KR102470864B1 - 양파의 생육 촉진 효과 및 가뭄 내성 증진 효과를 갖는 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주 및 이의 용도 - Google Patents

양파의 생육 촉진 효과 및 가뭄 내성 증진 효과를 갖는 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물의 생육 증진 및 식물의 건조 스트레스 저감 효과를 가지는 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 식물 종자의 생육 증진 방법과 식물의 건조 스트레스 저감 방법에 관한 것이다.

Description

양파의 생육 촉진 효과 및 가뭄 내성 증진 효과를 갖는 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주 및 이의 용도{PROMOTES ONION GROWTH AND DROUGHT TOLERANCE BY BACILLUS ALTITUDINIS H5-9 AND USES THEREOF}
본 발명은 식물의 생육 증진 및 식물의 건조 스트레스 저감 효과를 가지는 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 식물 종자의 생육 증진 방법과 식물의 건조 스트레스 저감 방법에 관한 것이다.
현재 상용화되어 있는 농업 유용 미생물은 식물 병원성 미생물에 대한 길항효과, 토양 내 무기 영양분의 가용화, 다양한 식물 생육 증진 등의 효과를 가지고 있는 미생물 제제가 있으며 현재 사용 가능한 화학 농약 및 비료의 숫자도 줄어들고 있는 실정이므로 이를 대체할 수 있는 미생물 제제가 요구되고 있다.
본 발명에서는 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공하고, 이를 이용한 식물 종자의 생육 증진 방법과 식물의 건조 스트레스 저감 방법을 제공하여 기존의 화학 농약 및 비료를 대체하고자 한다.
본 발명은, 식물의 건조 스트레스 저감용 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P)를 제공한다.
본 발명은, 식물의 생육 증진용 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P)를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 자이레이스(gyrase) 유전자 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 식물은 양파일 수 있다.
본 발명은 식물의 건조 스트레스 저감용 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P), 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미생물 제제는 식물 성장 조절제, 식물 성장 자극제 및 식물 영양제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 식물의 건조 스트레스 저감용 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P), 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하고, 미생물 제제는 식물 성장 조절제, 식물 성장 자극제 및 식물 영양제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 미생물 제제 중 적어도 하나를 식물, 식물 주변 영역, 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 식물 종자의 생육 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 식물은 양파일 수 있다.
본 발명은 식물의 건조 스트레스 저감용 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P), 상기 균주의 배양액 중 적어도 하나 이상을 양파, 양파 모종 주변 영역, 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 양파의 건조 스트레스 저감 방법을 제공한다.
본 발명은 식물의 건조 스트레스 저감용 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P), 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제 중 적어도 하나 이상을 양파, 양파 모종 주변 영역, 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 양파의 건조 스트레스 저감 방법을 제공한다.
본 발명은 식물의 건조 스트레스 저감용 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P), 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하고, 미생물 제제는 식물 성장 조절제, 식물 성장 자극제 및 식물 영양제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 미생물 제제 중 적어도 하나 이상을 양파, 양파 모종 주변 영역, 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 양파의 건조 스트레스 저감 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주를 식물에 적용하면, 건조 스트레스에 의한 피해가 감소하므로, 본 발명에 다른 미생물을 식물 활성 증진제, 식물 성장 조절제, 식물 성장 자극제 및 식물 영양제 등으로 활용될 수 있다.
도 1은 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주의 자이레이스(gyrase) 유전자 염기서열을 분석하여 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 2a는 실험실 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 생육 증진 효과를 나타낸 것이다.
도 2b는 실험실 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 건조 내성 효과를 나타낸 것이다.
도 3a는 비닐하우스 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 수확량(g)을 나타낸 것이다.
도 3b는 비닐하우스 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 구 직경(mm)을 나타낸 것이다.
도 4a는 비닐하우스 조건에서 수분을 공급한 대조군 양파를 나타낸 사진이다.
도 4b는 비닐하우스 조건에서 수분을 공급하지 않은 대조군 양파를 나타낸 사진이다.
도 4c는 비닐하우스 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파를 나타낸 사진이다.
도 5는 농가 포장 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 수확량(g)을 나타낸 것이다.
도 6a는 농가 포장 조건에서 대조군 양파를 나타낸 사진이다.
도 6b는 농가 포장 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파를 나타낸 사진이다.
도 7은 농가 포장 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 상품성 증진 효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 명세서에 개시된 실시예들을 도면을 참조하여 상세하게 설명하고 자 한다. 상세한 설명, 도면들 및 청구항들에서 상술하는 예시적인 실시예들은 한정을 위한 것이 아니며, 기재된 실시예들과 다른 실시예들이 이용될 수 있으며, 여기서 개시되는 기술의 사상이나 범주를 벗어나지 않는 한 다른 변경들도 가능하다.
개시된 기술에 관한 설명은 구조적 내지 기능적 설명을 위한 실시예에 불과하므로, 개시된 기술의 권리범위는 본문에 설명된 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니된다. 즉, 실시예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 개시된 기술의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
여기서 사용된 모든 용어들은 다르게 정의되지 않는 한, 개시된 기술이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 관련기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석 될 수 없다.
