheres and (C, D) BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanospheres.
3 is (A) UV-visible analysis of Fe ₂ O ₃ nanoparticles, BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles, and Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid. (B) XRD analysis. (C) A diagram showing magnetization curves of γ-Fe ₂ O ₃ nanoparticles, BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles, and Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid.
4 is a diagram showing (A, B, C) HR-TEM images, (D) EDS spectral analysis, and (E) elemental mapping results of Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid.
5 is a diagram showing the growth curve measurement results of (A) S. aureus and (B) E. coli at various concentrations of the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid.
Figure 6 is a diagram showing the culture results of (A) S. aureus and (B) E. coli when exposed to nanohybrids at various concentrations for 24 hours.
Figure 7 is (A) S. aureus and (B) a diagram showing the results of measuring the reusable antibacterial effect of the 20 μg mL ^-1 Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nano-hybrid against E. coli.

본 발명은 효소 고정을 위한 자성 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to magnetic nanoparticles for immobilizing enzymes and a method for preparing the same.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 은(Ag) 이온, 이산화규소(SiO₂) 및 산화철 (Fe₂O₃)을 포함하며, 생체 분자와 Ag-생체 분자-SiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노입자를 형성하는, 생체 분자 고정을 위한 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 SiO₂-Fe₂O₃ 나노입자 구조체의 표면에 생체 분자와 은 이온이 응집된 형태일 수 있다.The present invention includes silver (Ag) ions, silicon dioxide (SiO ₂ ) and iron oxide (Fe ₂ O ₃ ), and forms biomolecules and Ag-biomolecule-SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid nanoparticles. It relates to a composition for immobilizing molecules, and specifically, it may be a form in which biomolecules and silver ions are aggregated on the surface of a SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticle structure.

바람직하게는 상기 생체 분자는 녹차 잎 추출물의 항균 활성 물질일 수 있다.Preferably, the biomolecule may be an antibacterial active substance of green tea leaf extract.

여기서, 녹차 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, n-헥산, 벤젠 또는 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올로 추출된 추출물일 수 있다.Here, the green tea leaf extract may be extracted with a solvent selected from the group consisting of water, alcohol having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, n-hexane, benzene, or mixed solvents thereof, preferably extracted with ethanol. can be

본 발명에 따른 Ag-생체 분자-SiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드는 재사용 가능한 항균 활성을 갖을 수 있다. 바람직하게는 Ag-생체 분자-SiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드는 항균 활성의 최저 사멸 농도가 9μg mL^-1 일 수 있다.The Ag-biomolecule-SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid according to the present invention may have reusable antibacterial activity. Preferably, the Ag-biomolecule-SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid may have a minimum killing concentration of 9 μg mL ⁻¹ of antibacterial activity.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면 항균 활성을 갖는 생체 분자가 고정화된 Ag-생체 분자-SiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드를 포함하는, 은/생체 분자-실리카 페라이트 복합체 조성물이 개시된다.According to another embodiment of the present invention, a silver/biomolecule-silica ferrite composite composition comprising an Ag-biomolecule-SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid on which biomolecules having antibacterial activity are immobilized is disclosed.

본 발명의 조성물은 자성에 의해 분리될 수 있는 자성 나노입자를 형성함으로써 재사용 가능한 항균 활성을 나타낸다.The composition of the present invention exhibits reusable antibacterial activity by forming magnetic nanoparticles that can be separated by magnetism.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following examples. However, the following examples are described with the intention of explaining the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.

준비예 1. 실험 준비Preparation Example 1. Experiment preparation

질산은 (AgNO₃), 철 (III) 질산 무수화물 (Fe(NO₃)₃).9H₂O), 에탄올 (C₂H₅OH; 99.9 %), 테트라에틸 오르토실리케이트(Tetraethyl orthosilicate, TEOS), 탄산나트륨, 갈산 일수화물, 2,2- 디페닐-1- 피크릴 히드라질(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(ABTS), 및 황산칼륨 (K₂Cr₂O₇) 및 수산화암모늄 (NH₄OH)은 미국 미주리주 세인트루이스의 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 녹차 티백 한국 제주 시장에서 구입하였다. 화학 물질은 정제없이 분석 시약 등급 (AR 등급)으로 모든 실험에 사용되었다.silver nitrate (AgNO ₃ ), iron (III) nitric acid anhydride (Fe(NO ₃ ) ₃ ).9H ₂ O), ethanol (C ₂ H ₅ OH; 99.9%), tetraethyl orthosilicate (TEOS), Sodium carbonate, gallic acid monohydrate, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6 -sulfonic acid) (ABTS), and potassium sulfate (K ₂ Cr ₂ O ₇ ) and ammonium hydroxide (NH ₄ OH) were purchased from Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Green tea tea bags were purchased from a Jeju market in Korea. Chemicals were used in all experiments as analytical reagent grade (AR grade) without purification.

