KR102483119B1 - Snap25 안티센스 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents
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Abstract
인간 SNAP25 프리-mRNA의 3" 스플라이스 위치를 표적하는 펩타이드 핵산 유도체를 제공한다. 펩타이드 핵산 유도체는 세포에서 한 개 이상의 인간 SNAP25 mRNA 스플라이스 변형체의 생성을 강하게 유도하며, 국소 투여에 의해 인간 SNAP25 단백질의 발현에 연관된 피부 과학적인 징후 또는 질환을 안전하게 치료하는 데 유용하다.
Description
본 발명은 인간 SNAP25의 프리-mRNA를 표적으로 하여 SNAP25 단백질에 연관된 피부 과학적인 징후 또는 질환을 치료하는 펩타이드 핵산 유도체에 관한 것이며, 그 전체가 참조 문헌으로 인용되는 것인 2017년 1월 6일자로 출원된 미국 가특허출원 제 62/443,262호의 우선권의 이익을 주장한다.
세포가 커다란 분자를 세포안으로 흡수하는 과정을 내포작용이라고 (endocytosis) 한다. 반면에, 세포가 세포내의 물질이나 내용물을 세포 밖으로 분비하는 과정은 외포작용이라고 (exocytosis) 하는 데, 많은 종류의 세포들이 소낭성의 내용물 혹은 물질을 세포 밖으로 분비하는 데 외포작용을 현명하게 이용하고 있다. 신경 세포는, 이웃한 신경 세포 혹은 이웃한 조직과 소통하는 주어진 생리학적 역할을 위해, 외포작용을 통해 신경전달물질을 (neurotransmitter) 분비하도록 진화하였다. 또 다른 예로서, 비만 세포는 (mast cells) 외포작용을 통해 히스타민을 배출하여 면역 세포를 (immune cells) 불러 모은다.
분비 소포는 (secretory vesicle) 세포의 종류에 따라 다른 다양한 종류의 소포성 물질을 함유하고 있다. 예를 들면, 신경 세포에서 시냅스 이전의 소포는 신경의 시냅스 이전 말단에 위치하는 데 여러 종류의 신경전달물질을 함유한다. 소포성 막은 (vesicular membrane) 원형질막과 융합하여 신경전달물질을 시냅스 접합 영역에 배출하고 이웃한 세포나 조직에 대해 생리학적으로 조절하거나 영향을 끼치게 된다. 이자섬의 (pancreatic islets) β-세포는 인슐린이 들어있는 소포를 갖고 있는 데, 그 소포는 혈당 수치에 반응하여 막 융합을 통한 외포작용으로 인슐린을 혈류에 배출한다 [Cell Metabolism, vol 5, 237-252 (2007)].
외포작용은 소포성 막과 원형질막의 융합을 포함하는 세포의 과정인 데, "본질적인 (constitutive)" 및 "조절되는 (regulated)"의 두 종류가 있다. "본질적인" 외포작용은 자극 신호가 없어도 자발적으로 일어나는 반면, "조절되는" 외포작용은 운동 신경 세포 내의 칼슘 이온 농도 증가와 같은 특별한 자극 신호에 의해 일어난다 [Ann. Rev. Cell Dev. Biol. vol 16, 19-49 (2000)].
시냅스 접합부에서의 외포작용: 신경 세포는 신경 세포에 전문화된 "시냅스 접합부 (synaptic junction)"라는 시스템을 사용하여 서로 소통한다. 이웃한 신경 세포 사이의 시냅스 접합부에서 일어나는 외포작용이 도 1A에 도식화된다. 먼저, 신경전달물질을 포함한 소포는, 뉴런의 축삭돌기에 의해 인지되는 칼슘 이온 농도의 변화와 같은 자극 신호에 반응하여 시냅스 앞의 원형질막과 융합한다. 다음에, 막이 융합하면 신경전달물질이 시냅스 나들목에 배출되고 분산되어 이웃한 신경세포의 수지상 막에 발현된 신경전달물질 수용체에 결합한다. 마지막으로, 수용체는 신경전달물질과의 결합에 의해 활성화되어, 이웃한 신경세포의 축삭돌기에서 전해진 신경 신호를 전달한다.
신경근 접합부에서의 외포작용: 운동 신경세포는 "신경근 접합부"에서의 외포작용을 사용하여 근육의 움직임을 조절한다. 근육에서 운동 신경세포의 축삭돌기는 많은 축삭말단으로 가지를 쳐서 근육 세포의 근세포막과 접합부 즉 "신경근 접합부"를 형성한다 [Nat. Rev. Neuroscience, vol 2, 791-805 (2001)]. 신경 축삭말단과 근육 세포막 사이의 간극은 약 30 nm의 폭으로 접합렬이라 (synaptic cleft) 부른다.
활동 전위 형태의 신경 펄스가 운동 신경세포의 축삭말단에 도달하면 신경근 접합부에서 시냅스 전달이 시작된다. 운동 신경세포의 축삭돌기가 신경전달물질을 (즉, 척추동물의 경우 아세틸콜린) 접합렬로 배출하고 근육세포의 막에 발현된 아세틸콜린 수용체가 아세틸콜린의 결합에 의해 활성화되면 근섬유의 수축이 시작된다. 신경 축삭돌기와 근육세포 사이의 신경근 접합부에서 발생하는 외포작용이 도 1B에 도식화된다.
SNARE 단백질과 신경의 외포작용: 소포와 신경세포 막의 융합은 "조절되는" 외포작용에서 필수적이다. 그러한 "조절되는" 외포작용은 SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors) 단백질에 의해 조절된다고 알려져있다 [Ann. Rev. Cell Dev. Biol. vol 16, 19-49 (2000)]. 신경세포의 외포작용에는 다음 세 개의 SNARE 단백질이 작용한다: 소포의 막에 (v-SNARE) 위치한 막을 한 번 관통하는 단백질인 소포 관련 막 단백질 (VAMP2 혹은 synaptobrevin); 25 kDa의 시냅토좀 (synaptosome) 관련 단백질 (SNAP25); 신경세포의 원형질막에 존재하는 (t-SNARE) 한 개의 세포 관통 단백질인 syntaxin 1A. VAMP2와 syntaxin 1A는 각각 소포와 신경세포의 원형질막에 고정시키기 위한 C-말단의 막 관통 부위를 갖고 있다. SNAP25의 여러 개 시스테인 잔기에 공유결합으로 연결된 팔미토일 기들이 SNAP25의 막 고정을 용이하게 한다 [Am. J. Physiol. Cell Physiol. vol 285, C237-249 (2003)].
신경세포 활동 전위가 전압작동 칼슘 채널을 활성화하여 축삭돌기 내의 칼슘 이온 농도를 증가시키면, 칼슘 이온이 시냅토태그민과 (synaptotagmin) 복합체를 형성하여 시냅스 소포를 시냅스 이전막으로 이동하게한다. 시냅스 소포의 막과 축삭돌기의 원형질막이 도 2A에 도식화된 바와 같이 융합한다. syntaxin, SNAP25 및 synaptobrevin의 세 복합체는 두 개의 막이 인접하도록 몰아가서 막 융합이 일어나게 하여 아세틸콜린을 접합렬에 배출하게 한다 [Toxins vol 2, 24-53 (2010)]. 즉, SNARE 단백질의 세 복합체 형성은 신경전달물질의 배출에 관련된 막 융합에 대해 필수적인 요소이다.
보툴리눔 독소 A: 보툴리눔 독소는 (botulinum toxin, BTX) 보툴리누스균에 (Clostridium botulinum) 의해 생성되는 신경독이다. 독소의 활성형은 이황화 결합으로 연결된 중쇄 (100 kDa) 및 경쇄로 (50 kDa) 이루어진 하나의 폴리펩타이드 사슬이다 (single polypeptide chain, 150 kDa). BTX는 알려진대로 신경세포에 쉽게 흡수되어 SNARE 단백질을 자르고 아세틸콜린의 배출을 막아서, 결과적으로 신경세포의 필수적인 역할을 못하게 한다. BTX에 노출된 신경세포는 이웃한 근섬유의 수축을 일으키지 못하게 된다.
BTX는 신경세포 안으로 들어가면 중쇄 및 경쇄의 두 부분으로 잘려지는 데, 경쇄 부분이 신경독을 일으키는 아연 단백질 분해효소이다 (zinc metalloprotease). BTX 아형 A, C 및 E는 SNAP25를 자르는 반면 아형 B, D, F 및 G는 VAMP를 분해하고 아형 C는 syntaxin을 가수분해한다 [Nature, vol 365, 160-163 (1993)].
미용 목적의 Botulinum Toxin A: Botulinum Toxin A는 주로 안면 주름을 치료하는 미용 목적으로 알러간에 (Allergan) 의해 개발되었다. Botox®는 알러간이 등록한 유명한 상표명으로, 일반 대중들은 흔히 BTX와 동의어로 사용한다.
BTX A는, 생리적인 활성을 고려하면, 이론상으로는 과도한 근육 수축 혹은 머리와 목, 눈꺼풀, 팔 다리, 턱, 그리고 성대의 경련을 포함한 많은 장애들을 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한, BTX는 과다 침분비와 다한증을 포함하는 과다 분비 장애를 치료하는 데에 사용될 수도 있다 [Indian J. Dermatol. vol 55, 8-14 (2010)].
Botox® 주사는 안면 주름 치료용으로 미국 FDA에 의해 2002년에 승인되었는 데, 숙련된 피부과 전문의가 적절히 시술한다면 안전한 것으로 여겨진다. 그러나 BTX는 독성으로 악명이 높은 데, 예를 들면, BTX A와 B는 인간 정맥 투여 치사량은 1.3 ~ 2.1 ng/kg로 평가된다 [Indian J. Dermatol. vol 55, 8-14 (2010)]. 미용 목적의 BTX 안전성에 대한 우려가 아직 있는 데, BTX 근육 주사를 맞은 사람들에게 나타나는 가장 흔한 부작용은 안면 마비, 근력 저하 및 침삼키기 장애 등이 있다. 과잉 투여나 비숙련자의 근육 주사에 의한 전신성 노출로 야기된 더 심각한 부작용으로는 두통, 감기몸살 증상 및 알러지 반응 등이 있다. 반복된 BTX 주사는 항원성 반응을 일으킨다고 알려져 있는 데, 이 사실은 BTX의 미용 목적 사용을 제한한다. 치료 목적 사용에 대한 부작용은 미용 목적 사용의 경우보다 심각한 데, 부정맥, 심장마비, 발작, 호흡 정지 및 사망 등이 그 예이다 [J. Am. Acad. Dermatol. vol 53, 407-415 (2005)].
미용 목적으로 BTX 주사를 맞는 사람의 부작용을 최소화하기 위해서는 전통적인 근육 주사 대신에 BTX의 국소 투여가 선호된다. BTX는 150 kDa 크기의 고분자 화합물로서, BTX를 국소 투여로 피부 밑의 근육 층까지 깊이 전달하는 것은 침습적인 제형에 의존하지 않고서는 매우 어려운 일이다.
