KR102483402B1 - 세포외기질이 담지된 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치 - Google Patents

세포외기질이 담지된 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및 상기 하이드로젤 패치에 담지된 세포외기질을 포함하는 하이드로젤 패치에 관한 것이다.

Description

세포외기질이 담지된 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치{EXTRACELLULAR MATRIX-LOADED BIO-INSPIRED TISSUE-ADHESIVE HYDROGEL PATCH}
본 발명은 세포외기질이 담지된 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치에 관한 것이다.
전 세계 생체재료 시장은 2019년 1,050억 달러에서 연평균 14.5%로 성장하여, 2024년 2,070억 달러까지 그 규모가 크게 확대될 전망이다. 체내 이식형 소재 및 성형, 상처 치료용 소재 등 각종 의료 분야에서 생체재료의 수요가 급증하고 있으며, 특히 우리나라의 경우 초고령화 사회에 진입하면서 각종 질병, 노화에 따른 신체적 손실로 인해 실제 조직을 대체할 수 있는 기능성 생체재료의 수요가 더욱 증가하는 추세이다.
한편, 사고, 수술 등으로 인한 외상성 근육 손상 및 질병, 노화에 의한 근감소증은 근육 자체뿐 아니라 골, 혈관, 신경, 간, 심장, 췌장 등 신체 전반에 걸쳐 광범위한 영향을 끼치기 때문에 반드시 치료해야 하는 질환이다. 특히, 노화로 인한 근감소증의 경우 그 동안 질환으로 분류가 되어있지 않다가 미국과 일본에서는 각각 2016년과 2018년부터 근감소증에 질병 코드를 부여해 관리하고 있어 치료제 개발이 필요한 질환으로 인식되고 있다.
노화성 근감소증을 포함한 전세계 항노화 시장은 2017년 625억 달러의 시장규모로 연 평균 6.5% 성장해 2022년 886억달러(109조원) 수준으로 확대될 것으로 전망된다. 현재 미국과 유럽 등이 항노화 제품 및 의약품 시장을 주도하고 있지만 초고령화 사회에 진입한 한국, 일본을 포함한 중국, 인도 등 아시아 시장이 향후 성장을 이끌 것으로 예상되어 그 시장이 더욱 커질 것으로 예측된다.
조직 유래의 세포외기질 성분은 당단백질, 단백당 등 다양한 조직 특이적 생리활성 효과를 유도할 수 있는 물질들로 구성되어 있어 질환 치료 및 조직 재생을 위한 치료제로서 활발히 연구되고 있으며 최근 임상 적용 및 상업화가 시작된 기능성 생체재료이다. 그러나 대부분의 종래 기술에서는 세포외기질 성분을 약물처럼 주입하거나 그 자체를 하이드로젤 형태로 만들어 주입하는 방식으로 생체 내 전달을 시도하는데 이러한 기존 방식으로는 세포외기질 성분의 효과적인 생체 내 전달이 어렵고 체내에서 장기간 효과를 유지하지 못하였다.
따라서, 이러한 종래 기술의 한계를 극복하기 위해 본 발명에서는 페놀기 수식 히알루론산 유도체와 근육조직 특이적 세포외기질을 융합하여 우수한 생체적합성을 가지면서 용도에 따른 물성 조절이 매우 용이하고 조직 특이적 미세환경을 모사할 수 있는 기능성 하이드로젤 패치 시스템을 개발하였다. 페놀기 수식 히알루론산 패치에 탑재된 근육조직 세포외기질 성분은 근육 미세환경 구현을 통해 근육줄기세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 치료물질로서 근육손상 및 근질환 치료에 적용될 수 있다.
이와 더불어 현재 근육의 자체 재생 능력을 초과한 외상성 근육손상(volumetric muscle loss; VML) 및 퇴행성 근육 질환(근이영양증; muscular dystrophy, 근감소증: sarcopenia)을 치료하기 위해 줄기세포, 유전자 치료 등 다양한 연구가 진행되고 있으나 아직까지는 근본적인 치료 방법이 전무하다. 외상성 근육손상의 경우 임상적으로는 자가 근육조직을 이식하는 외과적 방법 외에는 마땅한 조직재건 치료술이 구축되지 못한 상황이며 근이영양증 및 근감소증의 경우 그 원인 자체가 노화, 유전적 변이, 신진대사 변화 등과 같이 매우 다양하기 때문에 운동 처방, 물리치료, 약물 치료, 식이요법 외에 적절한 치료법이 개발되어 있지 않으며 이 마저도 장기적으로는 적정 근육량을 유지하고 퇴행성 근육 손실을 방지하기에는 부족하다.
따라서, 이러한 의학적 난제를 해결하기 위해 인체 내에 존재하는 근육줄기세포의 증식 및 분화를 촉진할 수 있는 생체소재 및 약물전달 치료법의 개발이 요구된다. 본 발명에서 개발된 근육조직 유래 세포외기질을 이용하여 가교된 페놀기 수식 히알루론산 하이드로젤 패치 제형은 추가적인 산화제나 의료용 접착제 사용 없이 원하는 부위에 손쉽게 부착이 가능하며 근육 세포외기질 성분의 효율적인 전달을 통해 손상된 근육조직 내 존재하는 소량의 근육줄기세포를 활성화함으로써 세포 증식 및 분화를 통한 근육조직 재생 효능을 크게 증진시킬 수 있어 근본적인 근육 조직 재건을 위한 신 의료기술로서의 가능성을 보여준다.
KR 10-2021-0075051
본 발명은 기계적 물성, 조직 접착력, 생체적합성 및 사용편의성이 우수하면서, 세포외기질을 담지하는 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치를 제조하기 위한 것으로, 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및 상기 하이드로젤 패치에 담지된 세포외기질을 포함하는 세포외기질 하이드로젤 패치 등을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 홍합, 멍게 접착성분을 모사한 페놀기(카테콜기, 갈롤기)로 수식된 히알루론산 하이드로젤 패치를 이용하여 조직 유래의 세포외기질을 생체내로 전달하는 기술을 개발하였다.
구체적으로, 페놀기로 수식된 하이드로젤의 가교를 위해서는 일반적으로 산화제와 같은 가교제를 첨가해야 하지만 본 발명에서는 조직 유래 세포외기질 성분을 적용하여 가교제 사용 없이 가교를 유도하여 하이드로젤화하는데 성공하였다. 페놀기로 수식된 히알루론산은 가교제 처리 후 산화되는 페놀기 간의 반응을 통해 가교가 일어난다. 본 발명에서는 페놀기가 단백질 및 펩타이드에 포함된 작용기와 높은 반응성을 가지고 있다는 점에 착안하여 근육조직 유래의 세포외기질을 첨가함으로써 세포외기질 성분에 존재하는 다양한 작용기와의 반응을 통해 산화제 처리 없이도 가교를 유도할 수 있었다. 나아가 세포외기질 성분의 농도를 조절함으로써 하이드로젤의 물리적, 화학적 특성 및 기계적 물성을 조절할 수 있었다. 즉, 세포외기질 성분이 조직 재생을 위해 전달하고자 하는 치료 물질인 동시에 가교제로서의 역할을 동시에 담당할 수 있음을 확인하였다.
조직 유래 세포외기질 성분에 의한 페놀기 수식 하이드로젤의 가교 기전은 화학분석을 통해 밝혔다. 근육조직 유래 세포외기질을 페놀기 수식 히알루론산 유도체에 첨가했을 때 두 물질간 비공유결합(예; 수소결합)이 크게 증가하고, 카테콜 간의 공유결합 형성(예; dicatechol 형성)이 촉진되어 가교 효과를 유도할 수 있음을 확인하였다. 또한, 다량의 단백질로부터 유입된 아미드 결합이 하이드로젤의 3차원 구조의 안정성을 높이는 것을 확인하였다. 이와 같이 생체 내로 전달해야 하는 대상인 치료물질을 적용한 새로운 가교 방법을 개발하여 기존 페놀기 수식 하이드로젤 임상 적용에 가장 큰 걸림돌이었던 가교제(산화제) 사용 문제를 해결하였고 안전성이 향상된 약물전달 시스템을 개발하였다.