UV-가시광 분광법은 1cm 웰 스토퍼 석영 큐벳이 있는 Schimadzu UV 1600 분광 광도계를 사용하였다. 나노 구조체의 형태는 300kV에서 작동하는 JEM-3010 (JEOL)을 사용한 HR-TEM 분석과 EDS (Energy Dispersive Spectroscopy)로 확인하였다. 나노 구조의 결정학 분석은 Cu 타겟과 함께 X- 선회절계 (Rigaku, Japan)를 사용하였다. 유기 함량의 존재는 TGA 기기 (Q-5000 IR; 미국 TA Instruments)를 사용하였다. Fe₂O₃ 및 Fe₂O₃ 나노 하이브리드 구조의 자기 특성은 진동 샘플 자력계 (VSM; Lakeshore Cryotronics, Inc., USA)로 측정하였다.UV-visible light spectroscopy used a Schimadzu UV 1600 spectrophotometer with a 1 cm well stopper quartz cuvette. The morphology of the nanostructure was confirmed by HR-TEM analysis and EDS (Energy Dispersive Spectroscopy) using a JEM-3010 (JEOL) operating at 300 kV. Crystallographic analysis of the nanostructure was performed using an X-ray diffractometer (Rigaku, Japan) with a Cu target. The presence of organic content was measured using a TGA instrument (Q-5000 IR; TA Instruments, USA). The magnetic properties of the Fe ₂ O ₃ and Fe ₂ O ₃ nanohybrid structures were measured with a vibrating sample magnetometer (VSM; Lakeshore Cryotronics, Inc., USA).

실시예 1. Ag-BSiOExample 1. Ag-BSiO ₂₂ -Fe-Fe ₂₂ OO ₃₃ 하이브리드 나노 구조의 합성 Synthesis of hybrid nanostructures

1-1. 녹차 잎 에탄올 추출물의 제조1-1. Preparation of Green Tea Leaf Ethanol Extract

녹차 잎 1.2g을 분쇄하여 자기 교반하에 무수 에틸알코올(99.9 %)에서 4 시간 동안 환류시켰다. 현탁액을 실온에서 냉각시키고 10 분 동안 4000 rpm에서 원심 분리하여 녹차 잎의 큰 입자를 제거 하였다. 다음으로 녹차 잎 추출물을 Whatman 여과지를 통해 여과하여 작은 잎 미립자를 제거하였다. 정제된 에탄올 녹차 추출물을 어두운 곳에서 4 ° C에서 속에 보관하여 추가 실험 절차에 사용하였다.1.2 g of green tea leaves were pulverized and refluxed in anhydrous ethyl alcohol (99.9%) for 4 hours under magnetic stirring. The suspension was cooled at room temperature and centrifuged at 4000 rpm for 10 min to remove large particles of green tea leaves. Next, the green tea leaf extract was filtered through Whatman filter paper to remove small leaf particles. The purified ethanolic green tea extract was stored in the dark at 4 °C and used for further experimental procedures.

1-2. Fe1-2. Fe ₂₂ OO ₃₃ 나노입자의 합성 Synthesis of nanoparticles

Fe₂O₃ 나노입자(NP)는 1M 질산철 Fe(NO₃)₂을 30 분 동안 N₂ 가스 버블링 하에 50mL의 증류수 (DW)에서 준비하였다. 용액의 pH는 30% 수산화암모늄 수용액을 사용하여 교반하면서 10 이상을 유지 하였다. 그런 다음 용액을 스테인리스 스틸 반응기에서 150 ° C에서 10 시간 동안 오토클레이브시켰다. 형성된 침전물을 원심 분리하고 중성 pH가 될 때까지 에탄올과 물로 여러번 세척하고, 입자를 50 ° C에서 12 시간 동안 진공 건조시켰다.Fe ₂ O ₃ nanoparticles (NP) were prepared with 1M iron nitrate Fe(NO ₃ ) ₂ in 50 mL of distilled water (DW) under bubbling N ₂ gas for 30 minutes. The pH of the solution was maintained at 10 or more while stirring using a 30% aqueous ammonium hydroxide solution. The solution was then autoclaved for 10 h at 150 °C in a stainless steel reactor. The precipitate formed was centrifuged and washed several times with ethanol and water until a neutral pH, and the particles were vacuum dried at 50 °C for 12 h.

1-3. BSiO1-3. BSiO ₂₂ -Fe-Fe ₂₂ OO ₃₃ 나노입자의 합성 Synthesis of nanoparticles

BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자(NP)는 정제된 에탄올 녹차 추출물 40 mL 에서 50 mg의 Fe₂O₃ 나노입자를 초음파 처리하에 20 분 동안 분산시켰다. 2ml의 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS)를 Fe₂O₃ 현탁액에 적가하고, 1 시간 동안 기계적으로 교반하면서 추가 혼합하였다. 용액의 pH는 수산화암모늄 수용액을 추가하면서 11로 조정하였다. 24 시간 배양 후, 형성된 입자를 원심 분리시켜 수집하고 에탄올과 물로 반복적으로 세척하였다. BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자는 50 ° C에서 12 시간 동안 진공 건조시켰다.BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles (NP) were prepared by dispersing 50 mg of Fe ₂ O ₃ nanoparticles in 40 mL of purified ethanolic green tea extract under sonication for 20 minutes. 2 ml of tetraethyl orthosilicate (TEOS) was added dropwise to the Fe ₂ O ₃ suspension and further mixed with mechanical stirring for 1 hour. The pH of the solution was adjusted to 11 by adding aqueous ammonium hydroxide solution. After culturing for 24 hours, the formed particles were collected by centrifugation and washed repeatedly with ethanol and water. BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles were vacuum dried at 50 °C for 12 hours.

