KR102473370B1 - Increased fertility in bovine species - Google Patents

Abstract

본 발명은 암소의 수태율을 상승시키는데 효과적인 면역조절 조성물 및 방법에 관한 것이다.The present invention relates to immunomodulatory compositions and methods effective for increasing fertility in cows.

Description

소 종에서의 수정능 상승 Increased fertility in bovine species

본 발명은 암소 (cow)에서 면역조절을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암소에서 첫 서비스 수태율을 상승시키는데 효과적인 조성물 및 방법을 포함한다.The present invention relates to compositions and methods for immunomodulation in cows. In particular, the present invention includes compositions and methods effective for increasing first service conception rates in cows.

젖소에서 가장 높은 이환율 및 사망률은 분만 주위기에 발생한다. 미엘로퍼옥시다제 및 식세포작용 분석을 통해 입증된 바와 같이 백혈구 수가 감소하고 백혈구 기능이 저하되어 분만에 임박해 면역 기능이 손상되는 것으로 나타났다. 분만에 임박해 면역 기능이 향상될 수 있다면 면역 기능에 민감할 수 있는 생식 성과가 개선될 수 있다.The highest morbidity and mortality in dairy cows occurs in the peripartum period. As evidenced by myeloperoxidase and phagocytosis assays, decreased white blood cell count and reduced white blood cell function have been shown to impair immune function in the imminent parturition. Reproductive performance, which may be sensitive to immune function, may be improved if immune function can be improved in the imminent parturition.

젖소의 출산력은 축군 두수 증가, 발정 검출 감도 및 특이성 감소, 분만시 몸 상태 점수 하락 및 산후 몸 상태 점수 손실율 증가를 비롯한 여러 요인으로 인해 국제적인 규모로 감소하고 있다. (McDougall, J. Reproduction and Development 52, 185-194 (2006) 참조). 최적의 군 단위 건강관리 및 생산성을 유지하기 위해서는 높은 수준의 번식 능력이 필수이다. 암소 및 암송아지의 번식 능력을 상승시킬 수 있는 조성물 및 방법이 당 업계에서 요구된다.Dairy cow fertility is declining on an international scale due to several factors, including increased herd numbers, decreased sensitivity and specificity of estrus detection, lower parturition body condition scores and increased postpartum body condition score loss rates. (See McDougall, J. Reproduction and Development 52, 185-194 (2006)). High levels of reproductive capacity are essential to maintaining optimal herd health and productivity. There is a need in the art for compositions and methods that can enhance the fertility of cows and heifers.

발명의 요약Summary of Invention

본 발명은 암소 및 암송아지에서 수태율을 상승시키기 위한 면역조절 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 암소 및 암송아지에서 수태율을 상승시키기 위한 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함할 수 있다.The present invention relates to an immunomodulatory composition for increasing fertility in cows and heifers. In some embodiments, an immunomodulatory composition may include a cationic liposomal delivery vehicle and an isolated bacterial-derived nucleic acid molecule that does not encode an immunogen for enhancing fertility in cows and heifers.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 면역자극 CpG 모티프 및 적어도 하나의 비면역자극 CpG 모티프를 포함한다. 추가의 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 2를 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 3을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 4를 포함한다. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises at least one immunostimulatory CpG motif and at least one non-immunostimulatory CpG motif. In a further embodiment, the nucleic acid molecule has at least 80% sequence homology to the sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 1. In another embodiment, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO:2. In another embodiment, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO:3. In another embodiment, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO:4.

일부 구체예에서, 리포좀 전달 비히클은 멀티라멜라 소포 지질 및 압출 지질로 구성된 군으로부터 선택된 지질을 포함한다. 추가의 구체예에서, 리포좀 전달 비히클은 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택된 지질 쌍을 포함한다.In some embodiments, the liposomal delivery vehicle comprises a lipid selected from the group consisting of multilamellar vesicle lipids and extruded lipids. In a further embodiment, the liposomal delivery vehicle comprises N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and cholesterol; N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTAP) and cholesterol; 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium chloride (DOTIM) and cholesterol; and a lipid pair selected from the group consisting of dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB) and cholesterol.

일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 생물학적 제제를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 생물학적 제제는 면역 증강 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.In some embodiments, the immunomodulatory composition further comprises a biological agent. In a further embodiment, the biologic agent is selected from the group consisting of immune enhancing proteins, immunogens, vaccines, antimicrobial agents, or any combination thereof. In some embodiments, the immunomodulatory composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.

일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 정맥 내, 근육 내, 피내, 복강 내, 피하, 분무-에어로졸, 경구, 안내, 기관 내, 자궁 내, 질 내 및 비강 내로 구성된 군으로부터 선택된 투여용이다.In some embodiments, the immunomodulatory composition is for administration selected from the group consisting of intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutaneous, nebulization-aerosol, oral, intraocular, intratracheal, intrauterine, intravaginal and intranasal.

일부 구체예에서, 암소의 수태율은 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다.In some embodiments, the fertility rate of cows is increased relative to that of a control population.

일부 구체예에서, 비-사이클링 암소의 수태율은 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다.In some embodiments, the fertility rate of non-cycling cows is increased compared to that of a control population.

일부 구체예에서, 암소에서 첫 서비스 수태율은 대조 집단의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.In some embodiments, first service conception rates in cows are increased relative to first service conception rates in a control population.

일부 구체예에서, 비-사이클링 암소의 첫 서비스 수태율은 대조 집단의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.In some embodiments, the first service conception rate of non-cycling cows is increased compared to the first service conception rate of a control population.

일부 구체예에서, 암소의 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.In some embodiments, a cow's conception rate is increased relative to a first service conception rate in a control population, as determined by a p-value of 0.05 or less.

일부 구체예에서, 비-사이클링 암소의 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다.In some embodiments, the fertility rate of non-cycling cows is increased relative to that of a control population, as determined by a p-value of 0.05 or less.

일부 구체예에서, 암소의 첫 서비스 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단에서의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.In some embodiments, the cow's first service conception rate is increased relative to the first service conception rate in a control population, as determined by a p-value of 0.05 or less.

일부 구체예에서, 비-사이클링 암소에서의 첫 서비스 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조군에서의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.In some embodiments, first service conception rates in non-cycling cows are increased compared to first service conception rates in controls, as determined by a p-value of 0.05 or less.

본 발명은 또한 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암소에서 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 핵산 분자를 포함할 수 있다.The present invention also relates to a method of increasing fertility in cows comprising administering to the cows an effective amount of an immunomodulatory composition. In some embodiments, an immunomodulatory composition may include a cationic liposomal delivery vehicle and a nucleic acid molecule that does not encode an immunogen.

본 발명은 또한 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암소에서 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함할 수 있다.The present invention also relates to a method of increasing fertility in cows comprising administering to the cows an effective amount of an immunomodulatory composition. In some embodiments, an immunomodulatory composition may include a cationic liposomal delivery vehicle and an isolated bacterial-derived nucleic acid molecule that does not encode an immunogen.

본 발명은 또한 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-사이클링 암소에서 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 핵산 분자를 포함할 수 있다.The invention also relates to a method of increasing fertility in non-cycling cows comprising administering to the cows an effective amount of an immunomodulatory composition. In some embodiments, an immunomodulatory composition may include a cationic liposomal delivery vehicle and a nucleic acid molecule that does not encode an immunogen.

본 발명은 또한 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-사이클링 암소에서 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함할 수 있다.The invention also relates to a method of increasing fertility in non-cycling cows comprising administering to the cows an effective amount of an immunomodulatory composition. In some embodiments, an immunomodulatory composition may include a cationic liposomal delivery vehicle and an isolated bacterial-derived nucleic acid molecule that does not encode an immunogen.

또한, 본 발명은 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암소에서 첫 서비스 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 핵산 분자를 포함할 수 있다.The present invention also relates to a method of increasing first service conception rates in cows comprising administering to the cows an effective amount of an immunomodulatory composition. In some embodiments, an immunomodulatory composition may include a cationic liposomal delivery vehicle and a nucleic acid molecule that does not encode an immunogen.

또한, 본 발명은 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암소에서 첫 서비스 수태율을 상승시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함할 수 있다.The present invention also relates to a method of increasing first service conception rates in cows comprising administering to the cows an effective amount of an immunomodulatory composition. In some embodiments, an immunomodulatory composition may include a cationic liposomal delivery vehicle and an isolated bacterial-derived nucleic acid molecule that does not encode an immunogen.

또한, 본 발명은 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-사이클링 암소에서 첫 서비스 수태 비율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 핵산 분자를 포함할 수 있다.The present invention also relates to a method of increasing first service conception rates in non-cycling cows comprising administering to the cows an effective amount of an immunomodulatory composition. In some embodiments, an immunomodulatory composition may include a cationic liposomal delivery vehicle and a nucleic acid molecule that does not encode an immunogen.

또한, 본 발명은 암소에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 비-사이클링 암소에서 첫 서비스 수태 비율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함할 수 있다.The present invention also relates to a method of increasing first service conception rates in non-cycling cows comprising administering to the cows an effective amount of an immunomodulatory composition. In some embodiments, an immunomodulatory composition may include a cationic liposomal delivery vehicle and an isolated bacterial-derived nucleic acid molecule that does not encode an immunogen.

일부 구체예에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 면역자극 CpG 모티프 및 적어도 하나의 비면역자극 CpG 모티프를 포함한다. 추가의 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 1을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 2를 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 서열 번호 3을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산 분자는 핵산 분자는 서열 번호 4를 포함한다. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises at least one immunostimulatory CpG motif and at least one non-immunostimulatory CpG motif. In a further embodiment, the nucleic acid molecule has at least 80% sequence homology to the sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 1. In another embodiment, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO:2. In another embodiment, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO:3. In another embodiment, the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO:4.

일부 구체예에서, 리포좀 전달 비히클은 멀티라멜라 소포 지질 및 압출 지질로 구성된 군으로부터 선택된 지질을 포함한다. 추가의 구체예에서, 리포좀 전달 비히클은 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택된 지질 쌍을 포함한다.In some embodiments, the liposomal delivery vehicle comprises a lipid selected from the group consisting of multilamellar vesicle lipids and extruded lipids. In a further embodiment, the liposomal delivery vehicle comprises N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and cholesterol; N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTAP) and cholesterol; 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium chloride (DOTIM) and cholesterol; and a lipid pair selected from the group consisting of dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB) and cholesterol.

일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 생물학적 제제를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 생물학적 제제는 면역 증강 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 면역조절 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.In some embodiments, the immunomodulatory composition further comprises a biological agent. In a further embodiment, the biologic agent is selected from the group consisting of immune enhancing proteins, immunogens, vaccines, antimicrobial agents, or any combination thereof. In some embodiments, the immunomodulatory composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.

일부 구체예에서, 면역 요법 조성물은 정맥 내, 근육 내, 피내, 복강 내, 피하, 분무-에어로졸, 경구, 안내, 기관 내 및 비강 내로 구성된 군으로부터 선택된 투여용이다.In some embodiments, the immunotherapy composition is for administration selected from the group consisting of intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutaneous, nebulization-aerosol, oral, intraocular, intratracheal and intranasal.

도 1은 pMB75.6 플라스미드 (서열 번호 1) 지도이다.
도 2는 pGCMB75.6 플라스미드 (서열 번호 2) 지도이다.
도 3은 pLacZMB75.6 플라스미드 (서열 번호 3) 지도이다.
도 4A는 첫 수정에 대한 수태 확률 (산정 주변 평균 및 평균 표준 오차 (SEM))의 차트를 나타내고, 도 4B는 처리군 별 사이클링 및 비-사이클링 암소에 대한 계획된 번식 프로그램의 시작 후 3주 내에 임신 확률 (산정 주변 평균 및 SEM)을 나타낸다. 별표는 비-사이클링 군 내 처리간 차이를 나타낸다.Figure 1 is a pMB75.6 plasmid (SEQ ID NO: 1) map.
Figure 2 is a pGCMB75.6 plasmid (SEQ ID NO: 2) map.
Figure 3 is a pLacZMB75.6 plasmid (SEQ ID NO: 3) map.
4A shows charts of conception probabilities (estimated marginal means and mean standard errors (SEM)) for first fertilization, and FIG. 4B shows pregnancy within 3 weeks of initiation of the planned breeding program for cycling and non-cycling cows by treatment group. Probability (estimated marginal mean and SEM) is presented. Asterisks indicate differences between treatments within non-cycling groups.

