KR102479966B1

KR102479966B1 - Method for manufacturing organic solvent-free liposome using micro-fluidic chip

Info

Publication number: KR102479966B1
Application number: KR1020200020968A
Authority: KR
Inventors: 정호섭; 김기성; 강봉수; 곽문규
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-02-20
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2022-12-23
Also published as: KR20210106607A

Abstract

개시된 내용은 리포좀 제조용 미세유체칩 및 그것을 이용한 무유기용매 리포좀의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세 혼합 구조 채널을 통하여 바이셀 구조를 형성하고 있는 나노디스크 구조를 리포좀의 형태로 전환이 가능하게 하는 리포좀 제조용 미세유체칩 및 그것을 이용한 무유기용매 리포좀의 제조방법에 관한 것이다.
상기의 리포좀 제조용 미세유체칩, 그를 이용하는 무유기용매 리포좀의 제조방법은 유기용매를 포함하지 않는 시료를 사용할 수 있으므로, 유기상의 제거를 위한 추가 공정을 필요로 하지 않고, 잔여 유기상이 없는 무유기용매 리포좀을 제공한다.The disclosed content relates to a microfluidic chip for producing liposomes and a method for producing organic solvent-free liposomes using the same, and more specifically, the nanodisc structure forming a bicell structure can be converted into a liposome form through a fine mixed structure channel. It relates to a microfluidic chip for producing liposomes and a method for producing organic solvent-free liposomes using the microfluidic chip.
Since the above microfluidic chip for preparing liposomes and the method for preparing organic solvent-free liposomes using the same can use a sample that does not contain an organic solvent, an additional process for removing the organic phase is not required, and an organic solvent-free solvent without residual organic phase is required. Liposomes are provided.

Description

미세유체칩을 이용한 무유기용매 리포좀의 제조방법 {METHOD FOR MANUFACTURING ORGANIC SOLVENT-FREE LIPOSOME USING MICRO-FLUIDIC CHIP}Manufacturing method of organic solvent-free liposome using microfluidic chip {METHOD FOR MANUFACTURING ORGANIC SOLVENT-FREE LIPOSOME USING MICRO-FLUIDIC CHIP}

개시된 내용은 리포좀 제조용 미세유체칩 및 그것을 이용한 무유기용매 리포좀의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세 혼합 구조 채널을 통하여 바이셀(bicelle) 구조를 형성하고 있는 나노디스크 구조를 리포좀의 형태로 전환이 가능하게 하는 리포좀 제조용 미세유체칩 및 그것을 이용한 무유기용매 리포좀의 제조방법에 관한 것이다.The disclosed content relates to a microfluidic chip for producing liposomes and a method for producing organic solvent-free liposomes using the same, and more particularly, to a nanodisk structure forming a bicelle structure through a fine mixed structure channel in the form of liposomes. It relates to a microfluidic chip for producing liposomes capable of conversion and a method for preparing organic solvent-free liposomes using the microfluidic chip.

인지질 단일막으로로 구성된 리포좀은 약물전달 물질, 화장품 산업, 식품공학 등 다양한 산업 분야에서 사용되고 있으며, 나노 사이즈의 리포좀 자체만으로도 생체막 모사, DNA, 단백질, 물질전달 등의 연구에 활발히 활용되고 있다. 나노 크기의 리포좀 제작을 위한 관련 연구들이 활발히 진행되고 있으며, 제작 기술들도 함께 발전하고 있다.Liposomes composed of a single membrane of phospholipids are used in various industries such as drug delivery materials, cosmetics industry, and food engineering, and nano-sized liposomes themselves are actively used in research on biomembrane simulation, DNA, protein, and mass transfer. Related researches for the production of nano-sized liposomes are being actively conducted, and manufacturing technologies are also evolving.

종래의 리포좀 제작 공정은 수상(Water phase)과 유기상(Oil phase)의 혼합을 통해 에멀전을 형성하거나, 지질 또는 양친매성 고분자를 적절한 유기용매에 용해시킨 후, 용매의 기화를 통해 지질 막을 제조한 후 수상과 혼합하여 리포좀을 제조하였다. 이러한 제조방법은 고속 교반, 초음파, 진동 교반, 막 투과 등의 공정을 사용하고 있다. In the conventional liposome manufacturing process, an emulsion is formed by mixing a water phase and an organic phase, or a lipid film is prepared by dissolving a lipid or an amphiphilic polymer in an appropriate organic solvent and vaporizing the solvent. Liposomes were prepared by mixing with the aqueous phase. This manufacturing method uses processes such as high-speed stirring, ultrasonic waves, vibration stirring, and membrane permeation.

단순히 수상과 유기상을 혼합하는 에멀전 제조방법은 대량생산 공정적용에 용이하기 때문에 식품분야에서 널리 사용되고 있는 방법이나, 이 방법은 유기상으로 사용되는 유기용매가 생성물에 잔류하는 문제점이 있다. 또한, 새로운 기술로 알려진 미세유체칩을 이용한 방법으로는 잔존 유기용매의 분리를 위해서 추가적인 공정이 필요하며, 완전한 제거에 한계가 있다. 또한, 전술한 제조방법들은 균일한 크기의 리포좀의 제조 및 보존 안정성 확보가 어렵다는 단점이 있어서 화장품이나 의약품으로 사용하기에는 많은 제약이 따른다.The emulsion manufacturing method of simply mixing the aqueous phase and the organic phase is widely used in the food field because it is easy to apply to mass production processes, but this method has a problem in that the organic solvent used as the organic phase remains in the product. In addition, the method using a microfluidic chip known as a new technology requires an additional process to separate the remaining organic solvent, and there is a limit to complete removal. In addition, the above-described manufacturing methods have disadvantages in that it is difficult to prepare liposomes of a uniform size and to secure storage stability, so that many restrictions are imposed on their use as cosmetics or pharmaceuticals.