가교를 위해 첨가되는 조직 유래 세포외기질은 세포를 제거할 수 있는 탈세포 공정을 거쳐 생산되기 때문에 생체 내 적용 시 면역반응을 최소화할 수 있으며 이렇게 제조된 세포외기질은 페놀기 수식 히알루론산과 주로 비공유결합을 형성하여 하이드로젤을 구성하므로 가교에 참여했던 다양한 조직 특이적 당단백질(glycoprotein), 단백당(proteoglycan) 및 활성물질들이 기능을 잃지 않고 고유의 생리활성 효과를 유도할 수 있었다. 이러한 특성을 이용하여 특정 조직의 손상을 치료하고 조직재생을 유도하기 위한 치료물질을 효율적으로 전달할 수 있는 새로운 약물전달 시스템이 성공적으로 개발되었다.
본 발명에서는 근육조직 유래 세포외기질의 농도 조절을 통해 페놀기 수식 히알루론산 하이드로젤의 팽윤 정도, 분해 속도, 기계적 물성, 접착성과 같은 다양한 특성을 쉽게 제어할 수 있음을 확인하였고, 근육 줄기세포인 위성세포(satellite cell)를 활성화하여 세포 증식을 유도하고 근육조직 재생에 기여할 수 있음을 확인하였다. 나아가 개발된 세포외기질 전달용 하이드로젤 패치 시스템을 근육 손상 동물모델에 적용하였을 때, 뛰어난 조직 접착력으로 별도의 접착제 없이 근육 결손 부위에 안정적인 부착이 가능하였으며, 동물모델의 운동 능력을 크게 향상시키는 등 구조적, 기능적 근육조직 재생 효과를 유도할 수 있었다.
본 발명은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및 상기 하이드로젤 패치에 담지된 세포외기질을 포함하는 세포외기질 하이드로젤 패치를 제공한다.
먼저, 본 발명에 따른 하이드로젤 패치는 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치를 포함한다.
본 명세서 내 "페놀기"라 함은 말단에 페놀계 화합물 유래 작용기, 바람직하게, 하이드록시기(-OH) 두개가 인접 위치한 1,2-디하이드록시벤젠(dihydroxybenzene)을 포함하는 카테콜계 화합물 유래 작용기 또는 히드록시기(-OH) 세개가 인접 위치한 1,2,3-트리하이드록시벤젠(trihydroxybenzene)을 포함하는 파이로갈롤계 화합물 유래 작용기로서, 상기 페놀기는 산화반응에 의해서 여러가지 작용기(functional group)와 공유 가교(cross-linking)를 형성할 수 있다. 상기 페놀기 외에 상기 생체적합성 고분자와 반응하기 위한 말단 작용기를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 카테콜계 화합물은 카테콜(catechol), 4-tert-부틸카테콜(4-tert-butylcatechol; TBC), 우루시올(urushiol), 알리자린(alizarin), 도파민(dopamine), 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride), 3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; DOPA), 카페익산(caffeic acid), 노르에피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 3,4-디하이드록시페닐아세트산(3,4-dihydroxyphenylacetic acid; DOPAC), 이소프레날린(isoprenaline), 이소프로 테레놀(isoproterenol) 및 3,4-디하이드록시벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 본 발명에서는 카테콜계 화합물로서, 도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)를 사용하였고, 이때, 상기 도파민 하이드로클로라이드의 말단 작용기 중에 -NH2가 상기 생체적합성 고분자(특히, 히알루론산)와 반응할 수 있다.
또한, 상기 파이로갈롤계 화합물은 파이로갈롤(pyrogallol), 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine), 타닌산(tannic acid), 갈산(gallic acid), 에피갈로카테킨(epigallocatechin), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate), 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate), 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드(2,3,4-trihydroxybenzaldehyde), 2,3,4-트리하이드록시벤조산(2,3,4-Trihydroxybenzoic acid), 3,4,5-트리하이드록시벤즈알데하이드(3,4,5-Trihydroxybenzaldehyde), 3,4,5-트리하이드록시벤즈아마이드(3,4,5-Trihydroxybenzamide), 5-tert-부틸파이로갈롤(5-tert-Butylpyrogallol) 및 5-메틸파이로갈롤(5-Methylpyrogallol)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 본 발명에서는 파이로갈롤계 화합물로서, 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine)을 사용하였고, 이때, 상기 5-하이드록시도파민의 말단 작용기 중에 -NH2가 상기 생체적 합성 고분자(특히, 히알루론산)와 반응할 수 있다.
특히, 상기 페놀기가 파이로갈롤기인 경우, 특히 빠르게 산화되는 특성으로 인해 생체 내 존재하는 산소에 노출되면 산화제 처리 없이 자연산화가 수 분내로 이루어질 수 있으므로 하이드로젤 패치를 실제 임상에 적용할 때 별도의 산화제 처리 없이 바로 적용이 가능한 장점이 있다.
본 명세서 내 "생체적합성 고분자"라 함은 상기 페놀계 화합물에 존재하는 말단 작용기와 반응하여 페놀기가 수식될 수 있고, 구체적으로, 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 알지네이트, 키토산, 키틴, 콜라겐, 젤라틴, 콘드로이틴황산, 펙틴, 케라틴 및 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 히알루론산인 것이 바람직하고, 분자량이 100 kDa 내지 10 MDa인 히알루론산인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 히알루론산의 말단 작용기 중에 -COOH가 상기 페놀계 화합물과 반응할 수 있다.
본 명세서 내 "하이드로젤 패치"라 함은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 것으로, 일정 두께를 갖는 얇은 막 형태의 구조물을 말하며, 공지의 방법을 이용하여, 예컨대, 잘라서 또는 몰드를 통해, 원하는 형태로 사용할 수 있는 장점이 있다. 용액 기반의 벌크 하이드로젤과 비교하여 기계적 물성, 조직 접착력, 생체적합성 및 사용편의성이 우수한 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 하이드로젤 패치는 하기 단계를 통해 제조될 수 있다:
(a) 평평한 표면에 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 고르게 붓는 단계; 및
(b) 상기 용액을 영하 0.5 ℃ 내지 영하 100 ℃에서 5시간 내지 48시간 동안 동결건조 시키는 단계.
구체적으로, 상기(a) 단계는 원통 몰드에 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 40~ 200 ㎕씩 붓는 방식으로 이루어질 수 있으며, 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액은 0.1 내지 5(w/v)% 농도, 바람직하게 0.5 내지 3(w/v)% 농도로 사용될 수 있다. 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액의 용량은 0.8 내지 3.2 ㎜ 두께의 하이드로젤 패치를 만들기 위한 것으로 두께 조절이 용이하다.
또한, 상기(b) 단계는 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 영하 0.5 ℃ 내지 영하 100 ℃에서 5시간 내지 48 시간 동안 동결건조시키거나, 바람직하게, 영하 50 ℃ 내지 영하 100 ℃에서 12시간 내지 36시간 동안 동결건조시키는 방법으로 이루어질 수 있다. 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액을 동결건조시키면 용액의 부피가 축소하면서 일정한 두께를 갖는 얇은 막 형태의 하이드로젤 패치가 만들어질 수 있다.
이로써, 상기 하이드로젤 패치는 ⅰ) 두께가 0.05 내지 10.0 ㎜, 바람직하게, 0.1 내지 5.0 ㎜, 보다 바람직하게, 1.6 mm 내지 5.0 mm이고, ⅱ) 0.1 Hz 내지 10 Hz의 주파수 범위에서, 1Х102 Pa 내지 1Х106 Pa, 바람직하게, 1.5Х103 Pa 내지 1Х106 Pa의 저장 탄성률(G′) 및 0.2 내지 0.5의 tanδ을 가지고, ⅲ) 5 N의 수직항력 하에 0.01 m/s의 속도에서 측정된 마찰계수가 0.2 내지 0.4이며, iv) 접착강도가 1 N 내지 10 N일 수 있다. 상기 하이드로젤 패치가 파이로갈롤기 수식 생체 적합성 고분자 하이드로젤 패치인 경우, 기계적 물성을 더욱 향상시킬 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 하이드로젤 패치는 상기 하이드로젤 패치에 담지된 세포외기질을 포함한다. 상기 세포외기질 하이드로젤 패치의 총 함량에 대하여, 상기 세포외기질의 함량은 0.002 중량% 내지 10 중량%일 수 있고, 0.002 중량% 내지 4 중량%인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 다시 말해, 상기 하이드로젤 패치(0.05~10.0 mm 직경 및 0.05~10.0 ㎜ 두께 기준, 바람직하게, 0.1~5.0 mm 직경 및 0.1~5.0 ㎜ 두께 기준) 당, 상기 세포외기질 100 ng 내지 2 mg을 담지시킬 수 있다. 한편, 상기 세포외기질이 세포외기질 하이드로젤 패치 제조 과정에서 혼합될 경우 10 내지 500 μg/ml, 구체적으로는 20 내지 400 μg/ml, 더욱 구체적으로는 하이드로젤 패치의 페놀기가 카테콜일 경우, 50 내지 400 μg/ml, 하이드로젤 패치의 페놀기가 갈롤일 경우, 20 내지 140 μg/ml의 비율로 혼합되는 것일 수 있다.