발명의 상세한 설명DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

본 발명에 따라, 암소의 수태율을 상승시키기 위한 면역조절 조성물 및 이의 사용 방법이 제공된다. 상기 면역조절 조성물은 양이온성 리포좀 전달 비히클 및 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아-유래 핵산 분자를 포함한다. 이들 조성물 및 면역조절 조성물의 사용 방법은 하기에서 보다 상세히 논의된다.According to the present invention, an immunomodulatory composition for increasing fertility in cows and a method of using the same are provided. The immunomodulatory composition comprises a cationic liposomal delivery vehicle and an isolated bacterial-derived nucleic acid molecule that does not encode an immunogen. Methods of using these compositions and immunomodulatory compositions are discussed in more detail below.

I. 조성물I. composition

본원에 기재된 것과 같은 본 발명에 유용한 조성물은 일반적으로 감염성 질환에 대한 예방 요법, 메타예방 요법 또는 치료 요법으로 사용될 수 있다. 이 조성물은 본원에서 면역조절 조성물로서 지칭된다. 면역조절 조성물은 적어도 암소의 수태율을 상승시킬 수 있는 면역자극 플라스미드 또는 면역자극 DNA 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역조절 조성물은 또한 리포좀 전달 비히클을 포함할 수 있다.Compositions useful in the present invention, such as those described herein, can be used in prophylactic, meta-prophylactic or therapeutic regimens for infectious diseases in general. This composition is referred to herein as an immunomodulatory composition. The immunomodulatory composition contains at least an immunostimulatory plasmid or immunostimulatory DNA sequence capable of increasing fertility in cows. In some aspects, an immunomodulatory composition may also include a liposomal delivery vehicle.

A. 핵산A. Nucleic Acids

일부 측면에서, 본 발명은 암소의 수태율을 상승시키는데 유용한 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에 기재된 핵산 분자는 면역자극 플라스미드에 선형 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA, 아미노산 서열, 리보 핵산 (RNA) 또는 이들의 조합으로서 포함될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명은 면역자극 플라스미드 또는 면역자극 DNA 서열을 함유하는 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포 (시험관 내, 생체 내 또는 생체 외)에 관한 것이다.In some aspects, the present invention relates to nucleic acid molecules useful for increasing fertility in cows. Nucleic acid molecules described herein can be incorporated into immunostimulatory plasmids as linear double-stranded or single-stranded DNA, amino acid sequences, ribonucleic acids (RNA), or combinations thereof. In some aspects, the invention relates to immunostimulatory plasmids or nucleic acid molecules, vectors and host cells (in vitro, in vivo or ex vivo) containing immunostimulatory DNA sequences.

본원에 기재된 핵산 분자는 CpG 모티프가 풍부하다. 이러한 CpG 모티프는 TLR9 및 TLR21과 같은 특정 톨 (Toll)-유사 수용체를 통해 면역자극을 유도할 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 핵산 분자는 또한 비-CpG 면역자극 모티프를 함유한다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 무작위 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프 빈도 대비 약 2 내지 20%의 CpG 모티프를 함유한다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 무작위 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프의 빈도 대비 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40% 또는 그 이상의 CpG 모티프를 포함한다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 무작위 핵산 서열에서 예상되는 CpG 모티프의 빈도 대비 약 10%의 CpG 모티프를 함유한다. 일부 측면에서, 척추 동물 DNA와 비교하여, 10 배 이상 더 풍부한 CpG 모티프가 관찰된다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 척추 동물 DNA와 비교하여 약 2 내지 50 배 또는 그 이상의 CpG 모티프를 함유한다. 일부 측면에서, 핵산 분자는 척추 동물 DNA와 비교하여 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55배 또는 그 이상의 CpG 모티프를 포함한다.The nucleic acid molecules described herein are rich in CpG motifs. These CpG motifs can induce immunostimulation through certain Toll-like receptors such as TLR9 and TLR21. Additionally, the nucleic acid molecules described herein also contain non-CpG immunostimulatory motifs. In some aspects, the nucleic acid molecule contains between about 2 and 20% of CpG motifs relative to the expected frequency of CpG motifs in a random nucleic acid sequence. In some aspects, a nucleic acid molecule is about 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 relative to the expected frequency of a CpG motif in a random nucleic acid sequence. , 19, 20, 25, 30, 35, 40% or more CpG motifs. In some aspects, a nucleic acid molecule contains about 10% of CpG motifs relative to the expected frequency of CpG motifs in a random nucleic acid sequence. In some aspects, compared to vertebrate DNA, a 10-fold or greater abundance of CpG motifs is observed. In some aspects, the nucleic acid molecule contains about 2 to 50 times or more CpG motifs compared to vertebrate DNA. In some aspects, the nucleic acid molecule is about 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 or more CpG motifs.

일부 측면에서, 본 발명은 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 면역자극 플라스미드 또는 DNA 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 pMB75.6 플라스미드는 항생제 내성 유전자인 카나마이신을 포함한다. pMG75.6의 서열은 서열 번호 1로서 표 1에 제공되어 있다.In some aspects, the invention relates to an immunostimulatory plasmid or DNA sequence that does not contain an antibiotic resistance gene. For example, the pMB75.6 plasmid described herein contains the antibiotic resistance gene, kanamycin. The sequence of pMG75.6 is provided in Table 1 as SEQ ID NO: 1.

일부 측면에서, 본 발명은 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 면역자극 플라스미드 또는 DNA 서열에 관한 것이다. 플라스미드는 임의의 선택 또는 선별 마커 유전자가 결여되어 있을 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 pGCMB75.6 플라스미드는 임의의 전장 또는 기능성의 선택 또는 선별 마커 유전자를 포함하지 않는다. pGCMB75.6의 서열은 서열 번호 2로서 표 1에 제공되어 있다.In some aspects, the invention relates to an immunostimulatory plasmid or DNA sequence that does not contain an antibiotic resistance gene. The plasmid may lack any selectable or selectable marker gene. For example, the pGCMB75.6 plasmid described herein does not contain any full-length or functional selectable or selectable marker genes. The sequence of pGCMB75.6 is provided in Table 1 as SEQ ID NO:2.

일부 측면에서, 본원에 기재된 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 전장 또는 기능성의 선택 또는 선별 마커를 코딩하는 핵산 서열을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 플라스미드는 카나마이신 내성 유전자를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 플라스미드는 바람직하게는 면역원을 코딩하지 않는다.In some aspects, the immunostimulatory plasmids described herein preferably do not contain a full-length or functional selection or nucleic acid sequence encoding a selectable marker. In some aspects, the immunostimulatory plasmid does not contain an antibiotic resistance gene. For example, the plasmid does not contain a kanamycin resistance gene. In some aspects, the plasmids described herein preferably do not encode an immunogen.

일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 항생제 내성 유전자가 아닌 선택 또는 선별 마커 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 pLacZMB75.6 플라스미드는 선별 마커로서 LacZ 유전자를 포함한다. pLacZMB75.6의 지도는 도 3에 제공되고, pLacZMB75.6의 뉴클레오티드 서열은 표 1에서 서열 번호 3으로 제공된다. 도 3에서 제시된 바와 같이, pLacZMB75.6은 pGCMB75.6과 유사하지만, LacZ 선별 마커를 포함한다.In some aspects, an immunostimulatory plasmid may include a nucleic acid sequence encoding a selectable or selectable marker gene that is not an antibiotic resistance gene. For example, the pLacZMB75.6 plasmid described herein contains the LacZ gene as a selectable marker. A map of pLacZMB75.6 is provided in FIG. 3 and the nucleotide sequence of pLacZMB75.6 is provided as SEQ ID NO: 3 in Table 1. As shown in Figure 3, pLacZMB75.6 is similar to pGCMB75.6, but contains a LacZ selectable marker.

pMB75.6, pGCMB75.6 또는 pLacZMB75.6 플라스미드의 뉴클레오티드 서열은 그들의 면역자극 특성에 상당한 악영향을 미치지 않으면서 어느 정도 변화될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 측면에서, 본 발명은 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 보다 바람직하게는 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열을 포함한다.It will be appreciated that the nucleotide sequences of the pMB75.6, pGCMB75.6 or pLacZMB75.6 plasmids may be altered to some extent without significantly adversely affecting their immunostimulatory properties. In some aspects, the invention relates to an immunostimulatory plasmid comprising a nucleic acid sequence having at least 80% sequence identity to the sequence of pMB75.6 (SEQ ID NO: 1). The immunostimulatory plasmid preferably contains at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, At least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the sequence It includes nucleic acid sequences having identity. In some aspects, the immunostimulatory plasmid more preferably comprises the sequence of pMB75.6 (SEQ ID NO: 1).

일부 측면에서, 본 발명은 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 면역자극 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 보다 바람직하게는 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열을 포함한다.In some aspects, the invention relates to an immunostimulatory plasmid comprising a nucleic acid sequence having at least 80% sequence identity to the sequence of pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 2). The immunostimulatory plasmid preferably contains at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, At least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the sequence It includes nucleic acid sequences having identity. In some aspects, the immunostimulatory plasmid more preferably comprises the sequence of pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 2).

일부 측면에서, 본 발명은 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 면역자극 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 보다 바람직하게는 pMB75.6 (서열 번호 1)의 서열로 구성된다.In some aspects, the invention relates to an immunostimulatory plasmid consisting of a nucleic acid sequence having at least 80% sequence identity to the sequence of pMB75.6 (SEQ ID NO: 1). The immunostimulatory plasmid preferably contains at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, At least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the sequence It consists of nucleic acid sequences that have identity. In some aspects, the immunostimulatory plasmid more preferably consists of the sequence of pMB75.6 (SEQ ID NO: 1).

일부 측면에서, 본 발명은 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 이루어진 면역자극 플라스미드에 관한 것이다. 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열로 구성된다. 일부 측면에서, 면역자극 플라스미드는 보다 바람직하게는 pGCMB75.6 (서열 번호 2)의 서열로 구성된다.In some aspects, the invention relates to an immunostimulatory plasmid consisting of a nucleic acid sequence having at least 80% sequence identity to the sequence of pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 2). The immunostimulatory plasmid preferably contains at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, At least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the sequence It consists of nucleic acid sequences having sequence identity. In some aspects, the immunostimulatory plasmid more preferably consists of the sequence of pGCMB75.6 (SEQ ID NO: 2).

본 발명의 다른 중요한 측면은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 대해 고도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 핵산 서열을 포함하는 면역 반응을 자극할 수 있는 면역자극 DNA 서열 또는 면역자극 플라스미드를 제공한다. 적합한 핵산 서열은 본 발명의 핵산과 상동성이거나, 실질적으로 유사하거나, 또는 동일하다. 일부 측면에서, 상동성 핵산 서열은 서열 번호 1 또는 각각의 상보성 서열에 대해 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 유사성을 가질 것이다. 다른 측면에서, 상동성 핵산 서열은 서열 번호 2 또는 각각의 상보성 서열에 대해 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 유사성을 가질 것이다. 서열 유사성은 당 업계에 공지된 다수의 알고리즘, 예컨대 문헌 [Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]에 기재되어 있는 BLAST를 사용하여 계산될 수 있다. 핵산은 유전 코드의 축퇴성으로 인하여 상술한 핵산과 서열이 다를 수 있다. 일반적으로, 기준 서열은 18개의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로는 30개 이상의 뉴클레오티드일 것이며, 비교 목적을 위해 조성물의 전체 핵산 서열을 포함할 수 있다.Another important aspect of the present invention provides an immunostimulatory DNA sequence or immunostimulatory plasmid capable of stimulating an immune response comprising a nucleic acid sequence that hybridizes under highly stringent conditions to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Suitable nucleic acid sequences are homologous, substantially similar, or identical to the nucleic acids of the present invention. In some aspects, the homologous nucleic acid sequence is at least about 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% of the sequence will have similarities. In another aspect, the homologous nucleic acid sequence is at least about 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% sequence similarity. will be. Sequence similarity can be determined by a number of algorithms known in the art, such as Altschul, SF, et al., J. Mol. Biol . 215:403-10, 1990]. Nucleic acids may differ in sequence from those described above due to the degeneracy of the genetic code. Typically, the reference sequence will be 18 nucleotides, more usually 30 or more nucleotides, and for comparison purposes may include the entire nucleic acid sequence of the composition.