전술한 제조방법의 단점을 극복하기 위하여 미세유체 채널을 적용한 사례들도 존재한다. 십자 혹은 T 형태의 유로를 포함하는 미세유체 채널에 2 종류 이상의 섞이지 않는 시료를 주입할 경우, 유체가 만나는 채널에서 특정 유체가 점도 및 표면장력 등의 요소에 의하여 오리피스를 형성하게 되고, 유체가 집속하여 빠른 속도로 나노 입자를 형성하게 된다. 해당 기술은 전술한 기술들과 비교할 경우 비교적 높은 균일도의 확보가 가능하지만, 여전히 유상을 제거하기 위한 추가적인 공정이 필요하다. 한국 등록특허공보 제10-1731394호 마이크로 유체칩 및 이를 이용한 리포좀 제조방법 및 한국 공개특허공보 제10-2019-0055893호 미세유체 칩의 이중 액적 제조방법이 종래기술로서 개시되고 있지만, 종래 기술에는 유기용매나 유상이 잔존하지 않으면서 균일하고 안정적인 리포좀을 생산하는 효과적인 기술은 개시하지 않고 있으며 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 특정구조를 가진 미세유체칩을 활용하여 바이셀 용액 및 완충용액의 주입, 혼합 및 희석과정을 거쳐 만들어지는 유기용매가 잔존하지 않으며 균일하고 안정적인 리포좀을 생산하기 위해 일련의 공정을 단순한 주입을 통해 수행 가능한 기술이 필요하다.There are also cases in which microfluidic channels are applied to overcome the disadvantages of the above-described manufacturing method. When two or more types of immiscible samples are injected into a microfluidic channel including a cross or T-shaped flow path, a specific fluid forms an orifice by factors such as viscosity and surface tension in the channel where the fluids meet, and the fluid is focused. This leads to rapid formation of nanoparticles. This technology can secure relatively high uniformity when compared to the above-mentioned technologies, but still requires an additional process to remove the oil phase. Korean Patent Registration No. 10-1731394 Microfluidic chip and liposome manufacturing method using the same, and Korean Patent Publication No. 10-2019-0055893 Double droplet manufacturing method of microfluidic chip are disclosed as prior art, but the prior art is organic. An effective technique for producing uniform and stable liposomes without solvent or oil phase has not been disclosed, and in order to solve the problems of the prior art, a microfluidic chip with a specific structure is used to inject and mix the bicell solution and buffer solution. In order to produce homogeneous and stable liposomes without remaining organic solvents produced through dilution and dilution, a technology capable of performing a series of processes through simple injection is required.

개시된 내용은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 리포좀 제조용 미세유체칩을 사용하여 유기상의 제거를 위한 추가 공정을 필요로 하지 않고, 잔여 유기상이 없는 무유기용매 리포좀의 제조방법을 제공하는 것이다.The disclosed content is to solve the above-mentioned problems of the prior art, and provides a method for preparing organic solvent-free liposomes without a residual organic phase without requiring an additional process for removing the organic phase using a microfluidic chip for preparing liposomes. will be.

하나의 일 실시예로서 이 개시의 내용은 기판; 상기 기판 상에 형성된 2 이상의 유입부; 상기 기판 상에 형성되고 상기 2 이상의 유입부와 연결된 혼합부; 상기 기판 상에 형성되고 상기 혼합부와 연결된 안정부; 및 상기 기판 상에 형성되고 상기 안정부와 연결된 유출부;를 포함하고, 상기 혼합부는 유체 흐름의 수직방향으로 전단응력을 가하는 하나 이상의 마이크로기둥을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포좀 제조용 미세유체칩에 대해 기술하고 있다.As one example, the disclosure provides a substrate; two or more inlets formed on the substrate; a mixing unit formed on the substrate and connected to the two or more inlets; a stabilizing part formed on the substrate and connected to the mixing part; and an outflow portion formed on the substrate and connected to the stable portion, wherein the mixing portion includes one or more micropillars for applying shear stress in a vertical direction of fluid flow. For a microfluidic chip for preparing liposomes, are describing

바람직하기로는, 상기 미세유체칩은 높이가 100~200 ㎛인 채널로 구성될 수 있다.Preferably, the microfluidic chip may be composed of a channel having a height of 100 to 200 μm.

바람직하기로는, 상기 유입부는 폭이 200~400 ㎛일 수 있다.Preferably, the inlet may have a width of 200 to 400 μm.

바람직하기로는, 상기 마이크로기둥은 유로와 1~90˚의 각도를 이루는 벽면 구조일 수 있다.Preferably, the microcolumns may have a wall structure forming an angle of 1 to 90 degrees with the flow path.