유기질, 화학비료의 과다사용에 의해 토양의 오염, 연작장해, 토양양분의 불균형, 병해충 발생 등의 문제가 발생되어, 생산물의 품질저하, 농가의 소득 저하 등의 부작용이 나타나고 있다. 중요한 식물 영양분인 질소(N)는 이러한 화학 비료의 사용에 의해 공급되어 왔으나, 더 높은 수확량을 유지하기 위한 화학 비료의 과잉 이용은 낮은 투입으로 높은 생산성을 요하는 지속 가능한 농업의 원리에 반하는 문제점과, 환경적인 문제가 있었다.
이와 같은 문제를 해결하기 위하여 화학비료를 대체할 수 있는 수단으로, 농업환경 및 생태계 부담을 최소화하면서 안전한 먹거리를 해결하는 생물학적 방법이 요구된다. 이에 따라 본 발명에서는, 상기 생물학적 방법으로 식물의 건조 스트레스를 저감시킬 수 있는 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다. 특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제는 식물에 작용하여 건조 스트레스를 저감시킨다.
본 명세서에서 "식물"은 식물계에 속하는 임의의 살아있는 유기체 (즉, 식물계 내의 임의의 속/종)를 지칭하여, 나무, 허브, 관목, 목초, 덩굴, 양치식물, 이끼 및 녹조류와 같으나 이에 제한되지는 않는다. 따라서 미생물 제제가 적용될 수 있는 대표적인 식물로 양파, 고추, 브라시카, 구근 채소, 곡물, 시트러스, 목화, 조롱박, 과실 채소, 잎 채소, 콩과식물, 오일 종자 식물, 땅콩, 뿌리 채소, 괴경 채소, 구경 채소, 핵과류, 담배, 딸기 및 다른 장과류, 및 다양한 관상식물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시예에 있어서, 본 발명의 양파(Onion)에 적용될 수 있다.
본 명세서에서 “배양액”은 균주를 배지에 접종하고 일정시간 배양하여 얻은 결과물로서, 본 발명에 따른 균주를 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액, 상기 배양액, 여액, 상기 세포 파쇄액 등을 농축한 농축액 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 생균제 또는 항균용 조성물은 고체배지 배양물, 또는 상기 배양액의 건조물 또는 추출물 등의 배양물을 함유할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 나아가 적합한 부형제 또는 담체(열성유전자를 이형접합의 상태로 가지고 있는 개체)를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 미생물 제제는 액상 비료 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 “스트레스”는 식물에 대한 비생물적 스트레스일 수 있으며, 구체적으로 비생물적 스트레스는 건조 스트레스일 수 있다.
용어 "비생물적 스트레스"는 특정 환경에서 살아있는 유기체에 대한 비생물적 스트레스 인자의 부정적 영향으로서 그의 통상의 의미로 본원에서 사용되며, 따라서 식물과 관련하여 특정 환경에서 식물에 대한 비생물적 스트레스 인자의 부정적 영향을 의미한다.
생물적 스트레스는 진균 또는 유해 곤충과 같은 살아있는 방해물을 포함하는 반면에, 비생물적 스트레스 인자는 자연 발생적인 것 또는 인간이 만든 것일 수 있고, 온도, 건조 토양, 삼투 스트레스, 가뭄, 염 또는 영양분 결핍을 포함하며, 이들은 모두 영향을 받은 영역에서 식물에게 해를 유발할 수 있다.
본 발명의 미생물 제제는 식물의 건조 스트레스를 저감시킬 수 있으며, 상기 식물은 양파일 수 있다.
본 발명은 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공하며, 상기 미생물 제제를 이용하여, 식물의 건조 스트레스 저감 효과를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주는 2019년 10월 14일자로 국립농업과학원에 미생물을 기탁하였으며, 수탁 번호로 KACC 92279P를 부여받았다.
도 1은 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주의 자이레이스(gyrase) 유전자 염기서열을 분석하여 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
상기 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 표시된다.
본 발명에서의 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주는 상기 서열번호 1로 표시되는 유전자 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 미생물 제제는 상술한 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주, 상기 균주의 배양액, 또는 이들의 혼합물에 당해 분야에서 식물의 건조 스트레스를 저감시키는 것으로 사용되는 다른 임의의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 일례로, 식물 성장 조절제, 식물 성장 자극제 및 식물 영양제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물 성장 조절제, 식물 성장 자극제 또는 식물 영양제는 화학물질 또는 박테리아의 또 다른 균주 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 이에 더해, 제초제, 살균제, 살충제, 비료를 더 포함할 수도 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물 성장 조절제에는 유익한 다른 미생물들, 미생물 활성물질 및 유기 비료가 포함될 수 있다. 이에 더해, 화학비료가 포함될 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유익한 다른 미생물들에는 기존에 식물 생육을 증진시키는 것으로 알려진 바실러스 종(Bacillus spp.), 아조토박터 종(Azotobacter spp.), 트리코데르마 종(Trichoderma spp.) 및/또는 사카로미세스 종(Saccharomyces spp.)이 포함될 수 있다. 그러나 상기 미생물 종에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물 활성물질에는 효소 전구물질, 미생물 대사물질, 유기산, 탄수화물, 효소 및/또는 미량원소 등이 포함될 수 있다. 예를 들면, 미생물 활성물질에는 효모 자가용해질과 같은 가공된 효소 산물, 부식질(지표 및 땅 속에 존재하는 생물 이외의 유기물) 재료들, 해초 추출물, 전분, 아미노산, 그리고 아연, 철, 구리, 망간, 브롬, 몰리브덴과 같은 미량원소 등이 포함될 수 있다. 그러나 상기 미량원소에 한정되는 것은 아니다.