1-4. Ag-BSiO1-4. Ag-BSiO ₂₂ -Fe-Fe ₂₂ OO ₃₃ 하이브리드 나노 구조체의 합성 Synthesis of hybrid nanostructures

Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노 구조를 구성하기 위하여, BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자를 10ml 증류수에 분산시키고, 응집을 방지하기 위하여 20 분 동안 초음파 처리하였다. 10ml의 AgNO₃ 수용액을 용액에 부어 10mM AgNO₃ 용액을 형성하였다. 혼합물을 추가로 배양하고 30 분 동안 교반하고 색 변화를 관찰하였다. 형성된 하이브리드 나노 구조물을 물과 에탄올로 여러번 세척하고 원심 분리하여 얻은 후 50 ° C에서 진공 건조시켰다.To construct Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid nanostructures, BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles were dispersed in 10 ml of distilled water and sonicated for 20 minutes to prevent aggregation. 10 ml of AgNO ₃ aqueous solution was poured into the solution to form a 10 mM AgNO ₃ solution. The mixture was further incubated and stirred for 30 minutes and observed for color change. The formed hybrid nanostructures were washed several times with water and ethanol, centrifuged, and vacuum dried at 50 °C.

1-5. 하이브리드 나노 구조의 합성 모니터링1-5. Synthesis monitoring of hybrid nanostructures

자성 촉매 활성 나노 하이브리드 구조체는 자성 나노 구조체 표면의 SiO₂에 포획된 생체 분자로 합성되고, 환원 과정을 위해 수성 Ag ⁺ 이온이 추가로 분산되어 BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자 표면에 Ag 나노입자를 형성한다. 또한 ABTS 및 DPPH 소거 분석에서 얻은 에탄올 및 물 추출물의 항산화 특성은 두 용매 모두에서 효과적인 항산화 활성이 나타났다. 알칼리성인 에탄올 녹차 추출물에는 녹차 추출물에 존재하는 생체 분자가 포획되어 생체 분자가 포획된 SiO₂(BSiO₂)가 되는 SiO₂ 층 형성을 위해 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS)가 첨가되었다. (도 1).The magnetic catalytically active nanohybrid structure is synthesized with biomolecules trapped in SiO ₂ on the surface of the magnetic nanostructure, and aqueous Ag ⁺ ions are additionally dispersed for the reduction process to form Ag nanoparticles on the surface of BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles. form In addition, antioxidant properties of ethanol and water extracts obtained from ABTS and DPPH scavenging assays showed effective antioxidant activity in both solvents. Tetraethyl orthosilicate (TEOS) was added to the alkaline ethanolic green tea extract to form a SiO ₂ layer in which biomolecules present in the green tea extract were captured to become SiO ₂ (BSiO ₂ ) in which the biomolecules were captured. (Fig. 1).

Fe₂O₃ 나노입자는 도 2a 및 2b는 평균 직경이 100nm 인 Fe₂O₃ 나노입자를 나타낸다. 이러한 자성 나노입자에 녹차 에탄올 추출물과 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS)의 알칼리 혼합물을 첨가하고 실온에서 12 시간 동안 Fe₂O₃ 나노입자 표면에 BSiO₂ 층을 형성하도록 하였다. 도 2c 및 2d에서, 자성 나노입자의 표면에 매끄러운 BSiO₂ 층이 코어 쉘 구조를 형성하는 것을 확인하였다. 자성 나노입자의 크기는 약 30nm 증가했으며 10-20nm의 BSiO₂ 층이 형성되었다. BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자는 TGA 분석에서 92.3 %의 SiO₂-Fe₂O₃ 나노입자에 대한 중량 감소와 비교했을 때 65.5 %의 중량 감소를 보였으며, Fe₂O₃ 나노입자에 존재하는 SiO₂ 층의 생체 분자의 존재를 확인하였다. 형성된 코어 쉘 구조는 AgNO₃ 수용액에 노출되었으며 BSiO₂ 층의 활성 생체 분자는 AgNO₃를 감소시켜 Ag 나노입자를 형성하였다.2a and 2b show Fe ₂ O ₃ nanoparticles _having an average diameter of 100 nm _. An alkaline mixture of green tea ethanol extract and tetraethyl orthosilicate (TEOS) was added to these magnetic nanoparticles, and a BSiO ₂ layer was formed on the surface of the Fe ₂ O ₃ nanoparticles at room temperature for 12 hours. 2c and 2d, it was confirmed that a smooth BSiO ₂ layer formed a core-shell structure on the surface of the magnetic nanoparticles. The size of the magnetic nanoparticles increased by about 30 nm and a 10-20 nm BSiO ₂ layer was formed. BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles showed a weight loss of 65.5% compared to a weight loss for SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles of 92.3 % in TGA analysis, present in Fe ₂ O ₃ nanoparticles. The presence of biomolecules in the SiO ₂ layer to be confirmed. The formed core-shell structure was exposed to an aqueous solution of AgNO ₃ , and active biomolecules on the BSiO ₂ layer reduced AgNO ₃ to form Ag nanoparticles.

Ag 나노입자의 합성은 UV-visible spectroscopy를 사용하여 확인하여 도 3A에 나타내었다. 400-500 nm 범위에서는 Fe₂O₃ 및 BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자의 흡광도가 관찰되지 않은 반면, Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자는 424 nm에서 특징적인 흡광도를 보여 BSiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노구조체에서 Ag 나노입자의 형성을 확인하였다.The synthesis of Ag nanoparticles was confirmed using UV-visible spectroscopy and is shown in FIG. 3A. In the range of 400-500 nm, the absorbance of Fe ₂ O ₃ and BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles was not observed, whereas the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles showed characteristic absorbance at 424 nm, and the BSiO ₂ The formation of Ag nanoparticles in the -Fe ₂ O ₃ hybrid nanostructure was confirmed.