더욱 바람직하기로는, 상기 마이크로기둥은 폭이 150~200 ㎛일 수 있다.More preferably, the microcolumns may have a width of 150 to 200 μm.

바람직하기로는, 상기 마이크로기둥은 원형 기둥 또는 3개 이상의 변으로 이루어진 다각형 기둥일 수 있다.Preferably, the micro-pillars may be circular pillars or polygonal pillars having three or more sides.

더욱 바람직하기로는, 상기 마이크로기둥은 직경이 100~200 ㎛인 원형 기둥 또는 상기 변의 길이가 100~200 ㎛인 다각형 기둥일 수 있다.More preferably, the micropillars may be circular pillars with a diameter of 100 to 200 μm or polygonal pillars with side lengths of 100 to 200 μm.

바람직하기로는, 상기 안정부는 폭이 2~3 mm이고, 길이가 6~7 mm인 채널로 이루어질 수 있다.Preferably, the stabilizer may be formed of a channel having a width of 2 to 3 mm and a length of 6 to 7 mm.

바람직하기로는, 상기 기판은 PDMS(polydimethylsiloxane)를 소프트몰딩(soft-molding)법 또는 사출성형법으로 성형하여 제조될 수 있다.Preferably, the substrate may be manufactured by molding polydimethylsiloxane (PDMS) using a soft-molding method or an injection molding method.

다른 실시예로서 이 개시의 내용은 상기 리포좀 제조용 미세유체칩을 사용하고, (a) 하나 이상의 상기 유입부에 바이셀 및 완충액을 각각 주입하는 단계; (b) 상기 주입부, 상기 혼합부 및 상기 안정부를 통과한 용액을 상기 유출부로부터 수득하는 단계; 및 (c) 상기 용액을 저온 조건 하에서 추가 안정화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 무유기용매 리포좀의 제조방법에 대해 기술하고 있다.As another embodiment, the present disclosure includes the steps of using the microfluidic chip for preparing the liposome, (a) injecting a vicell and a buffer into one or more of the inlets, respectively; (b) obtaining a solution that has passed through the injection part, the mixing part, and the stabilizing part from the outlet part; and (c) further stabilizing the solution under low-temperature conditions.

바람직하기로는, 상기 바이셀을 구성하는 긴 탄소사슬 지질과 짧은 탄소사슬 지질의 비율은 3~7 : 7~3일 수 있다.Preferably, the ratio of long carbon chain lipids and short carbon chain lipids constituting the bicell may be 3-7: 7-3.

바람직하기로는, 상기 바이셀 및 상기 완충액의 비율을 조절하여 최종 지질 농도를 4~8 mM로 제어할 수 있다.Preferably, the final lipid concentration can be controlled to 4-8 mM by adjusting the ratio of the vicell and the buffer.

또 다른 실시예로서 이 개시의 내용은 상기 무유기용매 리포좀의 제조방법에 따라 제조된 무유기용매 리포좀에 대해 기술하고 있다.As another embodiment, this disclosure describes an organic solvent-free liposome prepared according to the method for preparing the organic solvent-free liposome.

바람직하기로는, 상기 무유기용매 리포좀은 평균 직경이 99~490 nm일 수 있다.Preferably, the organic solvent-free liposomes may have an average diameter of 99 to 490 nm.

개시된 리포좀 제조용 미세유체칩, 그를 이용하는 무유기용매 리포좀의 제조방법은 유기용매를 포함하지 않는 시료를 사용할 수 있으므로, 유기상의 제거를 위한 추가 공정을 필요로 하지 않고, 잔여 유기상이 없는 무유기용매 리포좀을 제공하는 탁월한 효과를 나타낸다.Since the disclosed microfluidic chip for preparing liposomes and the method for preparing organic solvent-free liposomes using the same can use a sample that does not contain an organic solvent, an additional process for removing the organic phase is not required and the organic solvent-free liposome having no residual organic phase is required. shows an excellent effect to provide.

도 1은 개시된 리포좀 제조용 미세유체칩의 다양한 예시를 나타낸 설계도이다.
도 2는 개시된 제조예를 통해 제조된 리포좀 제조용 미세유체칩을 400 ㎛ 스케일로 촬영한 이미지이다.
도 3은 개시된 제조예를 통해 제조된 마스터 몰드와 그를 이용하여 제조한 미세유체칩을 촬영한 이미지이다.
도 4는 개시된 실시예를 통한 리포좀의 제조 과정에서 미세유체칩 내 바이셀 및 완충액의 혼합양상을 촬영한 이미지이다.
도 5는 개시된 실시예를 통해 제조된 리포좀을 동적광산란분석(Dynamic Light Scattering; DLS)하여 분석한 것을 나타낸 그래프이다.
도 6은 개시된 실시예를 통해 제조된 리포좀의 형상학적인 분석을 위하여 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy; TEM) 촬영한 이미지이다.1 is a design diagram showing various examples of the disclosed microfluidic chip for preparing liposomes.
2 is an image taken at a scale of 400 μm of a microfluidic chip for preparing liposomes prepared through the disclosed preparation example.
3 is an image of a master mold manufactured through the disclosed manufacturing example and a microfluidic chip manufactured using the master mold.
Figure 4 is an image taken of the mixing aspect of the microfluidic chip and the buffer solution in the liposome manufacturing process through the disclosed embodiment.
Figure 5 is a graph showing the analysis of the liposomes prepared through the disclosed example by dynamic light scattering (DLS).
6 is a transmission electron microscope (TEM) image taken for morphological analysis of the liposome prepared through the disclosed example.