아지렐린 (Argireline): 아지렐린은 SNAP25 단백질의 N-말단에서 유래한 합성 헥사펩타이드로서 안면 주름 개선용 화장품으로 상품화되었다. 헥사펩타이드는 SNAP25 단백질과의 SNARE 복합체 형성을 방해한다고 주장되었다. 헥사펩타이드는 BTX의 기능을 모방하고 있으며, 국소 투여시 안면 주름을 감소시키는 데 유용할 것이다. 아지렐린은 국소 투여시 사람의 안면 주름을 감소시킨다고 보고되었다 [Am. J. Clin. Dermatol. vol 14(2), 147-153 (2013)].
프리-mRNA: DNA (2-deoxyribose nucleic acid) 상의 유전 정보는 전사되어 핵에서 프리-mRNA를 (pre-messenger ribonucleic acid) 생성한다. 포유동물의 프리-mRNA는 보통 엑손과 인트론으로 구성되며, 엑손과 인트론은 도 2B에 도식화된 바와 같이 서로 연결되고 번호가 붙여진다.
프리-mRNA 스플라이싱: 도 3A에 요약된 바와 같이, "스플라이싱"이라 불리는 복잡한 일련의 반응들을 통해서 인트론을 제거하고 프리-mRNA는 mRNA로 변환된다 . [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)]. 스플라이싱은 프리-mRNA와 스플라이싱 접속 인자의 초기 스플라이스오솜 복합체인 "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성으로 시작된다. 작은 핵단백질 U1은 프리-mRNA의 엑손 N과 인트론 N 연결 부위에 결합하고 U2AF35는 인트론 N과 엑손 (N+1) 연결 부위에 결합하여 스플라이스오솜 E 복합체를 만드는데, 따라서 엑손/인트론과 인트론/엑손 연결 부위는 초기 스플라이스오솜 복합체를 만드는 데 아주 중요하다. "스플라이스오솜 E 복합체"에 U2가 결합해서 "스플라이스오솜 A 복합체"를 형성하고, 이 복합체에서 인트론을 제거하고 바로 옆의 엑손을 연결하는 일련의 복잡한 작업이 진행된다.
리보솜 단백질 합성: 단백질은 DNA에 의해 암호화된다. 세포의 자극에 반응해서 혹은 저절로, DNA는 핵 안에서 프리-mRNA로 전사된다. 프리-mRNA의 인트론은 효소 작용에 의해 제거되고, 생성된 m-RNA는 세포질로 이동한다. 세포질에서 리보솜이라 불리는 번역 복합체가 mRNA에 붙어서 mRNA에 암호화되어 있는 유전 정보를 이용하여 단백질을 합성한다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].
안티센스 올리고뉴클레오타이드 (Antisense Oligonucleotide, ASO): DNA, mRNA 및 프리-mRNA 등의 핵산에 서열특이적으로 (상보적으로) 결합하는 올리고뉴클레오타이드를 안티센스 올리고뉴클레오타이드라고 부른다 (ASO). 예를 들면, 세포질에서 mRNA에 강하게 결합하는 ASO는 리보솜의 단백질 합성을 억제할 수 있는 데, 리보솜의 표적 단백질 합성을 억제하기 위해서는 ASO는 반드시 세포질 내에 있어야만 한다.
핵에서 프리-mRNA에 강하게 결합하는 ASO는 프리-mRNA가 mRNA로 스플라이싱되는 것을 억제하거나 조절할 수 있는 데, 프리-mRNA가 mRNA로 스플라이싱되는 것을 억제하거나 조절하기 위해서는 ASO는 반드시 핵 내에 있어야만 한다. 스플라이싱의 안티센스 억제에 의해 ASO가 표적하는 엑손을 결여한 mRNA 혹은 mRNA들이 생성되는 데, 그러한 mRNA(들)은 "스플라이스 변형체(들)"이라 불리며, 전체 길이 mRNA가 암호화하는 단백질보다 작은 단백질(들)을 암호화한다.
이론적으로, "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성을 억제하면 스플라이싱을 막을 수 있다. 만약 ASO가 (5'→3') 엑손-인트론 연결 부위 즉 "5' 스플라이스 위치"에 강하게 결합하면, ASO는 프리-mRNA와 인자 U1의 복합체 형성을, 따라서 "스플라이스오솜 E 복합체"의 형성을 막을 수 있다. 그와 유사하게, 만약 ASO가 (5'→3') 인트론-엑손 연결 부위 즉 "3' 스플라이스 위치"에 강하게 결합하면, "스플라이스오솜 E 복합체"는 형성될 수 없다. "3' 스플라이스 위치"와 "5' 스플라이스 위치"는 도 3B에 도식화 된다.
비천연 (unnatural) 올리고뉴클레오타이드: DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체 내에 존재하는 뉴클리에이즈 (nuclease)에 의해 쉽게 분해되므로, 치료적 용도에 한계가 있다. 지금까지 많은 유형의 비천연 (자연에 존재하지 않는) 올리고뉴클레오타이드가 연구되고 개발되어 왔는데 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)], 그 중 몇몇은 DNA와 RNA에 비하여 긴 대사 안정성을 나타냈다. 대표적인 인공 올리고뉴클레오타이드 중 몇몇의 화학 구조가 도 4A에 제공된다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA처럼 상보적인 핵산에 예측한대로 결합한다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 (PTO, Phosphorothioate Oligonucleotide): PTO는 모노머 당 골격의 포스페이트 산소 원자 중 하나가 황 원자로 치환된 DNA 유사체이다. 이러한 작은 구조적 변화는 PTO를 뉴클리에즈에 의한 분해에 비교적 잘 견디도록 만들었다 [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].
PTO와 DNA가 구조적으로 매우 유사함을 반영하듯이, 이들은 대부분의 동물세포에 대한 투과성이 매우 나쁘다. 그러나 DNA를 잘 투과시키는 트랜스포터가 (transporter) 많이 발현된 세포들의 경우, DNA와 PTO 모두 세포투과성이 좋은 편이다. 전신성으로 (systemically) 투약된 PTO는 간이나 신장에 많이 분포되는 것으로 알려져 있다 [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)].
PTO의 세포 투과성을 높이기 위하여, 리포펙션 (lipofection) 방법이 널리 사용되고 있다. 그러나 리포펙션 방법은 세포막을 변형시기고 세포 독성을 유발하므로 장기간의 임상 사용에는 이상적이지 못하다.
지난 30여년간 안티센스 PTO와 PTO의 변형체들이 각종 암, 면역 질환, 대사성 질환 등을 치료하기 위하여 임상적으로 평가되어 왔다 [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)]. 대부분의 이러한 안티센스 의약개발 프로그램들은 부분적으로는 PTO의 세포 투과성 부족으로 인하여 성공하지 못하였다. PTO의 세포 투과성 부족을 극복하기 위해서는, 치료 효과를 보기 위해 고용량의 PTO를 투약해야 한다. 그러나 PTO를 고용량 투약하면, 혈액 응고 시간이 길어지고, 보체 활성화 (complement activation), 신장 독성 (tubular nephropathy), 쿠퍼 (Kupffer) 세포 활성화, 그리고 비장 비대, 비장 림프구 증식증, 단핵세포 침윤과 같은 면역 자극 등의 다양한 독성을 유발한다 [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006)].
여러 안티센스 PTO들의 경우, 간이나 신장과 관련된 질환에서 임상적 약효를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 미포메르센 (Mipomersen)은 PTO 유사체로서 LDL 콜레스테롤 운반에 관여하는 apoB-100 단백질의 합성을 저해한다. 미포메르센은 일부 동맥경화 환자 군에서 약효를 나타냈는데, 이는 미포메르센이 간에 주로 분포함에 기인하는 것으로 보인다 [Circulation vol 118, 743-753 (2008)]. ISIS-113715는 PTP1B (Protein Tyrosine Phosphatase 1B)의 합성을 저해하는 안티센스 PTO 유도체로서 제2형 당뇨 환자들에서 약효를 나타낸다고 보고되었다 [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)].
잠금핵산 (LNA, Locked Nucleic Acid): LNA는 DNA 혹은 RNA에 대한 결합력을 증가시키기 위하여 RNA의 리보스 고리 골격을 구조적으로 제한한 핵산이다. 따라서, LNA는 강한 핵산 결합력을 지닌 DNA 혹은 RNA 유도체로 간주될 수 있다 [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)].
포스포로다이아미데이트 모폴리노 올리고뉴클레오타이드 (PMO, Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotide): PMO는 DNA 골격의 2-디옥시리보스 (2-deoxyribose)와 포스페이트 (phosphate)가 각각 모폴린과 (morpholine) 포스포로다이아미데이트로 (phosphodiamidate) 치환된 올리고뉴클레오타이드이다 [Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)]. DNA 골격이 음전하를 갖는 반면, PMO 골격은 중성이다. 따라서 PMO와 RNA의 결합은 정전기적 반발이 없어, PMO와 RNA의 결합은 DNA와 RNA 사이의 결합 보다 강하다. 아울러 PMO는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA나 RNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터 (hepatic transporter)에 의해 인식되지 않지만, PMO 역시 세포막을 잘 통과하지 못한다.
펩타이드 핵산 (PNA, Peptide Nucleic Acid): PNA는 N-(2-아미노에틸) 글리신을 단위 골격으로 갖는 폴리펩타이드로서 니엘슨 (Nielsen) 등에 의해 발명되었다 [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. PNA의 화학 구조와 축약된 이름은 도 4B에 도식화된다. DNA나 RNA와 마찬가지로, PNA 역시 상보적인 핵산과 선택적으로 결합한다 [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. 상보적인 핵산에 결합할 때, PNA의 N-말단은 DNA나 RNA의 5'-말단, 그리고 C-말단은 DNA나 RNA의 3'-말단에 해당한다.
PMO 처럼 PNA 골격은 전하를 띠지 않은 중성이기 때문에, PNA와 RNA의 결합은 DNA와 RNA의 결합 보다 강하다. PNA는 DNA와 구조적으로 매우 다르기 때문에, DNA를 인식하는 간에 있는 트랜스포터에 의해 인식되지 않으며, PTO와 매우 다른 조직 분포 특성을 갖고 있으나, PNA 역시 포유동물 세포막을 잘 통과하지 못한다 [Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280, (2003)].
변형된 핵산염기로 세포투과성과 결합력을 높인 PNA: 도 4C에 예시된 바와 같이, 양이온성 지질 (cationic lipid) 혹은 그와 동등한 것이 핵산 염기에 (즉, 염기) 공유 결합으로 연결된 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 포유류의 세포막 투과성이 매우 좋다. 이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 시토신, 아데닌 및 구아닌은 구아닌, 티민 및 아데닌과 각각 예측한대로 상보적 결합을 한다 [PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256; EP2268607; US8680253].
이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 리포펙션과 비슷한 환경이 된다. 리포펙션 상황에서는 올리고뉴클레오티드가 리포펙타민과 같은 양이온성 지질에 둘러싸이게 되는데, 그러한 리포펙타민/올리고뉴클레오티드 복합체는 올리고뉴클레오티드 그 자체에 비해 세포막 투과가 용이하다.