실시예 2. 합성된 Ag-BSiOExample 2. Synthesized Ag-BSiO ₂₂ -Fe-Fe ₂₂ OO ₃₃ 하이브리드 나노 구조체의 항균 활성 Antibacterial activity of hybrid nanostructures

Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노 구조체의 항균 활성은 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus) 및 대장균(Escherichia coli)에 대하여 테스트하였다. S. aureus와 E. coli에 사용된 성장 배지는 각각 trypticase soy broth와 Luria-Bertani broth이다. 하이브리드 나노 구조체의 효과는 박테리아 세포의 성장기 상에서 22시간 동안 테스트 하였으며, 두 미생물의 성장은 UV 가시 분광법으로 즉 610 nm에서 광학 밀도를 사용하여 모니터링하였다. 5 ~ 9μg mL^-1의 다양한 농도의 하이브리드 나노 구조물을 10⁶ ~ 10⁷ cells mL^-1 인 배양액 에 첨가하고 37 ℃에서 24 시간 더 배양한 후 배양된 배양액에서 0.1mL를 첨가 하였다. 각각 한천에 펴 바르고 24 시간 동안 배양하고 성장을 관찰하고 콜로니 형성 단위(CFU) mL^-1을 측정하였다. 더 높은 농도의 하이브리드 나노 구조는 박테리아의 성장을 완전히 억제하였으며, 이를 항균 재사용 실험에 사용하였으며, 하이브리드 나노 구조의 20μg mL^-1을 10⁶ ~ 10⁷ 개의 박테리아 세포 mL^-1에 접종 하였다. 나노 하이브리드 나노 구조의 5 및 20 μg mL^-1을 S. aureus 및 E. coli 배양액에 노출시킨 후 나노 입자의 항균 활성을 시각화하기 위해 live/dead 염색 분석 하였다.The antibacterial activity of the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid nanostructure was tested against Staphylococcus aureus and Escherichia coli . The growth media used for S. aureus and E. coli were trypticase soy broth and Luria-Bertani broth, respectively. The effect of the hybrid nanostructure was tested for 22 hours on the growth phase of bacterial cells, and the growth of both microorganisms was monitored by UV-visible spectroscopy, that is, using optical density at 610 nm. 5 ~ 9μg mL ^-1 of various concentrations of hybrid nanostructures were added to the culture medium of 10 ⁶ ~ 10 ⁷ cells mL ^-1 and incubated at 37 °C for 24 hours, and then 0.1mL was added to the culture medium. Each was spread on agar and cultured for 24 hours, growth was observed, and colony forming units (CFU) mL ^-1 were measured. Higher concentrations of the hybrid nanostructure completely inhibited bacterial growth, which was used for antibacterial reuse experiments, and 20 μg mL ⁻¹ of the hybrid nanostructure was inoculated into 10 ⁶ to 10 ⁷ bacterial cells mL ⁻¹ . 5 and 20 μg mL ⁻¹ of the nanohybrid nanostructures were exposed to S. aureus and E. coli cultures, followed by live/dead staining analysis to visualize the antibacterial activity of the nanoparticles.

항균 활성antibacterial activity

Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드 구조의 항균 활성은 S. aureus (gram-positive)와 E. coli (gram-negative)를 사용하여 분석하였다. Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 유효 농도는 두 미생물의 성장 곡선에 대한 억제 효과를 분석하였다. 미생물의 시간 의존적 성장은 605 nm에서 모니터링 하였다. 도 5는 5μg mL^-1의 나노 하이브리드가 두 미생물의 성장률에 영향을 미쳤지만 두 미생물을 완전히 억제하지는 못하였다. 10 및 20 μg mL^-1에서 두 미생물의 성장이 완전히 억제되었으며 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드와 함께 배양한 후 20 시간 동안 흡광도의 변화가 관찰되지 않았다. CLSM를 통해 나노 하이브리드 구조체의 항균 활성을 시각화한 결과, 5μg mL^-1의 하이브리드 구조가 S. aureus에 가장 효과적인 억제를 보인 반면 E. coli는 이 농도에서 약간의 억제를 나타냈다. 그러나 두 미생물 모두 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 20μg mL^-1에 매우 민감하였다. 최소 억제 농도를 결정하기 위해 두 균주 모두 다양한 농도의 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드에 노출시켰다. 5μg mL^-1의 나노 하이브리드가 미생물의 성장을 감소 시켰지만 완전히 성장을 억제하지는 못하였다. 그러나 나노 하이브리드의 농도가 5μg에서 9μg mL^-1로 증가함에 따라 두 미생물의 성장은 지속적으로 감소하였다 (도 6). 9μg mL^-1의 나노 하이브리드에서 완전한 억제가 관찰되었다. 따라서 두 균주 모두의 최저 사멸 농도 (minimum bactericidal concentration, MBC)로 확인할 수 있다.The antibacterial activity of the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid structure was analyzed using S. aureus (gram-positive) and E. coli (gram-negative). The effective concentration of the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid was analyzed for the inhibitory effect on the growth curve of the two microorganisms. Time-dependent growth of microorganisms was monitored at 605 nm. 5 shows that 5μg mL ^-1 of the nanohybrid had an effect on the growth rates of the two microorganisms, but did not completely inhibit the two microorganisms. The growth of both microorganisms was completely inhibited at 10 and 20 μg mL ^-1 , and no change in absorbance was observed for 20 hours after incubation with the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid. As a result of visualizing the antibacterial activity of the nanohybrid structure through CLSM, the hybrid structure at 5μg mL ^-1 showed the most effective inhibition against S. aureus, but showed little inhibition against E. coli at this concentration. However, both microorganisms were very sensitive to 20 μg mL ^-1 of Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid. Both strains were exposed to various concentrations of Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid to determine the minimum inhibitory concentration. 5μg mL ^-1 of the nanohybrid reduced the growth of microorganisms, but did not completely inhibit the growth. However, as the concentration of the nanohybrid increased from 5 μg to 9 μg mL ^-1 , the growth of the two microorganisms continuously decreased (FIG. 6). Complete inhibition was observed with 9 μg mL ⁻¹ of the nanohybrid. Therefore, it can be confirmed as the minimum bactericidal concentration (MBC) of both strains.