이하에는, 본 발명의 바람직한 실시예와 각 성분의 물성을 상세하게 설명하되, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.Hereinafter, a preferred embodiment of the present invention and the physical properties of each component will be described in detail, but this is to be explained in detail so that a person having ordinary knowledge in the art to which the present invention belongs can easily practice the invention, This is not meant to limit the technical spirit and scope of the present invention.

도 1을 참고하면, 개시된 리포좀 제조용 미세유체칩은 기판; 상기 기판 상에 형성된 2 이상의 유입부; 상기 기판 상에 형성되고 상기 2 이상의 유입부와 연결된 혼합부; 상기 기판 상에 형성되고 상기 혼합부와 연결된 안정부; 및 상기 기판 상에 형성되고 상기 안정부와 연결된 유출부;를 포함하고, 상기 혼합부는 유체 흐름의 수직방향으로 전단응력을 가하는 하나 이상의 마이크로기둥을 포함한다.Referring to Figure 1, the disclosed microfluidic chip for preparing a liposome substrate; two or more inlets formed on the substrate; a mixing unit formed on the substrate and connected to the two or more inlets; a stabilizing part formed on the substrate and connected to the mixing part; and an outflow part formed on the substrate and connected to the stable part, wherein the mixing part includes one or more micro-columns applying shear stress in a vertical direction of fluid flow.

개시된 내용의 미세유체칩에 형성된 각 성분들은 기판 상에 음각된 미세구조일 수 있고, 상기 미세유체칩은 상기 기판 상에, 각각의 유입부 및 유출부와 연결되는 통공이 형성된 평판이 접합될 수 있다. 상기 평판은 상기 기판과 동일한 소재로 제조될 수 있다.Each component formed in the disclosed microfluidic chip may be a microstructure engraved on a substrate, and the microfluidic chip may be bonded to a flat plate having through holes connected to each inlet and outlet on the substrate. there is. The flat plate may be made of the same material as the substrate.

개시된 내용의 미세유체칩을 구성하는 각 성분 간에는 미세유로, 즉 채널로 연결될 수 있다. 바람직하게는, 상기 미세유체칩은 높이가 100~200 ㎛인 채널로 구성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Each component constituting the disclosed microfluidic chip may be connected with a microchannel, that is, a channel. Preferably, the microfluidic chip may be composed of a channel having a height of 100 to 200 μm, but is not limited thereto.

상기 유입부는 리포좀의 제조에 사용되는 다양한 시료를 주입할 수 있는 구성으로, 원형 또는 3개 이상의 변으로 이루어진 다각형 구조를 가질 수 있다. 상기 유입부는 목적에 따라 서로 상이한 2 이상의 시료를 주입할 수 있도록 적어도 2개이다.The inlet has a configuration capable of injecting various samples used in the preparation of liposomes, and may have a circular or polygonal structure consisting of three or more sides. The inlet is at least two so as to inject two or more different samples according to the purpose.

바람직하기로는, 상기 유입부는 폭이 200~400 ㎛일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 이때 폭은 상기 유입부의 중심을 지나는 직선 중 가장 긴 것의 길이를 의미한다. 상기 폭은 목표 유량, 시료의 양, 시료의 종류 등에 따라 변경될 수 있다.Preferably, the inlet may have a width of 200 to 400 μm, but is not limited thereto. In this case, the width means the length of the longest straight line passing through the center of the inlet. The width may be changed according to the target flow rate, the amount of the sample, the type of the sample, and the like.

도 2를 참고하면, 상기 혼합부는 상기 각각의 유입부로 주입된 시료 간의 혼합 및 희석이 이루어지는 구성으로, 유체 흐름의 수직방향으로 전단응력을 가하는 하나 이상의 마이크로기둥을 포함한다. 유체는 상기 유입부로부터 상기 유출부로 흐르며, 상기 마이크로기둥은 이러한 유체의 흐름을 방해하여 수직방향으로 전단응력을 발생시킴으로써 각 시료의 혼합을 유도한다.Referring to FIG. 2 , the mixing unit is configured to mix and dilute the samples injected into the respective inlets, and includes one or more micro-columns that apply shear stress in the vertical direction of the fluid flow. Fluid flows from the inlet to the outlet, and the microcolumns obstruct the flow of the fluid to generate shear stress in a vertical direction, thereby inducing mixing of each sample.

상기의 효과를 나타내는 마이크로기둥은 일예로 유로와 1~90˚의 각도를 이루는 벽면 구조일 수 있다. 예를 들어, 도 2a 및 도 2e는 유로와 약 90˚의 각도를 이루는 벽면 구조이고, 도 2b 및 도 2f는 유로와 약 60˚의 각도를 이루는 벽면 구조이다.The micropillars exhibiting the above effect may be, for example, a wall structure forming an angle of 1 to 90 degrees with the flow path. For example, FIGS. 2A and 2E are wall structures at an angle of about 90 degrees with respect to the passage, and FIGS. 2B and 2F are wall structures at an angle of about 60 degrees with the passage.