이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 향상된 세포투과성 외에 상보적인 핵산에 대한 결합력이 매우 강하다. 예를 들면, 상보적인 DNA와 듀플렉스 (duplex)를 형성할 때, 4~5개의 변형된 핵산 염기가 도입된 11~13머의 PNA 유도체는 변형되지 않은 PNA에 비해 20oC 이상 높은 Tm 값을 보인다. 이렇게 변형된 핵산 염기를 갖는 PNA는 한 개의 염기 부정합에도 (mismatch) 매우 민감한 데, 변형된 염기의 종류나 PNA의 서열에 따라 다르지만 약 11~22oC의 낮은 Tm 값을 보인다.
작은 간섭 RNA (siRNA, Small Interfering RNA): 20~25개의 염기쌍으로 구성된 이중 나선의 RNA를 siRNA라한다 [Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]. siRNA의 안티센스 가닥과 단백질의 상호 작용으로 형성된 “RNA에 의해 유도된 사일런싱 복합체”(RISC)는 siRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 mRNA의 일부분과 결합한다. RISC와 결합한 mRNA는 잘려져서 다른 복사본 이중 나선 siRNA를 생성한다. 즉 siRNA는 표적 mRNA의 절단을 유도하는 촉매 반응을 일으켜, 결과적으로 mRNA에 의한 단백질의 발현을 막는다. 그러나 RISC가 항상 표적 mRNA의 상보적인 염기 서열들 전체와 결합하는 것은 아니어서 siRNA 치료법에 있어서 오프타겟 효과에 대한 문제가 제기되곤 한다. 또한, siRNA는 DNA나 RNA와 같은 골격을 갖고 있기 때문에 세포투과성이 나빠서, 좋은 세포 투과성을 위한 적절한 제제나 물질자체의 화학적 변형을 하지 않으면 생체외 또는 생체내 효과가 잘 나타나지 않는다.
SNAP25의 ASO나 siRNA: 신경세포에서 SNAP25 단백질의 생리적인 역할을 더 잘 이해하기 위하여, 주로 생물학적 도구로서 SNAP25 ASO와 siRNA가 평가되었다 [Nature vol 364, 445-448 (1993); Eur. J. Neurosci. vol 20(6), 1593-1603 (2004); EMBO Reports vol 14(7) 645-651 (2013); J. Biol. Chem. vol 281(38), 28174-28184 (2006)]. BTX의 유익한 치료 활성을 안전하게 모방하기 위하여, SNAP25 단백질의 활성을 하향 조절하는 올리고뉴클레오타이드를 국소적으로 사용하는 것이 아직 연구되고 있지않다. 올리고뉴클레오타이드 분야에서 경피 전달은 매우 어려운 과제라는 것을 인지해야한다.
발명의 요약
본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SNAP25 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소 [D], 수소 [H], 치환체가 있거나 없는 알킬 (alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 (aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH2-C(=O)-], 아미노티오카보닐 [NH2-C(=S)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실 (alkylacyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아실 (arylacyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 (alkyloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐 (aryloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 (alkylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐 (arylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐 (alkylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐 (arylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐 (alkyloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐 (aryloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐 (alkylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 (arylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 (alkylphosphonyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 (arylphosphoonyl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시 (hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌 (adenine), 티민 (thymine), 구아닌 (guanine), 시토신 (cytosine), 그리고 우라실 (uracil)을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산 염기로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA에서 "엑손 7"의 스키핑을 유도하여 "엑손 7"이 결여된 인간의 SNAP25 mRNA 스플라이스 변형체(들)을 생성하며, 인간의 SNAP25 프리-mRNA로 전사되는 유전자의 기능 활성을 억제하는 데 유용하다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SNAP25 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소 [D], 수소 [H], 치환체가 있거나 없는 알킬 (alkyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 (aryl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀 [H-C(=O)-], 아미노카보닐 [NH2-C(=O)-], 아미노티오카보닐 [NH2-C(=S)-], 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실 (alkylacyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아실 (arylacyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 (alkyloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐 (aryloxycarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐 (alkylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐 (arylaminocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐 (alkylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐 (arylaminothiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐 (alkyloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐 (aryloxythiocarbonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐 (alkylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 (arylsulfonyl), 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐 (alkylphosphonyl), 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 (arylphosphoonyl) 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시 (hydroxy), 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌 (adenine), 티민 (thymine), 구아닌 (guanine), 시토신 (cytosine), 그리고 우라실 (uracil)을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 치환체가 있거나 없는 아민이 핵산 염기에 공유결합으로 연결된 비천연 핵산 염기로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA에서 "엑손 7"의 스키핑을 유도하여 "엑손 7"이 결여된 인간의 SNAP25 mRNA 스플라이스 변형체(들)을 생성하며, 인간의 SNAP25 프리-mRNA로 전사되는 유전자의 기능 활성을 억제하는 데 유용하다.
화학식 I의 화합물을 서술하는 데 사용된 조건인 “n은 10과 25 사이의 정수이며”의 의미는 문자 그대로 “n은 정수 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 그리고 24 중에서 선택된다"는 것이다.
3' 스플라이스 위치를 표적하는 화학식 I의 화합물은 인간 SNAP25 유전자에서 [접속 NCBI 참고 서열: NG_029626.1] 유래된 인간 SNAP25 프리-mRNA에서 "엑손 7"의 3' 스플라이스 위치에 상보적으로 결합한다. 인간 SNAP25 프리-mRNA에서 "인트론 6"과 "엑손 7"의 연결 부위에 걸쳐있는 [(5'→3') AUCCCAGGGUAACA] 14-머 서열은, 7-머는 "인트론 6"로 그리고 7-머는 "엑손 7"로 구성되는 3' 스플라이스 위치이다. 즉 14-머 프리-mRNA는 전통적으로 [(5'→3') aucccag┃GGUAACA]로 표시되는 데, 여기서 소문자는 인트론을 그리고 대문자는 엑손을 각각 나타내며, “┃”는 인트론과 엑손의 연결 부분을 나타낸다. 프리-mRNA의 전통적인 표기 방법은 인간 SNAP25 프리-mRNA에서 "인트론 6"과 "엑손 7"의 연결 부위에 걸쳐있는 30-머 서열의 [(5'→3') cucuuuggaucccag┃GGUAACAAAUGAUGC]로 더 폭 넓게 예시된다. 엑손의 번호는 SNAP25 mRNA 전사물에 따라 변하기도 하기 때문에, 위의 30-머의 SNAP25 서열은 인간 SNAP25 mRNA의 엑손 번호와 관계없이 화학식 I 화합물의 표적 스플라이스 위치를 분명하게 확인하기 위하여 제공되었다.
화학식 I의 PNA 유도체에 포함되는 천연 (자연에 존재하는) 핵산 염기나 비천연 (자연에 존재하지 않는) 핵산 염기의 구조는 도 5에 예시되어 있다. 본 발명의 천연 또는 비천연 핵산 염기는 도 5에서 제공된 핵산 염기들로 구성되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다. 제공되는 천연 혹은 비천연 핵산염 기들은 단지 화학식 I의 화합물에 허용되는 핵산 염기들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다.
화학식 I의 PNA 유도체를 설명하기 위한 치환체들이 도 6A에서 도 6E에 예시된다. 치환체가 있거나 없는 알킬은 도 6A에 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실은 도 6B에 예시된다. 도 6C에는 치환된 알킬아미노, 치환된 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐이 예시된다. 도 6D에는 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐의 예들이 제공된다. 도 6E에는 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐이 제공된다. 제공되는 치환체들은 단지 치환체들의 화학식 I의 화합물에 허용되는 치환체들의 다양성을 보여주기 위한 것이며, 따라서 본 발명의 범위를 도 6A에서 6E에 예시된 치환체들로 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 PNA 올리고뉴클레오티드가 표적 프리-mRNA 서열에 서열 특이적 결합을 할 때 N-말단과 C-말단의 치환체들 보다는 PNA 올리고뉴클레오티드 서열이 더 중요하다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 [PCT/KR2009/001256] 화학식 I의 화합물은 상보적인 DNA에 강하게 결합한다. 화학식 I의 PNA 유도체와 전체 길이의 DNA나 RNA와의 듀플렉스는 너무 높은 Tm 값을 가지고 있어서 완충 수용액에서 확실하게 측정하기 어렵다. 화학식 I의 PNA 유도체와 상보적인 짧은 길이의 DNA와도 높은 Tm 값을 나타낸다.
화학식 I의 화합물은 인간 SNAP25 유전자에서 전사된 인간 SNAP25 프리-mRNA의 표적 3' 스플라이스 위치에 강하게 결합하여, 화학식 I의 화합물이 표적하는 엑손이 포함된 "초기 스플라이스오솜 복합체"의 형성을 방해한다. 본 발명의 화합물이 "초기 스플라이스오솜 복합체"의 형성을 입체적으로 방해하기 때문에, SNAP25 "엑손 7"이 잘려져 나가서 "엑손 7"이 결여된 SNAP25 mRNA 스플라이스 변형체가 생성된다. 결과적으로, 본 발명의 화합물은 SNAP25 "엑손 7"의 스키핑을 유도한다.
본 발명의 화합물이 상보적인 프리-mRNA 서열에 강하게 결합하기 때문에, 상보적인 프리-mRNA 서열과 한두 개의 부정합을 갖는 본 발명의 화합물도 강하게 결합하여 SNAP25 프리-mRNA내에 있는 표적 엑손의 스키핑을 유도한다.
선행 기술에 예시된 바와 같이 [PCT/KR2009/001256] 화학식 I의 화합물은 세포투과성이 우수해서 올리고뉴클레오티드 "그 자체"도 세포 내에 쉽게 전달된다. 즉 본 발명의 화합물을 올리고뉴클레오티드 "그 자체"로 세포에 처리하면, SNAP25 프리-mRNA에서 "엑손 7"의 스키핑을 유도하여 SNAP25 "엑손 7"이 결여된 SNAP25 mRNA 스플라이스 변형체가 생성된다. 화학식 I의 화합물은 세포에서 표적 엑손의 스키핑을 강력하게 유도하기 위해 세포로 전달하기 위한 어떠한 수단이나 제제가 필요하지 않다. 본 발명의 화합물 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"를 펨토몰 이하의 농도로 세포에 처리하면, 화학식 I의 화합물은 SNAP25 "엑손 7"의 스키핑을 잘 유도한다.
우수한 세포 혹은 막 투과성으로 인하여 화학식 I의 PNA 유도체는 올리고뉴클레오타이드 "그 자체"를 국부적으로 투여하여 표적 피부에서 SNAP25 "엑손 7"의 스키핑을 유도할 수 있다. 화학식 I의 화합물은 원하는 치료적 혹은 생물학적 활성을 위한 표적 조적으로의 피부 전달을 증가시키기 위해 제제가 필요하지 않다. 화학식 I의 화합물은 보통 물과 조용매에 녹여서, 투여 부위 근처 피부에서 원하는 치료적 혹은 생물학적 활성을 나타내기 위해 피코몰 이하를 국부 혹은 경피 투여한다. 본 발명의 화합물은 국부 치료 활성을 나타내기 위해 강한 혹은 침습성의 제제를 할 필요가 없다.
화학식 I의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기와 같이 사용될 수 있는데, 약제학적으로 허용 가능한 산이나 염기는 수산화 나트륨 (sodium hydroxide), 수산화 칼륨 (potassium hydroxide), 염산 (hydrochloric acid), 메탄설폰산 (methanesulfonic acid), 구연산 (citric acid), 그리고 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid) 등을 포함하나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니다.