이는 생체 내에서 효과적으로 서방출될 수 있어 지속적인 치료 효과를 유도할 수 있다. 상기 세포외기질에 존재하는 다양한 작용기들은 페놀기와 친핵성 반응 및 비공유 결합 등 상호 작용을 할 수 있다. 즉, 상기 세포외기질은 상기 페놀기와 상호 작용을 하여 가교제로서 작용할 수 있다.
구체적으로, 상기 세포외기질은 근육, 뇌, 척수, 혀, 기도, 피부, 림프, 폐, 심장, 간, 위, 신장, 비장, 췌장, 장, 부신, 지방, 자궁, 흉선, 식도, 침샘, 뼈, 방광, 혈관, 힘줄, 갑상선 및 잇몸으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조직 유래일 수 있고, 상기 세포외기질에 존재하는 다양한 작용기들은 페놀기와 친핵성 반응 및 비공유 결합 등 상호 작용을 할 수 있으므로, 생체 내에서 효과적으로 서방출될 수 있다.
구체적으로, 상기 하이드로젤 패치에 상기 세포외기질을 담지하는 방법은 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 용액과 세포외기질을 혼합시켜 하이드로젤 패치를 제조하거나, 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 하이드로젤 패치에 세포외기질을 도포하여 페놀기가 수식된 생체적합성 고분자 하이드로젤 패치에 세포외기질을 가교시키는 방법을 사용할 수 있다. 이때, 세포외기질 자체가 산화제로서 작용할 수 있으므로, 세포외기질의 도포 후에 별도의 산화제의 처리를 생략할 수 있다. 다시 말해, 상기 하이드로젤 패치에서 카테콜기가 수식된 경우 별도의 산화제 처리 없이 세포외기질 처리만으로도 카테콜기와 세포외기질 내의 단백질간의 반응으로 인해 가교가 일어날 수 있으며, 상기 하이드로젤 패치에서 파이로갈롤기가 수식된 경우에는 별도의 산화제 처리 없이도 생체 내 환경에서 자연산화되므로 실제 임상에서 간편하게 사용할 수 있다.
종래 근질환 치료 및 근육 재생 기술의 한계를 극복하기 위해 본 발명에서는 근육조직 세포외기질을 치료제 겸 동시에 하이드로젤 생체소재 제작을 위한 구성 성분으로 적용하는 새로운 패러다임의 치료제 전달 시스템을 개발하는데 성공하였다. 본 발명에서 개발된 세포외기질 전달 기술은 동결건조된 하이드로젤 패치 제형이므로 치료제 성분의 장기간 활성 유지가 가능하며 장기 보관 및 사용이 매우 간편하여 실용화 가능성이 매우 커서 마땅한 치료제가 없는 근육손상 및 근감소증 치료를 위한 새로운 치료기술로서 상업화를 통해 경제적 이익과 고부가가치 창출이 가능할 것으로 기대한다. 본 기술을 이용하면 다양한 조직 유래의 세포외기질 전달이 가능하므로 질환 적용 범위를 확장할 수 있어 근육질환뿐 아니라 다양한 난치성 질환 치료제로서 개발 가능할 것이다.
도 1은 HA-CA의 구조식(a)과, HA-CA 하이드로젤 패치의 팽윤도(b) 및 효소에 의한 분해 속도(c)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HA-CA 하이드로젤 패치의 저장탄성률 및 손실탄성률(a)과 평균 저장탄성률(b)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HA-CA 하이드로젤 패치의 마찰계수(a), 마모도 여부(b) 및 마모도 면적(c)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HA-PG의 구조식(a)과, HA-PG 하이드로젤 패치의 팽윤도(b) 및 효소에 의한 분해 속도(c)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HA-PG 하이드로젤 패치의 저장탄성률 및 손실탄성률(a)과 평균 저장탄성률(b)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HA-PG 하이드로젤 패치의 마찰계수(a), 마모도 면적(b) 및 마모도 여부(c)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 근육 조직 유래 세포외기질 (MEM) 전달을 위한 HA-CA 하이드로젤 패치 제작 과정을 나타낸 것이다.
도 8은 근육 조직 유래 세포외기질 하이드로젤 패치의 제조를 위해 사용된 근육 조직 유래 세포외기질의 제조방법 및 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 제조된 근육 조직 유래 세포외기질의 단백체 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 화학적 가교 기전 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 기계적 물성 및 접착성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 MEM/HA-CA 하이드로젤의 가교 방식에 따른 기계적 물성 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 13는 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 물리적 특징을 팽윤 및 분해 양상을 확인하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14은 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 MEM 서방형 전달 가능성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 생체적합성을 확인한 결과이다.
도 16는 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치에 의한 근육줄기세포 활성화 증진 효과를 확인한 결과이다.
도 17은 골격근 손상모델에서 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 적용 및 근육조직 재생 효과를 확인한 결과이다.
도 18은 골격근 손상모델에서 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치에 의한 근육 기능 향상 효과를 확인한 결과이다.
도 19는 골격근 손상모델에서 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치에 의한 조직 재생 효과를 확인한 결과이다.
도 20은 근육조직 유래 세포외기질 (MEM) 전달을 위한 페놀기 (갈롤기) 수식 하이드로젤 패치 (MEM/HA-PG) 개발 모식도를 나타낸 것이다.
도 21은 MEM/HA-PG 하이드로젤 패치의 기계적 물성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 MEM/HA-PG 하이드로젤 패치의 생체적합성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1
(1) HA-CA 하이드로젤 패치 제작
도파민 하이드로클로라이드(dopamine hydrochloride)를 사용하여 카테콜기가 수식된 히알루론산(catechol-functionalized hyaluronic acid; 이하, HA-CA로 기재함, 도 1 a)(분자량 = 200 kDa)을 증류수에 1(w/v)% 농도로 용해시키고, 8 ㎜ 원통 몰드에 1(w/v)% HA-CA 용액을 80 ㎕ 부은 후 -80 ℃에서 하룻밤 동안 동결건조시켜 8 mm 직경 및 1.6 ㎜ 두께의 HA-CA 하이드로젤 패치를 제작하였다. 제작된 HA-CA 하이드로젤 패치는 건조된 상태이므로 보관이 용이하고, 얇은 막 형태이므로 원하는 모양으로 용이하게 자를 수 있어 사용이 간편한 것을 특징으로 한다.
한편, HA-CA를 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)에 용해시키고, 이 용액에 4.5 mg/ml의 과요오드산 나트륨 용액을 첨가하여 HA-CA 벌크 하이드로젤을 제작하였다. 제작된 HA-CA 벌크 하이드로젤에서 HA-CA의 최종 농도는 1(w/v)%이다.
(2) HA-CA 하이드로젤 패치의 물리적 특성 분석
생체내 조건과 유사한 37℃의 PBS에 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤을 14일 동안 담그고, 12시간, 1일, 3일, 7일 및 14일 후에 팽윤도를 측정하였다. 측정 결과, HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)의 팽윤도가 HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)에 비해 높은 것으로 확인된다(도 1의 b).
한편, 실제 생체내 환경은 다양한 분해효소가 존재하므로 37℃의 PBS에 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤을 담그고, 분해될 때까지 히알루론산 분해효소를 처리하였다(100 U/샘플). 일정 시간마다 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤의 무게를 측정하여 시간 경과에 따른 분해 정도를 측정하였다. 측정 결과, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)은 히알루론산 분해효소를 처리한 후 2시간 이내에 빠르게 분해되어 6시간 후에는 완전히 분해되나, HA-CA 하이드로 젤 패치(Patch)는 히알루론산 분해효소 처리 24시간 이후에도 남아 있어 효소에 의한 분해 속도가 느려지는 것으로 확인된다(도 1의 c).