서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 본원에서 고려된다. 엄격한 하이브리드화 조건은 0.1X SSC (15 mM 염화나트륨/1.5 mM 시트르산나트륨) 및 50 ℃ 이상에서의 하이브리드화와 같은 조건을 포함한다. 또 다른 예는 50% 포름아미드, 5X SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5X 덴하르트 (Denhardt) 용액, 10% 덱스트란 설페이트 용액, 20 μg/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA의 용액 중에서 42 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 약 65 ℃에서 0.1X SSC로 세척하는 것이다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 상기 특정 조건 정도의 엄격성과 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95%인 하이브리드화 조건이다. 다른 엄격한 하이브리드화 조건은 당 업계에 공지되어 있으며, 또한 본 발명의 핵산 동족체를 동정하기 위해 사용될 수도 있다 (Current Protocols in Molecular Biology, Unit 6, pub. John Wiley & Sons, N.Y. 1989).Nucleotide sequences capable of hybridizing to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 are contemplated herein. Stringent hybridization conditions include conditions such as 0.1X SSC (15 mM sodium chloride/1.5 mM sodium citrate) and hybridization above 50°C. Another example is 50% formamide, 5X SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5X Denhardt's solution, 10% dextran sulfate solution, 20 μg/ ml of a solution of denatured sheared salmon sperm DNA at 42°C overnight, followed by washing with 0.1X SSC at about 65°C. Exemplary stringent hybridization conditions are hybridization conditions that are at least about 80%, 85%, 90% or 95% stringency on the order of the specified conditions above. Other stringent hybridization conditions are known in the art and may also be used to identify nucleic acid analogs of the present invention (Current Protocols in Molecular Biology, Unit 6, pub. John Wiley & Sons, N.Y. 1989).

돌연변이가 본원에 기재된 바와 같은 암소에서의 수태율을 상승시키는 능력을 유지하는 핵산 서열을 포함한다면, 본원에 기재된 DNA 분자의 돌연변이 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 그러한 돌연변이의 DNA 서열은 보통 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 상이할 것이다. 서열 변화는 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합일 수 있다. 클로닝된 유전자의 돌연변이유발 기술은 당 업계에 공지되어 있다. 부위 특이적 돌연변이유발을 위한 방법은 문헌 [Gustin et al., Biotechniques 14:22, 1993; Barany, Gene 37:111-23, 1985]; [Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. 199:537-9, 1985]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 15.3-15.108]에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 모두 본원에 참조로 원용된다. 요약하면, 본 발명은 대상 및 그의 변이체 또는 돌연변이에서 세포질 DNA 감시 분자를 활성화시킬 수 있는 핵산 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 기술된 핵산 서열에 의해 코딩된 중간 RNA 및 코딩된 임의의 결과 아미노산 서열을 포함한다.Mutant nucleotides of the DNA molecules described herein may be used provided that the mutation includes a nucleic acid sequence that retains the ability to increase fertility in cows as described herein. The DNA sequences of such mutants will usually differ by one or more nucleotides or amino acids. Sequence changes can be substitutions, insertions, deletions or combinations thereof. Techniques for mutagenesis of cloned genes are known in the art. Methods for site-directed mutagenesis are described in Gustin et al., Biotechniques 14:22, 1993; Barany, Gene 37:111-23, 1985]; [Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. 199:537-9, 1985]; and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 15.3-15.108], all of which are incorporated herein by reference. In summary, the present invention relates to nucleic acid sequences capable of activating cytoplasmic DNA surveillance molecules in a subject and variants or mutations thereof. The present invention also includes intermediate RNAs encoded by the described nucleic acid sequences and any resulting amino acid sequences encoded.

일부 측면에서, 면역자극 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1 및 2에 제공된 서열과 상이한 경우, 플라스미드 내의 CpG 디뉴클레오티드는 바람직하게는 손상되지 않은 채로 남는다. 대안적으로, 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 CpG 디뉴클레오티드가 제거되도록 변경되는 경우, 플라스미드의 서열은 플라스미드 내 CpG 디뉴클레오티드의 총 수가 동일하게 유지되도록 다른 위치에서 변경될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 pGCMB75.6에 이미 존재하는 것 외에 추가의 CpG 디뉴클레오티드도 플라스미드에 도입될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 면역자극 플라스미드는 바람직하게는 적어도 약 200, 적어도 약 220, 적어도 약 240, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 275, 적어도 약 280, 적어도 약 283, 적어도 약 285, 또는 적어도 약 288개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 면역자극 플라스미드는 283개의 CpG 디뉴클레오티드를 포함할 수 있다.In some aspects, where the nucleotide sequence of the immunostimulatory plasmid differs from the sequences provided in SEQ ID NOs: 1 and 2, the CpG dinucleotides within the plasmid are preferably left intact. Alternatively, if the nucleotide sequence of the plasmid is altered to remove CpG dinucleotides, the sequence of the plasmid can be altered at other locations such that the total number of CpG dinucleotides in the plasmid remains the same. Additional CpG dinucleotides other than those already present in the nucleotide sequence pGCMB75.6 may also be introduced into the plasmid. Thus, for example, an immunostimulatory plasmid described herein preferably contains at least about 200, at least about 220, at least about 240, at least about 260, at least about 270, at least about 275, at least about 280, at least about 283, at least about 285, or at least about 288 CpG dinucleotides. For example, an immunostimulatory plasmid may contain 283 CpG dinucleotides.

면역자극 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 본원에 제공된 서열과 상이한 일부 측면에서, 플라스미드 내의 CpG 모티프 유형은 세포질 DNA 감시 분자의 생성된 활성화를 조절하도록 변화된다. 예를 들어, 면역자극 CpG 모티프의 수는 면역자극 플라스미드/DNA의 특정 임계값에 반응하는 특정 세포질 DNA 감시 분자의 활성화를 증가시키도록 증가될 수 있다. 추가 예로서, 비면역자극성 CpG 모티프의 수는 특정 세포질 DNA 감시 분자의 활성화를 감소시키고/거나, 다른 DNA 감시 분자의 활성화를 증가시키도록 증가될 수 있다.In some aspects where the nucleotide sequence of the immunostimulatory plasmid differs from the sequences provided herein, the type of CpG motif within the plasmid is altered to control the resulting activation of cytoplasmic DNA surveillance molecules. For example, the number of immunostimulatory CpG motifs can be increased to increase activation of specific cytoplasmic DNA surveillance molecules in response to a specific threshold of immunostimulatory plasmid/DNA. As a further example, the number of non-immunostimulatory CpG motifs can be increased to decrease activation of certain cytoplasmic DNA monitoring molecules and/or increase activation of other DNA monitoring molecules.

특히, 본 발명은 본원에 기재된 면역자극 플라스미드 또는 DNA 서열 중 임의의 것 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제제에 관한 것이다.In particular, the present invention relates to pharmaceutical formulations comprising any of the immunostimulatory plasmids or DNA sequences described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

B. 면역조절제B. Immunomodulators

본원에 기재된 면역자극 플라스미드와 함께 사용하기에 적합한 면역조절 조성물은 미국 특허 출원 공개 제2000/0064151 A1호 및 제2013/0295167 A1호에 기재되어 있으며, 이들 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다.Immunomodulatory compositions suitable for use with the immunostimulatory plasmids described herein are described in US Patent Application Publication Nos. 2000/0064151 A1 and 2013/0295167 A1, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

면역조절 조성물은 리포좀 전달 비히클 및 본원에 기재된 면역자극 플라스미드 또는 DNA 서열 중 적어도 하나를 포함한다.The immunomodulatory composition comprises a liposomal delivery vehicle and at least one of the immunostimulatory plasmids or DNA sequences described herein.

적합한 리포좀 전달 비히클은 핵산 분자를 치료 대상의 조직으로 전달할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 리포좀 전달 비히클은 바람직하게는 핵산 분자 및/또는 생물학적 제제를 전달하기에 충분한 시간동안 대상에서 안정하게 유지될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 전달 비히클은 수용 대상에서 적어도 약 5분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 24시간 동안 안정하다.Suitable liposomal delivery vehicles include lipid compositions capable of delivering nucleic acid molecules to the tissue of a subject to be treated. A liposomal delivery vehicle can preferably remain stable in a subject for a period of time sufficient to deliver the nucleic acid molecule and/or biological agent. For example, a liposomal delivery vehicle is stable in a recipient subject for at least about 5 minutes, at least about 1 hour, and at least about 24 hours.

본 발명의 리포좀 전달 비히클은 세포로의 핵산 분자 전달을 용이하게 할 수 있는 지질 조성물을 포함한다. 핵산 분자가 하나 이상의 단백질을 코딩하는 경우, 핵산:리포좀 복합체는 바람직하게는 형질감염 효율이 전달되는 핵산 마이크로그램 (㎍) 당 전체 조직 단백질 밀리그램 (mg) 당 발현되는 단백질 적어도 약 1 피코그램 (pg)이다. 예를 들어, 핵산:리포좀 복합체의 형질감염 효율은 전달되는 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현되는 단백질 적어도 약 10 pg; 또는 전달되는 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현되는 단백질 적어도 약 50 pg이다. 복합체의 형질감염 효율은 전달되는 핵산 ㎍ 당 전체 조직 단백질 mg 당 발현되는 단백질 1 펨토그램 (fg) 정도로 낮을 수 있으며, 이 양이 보다 바람직하다.Liposomal delivery vehicles of the present invention include lipid compositions capable of facilitating delivery of nucleic acid molecules to cells. When the nucleic acid molecule encodes more than one protein, the nucleic acid:liposome complex preferably has a transfection efficiency of at least about 1 picogram (pg) of protein expressed per milligram (mg) of total tissue protein per microgram (μg) of nucleic acid delivered. )to be. For example, the transfection efficiency of a nucleic acid:liposome complex may be at least about 10 pg of protein expressed per mg of total tissue protein per μg of nucleic acid delivered; or at least about 50 pg of protein expressed per mg of total tissue protein per μg of nucleic acid delivered. The transfection efficiency of the complex can be as low as 1 femtogram (fg) of protein expressed per mg of total tissue protein per μg of nucleic acid delivered, with this amount being more preferred.

본 발명의 바람직한 리포좀 전달 비히클은 직경이 약 100 내지 500 나노미터 (nm)이다. 예를 들어, 리포좀 전달 비히클은 직경이 약 150 내지 450 nm, 또는 약 200 내지 400 nm일 수 있다.Preferred liposomal delivery vehicles of the present invention are about 100 to 500 nanometers (nm) in diameter. For example, a liposomal delivery vehicle can be about 150 to 450 nm in diameter, or about 200 to 400 nm in diameter.

적합한 리포좀은 예를 들어, 당업자에게 공지되어 있는 유전자 전달법에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 임의의 리포좀을 포함한다. 바람직한 리포좀 전달 비히클은 멀티라멜라 소포 (multilamellar vesicle: MLV) 지질 및 압출 지질을 포함한다. MLV의 제조 방법은 당업자가 숙지하고 있다. 더욱 바람직한 리포좀 전달 비히클은 폴리양이온성 지질 조성을 갖는 리포좀 (즉, 양이온성 리포좀) 및/또는 폴리에틸렌 글리콜에 공액된 콜레스테롤 주쇄를 갖는 리포좀을 포함한다. 양이온성 리포좀 조성물의 예로는, 비제한적으로, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 콜레스테롤, N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP) 및 콜레스테롤, 1-[2-(올레일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)-이미다졸리늄클로라이드 (DOTIM) 및 콜레스테롤, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB) 및 콜레스테롤, 및 이들의 조합물이 있다. 전달 비히클로서 사용하기에 가장 바람직한 리포좀 조성물은 DOTIM 및 콜레스테롤을 포함한다.Suitable liposomes include, for example, any liposomes conventionally used in gene transfer methods known to those skilled in the art. Preferred liposomal delivery vehicles include multilamellar vesicle (MLV) lipids and extruded lipids. Methods for preparing MLV are well known to those skilled in the art. More preferred liposome delivery vehicles include liposomes with a polycationic lipid composition (ie, cationic liposomes) and/or liposomes with a cholesterol backbone conjugated to polyethylene glycol. Examples of cationic liposomal compositions include, but are not limited to, N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and cholesterol, N-[1-( 2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTAP) and cholesterol, 1-[2-(oleyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydride oxyethyl)-imidazolinium chloride (DOTIM) and cholesterol, dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB) and cholesterol, and combinations thereof. Most preferred liposomal compositions for use as delivery vehicles include DOTIM and cholesterol.