화학식 I의 PNA 유도체나 약제학적으로 허용 가능한 염은 약제학적으로 허용 가능한 보조제 (adjuvant)와 함께 투약될 수 있는데, 이러한 보조제는 구연산, 염산, 주석산 (tartaric acid), 스테아린산, 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol), 폴리프로필렌글리콜 (polypropyleneglycol), 에탄올, 이소프로판올 (isopropanol), 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate), 증류수, 그리고 방부제 (preservative) 등을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물은 치료적 혹은 생물학적으로 효과적인 농도인 1 아토몰 (1 aM, 10-18 M)에서 1 나노몰 (1 nM) 이상의 농도로 국부 투여를 할 수 있는데, 그 농도는 투여 일정이나 대상자의 질환 및 증상 등에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 바람직한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SNAP25 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 중수소, 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
X와 Y는 수소, 포밀, 아미노카보닐, 아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 수소, 하이드록시, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시, 치환체가 있거나 없는 아미노, 치환체가 있거나 없는 알킬, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴 중에서 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산 염기를 연결시켜 준다:
[화학식 Ⅴ]
화학식 V 중에서,
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌 (-CH2-)이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소(-O-), 황(-S-), 그리고 치환체가 있거나 없는 아미노 [-N(H)- 또는 -N(치환체)-] 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 15 사이의 정수이다.
화학식 V를 설명하는 조건인 "m은 1에서 15 사이의 정수"의 의미는 문자 그대로 m은 정수 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 그리고 14 중에서 선택된다는 것이다.
본 발명의 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 21 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SNAP25 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 치환체가 있거나 없는 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 치환체가 있거나 없는 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 11 사이의 정수이다.
본 발명의 특히 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SNAP25 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌, 산소, 그리고 아미노 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 9 사이의 정수이다.
본 발명의 매우 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SNAP25 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R3, 그리고 R5는 수소이고, R2, R4, 그리고 R6는 수소 및 치환체가 있거나 없는 알킬 중에서 각각 독립적으로 선택되며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 8 사이의 정수이다.
본 발명의 매우 더 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SNAP25 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
Q1과 Qm은 메틸렌이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, …, 그리고 Qm-1은 메틸렌 및 산소 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 8 사이의 정수이다.
본 발명의 가장 중요한 PNA 유도체는 다음과 같은 조건을 갖는 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SNAP25 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X는 수소이며;
Y는 치환체가 있거나 없는 알킬아실, 치환체가 있거나 없는 아릴아실, 그리고 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐 중에서 각자 독립적으로 선택되나 꼭 이들에 한정되는 것은 아니며;
Z는 치환체가 있거나 없는 아미노이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, 또는 -CH2-O-(CH2)5- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
L2와 L3는 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, 그리고 -(CH2)2-O-(CH2)3- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다.
특별히 중요한 것으로서 다음 화합물들 중에서 선택된 화학식 I의 PNA 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2;
(N→C) Fethoc-A(6)TC-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2;
(N→C) Piv-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2;
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(2O2)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH2;
(N→C) Fmoc-Lys-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)T-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-Lys-Leu-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(2O2)T-Lys-NH2;
(N→C) H-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(3)G-A(5)T-NH2;
(N→C) Benzoyl-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-Val-Lys-NH2;
(N→C) Benzoyl-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O3)T-GG(5)G-A(5)T-NH2;
(N→C) n-Hexanoyl-TG(5)T-TA(8)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2;
(N→C) n-Propyl-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2;
(N→C) Ac-TG(5)T-TA(6)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(5)-NH2;
(N→C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-TG(5)T-TA(4)C-CC(1O2)T- GG(5)G-A(5)T-NH2;
(N→C) n-Propyl-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2;
(N→C) FAM-HEX-HEX-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2;
(N→C) n-Propyl-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-Arg-NH2;
(N→C) n-Benzoyl-Gly-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2;
(N→C) N-Me-N-Phenyl-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(5)T-NH2;
(N→C) p-Toluenesulfonyl-TG(2O3)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-Lys-NH2
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2;
(N→C) Bezenesulfonyl-TG(5)T-TA(2O3)C-CC(1O5)T-GG(5)G-A(6)T-NH2;
(N→C) Phenyl-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)G-TA(5)C-C(1O2)CT-TG(5)G-A(5)T-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(5)T-AA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)T-A(5)T-NH2;
(N→C) Fethoc-TG(6)T-TA(3)C-CC(1O5)T-GG(6)G-A(3)T-NH2;
(N→C) Fethoc-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH2;
(N→C) Benzyl-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH2;
(N→C) Fethoc-GTT-A(3)CC(1O5)-CTG(6)-GGA(3)-TC(1O5)-NH2;
(N→C) Fethoc-TA(5)C-C(1O2)CT(1O5)-GG(5)G-A(5)TC-C(1O2)A-NH2;
(N→C) Fmoc-Leu-TA(4)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(4)TC-C(1O3)A-NH2;
(N→C) Fethoc-C(1O2)AT-TTG(6)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(6)-NH2;
(N→C) Fethoc-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(5)C-C(1O2)CT-G(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-CA(6)T-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-A(5)TT-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2; 그리고
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-G(5)G-NH2:
상기에서,
A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산 염기인 아데닌, 구아닌, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이다;
C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII, 화학식 IX, 또는 화학식 X으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다:
상기에서,
p와 q는 정수이며; 그리고,
N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fmoc-"는 "[(9-플루오레닐)메틸옥시]카보닐]-"에 대한 약어이고; "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; "Ac-"는 "아세틸-"; " Benzoyl-"은 "벤젠카보닐-"; "Piv-"는 "피발릴-"; "n-Propyl-"은 1-(n-프로필)-"; "H-"는 "하이드리도-" 기; "p-Toluenesulfonyl"은 "(4-메틸벤젠)-1-설포닐-"; "-Lys-"는 아미노산 잔기 "리신"; "-Val-"은 아미노산 잔기 "발린"; "-Leu-"는 아미노산 잔기 "류신"; "-Arg-"는 아미노산 잔기 "아르기닌"; "-Gly-"는 아미노산 잔기 "글리신"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-"은 "[N-1-(2-페닐에틸)아미노]카보닐-"; "Benzyl-"은 "1-(페닐)메틸-"; "Phenyl-"은 "페닐-"; "Me-"는 "메틸-";"-HEX-"은 "6-아미노-1-헥사노일-", "FAM-"은 "5, 또는 6-플로레신카보닐- (이성체 혼합물)"; "-NH2"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다.
A, G, T, C, C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)로 약기된 PNA 모노머들에 대한 화학 구조를 총괄하여 도 7에 제공한다. 종래 기술 [PCT/KR2009/001256]에서 논의된 바와 같이, C(pOq)는 "구아닌"과 상보결합하기 때문에 "변형된 시토신" PNA 모노머로 인식된다. A(p) 및 A(pOq)는 "티민"에 강한 결합력을 갖기 때문에 "변형된 아데닌" PNA 모노머로 인식된다. 마찬가지로 G(p) 및 G(pOq)는 "시토신"과 생산적인 염기 쌍을 이루므로 "변형된 구아닌" PNA 모노머로 인식된다.
본 발명에서 화학식 I의 PNA 유도체의 N-말단 또는 C-말단의 다양화에 사용된 치환체들에 대한 다양한 약어들의 화학 구조를 도 8에 제공한다.
PNA 유도체들의 약자들을 분명히 보여주기 위해, 약자로 씌여진 14-머 PNA 유도체 "(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T- NH2"의 화학 구조가 도 9에 제공된다. 또 다른 예시로서 약자로 씌여진 15-머 PNA 유도체 "(N→C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT- AA(2O2)C-NH2" 의 화학 구조가 도 10에 제공된다.
"(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)- NH2"의 16-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5'→3') ATT-TGT-TAC-CCT-GGG-A"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 16-머 PNA는, 인간 SNAP25 프리-mRNA에서 "인트론 6"과 "엑손 7"의 연결 부위에 걸쳐 있는 [(5'→3') cucuuugga ucccag ┃ GGUAACAAAU GAUGC]의 30-머 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분의 인간 SNAP25 프리-mRNA와 16-머 상보성 오버랩을 한다.
"(N→C) Fmoc-Leu-TA(4)C-C(1O3)CT-GG(5)G-A(4)TC-C(1O3)A- NH2"의 14-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5'→3')TAC-CCT-GGG-ATC-CA"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 14-머 PNA는, [(5'→3') cucuu uggaucccag ┃ GGUA ACAAAUGAUGC]의 30-머 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분의 인간 SNAP25 프리-mRNA와 14-머 상보성 오버랩을 한다.
"(N→C) Fethoc-A(6)TC-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)- NH2"의 16-머 PNA 서열은 프리-mRNA에의 상보성 결합을 위한 "(5'→3') ATC-TGT-TAC-CCT-GGG-A"의 DNA 서열에 상응한다. 상기 16-머 PNA는, [(5'→3') cucuuugga ucccag ┃ GGUAACA "A" AU GAUGC]의 30-머 프리-mRNA 서열에서 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분의 인간 SNAP25 프리-mRNA와 15-머 상보성 오버랩을 하며, 한 개의 부정합은 인용 부호로 (" ") 표시된다. 이 16-머 PNA는 "엑손 7"에 한 개의 부정합을 가지며 SNAP25 "엑손 7"의 3' 스플라이스 위치와 부분적으로 상보적인 결합을 한다.
도 1A. 두 이웃한 신경세포 사이의 신경근 접합부에서 일어나는 외포작용의 도식화.
도 1B. 신경 축삭돌기와 근육 세포 사이의 시냅스 접합부에서 일어나는 외포작용의 도식화.
도 2A. 시냅스 소포성 막과 축삭돌기 원형질막 융합의 도식화.
도 2B. 프리-mRNA에서 인트론과 엑손의 번호 붙이기 예시.
도 3A. 인트론 N을 제거하는 스플라이싱 과정의 도식화.
도 3B. 스플라이스오솜 E 복합체에 대한 3' 스플라이스 위치와 5' 스플라이스 위치의 도식화.
도 4A. DNA와 대표적인 비천연 올리고뉴클레오타이드의 화학 구조.
도 4B. PNA의 화학 구조와 축약된 명명법.
도 4C. PNA의 세포 투과성을 향상시키기 위해 개발된 변형된 핵산 염기의 예.
도 5. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 천연 혹은 비천연 (변형된) 핵산 염기의 예.
도 6A. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬의 예.
도 6B. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실의 예.
도 6C. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 치환된 알킬아미노, 치환된 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐의 예.
도 6D. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐의 예.
도 6E. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐의 예.
도 7. A (아데닌), G (구아닌), T (티민), C (시토신), C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)로 축약된 PNA 모노머의 화학 구조.
도 8. N-말단 혹은 C-말단 치환체의 약자 및 화학 구조.
도 9. "(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2"로 축약된 14-머 PNA 유도체의 화학 구조.
도 10. "(N→C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C- NH2"로 축약된 15-머 PNA 유도체의 화학 구조.
도 11. 본 발명의 PNA 유도체를 합성하는 데 사용된 Fmoc-PNA 모노머 예의 화학 구조.
도 12. 본 발명의 SPPS에서 전형적인 모노머 신장주기의 도식화.