(3) HA-CA 하이드로젤 패치의 기계적 물성 분석
레오미터를 사용하여 주파수 0.1 내지 10 Hz 사이에서 HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤의 탄성계수를 측정하였다. 분석 결과, HA-CA 하이드로젤 패치(Patch) 및 HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)은 모두 저장탄성률(G′)이 손실탄성률(G′′)에 비해 높아 내부 구조가 안정적인 고분자 네트워크가 형성된 것으로 확인된다(도 2의 a).
또한, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel)의 평균 저장탄성률(G′)은 약 450 Pa 수준인 반면, HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)의 평균 저장탄성률(G′)은 약 2500~2600 Pa 수준인 것으로 나타나 평균 저장탄성률(G′)이 약 5배 이상 증가한 것으로 확인된다(도 2의 b).
한편, HA-CA 하이드로젤 패치 또는 HA-CA 벌크 하이드로젤이 코팅된 스틸 표면 사이에 5 N의 수직항력을 가한 상태에서 0.01 m/s의 속도로 마찰력 분석 장비를 이동시켜 마찰계수를 측정하였다. 측정 결과, 코팅되지 않은 경우(No treatment) 마찰계수가 가장 높게 나왔고, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel) 및 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch) 순이였다(도 3의 a). 또한, 코팅되지 않은 경우(No treatment) 마찰로 인해 마모도(wear scar)가 크게 생겼고, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel) 및 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)를 코팅한 경우 마모도(wear scar)가 적게 생긴 것으로 확인된다(도 3의 b). 따라서, HA-CA 벌크 하이드로젤(Gel) 및 HA-CA 하이드로젤 패치(Patch)를 코팅한 경우, 코팅되지 않은 경우(No treatment)에 비해 마모도 면적이 유의미하게 감소한 것으로 확인된다(도 3의 c).
제조예 2
(1) HA-PG 하이드로젤 패치 제작
5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine)을 사용하여 파이로갈롤기가 수식된 히알루론산(pyrogallol-functionalized hyaluronic acid; 이하, HA-PG로 기재함, 도 4 a)(분자량 = 200 kDa 및 1 MDa)을 증류수에 1(w/v)% 농도로 용해시키고, 8 ㎜ 원통 몰드에 1(w/v)% HA-PG 용액을 80 ㎕ 부은 후 -80℃에서 하룻밤 동안 동결건조시켜 8 mm 직경 및 1.6 ㎜ 두께의 HA-PG 하이드로젤 패치를 제작하였다. 제작된 HA-PG 하이드로젤 패치는 건조된 상태이므로 보관이 용이하고, 얇은 막 형태이므로 원하는 모양으로 용이하게 자를 수 있어 사용이 간편한 것을 특징으로 한다.
한편, HA-PG를 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)에 용해시키고, 이 용액에 4.5 mg/ml의 과요오드산 나트륨 용액을 첨가하여 HA-PG 벌크 하이드로젤을 제작하였다. 제작된 HA-PG 벌크 하이드로젤에서 HA-PG의 최종 농도는 1(w/v)%이다.
(2) HA-PG 하이드로젤 패치의 물리적 특성 분석
생체내 조건과 유사한 37℃의 PBS에 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤을 14일 동안 담그고, 12시간, 1일, 3일, 7일 및 14일 후에 팽윤도를 측정하였다. 측정 결과, HA-PG 하이드로젤 패치(Patch)의 팽윤도가 HA-PG 벌크 하이드로젤(Gel)에 비해 높은 것으로 확인된다(도 4의 b).
한편, 실제 생체내 환경은 다양한 분해효소가 존재하므로 37℃의 PBS에 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤을 담그고, 분해될 때까지 히알루론산 분해효소를 처리하였다(200 U/샘플). 일정 시간마다 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤의 무게를 측정하여 시간 경과에 따른 분해 정도를 측정하였다. 측정 결과, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel)은 히알루론산 분해효소를 처리한 후 초기에 빠르게 분해되나, HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch)는 히알루론산 분해효소 처리 28일 이후에도 남아 있어 효소에 의한 분해 속도가 상당히 느려지는 것으로 확인된다 (도 4의 c).
(3) HA-PG 하이드로젤 패치의 기계적 물성 분석
레오미터를 사용하여 주파수 0.1 내지 10 Hz 사이에서 HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤의 탄성계수를 측정하였다. 분석 결과, HA-PG 하이드로젤 패치(Patch) 및 HA-PG 벌크 하이드로젤(Gel)은 모두 저장탄성률(G′)가 손실탄성률(G′′)에 비해 높아 내부 구조가 안정적인 고분자 네트워크가 형성된 것으로 확인된다(도 5의 a).
또한, HA-PG 벌크 하이드로젤(200 kDa 및 1 MDa Gel)의 평균 저장탄성률(G′)은 모두 매우 낮은 수준인 반면, HA-PG 하이드로젤 패치(200 kDa 및 1 MDa Patch)의 평균 저장탄성률(G′)은 각각 약 14kPa 및 약 24kPa 수준인 것으로 나타나 평균 저장탄성률(G′)이 상당히 증가한 것으로 확인된다(도 5의 b).
한편, HA-PG 하이드로젤 패치 또는 HA-PG 벌크 하이드로젤이 코팅된 스틸 표면 사이에 5 N의 수직항력을 가한 상태에서 0.01 m/s의 속도로 마찰력 분석 장비를 이동시켜 마찰계수를 측정하였다. 측정 결과, 코팅되지 않은 경우 (No treatment) 마찰계수가 가장 높게 나왔고, HA-PG 벌크 하이드로젤 (200 kDa 및 1 MDa Gel) 및 HA-PG 하이드로젤 패치 (200 kDa 및 1 MDa Patch) 순이였다 (도 6의 a). 또한, 코팅되지 않은 경우 (No treatment) 마찰로 인해 마모도 (wear scar)가 크게 생겼고, HA-PG 벌크 하이드로젤 (200 kDa 및 1 MDa Gel) 및 HA-PG 하이드로젤 패치 (200 kDa 및 1 MDa Patch)를 코팅한 경우 마모도 (wear scar)가 적게 생긴 것으로 확인된다 (도 6의 b). 따라서, HA-PG 벌크 하이드로젤 (200 kDa 및 1 MDa Gel) 및 HA-PG 하이드로젤 패치 (200 kDa 및 1 MDa Patch)를 코팅한 경우, 코팅되지 않은 경우 (No treatment)에 비해 마모도 면적이 유의미하게 감소한 것으로 확인된다 (도 6의 c).
실시예 1: 조직 유래 세포외기질(ECM) 전달을 위한 페놀기 수식 하이드로젤 패치 제작 및 분석 (1)
1-1. 근육조직 유래 세포외기질 (MEM) 전달을 위한 페놀기 (카테콜기) 수식 하이드로젤 패치 (MEM/HA-CA)의 제작
탈세포 근육조직 유래 세포외기질(muscle extracellular matrix; MEM)이 탑재된 카테콜 수식 히알루론산 유도체(catechol-conjugated hyaluronic acid; HA-CA)를 동결건조하여 MEM/HA-CA 패치 제형으로 제작하였다. 개발된 MEM/HA-CA 패치는 별도의 산화제 첨가 없이 가교가 가능한 새로운 시스템으로 뛰어난 생체 안전성을 가지며, 동결건조 된 패치 형태로 제작하였을 때 사용이 간편하고 장기 보관이 가능할 뿐만 아니라, MEM에 존재하는 다양한 생리활성물질과 조직 특이적 단백질을 활용하여 근육질환 치료 및 조직재생을 유도할 수 있는 기능성 생체소재로 사용할 수 있다 (도 7).
여기에서 사용된 탈세포 근육조직 유래 세포외기질은 돼지 다리 근육을 1% SDS(sodium dodecyl sulfate)로 2일 동안 처리한 후 1% Triton X-100 + 0.1% NH4OH(ammonium hydroxide) 용액으로 2시간 처리하는 탈세포 공정을 통해 제작하였다 (도 8 A).
