KR102476844B1 - Wound treatment and dressing material containing Prussian blue nanoparticles, and manufacturing method thereof - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 실시예는 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 강력한 ROS 소거능과 항염증 활성 및 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과로 인하여 상처를 빠르게 회복하도록 유도하고 상처 부위의 피부 조직 재생을 빠르게 개선시킬 수 있는 효과를 갖는 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법을 제공 가능한 효과가 있다.One embodiment of the present invention provides a wound healing agent containing Prussian blue nanoparticles, a dressing material, and a manufacturing method thereof. According to one embodiment of the present invention, the Prussian blue nanoparticles induce rapid recovery of wounds due to their strong ROS scavenging ability and anti-inflammatory activity, induction of differentiation of keratinocytes, promotion of tissue microvascularization, and collagen deposition effects, There is an effect capable of providing a wound healing agent, a dressing material, and a manufacturing method thereof having an effect of rapidly improving skin tissue regeneration.

Description

프러시안 블루 나노입자를 포함하는 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법{Wound treatment and dressing material containing Prussian blue nanoparticles, and manufacturing method thereof}Wound treatment and dressing material containing Prussian blue nanoparticles, and manufacturing method thereof}

본 발명은 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 상처 치료제, 드레싱재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a wound treatment material, a dressing material, and a manufacturing method thereof, and more particularly, to a wound treatment material containing Prussian blue nanoparticles, a dressing material, and a manufacturing method thereof.

상처(wound)는 신체를 외부 감염원의 침입으로부터 보호하고 수분과 체온을 유지하는 피부 조직이 손상된 상태를 일컫는 것으로, 상처 치료(wound healing)는 손상된 조직의 기능과 형태적 특성을 정상화시키기 위한 필수적인 반응이다. 상처 발생 시 적절하게 치료되지 않으면 상처 부위를 통한 세균 감염 등으로 인체에 치명적 손상을 일으킬 수 있으므로 손상된 피부 부위가 가능한 한 빨리, 또 본래 피부 구조와 유사하게 복원되도록 조치를 취하는 것이 중요하다.Wound refers to a condition in which the skin tissue that protects the body from the invasion of external infectious agents and maintains moisture and body temperature is damaged. Wound healing is an essential response to normalize the function and morphological characteristics of damaged tissue. to be. When a wound is not properly treated, it can cause fatal damage to the human body due to bacterial infection through the wound, so it is important to take measures to restore the damaged skin area as quickly as possible and similar to the original skin structure.

그러나 상처 발생 시 상처 부위에서 발생하는 과도한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 및 염증 반응은 세포의 항산화 시스템을 압도하고 치유 과정을 방해하게 된다. 일반적으로 인간 포유류 세포는 증가된 세포 내 ROS에 대응하기 위한 기본적 항산화 방어 시스템을 갖추고 있지만, 상처 부위에서의 지속적인 산화 스트레스는 피부 세포(섬유 아세포, 각질 세포 등)의 기능을 손상시키고 염증, 괴사 및 섬유성 흉터를 촉진하여 피부 조직의 복구 과정을 지연시키게 된다. However, excessive reactive oxygen species (ROS) and inflammatory reactions generated at the wound site during wounding overwhelm the cellular antioxidant system and interfere with the healing process. In general, human mammalian cells have a basic antioxidant defense system to counter increased intracellular ROS, but persistent oxidative stress at the wound site impairs the function of skin cells (fibroblasts, keratinocytes, etc.) and leads to inflammation, necrosis, and It promotes fibrotic scarring and delays the repair process of skin tissue.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 최근 다양한 무기 나노 물질과 나노 기술 기반 치료제 등의 외인성 물질 도입을 통한 상처 조직의 빠른 치유와 회복을 위한 연구 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 대표적으로, CeO₂ 나노입자, MnO₂ 나노입자, 탄소 나노 튜브, 풀러렌(Fullerene) 및 Pt 나노입자 등이 조직의 산화 스트레스와 염증으로 인한 손상을 억제하기 위하여 적용이 시도되었다.In order to solve this problem, research and development for rapid healing and recovery of scar tissue through the introduction of exogenous materials such as various inorganic nanomaterials and nanotechnology-based therapeutic agents have recently been actively conducted. Representatively, CeO ₂ nanoparticles, MnO₂ nanoparticles, carbon nanotubes, fullerene, and Pt nanoparticles have been applied to suppress tissue damage due to oxidative stress and inflammation.

그러나 종래의 나노입자들은 제한적인 ROS 소거능을 가지거나, 가장 중요하게는 생물학적 안정성, 즉 체내 생체 적합성이나 장기적인 생체 내 효과에 있어 완전히 조사되지 않았다는 문제점이 있었다. 예를 들어, 호흡기를 통해 CeO₂ 나노입자에 노출된 쥐의 폐에서 폐 섬유증이 유발되었고 정맥 투여 시에는 간 손상을 유발하는 것이 확인된 바 있다. 또한, MnO₂ 나노입자의 반복적 경구 노출이 쥐에서 유전적 손상이나 생화학적 변화 및 조직학적 변화를 일으킨다는 사실이 연구된 바 있다.However, conventional nanoparticles have problems in that they have limited ROS scavenging ability or, most importantly, biological stability, that is, in vivo biocompatibility or long-term in vivo effects have not been fully investigated. For example, it has been confirmed that pulmonary fibrosis was induced in the lungs of mice exposed to CeO ₂ nanoparticles through the respiratory system, and liver damage was induced when administered intravenously. In addition, it has been studied that repeated oral exposure of MnO₂ nanoparticles causes genetic damage or biochemical and histological changes in mice.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 이미 생물학적 안정성이 검증되어 확인된 바 있으면서도 충분한 상처 치유 효능을 갖는 나노 물질의 탐색이 필요한 실정이다.In order to solve this problem, there is a need to search for nanomaterials having sufficient wound healing efficacy while their biological stability has already been verified and confirmed.

대한민국 공개특허 제2012-0094896호Republic of Korea Patent Publication No. 2012-0094896

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 이미 생물학적 안정성이 충분히 검증되어 확인된 프러시안 블루 나노입자의 신규한 상처 치료 및 피부 재생 효능을 밝힘으로써 이를 이용하여 상처 치료 또는 피부 조직 재생 효율이 향상된 치료제 및 드레싱재를 제공하는 것이다.The technical problem to be achieved by the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art, and by revealing the novel wound treatment and skin regeneration efficacy of Prussian blue nanoparticles, which have already been sufficiently verified for their biological stability, It is to provide a therapeutic agent and dressing material with improved treatment or skin tissue regeneration efficiency.

또한, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 프러시안 블루 나노입자의 결정화 특성을 이용하여 프러시안 블루 나노입자를 도포 또는 코팅하려는 드레싱재의 환부 접촉면을 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액에 담그거나 도포함으로써 손쉽게 드레싱재를 제조 가능한 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법을 제공하는 것이다.In addition, the technical problem to be achieved by the present invention is to immerse or apply a precursor solution for forming Prussian blue nanoparticles to the contact surface of the affected area of a dressing material to be applied or coated with Prussian blue nanoparticles by using the crystallization characteristics of Prussian blue nanoparticles. By doing so, it is to provide a method for manufacturing a dressing material for wound treatment or skin tissue regeneration that can easily manufacture a dressing material.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned technical problem, and other technical problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 상처 치료제를 제공한다.In order to achieve the above technical problem, one embodiment of the present invention provides a wound healing agent.

상기 상처 치료제는, 프러시안 블루 나노입자 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The wound healing agent may include a Prussian blue nanoparticle additive.

상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The wound may be a wound, abrasion, laceration, stab wound, ulcer, or a combination thereof.

상기 피부 조직 재생은 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The skin tissue regeneration may be characterized by induction of differentiation of keratinocytes, promotion of tissue microangiogenesis, collagen deposition, or a combination thereof.

상기 상처 치료제는, 항염증제, 진통제, 항-감염제 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상을 포함하는 상처 치료를 위한 치료 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The wound healing agent may further include a therapeutic component for wound healing including at least one selected from the group consisting of an anti-inflammatory agent, an analgesic agent, an anti-infective agent, or a combination thereof.

상기 상처 치료제는, 현탁액, 겔, 로션, 크림 또는 연고 성상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The wound healing agent may be in the form of a suspension, gel, lotion, cream or ointment.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재를 제공한다.In order to achieve the above technical problem, one embodiment of the present invention provides a dressing material for wound healing or skin tissue regeneration.

상기 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재는, 프러시안 블루 나노입자가 환부 접촉면에 도포 또는 코팅된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The dressing material for wound treatment or skin tissue regeneration may be characterized in that Prussian blue nanoparticles are applied or coated on the contact surface of the affected area.

상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The wound may be a wound, abrasion, laceration, stab wound, ulcer, or a combination thereof.

상기 피부 조직 재생은 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The skin tissue regeneration may be characterized by induction of differentiation of keratinocytes, promotion of tissue microangiogenesis, collagen deposition, or a combination thereof.

상기 드레싱재는, 하이드로콜로이드형, 폴리우레탄 폼형, 필름형 또는 하이드로겔형인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The dressing material may be of a hydrocolloid type, polyurethane foam type, film type or hydrogel type.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above technical problem, one embodiment of the present invention provides a method for manufacturing a dressing material for wound healing or skin tissue regeneration.

상기 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법은, 드레싱재를 준비하는 단계; 및 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The manufacturing method of the dressing material for wound healing or skin tissue regeneration includes preparing a dressing material; and coating the surface of the dressing material in contact with the affected area with Prussian blue nanoparticles.

상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계는, 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계; 및 상기 드레싱재의 환부 접촉면을 상기 전구체 용액에 담그거나, 상기 전구체 용액을 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 도포하여 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 형성시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The step of coating Prussian blue nanoparticles on the contact surface of the dressing material with the affected area includes preparing a precursor solution for forming Prussian blue nanoparticles; and immersing the dressing material in contact with the affected area in the precursor solution or applying the precursor solution to the affected area contact surface of the dressing material to form Prussian blue nanoparticles on the affected area contact surface of the dressing material. can

상기 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계는, 페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물 및 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물을 용매와 혼합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.In preparing the precursor solution for forming the Prussian blue nanoparticles, a compound containing a ferricyanide ion ([Fe(CN) ₆ ] ^3- ) and a compound containing an iron ion (Fe ³⁺ ) are mixed. preparing a mixture; And mixing the mixture with a solvent; it may be characterized by comprising a.

상기 페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물은, 페리시안화칼륨(K₃Fe(CN)₆) 또는 페리시안화나트륨(Na₃Fe(CN)₆)인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The compound containing the ferricyanide ion ([Fe(CN) ₆ ] ^3- ) is potassium ferricyanide (K ₃ Fe(CN) ₆ ) or sodium ferricyanide (Na ₃ Fe(CN) ₆ ), characterized in that it may be

상기 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물은, 염화철(FeCl₃), 과염소산철(Fe(ClO₄)₃) 및 질산철(Fe(NO₃)₃)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The compound containing iron ions (Fe ³⁺ ) is at least one selected from the group consisting of iron chloride (FeCl ₃ ), iron perchlorate (Fe(ClO ₄ ) ₃ ) and iron nitrate (Fe(NO ₃ ) ₃ ). It may be characterized by

상기 용매는 물인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The solvent may be water.

본 발명의 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 강력한 ROS 소거능과 항염증 활성 및 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과로 인하여 상처를 빠르게 회복하도록 유도하고 상처 부위의 피부 조직 재생을 빠르게 개선시킬 수 있는 효과를 갖는 프러시안 블루 나노입자 첨가제를 포함하는 상처 치료제 및 드레싱재를 제공 가능한 효과가 있다.According to an embodiment of the present invention, the strong ROS scavenging ability and anti-inflammatory activity of Prussian blue nanoparticles, induction of differentiation of keratinocytes, promotion of microangiogenesis in tissues, and collagen deposition effect induce rapid recovery of wounds and promote healing of wounds. There is an effect capable of providing a wound treatment and dressing material containing the Prussian blue nanoparticle additive having an effect of rapidly improving skin tissue regeneration.

또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 결정화 특성을 이용하여 프러시안 블루 나노입자를 도포 또는 코팅하려는 드레싱재의 환부 접촉면을 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액에 담그거나 도포함으로써 손쉽게 드레싱재를 제조 가능한 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법을 제공 가능한 효과가 있다.In addition, according to an embodiment of the present invention, the contact surface of a dressing material to be applied or coated with Prussian blue nanoparticles is immersed in a precursor solution for forming Prussian blue nanoparticles or applied using the crystallization characteristics of Prussian blue nanoparticles. By doing so, there is an effect that can provide a method of manufacturing a dressing material for wound treatment or skin tissue regeneration that can easily manufacture a dressing material.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.The effects of the present invention are not limited to the above effects, and should be understood to include all effects that can be inferred from the detailed description of the present invention or the configuration of the invention described in the claims.