적합한 핵산 분자는 본원에 기재된 임의의 면역조절 플라스미드를 포함한다. 코딩 핵산 서열은 단백질 또는 펩티드의 적어도 일부를 코딩하는 반면, 비-코딩 서열은 단백질 또는 펩티드의 어떠한 일부도 코딩하지 않는다. 본 발명에 따라서, "비-코딩" 핵산은 프로모터 영역과 같이, 전사 유니트의 조절 영역을 포함할 수 있다. 용어 "빈 벡터 (empty vector)"는 용어 "비-코딩"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 특히 유전자 삽입이 없는 플라스미드 벡터와 같은, 단백질 코딩 영역 부재하의 핵산 서열을 언급한다. 본원에 기재된 플라스미드에 의해 코딩된 단백질의 발현은 세포질 DNA 감시 분자 활성화를 필요로 하지 않으며; 따라서, 플라스미드는 전사 조절 서열에 작동적으로 연결된 어떤 코딩 서열도 함유하지 않는다. 그러나, 면역원 및/또는 사이토킨을 코딩하는 핵산 서열 (DNA 또는 RNA)을 조성물에 포함시킴으로써 추가적인 장점을 얻을 수 있다 (즉, 항원-특이적 및 면역성 증가). 면역원 및/또는 사이토킨을 코딩하는 이러한 핵산 서열은 본원에 기재된 면역자극 플라스미드에 포함될 수 있거나, 또는 조성물 내 별도의 핵산 (예: 별도의 플라스미드)에 포함될 수 있다.Suitable nucleic acid molecules include any of the immunomodulatory plasmids described herein. Coding nucleic acid sequences encode at least a portion of a protein or peptide, whereas non-coding sequences do not encode any portion of a protein or peptide. According to the present invention, a "non-coding" nucleic acid may include a regulatory region of a transcription unit, such as a promoter region. The term "empty vector" may be used interchangeably with the term "non-coding" and refers to a nucleic acid sequence in the absence of a protein coding region, such as a plasmid vector, particularly without genetic insertions. Expression of proteins encoded by the plasmids described herein does not require activation of cytoplasmic DNA surveillance molecules; Thus, the plasmid does not contain any coding sequences operably linked to transcriptional regulatory sequences. However, additional advantages may be obtained by including nucleic acid sequences (DNA or RNA) encoding immunogens and/or cytokines in the composition (ie, antigen-specific and increased immunity). Such nucleic acid sequences encoding immunogens and/or cytokines may be included in an immunostimulatory plasmid described herein, or may be included in a separate nucleic acid (eg, separate plasmid) within the composition.

리포좀을 본원에 기재된 면역자극 플라스미드와 복합체화하는 것은 당 업계에서의 표준 방법을 사용하거나 전체가 본원에 참고로 원용되는 미국 특허 제6,693,086호에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 리포좀에 첨가하기에 적합한 플라스미드의 농도는 전신적인 면역 반응이 일어나도록 하기에 충분한 양의 플라스미드를 대상으로 전달하도록 하기에 효과적인 농도이다. 예를 들어, 약 0.1 ㎍ 내지 약 10 ㎍의 플라스미드가 약 8 nmol의 리포좀과 조합될 수 있거나, 약 0.5 ㎍ 내지 약 5 ㎍의 플라스미드가 약 8 nmol의 리포좀과 조합될 수 있거나, 또는 예를 들어, 약 1.0 ㎍의 핵산 분자가 약 8 nmol의 리포좀과 조합될 수 있다. 조성물 중 플라스미드 대 지질의 비 (㎍ 플라스미드:nmol 지질)는 적어도 약 1:1 플라스미드:지질 중량비 (예컨대, 1 ㎍ 핵산:1 nmol 지질)이다. 예를 들어, 플라스미드:지질의 비는 적어도 약 1:5, 적어도 약 1:10, 또는 적어도 약 1:20일 수 있다. 여기서 표현된 비는 조성물 중 양이온성 지질의 양을 기준으로 한 것이며, 조성물 중 지질의 총량을 기준으로 한 것이 아니다. 본 발명의 조성물 중 플라스미드 대 지질의 비는 적합하게는 약 1:1 내지 약 1:80 핵산:지질 중량비; 약 1:2 내지 약 1:40 플라스미드:지질 중량비; 약 1:3 내지 약 1:30 플라스미드:지질 중량비; 또는 약 1:6 내지 약 1:15 플라스미드:지질 중량비이다.Complexing the liposomes with the immunostimulatory plasmids described herein can be performed using standard methods in the art or as described in US Pat. No. 6,693,086, which is incorporated herein by reference in its entirety. A suitable concentration of plasmid for addition to the liposome is a concentration effective to deliver to the subject an amount of plasmid sufficient to elicit a systemic immune response. For example, about 0.1 μg to about 10 μg of plasmid can be combined with about 8 nmol of liposomes, or about 0.5 μg to about 5 μg of plasmid can be combined with about 8 nmol of liposomes, or, for example, , about 1.0 μg of nucleic acid molecules can be combined with about 8 nmol of liposomes. The ratio of plasmid to lipid (μg plasmid:nmol lipid) in the composition is at least about 1:1 plasmid:lipid weight ratio (eg, 1 μg nucleic acid:1 nmol lipid). For example, the plasmid:lipid ratio can be at least about 1:5, at least about 1:10, or at least about 1:20. Ratios expressed herein are based on the amount of cationic lipid in the composition and not on the total amount of lipid in the composition. The ratio of plasmid to lipid in the composition of the present invention is suitably from about 1:1 to about 1:80 nucleic acid:lipid weight ratio; a plasmid:lipid weight ratio of about 1:2 to about 1:40; a plasmid:lipid weight ratio of about 1:3 to about 1:30; or about 1:6 to about 1:15 plasmid:lipid weight ratio.

C. 생물학적 제제C. Biologics

본원에 기재된 임의의 면역조절 조성물은 본원에 기재된 적어도 하나의 플라스미드 및 리포좀 전달 비히클 외에 적어도 하나의 생물학적 제제를 추가로 포함할 수 있다.Any immunomodulatory composition described herein may further comprise at least one biological agent in addition to at least one plasmid and liposome delivery vehicle described herein.

적합한 생물학적 제제는 질병을 예방하거나 치료하는데 효과적인 제제이다. 이러한 생물학적 제제는 면역 증강 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이들의 임의 조합물을 포함한다. 적합한 면역 증강 단백질은 면역을 증강시키는 것으로 알려진 단백질이다. 비제한적인 예로서, 단백질 패밀리를 포함하는 사이토킨이 공지된 면역 증강 단백질 패밀리이다. 적합한 면역원은 대상으로의 면역원 투여가 대상 조직 내에서 마주치는 동일하거나 유사한 단백질에 대한 면역원 특이적 면역 반응을 일으키도록 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는 단백질이다. 면역원은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 곰팡이에 의해 발현되는 병원성 항원을 포함할 수 있다. 바람직한 항원은 대상에서 감염성 질환을 유발하는 유기체로부터 유래된 항원을 포함한다. 본 발명에 따라, 면역원은 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는 자연 발생 또는 합성 유도된 단백질의 임의의 부분일 수 있다. 이와 같이, 항원 또는 면역원의 크기는 약 5-12 아미노산만큼 작을 수 있으며, 그 사이의 임의의 크기를 포함하여 전장 단백질만큼 클 수 있다. 항원은 멀티머 단백질 또는 융합 단백질일 수 있다. 항원은 정제된 항원일 수 있다. 대안적으로, 면역 증강 단백질 또는 면역원은 면역자극 플라스미드에 의해 또는 면역조절 조성물에 포함된 또 다른 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 면역 증강 단백질 또는 면역원이 면역조절 조성물 중의 핵산 분자에 의해 코딩되는 경우, 면역 증강 단백질 또는 면역원을 코딩하는 핵산 서열은 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 면역원이 비특이적 면역 반응 이외에, 대상에서 면역원 특이적 면역 반응을 유도하도록 대상 저직에서 발현될 수 있다. 병원체 항원 면역원성 또는 사이토킨 활성과 같은 면역원성을 스크리닝하기 위한 기술은 당업자에게 공지되었으며 다양한 시험관 내 및 생체 내 분석을 포함한다.A suitable biologic agent is one that is effective in preventing or treating a disease. Such biologics include immune enhancing proteins, immunogens, vaccines, antimicrobial agents, or any combination thereof. Suitable immune enhancing proteins are proteins known to enhance immunity. By way of non-limiting example, cytokines comprising a family of proteins are known immune enhancing protein families. A suitable immunogen is a protein that induces a humoral and/or cellular immune response such that administration of the immunogen to a subject elicits an immunogen-specific immune response against the same or similar protein encountered in the tissue of the subject. Immunogens may include pathogenic antigens expressed by bacteria, viruses, parasites or fungi. Preferred antigens include antigens derived from organisms that cause infectious disease in a subject. According to the present invention, an immunogen may be any portion of a naturally occurring or synthetically derived protein that induces a humoral and/or cellular immune response. As such, the size of an antigen or immunogen can be as small as about 5-12 amino acids and as large as a full-length protein, including any size in between. Antigens can be multimeric proteins or fusion proteins. The antigen may be a purified antigen. Alternatively, the immune enhancing protein or immunogen may be encoded by an immunostimulatory plasmid or by another nucleic acid included in an immunomodulatory composition. When the immune enhancing protein or immunogen is encoded by a nucleic acid molecule in the immunomodulatory composition, the nucleic acid sequence encoding the immune enhancing protein or immunogen is operably linked to a transcriptional regulatory sequence so that the immunogen induces an immunogen-specific in a subject in addition to a non-specific immune response. It can be expressed in the target tissue to induce an immune response. Techniques for screening for immunogenicity, such as pathogen antigen immunogenicity or cytokine activity, are known to those skilled in the art and include a variety of in vitro and in vivo assays.

생물학적 제제가 백신인 경우, 백신은 생, 감염성, 바이러스성, 박테리아성 또는 기생성 백신을 포함하거나, 또는 사멸, 비활성, 바이러스성, 박테리아성 또는 기생성 백신을 포함할 수 있다. 하나 이상의 백신, 생 또는 사멸 바이러스성 백신이 본 발명의 면역조절 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 백신은 조류 또는 소 종에 대한 당 업계에 공지된 백신을 포함한다.Where the biologic is a vaccine, the vaccine may include a live, infectious, viral, bacterial or parasitic vaccine, or may include a killed, inactivated, viral, bacterial or parasitic vaccine. One or more vaccines, live or killed viral vaccines, may be used in combination with the immunomodulatory composition of the present invention. Suitable vaccines include vaccines known in the art for avian or bovine species.

생물학적 제제는 항균제일 수 있다. 적합한 항균제는 퀴놀론, 바람직하게는 플루오로퀴놀론, β-락탐 및 매크롤라이드-린코사미드스트렙토그라민 (MLS) 항생제를 포함한다.A biologic agent may be an antimicrobial agent. Suitable antimicrobial agents include quinolones, preferably fluoroquinolones, β-lactams and macrolide-lincosamide streptogramin (MLS) antibiotics.

적절한 퀴놀론으로는 베노플록사신, 빈플록사신, 시녹사신, 시프로플록사신, 클리나플록사신, 다노플록사신, 디플록사신, 에녹사신, 엔로플록사신, 플레록사신, 게미플록사신, 이바플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 마르보플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 오르비플록사신, 파주플록사신, 프라도플록사신, 퍼플록사신, 사라플록사신, 스파플록사신, 테마플록사신 및 토수플록사신을 들 수 있다. 바람직한 플루오로퀴놀린은 시프로플록사신, 다노플록사신, 엔로플로사신, 목시플록사신 및 프라도플록사신을 포함한다. 적합한 나프티리돈은 날리딕스산을 포함한다. 적합한 β-락탐으로는 페니실린 (예: 아목시실린, 암피실린, 아즐로실린, 벤자틴 페니실린, 벤질페니실린, 카르베니실린, 클록사실린, 코-아목시클라브 [즉, 아목시실린/클라불란산], 디클록사신, 플루클록사신, 메티실린, 메즐로실린, 나프실린, 옥사실린, 페녹시메틸페니실린, 피페라실린, 프로카인 페니실린, 테모실린 및 티카실린); 세팔로스포린 (예: 세파클로르, 세팔로늄, 세파만돌, 세파프리린, 세파졸린, 세페핌, 세픽심, 세포탁심, 세폭시틴, 세프피롬, 세프포독심, 세프퀴놈, 세프타지딤, 세프티오푸르, 세프트리악손, 세푸록심, 세팔렉신, 세팔로틴 및 데포테탄); 카바페넴 및 페넴 (예: 도리페넴, 에르타페넴, 파로페넴, 이미페넴 및 메로페넴); 모노박탐 (예: 아즈트레오남, 노카디신 A, 탑톡시닌-β-락탐 및 티게모남); 및 β-락타마제 억제제 (예: 클라불란산, 술박탐 및 타조박탐)를 들 수 있다. 바람직한 β-락탐은 세팔로스포린, 특히 세파졸린을 포함한다.Suitable quinolones include benofloxacin, benfloxacin, cinoxacin, ciprofloxacin, clinafloxacin, danofloxacin, diploxacin, enoxacin, enrofloxacin, fleoxacin, gemifloxacin, ivafloxacin, Levofloxacin, Romefloxacin, Marbofloxacin, Moxifloxacin, Norfloxacin, Ofloxacin, Orbifloxacin, Pajufloxacin, Pradofloxacin, Purfloxacin, Sarafloxacin, Spaphloxacin, Themefloxacin and tosufloxacin. Preferred fluoroquinolines include ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, moxifloxacin and pradofloxacin. Suitable naphthyridones include nalidixic acid. Suitable β-lactams include penicillins (e.g. amoxicillin, ampicillin, azlocillin, benzathine penicillin, benzylpenicillin, carbenicillin, cloxacillin, co-amoxyclave [i.e. amoxicillin/clavulanic acid], diclox reaper, flucloxacin, methicillin, mezlocillin, nafcillin, oxacillin, phenoxymethylpenicillin, piperacillin, procaine penicillin, temocillin and ticarcillin); Cephalosporins (e.g. cefaclor, cephalonium, cefamandole, cefaprine, cefazolin, cefepime, cefixim, cefotaxime, cefoxitin, cefpyrome, cefpodoxime, cefquinome, ceftazidime, ceftiopur, ceftriaxone, cefuroxime, cephalexin, cephalothin and depotetane); carbapenems and penems (eg doripenem, ertapenem, faropenem, imipenem and meropenem); monobactams (eg, aztreonam, nocardicin A, toptoxinin-β-lactam and tigemonam); and β-lactamase inhibitors such as clavulanic acid, sulbactam and tazobactam. Preferred β-lactams include cephalosporins, particularly cefazolin.