탈세포 전 근육조직(Before)과 탈세포 후 근육조직(After)의 조직학적 형태 (도 8 B)와 DNA (도 8 C), GAG(glycosaminoglycan) 잔존량 (도 8 D)을 정량 비교하였다. 탈세포 공정을 통해 98.4%의 유전물질(DNA)을 제거하여 생체 적용 시 발생할 수 있는 면역반응을 최소화한 반면, 대표적인 유효 세포외기질 성분인 GAG는 원래 조직 수준으로 유지하여 근육조직의 탈세포 공정 프로토콜을 성공적으로 구축했음을 확인하였다.
질량분석(mass spectrometry) 기반 단백체(proteomics) 분석과 iBAQ(intensity Based Absolute Quantification) 알고리즘을 이용한 단백질 함량 분석을 통해 제조된 근육 조직 유래 탈세포 세포외기질 (MEM)에 존재하는 다양한 종류의 근육조직 특이적 단백질을 확인하였다 (도 9 A-D).
도 9 A에서 확인되는 바와 같이 MEM은 collagen, glycoprotein, proteoglycan으로 구성된 core matrisome protein과 이와 관련된 단백질(matrisome-associated protein)로 65.71%가 이루어져 있으며, 나머지 34.29%는 non-matrisome protein으로 총 275개의 단백질로 구성되어 있고 이 중 255개가 근육조직 특이적 단백질임을 확인하였다.
MEM의 matrisome protein을 유형별로 분류하였을 때 collagen, glycoprotein, proteoglycan, ECM-affiliated protein, ECM regulator는 각 18개, 39개, 10개, 10개, 8개의 단백질로 구성되어 있었으며, 이 중 발현이 가장 높은 상위 10개의 matrisome 단백질은 (노란색 하이라이트) collagen 6 (COL6A3, COL6A1, COL6A2), collagen 1 (COL1A1, COL1A2), fibrillin (FBN1), fibrinogen (FGA), lumican (LUM), decorin (DCN), fibromodulin (FMOD)으로 구성되어 있는데 이들 단백질들은 근육 재생과 관련이 있다는 보고가 있어 MEM이 손상된 근육 조직 재생 및 성숙을 유도하기에 적합하다고 판단된다 (도 9 B).
MEM을 구성하고 있는 모든 단백질을 iBAQ 값에 따라 맵핑(mapping)하여 분포를 확인하였다. MEM에서 가장 큰 비중을 차지하고 있는 collagen을 붉은색으로, 다른 조직 대비 근육조직에서 최소 4배 이상의 발현량을 보이는 근육 특이적 단백질(skeletal muscle-enriched protein)을 파란색으로 표기하였다. MEM은 61개의 단백질이 전체 비중의 90%를 차지하고 있으며 (회색 영역) 이 중 matrisome protein은 총 27개가 해당되었다. Collagen, glycoprotein, proteoglycan, ECM-affiliated protein 단백질이 각 9개, 11개, 6개, 1개로 구성되어 있으며 나머지 34개의 non-matrisome protein은 25개의 skeletal muscle-elevated protein과 6개의 skeletal muscle-enriched protein으로 구성되어 있다 (도 9 C).
*skeletal muscle-elevated protein과 skeletal muscle-enriched protein은 인간 조직의 단백질 발현 양상을 분석한 “https://www.proteinatlas.org/”에서 제공하는 정보로서, 두 단백질 모두 다른 조직과 비교하여 근육 조직에서 평균적으로 4배 이상의 발현량을 보이는 단백질을 의미하지만 skeletal muscle-enriched protein은 근육 조직에서 절대적으로 4배 이상의 발현이 관찰되는 단백질로서 skeletal muscle-elevated protein 보다 더 의미 있는 분류라고 할 수 있다.
Matrisome protein 외에 non-matrisome protein 275개를 유전자 온톨로지 (Gene Ontology; GO) 분석을 수행하여 생물학적 프로세스 관점에서 (biological process) MEM의 기능을 예측하였을 때, actin filament-based process (GO:0030029), regulation of muscle system process (GO:0090257), muscle system process (GO:0003012) 및 이와 관련된 하위 항목들의 GO term이 유의한 수준으로 예측(enrichment p value < 10-3)되는 것을 확인하였다 (도 9D).
*GO 분석은 web-based GOrilla application (http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il)을 이용하여 수행하였다.
일련의 단백체 분석을 통해 MEM에는 실제 근육에 존재하는 조직 특이적 단백질이 다량 존재하므로, 근육질환 치료 및 조직재생을 위한 활성물질로 MEM을 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
1-2. MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 화학적 가교 기전 분석
MEM에 존재하는 다양한 단백질은 HA-CA와 반응하여 가교를 유도할 수 있을 것으로 기대된다.
이를 확인하기 위해 HA-CA (0.5%)에 MEM (7 mg/ml)을 첨가한 용액(MEM/HA-CA)과 첨가하지 않은 용액(HA-CA)을 37 ℃ 조건에서 incubation 하면서 UV-vis spectroscopy로 비교 분석하였다.
그 결과 HA-CA 그룹은 280 nm peak가 증가하였고, 이는 자연 산화에 의해 catechol-catechol 간의 공유 결합 (e.g. dicatechol)이 형성되었음을 알 수 있다. 또한, MEM/HA-CA 그룹은 280 nm peak가 HA-CA 그룹보다 급격히 증가한 것으로, MEM에 의해 catechol의 산화가 촉진되어 catechol-catechol 공유 결합 형성이 촉진되었음을 알 수 있다. 이 때, 450~550 nm에 새로운 peak가 크게 관찰되지 않는 것을 보아 catechol-MEM 간의 공유 결합 (e.g. catechol-amine 간의 공유결합)이 많이 형성되지는 않은 것으로 보이며 HA-CA 유도체와 MEM간의 비공유 결합(e.g. 수소결합)이 다량 이루어졌을 것으로 추정된다 (도 10 A).
FT-IR 분석을 통해 HA-CA에 MEM을 첨가하였을 때 MEM 단백질의 peak 변화 (amide bond; 1600-1700, 1180-1300 cm-1, -CH3 & -CH2 group; 1453 cm-1, carbohydrate moiety; 1005-1100, 1164 cm-1)를 확인하여 HA-CA 유도체와 MEM 사이에 상호작용이 일어난 것을 확인하였다 (도 10 B). 이때 primary NH2와 secondary N-H의 stretching과 (파란색 동그라미, 3100-3500 cm-1) 다량의 hydrogen bond (초록색 동그라미, 3500 cm-1)가 형성된 것을 확인하였다.
따라서, MEM/HA-CA의 가교는 catechol 그룹 간의 공유결합 형성과 (e.g. dicatechol 형성) HA-CA와 MEM 사이의 비공유결합 (e.g. 수소결합) 형성을 통해 주로 이루어지고, 이 때 MEM으로부터 유입된 다량의 단백질로부터 공급된 아미드 결합이 하이드로젤 3차원 구조의 안정성을 높이는 것으로 사료된다.
1-3. MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 기계적 물성 및 접착성 분석
HA-CA 유도체는 본래 카테콜기가 산화되어야 안정적인 가교가 유도되기 때문에 산화제 처리가 꼭 필요하지만, MEM을 도입하면 catechol 간의 공유결합뿐 아니라 HA-CA 유도체와 MEM 사이의 다량의 수소결합을 통해 추가적인 산화제 처리 없이도 안정적인 가교를 유도할 수 있다. HA-CA 가교를 위해 기존 연구에서 주로 사용한 산화제 첨가 방식 (NaIO4 그룹; 4.5 mg/ml NaIO4 사용)을 대조군으로 설정하여 비교하였다. MEM only 그룹을 제외한 모든 그룹에서 0.5% HA-CA (DS: 15%)를 사용하였다.
Rheometer (frequency sweep mode) 분석을 통해 첨가한 MEM 농도가 증가할수록 물성은 감소하는 것을 확인하여 MEM 농도 변화에 따라 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 물성 조절이 가능하다는 것을 확인하였다 (도 11 A).
MEM을 첨가한 모든 그룹에서 tan δ 값(elasticity)이 0.39 이하의 값을 가져 안정적인 하이드로젤이 형성되었음을 확인하였다. 한편, MEM 없이 3차 증류수만 처리한 HA-CA 그룹의 경우 elasticity 값이 평균 1.27을 보이는 것을 확인하여 HA-CA 유도체의 가교가 MEM 성분에 의해 유도되었음을 다시 한번 확인하였다 (도 11 B).
*elasticity 값이 1 이상일 경우 G′ (저장탄성률) 값보다 G′′ (손실 탄성률) 값이 상대적으로 크므로 하이드로젤이라 할 수 없음.