도 1은 본 발명의 PB 나노입자의 특성을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 PB 나노입자의 항산화 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 PB 나노입자의 시험관 내 세포 독성을 확인하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 PB 나노입자의 체외 항 염증 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 PB 나노입자의 생체 내 상처 치유 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 PB 나노입자를 처리한 상처 피부 샘플을 조직학적으로 분석한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 PB 나노입자를 처리한 상처 피부에서의 콜라겐 조직을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 8은 본 발명의 PB 나노입자를 처리한 피부 상처 모델의 면역 조직 화학적 염색 분석 사진이다.
도 9는 본 발명의 PB 나노 자임의 생체 내 항 염증 효과를 나타내는 이미지 및 그래프이다.1 is a graph showing the analysis of the characteristics of the PB nanoparticles of the present invention.
2 is a graph showing the antioxidant activity of the PB nanoparticles of the present invention.
3 is a graph showing the in vitro cytotoxicity of the PB nanoparticles of the present invention.
4 is a graph showing the in vitro anti-inflammatory effect of the PB nanoparticles of the present invention.
5 is a graph showing the in vivo wound healing activity of the PB nanoparticles of the present invention.
6 is a graph of histologically analyzing wound skin samples treated with the PB nanoparticles of the present invention.
7 is a photograph and a graph showing collagen tissue in wound skin treated with the PB nanoparticles of the present invention.
8 is a photograph of immunohistochemical staining analysis of a skin wound model treated with the PB nanoparticles of the present invention.
9 is an image and a graph showing the in vivo anti-inflammatory effect of the PB nanozyme of the present invention.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.Hereinafter, the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. However, the present invention may be embodied in many different forms and, therefore, is not limited to the embodiments described herein. And in order to clearly explain the present invention in the drawings, parts irrelevant to the description are omitted, and similar reference numerals are attached to similar parts throughout the specification.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.Throughout the specification, when a part is said to be "connected (connected, contacted, combined)" with another part, this is not only "directly connected", but also "indirectly connected" with another member in between. "Including cases where In addition, when a part "includes" a certain component, it means that it may further include other components without excluding other components unless otherwise stated.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.Terms used in this specification are only used to describe specific embodiments, and are not intended to limit the present invention. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In this specification, terms such as "include" or "have" are intended to indicate that there is a feature, number, step, operation, component, part, or combination thereof described in the specification, but one or more other features It should be understood that the presence or addition of numbers, steps, operations, components, parts, or combinations thereof is not precluded.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명의 일 실시예에 따른 상처 치료제를 설명한다.A wound healing agent according to an embodiment of the present invention will be described.

상기 상처 치료제는, 프러시안 블루(Prussian Blue, PB) 나노입자 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The wound healing agent may include a Prussian Blue (PB) nanoparticle additive.

상기 프러시안 블루 나노입자(이하 PB 나노입자)는, 페로시안화 철의 수화물로, 푸른 빛깔을 띄는 것을 특징으로 하며, 종래 주로 세슘이나 탈륨에 노출된 환자의 치료를 위해 사용되거나, 자기공명영상(MRI)을 위한 생체 적합성 조영제로 개발되어, 근적외선을 열로 변환하는 기능 덕분에 광열 암 치료에도 사용되어 FDA에서 승인되어 그 생체 안정성이 입증되었다.The Prussian blue nanoparticles (hereinafter referred to as PB nanoparticles) are a hydrate of iron ferrocyanide and are characterized by a blue color, and are conventionally used mainly for the treatment of patients exposed to cesium or thallium, or magnetic resonance imaging ( It was developed as a biocompatible contrast agent for MRI) and, thanks to its function of converting near-infrared rays into heat, it was also used for photothermal cancer treatment and was approved by the FDA, proving its biostability.

상기 PB 나노입자는 또한 PB 나노입자는 입자는 카탈라아제(catalase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD)와 같은 여러 생물학적 효소의 작용을 모방할 수 있는 특징을 가지므로 차세대 나노자임으로 각광받고 있다. 그러나 상기 PB 나노입자의 상처 치료 또는 피부 조직 재생을 위한 효능은 아직 연구된 바 없다.The PB nanoparticles are also characterized by being able to mimic the actions of various biological enzymes such as catalase, peroxidase, and superoxide dismutase (SOD). It is in the limelight as a next-generation nanozyme. However, the efficacy of the PB nanoparticles for wound healing or skin tissue regeneration has not yet been studied.

이에 착안하여, 본 발명의 발명자들은, 상기 기존에 생체 적합성이 이미 충분히 입증된 바 있는 PB 나노입자를 이용하여 상처 치료제의 첨가제로서의 신규한 용도를 발명하기에 이르렀다.In view of this, the inventors of the present invention came to invent a new use as an additive for a wound treatment using the PB nanoparticles whose biocompatibility has already been sufficiently demonstrated.

이때, 상기 PB 나노입자는, 세포 내 ROS 소거능 및 염증성 사이토카인의 발현 억제를 통한 항염증 활성 특성뿐 아니라, 이를 통한 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.At this time, the PB nanoparticles have anti-inflammatory activity properties through intracellular ROS scavenging ability and inhibition of inflammatory cytokine expression, as well as induction of differentiation of keratinocytes, promotion of tissue microvascularization, and collagen deposition. to be

전술한 바와 같이, 상처 발생 시 상처 부위에서 발생하는 과도한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 및 염증 반응은 세포의 항산화 시스템을 압도하고 치유 과정을 방해하게 된다. As described above, excessive reactive oxygen species (ROS) and inflammatory reactions generated at the wound site during wounding overwhelm the cellular antioxidant system and interfere with the healing process.

따라서, 상기 PB 나노입자를 첨가제로 포함하는 본 발명의 상처 치료제는, 상기 PB 나노입자의 강력한 ROS 소거능과 항염증 활성뿐만 아니라, 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과로 인하여, 상처를 빠르게 회복하도록 유도하고 상처 부위의 피부 조직 재생을 빠르게 개선시킬 수 있는 효과를 갖는다. Therefore, the wound healing agent of the present invention comprising the PB nanoparticles as an additive has not only the strong ROS scavenging and anti-inflammatory activities of the PB nanoparticles, but also the induction of differentiation of keratinocytes, promotion of tissue microvascularization, and collagen deposition effects. Due to this, it has an effect of inducing rapid recovery of wounds and rapidly improving skin tissue regeneration at the wound site.

이때, 상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있다.In this case, the wound may be a wound, abrasion, laceration, stab wound, ulcer, or a combination thereof.

이때, 상기 피부 조직 재생은 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있다.At this time, the skin tissue regeneration may be characterized by induction of differentiation of keratinocytes, promotion of tissue microvascularization, collagen deposition, or a combination thereof.

상기 상처 치료제는, 항염증제, 진통제, 항-감염제 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상을 포함하는 상처 치료를 위한 치료 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상처 치료를 위해 사용되는 공지의 치료제 성분이라면 제한 없이 이용될 수 있다.The wound healing agent may further include a therapeutic component for wound healing including at least one selected from the group consisting of an anti-inflammatory agent, an analgesic agent, an anti-infective agent, or a combination thereof, but is limited thereto It is not, and any known therapeutic component used for wound treatment may be used without limitation.

이때, 상기 상처 치료제는, 현탁액, 겔, 로션, 크림 또는 연고 성상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상처를 치료하기 위해 유효하고 효과적인 성상이라면 제한없이 해당될 수 있다.At this time, the wound healing agent may be characterized in that it is a suspension, gel, lotion, cream or ointment, but is not limited thereto, and may be applicable without limitation as long as it is effective and effective for treating wounds.

상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 강력한 ROS 소거능과 항염증 활성 및 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과로 인하여 상처를 빠르게 회복하도록 유도하고 상처 부위의 피부 조직 재생을 빠르게 개선시킬 수 있는 효과를 갖는 프러시안 블루 나노입자 첨가제를 포함하는 상처 치료제를 제공 가능한 효과가 있다.Due to the characteristics of the configuration as described above, according to one embodiment of the present invention, the strong ROS scavenging ability and anti-inflammatory activity of Prussian blue nanoparticles, induction of differentiation of keratinocytes, promotion of tissue microvascularization, and collagen deposition effects There is an effect capable of providing a wound healing agent containing a Prussian blue nanoparticle additive having an effect of inducing rapid recovery of a wound and rapidly improving skin tissue regeneration of a wound.

본 발명의 다른 실시예에 따른 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재를 설명한다.A dressing material for wound healing or skin tissue regeneration according to another embodiment of the present invention will be described.

상기 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재는, 프러시안 블루 나노입자가 환부 접촉면에 도포 또는 코팅된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.The dressing material for wound treatment or skin tissue regeneration may be characterized in that Prussian blue nanoparticles are applied or coated on the contact surface of the affected area.

이때, 상기 드레싱재는, 하이드로콜로이드형, 폴리우레탄 폼형, 필름형 또는 하이드로겔형인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.At this time, the dressing material may be characterized in that the hydrocolloid type, polyurethane foam type, film type or hydrogel type.

본 발명에서 사용되는 용어 '드레싱(dressing)'이란, 상처면을 보호하기 위하여 소정의 소재로 상처를 덮어주는 것을 말하며, 이때 사용되는 소재를 '드레싱재'라 한다. 드레싱재는 상처에 외부로부터의 이물 침입을 방지하고 물리적 충격 혹은 자극으로부터 보호하며, 내부의 상처 분비물을 흡수 또는 제거하여 상처가 효율적으로 아물도록 보조하는 역할을 한다. The term 'dressing' used in the present invention refers to covering a wound with a predetermined material to protect the wound surface, and the material used at this time is called a 'dressing material'. The dressing material serves to prevent foreign matter from entering the wound, protect it from physical shock or irritation, and absorb or remove internal wound secretions to help the wound heal efficiently.

드레싱은 크게 건조드레싱과 습윤드레싱으로 분류할 수 있다.Dressings can be broadly classified into dry dressings and wet dressings.

상기 건조드레싱은 전통적인 종래 방식의 드레싱을 의미한다. 이는 가격이 저렴할 뿐만 아니라 창상을 건조시켜 치유하는 것이 바이러스 등의 번식을 막고 감염을 줄일 수 있기 때문에 감염방지에 좋은 효과를 볼 수 있지만, 외부로부터의 세균에 대한 방어능력이 없고, 드레싱재가 상처 면에 고착하기 쉽고 이물을 남기게 되는 단점이 있다. The dry dressing refers to a traditional conventional dressing. This is not only cheap, but also has a good effect on preventing infection because drying and healing the wound can prevent the propagation of viruses and reduce infection, but it has no ability to defend against germs from the outside, and the dressing material is applied to the wound surface. There is a disadvantage that it is easy to adhere to and leaves foreign matter.

즉, 삼출액 흡수성, 물리적 보호성은 갖고 있으나, 상처의 회복에 필요한 습윤 환경 유지성, 이물질 세균 침입 방어 능력, 보온성 등 창상 치유 인자에 관한 특성은 보유하지 못한 단순 보호재로서의 특성을 갖고 있다.That is, it has exudate absorption and physical protection, but it has properties as a simple protective material that does not have properties related to wound healing factors such as maintenance of a moist environment necessary for wound recovery, ability to defend against invasion of foreign substances, and warmth.

상기 습윤드레싱은 종래 건조드레싱의 문제점을 해결하기 위한 것으로 상처의 치유는 건조 환경보다 습윤 환경에서 보다 효율적으로 진행된다는 사실에 착안하여 개발된 드레싱 기술이다. 특히, 삼출액에 포함되어 있는 다핵 백혈구, 대식세포, 단백질 분해효소, 세포 성장인자 등의 창상 치유에 관여하는 물질들이 건조 환경에서는 외부로 배출되거나 건조되어 그 역할을 못하게 되지만 습윤 환경에서는 원활하게 그 역할을 수행할 수 있기 때문에 상처 치유가 효율적으로 진행 가능하다.The wet dressing is a dressing technique developed in consideration of the fact that healing of wounds proceeds more efficiently in a wet environment than in a dry environment to solve the problems of conventional dry dressings. In particular, substances involved in wound healing such as multinuclear leukocytes, macrophages, proteolytic enzymes, and cell growth factors contained in the exudate are discharged to the outside or dried out in a dry environment and lose their role, but play a role smoothly in a wet environment. can perform wound healing efficiently.

상기 습윤드레싱으로 사용되는 드레싱재의 종류는 크게 하이드로콜로이드, 폴리우레탄 폼, 하이드로겔 등이 있다. Types of dressing materials used as the wet dressing include hydrocolloid, polyurethane foam, hydrogel, and the like.

그러나 종래의 습윤 드레싱재는, 상처의 삼출액 흡수 기능 등은 뛰어나지만, 전술한 바와 같은 상처의 과도한 ROS 발생 등으로 인한 치유 효율 저하 문제나 상처 난 피부 조직 자체의 재생 능력을 향상시키는 것에 기여하지는 못한다는 문제점이 있었다.However, the conventional wet dressing material, although excellent in absorbing exudate from the wound, does not contribute to improving the healing efficiency problem or the regeneration ability of the wounded skin tissue itself due to the excessive generation of ROS in the wound as described above. There was a problem.