적합한 MLS 항생제는 클린다마이신, 린코마이신, 피를리마이신 및 임의의 마크롤라이드 항생제를 포함한다. 바람직한 린코사미드 항생제는 피를리마이신이다.Suitable MLS antibiotics include clindamycin, lincomycin, pirlimycin and any macrolide antibiotic. A preferred lincosamide antibiotic is pirlimycin.

다른 항균제로는 아미노글리코시드, 클로피돌, 디메트리다졸, 에리트로마이신, 프라마이세틴, 푸라졸리돈, 할로푸기논, 2-피리돈, 로베니딘, 설폰아미드, 테트라사이클린, 트리메토프림, 다양한 플레우로무틸린 (예: 티아물린 및 발네물린), 및 다양한 스트렙토마이신 (예: 모넨신, 나라신 및 살리노마이신)이 있다.Other antimicrobial agents include aminoglycosides, clopidol, dimetidazole, erythromycin, framycetin, furazolidone, halofuginone, 2-pyridone, lovenidine, sulfonamides, tetracycline, trimethoprim, various pleuromutilins (eg thiamulin and balnemulin), and various streptomycins (eg monensin, naracin and salinomycin).

II. 방법II. Way

A. 면역자극법A. Immunostimulation method

본 발명의 일 구체예로, 암소 종의 일원에게 유효량의 면역조절 조성물을 투여함으로써 상기 암소 종의 일원에서 면역 반응을 유도한다. 상기 유효량은 암소 종의 일원에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양이다. 면역조절제는 리포좀 전달 비히클 및 핵산 분자를 포함한다.In one embodiment of the invention, an immune response is induced in a member of the cow species by administering to the member of the cow species an effective amount of an immunomodulatory composition. The effective amount is an amount sufficient to induce an immune response in a member of the cow species. Immunomodulatory agents include liposomal delivery vehicles and nucleic acid molecules.

일 구체예로, 면역조절제의 유효량은 동물당 약 1 마이크로그램 내지 약 1000 마이크로그램이다. 다른 구체예로, 면역조절제의 유효량은 동물당 약 5 마이크로그램 내지 약 500 마이크로그램이다. 또 다른 구체예로, 면역조절제의 유효량은 동물당 약 10 마이크로그램 내지 약 100 마이크로그램이다. 추가의 구체예에서, 면역조절제의 유효량은 동물당 약 10 마이크로그램 내지 약 50 마이크로그램이다.In one embodiment, an effective amount of an immunomodulatory agent is from about 1 microgram to about 1000 micrograms per animal. In another embodiment, an effective amount of an immunomodulatory agent is from about 5 micrograms to about 500 micrograms per animal. In another embodiment, an effective amount of an immunomodulatory agent is from about 10 micrograms to about 100 micrograms per animal. In a further embodiment, the effective amount of the immunomodulatory agent is from about 10 micrograms to about 50 micrograms per animal.

본 발명의 다른 구체예로, 리포좀 전달 비히클, 단리된 핵산 분산, 및 생물학적 제제를 포함하는, 유효량의 면역조절제를 투여함으로써 암소 종의 일원에서 면역 반응을 유도한다. 생물학적 제제는 면역조절제와 혼합되거나 이와 함께 또는 독립적으로 투여될 수 있음이 고려된다. 독립 투여는 면역조절제의 투여 전 또는 후일 수 있다. 또한, 면역조절제 또는 생물학적 제제를 복수 회 투여하여 증가된 면역성을 연장시킬 수 있음도 고려된다. 또한, 복수 생물학적 제제를 면역조절제와 함께 투여하거나, 면역조절제의 투여 전에 투여하거나, 면역조절제의 투여 후에 투여하거나, 또는 이와 동시에 투여할 수 있다.In another embodiment of the invention, an immune response is induced in a member of a cow species by administering an effective amount of an immunomodulatory agent, including a liposomal delivery vehicle, an isolated nucleic acid dispersion, and a biological agent. It is contemplated that the biologic agent may be administered in admixture with, together with, or independently of the immunomodulatory agent. Independent administration can be before or after administration of the immunomodulatory agent. It is also contemplated that increased immunity may be prolonged by multiple administrations of an immunomodulatory agent or biological agent. In addition, multiple biological agents can be administered together with an immunomodulatory agent, administered before administration of an immunomodulatory agent, administered after administration of an immunomodulatory agent, or concurrently.

B. 수태율B. Conception rate

본 발명의 방법은 암소의 수태율을 상승시키는데 유용하다. 바람직한 구체예에서, 암소의 수태율은 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다. 일부 바람직한 구체예에서, 암소의 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조군의 수태율에 비해 증가한다.The method of the present invention is useful for increasing fertility in cows. In a preferred embodiment, the fertility rate of cows is increased relative to that of a control population. In some preferred embodiments, the fertility rate of cows is increased relative to that of controls, as determined by a p-value of 0.05 or less.

본 발명의 방법은 암소에서 첫 서비스 수태율을 증가시키는데 유용하다. 본원에서 사용된 첫 서비스 수태율이란 첫 수정으로 수태되는 인공 수정을 받은 암소 비율을 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 암소의 첫 서비스 수태율은 대조 집단의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다. 일부 바람직한 구체예에서, 암소의 첫 서비스 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단에서의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.The method of the present invention is useful for increasing first service conception rates in cows. First service conception rate as used herein refers to the percentage of artificially inseminated cows that are conceived by first insemination. In a preferred embodiment, the first service conception rate of cows is increased relative to the first service conception rate of a control population. In some preferred embodiments, the cow's first service conception rate is increased relative to the first service conception rate in a control population, as determined by a p-value of 0.05 or less.

본 발명의 방법은 비-사이클링 암소에서 수태율을 상승시키는데 유용하다. 본원에서 "비-사이클링 (non-cycling)"이란 번식 계획 시작 약 30일 전에 꼬리 페인트 제거 또는 관찰에 의해 암소에서 발정기가 검출되지 않음을 가리킨다. 바람직한 구체예에서, 비-사이클링 암소의 수태율은 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다. 일부 바람직한 구체예에서, 비-사이클링 암소의 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단의 수태율에 비해 증가한다.The method of the present invention is useful for increasing conception rates in non-cycling cows. As used herein, “non-cycling” refers to no estrus being detected in a cow by observation or removal of tail paint approximately 30 days prior to the start of the breeding programme. In a preferred embodiment, the fertility rate of non-cycling cows is increased relative to that of a control population. In some preferred embodiments, the fertility rate of non-cycling cows is increased relative to that of a control population, as determined by a p-value of 0.05 or less.

본 발명의 방법은 비-사이클링 암소에서 첫 서비스 수태율을 상승시키는데 유용하다. 바람직한 구체예에서, 비-사이클링 암소의 첫 서비스 수태율은 대조군의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다. 일부 바람직한 구체예에서, 비-사이클링 암소에서의 첫 서비스 수태율은 p-값이 0.05 이하로 측정된 바와 같이 대조 집단에서의 첫 서비스 수태율에 비해 증가한다.The method of the present invention is useful for increasing first service conception rates in non-cycling cows. In a preferred embodiment, the first service conception rate of non-cycling cows is increased compared to the first service conception rate of a control group. In some preferred embodiments, the first service conception rate in non-cycling cows is increased compared to the first service conception rate in a control population, as determined by a p-value of 0.05 or less.

C. 투여C. Administration

다양한 투여 경로가 이용가능하다. 물론, 선택되는 특정 방식은 선택된 특정 생물학적 제제, 대상 연령 및 일반적인 건강 상태, 치료할 특정 질환 및 치료 효능에 요구되는 투여량에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 방법은 임상적으로 허용될 수 없는 부작용을 일으키지 않고 효과적인 수준의 면역 반응을 산출하는 임의의 투여 방식을 사용하여 실시될 수 있다. 조성물은 단위 투여형으로 편리하게 제공될 수 있으며 당업자에 숙지되어 있는 임의의 방법으로 제조될 수 있다.A variety of routes of administration are available. Of course, the particular mode selected will depend on the particular biologic selected, the age and general state of health of the subject, the particular disease being treated, and the dosage required for therapeutic efficacy. The methods of the present invention can be practiced using any mode of administration that produces an effective level of immune response without causing clinically unacceptable side effects. The compositions may conveniently be presented in unit dosage form and may be prepared by any method known to those skilled in the art.

소 종 동물의 예방접종은 어느 연령대에서나 수행될 수 있다. 백신은 정맥 내로, 근육 내로, 피 내로, 복강 내로, 피하로, 스프레이/에어로졸에 의해, 경구적으로, 안 내로, 기관 내로, 비강 내로, 또는 당 업계에 공지된 다른 방법에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법이 일상적인 예방접종 스케줄에 기초해 사용될 수 있음도 고려된다. 본 발명의 면역조절제는 또한 정맥 내로, 근육 내로, 피하로, 스프레이에 의해, 경구적으로, 안 내로, 기관 내로, 비강 내로, 또는 당 업계에 공지된 다른 방법에 의해 투여될 수도 있다. 일 구체예에서, 면역조절제는 피하로 투여된다. 다른 구체예에서, 면역조절제는 근육 내로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 스프레이로 투여된다. 추가의 구체예에서, 면역조절제는 경구적으로 투여된다.Vaccination of small breed animals can be performed at any age. The vaccine may be administered intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, subcutaneously, by spray/aerosol, orally, intraocularly, intratracheally, intranasally, or by other methods known in the art. . It is also contemplated that the method of the present invention may be used based on a routine immunization schedule. The immunomodulatory agents of the present invention may also be administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously, by spray, orally, intraocularly, intratracheally, intranasally, or by other methods known in the art. In one embodiment, the immunomodulatory agent is administered subcutaneously. In another embodiment, the immunomodulatory agent is administered intramuscularly. In another embodiment, the immunomodulatory agent is administered as a spray. In a further embodiment, the immunomodulatory agent is administered orally.

일 구체예에서, 면역조절제는 분만 전에 자체로 동물에 투여된다. 다른 구체예에서, 면역조절제는 분만 후에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 분만과 동시에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 분만 전뿐만 아니라 분만과 동시에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 분만 전 예방접종과 동시에 공동 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 분만과 동시에 예방접종과 동시에 공동 투여된다. 공동-투여 (co-administration)는 백신과 면역조절제를 동물의 동일한 일반적인 위치에서 서로 옆 두 상이한 부위에 (즉, 동물의 목에서 서로 옆에 주사), 동일한 일반적인 위치에서 동물의 반대 측 (즉, 목의 각 측에 1회씩), 또는 동일한 동물의 상이한 위치에 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 예방접종 및 분만 전에 투여된다. 추가의 구체예에서, 면역조절 조성물은 예방접종 후, 분만 전에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 분만 전에 이미 예방접종시킨 동물에게 분만 후에 투여된다. 당업자라면 투여 경로가 대상 및 대상의 건강 또는 상태에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다.In one embodiment, the immunomodulatory agent is administered to the animal per se prior to parturition. In another embodiment, the immunomodulatory agent is administered to the animal per se after parturition. In another embodiment, the immunomodulatory agent is administered to the animal by itself at the time of parturition. In another embodiment, the immunomodulatory agent is administered to the animal by itself prior to calving as well as simultaneously with calving. In another embodiment, the immunomodulatory composition is co-administered concurrently with prepartum vaccination. In another embodiment, the immunomodulatory composition is co-administered with the vaccination at the same time as the delivery. Co-administration is when the vaccine and immunomodulatory agent are injected at two different sites next to each other in the same general location on the animal (i.e., injected next to each other in the animal's neck), and on opposite sides of the animal at the same general location (i.e., once on each side of the neck), or to different locations on the same animal. In another embodiment, the immunomodulatory composition is administered prior to vaccination and parturition. In a further embodiment, the immunomodulatory composition is administered after vaccination but prior to parturition. In another embodiment, the immunomodulatory composition is administered after calving to an animal that has already been vaccinated prior to calving. Those skilled in the art will recognize that the route of administration may vary depending on the subject and the subject's health or condition.