바람직하기로는, 상기 마이크로기둥은 폭이 150~200 ㎛일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 이때 폭은 유체의 흐름방향으로 잰 두께를 의미한다.Preferably, the microcolumn may have a width of 150 to 200 μm, but is not limited thereto, and in this case, the width refers to a thickness measured in the flow direction of the fluid.

상기의 효과를 나타내는 상기 마이크로기둥은 다른 일예로 원형 기둥 또는 3개 이상의 변으로 이루어진 다각형 기둥일 수 있다. 예를 들어, 도 2c는 원형 기둥이고, 도 2d는 삼각형 기둥이다.As another example, the micro-pillars exhibiting the above effects may be circular pillars or polygonal pillars having three or more sides. For example, FIG. 2C is a circular pillar, and FIG. 2D is a triangular pillar.

바람직하기로는, 상기 마이크로기둥은 직경이 100~200 ㎛인 원형 기둥 또는 상기 변의 길이가 100~200 ㎛인 다각형 기둥일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the micropillars may be circular pillars having a diameter of 100 to 200 μm or polygonal pillars having a side length of 100 to 200 μm, but are not limited thereto.

도 1을 참고하면, 상기 안정부는 상기 혼합부 대비 폭이 확장된 채널로 구성되며, 유속을 감소시켜 베시클(vesicle), 즉 리포좀(liposome)의 안정성을 확보할 수 있다.Referring to FIG. 1 , the stabilizing unit is composed of a channel having an extended width compared to the mixing unit, and the stability of the vesicle, that is, the liposome, can be secured by reducing the flow rate.

바람직하기로는, 상기 안정부는 폭이 2~3 mm이고, 길이가 6~7 mm인 채널로 이루어질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.Preferably, the stabilizer may be formed of a channel having a width of 2 to 3 mm and a length of 6 to 7 mm, but is not limited thereto.

상기의 구성들이 형성된 상기 기판은 PDMS(polydimethylsiloxane)를 소프트몰딩(soft-molding)법 또는 사출성형법으로 성형하여 제조될 수 있다.The substrate on which the above configurations are formed may be manufactured by molding polydimethylsiloxane (PDMS) using a soft-molding method or an injection molding method.

이때, 소프트몰딩법이란 실리콘 웨이퍼 상에 포토리소그래피(photolithography) 공정을 수행하여 전술한 미세구조가 양각된 마스터몰드를 제조하고, 이를 주형으로 이용하여 소재를 성형함으로써 미세유체칩을 제조하는 방법을 의미한다.In this case, the soft molding method refers to a method of manufacturing a microfluidic chip by performing a photolithography process on a silicon wafer to manufacture a master mold embossed with the above-described microstructure, and molding a material using this as a template. do.

개시된 무유기용매 리포좀의 제조방법은 상기 리포좀 제조용 미세유체칩을 사용하고, (a) 하나 이상의 상기 유입부에 바이셀 및 완충액을 각각 주입하는 단계; (b) 상기 주입부, 상기 혼합부 및 상기 안정부를 통과한 용액을 상기 유출부로부터 수득하는 단계; 및 (c) 상기 용액을 저온 조건 하에서 추가 안정화하는 단계를 포함한다.The disclosed method for producing organic solvent-free liposomes includes the steps of using the microfluidic chip for preparing the liposomes, and (a) injecting a vicell and a buffer into one or more inlets, respectively; (b) obtaining a solution that has passed through the injection part, the mixing part, and the stabilizing part from the outlet part; and (c) further stabilizing the solution under low temperature conditions.

생체막 연구분야에 다양하게 사용되는 지질 박막 수화 기술은 서로 다른 탄소 길이를 가진 두 종류의 지질로 구성된 바이셀을 제조하기 위해, 가열 및 증발공정을 거쳐 균일하게 혼합된 지질 박막을 제조한 후 특정 pH 및 농도의 완충액으로 수화함으로써 지질들의 자가조립을 유도하고, 냉각 및 용융공정을 반복하여 생성되는 바이셀의 균일도와 안정성을 확보한다.Lipid thin film hydration technology, which is widely used in the field of biofilm research, is to prepare a bicell composed of two types of lipids with different carbon lengths, through a heating and evaporation process to prepare a uniformly mixed lipid thin film, and hydration with a buffer of concentration to induce self-assembly of lipids, and to secure the uniformity and stability of the bicell produced by repeating the cooling and melting process.

상기 공정을 통해 제조된 바이셀은 나노 디스크 형태의 특수한 지질 자가조립체로, 완충액과의 희석공정을 통해 구형의 리포좀 형태로 전환될 수 있다. 이러한 희석공정에서 바이셀을 구성하는 짧은 탄소사슬 지질이 분리되고, 긴 탄소사슬 지질로 구성된 지질 이중층은 구형의 베시클, 즉 리포좀으로 전환된다.The bicell prepared through the above process is a special lipid self-assembly in the form of a nanodisc, and can be converted into a spherical liposome form through a dilution process with a buffer solution. In this dilution process, short carbon chain lipids constituting bicells are separated, and the lipid bilayer composed of long carbon chain lipids is converted into spherical vesicles, that is, liposomes.