이에, 본 발명의 발명자들은 전술한 상처 치료 또는 피부 조직 재생 효능을 갖는 프러시안 블루 나노입자를 본 발명의 드레싱재의 환부 접촉면에 도포 또는 코팅함으로써, 상기 프러시안 블루 나노입자가 상처 부위에 과도하게 발생된 ROS를 소거하고 염증성 사이토카인의 발현 억제를 통한 항염증 활성을 증진시킬 뿐 아니라, 상처 조직의 각질 세포 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진 및 콜라겐 침착 효능을 통하여 상처 치유 효율을 현저하게 향상시킨 드레싱재를 발명하기에 이르렀다. Therefore, the inventors of the present invention apply or coat the Prussian blue nanoparticles having the aforementioned wound healing or skin tissue regeneration effect on the affected area contact surface of the dressing material of the present invention, so that the Prussian blue nanoparticles are excessively generated in the wound area. It eliminates ROS and promotes anti-inflammatory activity by suppressing the expression of inflammatory cytokines, as well as significantly improving wound healing efficiency through the induction of keratinocyte differentiation in scar tissue, promotion of tissue microvascularization, and collagen deposition. It led to the invention of a dressing material.

이때, 상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.In this case, the wound may be a wound, abrasion, laceration, stab wound, ulcer, or a combination thereof.

이때, 상기 피부 조직 재생은 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.At this time, the skin tissue regeneration may be characterized by induction of differentiation of keratinocytes, promotion of tissue microvascularization, collagen deposition, or a combination thereof.

상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 강력한 ROS 소거능과 항염증 활성 및 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 효과로 인하여 상처를 빠르게 회복하도록 유도하고 상처 부위의 피부 조직 재생을 빠르게 개선시킬 수 있는 효과를 갖는 프러시안 블루 나노입자가 환부 접촉면에 도포된 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재를 제공 가능한 효과가 있다.Due to the characteristics of the configuration as described above, according to one embodiment of the present invention, the strong ROS scavenging ability and anti-inflammatory activity of Prussian blue nanoparticles, induction of differentiation of keratinocytes, promotion of tissue microvascularization, and collagen deposition effects There is an effect capable of providing a dressing material for treating wounds or regenerating skin tissue coated with Prussian blue nanoparticles having an effect of inducing rapid recovery of wounds and rapidly improving skin tissue regeneration at the wound site.

본 발명의 또 다른 실시예에 따른 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법을 설명한다.A method for manufacturing a dressing material for wound healing or skin tissue regeneration according to another embodiment of the present invention will be described.

상기 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법은, 드레싱재를 준비하는 단계; 및 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.The manufacturing method of the dressing material for wound healing or skin tissue regeneration includes preparing a dressing material; and coating Prussian blue nanoparticles on the surface of the dressing material in contact with the affected area.

이때, 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계는, 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계; 및 상기 드레싱재의 환부 접촉면을 상기 전구체 용액에 담그거나, 상기 전구체 용액을 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 도포하여 상기 드레싱재의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 형성시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.At this time, the step of coating the Prussian blue nanoparticles on the affected area contact surface of the dressing material may include preparing a precursor solution for forming Prussian blue nanoparticles; and immersing the dressing material in contact with the affected area in the precursor solution or applying the precursor solution to the affected area contact surface of the dressing material to form Prussian blue nanoparticles on the affected area contact surface of the dressing material. can

상기와 같이 프러시안 블루 나노입자는 전구체 용액으로부터 스스로 결정화하는 특성을 가지므로, 프러시안 블루 나노입자를 도포 또는 코팅하려는 드레싱재의 환부 접촉면을 상기와 같이 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액에 담그거나 도포함으로써 본 발명의 드레싱재를 손쉽게 제조 가능하다.As described above, since the Prussian blue nanoparticles have the property of self-crystallizing from the precursor solution, the contact surface of the affected area of the dressing material to be applied or coated with the Prussian blue nanoparticles is immersed in the precursor solution for forming the Prussian blue nanoparticles as described above. By drawing or applying, the dressing material of the present invention can be easily manufactured.

이때, 상기 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계는, 페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물 및 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 상기 혼합물을 용매와 혼합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.At this time, in the step of preparing a precursor solution for forming the Prussian blue nanoparticles, a compound containing a ferricyanide ion ([Fe(CN) ₆ ] ^3- ) and a compound containing an iron ion (Fe ³⁺ ) are prepared. mixing to prepare a mixture; And mixing the mixture with a solvent; it may be characterized by comprising a.

이때, 상기 페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물은, 페리시안화칼륨(K₃Fe(CN)₆) 또는 페리시안화나트륨(Na₃Fe(CN)₆)인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.In this case, the compound containing the ferricyanide ion ([Fe(CN) ₆ ] ^3- ) is potassium ferricyanide (K ₃ Fe(CN) ₆ ) or sodium ferricyanide (Na ₃ Fe(CN) ₆ ). may be characterized.

이때, 상기 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물은, 염화철(FeCl₃), 과염소산철(Fe(ClO₄)₃) 및 질산철(Fe(NO₃)₃)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.At this time, the compound containing the iron ion (Fe ³⁺ ) is 1 selected from the group consisting of iron chloride (FeCl ₃ ), iron perchlorate (Fe(ClO ₄ ) ₃ ) and iron nitrate (Fe(NO ₃ ) ₃ ). It may be characterized by more than one species.

이때, 상기 용매는 물인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.At this time, the solvent may be characterized in that water.

상기와 같은 구성의 특징으로 인하여, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 프러시안 블루 나노입자의 결정화 특성을 이용하여 프러시안 블루 나노입자를 도포 또는 코팅하려는 드레싱재의 환부 접촉면을 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액에 담그거나 도포함으로써 손쉽게 드레싱재를 제조 가능한 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱재의 제조방법을 제공 가능한 효과가 있다.Due to the features of the configuration as described above, according to one embodiment of the present invention, the Prussian blue nanoparticles are formed on the contact surface of the affected area of the dressing material to be applied or coated with the Prussian blue nanoparticles by using the crystallization characteristics of the Prussian blue nanoparticles. There is an effect that can provide a method of manufacturing a dressing material for wound healing or skin tissue regeneration that can be easily manufactured by immersing or applying a precursor solution for a dressing material.

이하에서는 제조예, 비교예 및 실험예를 통해 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명한다. 하지만 본 발명이 하기 제조예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through Preparation Examples, Comparative Examples and Experimental Examples. However, the present invention is not limited to the following Preparation Examples and Experimental Examples.

<제조예 1> 프러시안 블루 나노입자의 제조<Preparation Example 1> Preparation of Prussian Blue Nanoparticles

본 발명의 일 실시예에 따른 프러시안 블루 나노입자를 포함하는 상처 치료제를 제조하기 위하여, 먼저 프러시안 블루 나노입자를 제조하였다.In order to prepare a wound healing agent containing Prussian blue nanoparticles according to an embodiment of the present invention, Prussian blue nanoparticles were first prepared.

상기 프러시안 블루 나노입자는, K₃Fe(CN)₆과 FeCl₂를 반응시켜 합성되었다. 이를 위하여, 먼저 13.2mg(40μmol) K₃Fe(CN)₆을 9mL의 탈 이온수 (DIW)에 용해시키고 8mg(40μmol)의 FeCl₂를 1mL DI에 별도로 용해시켰다. 그런 다음 FeCl₂ 용액을 ferricyanide 용액에 첨가하고 혼합물을 60℃에서 12시간 동안 교반하여 반응을 완료하였다. 마지막으로 PB 나노입자는 분자량 컷오프(MWCO; molecular weight cut-off)가 100kD 인 Nanosep®원심 분리 장치(Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 스핀 여과에 의해 정제되었다. The Prussian blue nanoparticles were synthesized by reacting K ₃ Fe(CN) ₆ and FeCl ₂ . To this end, first, 13.2 mg (40 μmol) K ₃ Fe(CN) ₆ was dissolved in 9 mL of deionized water (DIW) and 8 mg (40 μmol) of FeCl ₂ was separately dissolved in 1 mL DI. Then, the FeCl ₂ solution was added to the ferricyanide solution and the mixture was stirred at 60° C. for 12 hours to complete the reaction. Finally, the PB nanoparticles were purified by spin filtration using a Nanosep® centrifugal separator (Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI, USA) with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kD.

<실험예 1> PB 나노입자의 확인<Experimental Example 1> Identification of PB nanoparticles

본 발명의 PB 나노입자의 특성을 분석하는 실험을 진행하였다. 먼저 PB 나노입자의 크기와 표면 전하는 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 측정 (ELSZ 2000, Otsuka Electronics Co. Ltd., Osaka, Japan)에 의해 분석되었다. 나노입자의 형태는 투과 전자 현미경(TEM) 분석(TecnaiG2, FEI Co., Hillsboro, OR, USA)에 의해 분석되었다. PB 나노입자의 푸리에 변환 된 적외선 (FTIR) 스펙트럼은 FTIR 분광 광도계 (Spectrum 2000, Perkin-Elmar, Waltham, MA, USA)에서 KBr 펠릿 방법으로 분석 되었다. PB 나노입자의 결정도는 CuΚα 방사선을 사용하여 분말 X-선 회절(XRD) 측정(Rigaku RINT 2000, Rigaku Co., Tokyo, Japan)에 의해 분석되었다.Experiments were conducted to analyze the characteristics of the PB nanoparticles of the present invention. First, the size and surface charge of the PB nanoparticles were analyzed by Dynamic Light Scattering (DLS) measurements (ELSZ 2000, Otsuka Electronics Co. Ltd., Osaka, Japan). The morphology of the nanoparticles was analyzed by transmission electron microscopy (TEM) analysis (TecnaiG2, FEI Co., Hillsboro, OR, USA). Fourier transform infrared (FTIR) spectra of the PB nanoparticles were analyzed by the KBr pellet method on an FTIR spectrophotometer (Spectrum 2000, Perkin-Elmar, Waltham, MA, USA). The crystallinity of the PB nanoparticles was analyzed by powder X-ray diffraction (XRD) measurements (Rigaku RINT 2000, Rigaku Co., Tokyo, Japan) using CuΚα radiation.

도 1은 PB 나노입자의 특성을 분석하여 나타낸 그래프이다. 1 is a graph showing the analysis of the characteristics of PB nanoparticles.

도 1의 (a)는 PB 나노 자임의 UV- 가시 광선 흡수 스펙트럼을 나타낸 그래프이다. Figure 1(a) is a graph showing the UV-visible light absorption spectrum of PB nanozymes.

도 1의 (a)를 참조하면, PB 나노입자의 흡광도 스펙트럼은 Fe(II)와 Fe(III) 사이의 원자가 전하 이동으로 인해 약 690nm의 피크를 갖는 전형적인 넓은 스펙트럼의 PB를 나타내는 것을 확인할 수 있다.Referring to (a) of FIG. 1, it can be seen that the absorbance spectrum of PB nanoparticles shows a typical broad spectrum of PB with a peak at about 690 nm due to valence charge transfer between Fe(II) and Fe(III). .

도 1의 (b)는 DLS 측정에 의한 PB 나노 자임의 유체 역학적 크기 분포를 나타낸 그래프이다. Figure 1(b) is a graph showing the hydrodynamic size distribution of PB nanozymes by DLS measurement.

도 1의 (b)를 참조하면, PB 나노입자는 DLS 분석에서 우수한 단 분산도 (다 분산 지수 ~ 0.2)와 함께 34±8nm의 평균 유체 역학적 크기를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한, PB 나노입자의 제타 전위는 -38±7mV로 음의 표면 전하를 나타낸다.Referring to (b) of FIG. 1, it can be seen that the PB nanoparticles exhibit an average hydrodynamic size of 34±8 nm with excellent monodispersity (polydispersity index ~ 0.2) in DLS analysis. In addition, the zeta potential of the PB nanoparticles is -38±7mV, indicating a negative surface charge.

도 1의 (c)는 PB 나노입자의 저배율 TEM 이미지이다. 도 1의 (d)는 단일 PB 나노입자의 고배율 TEM 이미지이다. 1(c) is a low-magnification TEM image of PB nanoparticles. 1(d) is a high-magnification TEM image of a single PB nanoparticle.

도 1의 (c) 및 (d)를 참조하면, 단분산 PB 나노입자가 특징적인 입방체 모양으로 성공적으로 형성되었음을 확인할 수 있다.Referring to (c) and (d) of FIG. 1 , it can be confirmed that the monodisperse PB nanoparticles were successfully formed in a characteristic cubic shape.

도 1의 (e)는 PB 나노입자의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다. 1(e) is a graph showing the FTIR spectrum of PB nanoparticles.

도 1의 (e)를 참조하면, PB 나노입자의 FTIR 스펙트럼은 2080cm^-1에서 주요 피크를 나타냈으며, 이는 Fe(II)-CN-Fe(III) 결합에서 늘어난 -C≡N-의 특성을 나타내는 피크임을 확인할 수 있다. 3415cm^-1 주변의 넓은 피크는 하이드록실기(-OH), 1611cm^-1의 피크는 H-O-H의 굽힘에서 발생하여 PB 나노입자 내에 물이 존재함을 나타낸다.Referring to (e) of FIG. 1, the FTIR spectrum of the PB nanoparticles showed a main peak at 2080 cm ^-1 , indicating the nature of -C≡N- extended in Fe(II)-CN-Fe(III) bonds. It can be confirmed that the peak represents The broad peak around 3415 cm ^-1 is a hydroxyl group (-OH), and the peak at 1611 cm ^-1 is caused by bending of HOH, indicating the presence of water in the PB nanoparticles.