20μg mL^-1의 나노 하이브리드가 두 병원성 균주의 완전한 억제를 나타냈기 때문에 항균 활성의 반복 사용에 대해 나노 하이브리드의 농도를 확인하였다. Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드를 각각 박테리아 현탁액에 첨가하고 혼합물을 24 시간 동안 배양 하였다. 배양 후 외부에서 자석으로 나노 하이브리드 재료를 분리하고 박테리아 현탁액을 분광학적으로 분석하였다. 나노 하이브리드 구조체는 각 반복 사용 전에 완충액으로 세척되었고, 새로운 박테리아 현탁액이 세척된 완충액에 첨가되었다. 이는 연속하여 5 사이클 동안 반복하였다. Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드는 S. aureus에 대한 상대적 항균 활성의 80 %를 유지하고 E. coli에 대해 75 %를 유지하였다 (도 7).Since 20 μg mL ⁻¹ of the nanohybrid exhibited complete inhibition of both pathogenic strains, the concentration of the nanohybrid was confirmed for repeated use of antibacterial activity. Each Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid was added to the bacterial suspension and the mixture was incubated for 24 h. After incubation, the nanohybrid material was separated with a magnet from the outside and the bacterial suspension was spectroscopically analyzed. The nanohybrid constructs were washed with the buffer before each repeated use, and a fresh bacterial suspension was added to the washed buffer. This was repeated for 5 cycles in succession. The Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid maintained 80% of the relative antibacterial activity against S. aureus and 75% against E. coli (FIG. 7).

실시예 3. 합성된 Ag-BSiOExample 3. Synthesized Ag-BSiO ₂₂ -Fe-Fe ₂₂ OO ₃₃ 하이브리드 나노 구조체의 생화학적 분석 Biochemical analysis of hybrid nanostructures

3-1. 총 페놀 함량 측정3-1. Determination of total phenol content

물과 에탄올을 사용하여 제조한 녹차 추출물의 총 페놀 함량은 McDonald 방법을 사용하여 측정하였으며, 구체적으로는, 갈산 일 수화물 (100μg mL^-1)의 표준 용액과 메탄올을 준비하고, 0.1 내지 1.0 mL의 녹차 잎 추출물의 상이한 농도를 10 개의 상이한 튜브에서 Folin-Ciocalteu 시약 및 DW의 1 : 1로 혼합 하였다. 각 튜브에 7.5 % 탄산나트륨 (2 mL)을 첨가하고 혼합물을 30 분 동안 더 반응시켰다. 흡광도는 765nm에서 측정하고, 그런 다음 100 μL의 테스트 샘플을 사용하여 갈산 당량 mg GAE g^-1 을 표준 그래프로 총 페놀 함량을 측정하였다.The total phenol content of the green tea extract prepared using water and ethanol was measured using the McDonald method. Specifically, a standard solution of gallic acid monohydrate (100μg mL ^-1 ) and methanol were prepared, and 0.1 to 1.0 mL of Different concentrations of green tea leaf extract were mixed 1:1 of Folin-Ciocalteu reagent and DW in 10 different tubes. 7.5% sodium carbonate (2 mL) was added to each tube and the mixture reacted for an additional 30 min. The absorbance was measured at 765 nm, and then the total phenol content was measured using a standard graph of gallic acid equivalent mg GAE g ^-1 using 100 μL of the test sample.

3-2. DPPH 라디칼 소거 활성 측정3-2. Measurement of DPPH radical scavenging activity

에탄올 녹차 추출물과 BSiO₂ 나노입자의 항산화 특성은 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 기준으로 측정하였다. 100 mL 메탄올과, DPPH 6 mg 용액을 준비하였다. 항산화 활성은 메탄올에서 안정한 DPPH 라디칼의 변색을 기준으로 측정하였으며 517 nm에서 흡광도를 얻었다. DPPH 용액의 변색에 대해 테스트 샘플의 다른 분취량을 테스트하였다. 라디칼 소거 활성은 하기 식 1을 통하여 계산하였다. Antioxidant properties of ethanolic green tea extract and BSiO ₂ nanoparticles were measured based on DPPH free radical scavenging activity. 100 mL methanol and 6 mg DPPH solution were prepared. Antioxidant activity was measured based on the discoloration of stable DPPH radicals in methanol, and absorbance was obtained at 517 nm. Different aliquots of the test samples were tested for discoloration of the DPPH solution. Radical scavenging activity was calculated through Equation 1 below.