상기 무유기용매 리포좀의 제조방법에 따르면 잔류 유상을 최소화하며, 균일한 리포좀 입자를 연속적으로 제조하여 대량생산에 유리할 수 있다According to the organic solvent-free liposome manufacturing method, residual oil phase is minimized and uniform liposome particles are continuously produced, which can be advantageous for mass production.

상기 (a) 단계에서 바이셀 및 완충액은 각각 상이한 1 이상의 유입부에 주입될 수 있다.In step (a), the vicell and the buffer may be injected into one or more different inlets, respectively.

개시된 무유기용매 리포좀의 제조방법은 바이셀을 완충액과 혼합하여 유체의 흐름 속에서 분해시켜 구형의 리포좀 형태로 전환시킬 수 있다. 이때, 주입된 시료들이 상기 (b) 단계에서 층류(laminar flow)의 형태로 상기 혼합부로 이송되어 상호 혼합 및 희석되어 리포좀 형태로 전환된 후, 상기 안정부에서 일차적으로 안정성을 확보한 후 유출부에서 수득된다.In the disclosed method for producing organic solvent-free liposomes, Vicells can be mixed with a buffer and disassembled in a fluid flow to convert them into spherical liposomes. At this time, the injected samples are transported to the mixing unit in the form of laminar flow in the step (b), mutually mixed and diluted, and converted into liposomes. After securing stability primarily in the stabilization unit, the outlet unit is obtained from

이후, 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 저온 조건, 예를 들면, 0~10℃의 저온 조건에서 일정 시간 동안 추가적인 안정화를 수행하여 무유기용매 리포좀을 제조할 수 있다.Thereafter, the organic solvent-free liposome may be prepared by performing additional stabilization of the solution obtained in step (c) at a low temperature, for example, 0 to 10° C. for a certain period of time.

바람직하기로는, 상기 단계를 거쳐 수득한 무유기용매 리포좀은 평균 직경이 99~490 nm일 수 있다.Preferably, the organic solvent-free liposome obtained through the above step may have an average diameter of 99 to 490 nm.

이하에서는, 개시된 리포좀 제조용 미세유체칩의 제조방법과 그를 이용하여 무유기용매 리포좀을 제조하는 방법을 실시예를 들어 설명하기로 한다.Hereinafter, the disclosed method of manufacturing a microfluidic chip for preparing liposomes and the method of manufacturing organic solvent-free liposomes using the same will be described with reference to examples.

<제조예> 미세유체칩의 제조<Manufacturing Example> Manufacture of microfluidic chip

실리콘 웨이퍼(Silicon wafer) 기판 상에 자외선 경화성 음각 감광액(negative photoresist)인 SU-8 2100 또는 SU-8 2150을 스핀코팅하여 100~200 ㎛의 균일한 두께로 도포하였다. 도 1과 같은 미세유체칩 설계도를 기반으로 제조한 포토마스크를 이용하여 코팅된 감광액에 자외선을 조사함으로써 설계된 채널의 형상으로 일괄 경화시켰다. 이후 식각(etching) 공정을 수행하고, 이러한 포토리소그래피 공정을 거쳐 실리콘 마스터몰드를 제조하였다(도 3a).SU-8 2100 or SU-8 2150, an ultraviolet curable negative photoresist, was spin-coated on a silicon wafer substrate and applied to a uniform thickness of 100 to 200 μm. Using a photomask manufactured based on the microfluidic chip design diagram as shown in FIG. 1, the coated photoresist was irradiated with ultraviolet rays to be collectively cured in the shape of the designed channel. Thereafter, an etching process was performed, and a silicon master mold was manufactured through such a photolithography process (FIG. 3a).

제조된 마스터몰드 상에 열경화성 폴리머인 PDMS를 경화제와 10:1 비율로 혼합한 후 탈기공정을 거쳐 70℃에서 1시간 동안 가열경화시켰다. 경화된 PDMS 기판을 이형한 후, PDMS 평판과 접합하여 미세유체칩을 제조하였다(도 3b, 3c).PDMS, a thermosetting polymer, was mixed with a curing agent in a ratio of 10:1 on the prepared master mold, and cured by heating at 70° C. for 1 hour through a degassing process. After releasing the cured PDMS substrate, a microfluidic chip was prepared by bonding with a PDMS plate (FIG. 3b, 3c).

<실시예> 리포좀의 제조<Example> Preparation of liposomes

시린지 펌프를 이용하여 제조예에 따른 미세유체칩의 유입부 중 중간 채널에 바이셀 용액을 주입하고, pH 7.0, 50 mM의 PBS(phosphate buffer saline) 완충액을 양쪽 채널에 주입하여 세 갈래의 층류를 형성하였다. 도 4를 참고하면, 투입된 층류는 혼합부에서 마이크로기둥에 의해 혼합 및 희석이 수행되었으며, 안정부에 접근할 수록 균일한 혼합이 수행되었다. 충분한 희석이 수행된 용액 내의 바이셀은 리포좀으로 전환되며, 상대적으로 유속이 낮은 안정부에서 안정화되었다. 이후, 유출부를 통해 수득된 용액을 4℃의 저온 조건 하에서 일정 시간 동안 추가적인 안정화를 거쳐 리포좀 용액을 제조하였다.Using a syringe pump, the Vicell solution is injected into the middle channel of the inlet of the microfluidic chip according to the manufacturing example, and a phosphate buffer saline (PBS) buffer of pH 7.0 and 50 mM is injected into both channels to create a three-pronged laminar flow. formed. Referring to FIG. 4 , mixing and dilution of the introduced laminar flow was performed by the microcolumn in the mixing section, and uniform mixing was performed as it approached the stable section. The vicells in the sufficiently diluted solution were converted into liposomes and stabilized in a stable section with a relatively low flow rate. Thereafter, the solution obtained through the outlet was subjected to additional stabilization under a low temperature condition of 4° C. for a certain period of time to prepare a liposome solution.