도 1의 (f)는 XRD 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.1(f) is a graph showing an XRD spectrum.

도 1의 (f)를 참조하면, PB 나노입자의 XRD 측정은 16.8°, 24.2°, 34.6°, 38.9°, 50.2°, 53.4° 및 56.5°의 2θ값에서 특징적인 회절 피크를 보였으며, 전술한 흡광도 스펙트럼, DLS, TEM, FTIR 스펙트럼 및 XRD 패턴을 통해 좁은 크기 분포와 높은 결정도를 가진 PB 나노입자의 성공적인 합성을 확인할 수 있다.Referring to (f) of FIG. 1, the XRD measurement of the PB nanoparticles showed characteristic diffraction peaks at 2θ values of 16.8 °, 24.2 °, 34.6 °, 38.9 °, 50.2 °, 53.4 ° and 56.5 °, Absorbance spectra, DLS, TEM, FTIR spectra and XRD patterns confirmed the successful synthesis of PB nanoparticles with narrow size distribution and high crystallinity.

<실험예 2> PB 나노입자의 항산화 활성 측정 실험<Experimental Example 2> Antioxidant activity measurement experiment of PB nanoparticles

포유류 세포에서 SOD와 카탈라아제는 일반적으로 각각 과산화물(슈퍼옥사이드 음이온)과 H₂O₂의 분해를 담당하는 두 가지 주요 항산화 효소이다. 카탈라아제와 퍼옥시다아제는 독성 H₂O₂를 산소(O₂) 및 물(H₂O)과 같은 생체 독성을 갖지 않는 물질로 분해할 수 있으며, 이때 PB 나노입자는 다양한 산화환원 경로를 통해 SOD, 카탈라아제 및 퍼옥시다아제의 모방 활성을 나타낼 수 있다. 과산화수소(H₂O₂) 및 슈퍼옥사이드 음이온 산소(O^2-)는 상처 또는 조직 손상 시 세포에서 가장 많이 생성되는 ROS이므로, 따라서 본 실험예 2에서는 PB 나노입자의 과산화수소(H₂O₂) 분해 활성 및 과산화물 소거 활성을 확인하는 실험을 진행하였다.In mammalian cells, SOD and catalase are the two major antioxidant enzymes generally responsible for the breakdown of superoxide (superoxide anion) and H ₂ O ₂ , respectively. Catalase and peroxidase can decompose toxic H ₂ O ₂ into substances that do not have biotoxicity, such as oxygen (O ₂ ) and water (H ₂ O). It can exhibit catalase and peroxidase mimetic activity. Hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) and superoxide anion oxygen (O ^2- ) are ROS most frequently produced in cells during wound or tissue damage. Therefore, in Experimental Example 2, hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) decomposition An experiment was conducted to confirm the activity and peroxide scavenging activity.

먼저 PB 나노입자의 과산화수소 분해 활성을 확인하기 위하여, 다양한 농도의 PB 나노입자를 H₂O₂ 용액(250μM)과 혼합하고 37℃ 100rpm에서 교반하였다. 일정 시간 간격으로 반응 혼합물에서 용액 20μL를 추출하여 자일레놀 오렌지(xylenol orange) 분석을 통해 H₂O₂ 농도를 측정하였다. 농도 측정은 20μL의 샘플 용액을 200μL의 자일레놀 오렌지 시약과 혼합하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션 한 다음 Varioskan™ LUX 마이크로 플레이트 리더(Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)로 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 값은 대조군이 되는 순수한 H₂O₂ 농도로 얻은 표준 곡선을 기반으로 변환되었다.First, in order to confirm the hydrogen peroxide decomposition activity of the PB nanoparticles, PB nanoparticles of various concentrations were mixed with a H ₂ O ₂ solution (250 μM) and stirred at 37° C. and 100 rpm. 20 μL of the solution was extracted from the reaction mixture at regular time intervals, and the H ₂ O ₂ concentration was measured through xylenol orange analysis. For concentration measurement, 20 μL of the sample solution was mixed with 200 μL of xylenol orange reagent, incubated at room temperature for 15 minutes, and then absorbance was measured at 595 nm with a Varioskan™ LUX microplate reader (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA). . Absorbance values were converted based on standard curves obtained with pure H ₂ O ₂ concentrations as controls.

PB 나노입자의 슈퍼옥사이드 음이온(O^2-) 소거 활성은 SOD 분석 키트로 분석되었다. 이 분석에서 크산틴/크산틴 산화효소 반응 시스템에 의해 생성된 슈퍼옥사이드 음이온은 WST-1 시약과 반응하여 노란색 포르마잔 생성물을 생성하는데, 이는 450nm에서 흡광도로 측정 가능하다. 즉, 흡광도 변화는 과산화물 농도에 비례하며, 따라서 과산화물 소거 활성(Superoxide scavenging activity, %)은 하기 식 1과 같이 측정되었다.The superoxide anion (O ^2- ) scavenging activity of the PB nanoparticles was analyzed with an SOD assay kit. In this assay, the superoxide anion generated by the xanthine/xanthine oxidase reaction system reacts with the WST-1 reagent to produce a yellow formazan product, which can be measured by absorbance at 450 nm. That is, the absorbance change is proportional to the peroxide concentration, and therefore, the superoxide scavenging activity (%) was measured as shown in Equation 1 below.

[식 1][Equation 1]

과산화물 소거 활성(%) = 100 × (A_control - A_sample) / A_control Peroxide scavenging activity (%) = 100 × (A _control - A _sample ) / A _control

도 2는 본 발명의 PB 나노입자의 항산화 활성을 나타내는 그래프이다.2 is a graph showing the antioxidant activity of the PB nanoparticles of the present invention.

도 2의 (a)는 PB 나노입자의 카탈라아제 및 퍼옥시다아제 모방 활성을 통한 시간에 따른 과산화수소 분해 활성을 나타내는 그래프이다. Figure 2 (a) is a graph showing the hydrogen peroxide decomposition activity over time through catalase and peroxidase mimetic activities of PB nanoparticles.

도 2의 (a)를 참조하면, PB 나노입자에 의한 시간 및 농도 의존적인 H₂O₂ 분해 활성을 확인할 수 있다. 낮은 농도의 PB(10μg/mL)는 30분 이내에 약 17%의 H₂O₂를 분해했으며, 120분 후에 분해율은 약 50%이다. 또한, H₂O₂ 분해율은 PB 농도가 증가함에 따라 크게 증가하는 것을 확인할 수 있다. 50μg/mL 및 100μg/mL PB의 존재 하에, 각각 약 65% 및 80%의 H₂O₂가 반응 60분 이내에 분해되었다. 그러나 120분의 반응 후에는 50μg/mL 및 100 μg/mL의 PB 모두 유사한 H₂O₂ 분해 능력을 보이는 것을 확인할 수 있다.Referring to (a) of FIG. 2 , time- and concentration-dependent H ₂ O ₂ decomposition activity by PB nanoparticles can be confirmed. A low concentration of PB (10 μg/mL) decomposed about 17% of H ₂ O ₂ within 30 minutes, and the degradation rate is about 50% after 120 minutes. In addition, it can be seen that the H ₂ O ₂ decomposition rate greatly increases as the PB concentration increases. In the presence of 50 μg/mL and 100 μg/mL PB, about 65% and 80% of H ₂ O ₂ , respectively, were decomposed within 60 minutes of reaction. However, after 120 minutes of reaction, it can be seen that both 50 μg/mL and 100 μg/mL of PB show similar H ₂ O ₂ decomposition ability.

도 2의 (b)는 PB 나노입자의 SOD 모방 활성을 통한 과산화물 소거 활성을 나타내는 그래프이다. Figure 2 (b) is a graph showing the peroxide scavenging activity through the SOD mimetic activity of PB nanoparticles.

도 2의 (b)를 참조하면, H₂O₂ 분해와 유사하게 PB 나노입자는 농도와 시간에 따라 높은 슈퍼옥사이드 소거능을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 10μg/mL의 PB는 반응 30분 및 60분 이내에 각각 약 44% 및 64%의 슈퍼옥사이드 라디칼을 제거하였다. PB 농도를 50μg/mL로 증가시킨 경우 슈퍼옥사이드의 90%가 30분 이내에 제거되었다. 50μg/mL 및 100μg/mL의 PB는 모두 120분 후에는 유사한 슈퍼옥사이드 소거 활성을 나타냈다. 이를 통해 PB 나노입자의 ROS 소거능 및 상기 ROS 소거능은 PB 나노입자의 농도 및 반응 시간에 비례하여 증가하는 것을 확인할 수 있다. Referring to (b) of FIG. 2 , similar to H ₂ O ₂ decomposition, it can be seen that PB nanoparticles exhibit high superoxide scavenging ability according to concentration and time. PB at 10 μg/mL removed about 44% and 64% of superoxide radicals within 30 and 60 minutes of reaction, respectively. When the PB concentration was increased to 50 μg/mL, 90% of the superoxide was removed within 30 minutes. Both 50 μg/mL and 100 μg/mL of PB showed similar superoxide scavenging activity after 120 minutes. Through this, it can be confirmed that the ROS scavenging ability of the PB nanoparticles and the ROS scavenging ability increase in proportion to the concentration and reaction time of the PB nanoparticles.

<실험예 3> PB 나노입자의 생체 적합성 확인 및 세포 내 ROS 소거 활성 확인 실험<Experimental Example 3> Confirmation of biocompatibility of PB nanoparticles and confirmation of intracellular ROS scavenging activity

본 발명의 PB 나노입자의 생체 적합성을 확인하기 위하여, 쥐의 섬유 아세포(NIH-3 T3)를 모델 세포주로 사용하여 PB 나노입자의 생체 적합성을 평가하는 실험을 진행하였다. 이를 위하여, NIH-3 T3를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양하고 CO₂ 배양기에서 37℃에서 12 시간 동안 배양 하였다. PB 나노입자의 시험관 내(in vitro) 세포 독성을 확인하기 위해 NIH-3 T3 세포를 96-well 조직 배양 플레이트(2x104cell/well)에 접종하였다. 세포 부착 후, 농도가 10μg/mL 내지 200μg/mL인 PB 나노입자를 세포에 첨가 하였다. 24 시간 배양 후, 세포를 세척하고 MTT 시약을 함유하는 새로운 배지에서 37℃에서 1시간 동안 배양 하였다. 배양된 세포를 세척하고 세포 생존력을 MTT 분석으로 측정 하였다.In order to confirm the biocompatibility of the PB nanoparticles of the present invention, an experiment was conducted to evaluate the biocompatibility of the PB nanoparticles using mouse fibroblasts (NIH-3 T3) as a model cell line. To this end, NIH-3 T3 was cultured in DMEM containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin and incubated for 12 hours at 37°C in a CO ₂ incubator. To confirm the in vitro cytotoxicity of the PB nanoparticles, NIH-3 T3 cells were seeded in a 96-well tissue culture plate (2x10 4 cells/well). After cell attachment, PB nanoparticles at concentrations ranging from 10 μg/mL to 200 μg/mL were added to the cells. After 24 hours of culture, the cells were washed and incubated for 1 hour at 37°C in fresh medium containing MTT reagent. Cultured cells were washed and cell viability was measured by MTT assay.

세포 내 ROS 생성은 ROS 민감성 형광 프로브로 DCFH-DA를 사용하여 분석되었다. NIH-3 T3 세포를 PB 나노입자(50μg/mL)의 유무에 관계 없이 다양한 농도의 H₂O₂에 노출하였다. 2시간 처리 후, 세포를 세척하고 30분 동안 10μM DCFH-DA로 배양 하였다. 마지막으로 여기 파장이 485nm이고 방출 파장이 525nm인 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 세포 내 형광 신호를 측정하였다. 세포 내 형광 신호는 형광 현미경(TE2000, Nikon, Tokyo, Japan)으로 가시화되었다.Intracellular ROS production was assayed using DCFH-DA as a ROS-sensitive fluorescent probe. NIH-3 T3 cells were exposed to various concentrations of H ₂ O ₂ with or without PB nanoparticles (50 μg/mL). After 2 h treatment, cells were washed and incubated with 10 μM DCFH-DA for 30 min. Finally, intracellular fluorescence signals were measured using a microplate reader with an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 525 nm. Intracellular fluorescence signals were visualized with a fluorescence microscope (TE2000, Nikon, Tokyo, Japan).

도 3은 본 발명의 PB 나노입자의 시험관 내 세포 독성을 확인하여 나타낸 그래프이다.3 is a graph showing the in vitro cytotoxicity of the PB nanoparticles of the present invention.

도 3의 (a)는 다양한 농도의 PB 나노입자로 처리 된 NIH-3 T3 섬유 아세포의 생존율을 나타낸 그래프이다. Figure 3 (a) is a graph showing the survival rate of NIH-3 T3 fibroblasts treated with various concentrations of PB nanoparticles.