식 1: 라디칼 소거 활성 (%) = 흡광도 (대조군) - 흡광도 (샘플) / 흡수성 (대조군) Х 100Equation 1: Radical scavenging activity (%) = absorbance (control) - absorbance (sample) / absorbance (control) Х 100

3-3. ABTS 라디칼 소거 분석3-3. ABTS radical scavenging assay

ABTS 라디칼 소거 분석은 테트라에틸 오르토실리케이트 가수 분해 전후에 에탄올 녹차 추출물의 항산화 능력을 분석하였다. 테트라에틸 오르토실리케이트(Tetraethyl orthosilicate, TEOS) 가수 분해에서 얻은 녹차 추출물과 용액을 다른 농도로 희석하고 2.45mM과 황산칼륨 (K₂S₂O₈)으로 제조된 7mM ABTS 표준 용액에 첨가하고 혼합물을 추가로 30 ° C에서 6 분 동안 반응시켰다. 배양후 흡광도는 734 nm에서 측정하였다. 추출물의 라디칼 소거 활성은 하기 식2를 통해 계산하고 BHT와 비교하였다.ABTS radical scavenging assay analyzed the antioxidant capacity of ethanolic green tea extracts before and after tetraethyl orthosilicate hydrolysis. Green tea extract and solutions obtained from tetraethyl orthosilicate (TEOS) hydrolysis were diluted to different concentrations and added to a 7 mM ABTS standard solution prepared with 2.45 mM and potassium sulfate (K ₂ S ₂ O ₈ ) and the mixture was added. and reacted at 30 °C for 6 min. After incubation, absorbance was measured at 734 nm. The radical scavenging activity of the extract was calculated through Equation 2 below and compared with BHT.

식 2 : ABTS 라디칼 소거 활성 (%) = 흡광도 (대조군) - 흡광도 (샘플) / 흡수성 (대조군) Х100Equation 2: ABTS radical scavenging activity (%) = absorbance (control) - absorbance (sample) / absorbance (control) Х100

에탄올로 제조된 녹차 추출물은 폴리 페놀 함량이 높고 항산화 특성이 높다. 본 발명에서 나노 하이브리드 구조체는 활성 환원력을 가진 에탄올 녹차 추출물에서 농축된 카테킨 유도체를 사용하였다. 도 3B에 γ-Fe₂O₃ 나노입자 (검은색), BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자 (빨간색), Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드 (파란색)의 XRD 스펙트럼으로 나노 하이브리드 재료의 결정성을 나타내었다. γ-Fe₂O₃ 나노입자는 도 3B, 검은 색과 같이 JCPDS 카드 번호 96-101-3050 와 일치하는 자성 표면의 중심에 입방체 구조를 갖는 전형적인 XRD 패턴을 나타낸다. 2θ에서 얻은 특성 피크는 30.06 °, 35.4 °, 43.0 °, 56.9 ° 및 62.5 °였으며 각각 022, 113, 004, 115 및 044 지수에 해당된다. BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자의 XRD 데이터 (도 3B, 빨간색)는 Fe₂O₃ 나노입자에 대한 데이터와 유사했으며, 2θ에서 21 °의 넓은 피크는 비정질 BSiO₂ 층에 해당한다. Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드 (도 3B, 파란색)의 XRD 패턴은 Fe₂O₃에 대한 특징적인 피크와 함께 위상 지수에 해당하는 2θ에서 37.8 °, 63.9 ° 및 76.7 °의 Ag에 대한 특징적인 피크 (각각, 111, 022 및 113 지수)를 보여주었다. XRD 패턴은 금속 은의 표면 중심에 큐빅 구조를 보여준다. Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 XRD에서 SiO₂에 대해 2θ에서 21-23 °의 넓은 피크가 관찰되었다.Green tea extract prepared with ethanol has high polyphenol content and high antioxidant properties. In the present invention, the nano-hybrid structure used a catechin derivative concentrated in ethanol green tea extract having active reducing power. 3B shows XRD spectra of γ-Fe ₂ O ₃ nanoparticles (black), BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles (red), and Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid (blue) nanohybrid materials. showed crystallinity. The γ-Fe ₂ O ₃ nanoparticles show a typical XRD pattern with a cubic structure at the center of the magnetic surface consistent with JCPDS Card No. 96-101-3050, as shown in Fig. 3B, black. The characteristic peaks obtained at 2θ were 30.06°, 35.4°, 43.0°, 56.9° and 62.5°, corresponding to indices 022, 113, 004, 115 and 044, respectively. The XRD data of the BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles (Fig. 3B, red) were similar to those of the Fe ₂ O ₃ nanoparticles, and the broad peak at 21° at 2θ corresponds to the amorphous BSiO ₂ layer. The XRD pattern of the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid (Fig. 3B, blue) shows the characteristic peaks for Fe ₂ O ₃ at 37.8°, 63.9° and 76.7° of Ag at 2θ corresponding to the phase indices. showed characteristic peaks (indices 111, 022 and 113, respectively) for The XRD pattern shows a cubic structure centered on the surface of metallic silver. In the XRD of the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid, a broad peak of 21–23° at 2θ was observed for SiO ₂ .