<실험예 1><Experimental Example 1>

상기 실시예에서 제조한 리포좀 용액의 베시클 균일도 및 직경 측정을 위하여 동적광산란분석장치(Dynamic Light Scattering; DLS)를 이용한 시료분석을 실시하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.In order to measure the vesicle uniformity and diameter of the liposome solution prepared in the above example, sample analysis was performed using Dynamic Light Scattering (DLS), and the results are shown in FIG. 5.

도 5를 참고하면, 지질 농도가 상이한 4개의 실험 샘플을 분석한 결과, 최종 지질 농도가 감소할 수록 형성된 리포좀의 직경이 증가하는 경향을 나타내었다. 이에 따라, 최종 지질 농도를 4~8 mM로 제어하여 99~490 nm의 평균 직경을 가지는 나노 리포좀의 제조가 가능함을 확인하였다.Referring to FIG. 5, as a result of analyzing four experimental samples having different lipid concentrations, the diameter of the formed liposomes tended to increase as the final lipid concentration decreased. Accordingly, it was confirmed that it was possible to prepare nanoliposomes having an average diameter of 99 to 490 nm by controlling the final lipid concentration to 4 to 8 mM.

<실험예 2><Experimental Example 2>

상기 실시예에서 제조한 리포좀의 형상학적 분석을 위하여 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy; TEM) 촬영을 실시하여 도 6에 나타내었다.For the morphological analysis of the liposome prepared in the above example, transmission electron microscopy (TEM) was taken and shown in FIG. 6 .

도 6을 참고하면, 혼합 및 희석 공정 전에 디스크 형태를 가지는 바이셀이 관찰되나, 상기 공정 이후 구형의 리포좀으로 전환되었음을 시각적으로 확인하였다.Referring to FIG. 6 , although disc-shaped bicells were observed before the mixing and dilution process, it was visually confirmed that they were converted to spherical liposomes after the process.

따라서, 개시된 리포좀 제조용 미세유체칩을 이용하면 혼합 및 희석공정에서 일관된 조건 유지가 가능하여 리포좀 크기의 균일도를 높일 수 있고, 농도와 유량이라는 간단한 변수의 제어를 통해 다양한 크기의 리포좀 제조가 가능하다. 또한, 개시된 무유기용매 리포좀의 제조방법은 유기용매를 포함하지 않는 시료를 사용하여 추가적인 유기상 제거 공정이 불필요하고, 잔존 유기용매가 없으므로 균일한 무유기용매 리포좀을 대량으로 생산할 수 있다.Therefore, using the disclosed microfluidic chip for preparing liposomes, it is possible to maintain consistent conditions in mixing and dilution processes, thereby increasing the uniformity of liposome size, and it is possible to manufacture liposomes of various sizes by controlling simple variables such as concentration and flow rate. In addition, the disclosed method for preparing organic solvent-free liposomes does not require an additional organic phase removal process by using a sample that does not contain an organic solvent, and since there is no residual organic solvent, uniform organic solvent-free liposomes can be mass-produced.

Claims

리포좀 제조용 미세유체칩에 있어서,
기판;
상기 기판 상에 형성된 2 이상의 유입부;
상기 기판 상에 형성되고 상기 2 이상의 유입부와 연결된 혼합부;
상기 기판 상에 형성되고 상기 혼합부와 연결된 안정부; 및
상기 기판 상에 형성되고 상기 안정부와 연결된 유출부를 포함하고,
상기 혼합부는 유체 흐름의 수직방향으로 전단응력을 가하는 하나 이상의 마이크로기둥을 포함하고,
상기 미세유체칩은 높이가 100~200 ㎛인 채널로 구성되며,
상기 유입부는 폭이 200~400 ㎛이며,
상기 마이크로기둥은 유로와 60˚의 각도를 이루는 벽면 구조이며,
바이셀 및 완충액이 상기 유입부에 주입되고 상기 혼합부에서 리포좀 형태로 전환되며,
상기 안정부는 상기 혼합부 대비 폭이 확장된 육각형 형태의 채널로 구성되고 유속을 감소시켜 상기 리포좀의 안정성을 확보하는 것을 특징으로 하는 리포좀 제조용 미세유체칩.
In the microfluidic chip for producing liposomes,
Board;
two or more inlets formed on the substrate;
a mixing unit formed on the substrate and connected to the two or more inlets;
a stabilizing part formed on the substrate and connected to the mixing part; and
It is formed on the substrate and includes an outflow portion connected to the stabilization portion,
The mixing unit includes one or more micro-columns that apply shear stress in the vertical direction of the fluid flow,
The microfluidic chip is composed of a channel having a height of 100 to 200 μm,
The inlet has a width of 200 to 400 μm,
The microcolumn is a wall structure forming an angle of 60 degrees with the flow path,
Vicell and buffer are injected into the inlet and converted into liposomes in the mixing section,
The stabilizing part is composed of a hexagonal channel with an extended width compared to the mixing part and reduces the flow rate to secure the stability of the liposome microfluidic chip.