도 3의 (a)를 참조하면, 거의 100%의 세포가 100μg/mL의 PB 나노입자의 존재 하에서 대사 활성이었고 세포 생존율은 200μg/mL의 PB 나노입자에서도 88±6% 임을 확인할 수 있다. 즉, PB 나노입자의 유의한 세포 독성은 관찰되지 않은 것을 확인할 수 있다.Referring to (a) of FIG. 3, it can be seen that almost 100% of the cells were metabolically active in the presence of 100 μg/mL PB nanoparticles, and the cell viability was 88±6% even in the presence of 200 μg/mL PB nanoparticles. That is, it can be confirmed that no significant cytotoxicity of the PB nanoparticles was observed.

도 3의 (b)는 다양한 농도의 H₂O₂로 처리된 NIH-3 T3 섬유아세포의 PB 나노입자(50μg/mL)의 첨가 여부에 따른 생존력을 나타낸 그래프이다. 3(b) is a graph showing the viability of NIH-3 T3 fibroblasts treated with various concentrations of H ₂ O ₂ depending on whether PB nanoparticles (50 μg/mL) were added or not.

도 3의 (b)를 참고하면, H₂O₂ 농도가 증가함에 따라 세포 생존력이 크게 감소하고, PB 나노입자 없이 세포 생존율은 각각 25μM, 50μM 및 100μM의 H₂O₂ 농도에서 37±6%, 13±2% 및 8±3% 인 것에 반해, PB 나노입자(50μg/mL)를 추가하면 동일한 H₂O₂ 환경에서 세포 생존율이 88±5%, 79±4%, 67±8%로 현저하게 향상된 것을 확인할 수 있다.Referring to (b) of FIG. 3, as the H ₂ O ₂ concentration increases, cell viability decreases significantly, and the cell viability without PB nanoparticles is 37±6% at H ₂ O ₂ concentrations of 25 μM, 50 μM, and 100 μM, respectively. , 13±2% and 8±3%, when PB nanoparticles (50 μg/mL) were added, the cell viability increased to 88±5%, 79±4%, and 67±8% in the same H ₂ O ₂ environment. Significant improvement can be seen.

도 3의 (c)는 형광 현미경으로 시각화 된 NIH-3 T3 섬유아세포에서 H₂O₂ 매개 세포 내 ROS 생성에 대한 PB 나노입자의 첨가 여부에 따른 효과를 나타낸 사진이다. 3(c) is a photograph showing the effect of adding or not adding PB nanoparticles on H ₂ O ₂ -mediated intracellular ROS generation in NIH-3 T3 fibroblasts visualized under a fluorescence microscope.

도 3의 (d)는 마이크로 플레이트 리더를 통한 형광 측정에 의한 정량 분석 그래프이다.3(d) is a graph of quantitative analysis by fluorescence measurement through a microplate reader.

도 3의 (c) 및 (d)를 참조하면, H₂O₂를 처리한 경우 높은 세포 내 형광 신호를 보이는 것으로 보아 세포 내에 높은 수준의 ROS가 있음을 확인할 수 있으나, 이에 PB 나노입자를 첨가하는 경우 형광 신호가 극적으로 감소한 것을 확인하여 PB 나노입자에 따른 세포 내 ROS 소거 활성을 확인할 수 있다.Referring to (c) and (d) of FIG. 3 , when treated with H ₂ O ₂ , high intracellular fluorescence signal was observed, indicating that there was a high level of ROS in the cells, but PB nanoparticles were added thereto. In this case, it is confirmed that the fluorescence signal is dramatically reduced, and thus the intracellular ROS scavenging activity according to the PB nanoparticles can be confirmed.

<실험예 4> PB 나노입자의 체외(in vitro) 항 염증 효과 측정 실험<Experimental Example 4> In vitro anti-inflammatory effect measurement experiment of PB nanoparticles

본 발명의 PB 나노입자의 체외 항 염증 효과를 측정하는 실험을 진행하였다. 이를 위하여, LPS로 자극 된 RAW 264.7 대식세포주를 이용하였다. LPS는 Toll-like receptor 4 (TLR4)를 통해 대식세포를 활성화하여 일련의 신호 발생 이벤트를 유발하여 ROS 및 기타 염증 매개체를 생성한다. 이러한 대식세포에 의해 생성 된 높은 수준의 ROS와 염증성 사이토 카인은 상처 회복을 더디게 하는 주요 원인이다. 따라서, 상처 치료 효율을 높이기 위해서는 과도하게 활성화된 대식세포의 염증 촉진 특성을 완화할 필요가 있다. 실험예 4에서는 유세포 분석을 통하여 대식세포에서 LPS 유도 ROS 생성에 대한 PB 나노입자의 억제 효과를 확인하였다. An experiment was conducted to measure the in vitro anti-inflammatory effect of the PB nanoparticles of the present invention. For this purpose, RAW 264.7 macrophage cell line stimulated with LPS was used. LPS activates macrophages via Toll-like receptor 4 (TLR4), triggering a series of signaling events to produce ROS and other inflammatory mediators. High levels of ROS and inflammatory cytokines produced by these macrophages are major contributors to slow wound healing. Therefore, in order to increase wound healing efficiency, it is necessary to alleviate the inflammatory properties of excessively activated macrophages. In Experimental Example 4, the inhibitory effect of PB nanoparticles on LPS-induced ROS generation in macrophages was confirmed through flow cytometry.

이를 위하여, 먼저 RAW 264.7 대식세포주를 6-well 조직 배양 플레이트(5x105cell/well)에 접종하였다. 12시간 후, PB 나노입자(50μg/mL) 첨가 여부를 달리하고 LPS(100ng/mL)로 세포를 자극하였다. LPS 처리가 없는 세포는 대조군으로 사용되었다. 24시간 배양 후, 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 PureLink RNA 미니 키트를 사용하여 세포 내 모든 RNA를 분리하였다. 정제된 RNA의 농도와 품질은 260nm 및 280nm에서 흡광도 측정을 통해 측정되었다. AccuPower RocketScript CycleRT 프리믹스 (Bioneer, Seoul, Korea)를 사용하여 샘플 당 2μg의 RNA를 cDNA로 역전사하고 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems, CA, USA)에서 ROX와 함께 PowerUp SYBR Green Master Mix를 사용하여 RT-qPCR을 수행하였다. 이때, β은 정규화를 위한 내인성 참조 유전자로 사용되었다. 상대적인 유전자 발현은 대조군과 비교하여 ΔΔCt방법으로 계산되었다. 실험에 사용 된 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다. 그 다음, 단백질 수준 분석을 위해 대식세포를 LPS 자극 후 그 배지를 수집하여, TNF-α의 농도는 마우스 TNF-α ELISA 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 측정하였다.To this end, RAW 264.7 macrophage cell line was first inoculated into a 6-well tissue culture plate (5x105 cell/well). After 12 hours, the cells were stimulated with LPS (100 ng/mL) with or without the addition of PB nanoparticles (50 μg/mL). Cells without LPS treatment were used as controls. After culturing for 24 hours, the cells were washed with PBS (phosphate-buffered saline) and all RNAs in the cells were isolated using the PureLink RNA mini kit. The concentration and quality of purified RNA was measured by measuring absorbance at 260 nm and 280 nm. 2 μg of RNA per sample was reverse-transcribed into cDNA using AccuPower RocketScript CycleRT premix (Bioneer, Seoul, Korea) and PowerUp SYBR Green Master Mix with ROX in a StepOnePlus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, CA, USA). RT-qPCR was performed. At this time, β was used as an endogenous reference gene for normalization. Relative gene expression was calculated by the ΔΔCt method compared to control. Primer sequences used in the experiment are shown in Table 1 below. Then, for protein level analysis, after stimulating macrophages with LPS, the medium was collected, and the concentration of TNF-α was measured using a mouse TNF-α ELISA kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

[표 1][Table 1]

도 4는 PB 나노입자의 체외 항 염증 효과를 나타낸 그래프이다.4 is a graph showing the in vitro anti-inflammatory effect of PB nanoparticles.

도 4의 (a)는 PB 나노입자(50μg/mL) 첨가 여부를 달리하여 LPS 자극된 뮤린 대식세포에서 측정한 ROS 생성에 대한 유세포 분석 그래프이다.Figure 4 (a) is a graph of flow cytometry for ROS production measured in LPS-stimulated murine macrophages with or without the addition of PB nanoparticles (50 μg/mL).

도 4의 (b)는 PB 나노입자 첨가 여부를 달리하여 LPS 유도 ROS의 현저한 감소를 보여주는 유세포 분석 데이터의 정량 분석 그래프이다.Figure 4(b) is a quantitative analysis graph of flow cytometry data showing a significant reduction in LPS-induced ROS with and without the addition of PB nanoparticles.

도 4의 (a) 및 (b)를 참조하면, LPS 자극된 대식세포 내에서 ROS 수준이 증가하여 세포에서 높은 형광 신호가 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 이와 달리, PB 나노입자를 첨가하였을 때 대식세포의 ROS 수준이 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있다.Referring to (a) and (b) of FIG. 4 , it can be confirmed that a high fluorescence signal was observed in the cells due to an increase in the level of ROS in the LPS-stimulated macrophages. In contrast, when the PB nanoparticles were added, it was confirmed that the ROS level of macrophages was remarkably low.

상기에 착안하여 유전자 발현 분석을 통해 PB 나노입자의 항 염증 효과를 구체적으로 분석하였다.In view of the above, the anti-inflammatory effect of the PB nanoparticles was analyzed in detail through gene expression analysis.

도 4의 (c)는 PB 나노입자 첨가 여부를 달리하여 LPS 활성화 RAW 264.7 세포에서 전 염증(TNF-α, IL-1β) 및 항 염증(ARG-1) 유전자의 발현을 분석한 그래프이다.Figure 4 (c) is a graph analyzing the expression of pro-inflammatory (TNF-α, IL-1β) and anti-inflammatory (ARG-1) genes in LPS-activated RAW 264.7 cells with or without the addition of PB nanoparticles.

도 4의 (c)를 참조하면, 염증 환경에서 대식세포의 전 염증 유전자의 발현은 현저하게 증가하는 반면, 항 염증 유전자의 발현은 감소한다. PB 나노입자와 함께 배양 된 RAW 264.7 세포는 전 염증성 사이토 카인(TNF-α 및 IL-1β)의 발현이 증가하지 않은 것을 확인할 수 있다. 예상대로 대식세포에서 TNF-α와 IL-1β의 발현은 LPS로 자극 한 후 현저하게 증가하였으나, LPS와 PB 나노입자를 함께 처리 한 세포는 LPS 만 처리 한 세포에 비해 TNF-α와 IL-1β의 발현이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있다. 또한, PB 나노입자가 처리되지 않은 대조군 세포에 비해 PB 나노입자를 처리한 세포에서 항 염증 유전자 ARG-1의 더 높은 발현이 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 예상대로 ARG-1의 발현은 LPS 자극 후 감소했으나, 이에 비해 LPS와 PB 나노입자를 함께 처리 한 세포에서 ARG-1의 발현이 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있다(p<0.05).Referring to (c) of FIG. 4 , the expression of pro-inflammatory genes in macrophages significantly increases in an inflammatory environment, whereas the expression of anti-inflammatory genes decreases. It can be seen that RAW 264.7 cells cultured with PB nanoparticles did not increase the expression of pro-inflammatory cytokines (TNF-α and IL-1β). As expected, the expression of TNF-α and IL-1β in macrophages significantly increased after stimulation with LPS, but cells treated with LPS and PB nanoparticles were compared with cells treated only with LPS. It can be confirmed that the expression of is significantly reduced. In addition, it can be confirmed that higher expression of the anti-inflammatory gene ARG-1 was observed in cells treated with PB nanoparticles compared to control cells not treated with PB nanoparticles. As expected, ARG-1 expression decreased after LPS stimulation, but in contrast, ARG-1 expression significantly increased in cells treated with LPS and PB nanoparticles (p<0.05).

유전자 발현 분석과 더불어 PB 나노 자임에 의한 TNF-α 분비 억제도 ELISA를 통해 단백질 수준에서 평가되었다In addition to gene expression analysis, inhibition of TNF-α secretion by PB nanozyme was also evaluated at the protein level by ELISA.

도 4의 (d)는 PB 나노입자 첨가 여부를 달리하여 LPS 자극 대식세포에 의한 TNF-α 분비를 측정한 그래프이다.Figure 4 (d) is a graph measuring TNF-α secretion by LPS-stimulated macrophages with or without the addition of PB nanoparticles.