Rheometer (tack test) 분석을 통해 첨가한 MEM 농도가 증가할수록 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 접착성은 감소하는 경향을 보였으나, 기존 MEM 하이드로젤(MEM only 그룹; 5 mg/ml MEM 하이드로젤 사용) 대비 19.5~33배 향상된 접착 성능을 가짐을 확인하였다 (도 11 C).
주사전자현미경 (SEM) 분석을 이용하여 하이드로젤 패치의 내부 구조를 분석한 결과, 가교 방식에 따른 (기존 산화제 NaIO4 가교 vs 본 발명의 MEM 가교) pore size 등 변화가 관찰되지 않아 내부의 다공성 구조는 유사함을 확인하였다 (도 11 D).
MEM을 이용한 HA-CA 가교 시 MEM 추가 시점에 따라 형성된 하이드로젤의 기계적 물성 차이가 생기는지 확인하기 위해 HA-CA 패치 제작 전 MEM을 추가한 그룹(pre-mixed)과 HA-CA 패치 제작 후 MEM을 추가한 그룹(added later)의 modulus를 비교하였다. Pre-mixed 그룹은 HA-CA 용액에 MEM을 미리 혼합하고 동결건조하여 패치로 제작하였다. Added later 그룹은 HA-CA 용액을 우선 동결건조하여 패치를 제작하고 이후 하이드로젤 형성시 MEM을 추가하였다.
0.5% HA-CA(DS: 15%) 용액에 최종 MEM 농도가 50, 100, 200, 400 μg/ml(각각 50, 100, 200, 400 그룹) 되도록 다양한 가교 조건 및 MEM 농도 조건에서 하이드로젤의 물성을 비교하였다.
MEM을 넣는 시점에 관계없이 400~700 Pa 정도의 elastic modulus 값을 갖는 하이드로젤이 형성되는 것을 확인하였다. NaIO4 산화제를 이용하여 HA-CA를 가교하였을 때 보다는 elastic modulus가 50% 이하로 감소했지만 기존 MEM 하이드로젤(가장 일반적으로 사용하는 농도인 5 mg/ml MEM hydrogel)과 비교하였을 때 최대 30배까지 물성이 강화되는 것을 확인하였다(도 12의 a).
MEM이 혼합되지 않은 HA-CA(0 그룹)는 tan delta 값이 1 이상으로 MEM 없이 HA-CA 유도체 자체만으로는 하이드로젤을 형성할 수 없음을 확인하였다(도 12의 b).
1-4. MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 물리적 특징 (팽윤 및 분해 양상) 분석
다양한 MEM 농도 조건에서 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 팽윤 양상을 비교하였다 (37 ℃, PBS incubation, 0.5% HA-CA 사용). MEM 농도가 가장 낮은 MEM 50 μg/ml 그룹의 경우 시간이 지나면서 팽윤된 하이드로젤 구조체가 잘 유지되지 못하였으나 100 μg/ml 이상의 MEM 농도 조건에서는 (100, 200, 400 μg/ml 그룹) 팽윤된 하이드로젤의 구조가 잘 유지되는 것을 확인하였다 (도 13 A).
MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 분해 양상을 분석하였다 (37 ℃, 2.5 U/ml HAdase incubation). 첨가된 MEM의 농도가 높을수록 분해가 느려지는 것을 확인하였으며 이를 통해 MEM 농도에 따라 하이드로젤의 생체 내 분해 속도를 조절할 수 있음을 알 수 있다 (도 13 B).
1-5. MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 MEM 서방형 전달 가능성 확인
MEM과 HA-CA 유도체 사이에 형성된 수소결합은 비공유결합으로 가역적 반응을 이루기 때문에 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치는 시간이 지남에 따라 MEM 단백질의 활성에 손상 없이 서방형 방출 거동을 보여줄 수 있을 것으로 예측되어, 이를 확인하였다.
구체적으로, HA-CA 하이드로젤 패치에 MEM을 탑재하고 (400 μg/ml MEM + 0.5% HA-CA 사용) MEM 또는 NaIO4 (4.5 mg/ml NaIO4 사용)로 가교를 유도한 뒤 방출 양상을 확인하였다 (37 ℃, PBS incubation).
그 결과 MEM으로 가교된 하이드로젤 패치 (MEM cross-linked)는 3달에 걸쳐 MEM이 서서히 방출되는 것을 확인하였다 (도 14 A). 또한, NaIO4 처리를 통해 가교된 하이드로젤 패치 (NaIO4 cross-linked)에서는 MEM이 초기에 일부 소량 방출된 이후로는 산화된 카테콜과 MEM 단백질 간의 강한 공유결합으로 인해 MEM이 거의 방출되지 않음을 확인하였다 (도 14 B).
따라서 근육 ECM을 전달하는 서방형 제제로서 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 활용 가능성을 확인하였다.
1-6. MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 생체적합성 확인
다양한 MEM 농도 조건에서 가교된 HA-CA 하이드로젤 패치 (0.5 % HA-CA 사용)에 근육줄기세포라고 불리는 위성세포 (satellite cell)를 마우스 대퇴부 근육조직에서 분리하여 5x104 cells/gel 농도로 파종하고 7일간 배양하면서 Live/Dead 분석을 실시한 결과, MEM/HA-CA 하이드로젤 패치는 MEM 농도에 관계없이 92.9 % 이상의 세포 생존율을 보여줌으로써 세포 독성이 거의 없는 것을 확인하였다 (도 15 A, B).
그리고, 마우스 피하에 MEM/HA-CA 패치 이식 1일 후 하이드로젤 패치의 상태를 확인했을 때, MEM/HA-CA 그룹의 경우 이식 부위에 잘 부착되어 있는 것을 확인했으며 (도 15 C, 붉은색 화살표), Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색과 toluidine blue (TB) 염색을 통한 조직학 분석으로도 이식된 MEM/HA-CA가 특별한 면역 반응이나 체내 독성 유발 없이 잘 유지되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 15 C, MEM/HA-CA 그룹 H&E, TB 염색 이미지에서 검정색 점선 아래 부분 해당). 반면, 가교제 없이 HA-CA만 이식한 그룹의 경우 (HA-CA) 하이드로젤 구조를 형성하지 못해 이식한 재료의 대부분이 사라진 상태였고, 조직학 분석으로도 하이드로젤 구조를 찾기 어려웠다 (도 15 C). 이를 통해 HA-CA 유도체 자체만으로는 체내 산화 조건에 노출이 되어도 하이드로젤 형성이 어렵다는 것을 알 수 있다.
*MEM/HA-CA와 HA-CA는 모두 동결건조된 패치 상태로 이식함 (별도의 가교제를 처리하지 않음).
따라서, 본 발명에서 개발한 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 조직 접착성능과 생체적합성이 매우 뛰어나며 실제 생체 내 적용이 매우 용이하고 안전한 소재임을 확인하였다.
1-7. MEM/HA-CA 하이드로젤 패치에 의한 근육줄기세포 활성화 증진 효과 확인
근육줄기세포라고 불리는 위성세포(satellite cell)를 마우스 대퇴부 근육조직에서 분리하여 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치 (0.5% HA-CA에 50, 100, 200 또는 400 μg/ml MEM을 함께 적용)에서 배양한 후 위성세포 특이적 마커인 Pax7 (Paired Box 7), 활성화된 위성세포 특이적 마커인 MyoD (myoblast determination protein 1)와 desmin 발현량을 정량적 PCR 분석 및 세포 면역염색을 통해 확인하였다. 위성세포는 분화를 통해 근섬유 (myofiber)를 형성할 수 있어 골격근 분화, 형성 및 재건 과정 중에 발현되는 마커인 MyoG (myogenic factor 4, Myogenin)와 myosin heavy chain 마커인 MF20 (MYH1E) 발현량도 함께 분석하였다.
배양 1일째 세포 면역염색을 통해 MEM 농도가 증가할수록 Pax7, desmin 마커 발현이 증가하는 것을 확인하여 위성세포가 활성화되는 것을 확인하였다 (도 16 A). 배양 초기이기 때문에 분화 마커인 MF20과 MyoG 발현이 전체 그룹에서 거의 관찰되지 않았다. 배양 1일째 정량적 PCR을 통해 유전자 발현 양상을 확인하였다. MEM의 농도가 높아질수록 Pax7과 MyoD 유전자 발현이 증가하는 경향을 보였는데, 이 중 MEM 400 그룹에서 Pax7 마커 발현은 오히려 감소하고 MyoG 발현은 가장 높은 특징을 보였다 (도 16 B). MEM 농도가 일정 수준 이상으로 높아지면 위성세포의 줄기세포능(stemness)이 감소하고 분화가 유도되는 것으로 사료된다.