일 구체예에서, 면역조절제는 번식 전에 자체로 동물에 투여된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 면역조절제는 번식 후에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 번식과 동시에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 번식 전뿐만 아니라 번식과 동시에 자체로 동물에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 번식 전 예방접종과 동시에 공동 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 번식과 동시에 예방접종과 동시에 공동 투여된다. 공동-투여는 백신과 면역조절제를 동물의 동일한 일반적인 위치에서 서로 옆 두 상이한 부위에 (즉, 동물의 목에서 서로 옆에 주사), 동일한 일반적인 위치에서 동물의 반대 측 (즉, 목의 각 측에 1회씩), 또는 동일한 동물의 상이한 위치에 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 예방접종 및 번식 전에 투여된다. 추가의 구체예에서, 면역조절 조성물은 예방접종 후, 번식 전에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절 조성물은 번식 전에 이미 예방접종시킨 동물에게 번식 후에 투여된다. 당업자라면 투여 경로가 대상 및 대상의 건강 또는 상태에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다.In one embodiment, the immunomodulatory agent is administered to the animal itself prior to breeding. In another embodiment, the immunomodulatory agent of the invention is administered to the animal itself after breeding. In another embodiment, the immunomodulatory agent is administered to the animal by itself concurrently with breeding. In another embodiment, the immunomodulatory agent is administered to the animal itself prior to breeding as well as simultaneously with breeding. In another embodiment, the immunomodulatory composition is co-administered concurrently with the pre-breeding vaccination. In another embodiment, the immunomodulatory composition is co-administered simultaneously with breeding and vaccination. Co-administration involves administering the vaccine and immunomodulatory agent to two different sites next to each other in the same general location on the animal (i.e. injections next to each other in the animal's neck) and to opposite sides of the animal in the same general location (i.e. on each side of the neck). one at a time), or to different locations on the same animal. In another embodiment, the immunomodulatory composition is administered prior to vaccination and breeding. In a further embodiment, the immunomodulatory composition is administered after vaccination but prior to breeding. In another embodiment, the immunomodulatory composition is administered after breeding to animals that have already been vaccinated prior to breeding. Those skilled in the art will recognize that the route of administration may vary depending on the subject and the subject's health or condition.

일 구체예에서, 면역조절제는 챌린지 약 1 내지 약 14일 전 또는 챌리지 약 1 내지 약 14일 후 투여한다. 다른 구체예에서, 면역조절제는 챌린지 약 1 내지 약 7일 전 또는 챌리지 약 1 내지 약 7일 후 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 챌린지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 전 또는 챌린지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 후 투여된다. 또 다른 구체예에서, 면역조절제는 챌린지 3일 전 또는 챌린지 3일 후 투여된다.In one embodiment, the immunomodulatory agent is administered about 1 to about 14 days before challenge or about 1 to about 14 days after challenge. In another embodiment, the immunomodulatory agent is administered from about 1 to about 7 days before challenge or about 1 to about 7 days after challenge. In another embodiment, the immunomodulatory agent is administered 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 days before challenge or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 days after challenge. In another embodiment, the immunomodulatory agent is administered 3 days before challenge or 3 days after challenge.

다른 전달 시스템은 시간-방출, 지연 방출 또는 서방출 전달 시스템을 포함할 수 있다. 그러한 시스템은 조성물의 반복 투여에 따른 불편의 증가를 피할 수 있다. 여러가지 타입의 방출 전달 시스템이 이용가능하며 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 폴리머 기반 시스템, 예컨대 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리하이드록시부티르산, 및 폴리무수물을 포함한다. 전술한 약제 함유 폴리머의 미세캡슐제가 예를 들어, 미국 특허 제5,075,109호에 기재되어 있다.Other delivery systems may include time-release, delayed-release or sustained-release delivery systems. Such a system can avoid increased discomfort with repeated administration of the composition. Several types of release delivery systems are available and known to those skilled in the art. These include polymer based systems such as poly(lactide-glycolide), copolyoxalates, polycaprolactones, polyesteramides, polyorthoesters, polyhydroxybutyric acids, and polyanhydrides. Microencapsulations of the aforementioned drug-containing polymers are described, for example, in U.S. Patent No. 5,075,109.

전달 시스템은 또한 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대 모노-, 디- 및 트리-글리세리드를 포함하는 지질인 비-폴리머 시스템; 하이드로겔 방출 시스템; 실래스틱 시스템 (sylastic system); 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅; 통상의 결합제와 부형제를 사용한 압축 정제; 부분적으로 융합된 이식물; 등을 포함한다. 특정 예로는, 비제한적으로, 본 발명의 약제가 미국 특허 제4,452,775호, 제4,675,189호 및 제5,736,152호에 기재된 바와 같이 매트릭스내의 형태로 함유되어 있는 침식형 시스템 (erosional systems), 및 활성 성분이 미국 특허 제3,854,480호, 제5,133,974호 및 제5,407,686호에 기재된 바와 같이 폴리머로부터 조절된 속도로 침투하는 확산형 시스템이 있다. 또한, 펌프-기반 하드웨어 전달 시스템이 사용될 수 있으며, 이들 중 일부는 이식용으로 채택된다.Delivery systems may also include non-polymeric systems that are lipids including sterols such as cholesterol, cholesterol esters and fatty acids or neutral fats such as mono-, di- and tri-glycerides; hydrogel release systems; silastic systems; peptide based systems; wax coating; Compressed tablets using conventional binders and excipients; partially fused implants; Include etc. Specific examples include, but are not limited to, erosional systems in which the agent of the present invention is contained in a matrix form as described in U.S. Pat. Nos. 4,452,775, 4,675,189, and 5,736,152, and active ingredients There are diffusion-type systems that permeate at a controlled rate from polymers as described in Patent Nos. 3,854,480, 5,133,974 and 5,407,686. Pump-based hardware delivery systems may also be used, some of which are adapted for implantation.

본 발명의 범주로부터 벗어나지 않고 조성물, 제품 및 방법을 다양하게 변화시킬 수 있기 때문에, 상기 설명 및 이후 제시되는 실시예에 포함되는 모든 것들은 설명으로서 이해되어야 하며 제한적 의미가 아님을 이해하여야 할 것이다.It is to be understood that as various changes can be made in the compositions, products and methods without departing from the scope of the present invention, everything included in the foregoing description and in the examples presented thereafter is to be understood as illustrative and not in a limiting sense.

정의Justice

용어 "유효량"은 목적하는 생물학적 효과를 실현시키기에 필수적이거나 충분한 양을 언급한다. 예를 들어, 감염성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 면역조절제의 유효량은 미생물에 노출시 면역 반응을 발달시켜, 대상내 미생물의 양을 감소, 바람직하게는 미생물을 근절시키는데 필요한 양이다. 특정 용도에 대한 유효량은 치료할 질병 또는 상태, 대상의 크기, 또는 상기 질병 또는 상태의 중증도와 같은 인자에 따라 변화될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험없이 면역조절제의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.The term "effective amount" refers to an amount necessary or sufficient to realize a desired biological effect. For example, an effective amount of an immunomodulatory agent for treating or preventing an infectious disease is that amount necessary to reduce, preferably eradicate, the amount of microorganisms in a subject by developing an immune response upon exposure to the microorganisms. An effective amount for a particular use may vary depending on factors such as the disease or condition being treated, the size of the subject, or the severity of the disease or condition. One skilled in the art can empirically determine an effective amount of an immunomodulatory agent without undue experimentation.

본원에 사용된 용어 "암소"는 암컷 소, 젖소 및 어린 암소를 제한 없이 포함하는 새끼를 가질 수 있는 소 종의 임의의 구성원을 지칭한다.As used herein, the term “cow” refers to any member of the bovine species that is capable of bearing offspring, including without limitation female cows, dairy cows and heifers.

용어 "사이토킨"은 면역 증강 단백질 패밀리를 지칭한다. 사이토킨 패밀리는 조혈 성장 인자, 인터류킨, 인터페론, 면역글로불린 상과 (superfamily) 분자, 종양괴사인자 패밀리 분자 및 케모킨 (즉, 세포, 특히 식세포의 이동 및 활성화를 조절하는 단백질)을 포함한다. 사이토킨의 예로는, 제한없이, 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-12 (IL-12), 인터류킨-15 (IL-15), 인터류킨-18 (IL-18), 인터페론-α (IFNα), 및 인터페론-γ (IFNγ)이 있다.The term “cytokine” refers to a family of immune enhancing proteins. The cytokine family includes hematopoietic growth factors, interleukins, interferons, immunoglobulin superfamily molecules, tumor necrosis factor family molecules and chemokines (ie, proteins that regulate the migration and activation of cells, particularly phagocytes). Examples of cytokines include, without limitation, interleukin-2 (IL-2), interleukin-12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15), interleukin-18 (IL-18), interferon-α (IFNα) , and interferon-γ (IFNγ).

용어 "유도하다"는 용어 활성화시키다, 자극하다, 발생시키다 또는 상향조절하다와 상호교환적으로 사용될 수 있다.The term "induce" can be used interchangeably with the terms activate, stimulate, generate or upregulate.

용어 대상에서 "면역 반응을 유도하는"이란 면역 반응의 활성을 특이적으로 조절하거나 영향을 주는 것을 언급하며, 면역 반응을 활성화, 면역 반응을 상향조절, 면역 반응을 증강 및/또는 면역 반응을 변화시키는 것 (예컨대 일정 타입의 면역 반응을 일으킨 다음 이것이, 어떤 대상에서는 유해하거나 효과가 없는 것이 다른 대상에서는 유익하거나 보호적인 것으로, 지배적인 타입의 면역 반응을 변화시키는 것)을 포함할 수 있다.The term "inducing an immune response" in the subject refers to specifically modulating or influencing the activity of an immune response, activating an immune response, upregulating an immune response, enhancing an immune response, and/or altering an immune response. This may include causing (e.g., eliciting an immune response of one type, which then alters the dominant type of immune response, such that what is detrimental or ineffective in some subjects is beneficial or protective in others).

용어 "작동가능하게 결합된"이란 핵산 분자가 숙주 세포로 형질주입시 (즉, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염) 상기 분자가 발현될 수 있도록 하는 방식으로 전사 조절 서열에 결합되어 있는 것을 언급한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 신장 (elongation), 및 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 전사 개시를 조절하는 것들로, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 리프레서 서열이 있다. 그러한 다양한 전사 조절 서열이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 바람직한 전사 조절 서열은 조류, 어류, 포유류, 박테리아, 식물, 및 곤충 세포에서 작용하는 것들을 포함한다. 임의의 전사 조절 서열이 본 발명에서 사용될 수 있는데, 상기 서열은 면역원 또는 면역 자극 단백질을 코딩하는 서열과 자연적으로 관련된 천연 전사 조절 서열을 포함할 수 있다.The term "operably linked" refers to a nucleic acid molecule being linked to transcriptional regulatory sequences in such a way that upon transfection (i.e., transformation, transduction or transfection) into a host cell, the molecule can be expressed. . Transcriptional regulatory sequences are sequences that control the initiation, elongation, and termination of transcription. Particularly important transcriptional regulatory sequences are those that control transcription initiation, such as promoter, enhancer, operator and repressor sequences. A variety of such transcriptional regulatory sequences are known to those skilled in the art. Preferred transcriptional regulatory sequences include those that function in avian, fish, mammalian, bacterial, plant, and insect cells. Any transcriptional regulatory sequence may be used in the present invention, including native transcriptional regulatory sequences that are naturally associated with sequences encoding immunogens or immune stimulatory proteins.