도 4의 (d)를 참조하면, TNF-α 분비는 대조군과 PB 나노입자 처리 된 세포에서 가장 최소인 것을 확인할 수 있다. 이와 대조적으로, LPS 자극된 대식세포는 높은 수준의 TNF-α를 생산하였다. 그러나 LPS로 자극하고 PB 나노입자를 처리 한 세포는 유전자 발현 분석과 동일하게 전 염증성 사이토 카인의 분비가 현저하게 감소(p<0.001) 된 것으로 확인되었다. 이를 통해, PB 나노입자는 ROS 소거와 더불어 항 염증 매개체로도 작용할 수 있음을 확인할 수 있다.Referring to (d) of FIG. 4 , it can be seen that the secretion of TNF-α is minimal in the control and PB nanoparticle-treated cells. In contrast, LPS stimulated macrophages produced high levels of TNF-α. However, it was confirmed that cells stimulated with LPS and treated with PB nanoparticles showed a significant decrease (p<0.001) in the secretion of pro-inflammatory cytokines, consistent with gene expression analysis. Through this, it can be confirmed that the PB nanoparticles can also act as an anti-inflammatory mediator in addition to ROS scavenging.

<실험예 5> PB 나노입자의 상처 치료 및 조직 재생 효과 확인 실험<Experimental Example 5> Experiments to confirm the effects of PB nanoparticles on wound healing and tissue regeneration

본 발명의 PB 나노입자의 생체 내 상처 치료 및 조직 재생 효과를 확인하는 실험을 진행하였다.Experiments were conducted to confirm the in vivo wound healing and tissue regeneration effects of the PB nanoparticles of the present invention.

이를 위하여, 먼저 마우스를 이용하여 염증 피부 상처 모델을 준비하였다.To this end, first, an inflammatory skin wound model was prepared using a mouse.

<실시예 1> 염증 피부 상처 모델 준비<Example 1> Preparation of inflammatory skin wound model

생체 내 상처 치유 실험에는 암컷 ICR 마우스를 이용하였다. 상처는, 먼저 수술용 가위를 사용하여 등쪽에 피부 절개(20×20mm²)를 형성하였다. 그런 다음 표피, 진피 및 피하 조직을 완전히 제거하여 근막을 노출시켰다. 이때, 6-0 실크 봉합사(Ethicon, Somerville, NJ, USA)를 사용하여 상처 가장자리에 8개의 봉합사를 적용하여 상처의 수축을 최소화하였다. 모든 마우스는 0일째부터 격일로 상처 부위에 10μg의 LPS를 피내 주사하여 급성 염증을 생성하였다. 그런 다음, PBS에 PB 나노입자(50μg 또는 500μg)를 첨가하여 전체 상처에 국소적으로 도포하였다. 50μg×4 그룹의 경우, 50μg PB 나노입자를 마우스 상처 부위에 4 일마다 반복적으로 국소 처리 하였다. 대조군 그룹의 마우스는 PBS만 처리하였다. 수술 및 치료 후 각 상처를 6.25cm² 크기의 파라 필름으로 덮은 다음 9.0cm² 크기의 투명 테가덤(tegaderm) 필름(3M), 거즈(대한 메디칼), 코반 붕대(대한 메디칼)로 드레싱하였다. 비접착성 파라 필름은 PB 나노입자의 손실을 최소화하기 위해 PB와 드레싱 사이의 장벽으로 사용되었다. 그러나, 각 파라 필름은 공기를 순환시키고 고름 축적을 방지하기 위해 여러 개의 작은 구멍(직경 1mm)으로 천공되었다. 2일 마다 파라 필름, 테가 덤, 거즈, 코반을 제거하고 상처 부위를 디지털 카메라로 촬영하였다. 그런 다음 파라 필름을 재사용하고 다른 드레싱을 새로 교체하여 상처 등을 덮었다. 14일 이후 상처 부위의 조직 외식편을 제거하고 조직 샘플을 조직학적 분석을 위하여 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였다.Female ICR mice were used for in vivo wound healing experiments. For wounds, a skin incision (20×20 mm ² ) was first made on the dorsal side using surgical scissors. Then, the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue were completely removed to expose the fascia. At this time, 8 sutures were applied to the edges of the wound using 6-0 silk sutures (Ethicon, Somerville, NJ, USA) to minimize contraction of the wound. All mice generated acute inflammation by intradermal injection of 10 μg of LPS into the wound site every other day from day 0. Then, PB nanoparticles (50 μg or 500 μg) were added to PBS and applied topically to the entire wound. For the 50 μg × 4 group, 50 μg PB nanoparticles were topically applied repeatedly every 4 days to the mouse wound. Mice in the control group were treated only with PBS. After surgery and treatment, each wound was covered with a 6.25 cm ² parafilm and then dressed with a 9.0 cm ² transparent tegaderm film (3M), gauze (Daehan Medical), and a Koban bandage (Daehan Medical). A non-adhesive parafilm was used as a barrier between the PB and the dressing to minimize the loss of PB nanoparticles. However, each parafilm was perforated with several small holes (1 mm in diameter) to circulate air and prevent pus accumulation. Every 2 days, Parafilm, Tega Derm, gauze, and Koban were removed, and the wounds were photographed with a digital camera. Then, the parafilm was reused and another dressing was replaced with a new one to cover the wound. After 14 days, tissue explants were removed from the wounded area and the tissue samples were fixed in 10% neutral buffered formalin for histological analysis.

도 5는 PB 나노입자의 생체 내 상처 치유 활성을 나타내는 그래프이다.5 is a graph showing the wound healing activity of PB nanoparticles in vivo.

도 5의 (a)는 상처 부위를 나타내는 사진이다. Figure 5 (a) is a photograph showing the wound area.

도 5의 (b)는 상처 봉합률을 정량화하여 나타낸 그래프이다. 이때, *는 무 처리 군에 비해 p<0.05, @는 50μg 군에 비해 p<0.05, #은 500μg 군에 비해 p<0.05임을 나타낸다.Figure 5 (b) is a graph showing the quantification of the wound closure rate. At this time, * indicates p<0.05 compared to the untreated group, @ indicates p<0.05 compared to the 50 μg group, and # indicates p<0.05 compared to the 500 μg group.

도 5의 (a) 및 (b)를 참조하면, 4일차까지 모든 PB 나노입자 처리 그룹은 동일하게 효과적이었고, 처리되지 않은 대조군보다 더 높은 상처 봉합률을 보이는 것을 확인할 수 있다. 그러나 6일부터 상처 봉합률은 PB 나노입자 처리 그룹간에 차이를 나타내기 시작하였으며, 적은 양의 PB(50μg) 치료군의 치유 효과는 6일부터 약화되기 시작하였으며, 치료하지 않은 군과의 차이는 시간이 지남에 따라 감소하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 50μg 치료군과 비교하여, 500μg 치료군에서 더 높은 상처 봉합률을 보이는 것을 확인할 수 있으며, 이는 곧 PB 나노입자의 용량이 높을수록 효과적인 상처 봉합률을 갖는 것을 확인할 수 있다. 반면에, 적은 양의 PB 나노입자(4일마다 50μg PB 반복 도포)을 사용한 경우 500μg 또는 50μg 단일 처리보다 더 효과적인 것을 확인할 수 있다. 수술 후 10일 째에 50μg×4 그룹 만이 대조군 (58.9 ± 2.7 %)에 비해 훨씬 더 높은 상처 봉합률(73.5 ± 4.7 %)을 나타냈으며, 12 일째에 50μg×4 그룹 (89.9 ± 2.5 %) 및 500μg 그룹 (81.5 ± 3.6 %)은 대조군 (67.2 % ± 2.3 %) 및 50μg 그룹 (74.3 ± 4.1%)과 비교하여 유의 한 차이(p <0.05)를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 결과적으로, 14 일째에 50μg×4 그룹은 95.5 ± 1.1 %의 상처 봉합 결과를 보였으며 이는 500μg 그룹 (87.6 ± 1.5 %), 50μg 그룹 (71.5 ± 5.5 %) 및 대조군 (72.0 ± 1.3%) 보다 현저하게 높은 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, PB 나노입자의 농도가 높을수록, 또한, PB 나노입자를 반복적으로 처리할수록 상처 부위에서 지속적으로 ROS 소거 및 항염 효과를 제공함으로써 최상의 상처 봉합을 제공 할 수 있음을 확인할 수 있다.Referring to (a) and (b) of FIG. 5 , it can be seen that up to the 4th day, all PB nanoparticle treatment groups were equally effective, and exhibited a higher wound closure rate than the untreated control group. However, from the 6th day, the wound closure rate began to show differences between the PB nanoparticle treatment groups, and the healing effect of the small amount of PB (50μg) treatment group began to weaken from the 6th day, and the difference from the untreated group was It can be seen that this decreases over time. In addition, compared to the 50 μg treatment group, it can be confirmed that the 500 μg treatment group shows a higher wound closure rate, which means that the higher the dose of PB nanoparticles, the more effective the wound closure rate is. On the other hand, when using a small amount of PB nanoparticles (repeated application of 50 μg PB every 4 days), it can be seen that it is more effective than 500 μg or 50 μg single treatment. At postoperative day 10, only the 50μg×4 group showed a significantly higher wound closure rate (73.5 ± 4.7%) compared to the control group (58.9 ± 2.7%), and on day 12, the 50μg×4 group (89.9 ± 2.5%) and It can be seen that the 500μg group (81.5 ± 3.6%) shows a significant difference (p <0.05) compared to the control group (67.2% ± 2.3%) and the 50μg group (74.3 ± 4.1%). As a result, on day 14, the 50μg×4 group showed 95.5 ± 1.1% of wound closure, which was significantly better than the 500μg group (87.6 ± 1.5%), 50μg group (71.5 ± 5.5%) and the control group (72.0 ± 1.3%). It can be seen that it is quite high. Through this, it can be confirmed that the higher the concentration of the PB nanoparticles and the more repeatedly treated with the PB nanoparticles, the better wound closure can be provided by continuously providing ROS scavenging and anti-inflammatory effects at the wound site.

<실험예 6> PB 나노입자 처리에 따른 상처 성숙 및 조직학적 분석 실험<Experimental Example 6> Wound maturation and histological analysis experiments according to PB nanoparticle treatment

본 발명의 PB 나노입자의 상처 성숙 및 조직 재생 효과 확인을 위하여 상처를 조직학적으로 분석해보는 실험을 진행하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 1의 마우스의 피부 상처 부위를 4일마다 촬영하여 분석하였으며, H&E(헤마톡실린-에오신) 및 MT(Masson 's trichrome)으로 염색하여 상처 부위의 재생된 피부 층을 정의하고 상처 가장자리, 피하(SC), 육아 조직 면적 및 비대 표피(HE) 층의 두께를 정량화하여 Image J 소프트웨어로 정량 분석 하였다.In order to confirm the wound maturation and tissue regeneration effects of the PB nanoparticles of the present invention, an experiment was conducted to analyze the wound histologically. To this end, the skin wound of the mouse of Example 1 was photographed and analyzed every 4 days, and stained with H&E (hematoxylin-eosin) and MT (Masson's trichrome) to define the regenerated skin layer of the wound. and the thickness of the wound margin, subcutaneous (SC), granulation tissue area, and hypertrophic epidermal (HE) layer were quantified and analyzed quantitatively with Image J software.

도 6은 상처 피부 샘플을 조직학적으로 분석한 그래프이다.6 is a graph of histologically analyzing wound skin samples.

도 6의 (a)는 각 그룹을 H&E 염색(상단) 및 MT 염색(하단) 한 사진이다. 이때, 검은색 화살표는 피부 상처의 가장자리를 나타낸다. Figure 6 (a) is a photograph of H&E staining (top) and MT staining (bottom) of each group. At this time, the black arrow indicates the edge of the skin wound.

도 6의 (b)는 (a)의 점선 사각형 상자를 확대하여 나타낸 이미지이다. 이때, EP는 표피, HE는 비대성 표피, DE는 진피, GR은 육아 조직을 나타낸다.(b) of FIG. 6 is an enlarged image of the dotted square box of (a). Here, EP denotes epidermis, HE denotes hypertrophic epidermis, DE denotes dermis, and GR denotes granulation tissue.

도 6의 (c)는 상처의 가장자리 간의 거리, (d)는 피하층 간의 거리, (e)는 육아 조직의 면적, (f)는 비대성 표피 두께를 비교한 그래프이다. 이때, *는 대조군에 비해 p<0.05를 나타내고, @는 50μg군에 비해 p<0.05를 나타낸다.6 (c) is a graph comparing the distance between wound edges, (d) the distance between the subcutaneous layers, (e) the area of granulation tissue, and (f) the hypertrophic epidermal thickness. At this time, * indicates p<0.05 compared to the control group, and @ indicates p<0.05 compared to the 50 μg group.