배양 3일째 MEM 200 그룹에서 세포 증식이 가장 많이 이루어졌고 대부분의 세포가 Pax7, desmin 마커 발현이 되는 것을 보아 전체적으로 위성세포 활성화가 많이 진행된 것으로 판단된다. 분화 마커인 MF20과 MyoG는 MEM 100과 MEM 200 그룹에서 일부 증가한 것을 확인하였다 (도 16 C). 배양 3일째 유전자 발현은 Pax7, MyoD, MyoG 모두 MEM의 농도가 높아질수록 증가하는 경향을 보이며 가장 고농도의 MEM이 첨가된 MEM 400 그룹에서는 발현이 감소되는 양상을 보였다 (도 16 D). 배양 1, 3일에서 MEM이 첨가된 모든 그룹에서 대조군인 NaIO4으로 HA-CA의 가교를 유도한 그룹 (NaIO4) 보다는 세포 증식이 증진되었고, 높은 마커 유전자 발현 양상을 보이는 것을 확인하였다 (도 16 A-D). MEM 첨가가 위성세포의 증식 및 세포 활성을 증진시키는데 작용하는 것으로 사료된다.
배양 7일째 MEM 50, MEM 100, MEM 200 그룹에서 비슷한 수준의 Pax7, desmin 마커 발현이 이루어지는 것을 확인하였다 (도 16 E). 분화 마커인 MF20과 MyoG는 MEM 200 그룹에서 가장 발현이 증가되었다. 배양 7일째 Pax7의 발현은 MEM 200 그룹에서 여전히 높았으나 나머지 그룹은 NaIO4 그룹 보다 다소 감소된 것을 확인하였다 (도 16 F). MyoD 마커 발현은 100 μg/ml 이상의 MEM을 적용한 모든 그룹에서 NaIO4 그룹 대비 1.52배 이상 높고, MyoG 발현은 MEM 200 그룹까지 MEM의 농도가 높아짐에 따라 발현이 증가하는 것으로 보아 100 μg/ml 이상의 MEM을 사용한 그룹은 위성세포의 분화가 본격적으로 일어난 것으로 사료된다. 이 중 200 μg/ml MEM을 사용하여 제작한 HA-CA 하이드로젤 패치 (MEM 200)는 위성세포의 활성화 (Pax7+, MyoD+)를 가장 오랜 기간 유지할 수 있으면서, 동시에 적절한 분화 효과까지 기대할 수 있어 근육 재생에 가장 적합한 조건으로 확인되었다.
1-8. 골격근 손상모델에서 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치의 근육조직 재생 효과 확인
MEM (200 μg/ml) 탑재한 HA-CA 하이드로젤 패치(MEM/HA-CA)를 골격근 손상 동물모델(volumetric muscle loss model; VML model)에 적용하여 근육조직 재생을 위한 치료제로서의 가능성을 확인하였다.
MEM/HA-CA 하이드로젤 패치는 뛰어난 조직 접착력으로 별도의 의료용 접착제 없이도 손상된 조직에 쉽게 부착되어 고정되었다. 반면, 산화제를 통해 가교를 해야 하는 기존 방식은 (NaIO4/HA-CA) 패치 적용 후 NaIO4를 별도로 주입하고, HA-CA가 산화될 때까지 기다린 후 잉여 산화제를 세척해야 하는 번거로움이 있었다. 한편, MEM 하이드로젤 (5 mg/ml MEM 사용)은 접착력이 없기 때문에 근육 손상 부위에 제대로 고정되지 못한 것을 확인하였다 (도 17 A)
75%의 quadriceps femoris 근육을 제거하는 근육손상 유발 후 다양한 조건의 하이드로젤을 적용한 뒤, 8주와 12주차에 손상된 부위 조직을 적출하여 정상 조직(같은 개체에서 손상을 유발하지 않은 반대쪽 다리 사용)과 무게를 비교하였다. 그 결과 MEM/HA-CA과 NaIO4/HA-CA 그룹은 최종적으로 정상 그룹(sham)과 유의한 차이가 없어 정상 수준의 조직 mass 회복이 일어난 것을 확인하였다 (도 17 B).
그리고, 12주차에 MRI (T2-image) 촬영을 통해 근육 조직 재생이 얼마나 이루어졌는지 확인하였다. 그 결과 모델 유발 후 아무 처리도 하지 않은 그룹 (no treatment)과 MEM 그룹은 충분한 근육 조직 재생이 관찰되지 않았으며 (붉은색 화살표), NaIO4/HA-CA 그룹의 경우 충분한 크기의 근육 조직 재생이 관찰되었으나 수분 함량이 높아 밝은 흰색을 띄는 것을 보아 상대적으로 단단한 물성 때문에 주변조직과 빨리 융합되지 못하고 여전히 하이드로젤의 비중이 큰 상태인 것을 확인하였다 (도 17 C, 노란색 화살표). 반면, MEM/HA-CA 그룹의 경우 주변 조직과 융합이 잘 일어났으며 적절한 크기의 조직 재생이 이루어진 것을 확인할 수 있었고 (흰색 화살표) 이러한 특징은 육안으로도 관찰 가능했다 (검정색 화살표: 이식한 하이드로젤 패치에 의해 새롭게 형성된 근육 조직) (도 17 C).
결론적으로 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치를 이용한 이식 치료는 근육 세포외기질(MEM)의 효율적인 전달 및 근육 미세환경 조성을 통해 근육에 존재하는 줄기세포의 증식, 분화를 촉진시킴으로써 근육 손상 동물모델에서 정상 근육 수준의 조직 재생을 유도할 수 있음이 확인되었다.
1-9. 골격근 손상모델에서 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치에 의한 근육 기능 향상 효과 확인
MEM/HA-CA 하이드로젤 패치 이식 후 Rota-rod 장비를 이용하여 근육손상 동물모델의 운동 능력을 평가하였다.
그 결과, Rota-road 장비를 30-50 rpm 속도로 가속할 때 (도 18 A)와 40 rpm 속도로 유지할 때 (도 18 B) 두 조건에서 모두 MEM, NaIO4/HA-CA, MEM/HA-CA 그룹에서 향상된 운동능력이 확인되었다. 특히, MEM/HA-CA 그룹은 sham (정상) 그룹과 유의미한 차이가 없는 수준으로 운동 능력이 향상되었다. 따라서, MEM/HA-CA 하이드로젤 패치를 이용한 치료를 통해 근육손상 동물모델에서 기능적으로도 향상된 근육 재생을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.
1-10. 골격근 손상모델에서 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치에 의한 근육 조직 재생 효과 확인
MEM/HA-CA 하이드로젤 패치 이식 12주 뒤, 어떠한 처치도 하지 않은 그룹 (No treatment)과 MEM 하이드로젤만 이식한 그룹 (MEM, 5 mg/ml MEM hydrogel 사용)에서는 새로 생성된 근육 조직이 관찰되지 않았다. NaIO4로 가교한 HA-CA 패치를 이식한 그룹 (NaIO4/HA-CA, 0.5% HA-CA 사용)과 MEM으로 가교한 HA-CA 패치를 이식한 그룹 (MEM/HA-CA, 0.5% HA-CA에 200 μg/ml MEM이 탑재된 하이드로젤 패치 사용)의 경우 새로운 조직이 형성되었으나 NaIO4/HA-CA 그룹은 하이드로젤이 그대로 남아있어 실질적인 근육 조직 재생은 이루어지지 않은 것을 확인하였다 (도 19 A).
새로 생성된 조직을 분석한 결과, No treatment 그룹과 NaIO4/HA-CA 그룹에서는 작은 myotube와 핵이 중앙에 존재하는 dystrophic myofiber들이 섞여 있는 것이 관찰되어 손상된 근육이 일부 재생되고 있음을 확인하였다. 반면, MEM/HA-CA 그룹의 경우 정상 조직 (sham 그룹)에서처럼 대부분의 핵이 myofiber 밖에 존재하는 것으로 확인되어 조직 재생이 거의 완료된 것을 확인하였다 (도 19 B).