실온에서 20 KOe의 피크 필드를 갖는 VSM 측정은 γ-Fe₂O₃ 나노입자 (검정색), BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자 (빨간색) 및 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ (파란색)나노 하이브리드의 자성 히스테리시스 루프를 계산하고 자기 변화를 분석하여 도 3C에 나타내었다. γ-Fe₂O₃ 나노입자의 포화 자화 saturation magnetization, Ms) 값은 300K에서 61 emu g^-1이었다. γ-Fe₂O₃ 나노입자의 표면에 BSiO₂로 개량한 후의 포화 자화(Ms) 값은 39 emu g^-1로 감소하였다. BSiO₂ 층에 Ag 나노입자가 존재하기 때문에 23 emu g^-1로 더 감소하였다. 포화 자화의 감소는 자성 나노입자를 SiO₂ 및 Ag 나노입자로 대량 대체하고 차폐하기 때문이다. 베어 Fe₂O₃의 잔여 자기(remnant magnetization, Mr) 및 보자력 (coercivity, Hc)도 SiO₂ 및 Ag 나노입자를 사용한 개량도 영향을 보였다. 잔여 자기는 γ-Fe₂O₃ 나노입자의 경우 16.3 emu g^-1에서 BSiO₂-Fe₂O₃ NP의 경우 11.5 emu g^-1로 감소했으며 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 경우 6.4 emu g^-1로 감소하였다. Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 경우 Fe₂O₃ NP의 보자력 값이 114 Oe에서 121 Oe로 증가하였다. 보자력의 증가는 도메인 구조 또는 표면 코팅 이방성의 변화에 기인한다. Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드는 Ag 나노입자와 SiO₂의 존재로 인해 자기 반응을 나타내어 자기 분리 능력을 보여주었다. 따라서 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드는 외부 자기장을 적용하여 회수 및 재사용 할 수 있다.VSM measurements with a peak field of 20 KOe at room temperature show γ-Fe ₂ O ₃ nanoparticles (black), BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles (red) and Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ (blue) nanoparticles. The magnetic hysteresis loop of the hybrid was calculated and the magnetic change was analyzed and shown in Fig. 3C. The saturation magnetization (Ms) value of the γ-Fe ₂ O ₃ nanoparticles was 61 emu g ^-1 at 300K. After modification with BSiO ₂ on the surface of γ-Fe ₂ O ₃ nanoparticles, the saturation magnetization (Ms) value decreased to 39 emu g ^-1 . Due to the presence of Ag nanoparticles in the BSiO ₂ layer, it was further reduced to 23 emu g ^-1 . The decrease in saturation magnetization is due to mass replacement and shielding of magnetic nanoparticles with SiO ₂ and Ag nanoparticles. Remnant magnetization (Mr) and coercivity (Hc) of bare Fe ₂ O ₃ were also affected by modification using SiO ₂ and Ag nanoparticles. Residual magnetism decreased from 16.3 emu g ^-1 for γ-Fe ₂ O ₃ nanoparticles to 11.5 emu g ^-1 for BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ NPs and Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrids. decreased to 6.4 emu g ^-1 . In the case of the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid, the coercive force of the Fe ₂ O ₃ NP increased from 114 Oe to 121 Oe. The increase in coercivity is due to a change in domain structure or surface coating anisotropy. The Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid exhibited magnetic separation ability due to the presence of Ag nanoparticles and SiO ₂ . Therefore, the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid can be recovered and reused by applying an external magnetic field.

도 4A 및 4B는 BSiO₂-Fe₂O₃ 나노입자의 표면에 작은 Ag 나노입자가 존재하여 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드 구조를 형성하는 나노 하이브리드 구조의 HR-TEM 이미지를 나타낸 도이다. Ag 나노입자는 크기가 5-10 nm 였고 BSiO₂ 층에 고르게 분포되어 있다(도 4C). EDS 분석은 하이브리드 나노 구조에서 은 원소의 존재를 확인하였다(도 4D). 도 4E는 C, Fe, O, Si 및 Ag의 원소 맵핑을 개별적으로 표시하는 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 나노 하이브리드의 원소 분포를 나타낸 도이다. 원소 매핑을 통해서 녹차 추출물의 생체 분자가 Fe₂O₃ 나노 입자 주변의 SiO₂ 층에 잘 분포되어 있으며 Ag 나노입자를 합성하여 하이브리드 나노 구조체를 형성한다는 것을 보여준다.4A and 4B are diagrams showing HR-TEM images of nanohybrid structures in which Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid structures are formed by the presence of small Ag nanoparticles on the surface of BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanoparticles. to be. Ag nanoparticles were 5-10 nm in size and evenly distributed in the BSiO ₂ layer (Fig. 4C). EDS analysis confirmed the presence of elemental silver in the hybrid nanostructure (Fig. 4D). 4E is a diagram showing the elemental distribution of the Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ nanohybrid, showing elemental mapping of C, Fe, O, Si, and Ag individually. Elemental mapping shows that the biomolecules of the green tea extract are well distributed in the SiO ₂ layer around the Fe ₂ O ₃ nanoparticles and synthesize the Ag nanoparticles to form a hybrid nanostructure.