도 6을 참조하면, 대조군(No treat)은 비대성 표피 (151.03±15.03μm) 아래에 큰 면적의 육아 조직 (35.60±3.11mm²)이 존재하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 곧 재생된 상처 조직의 성숙이 잘 일어나지 않은 것을 나타낸다. 또한, 미성숙된 재생 피부는 육아 조직이 피부층으로 완전히 분화하지 않아 상처 가장자리 거리 (15.03±2.00mm) 및 피하층 간 거리가 길다. 이와 달리 500μg의 PB 나노입자로 처리된 그룹은 상처 가장자리에서 재생 조직이 더 잘 성숙되어 대조군에 비해 상처 가장자리 거리 (7.89±1.06mm)와 비대성 표피 두께 (111.07±12.59 μm)가 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 특히, 50μg×4 그룹(4 일간 50μg의 PB 나노입자를 반복 처리 한 그룹)은 가장 낮은 상처 가장자리 거리 (6.31±0.28mm), SC 간 거리(9.85±0.37mm), 육아 조직 영역 (18.73±0.74mm²) 및 HE 두께 (79.10±13.41μm)를 나타내며 다른 그룹에 과립 조직이 적은 상피 및 진피층의 재건이 개선되었음을 확인할 수 있다.Referring to FIG. 6, in the control group (No treat), it was confirmed that a large area of granulation tissue (35.60±3.11 mm ² ) was present under the hypertrophic epidermis (151.03±15.03 μm), which was due to the maturation of the regenerated scar tissue. indicates that this did not happen well. In addition, in the immature regenerated skin, the granulation tissue is not completely differentiated into the dermal layer, so the wound edge distance (15.03±2.00 mm) and the distance between the subcutaneous layers are long. In contrast, in the group treated with 500 μg of PB nanoparticles, the regenerative tissue matured better at the wound edge, significantly reducing the wound edge distance (7.89±1.06 mm) and hypertrophic epidermal thickness (111.07±12.59 μm) compared to the control group. can In particular, the 50 μg × 4 group (the group treated with 50 μg of PB nanoparticles for 4 days) had the lowest wound edge distance (6.31±0.28 mm), inter-SC distance (9.85±0.37 mm), and granulation tissue area (18.73±0.74 mm). mm ² ) and HE thickness (79.10±13.41 μm), and it can be confirmed that the reconstruction of the epidermal and dermal layers with less granulation tissue was improved in the other groups.

<실험예 7> PB 나노입자의 상처 콜라겐 침착 및 조직 효과 확인 실험<Experimental Example 7> Wound collagen deposition and tissue effect confirmation experiment of PB nanoparticles

콜라겐 침착은 상처 부위의 재생에 매우 중요하다. 이는 상처 치유의 첫 단계에서 형성되는 피브린-피브로넥틴 혈전을 대체하며 상처 부위를 보호한다. 게다가 콜라겐은 혈관 신생과 결합 조직 형성에 관여하는 세포의 부착, 성장, 분화를 위한 주형 역할을 하므로, 상처 부위에서의 콜라겐 침착은 피부 조직 재생을 위해 중요하다.Collagen deposition is very important for wound regeneration. It replaces the fibrin-fibronectin clots that form in the first stage of wound healing and protects the wound site. In addition, since collagen serves as a template for cell attachment, growth, and differentiation involved in angiogenesis and connective tissue formation, collagen deposition at the wound site is important for skin tissue regeneration.

실험예 7에서는 본 발명의 PB 나노입자의 상처 부위의 콜라겐 침착 및 조직 효과를 확인하는 실험을 진행하였다. In Experimental Example 7, an experiment was conducted to confirm the collagen deposition and tissue effect of the PB nanoparticles of the present invention on the wound site.

이를 위하여, 먼저 시리우스 레드(Picro-sirius red) 염색을 통해 상처 부위의 콜라겐 침착을 확인하였다.To this end, first, collagen deposition at the wound site was confirmed through Picro-sirius red staining.

도 7은 상처 피부에서의 콜라겐 조직을 나타낸 사진 및 그래프이다.7 is a photograph and a graph showing collagen tissue in scarred skin.

도 7의 (a)는 시리우스 레드 염색 후 상처 조직 절편의 진피층에서 콜라겐 다발의 형태를 보여주는 명시야(Bright field) 이미지를 나타낸 도면이다.FIG. 7 (a) is a bright field image showing the morphology of collagen bundles in the dermal layer of a scar tissue section after Sirius red staining.

도 7의 (a)를 참조하면, 대조군에서부터 500μg까지 PB 나노입자의 용량이 증가할수록 콜라겐 다발이 더 조밀하고 두껍게 형성된 것을 확인할 수 있다. 특히, 50μg×4 그룹은 다른 그룹에 비해 콜라겐이 가장 높은 밀도와 두께를 나타냈다. 이를 통해 PB 나노입자가 상처 치유 과정에서 콜라겐 침착을 향상시켰음을 확인할 수 있다.Referring to (a) of FIG. 7 , it can be seen that as the amount of PB nanoparticles increased from the control group to 500 μg, collagen bundles were formed more densely and thickly. In particular, the 50μg×4 group showed the highest density and thickness of collagen compared to other groups. Through this, it can be confirmed that the PB nanoparticles improved collagen deposition in the wound healing process.

본 발명의 PB 나노입자 처리는 콜라겐 침착뿐만 아니라 콜라겐 조직에도 영향을 미친다. 일반적으로 III형 콜라겐은 콜라겐 침착 초기 단계에서 많이 생성되어, 성숙 후기 단계에서 III형 콜라겐보다 더 강력한 특성을 갖는 I형 콜라겐으로 대체된다. 정상 피부 세포에서 콜라겐 섬유는 바구니 짜임새와 같은 형태를 나타내는 반면, 미성숙한 재생 상처 조직의 콜라겐 섬유는 일렬에 가깝게 정렬된 형태를 갖는다.The PB nanoparticle treatment of the present invention affects not only collagen deposition but also collagen organization. In general, type III collagen is produced in abundance in the early stage of collagen deposition, and is replaced by type I collagen, which has stronger properties than type III collagen, in the later stage of maturation. Collagen fibers in normal skin cells exhibit a basket texture, whereas collagen fibers in immature regenerated scar tissue have a close-aligned morphology.

이러한 콜라겐 조직을 분석하기 위하여 새로 형성된 콜라겐 섬유의 배향을 편광 현미경으로 관찰하였다.In order to analyze these collagen tissues, the orientation of newly formed collagen fibers was observed with a polarized light microscope.

도 7의 (b)는 콜라겐 섬유의 배향을 편광 현미경으로 관찰한 이미지이다. 이때, 콜라겐 I형은 주황색-적색, 콜라겐 III형은 녹색-노란색으로 나타난다.Figure 7 (b) is an image of observing the orientation of the collagen fibers with a polarizing microscope. At this time, collagen type I appears in orange-red, and collagen type III appears in green-yellow.

도 7의 (c) 및 (d)는 콜라겐 I형 및 III형의 분포를 분석하기 위한 이미지 및 그래프이다.7 (c) and (d) are images and graphs for analyzing the distribution of collagen type I and type III.

도 7의 (c) 및 (d)를 참조하면, 대조군과 50μg군은 주로 I형 콜라겐이 거의 없는 III형 콜라겐의 분포를 나타내었으며, 두 군 모두에서 콜라겐 배향이 일렬에 가깝게 정렬된 상태인 것을 확인할 수 있다. 500μg군에서도 III형 콜라겐 다발이 남아 있었지만, I 형 콜라겐이 바닥에서부터 점차 III 형 콜라겐 다발을 대체 한 것으로 확인되었으며, 대조군이나 50μg군에 비하여 콜라겐 배향이 훨씬 넓어진 것을 확인할 수 있다. 특히, 50μg×4 그룹의 경우, 콜라겐 섬유 다발이 다른 군에 비해 두께가 가장 두껍고 밀도가 높은 것을 확인할 수 있다.Referring to (c) and (d) of FIG. 7, the control group and the 50 μg group mainly showed the distribution of type III collagen with almost no type I collagen, and the collagen orientation in both groups was closely aligned. You can check. Type III collagen bundles remained in the 500 μg group, but it was confirmed that type I collagen gradually replaced the type III collagen bundles from the bottom, and the collagen orientation was much wider than in the control group or the 50 μg group. In particular, in the case of the 50 μg × 4 group, it can be seen that the collagen fiber bundles are the thickest and have the highest density compared to the other groups.

<실험예 8> PB 나노입자의 상처 표피 분화 촉진 및 혈관 신생 효과 확인 실험<Experimental Example 8> Experiment confirming the effect of promoting wound epidermal differentiation and angiogenesis of PB nanoparticles

상처가 치유되는 과정에서는 각질 세포와 같은 상피 세포가 활성화되어 새로운 조직으로 이동하여 상처와 환경 사이의 장벽을 형성하게 된다. 상처 부위에서 재생 된 피부층이 성숙하는 동안, 표피의 각질 세포는 층을 이루고 분화하여 각질층 위에 놓인 기저층과 과립층을 형성하게 된다. 이러한 각질 세포는 기저 세포층에서 피부 표면을 향해 이동함에 따라 점차 분열 및 최종 분화 능력을 상실하게 되는데, 이 과정에서 각질화 된 외피의 세포질 단백질 전구체인 인볼루크린(involucrin)을 포함한 분화 의존성 단백질이 합성된다. 따라서, 본 발명의 실험예 8에서는 상기와 같은 상처에서의 표피 분화에 대한 PB 나노입자의 효과를 분석하기 위하여, 인볼루크린 등 분화 의존성 단백질의 발현을 분석하였다.In the process of wound healing, epithelial cells such as keratinocytes are activated and move to new tissues to form a barrier between the wound and the environment. During the maturation of the regenerated skin layer at the wound site, the keratinocytes of the epidermis layer and differentiate to form the basal and granular layers overlying the stratum corneum. As these keratinocytes migrate from the basal cell layer toward the skin surface, they gradually lose their ability to divide and finally differentiate. During this process, differentiation-dependent proteins including involucrin, a precursor of keratinized epidermal cytoplasmic proteins, are synthesized. . Therefore, in Experimental Example 8 of the present invention, expression of differentiation-dependent proteins such as involucrin was analyzed in order to analyze the effect of PB nanoparticles on epidermal differentiation in wounds as described above.

인볼루크린, CD31, α-SMA, F4/80 및 TNF-α의 발현 수준은 면역 형광 염색으로 확인되었다. 이를 위하여, 먼저 섹션화 된 실시예 1에 따른 상처 조직 샘플을 준비하여 0.1% Triton X-100 처리 후 5% 염소 혈청과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단하였다. 그런 다음 샘플을 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체로 처리하였다(인볼루크린 및 CD31의 경우 1:100, α-SMA, F4/80 및 TNF-α의 경우 1:200으로 처리). 상기 샘플을 세척하여 형광단이 결합 된 2차 항체(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)와 반응시켰다. 마지막으로, 샘플을 핵염색 DAPI로 대조 염색하고 형광 현미경 (IX71 도립 현미경; Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰하였다.Expression levels of involucrin, CD31, α-SMA, F4/80 and TNF-α were confirmed by immunofluorescence staining. To this end, first, a sectioned wound tissue sample according to Example 1 was prepared, treated with 0.1% Triton X-100, and then incubated with 5% goat serum at room temperature for 1 hour to block non-specific binding. Samples were then treated with primary antibodies (1:100 for involucrin and CD31, 1:200 for α-SMA, F4/80 and TNF-α) overnight at 4°C. The sample was washed and reacted with a fluorophore-conjugated secondary antibody (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA). Finally, samples were counterstained with the nuclear dye DAPI and observed using a fluorescence microscope (IX71 inverted microscope; Olympus, Tokyo, Japan).

도 8은 피부 상처 모델의 면역 조직 화학적 염색 분석 사진이다. 8 is a photograph of immunohistochemical staining analysis of a skin wound model.

도 8의 (a) 및 (b)의 녹색은 인볼루크린, 파란색은 DAPI, 빨간색(위쪽)은 Anti-CD31, 빨간색(아래쪽)은 anti-α-SMA, 흰색 화살표는 세동맥을 나타낸다. In (a) and (b) of FIG. 8 , green indicates involucrin, blue indicates DAPI, red (top) indicates anti-CD31, red (bottom) indicates anti-α-SMA, and white arrows indicate arterioles.

도 8의 (c)는 인볼루크린, (d)는 CD3, 및 (e)는 세동맥을 발현 면적에 대한 백분율로 정량화한 그래프이다. 이때, *는 대조군에 비해 p<0.05, @는 50μg 군에 비해 p<0.05, #은 500μg 군에 비해 p<0.05를 나타낸다 8 (c) is a graph quantifying involucrin, (d) CD3, and (e) arterioles as a percentage of the expression area. At this time, * indicates p<0.05 compared to the control group, @ indicates p<0.05 compared to the 50μg group, and # indicates p<0.05 compared to the 500μg group.

도 8의 (a) 및 (c)를 참조하면, 대조군과 50μg 군에서는 표피층에 인볼루크린이 거의 발현되지 않은 것을 확인할 수 있다. 반면, 500μg 그룹에서는 인볼루크린의 발현이 향상된 것을 확인할 수 있으며, 특히, 50μg×4 그룹에서는 더욱 강한 발현이 관찰되는 것을 확인할 수 있다. Referring to (a) and (c) of FIG. 8 , it can be seen that involucrin was hardly expressed in the epidermal layer in the control group and the 50 μg group. On the other hand, it can be confirmed that the expression of involucrin is improved in the 500 μg group, and in particular, a stronger expression is observed in the 50 μg × 4 group.