Masson's trichrome (MT) 염색을 통해 섬유화 정도를 분석하였을 때, sham (정상) 그룹에 비해 모든 그룹에서 섬유화 콜라겐 침착이 일어난 것을 확인하였다. 이 중 MEM/HA-CA 그룹이 sham 그룹과 가장 유사한 수준으로 낮은 콜라겐 침착이 일어난 것을 관찰함으로써 조직 손상으로 인한 scar tissue formation이 가장 적은 것을 확인하였다 (도 19 C-D).
근육 특이적 마커인 myosin heavy chain 1E (MYH1E)와 laminin을 염색한 결과, no treatment 그룹을 제외한 모든 그룹에서 MYH1E-양성 myofiber가 관찰되었고, MEM/HA-CA 그룹에서 sham 그룹 수준의 MYH1E 발현과 correct laminin deposition이 관찰되었다 (도 19 E). Myofiber의 최소 feret diameter (도 19 F)와 cross-sectional area (CSA) (도 19 G)를 분석하였을 때도 마찬가지로, MEM/HA-CA 그룹의 myofiber 크기 분포가 sham 그룹과 가장 유사한 수준인 것을 관찰하여 근육 조직 재생이 성공적으로 이루어진 것을 확인하였다.
근육의 재생 및 기능 수행은 근육 조직에 함께 존재하는 혈관을 통해 원활한 산소 및 영양분 공급이 이루어져야 극대화 될 수 있다. 혈관화 관련 마커인 α-smooth muscle actin (α-SMA)과 CD31을 염색한 결과 (도 19 H), α-SMA-양성 소동맥의 수와 CD31-양성 미세혈관의 수가 no treatment 그룹에 비해 MEM/HA-CA 그룹에서 유의하게 증가하는 것을 확인하였다 (도 19 I).
이를 통해 MEM/HA-CA 하이드로젤 패치는 근육뿐만 아니라 혈관과 같은 주변 조직의 재생을 함께 유도하여 기능적으로 향상된 근육 재생을 유도할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2: 조직 유래 세포외기질(ECM) 전달을 위한 페놀기 수식 하이드로젤 패치 제작 및 분석 (2)
2-1. 근육조직 유래 세포외기질 (MEM) 전달을 위한 페놀기 (갈롤기) 수식 하이드로젤 패치 (MEM/HA-PG)의 제작
또 다른 접착성 페놀기인 갈롤기로 수식된 히알루론산 유도체(pyrogallol-conjugated hyaluronic acid; HA-PG)를 합성하고 근육조직 유래 세포외기질(muscle extracellular matrix; MEM)을 탑재한 MEM/HA-PG 하이드로젤 패치를 제작하였다.
제작된 MEM/HA-PG 패치는 MEM/HA-CA 패치와 마찬가지로 MEM와 갈롤기 사이의 반응을 통한 가교 및 하이드로젤 형성이 가능하며 따라서 MEM의 효율적인 전달을 통해 근육조직 재생을 유도할 수 있다 (도 20).
여기에서 사용된 탈세포 근육조직 유래 세포외기질은 전술한 바와 같다.
2-2. MEM/HA-PG 하이드로젤 패치의 기계적 물성 분석
HA-PG 유도체는 갈롤기의 우수한 자가 산화능력을 통해 빠른 가교 유도가 가능하고 MEM에 존재하는 다양한 성분들과 높은 반응성을 가질 수 있을 것으로 예상되어 이를 확인하였다.
구체적으로, 0.5% HA-PG 유도체 (DS: 7%) 용액에 최종 MEM 농도가 0, 20, 60, 100, 140 μg/ml (각각 0, 20, 60, 100, 140 그룹) 되도록 첨가하여 다양한 농도 조건에서 하이드로젤 형성을 유도하고 각각의 기계적 물성을 비교하였다.
MEM의 농도가 높을수록 elastic modulus 값이 증가하고 tan delta 값이 작아지는 경향을 보였는데 (도 21) 이는 MEM 성분이 HA-PG 하이드로젤 패치의 물성 강화를 유도할 수 있음을 보여주는 것이다.
2-3. MEM/HA-PG 하이드로젤 패치의 생체적합성 확인
다양한 MEM 농도 조건에서 형성된 MEM/HA-PG 하이드로젤 패치에 C2C12(mouse myoblast) 세포를 파종하고 7일간 삼차원 배양하면서 세포 상태를 관찰하고 Live/Dead 염색을 실시하여 세포 생존율 (viability)을 분석하였다.
60 μg/ml MEM이 첨가된 HA-PG 하이드로젤 패치 (MEM 60, 0.5% HA-PG 사용)에서 배양 시간이 지날 수록 muscle tube 구조가 생성되는 등 (붉은색 화살표) 다른 그룹과 비교하여 전반적으로 세포가 잘 성장하였으며, MEM을 추가하지 않은 그룹보다 추가한 그룹에서 세포 생존율이 더욱 높음을 확인하였다 (도 22 A).
*MEM 0: MEM이 첨가되지 않은 HA-PG 패치
*MEM 140: 140 μg/ml MEM이 첨가된 HA-PG 패치
또한, 동일한 조건의 MEM/HA-PG 하이드로젤 패치를 생리학적 조건(37℃, 근육줄기세포 배양액)에서 24시간 incubation하여 담지된 MEM의 방출을 유도한 뒤, 배양액을 회수하여 마우스 유래 근육줄기세포에 처리하고 세포 viability와 (도 22 B-C) proliferation 정도를 평가하였다 (도 22 D). 세포 배양 후 7일까지 viability에는 큰 차이가 없으나 proliferation 분석에서 배양 1일 후 MEM이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치로부터 수거된 배양액을 처리한 그룹에서 유의미한 세포 증식이 관찰되어 HA-PG 하이드로젤 패치에 탑재된 MEM이 초기 세포 증식에 관여하는 것을 알 수 있었다. 한편, 배양 7일째에는 MEM이 담지된 HA-PG 하이드로젤 패치로부터 수거된 배양액 처리 그룹과 아무 처리하지 않은 그룹(기존 근육줄기세포 배양액을 사용 - No treatment 그룹)간의 proliferation에 차이가 나지 않았거나 다소 감소하였는데 이는 방출된 MEM의 양이 증가함에 따라 근육줄기세포의 분화가 더 많이 유도되어 상대적으로 세포 증식은 감소하였기 때문으로 사료된다.
*세포 viability는 live/dead assay를 사용하여 분석하였고, 세포 proliferation은 MTT assay를 사용하여 확인하였다.
이는 MEM이 탑재된 HA-PG 하이드로젤 패치의 생체적합성이 우수하며 근육세포의 증식 및 분화를 증진시킬 수 있음을 보여주는 것이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 페놀기를 포함하는 화합물이 수식된 생체적합성 고분자를 포함하는 하이드로젤 패치; 및
    상기 하이드로젤 패치에 담지된 세포외기질을 포함하며,
    상기 페놀기는 도파민-하이드로클로라이드 및 5-하이드록시도파민으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 것이고,
    상기 생체적합성 고분자는 히알루론산이며,
    상기 세포외기질은 탈세포 조직 유래인 것인,
    세포외기질 하이드로젤 패치
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포외기질 하이드로젤 패치는
    i) 두께가 0.05 내지 10.0 ㎜이고,
    ii) 0.1 Hz 내지 10 Hz의 주파수 범위에서, 1Х102 Pa 내지 1Х106 Pa의 저장 탄성률(G′) 및 0.2 내지 0.5의 tanδ를 가지고,
    iii) 5 N의 수직항력 하에 0.01 m/s의 속도에서 측정된 마찰계수가 0.2 내지 0.4이며,
    iv) 접착강도가 1 N 내지 10 N인, 세포외기질 하이드로젤 패치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 세포외기질은 상기 페놀기와 상호 작용을 하여 가교제로서 작용하는, 세포외기질 하이드로젤 패치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포외기질은 근육, 뇌, 척수, 혀, 기도, 피부, 림프, 폐, 심장, 간, 위, 신장, 비장, 췌장, 장, 부신, 지방, 자궁, 흉선, 식도, 침샘, 뼈, 방광, 혈관, 힘줄, 갑상선 및 잇몸으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조직 유래인, 세포외기질 하이드로젤 패치.
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