도 13A. "ASO 1"의 정제 전 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 13B. "ASO 1"의 정제 후 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 14. HPLC로 정제한 "ASO 1"의 ES-TOF 질량 스펙트럼 데이터.
도 15A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 3"을 처리한 PC12 세포에서 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터 (위); 전체 길이 mRNA와 엑손 스키핑을 한 스플라이스 변형체 mRNA에 대한 PCR 산물의 증폭 길이를 보여주는 도표 (아래).
도 15B. 엑손 5-7의 스키핑으로 판명된 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 16A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 3"을 처리한 PC12 세포에서 전체 길이 SNAP25 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 16B. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 1"을 처리한 PC12 세포에서 전체 길이 SNAP25 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 17A. 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM 혹은 10 aM의 "ASO 3"을 48시간 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터 (위 도표); β-액틴에 대해 정규화한 상대적인 SNAP25 발현량 (아래 도표).
도 17B. 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 1"을 48시간 혹은 72시간 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터.
도 18. 0 (음성 대조용), 1, 10 혹은 100 fM의 " ASO 1"을 4일 동안 하루에 2번 국소 투여한 쥐의 피부 샘플에 대한 SNAP25 IHC 이미지.
도 19A. 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM 혹은 100 aM의 " ASO 3"을 48시간 처리한 SiMa 세포에서 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터와 (위 도표) β-액틴에 대해 정규화된 상대적인 SNAP25 발현량 (아래 도표).
도 19B. 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM, 혹은 100 aM 의 "ASO 3"을 처리한 SiMa 세포에서 전체 길이 인간 SNAP25 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 1B. 신경 축삭돌기와 근육 세포 사이의 시냅스 접합부에서 일어나는 외포작용의 도식화.
도 2A. 시냅스 소포성 막과 축삭돌기 원형질막 융합의 도식화.
도 2B. 프리-mRNA에서 인트론과 엑손의 번호 붙이기 예시.
도 3A. 인트론 N을 제거하는 스플라이싱 과정의 도식화.
도 3B. 스플라이스오솜 E 복합체에 대한 3' 스플라이스 위치와 5' 스플라이스 위치의 도식화.
도 4A. DNA와 대표적인 비천연 올리고뉴클레오타이드의 화학 구조.
도 4B. PNA의 화학 구조와 축약된 명명법.
도 4C. PNA의 세포 투과성을 향상시키기 위해 개발된 변형된 핵산 염기의 예.
도 5. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 천연 혹은 비천연 (변형된) 핵산 염기의 예.
도 6A. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬의 예.
도 6B. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬아실과 치환체가 있거나 없는 아릴아실의 예.
도 6C. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 치환된 알킬아미노, 치환된 아릴아미노, 치환체가 있거나 없는 아릴, 치환체가 있거나 없는 알킬설포닐, 치환체가 있거나 없는 아릴설포닐, 치환체가 있거나 없는 알킬포스포닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴포스포닐의 예.
도 6D. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴옥시카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴아미노카보닐의 예.
도 6E. 화학식 I의 펩타이드 핵산 유도체를 위하여 선택될 수 있는, 치환체가 있거나 없는 알킬아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 아릴아미노티오카보닐, 치환체가 있거나 없는 알킬옥시티오카보닐, 그리고 치환체가 있거나 없는 아릴옥시티오카보닐의 예.
도 7. A (아데닌), G (구아닌), T (티민), C (시토신), C(pOq), A(p), A(pOq), G(p), 그리고 G(pOq)로 축약된 PNA 모노머의 화학 구조.
도 8. N-말단 혹은 C-말단 치환체의 약자 및 화학 구조.
도 9. "(N→C) Fethoc-GA(5)A-C(1O2)TT-A(5)TC-CTA(5)-C(1O2)T-NH2"로 축약된 14-머 PNA 유도체의 화학 구조.
도 10. "(N→C) Fmoc-Val-CTC(1O2)-A(5)TC-CTA(6)-C(1O3)TT-AA(2O2)C- NH2"로 축약된 15-머 PNA 유도체의 화학 구조.
도 11. 본 발명의 PNA 유도체를 합성하는 데 사용된 Fmoc-PNA 모노머 예의 화학 구조.
도 12. 본 발명의 SPPS에서 전형적인 모노머 신장주기의 도식화.
도 13A. "ASO 1"의 정제 전 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 13B. "ASO 1"의 정제 후 C18-역상 HPLC 크로마토그램.
도 14. HPLC로 정제한 "ASO 1"의 ES-TOF 질량 스펙트럼 데이터.
도 15A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 3"을 처리한 PC12 세포에서 중첩 PCR 산물의 전기영동 데이터 (위); 전체 길이 mRNA와 엑손 스키핑을 한 스플라이스 변형체 mRNA에 대한 PCR 산물의 증폭 길이를 보여주는 도표 (아래).
도 15B. 엑손 5-7의 스키핑으로 판명된 PCR 산물 밴드의 생거 서열분석 데이터.
도 16A. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 3"을 처리한 PC12 세포에서 전체 길이 SNAP25 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 16B. 0 (음성 대조용), 10, 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 1"을 처리한 PC12 세포에서 전체 길이 SNAP25 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
도 17A. 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM 혹은 10 aM의 "ASO 3"을 48시간 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터 (위 도표); β-액틴에 대해 정규화한 상대적인 SNAP25 발현량 (아래 도표).
도 17B. 0 (음성 대조용), 100 혹은 1,000 zM의 "ASO 1"을 48시간 혹은 72시간 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터.
도 18. 0 (음성 대조용), 1, 10 혹은 100 fM의 " ASO 1"을 4일 동안 하루에 2번 국소 투여한 쥐의 피부 샘플에 대한 SNAP25 IHC 이미지.
도 19A. 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM 혹은 100 aM의 " ASO 3"을 48시간 처리한 SiMa 세포에서 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터와 (위 도표) β-액틴에 대해 정규화된 상대적인 SNAP25 발현량 (아래 도표).
도 19B. 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM, 혹은 100 aM 의 "ASO 3"을 처리한 SiMa 세포에서 전체 길이 인간 SNAP25 mRNA 양의 변화 (표준 오차에 의한 에러 바).
PNA 올리고머를 합성하는 일반적인 방법
PNA 올리고머는 선행 기술 [US6,133,444; WO96/40685]에 공개된 방법으로, 필요하면 이를 약간 변형하여 Fmoc-화학에 기반한 고체상 펩타이드 합성 (SPPS: solid phase peptide synthesis)에 의해 합성하였다. 상기 연구에 사용된 고체 지지체는 PCAS 바이오매트릭스 인코포레이티드로부터 (PCAS BioMatrix Inc., 캐나다 퀘백 소재) 구입한 H-링크 아미드-켐매트릭스 (H-Rink Amide- ChemMatrix)였다. 변형된 핵산 염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머는 선행 기술에 [PCT/KR 2009/001256] 따라 혹은 약간 변형하여 합성하였다. 변형된 핵산 염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머와 천연 핵산 염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머를 사용하여 본 발명의 PNA 유도체를 합성하였다. 변형된 핵산 염기를 갖는 Fmoc-PNA 모노머는 도 11에 제공된다. 이 분야의 숙련된 전문가들은 PNA 모노머들에 대한 보호기들의 변형을 쉽게 할 수 있을 것이다. 즉, 도 11에 제공되는 Fmoc-PNA 모노머들은 단지 예들로서 받아들여져야 하며, 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다. PNA 올리고머는 C18-역상 HPLC로 (0.1% TFA가 포함된 물/아세토니트릴 또는 물/메탄올) 정제하고 ESI/TOF/MS와 같은 질량 분광분석법에 의해 특성화하였다.
도 12는 본 발명의 SPPS에서의 전형적인 모노머 신장주기 (elongation cycle)를 예시하며, 합성 세부사항을 하기와 같이 제공한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에게는 자동 펩타이드 합성기 또는 수동 펩타이드 합성기 상에서 상기와 같은 SPPS 반응을 유효하게 실행함에 있어서 명백하게 가능한 작은 변화들이 다수 존재한다. 각 반응 단계들이 하기와 같이 제공된다.
[H-링크-캠마트릭스 레진의 활성화] 0.01 mmol (약 20 mg) 켐매트릭스 레진과 1.5 mL 20% 피페리딘/디메틸포름아미드(DMF)가 혼합된 현탁액을 리브라 튜브에서 20분간 보텍싱 (vortexing)후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL 메틸렌클로라이드 (MC), 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나면, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머나 Fmoc으로 보호된 아미노산과 반응할 준비가 완료된다.
[Fmoc 제거 (DeFmoc)] 0.01 mmol (약 20 mg) 레진과 1.5 mL 20% 피페리딘/DMF가 혼합된 현탁액을 7분간 보텍싱 후 DeFmoc 용액을 여과해서 제거한다. 레진을 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척하고 나서, 레진의 아민은 Fmoc으로 보호된 PNA 모노머와 즉시 반응을 시킨다.
[Fmoc-PNA 모노머와의 커플링 (Coupling)] 레진의 아민은 다음과 같은 방법으로 Fmoc-PNA 모노머와 커플링된다. 0.04 mmol Fmoc-PNA 모노머, 0.05 mmol HBTU [2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트], 그리고 10 mmol DIEA 등을 1 mL 무수 DMF에 녹인 다음, 2분 후에 그 용액을 레진의 아민에 가한다. 레진 현탁액을 1 시간 동안 보텍싱 후 용액은 여과해서 제거하고, 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.
[캡핑 (Capping)] 커플링 반응 후에 반응하지 않은 아민은 1.5 mL 캡핑 용액 (capping solution, 5% 아세틱안하이드라이드와 6% 2,6-루티딘의 DMF 용액)에서 5분간 반응을 통하여 캡핑(capping)된다. 캡핑 용액을 여과하여 제거한 후 레진은 1.5 mL MC, 1.5 mL DMF, 그리고 1.5 mL MC로 각각 30초간 세척한다.
[N-말단에 "Fethoc"기 도입] 일반적인 염기성의 커플링 조건에서 "Fethoc-OSu"와 반응하여 레진의 N-말단 아민에 "Fethoc"기가 도입되는 데, "Fethoc-OSu"의 [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, MW 351.36] 화학적 구조는 다음과 같이 제공된다.
[레진으로부터 분리] 레진에 결합되어있는 PNA 올리고머는 1.5 mL 분리 용액 (cleavage solution, 2.5% 트리이소프로필실란과 2.5% 물의 트리플루오로아세틱산 용액)에서 3 시간 동안 반응하여 레진에서 분리된다. 레진을 여과하여 제거하고 여과액을 저압을 이용해서 농축한다. 잔사를 에테르(diethylether)로 처리하여 얻은 고체를 여과하여 수득한 다음, 역상 HPLC로 정제한다.
[HPLC 분석 및 정제] 레진에서 분리된 PNA 유도체의 조생성물 (crude product)은 0.1% TFA가 포함된 물/아세토니트릴이나 물/메탄올을 용리제로 사용하여 구배 방법의(gradient method) C18-역상 HPLC로 정제한다. 도 13A와 13B는 각각 " ASO 1"의 정제 전과 후의 C18-역상 HPLC 크로마토그램의 예시이다. " ASO 1"의 서열은 표 1에 제공된다.