다음으로, 피부 상처 조직 재생을 위하여 섬유아세포와 상피 세포에 산소와 영양소 공급이 필요하므로 상처 재생에 필수적인 혈관 신생 특성을 평가하였다. 이를 위하여 α-SMA 항체 염색을 이용하였는데, 이는 새로운 혈관을 검출하기 위하여 혈관벽의 평활근 세포를 식별하는 역할을 한다. 이때, α-SMA는 평활근 세포뿐만 아니라 근섬유 아세포에서도 발현되기 때문에 새로 형성된 혈관을 나타내는 α-SMA 양성 원형 구조 만을 분석하였다. 이는 도 8의 (b)의 흰색 화살표로 표시된다. 이러한 원형 구조를 가진 세동맥의 단위 면적당 개수를 세어 분석하였다. 또한, CD31 항체 염색을 사용하여 상처 부위의 모세 혈관을 검출하였다.Next, since the supply of oxygen and nutrients to fibroblasts and epithelial cells is necessary for skin wound tissue regeneration, angiogenic properties essential for wound regeneration were evaluated. To this end, α-SMA antibody staining was used, which serves to identify smooth muscle cells in the vessel wall in order to detect new blood vessels. At this time, since α-SMA is expressed not only in smooth muscle cells but also in myofibroblasts, only α-SMA-positive circular structures representing newly formed blood vessels were analyzed. This is indicated by a white arrow in FIG. 8(b). The number per unit area of arterioles having such a circular structure was counted and analyzed. In addition, capillaries at the wound site were detected using CD31 antibody staining.

도 8의 (b), (d) 및 (e)를 참조하면, 신생 세동맥의 수는 대조군 및 50μg 그룹에 비해 50μg×4 그룹 및 500μg 그룹에서 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있으며, 이때 50μg×4 그룹의 세동맥 수가 500μg군에 비해 현저히 많은 것을 확인할 수 있다. 또한, 대조군과 50μg 그룹 모두 낮은 CD31 발현을 나타내는 것에 반해 50μg×4 그룹은 다른 모든 그룹에 비해 CD31의 발현이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해, PB 나노입자의 반복적인 도포가 높은 수준의 혈관 신생 및 혈관 신생을 유도할 수 있으며, 이는 적절한 혈액 공급으로 인해 상처 피부의 재 상피화, 콜라겐 침착 및 피부 층의 성숙을 통해 상처 치유 효율을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있다.Referring to (b), (d) and (e) of FIG. 8 , it can be seen that the number of new arterioles increased significantly in the 50 μg × 4 group and the 500 μg group compared to the control group and the 50 μg group. In this case, the 50 μg × 4 group It can be seen that the number of arterioles was significantly higher than that of the 500 μg group. In addition, while both the control group and the 50μg group showed low CD31 expression, the 50μg×4 group showed a significantly higher expression of CD31 than all other groups. It can be confirmed that angiogenesis and angiogenesis can be induced, which can improve wound healing efficiency through re-epithelialization of the wound skin, collagen deposition, and maturation of the skin layer due to proper blood supply.

<실험예 9> PB 나노입자의 생체 내(in vivo) 항 염증 효과 확인 실험<Experimental Example 9> Experiment to confirm the in vivo anti-inflammatory effect of PB nanoparticles

본 발명의 PB 나노입자의 생체 내 항 염증 효과를 확인하는 실험을 진행하였다. An experiment was conducted to confirm the anti-inflammatory effect of the PB nanoparticles of the present invention in vivo.

이를 위하여, 대식세포 모집의 정도를 분석하기 위해 대식세포 표면에서 발현되고 일반적으로 조직 대식세포를 식별하는데 사용되는 F4/80 당 단백질의 면역 염색을 사용하였다.To this end, immunostaining of the F4/80 glycoprotein, which is expressed on the macrophage surface and is commonly used to identify tissue macrophages, was used to analyze the extent of macrophage recruitment.

도 9는 PB 나노 자임의 생체 내 항 염증 효과를 나타내는 이미지 및 그래프이다.9 is an image and a graph showing the anti-inflammatory effect of PB nanozyme in vivo.

도 9의 (a) 및 (b)의 빨간색(위)은 F4/80을, 파란색은 DAPI를, 빨간색(아래)는 TNF-α를 나타낸다.In (a) and (b) of FIG. 9 , red (upper) indicates F4/80, blue indicates DAPI, and red (lower) indicates TNF-α.

도 9의 (c) 내지 (e)는 각각 (c) F4/80의 중심 영역, (d) F4/80의 가장자리 영역 및 (e) TNF-α의 중심 영역에 대한 양성 발현 영역의 백분율을 정량화하여 나타낸 그래프이다.Figure 9 (c) to (e) quantify the percentage of the positive expression area for (c) the center area of F4/80, (d) the edge area of F4/80 and (e) the center area of TNF-α, respectively. This is the graph shown by

도 9를 참조하면, F4/80 발현은 PB 나노입자의 용량이 증가함에 따라 감소하였으며, 50μg 그룹조차도 대조군보다 현저하게 감소 된 F4/80 양성 영역 (중앙 : 2.4 ± 0.9 %, 가장자리 : 2.5 ± 0.8 %)을 나타내었다. 50μg × 4그룹 (중앙 : 0.4 ± 0.1 %, 가장자리 : 0.3 ± 0.7 %) 그룹에서 F4/80의 발현은 대조군 또는 50μg 그룹보다 거의 10 배 가량 낮은 것으로 확인되었다. 활성화 된 대식세포에서 분비되는 염증의 급성 반응에 관여하는 전 염증 사이토카인 인 TNF-α 또한 PB 나노입자 처리에 의해 상처의 중앙부에서도 감소한 것을 확인할 수 있으며, 500μg 그룹(1.7 ± 0.2%) 또는 50μg × 4그룹 (1.4 ± 0.3%)은 대조군 (5.2 ± 1.4%)과 비교하여 약 1/3으로 감소한 TNF-α 발현을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 PB 나노입자의 강력한 생체 내 항 염증 효과는 감염된 상처 모델에서 전 염증성 사이토 카인의 분비를 방지 할뿐만 아니라, 대식세포 부담을 감소시킬 수 있음 또한 확인할 수 있다. 따라서, 전반적으로 PB 나노입자의 항 염증 활성은 상처를 장기간의 염증 상태로부터 예방하고 효과적인 상처 치유를 촉진하는 데 기여 가능한 것을 확인할 수 있다.Referring to Figure 9, F4/80 expression decreased as the dose of PB nanoparticles increased, and even the 50 μg group showed a significantly reduced F4/80 positive area (center: 2.4 ± 0.9%, edge: 2.5 ± 0.8%) than the control group. %) was shown. The expression of F4/80 in the 50 μg × 4 group (center: 0.4 ± 0.1%, edge: 0.3 ± 0.7%) group was found to be almost 10 times lower than that in the control or 50 μg group. TNF-α, a pro-inflammatory cytokine involved in the acute response of inflammation secreted from activated macrophages, was also reduced in the central part of the wound by PB nanoparticle treatment. It can be seen that group 4 (1.4 ± 0.3%) exhibits TNF-α expression reduced by about 1/3 compared to the control group (5.2 ± 1.4%). Through this, it was confirmed that the strong in vivo anti-inflammatory effect of the PB nanoparticles of the present invention can not only prevent the secretion of pro-inflammatory cytokines in an infected wound model, but also reduce macrophage burden. Therefore, it can be confirmed that the overall anti-inflammatory activity of PB nanoparticles can contribute to preventing wounds from a long-term inflammatory state and promoting effective wound healing.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, the embodiments described above should be understood as illustrative in all respects and not limiting. For example, each component described as a single type may be implemented in a distributed manner, and similarly, components described as distributed may be implemented in a combined form.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the following claims, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and equivalent concepts should be interpreted as being included in the scope of the present invention.

Claims (15)

프러시안 블루 나노입자 첨가제를 포함하는 상처 치료제로서,
상기 상처 치료제의 용도는 피부조직의 상처 치료 및 재생용인 것을 특징으로 하는 상처 치료제.
As a wound treatment comprising a Prussian blue nanoparticle additive,
Wound treatment, characterized in that the use of the wound treatment is for wound treatment and regeneration of skin tissue.
제1항에 있어서,
상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것인 상처 치료제.
According to claim 1,
The wound is a wound, abrasion, laceration, stab wound, ulcer, or a combination thereof.
제1항에 있어서,
상기 프러시안 블루 나노입자는, 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합을 통해 상처 부위의 피부 조직 재생을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 상처 치료제.
According to claim 1,
The Prussian blue nanoparticles promote skin tissue regeneration at the wound site through induction of differentiation of keratinocytes, promotion of tissue microangiogenesis, collagen deposition, or a combination thereof.
삭제delete 제1항에 있어서,
현탁액, 겔, 로션, 크림 또는 연고 성상인 것을 특징으로 하는 상처 치료제.
According to claim 1,
A wound healing agent characterized in that it is in the form of a suspension, gel, lotion, cream or ointment.
프러시안 블루 나노입자가 환부 접촉면에 도포 또는 코팅된 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱제.
A dressing for wound healing or skin tissue regeneration, characterized in that Prussian blue nanoparticles are applied or coated on the contact surface of the affected area.
제6항에 있어서,
상기 상처는 창상(wound), 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상(stab wound), 궤양 또는 이들의 조합인 것인 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱제.
According to claim 6,
The wound is a wound, abrasion, laceration, stab wound, ulcer, or a combination thereof for wound healing or skin tissue regeneration dressing.
제6항에 있어서,
상기 피부 조직 재생은 각질 세포의 분화 유도, 조직의 미세혈관 신생 촉진, 콜라겐 침착 또는 이들의 조합인 것인 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱제.
According to claim 6,
The skin tissue regeneration is a dressing agent for wound treatment or skin tissue regeneration that induces differentiation of keratinocytes, promotes tissue microangiogenesis, collagen deposition, or a combination thereof.
제6항에 있어서,
하이드로콜로이드형, 폴리우레탄 폼형, 필름형 또는 하이드로겔형인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱제.
According to claim 6,
A dressing agent for wound healing or skin tissue regeneration, characterized in that it is in the form of a hydrocolloid, polyurethane foam, film or hydrogel.
드레싱제를 준비하는 단계; 및
상기 드레싱제의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계;
를 포함하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱제의 제조방법.
Preparing a dressing agent; and
Coating Prussian blue nanoparticles on the contact surface of the dressing agent;
Method for producing a dressing for wound healing or skin tissue regeneration comprising a.
제10항에 있어서,
상기 드레싱제의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 코팅하는 단계는,
프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계; 및
상기 드레싱제의 환부 접촉면을 상기 전구체 용액에 담그거나, 상기 전구체 용액을 상기 드레싱제의 환부 접촉면에 도포하여 상기 드레싱제의 환부 접촉면에 프러시안 블루 나노입자를 형성시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱제의 제조방법.
According to claim 10,
Coating the Prussian blue nanoparticles on the affected area contact surface of the dressing agent,
Preparing a precursor solution for forming Prussian blue nanoparticles; and
Forming Prussian blue nanoparticles on the affected area contact surface of the dressing agent by immersing the dressing agent in contact with the affected area in the precursor solution or applying the precursor solution to the affected area contact surface of the dressing agent;
Method for producing a dressing for wound healing or skin tissue regeneration, characterized in that it comprises a.
제11항에 있어서,
상기 프러시안 블루 나노입자 형성을 위한 전구체 용액을 준비하는 단계는,
페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물 및 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
상기 혼합물을 용매와 혼합하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱제의 제조방법.
According to claim 11,
Preparing a precursor solution for forming the Prussian blue nanoparticles,
preparing a mixture by mixing a compound containing ferricyanide ion ([Fe(CN) ₆ ] ^3- ) and a compound containing iron ion (Fe ³⁺ ); and
mixing the mixture with a solvent;
Method for producing a dressing for wound healing or skin tissue regeneration, characterized in that it comprises a.
제12항에 있어서,
상기 페리시안화 이온([Fe(CN)₆]^3-)을 포함하는 화합물은, 페리시안화칼륨(K₃Fe(CN)₆) 또는 페리시안화나트륨(Na₃Fe(CN)₆)인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱제의 제조방법.
According to claim 12,
The compound containing the ferricyanide ion ([Fe(CN) ₆ ] ^3- ) is potassium ferricyanide (K ₃ Fe(CN) ₆ ) or sodium ferricyanide (Na ₃ Fe(CN) ₆ ), characterized in that Method for producing a dressing for wound treatment or skin tissue regeneration.
제12항에 있어서,
상기 철 이온(Fe³⁺)을 포함하는 화합물은, 염화철(FeCl₃), 과염소산철(Fe(ClO₄)₃) 및 질산철(Fe(NO₃)₃)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱제의 제조방법.
According to claim 12,
The compound containing iron ions (Fe ³⁺ ) is at least one selected from the group consisting of iron chloride (FeCl ₃ ), iron perchlorate (Fe(ClO ₄ ) ₃ ) and iron nitrate (Fe(NO ₃ ) ₃ ). Method for producing a dressing for wound healing or skin tissue regeneration, characterized in that.
제12항에 있어서,
상기 용매는 물인 것을 특징으로 하는 상처 치료용 또는 피부 조직 재생용 드레싱제의 제조방법.
According to claim 12,
The solvent is a method for producing a dressing for wound treatment or skin tissue regeneration, characterized in that water.

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