용어 "핵산 분자" 및 "핵산 서열"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며 DNA, RNA, 또는 DNA 또는 RNA의 유도체를 포함한다. 상기 용어는 또한 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 분자와 조절 영역, 인트론, 또는 기타 비-코딩 DNA 또는 RNA를 포함하는 핵산 분자를 둘 다 포함하는, 올리고뉴클레오티드 및 더 큰 서열을 포함한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 약 1 내지 약 500개의 뉴클레오티드의 핵산 서열을 갖고 있으며, 더욱 전형적으로는 길이가 적어도 약 5개의 뉴클레오티드인 것이다. 상기 핵산 분자는 포유류, 어류, 박테리아, 곤충, 바이러스, 식물 또는 합성 공급원을 포함한, 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (예, 폴리머라제 연쇄반응 (PCR), 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성법과 같이 당해 분야에 통상적으로 공지되어 있는 방법으로 제조될 수 있다. 핵산 분자는 비제한적으로, 천연 대립형질 변이체 및 본 발명의 방법에서 유용한 면역원 또는 면역 자극 단백질을 코딩할 수 있는 핵산 분자의 능력이 실질적으로 영향받지 않도록 하는 개질 방식으로 뉴클레오티드가 삽입, 결실, 치환, 또는 전환되어 있는 개질된 핵산 분자를 포함하는, 천연 핵산 분자와 이들의 동족체를 포함한다. 핵산 동족체는 당해 분야의 숙련가에 공지되어 있는 수많은 방법 (예를 들어, 다음 문헌을 참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989, 이는 본 명세서에서 참고로 인용됨)을 사용하여 제조할 수 있다. 병원균 항원 면역원성과 같은 면역원성 또는 사이토킨 활성에 대한 스크리닝 기술은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 다양한 시험관 내 및 생체 내 검정법을 포함한다.The terms “nucleic acid molecule” and “nucleic acid sequence” may be used interchangeably and include DNA, RNA, or derivatives of DNA or RNA. The term also includes oligonucleotides and larger sequences, which include both nucleic acid molecules that encode proteins or fragments thereof and nucleic acid molecules that include regulatory regions, introns, or other non-coding DNA or RNA. Typically, an oligonucleotide has a nucleic acid sequence of about 1 to about 500 nucleotides, more typically at least about 5 nucleotides in length. The nucleic acid molecule may be from any source, including mammalian, fish, bacterial, insect, viral, plant or synthetic sources. Nucleic acid molecules can be prepared by methods commonly known in the art, such as recombinant DNA techniques (eg, polymerase chain reaction (PCR), amplification, cloning) or chemical synthesis. Nucleic acid molecules can be modified to include, but are not limited to, natural allelic variants and the ability of the nucleic acid molecule to encode immunogens or immune stimulatory proteins useful in the methods of the invention are substantially unaffected by insertions, deletions, substitutions, or natural nucleic acid molecules and their analogs, including modified nucleic acid molecules that have been converted. Nucleic acid analogs can be prepared by a number of methods known to those skilled in the art (see, eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989, incorporated herein by reference). ) can be used to prepare. Screening techniques for immunogenicity or cytokine activity, such as pathogen antigen immunogenicity, are known to those skilled in the art and include a variety of in vitro and in vivo assays.

"선택 마커" 및 "선택 마커 유전자"라는 용어는 유전자가 선택 약제 (예: 항생제) 또는 정상적으로 유기체를 죽일 수 있거나 그의 성장을 억제할 수 있는 상태로부터 발현되는 유기체를 보호하는 산물을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 선별 마커 유전자는 가장 일반적으로 항생제 내성 유전자 (예: 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 등)이다. 따라서, 예를 들어, 대장균 세포를 형질전환 절차에 적용하여 카나마이신 내성 유전자를 코딩하는 플라스미드를 도입한 뒤 카나마이신을 함유하는 배지 상 또는 그에서 증식시키는 경우, 플라스미드를 성공적으로 흡수하고 카나마이신 내성 유전자를 발현하는 대장균만이 생존할 것이다. "선택 마커" 및 "선택 마커 유전자"라는 용어는 유기체의 성장에 필수적인 화합물의 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자도 포함한다. 필수 화합물을 합성할 수 없는 영양요구성 유기체에 도입된 경우, 이러한 유전자는 유기체가 필수 화합물로 보충된 배지에서 성장하도록 허용한다. 예를 들어, 라이신 생합성에 관여하는 효소의 돌연변이 또는 그 부재로 인해 아미노산 라이신에 대해 영양요구성인 박테리아 세포는 정상적으로 라이신이 보충되지 않은 배지에서 성장할 수 없다. 이러한 박테리아가 라이신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 플라스미드의 도입을 위해 형질전환 절차를 거치면, 플라스미드를 성공적으로 흡수하고 효소를 발현한 박테리아는 라이신이 보충되지 않은 배지에서 성장되는 경우 생존할 것이다. "선택 마커" 및 "선택 마커 유전자"라는 용어는 독/해독제 선택을 가능케 하는 유전자를 더 포함한다. 예를 들어, ccdB 유전자는 세포 분열에 필수 효소인 DNA 자이라제 (gyrase)에 결합하는 단백질을 코딩한다. DNA 자이라제에 결합시, ccdB 유전자 산물은 유전자 복제를 손상시키고 세포사를 유도한다. 따라서, ccdB 유전자 산물을 발현하는 박테리아는 생존할 수 없다. ccdA 유전자는 ccdB 유전자 산물의 천연 억제제 역할을 하는 단백질 (해독제)을 코딩한다. 따라서 박테리아 게놈에 ccdB 유전자를 가진 박테리아가 ccdA 유전자 산물을 코딩하는 플라스미드의 도입을 위해 형질전환 과정을 거치면 플라스미드를 성공적으로 흡수하고 ccdA 유전자를 발현하는 세포만이 생존할 것이다.The terms "selectable marker" and "selectable marker gene" refer to a gene that encodes a selectable agent (eg, antibiotic) or a product that protects an organism from which it is expressed from conditions that would normally kill the organism or inhibit its growth. refers to The selectable marker gene is most commonly an antibiotic resistance gene (eg kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, tetracycline resistance gene, etc.). Thus, for example, when E. coli cells are subjected to a transformation procedure to introduce a plasmid encoding a kanamycin resistance gene and then grown on or in a medium containing kanamycin, the plasmid is successfully taken up and the kanamycin resistance gene is expressed. Only E. coli that does so will survive. The terms "selectable marker" and "selectable marker gene" also include genes encoding enzymes involved in the synthesis of compounds essential for the growth of organisms. When introduced into an auxotrophic organism that cannot synthesize essential compounds, these genes allow the organism to grow in a medium supplemented with essential compounds. Bacterial cells that are auxotrophic for the amino acid lysine, for example due to mutations or absence of enzymes involved in lysine biosynthesis, cannot normally grow in media not supplemented with lysine. If these bacteria undergo a transformation procedure to introduce a plasmid encoding an enzyme involved in lysine biosynthesis, the bacteria that successfully take up the plasmid and express the enzyme will survive when grown in a medium not supplemented with lysine. The terms "selectable marker" and "selectable marker gene" further include genes enabling poison/antidote selection. For example, the ccdB gene encodes a protein that binds to DNA gyrase, an essential enzyme for cell division. Upon binding to DNA gyrase, the ccdB gene product impairs gene replication and induces cell death. Thus, bacteria expressing the ccdB gene product are not viable. The ccdA gene encodes a protein that acts as a natural inhibitor (antidote) of the ccdB gene product. Therefore, when a bacterium having a ccdB gene in its genome undergoes a transformation process to introduce a plasmid encoding the ccdA gene product, only cells that successfully take up the plasmid and express the ccdA gene will survive.

"선택 마커" 및 "선별 마커 유전자"라는 용어는 관찰자로 하여금 선별 마커 유전자를 발현하는 세포와 선별 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 구별토록 할 수 있는 산물을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 선별 마커 유전자 시스템은 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, lacZ 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 청색 형광 단백질 BFP) 또는 시안 형광 단백질 (CFP)과 같은 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.The terms "selectable marker" and "selectable marker gene" refer to a gene that encodes a product that allows an observer to distinguish between cells that express the selectable marker gene and cells that do not express the selectable marker gene. Selectable marker gene systems are well known in the art and include, for example, the lacZ gene and green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP), red fluorescent protein (RFP), blue fluorescent protein (BFP) or cyan fluorescent protein (CFP).

실시예Example

하기 실시예는 본 발명의 다양한 구체예를 설명한다.The following examples illustrate various embodiments of the present invention.

실시예Example 1: 비-사이클링 암소에서 수태율을 상승시키는데 면역조절 조성물의 효능 1: Efficacy of Immunomodulatory Compositions in Increasing Fertility in Non-Cycling Cows

본 연구의 목적은 분만시 면역 기능을 조절하는 것이 처리된 암소의 생식 결과에 미치는 영향을 평가하는데 있다.The purpose of this study was to evaluate the effect of modulating immune function at farrowing on the reproductive outcome of treated cows.

면역조절제immunomodulator

본 연구에 사용된 면역조절제는 실시예 1에서 기술한 상술된 조성물이다.The immunomodulatory agent used in this study is the aforementioned composition described in Example 1.

연구 동물 research animals

뉴질랜드 와이카토 (Waikato) 지역에 있는 2곳의 상업적 젖소 농장 A 및 B에서 2년생 이상 프리지아종, 저지종 또는 교배종 암소 875 마리를 입수하였다. 이때 암소들은 새로 태어나 젖을 먹는 송아지를 기준으로 선정되었다. 분만 30일 전에 항생제, 비스테로이드계 항염증제 또는 코르티코스테로이드로 처치되었거나 분만시 질병의 징후가 있는 소는 배제했다. 남은 동물들을 연령별 (암송아지 대 암소)로 블록화하고 처리군 또는 위약군으로 사전 준비된 무작위화 목록에 제시된 일련의 동물쌍에 배정하였다.875 freesia, jersey or crossbred cows of at least 2 years of age were obtained from two commercial dairy farms A and B in the Waikato region of New Zealand. At this time, cows were selected on the basis of newly born calves to suckle. Cows treated with antibiotics, non-steroidal anti-inflammatory drugs or corticosteroids 30 days before farrowing or showing signs of disease at farrowing were excluded. The remaining animals were blocked by age (heifers vs. heifers) and assigned to a series of animal pairs presented in a pre-prepared randomized list as treatment or placebo groups.

처리process

처리는 무작위적으로 하였고 처리 배정은 처리 후 샘플링 시트에 포함되지 않았으며 젖 샘플에는 후속 실험실 분석에 사용된 가입 고유 번호가 할당되었다. 분만 당일 (0일)과 신체 검사 및 등록 후 우측 둔부근에 근육 주사로 적절한 처리를 시행하였다. 주사하기 전에 주사 부위를 70% 메틸화 변성 알콜로 적신 면봉으로 닦았다. 처리는 산후 3일째 저녁 또는 4일째 아침과 7일째에 한 번 더 우측 둔부근 주사로 반복 실시하였다.Treatments were randomized, treatment assignments were not included in post-treatment sampling sheets, and milk samples were assigned a unique accession number used for subsequent laboratory analysis. On the day of delivery (day 0) and after physical examination and registration, appropriate treatment was performed by intramuscular injection into the right gluteal muscle. Before injection, the injection site was wiped with a cotton swab moistened with 70% methylated denatured alcohol. The treatment was repeated in the evening of the 3rd day or in the morning of the 4th day and once again on the 7th day by right gluteal muscle injection.

번식 관리breeding management

계획한 번식 프로그램 시작 대략 30일 전에 꼬리 페인트 (열 감지 지원)를 칠했다. 꼬리 페인트 제거 또는 관찰에 의해 발정기가 검출되지 않은 암소를 프로게스테론, GnRH 및 프로스타글란딘 F_2α의 조합으로 처리하고 설정된 인공 수정 시기까지 사육하였다. 농장 A 지구에서는 첫 37일 동안, 농장 B 지구에서는 47일 동안, 지속 발정기가 관찰된 암소를 인공 수정시켰다. 그 후 온전한 수컷을 무리와 지내게 하였다. 교미 총 기간은 농장 A 및 B에서 각각 77일 및 80일이었다. 암소를 번식 프로그램 시작 후 83일 및 113일 (농장 A), 그리고 번식 프로그램 시작 후 90일 및 120일 (농장 B)에 경직장 초음파검사로 검사하였다. 임신이 관찰된 암소들의 임신 것을 산정하였다. 임신 산정 단계가 인공 수정 또는 자연 적 교미의 기록 번식 7일 이내인 경우, 기록 날짜를 수태일로 하였다.Tail paint (heat-sensing aid) was applied approximately 30 days prior to the start of the planned breeding program. Cows whose estrus was not detected by tail paint removal or observation were treated with a combination of progesterone, GnRH and prostaglandin F _2α and reared until the established artificial insemination period. Cows in continuous estrus were artificially inseminated during the first 37 days in Farm A and 47 days in Farm B. Intact males were then allowed to stay with the group. The total duration of mating was 77 and 80 days in farms A and B, respectively. Cows were examined by transrectal sonography on days 83 and 113 after starting the breeding program (Farm A), and on days 90 and 120 after starting the breeding program (Farm B). Pregnancy of cows whose pregnancy was observed was calculated. If the pregnancy calculation stage was within 7 days of recorded propagation of artificial insemination or natural mating, the recorded date was taken as the date of conception.