화학식 I의 PNA 유도체에 대한 합성 예
인간 SNAP 25 프리-mRNA에서 "엑손 7"의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하기 위하여, 본 발명의 PNA 유도체를 위의 방법을 따라서 혹은 부분적인 수정을 통하여 합성하였다. 인간 SNAP 25 프리-mRNA를 표적하는 PNA 유도체들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체들을 예시하기 위함이며 따라서 본 발명의 범위를 한정하는 방향으로 해석하지 않아야 한다.
표 1에서 인간 SNAP 25 프리-mRNA에서 "엑손 7"의 3' 스플라이스 위치를 상보적으로 표적하는 PNA 유도체들과 질량 분광분석법에 의해 특성화한 데이터를 함께 제공한다. 표 1에서 SNAP25 ASO들을 제공하는 것은 화학식 I의 PNA 유도체를 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
PNA 예 | PNA 서열 (N→C) | 정확한 질량, m/z | |
theor.a | obs.b | ||
ASO 1 | Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G- A(6)-NH2 |
5190.39 | 5188.38 |
ASO 2 | Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2 | 4266.93 | 4266.95 |
ASO 3 | Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2 | 4533.03 | 4533.04 |
ASO 4 | Fethoc-TG(5)G-TA(5)C-C(1O2)CT-TG(5)G-A(5)T-NH2 | 4519.01 | 4518.95 |
ASO 5 | Fethoc-TG(6)T-TA(3)C-CC(1O5)T-GG(6)G-A(3)T-NH2 | 4533.03 | 4533.04 |
ASO 6 | Fethoc-G(5)TT-A(5)CC(1O2)-CTG-G(5)GA(5)-TC(1O2)-NH2 | 4601.07 | 4601.08 |
ASO 7 | Fethoc-C(1O2)AT-TTG(6)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(6)-NH2 | 4478.98 | 4478.99 |
ASO 8 | Fethoc-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)-TG(5)-NH2 | 4468.02 | 4468.04 |
ASO 9 | Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(5)C-C(1O2)CT-G(5)-NH2 | 4216.91 | 4216.93 |
ASO 10 | Fethoc-CA(6)T-CA(6)T-TTG(5)-TTA(5)-CCC(1O2)- TG(5)-NH2 | 5374.45 | 5374.44 |
ASO 11 | Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(5)-NH2 | 5188.36 | 5188.35 |
ASO 12 | Fethoc-A(6)TT-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-G(5)G-NH2 | 4522.04 | 4522.05 |
ASO 13 | Fethoc-A(5)TT-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)-NH2 | 5160.33 | 5160.31 |
ASO 14 | p-Toluenesulfonyl-TG(2O3)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G- A(5)T-Lys-NH2 | 4581.03 | 4581.05 |
ASO 15 | n-Hexanoyl-TG(5)T-TA(8)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2 | 4423.05 | 4423.03 |
ASO 16 | Fethoc-Lys-Leu-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)G-A(2O2)T-Lys-NH2 | 4890.27 | 4890.27 |
ASO 17 | [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-TG(5)T-TA(4)C-CC(1O2)T- GG(5)G-A(5)T-NH2 | 4415.98 | 4416.14 |
ASO 18 | H-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O2)T-GG(3)G-A(5)T-NH2 | 4254.90 | 4254.64 |
ASO 19 | n-Propyl-TG(2O2)T-TA(5)C-CC(2O2)T-GG(5)G-A(5)T-NH2 | 4340.97 | 4341.03 |
ASO 20 | Fethoc-TG(5)T-AA(5)C-CC(1O2)T-GG(5)T-A(5)T-NH2 | 4503.02 | 4503.04 |
ASO 21 | N-Me-N-Phenyl-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O5)T-GG(5)G- A(5)T-NH2 | 4415.03 | 4415.00 |
ASO 22 | Benzoyl-TG(5)T-TA(5)C-CC(1O3)T-GG(5)G-A(5)T-NH2 | 4400.97 | 4401.44 |
a) 이론상 정확한 질량, b) 관측된 정확한 질량도 13A는 "ASO 1" 조생성물의 HPLC 크로마토그램이다. 조생성물은 C18-역상 대용량 HPLC로 정제하였다. 도 13B는 정제된 "ASO 1"의 HPLC 크로마토그램인 데, 대용량 HPLC 정제로 "ASO 1"의 순도가 많이 향상되었다. 도 14는 정제된 "ASO 1"의 ESI-TOF 질량 분석 스팩트럼을 제공한다. "ASO 1"의 분석 데이터를 제공하는 것은 본 발명에서 화학식 I의 PNA 유도체를 정제하고 특성화하는 방법을 예시하기 위함이며 본 발명의 범위를 한정하기 위함이 아니다.
상보적인 DNA에 대한 모델 PNA 유도체의 결합력 (Binding Affinity)
표 1의 PNA 유도체와 N-말단이나 C-말단을 상보적으로 표적하는 10-머 DNA의 결합력을 평가하였다. PNA와 상보적인 10-머 DNA의 듀플렉스에 대한 Tm 값으로 결합력을 평가하였다. 표 1의 PNA 유도체와 완전히 상보적인 DNA의 듀플렉스에 대한 Tm 값은 너무 높아서, Tm 값 측정 중에 완충 수용액이 끓는 경향이 있기 때문에 완충 수용액에서 확실하게 측정하기 힘들다.
Tm 값은 UV/가시광선 분광 광도계를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 15 mL 폴리프로필렌 팔콘 튜브 (falcon tube)에서 4 μM PNA 올리고머와 4 μM의 상보적인 10-머 DNA를 완충 용액 (pH 7.16, 10mM 소듐 포스페이트, 100mM NaCl)에 섞은 후, 90oC에서 일 분간 인큐베이션하고 상온으로 서서히 냉각시켰다. 이 용액을 3 mL 석영 큐벳 (Quartz Cuvette)에 옮기고 잘 봉인한 후 UV/가시광선 분광 광도계에 장착하고, 종래 기술 [PCT/KR 2009/001256]에 기재된 바와 같이 혹은 이를 약간 변형하여 260 nm에서 Tm을 측정하였다. Tm 측정에 사용된 10-머 DNA는 (주)바이오니아 (www.bioneer.com, 대한민국 대전직할시)로부터 구매하여 별도의 정제 없이 사용되었다.
화학식 I의 PNA 유도체와 상보적인 10-머 DNA의 Tm 값은 매우 높은 데, 수정되지 않은 데이터가 표 2에 제공된다. 예를 들면, "ASO 3"와 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분의 [(N→C) Fethoc- TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-G G(5)G-A(6)T-NH2] PNA의 N-말단 10-머를 표적하는 DNA의 듀플렉스는 77.3oC의 Tm 값이 관찰되었다. 반면에, "ASO 3"와 "진하게" "밑줄그어" 표시한 부분의 [(N→C) Fethoc-TG(5)T-T A(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T -NH2] PNA의 C-말단 10-머를 표적하는 DNA의 듀플렉스는 88.7oC의 Tm 값이 관찰되었다.
PNA | Tm 값, oC | |
N-말단 10-머 DNA | C-말단 10-머 DNA | |
ASO 2 | 76.0 | 87.6 |
ASO 3 | 77.3 | 88.7 |
ASO 4 | 83.0 | 77.0 |
ASO 5 | 73.0 | 85.8 |
ASO 6 | 84.0 | 91.8 |
ASO 8 | 58.0 | 68.0 |
ASO 9 | 62.0 | 76.0 |
ASO 10 | 61.0 | 68.0 |
ASO 12 | 62.0 | 74.0 |
화학식 I의 PNA 유도체의 생물학적 활성에 대한 예
표 1에 명시된 화학식 I의 PNA 유도체에 대하여, 쥐에서 기원하는 PC12 세포에서와 인간에서 기원하는 SiMa 세포에서 안티센스 활성을 평가하였고, 국부 투여한 C57BL/6 쥐의 피부에서 SNAP25의 발현을 억제하는 정도를 평가하였다. 화학식 I의 PNA 유도체의 안티센스 활성을 예시하기 위하여 생물학적 예들이 제공되며, 본 발명의 범위를 표 1에 실린 화합물들로 한정하기 위함이 아니다.
실시예 1. "ASO 3"에 의해 유도된 엑손 스키핑.
표 1에 명시된 "ASO 3"은 인간 SNAP25 프리-mRNA 중 "인트론 6" 및 "엑손 7"의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 14-머 ASO이다. "ASO 3"은 [(5' 3') cucuuugg aucccag ┃ GGUAACA AAUGAU- GC]의 30-머 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 14-머 서열과 상보성 결합을 한다. "ASO 3"은 "인트론 6"과 7-머 결합을 하고 "엑손 7"과 7-머 결합을 한다.
반면에, "ASO 3"은 쥐 유전체 DNA에서 유래한 [접속 NCBI 참고 서열: NC_005012] 쥐 SNAP25 프리-mRNA에서, [(5' 3') ugg"c" ucccag ┃ GGUAACA AACGAUGC]의 25-머 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같이 13-머의 상보성 결합을 하는 데, 한 개의 부정합은 인용 부호로 (" ") 표시하였다.
"ASO 3"이 PC12 세포에서 (Cat. Number CRL-1721, ATCC) 엑손 스키핑을 유도하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] PC12 세포를, 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 RPMI 1640 배양액에 5% 소 혈청 (FBS, Fetal Bovine Serum), 10% 말 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 파이루베이트를 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 세포 배양한 다음 "ASO 3"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도로 처리하였다.
[RNA 추출 및 원스텝 PCR에 의한 cDNA합성] 42시간의 배양 후에, 리보솜에 의한 번역을 억제하기 위해 세포를 100 μg/mL 사이클로헥시미드로 6시간 동안 처리하였다. 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)"(Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 1_순방향: (5' 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; 및 엑손 14_역방향: (5' 3') AGCATCTTTGTTGCACGTTG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 플래티늄 (platinum®) Taq 폴리머라제 (Cat. No. 10928-042, 인비트로젠 (Invitrogen))를 갖는 슈퍼스크립트(Super Script®) 원스텝(One-Step) RT-PCR 키트를 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 40 주기의 94oC 30초, 50oC 30초 및 72oC 1분.
[네스티드 PCR 증폭] 1 μL의 cDNA를, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 1_순방향: (5' 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; 및 엑손 14n_역방향: (5' 3') TTGTTGGAGTCAGCGCCT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 μL 네스티드 PCR 반응(Cat. No. K2612, 바이오니어)에서 추가로 증폭시켰다: 95oC 2분에 이어서, 34 주기 95oC 30초, 55oC 30초 및 72oC 1분.
[엑손 스키핑 생성물의 확인] 상기 PCR 산물에 대해 2% 아가로스 젤 상에서 전기영동 분리를 수행하였다. 타겟 크기에 따라 밴드들을 수집하고 생거 서열분석에 의해 분석하였다.