본 발명에서 녹차의 활성 생체 분자를 사용하여 항균 하이브리드 나노 구조를 합성하는 방법을 개발하였다. 녹차(C. sinensis) 에탄올 추출물은 폴리페놀 및 기타 활성 성분을 포함하며 높은 항산화 및 환원 활성을 가지고 있다. 추출물은 가수 분해에 의해 실리카(SiO₂)층에 포집되도록 하였다. 이 포집 과정은 분리될 수 있는 SiO₂로 코팅된 Fe₂O₃ 나노입자를 자기적으로 합성하였다. 상기 생체 분자가 포집된 SiO₂-Fe₂O₃ 자성 구조체의 표면에 Ag 나노입자를 합성하여 Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노 구조체를 형성하였다. 포획된 생체 분자는 환원력이 높기 때문에 매우 짧은 시간에 Ag ⁺ 이온의 감소가 발생하여 자성 나노 구조체에 직경이 5-10nm 범위인 구형 Ag 나노입자가 형성되었다. 원소 도트 매핑에서 Fe₂O₃ 나노입자에 코팅 된 SiO₂ 층에서 생체 분자와 Ag 나노입자의 균일한 분포를 나타내었다. Ag-BSiO₂-Fe₂O₃ 하이브리드 나노 구조체는 S. aureus와 E. coli에 대해 우수한 항균 활성이 나타났다. 하이브리드 나노 구조체는 본질적으로 자성을 띄기 때문에 우수한 재사용 가능한 항균 활성을 보여 주었다.In the present invention, a method for synthesizing an antibacterial hybrid nanostructure using active biomolecules of green tea was developed. Green tea (C. sinensis) ethanol extract contains polyphenols and other active components and has high antioxidant and reducing activities. The extract was allowed to be collected on a silica (SiO ₂ ) layer by hydrolysis. This capture process magnetically synthesized Fe ₂ O ₃ nanoparticles coated with separable SiO ₂ . An Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid nanostructure was formed by synthesizing Ag nanoparticles on the surface of the SiO ₂ -Fe ₂ O ₃ magnetic structure in which the biomolecules were collected. Since the captured biomolecules have high reducing power, the reduction of Ag ⁺ ions occurred in a very short time, and spherical Ag nanoparticles with a diameter in the range of 5-10 nm were formed on the magnetic nanostructure. Elemental dot mapping showed a uniform distribution of biomolecules and Ag nanoparticles in the SiO ₂ layer coated on Fe ₂ O ₃ nanoparticles. The Ag-BSiO ₂ -Fe ₂ O ₃ hybrid nanostructure showed excellent antibacterial activity against S. aureus and E. coli. Since the hybrid nanostructures are inherently magnetic, they show excellent reusable antibacterial activity.

Claims (9)

산화철 (Fe₂O₃) 나노입자;
상기 산화철 나노입자 표면에 코팅되는 이산화규소(SiO₂)층;
상기 이산화규소층에 포집되는 녹차 잎 추출물; 및
상기 이산화규소층에 포집되는 은(Ag) 이온;을 포함하는 항균 기능성 하이브리드 나노입자.iron oxide (Fe ₂ O ₃ ) nanoparticles;
A silicon dioxide (SiO ₂ ) layer coated on the surface of the iron oxide nanoparticles;
Green tea leaf extract captured in the silicon dioxide layer; and
Silver (Ag) ions collected in the silicon dioxide layer; antibacterial functional hybrid nanoparticles containing. 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 녹차 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, n-헥산, 벤젠 또는 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 것을 특징으로 하는, 항균 기능성 하이브리드 나노입자.The method of claim 1, wherein the green tea leaf extract is extracted with a solvent selected from the group consisting of water, alcohol having 1 to 4 carbon atoms, ethyl acetate, n-hexane, benzene, or a mixture thereof. Functional hybrid nanoparticles. 제1항에 있어서, 상기 항균 기능성 하이브리드 나노입자는 재사용 가능한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항균 기능성 하이브리드 나노입자.According to claim 1, wherein the antibacterial functional hybrid nanoparticle is characterized in that it has a reusable antibacterial activity, antibacterial functional hybrid nanoparticle. 삭제delete 녹차 잎 추출물에 산화철 (Fe₂O₃) 나노입자를 첨가하고 분산시키는 단계(단계 1);
테트라에틸오르토실리케이트(TEOS)를 적가하면서, 수산화암모늄(NH₄OH)으로 pH를 10.9-11.1 수준으로 조정하며 교반하여, 산화철 나노입자 표면에 이산화규소층이 코팅되고 상기 이산화규소층에 녹차 추출물이 포집된 형태의 나노입자를 제조하는 단계(단계 2); 및
상기 단계 2에서 제조한 나노입자를 증류수에 분산시키고, 질산은(AgNO₃) 수용액을 첨가하고 교반하여, 산화철 나노입자 표면에 이산화규소층이 코팅되고 상기 이산화규소층에 녹차 추출물 및 은 이온이 포집된 형태의 하이브리드 나노입자를 제조하는 단계(단계 3);을 포함하는,
항균 기능성 하이브리드 나노입자의 제조방법.Adding and dispersing iron oxide (Fe ₂ O ₃ ) nanoparticles to the green tea leaf extract (step 1);
While adding tetraethyl orthosilicate (TEOS) dropwise, adjusting the pH to 10.9-11.1 with ammonium hydroxide (NH ₄ OH) and stirring, a silicon dioxide layer is coated on the surface of the iron oxide nanoparticles, and green tea extract is applied to the silicon dioxide layer. Preparing entrapped nanoparticles (step 2); and
The nanoparticles prepared in step 2 were dispersed in distilled water, and an aqueous solution of silver nitrate (AgNO ₃ ) was added and stirred, so that a silicon dioxide layer was coated on the surface of the iron oxide nanoparticles, and green tea extract and silver ions were collected on the silicon dioxide layer. Preparing a hybrid nanoparticle of the form (step 3); including,
Manufacturing method of antibacterial functional hybrid nanoparticles. 삭제delete 삭제delete

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