삭제delete

청구항 1에 있어서,
상기 마이크로기둥은 폭이 150~200 ㎛인 것을 특징으로 하는 리포좀 제조용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The microcolumns are microfluidic chips for producing liposomes, characterized in that the width is 150 ~ 200 ㎛.

청구항 1에 있어서,
상기 마이크로기둥은 원형 기둥 또는 3개 이상의 변으로 이루어진 다각형 기둥인 것을 특징으로 하는 리포좀 제조용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The micro-column is a microfluidic chip for producing liposomes, characterized in that a circular column or a polygonal column consisting of three or more sides.

청구항 6에 있어서,
상기 마이크로기둥은 직경이 100~200 ㎛인 원형 기둥 또는 상기 마이크로기둥의 변의 길이가 100~200 ㎛인 다각형 기둥인 것을 특징으로 하는 리포좀 제조용 미세유체칩.
The method of claim 6,
The microfluidic chip for producing liposomes, characterized in that the microcolumns are circular pillars with a diameter of 100 to 200 μm or polygonal pillars with side lengths of 100 to 200 μm.

청구항 1에 있어서,
상기 안정부는 폭이 2~3 mm이고, 길이가 6~7 mm인 채널로 이루어진 것을 특징으로 하는 리포좀 제조용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The stabilizer is a microfluidic chip for producing liposomes, characterized in that consisting of a channel having a width of 2 to 3 mm and a length of 6 to 7 mm.

청구항 1에 있어서,
상기 기판은 PDMS(polydimethylsiloxane)를 소프트몰딩(soft-molding)법 또는 사출성형법으로 성형하여 제조된 것을 특징으로 하는 리포좀 제조용 미세유체칩.
The method of claim 1,
The substrate is a microfluidic chip for producing liposomes, characterized in that manufactured by molding polydimethylsiloxane (PDMS) by a soft-molding method or an injection molding method.

리포좀 제조용 미세유체칩을 사용하는 무유기용매 리포좀의 제조방법에 있어서,
기판;
상기 기판 상에 형성된 2 이상의 유입부;
상기 기판 상에 형성되고 상기 2 이상의 유입부와 연결된 혼합부;
상기 기판 상에 형성되고 상기 혼합부와 연결된 안정부; 및
상기 기판 상에 형성되고 상기 안정부와 연결된 유출부를 포함하고,
상기 혼합부는 유체 흐름의 수직방향으로 전단응력을 가하는 하나 이상의 마이크로기둥을 포함하고,
상기 미세유체칩은 높이가 100~200 ㎛인 채널로 구성되며,
상기 유입부는 폭이 200~400 ㎛이며,
상기 마이크로기둥은 유로와 60˚의 각도를 이루는 벽면 구조이며,
바이셀 및 완충액이 상기 유입부에 주입되고 상기 혼합부에서 리포좀 형태로 전환되며,
상기 안정부는 상기 혼합부 대비 폭이 확장된 육각형 형태의 채널로 구성되고 유속을 감소시켜 상기 리포좀의 안정성을 확보하는 것을 특징으로 하는 리포좀 제조용 미세유체칩을 사용하는 무유기용매 리포좀의 제조방법.
In the method for producing organic solvent-free liposomes using a microfluidic chip for producing liposomes,
Board;
two or more inlets formed on the substrate;
a mixing unit formed on the substrate and connected to the two or more inlets;
a stabilizing part formed on the substrate and connected to the mixing part; and
It is formed on the substrate and includes an outflow portion connected to the stabilization portion,
The mixing unit includes one or more micro-columns that apply shear stress in the vertical direction of the fluid flow,
The microfluidic chip is composed of a channel having a height of 100 to 200 μm,
The inlet has a width of 200 to 400 μm,
The microcolumn is a wall structure forming an angle of 60 degrees with the flow path,
Vicell and buffer are injected into the inlet and converted into liposomes in the mixing section,
The stabilizing part is composed of a hexagonal channel with an extended width compared to the mixing part and reduces the flow rate to secure the stability of the liposome.

청구항 10에 있어서,
상기 바이셀을 구성하는 긴 탄소사슬 지질과 짧은 탄소사슬 지질의 비율은 3~7 : 7~3인 것을 특징으로 하는 무유기용매 리포좀의 제조방법.
The method of claim 10,
Method for producing organic solvent-free liposomes, characterized in that the ratio of long carbon chain lipids and short carbon chain lipids constituting the bicell is 3-7: 7-3.

청구항 10에 있어서,
상기 바이셀 및 상기 완충액의 비율을 조절하여 최종 지질 농도를 4~8 mM로 제어하는 것을 특징으로 하는 무유기용매 리포좀의 제조방법.
The method of claim 10,
Method for producing organic solvent-free liposomes, characterized in that the final lipid concentration is controlled to 4 ~ 8 mM by adjusting the ratio of the vicell and the buffer.

삭제delete