도 15A에서는 PCR 산물의 전기영동 데이터를 제공하는 데, 10 zM ASO 투여군에서 엑손 5-7 스키핑으로 해석할 수 있는 희미한 PCR 밴드가 생성되었다. 세포를 사이클로헥시미드로 처리하여 전체 길이 mRNA를 불안정화하여 리보솜에 의한 번역을 억제하였지만, 엑손 스키핑 밴드는 희미하게 나타났다. 즉 엑손 5-7 스키핑으로 해석할 수 있는 SNAP25 mRNA 스플라이스 변형체는 전체 길이 mRNA에 비해서 대사 안정성이 나쁜 것으로 보인다. 엑손 스키핑 PCR 산물은 도 15B에 나타난 바와 같이 엑손 5-7 스키핑으로 서열분석되었다. 엑손 6 스키핑으로 해석할 수 있는 PCR 산물이 ASO의 농도와 관계없이 관찰된 것을 보면 엑손 6의 스키핑은 자발적으로 일어나는 것으로 생각된다.
전체 길이 SNAP25 mRNA의 강도는 10 zM "ASO 3"을 처리한 세포에서 가장 많이 감소하였다. ASO의 농도를 10에서 1,000 zM로 증가시킬수록 전체 길이 mRNA의 강도는 점차 음성 대조군의 (ASO를 처리하지 않음) 수준으로 증가하였다. 중첩 PCR 데이터에서 역전된 용량 반응 패턴은 "ASO 3"에 의한 엑손 스키핑 중에 축적된 "엑손 인트론 고리형 RNA (EIciRNA)"에 의한 전사 상향조절 때문일 수도 있다 [Nature Struct. Mol. Biol. vol 22(3), 256-264 (2015)].
실시예 2. "ASO 3"을 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 mRNA의 qPCR 평가.
PC12 세포에서 "ASO 3"이 쥐 SNAP25 mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 SNAP25 중첩 qPCR로 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 PC12 세포에 대해 "ASO 3"을 0 (음성 대조용), 10, 100, 또는 1,000 zM의 농도로 처리하였다 (ASO 농도당 2 배양 접시).
[RNA 추출 및 원스텝 RT-PCR에 의한 cDNA합성] "ASO 3"와 함께 42시간의 배양 후에, 리보솜에 의한 번역을 억제하기 위해 세포를 100 μg/mL 사이클로헥시미드로 6시간 동안 처리하였다. 전체 RNA를 "유니버셜 RNA 익스트랙션 키트 (Universal RNA Extraction Kit)"(Cat. Number 9767, 타카라(Takara))를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 200 ng의 RNA 주형을, 하기의 주기 조건에 따라 [엑손 1_순방향: (5' 3') ATGGCCGAGGACGCAGACA; 및 엑손 14_역방향: (5' 3') AGCATCTTTGTTGCACGTTG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 원스텝 RT-PCR 키트를 (Invitrogen, USA) 사용하여, 25 μL 역전사 반응에 사용하였다: 50oC 30분 및 94oC 2분에 이어서, 20 주기의 94oC 30초, 55oC 30초 및 72oC 1분.
[네스티드 PCR 증폭] 100배 희석한 1 μL의 cDNA 용액을, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 7q_순방향: (5' 3') ATGGATGAAAACCTAGAGC; 및 엑손 8q_역방향: (5' 3') CTTCCCAGCATCTTTGTT]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 20 μL 실시간 PCR 반응을 실시하였다: 95oC 3분에 이어서, 40 주기 95oC 10초 및 60oC 30초. 전체 길이 SNAP25 mRNA를 정량하기 위해 엑손 7과 엑손 8의 연결 부위를 표적하는 택만 탐침을 [(5'→3') 5,6-FAM-CAGCCTTCT-ZEN-CCATGATCCT-3IABkFQ] 이용하여 qPCR 반응을 추적하였다.
도 16A에서 qPCR 데이터를 제공하는 데, 10 zM 및 100 zM의 "ASO 3"을 처리한 세포에서 전체 길이 mRNA의 양이 각각 약 50% 및 20% 유의적으로 (독립표본 T 검정) 감소하였다. 그러나, 1,000 zM의 "ASO 3"를 처리한 세포에서는 전체 길이 mRNA의 양이 ASO를 처리하지 않은 세포에서의 (음성 대조군) 양보다 약간 많았다. qPCR 데이터의 역전된 용량 반응 패턴은 "실시예 1"에서 서술된, 엑손 스키핑 중에 전체 길이 mRNA 양에 대한 용량 반응 패턴과 잘 일치하는 데, ASO의 용량이 10에서 1,000 zM로 증가함에 따라 전사의 상향 조절이 일어난다는 것을 의미한다.
실시예 3. "ASO 1"을 처리한 PC12 세포에서 SNAP25 mRNA의 qPCR 평가.
표 1에 명시된 "ASO 1"은 인간 SNAP25 프리-mRNA 중의 인트론 6 및 엑손 7의 연결 부위에 걸쳐 있는 3' 스플라이스 위치에 완전히 상보적인 16-머 ASO이다. "ASO 1"은 [(5' 3') cucuuugga ucccag ┃ GGUAACAAAU GAUGC]의 30-머 인간 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 16-머 서열과 상보성 결합을 한다. "ASO 1"은 인트론 6과 6-머 결합을 하고 엑손 7과 10-머 결합을 한다. 그러나, "ASO 1"은 [(5'→3') uggc ucccag ┃ GGUAACAAA "C"GAUGC]의 25-머 프리-mRNA 서열 내에 "진하게" "밑줄그어" 표시한 바와 같이 쥐 SNAP25 프리-mRNA와 15-머의 상보성 결합을 하고 한 개의 부정합이 있는 데, 한 개의 부정합은 인용 부호로 (" ") 표시하였다.
별다른 언급이 없으면 "실시예 2"와 같이, PC12 세포에서 "ASO 1"이 쥐 SNAP25 mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 SNAP25 중첩 qPCR로 평가하였다.
도 16B에서 qPCR 데이터를 제공하는 데, 10 zM, 100 zM 및 1,000 zM의 "ASO 1"을 처리한 세포에서 전체 길이 mRNA의 양이 각각 약 50%, 40% 및 70% 유의적으로 (독립표본 T 검정) 감소하였다. "ASO 3"의 경우와 같이 "ASO 1"의 경우에도 용량이 10에서 100 zM로 증가함에 따라 역전된 용량 반응 패턴이 부분적으로 재현되었다. 그러나, ASO의 농도가 1,000 zM로 증가했을 때 전체 길이 mRNA의 양이 더 감소한 것을 고려하면, "ASO 1"이 "ASO 3"보다 엑손 스키핑 효능이 더 강한 것으로 보인다.
실시예 4. PC12 세포에서 "ASO 3"에 의한 SNAP25 단백질 발현의 억제.
PC12 세포에서 "ASO 3"이 SNAP25 단백질 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 PC12 세포에 대해 "ASO 3"을 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 30 zM, 100 zM, 300 zM, 1 aM, 3 aM, 또는 10 aM의 농도로 48시간 동안 처리하였다. 웨스턴 블럿 분석 중 생길 수 있는 기술적 오류에 대처하기 위해 음성 대조군에 4 배양 접시를 사용하였다.
[세포 용해] 1% SDS와 1X 단백질 가수 분해 요소 억제제 칵테일이 (cOmplete Mini, Roche) 첨가된 200 μL 1X RIPA 완충 용액으로 (Cat. Number 9806, Cell Signaling Tech) 얼음 위에서 세포를 용해하였다. 용해액을 1.5 mL e-튜브에 모으고 100 μL 5X 샘플 완충 용액과 섞은 후 5분 동안 끓였다.
[웨스턴 블럿] 용해액에 대해 4-15% TGX-PAGE 경사 젤 (Cat. Number 456-1086, Bio-Rad) 상에서 전기영동 분리를 수행한 다음 0.45 μm PVDF 막으로 옮겼다. 막은 항-SNAP25 항체와 (Cat. Number S9684, Sigma) 항-β-액틴 항체로 (Cat. Number A3845, Sigma) 탐색하였다.
도 17A에서는 PC12 세포 용해액의 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터와 (위 도표) 덴시토미트리로 측정한 β-액틴에 대해 정규화한 상대적인 SNAP25 단백질 발현량을 (아래 도표) 제공한다. "ASO 3"으로 처리한 세포에서 SNAP25 단백질 발현량이 10 내지 60% 감소하였는 데, 음성 대조군의 (즉, 0 zM "ASO 3") 발현량은 4 샘플의 평균 값이다.
실시예 5. PC12 세포에서 "ASO 1"에 의한 SNAP25 단백질 발현의 억제.
별다른 언급이 없으면 "실시예 4"와 같이, PC12 세포에서 "ASO 1"이 SNAP25 단백질 발현을 억제하는 정도를 평가하였다. PC12 세포에 대해 "ASO 1"을 0 (음성 대조용), 100 zM, 또는 1,000 zM의 농도로 48시간 혹은 72시간 동안 처리하였다 (각 ASO 농도당 1 배양 접시).
도 17B에서는 ASO를 48시간 (왼쪽) 및 72시간 (오른쪽) 동안 처리한 세포의 웨스턴 블럿 데이터를 제공한다. 두 시간 대 모두, PC12 세포에서 "ASO 1"이 SNAP25 단백질 발현을 상당히 억제하였다.
실시예 6. "ASO 1"을 국소 투여한 쥐의 피부에서 SNAP25 단백질 발현의 억제.
"ASO 1"은 쥐 SNAP25 프리-mRNA에서 "엑손 7"의 3' 스플라이스 위치에 대해 완전히 상보적이다. 국소 투여한 쥐의 피부에서 "ASO 1"이 SNAP25 단백질 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[털 제거 및 군분리] 실험 전날에 (날자 0), 5주령 암컷 C57BL/6 쥐 8마리를 졸레틸/롬펀으로 마취하고 등의 (약 3 cm x 4 cm) 털을 클리퍼로 제거한다. 쥐들은 다음과 같이 4군으로 무작위 분리하였다: ASO를 투여하지 않음 (음성 대조용), 1 fM, 10 fM 및 100 fM의 "ASO 1" (군당 2마리).
[국부 투여] 국소 용액은 "ASO 1" 진한 저장 수용액을 3% (v/v) 글리세린이 첨가된 30% (v/v) 에틸 알콜 수용액으로 묽혀 0, 1, 10 및 100 fM의 "ASO 1"을 각각 준비하였다. 날자 0에서 4 사이에 공모양의 솜을 사용하여 털을 제거한 동물의 등에 약 100 μL의 국소용액을 하루에 2번 (아침 & 늦은 오후) 국소 투여하였다.
[피부 샘플링] 4일차 오후에, ASO를 국소 투여한 부분의 피부를 채취하기 위하여 졸레틸/롬펀으로 동물을 마취하고 희생하였다. 피부 샘플은 SNAP25 단백질에 대해 다음과 같이 IHC 분석을 실시하였다.
[SNAP25 IHC] 피부 샘플을 동결 절단하고 (cryosection) 빨간 형광 표지를 위해 200배 묽힌 1차 안티-SNAP25 항체 (Cat. Number ab41455, Abcam), 200배 묽힌 2차 안티-IgG 항체 (Cat Number BA-1100, Vector), 그리고 200배 묽힌 Dylight 594-스트렙타비딘을 (Cat Number SA-5594, Vector, CA, USA) 차례로 사용하여 면역염색하였다. 안티-SNAP25 항체는 SNAP25 단백질의 C-말단을 탐색한다. IHC 이미지는 SNAP25 단백질 발현을 평가하기 위하여 자이스 슬라이드 스캐너에 포착되었다. DAPI 염색은 피부의 미세조직을 시각화하기 위하여 실시되었다.