결과result

3주 제시율 (번식 프로그램을 시작하여 3주 내에 관찰되고 수정된 암소의 비율), 첫 서비스 수태율 (첫 수정으로 수태된 인공 수정을 받은 암소의 비율), 3 및 6주 새끼 비율 (번식 프로그램의 첫 3주 및 6주 내에 임신이 확인된 암소의 비율), 및 최종 임신율을 계산하였다.3-week presentation rate (percentage of cows observed and inseminated within 3 weeks of starting the breeding program), first-service conception rate (percentage of artificially inseminated cows conceived with first insemination), and 3- and 6-week litter rate (first service fertility rate). Proportion of cows with confirmed pregnancy within 3 and 6 weeks), and final pregnancy rate were calculated.

이항 생식 결과를 먼저 이변량 (카이 제곱) 분석으로 분석하였다. 처리, 집단, 연령 (2, 3 및 3년 초과령), 번식 프로그램 시작에서의 젖 일 수 (50 내지 71일 및 72일 이상으로 분류됨) 및 품종 (프리지아종 대 다른 품종)의 설명 변수를 비롯한 다변량 로지스틱 회귀 모델을 행하였다. 또한, 수태 간격에 대한 계획된 교미 시작을 각 암소에 대해 계산하고, 카플란-메이어 (Kaplan-Meier) 생존 분석을 사용하여 수태까지의 중앙 일 수를 계산하였다.Binomial reproductive outcomes were first analyzed by bivariate (chi-squared) analysis. Descriptive variables of treatment, cohort, age (2, 3 and older than 3 years), number of lactating days at start of breeding program (categorized as 50 to 71 days and 72 days or older) and breed (Frisian versus other breeds) were analyzed. A multivariate logistic regression model was performed, including In addition, the planned start of mating for gestation interval was calculated for each cow, and the median number of days to conception was calculated using Kaplan-Meier survival analysis.

처리군을 품종 코드 및 연령에 대해 조정하고 카이 제곱 검정을 사용하여 p-값을 계산하였으며, 결과를 표 1에 나타내었다.Treatment groups were adjusted for breed code and age and p-values were calculated using a chi-square test, and the results are shown in Table 1.

또한, 분만에서부터 계획된 교미 시작까지의 평균 및 중간 시간은 표 2에 나타낸 바와 같이 처리군과 대조군 간 동일하였다. 처리군 및 대조군에 대해 분만에서부터 계획된 번식 시작까지의 중간값을 비교한 p-값을 만-휘트니 (Mann-Whitney) 검정을 사용하여 계산하였다.In addition, the average and median times from parturition to planned start of mating were the same between the treated and control groups, as shown in Table 2. P-values comparing median values from farrowing to planned start of breeding for treatment and control groups were calculated using the Mann-Whitney test.

표 3에 나타난 바와 같이, 처리군과 대조군 간에는 이변량 수준에서 계획된 교미 시작 (planned start of mating, PSM) 후 21일 (3주 제시)에 인공 수정에 대한 제시 확률, PSM 후 첫 수정에 대한 수태 확률 (첫 서비스에 대한 수태), PSM 후 21일 및 42일 까지 임신 확률 (각각 3주에 임신 및 6주에 임신) 및 전체 임신에 차이가 없었다. 카이 제곱 검정을 사용하여 P-값을 계산하였다.As shown in Table 3, between the treatment group and the control group, at the bivariate level, the probability of presentation for artificial insemination at 21 days (presentation of 3 weeks) after the planned start of mating (PSM), the conception for the first insemination after PSM There were no differences in odds (conception at first service), odds of pregnancy by 21 and 42 days after PSM (pregnancy at 3 weeks and pregnancy at 6 weeks, respectively), and overall pregnancy. P-values were calculated using a chi-squared test.

품종 (홀스타인종, 저지종 및 교배종), 연령 (2, 3 및 4+년생), 무리 (1 및 2), 난소 사이클링 활동 (CIDR 장치의 삽입에 기반한 사이클링 및 비-사이클링) 및 분만에서부터 PSM까지의 시간 (50 내지 71일 및 72일 이상)을 비롯한 잠재 효과 변경 인자를 제어한 다변수 회귀 분석에서, 처리군에서 비-사이클링 암소의 첫 서비스에 대한 수태 및 3주째 임신 확률이 대조군에서의 그의 대응상대에 비해 더 높았다. 도 4A는 첫 수정에 대한 수태 확률 (산정 주변 평균 및 평균 표준 오차 (SEM))의 차트를 도시하고, 도 4B는 처리군에 의한 사이클링 및 비-사이클링 암소에 대한 계획된 번식 프로그램 시작 후 3주 내 임신 확률 (산정 주변 평균 및 SEM)을 나타낸다. 별표는 비-사이클링 군 내 처리간 차이를 나타낸다. PSM에서 임신까지의 평균 시간은 처리군과 대조군에 대해 각각 15일 및 16일이었다 (P=0.27).Breed (Holstein, Jersey and crossbreeds), age (2, 3 and 4+ years old), herd (1 and 2), ovarian cycling activity (cycling and non-cycling based on implantation of CIDR device) and farrowing to PSM In a multivariate regression analysis controlling for potential effect modifiers, including time (from 50 to 71 days and over 72 days), conception to first service of non-cycling cows in the treatment group and probabilities of pregnancy at 3 weeks compared to those in the control group. higher than that of its counterpart. 4A shows charts of conception probabilities (estimated marginal mean and mean standard error (SEM)) for first fertilization, and FIG. 4B shows a chart within 3 weeks of starting a planned breeding program for cycling and non-cycling cows by treatment. Pregnancy probability (calculated marginal mean and SEM) is shown. Asterisks indicate differences between treatments within non-cycling groups. The median time from PSM to conception was 15 and 16 days for the treated and control groups, respectively (P=0.27).

첫 서비스를 받은 처리 암소가 비처리 대조군보다 수치상으로 더 많이 (69% 대 65%) 3주 (63% 대 61%) 및 6주 (80% 대 76%)까지 임신하였다. 발정기가 발견되지 않은 것으로 진단되고 이 상태에서 처리된 암소들에 비-사이클링 상태 상호작용에 의한 처리가 있었는데, 처리된 암소는 첫 서비스 수태율이 더 높았고 번식 프로그램에서 3주까지 임신율이 더 높았다.Treated cows that received first service were numerically more (69% vs. 65%) pregnant than untreated controls by 3 weeks (63% vs. 61%) and 6 weeks (80% vs. 76%). There was treatment by non-cycling state interaction in cows diagnosed as not in estrus and treated in this state, treated cows had higher first service conception rates and higher pregnancy rates by 3 weeks in the breeding program.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer HealthCare LLC <120> INCREASED FERTILITY IN BOVINE SPECIES <130> BHC168033 US | 2920951-141000 <140> 16/320,256 <141> 2019-01-24 <150> PCT/US2017/043662 <151> 2017-07-25 <150> US 62/366,772 <151> 2016-07-26 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4242 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of plasmid pMB75.6 <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 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tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 3720 ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg ccattcaggc 3780 tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 3840 aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 3900 gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc gaattgggta 3960 ccgggccccc cctcgagcag gatctataca ttgaatcaat attggcaatt agccatatta 4020 gtcattggtt atatagcata aatcaatatt ggctattggc cattgcatac gttgtatcta 4080 tatcataata tgtacattta tattggctca tgtccaatat gaccgccatg ttgacattga 4140 ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 4200gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gc 4242

Claims (24)

a. N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)와 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP)와 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄클로라이드 (DOTIM)와 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)와 콜레스테롤;로 구성된 군으로부터 선택된 지질쌍을 포함하는 양이온성 리포좀 전달 비히클; 및
b. 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 서열을 포함하는, 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아 유래 핵산 분자;를 포함하는
비-질병(non-diseased) 암소의 수태율을 상승시키기 위한 면역조절 조성물.a. N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and cholesterol; N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTAP) and cholesterol; 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium chloride (DOTIM) with cholesterol; and dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB) and cholesterol; a cationic liposome delivery vehicle comprising a lipid pair selected from the group consisting of; and
b. An isolated bacterial nucleic acid molecule not encoding an immunogen comprising the sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3;
An immunomodulatory composition for increasing the fertility rate of non-diseased cows. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 적어도 하나의 면역자극 CpG 모티프 및 적어도 하나의 비-면역자극 CpG 모티프를 포함하는 면역조절 조성물.2. The immunomodulatory composition according to claim 1, wherein the nucleic acid molecule comprises at least one immunostimulatory CpG motif and at least one non-immunostimulatory CpG motif. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 1을 포함하는 면역조절 조성물.2. The immunomodulatory composition of claim 1, wherein the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 1. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 2를 포함하는 면역조절 조성물.2. The immunomodulatory composition of claim 1, wherein the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO:2. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 증강 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 제제를 추가로 포함하는 면역조절 조성물.5. The immunomodulatory composition according to any one of claims 1 to 4, further comprising a biological agent selected from the group consisting of immune enhancing proteins, immunogens, vaccines, antimicrobial agents, or any combination thereof. 제1항에 있어서, 정맥 내, 근육 내, 피내, 복강 내, 피하, 분무-에어로졸, 경구, 안내, 기관 내 및 비강 내로 구성된 군으로부터 선택된 투여용의 면역조절 조성물.The immunomodulatory composition according to claim 1, for administration selected from the group consisting of intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutaneous, spray-aerosol, oral, intraocular, intratracheal and intranasal. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 면역조절 조성물.The immunomodulatory composition according to claim 1, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. 암소에서 수태율을 상승시키는 방법으로서,
면역조절 조성물의 유효량을 암소에게 투여하는 것을 포함하며,
상기 면역조절 조성물이
a. N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)와 콜레스테롤; N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP)와 콜레스테롤; 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄클로라이드 (DOTIM)와 콜레스테롤; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)와 콜레스테롤;로 구성된 군으로부터 선택된 지질쌍을 포함하는 양이온성 리포좀 전달 비히클; 및
b. 서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 서열을 포함하는, 면역원을 코딩하지 않는 단리된 박테리아 유래 핵산 분자;를 포함하는,
방법.As a method of increasing conception rate in cows,
administering an effective amount of an immunomodulatory composition to cows,
The immunomodulatory composition
a. N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and cholesterol; N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTAP) and cholesterol; 1-[2-(oleoyloxy)ethyl]-2-oleyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazolinium chloride (DOTIM) with cholesterol; and dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB) and cholesterol; a cationic liposome delivery vehicle comprising a lipid pair selected from the group consisting of; and
b. An isolated bacterial nucleic acid molecule not encoding an immunogen comprising the sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3;
Way. 제8항에 있어서, 핵산 분자가 적어도 하나의 면역자극 CpG 모티프 및 적어도 하나의 비-면역자극 CpG 모티프를 포함하는 방법.9. The method of claim 8, wherein the nucleic acid molecule comprises at least one immunostimulatory CpG motif and at least one non-immunostimulatory CpG motif. 제8항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 1을 포함하는 방법.9. The method of claim 8, wherein the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO: 1. 제8항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 2를 포함하는 방법.9. The method of claim 8, wherein the nucleic acid molecule comprises SEQ ID NO:2. 제8항에 있어서, 면역조절 조성물이 면역 증강 단백질, 면역원, 백신, 항균제 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 제제를 추가로 포함하는, 방법.9. The method of claim 8, wherein the immunomodulatory composition further comprises a biological agent selected from the group consisting of immune enhancing proteins, immunogens, vaccines, antimicrobial agents, or any combination thereof. 제8항에 있어서, 투여가 정맥 내, 근육 내, 피내, 복강 내, 피하, 분무-에어로졸, 경구, 안내, 기관 내 및 비강 내로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.9. The method of claim 8, wherein administration is selected from the group consisting of intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutaneous, nebulization-aerosol, oral, intraocular, intratracheal and intranasal. 제8항에 있어서, 면역조절 조성물이 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 방법.9. The method of claim 8, wherein the immunomodulatory composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier. 제1항에 있어서, 비-사이클링 암소에서 수태율을 증가시키기 위한 것인 면역조절 조성물.The immunomodulatory composition according to claim 1, which is for increasing fertility in non-cycling cows. 제8항에 있어서, 수태율이 비-사이클링 암소에서 증가되는 방법.9. The method of claim 8, wherein conception rates are increased in non-cycling cows. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete

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