도 18에서는 대표적인 군별 SNAP25 IHC 이미지를 제공한다. 음성 대조군에서는 피부 바로 밑의 근육층에서 SNAP25 단백질 발현이 높았다. 근육층의 SNAP25 단백질 발현은 운동뉴런 축색 돌기의 SNAP25 단백질 발현에서 유래한다고 생각된다. 근육층에서의 SNAP25 단백질 발현은 투여량이 증가할수록 감소하였는 데, 100 fM 투여군에서 가장 많이 감소하였다. 피부에서 전체 길이 SNAP25 단백질 발현의 억제는 PC12 세포에서 관찰된 억제보다 ("실시예 5" 참고) 더 강한 것으로 보인다.
BTX가 안면 주름을 (노화방지용) 주사로 치료하는 데 널리 사용되는 것을 고려할 때, 피부 아래의 근육층에서 SNAP25 단백질 발현을 억제하는 것은 약학적으로 그리고 치료적으로 중요하다. BTX 주사는 그 일부가 근육 조직으로 퍼지는 안전상 문제가 발생할 수 있는 데, 예를 들면 만약 BTX가 폐의 평활근 조직으로 퍼지게 되면 폐의 기능 부전이라는 큰 위험이 올 수 있다.
SNAP25 억제 활성은 표적 조직에서의 ASO 농도에 달려 있다. 국소 투여의 경우, ASO를 투여한 피부에서 멀리 떨어진 조직에서의 ASO의 농도는 급격히 감소하므로, 표적 조직에서의 ASO 농도는 안전에 대한 우려를 할 만큼 높지 않다. 즉 국소 투여용의 화학식 I의 PNA 유도체는 대상자의 순응도 및 안전성에 대하여 BTX보다 확실히 장점이 있다.
실시예 7. SiMa 세포에서 "ASO 3"에 의한 SNAP25 단백질 발현의 억제.
SiMa 인간 신경모세포종 세포에서 "ASO 3"이 SNAP25 단백질 발현을 억제하는 정도를 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] SiMa 세포를 (Cat. Number ACC164, DSMZ) RPMI 1640 배양액에 10% 소 혈청 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민, 그리고 1% 나트륨 파이루베이트를 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 SiMa 세포에 대해 "ASO 3"을 0 zM (음성 대조용), 1 zM에서 100 aM의 농도로 48시간 동안 처리하였다. 웨스턴 블럿 분석 중 생길 수 있는 기술적 오류에 대처하기 위해 음성 대조군에 3 배양 접시를 사용하였다.
[세포 용해] 1% SDS와 1X 단백질 가수 분해 요소 억제제 칵테일이 (cOmplete Mini, Roche) 첨가된 200 μL 1X RIPA 완충 용액으로 (Cat. Number 9806, Cell Signaling Tech) 얼음 위에서 세포를 용해하였다. 용해액을 1.5 mL e-튜브에 모으고 100 μL 5X 샘플 완충 용액과 섞은 후 5분 동안 끓였다.
[웨스턴 블럿] 용해액에 대해 12% SDS-PAGE 젤 상에서 전기영동 분리를 수행한 다음 0.2 μm 폴리비닐리덴 다이플로라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. 막은 항-SNAP25 항체와 (Cat. Number ab41455, Sigma) 항-β-액틴 항체로 (Cat. Number A3845, Sigma) 탐색하였다.
도 19A에서는 SiMa 세포 용해액의 SNAP25 웨스턴 블럿 데이터와 (위 도표) 덴시토미트리로 측정한 β-액틴에 대해 정규화한 상대적인 SNAP25 단백질 발현량을 (아래 도표) 제공한다. 음성 대조군(즉 0 zM "ASO 3")의 발현량은 3개 샘플의 평균 발현량이다. "ASO 3"으로 처리한 세포에서 SNAP25 단백질 발현량이 40 내지 50% 감소하였다.
실시예 8. "ASO 3"을 처리한 SiMa 세포에서 SNAP25 mRNA의 qPCR 평가.
SiMa 세포에서 "ASO 3"이 인간 SNAP25 mRNA 양의 변화를 유도하는 정도를 SNAP25 중첩 qPCR로 다음과 같이 평가하였다.
[세포배양 & ASO 처리] 60 mm 배양 접시에서 5 mL의 배양액에서 배양된 SiMa 세포에 대해 "ASO 3"을 0 zM (음성 대조용), 1 zM, 10 zM, 100 zM, 1 aM, 10 aM, 또는 100 aM의 농도로 처리하였다 (ASO 농도당 2 배양 접시).
[RNA 추출 및 cDNA합성] 전체 RNA를 "RNeasy 미니 키트" (Cat. Number 74106, Qiagen)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 추출하였다. 무작위 헥사머에 대하여 200 ng의 RNA 주형을 PrimeScript 1st 스트랜드 cDNA 합성 키트 (Cat. No. 6110B, Takara)를 이용한 25 μL 역전사 반응에 사용하였다.
[qPCR 증폭] 엑손 6과 엑손 7의 연결 부위를 표적하는 택만 탐침을 [(5'→3') 5,6- FAM-CGGCTTCAT-ZEN-CCGCAGGGTAACAA-3IABkFQ] 이용하여 PCR 반응을 추적하였고, 하기와 같이 명시된 주기 조건에 따라 [엑손 6_순방향: (5' 3') GACGAACGGGAGCAGATG; 및 엑손 8_역방향 (2): (5' 3') ATCTCATTGCCCATATCCAGG]의 엑손-특이성 프라이머 세트에 대해 PCR 반응을 실시하였다: 95oC 3분에 이어서, 40 주기 95oC 15초 및 60oC 30초.
도 19B에서 qPCR 데이터를 제공하는 데, 1 zM, 100 zM, 1 aM 및 100 aM의 "ASO 3"를 처리한 세포에서 전체 길이 인간 SNAP25 mRNA의 양이 각각 약 20%에서 40%까지 유의적으로 (독립표본 T 검정) 감소하였다. 100 aM의 "ASO 3"를 처리한 세포에서 40%의 가장 강한 억제가 관찰되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> OLIPASS CORPORATION
<120> SNAP25 ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES
<130> OSH-00637
<140>
<141>
<150> 62/443,262
<151> 2017-01-06
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aucccagggu aaca 14
<210> 2
<211> 30
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
cucuuuggau cccaggguaa caaaugaugc 30
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 3
atttgttacc ctggga 16
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 4
taccctggga tcca 14
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 5
atctgttacc ctggga 16
<210> 6
<211> 25
<212> RNA
<213> Rattus sp.
<400> 6
uggcucccag gguaacaaac gaugc 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 7
atggccgagg acgcagaca 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 8
agcatctttg ttgcacgttg 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 9
ttgttggagt cagcgcct 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 10
atggatgaaa acctagagc 19
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 11
cttcccagca tctttgtt 18
<210> 12
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 12
ccatgatcct 10
<210> 13
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
probe
<400> 13
ccgcagggta acaa 14
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 14
gacgaacggg agcagatg 18
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer
<400> 15
atctcattgc ccatatccag g 21
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 16
aaagatgctg gcatcaggac tttggttatg ttggatgagc aaggcgctga ctccaacaaa 60
Claims (3)
- 화학식 I로 대표되는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 I]
화학식 I 중에서,
n은 10와 25 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SNAP25 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하거나, 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 한 개 혹은 두 개의 염기 부정합을 포함한 부분적으로 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X와 Y는 수소, 또는 치환 또는 비치환된 알킬옥시카보닐을 나타내며, 여기에서 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 라디칼은 하기에서 선택되며;
Z는 아미노 라디칼이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 우라실을 포함하는 천연 핵산 염기 및 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 네 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기 중에서 각각 독립적으로 선택된다.
화학식 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ 중에서,
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이고;
L1, L2 그리고 L3는 화학식 V로 대표되는 공유결합성 링커이며, 염기성 아민과 핵산 염기를 연결시켜 준다:
[화학식 Ⅴ]
화학식 V 중에서,
Q1과 Qm은 메틸렌 (-CH2-)이고, Qm은 염기성 아민에 직접 연결되며;
Q2, Q3, … 그리고 Qm-1은 메틸렌과 산소(-O-) 중에서 각자 독립적으로 선택되며; 그리고,
m 은 1과 15 사이의 정수이다.
- 제 1항에 있어서, 다음의 조건을 만족하는 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
화학식 I 중에서,
n은 11와 19 사이의 정수이며;
화학식 I의 화합물은, 인간의 SNAP25 프리-mRNA 중 14-머의 프리-mRNA 서열 [(5' 3') AUCCCAGGGUAACA]과 최소한 10개 이상의 상보적인 결합을 하며;
화학식 I의 화합물은 인간의 SNAP25 프리-mRNA와 완전히 상보적인 결합을 하며;
S1, S2, ……, Sn-1, Sn, T1, T2, ……, Tn-1 그리고 Tn은 수소이며;
X는 수소이며;
Y는 수소, 또는 치환 또는 비치환된 알킬옥시카보닐을 나타내며, 여기에서 치환 또는 비-치환 알킬옥시카르보닐 라디칼은 하기에서 선택되며;
Z는 아미노 라디칼이며;
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn은 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 그리고 비천연 핵산 염기 중에서 각각 독립적으로 선택되며; 그리고,
B1, B2, ……, Bn-1 그리고 Bn 중 최소한 다섯 개는, 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ, 또는 화학식 Ⅳ로 대표되는 비천연 핵산염기로부터 독립적으로 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R5 그리고 R6는 수소이며;
L1은 -(CH2)2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)2-, -CH2-O-(CH2)3-, -CH2-O-(CH2)4-, 또는 -CH2-O-(CH2)5- 이고 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결되며; 그리고,
L2와 L3는 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)2-O-(CH2)2-, -(CH2)3-O-(CH2)2-, 그리고 -(CH2)2-O-(CH2)3- 중에서 각자 독립적으로 선택되며 우측 단부가 염기성 아민에 직접 연결된다. - 제 1항에 있어서, 아래에 제공된 펩타이드 핵산 유도체들 중에서 선택된 펩타이드 핵산 유도체 혹은 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
(N→C) Fethoc-A(6)TT-TG(6)T-TA(6)C-CC(1O2)T-GG(6)G-A(6)-NH2; 그리고
(N→C) Fethoc-TG(5)T-TA(6)C-C(1O2)CT-GG(5)G-A(6)T-NH2:
상기에서,
A, G, T, 그리고 C는 각각 천연 핵산 염기인 아데닌, 구아닌, 티민, 그리고 시토신을 가지는 PNA 모노머이다;
C(pOq), A(p) 그리고 G(p)는 각각 화학식 VI, 화학식 VII 그리고 화학식 IX 으로 대표되는 비천연 핵산염기를 가지는 PNA 모노머이다:
상기에서,
p와 q는 정수이며; 그리고,
N-과 C-말단의 치환체들에 대한 약자들은 하기와 같이 구체적으로 기재된다: "Fethoc-"는 "[2-(9-플루오레닐)에틸-1-옥시]카보닐"; 그리고 "-NH2"는 비치환된 "-아미노" 기에 대한 약어이다.
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