유익한 다른 미생물들, 미생물 활성물질 그리고 유기 비료는 상기에서 설명된 것과 동일할 수 있다. 화학비료에는 식물 생육을 지원하기 위하여 질소, 인, 및 칼륨 영양소를 제공할 수 있는 다양한 화학물질이 포함될 수 있다. 예를 들면, 화학비료에는 요소, 인산칼슘, 인산칼륨 및 혼합형 질소-인산-칼륨(N-P-K) 비료가 포함될 수도 있다. 화학비료에는 해당분야에 공지된 다른 재료들도 포함될 수 있다.
상기 유익한 다른 미생물들에는 기존에 식물 생육을 증진시키는 것으로 알려진 바실러스 종(Bacillus spp.), 아조토박터 종(Azotobacter spp.), 트리코데르마 종(Trichoderma spp.) 및/또는 사카로미세스 종(Saccharomyces spp.)이 포함될 수 있다. 그러나 상기 미생물 종에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 식물 주변 영역 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 식물 종자의 생육 증진 방법을 제공한다. 상기 식물은 양파일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 식물 주변 영역 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 식물의 건조 스트레스 저감 방법을 제공한다. 상기 식물은 양파일 수 있다.
구체적으로 상기 처리하는 단계는, 상기 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주, 상기 균주를 배양한 배양액 및 상기 균주를 이용한 미생물 제제를 종자나 식물에 침지하거나 관주 또는 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 관주 또는 종자를 배양액 및 미생물 제제에 담가 접종할 수 있다. 그러나 상기 접종 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 미생물 제제를 식물의 수명 주기 동안 임의의 시점에, 식물의 수명 주기의 하나 이상의 단계 동안, 또는 식물의 수명 주기에서 정기적인 간격으로, 또는 식물의 수명 전체에 걸쳐 계속적으로 적용하는 것을 포함한다. 따라서 미생물 제제는 필요에 따라 적용될 수 있다. 예를 들어 미생물 제제는 식물에게 성장 동안, 개화 전 및/또는 개화하는 동안, 및/또는 종자 발생 전 및/또는 종자가 발생하는 동안 적용될 수 있다. 일례로, 미생물 제제는 식물이 한 위치에서 또 다른 위치로, 예컨대 온실 또는 온상에서 필드로 이식되기 전, 동안 및/또는 직후에 적용될 수 있다. 또 다른 일례로, 각각의 미생물 제제는 식물에 원하는 간격 기간으로 다수 회 적용될 수 있다.
상기 식물체 주변의 토양과 관련하여, 본 발명이 적용되는 주변 영역이란, 본 발명의 미생물 제제가 효과를 발휘할 수 있는 범위를 의미하는 것으로, 지상 및 지하를 모두 포함한다. 예를 들어 식물, 식물 부분 또는 과실 주위의 약 2m 이내, 약 1m 이내, 약 70㎝이내, 약 50㎝ 이내, 약 25㎝ 이내, 약 10㎝ 이내 또는 약 5㎝ 이내의 영역일 수 있다. 그러나 상기 영역에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물의 건조 스트레스 저감 방법은 나무, 허브, 관목, 목초, 덩굴, 양치식물, 이끼, 녹조류, 외떡잎 식물, 및 쌍떡잎 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 식물의 건조 스트레스를 저감시키는 방법이다. 상기 식물은 일 실시예로서, 본 발명의 양파일 수 있다.
본 발명이 적용되는 식물의 부위는 제한되지 않는다. 따라서, 식물 전체는 물론, 식물의 부분 예를 들어 씨앗, 새순, 줄기, 뿌리, 잎, 과실, 이들의 전체는 물론 이들의 일부를 모두 포함한다.
본 발명에서는 식물 성장 조절제, 식물 성장 자극제 및 식물 영양제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는 미생물 제제 중 적어도 하나를, 식물, 식물 주변 영역, 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 식물 종자의 생육 증진 방법을 제공한다. 상기 식물은 양파일 수 있다.
이하, 실험예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 실험예로 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 바실러스 알티투디니스( Bacillus altitudinis ) H5-9 균주의 동정
바실러스 알티투디니스 H5-9 균주의 계통분류학적 위치와 동정은 gyrase 유전자 염기서열 분석을 이용하였다. 염기서열 유사도는 이지탁손(EzTaxon)으로 분석하였고, 계통도의 작성을 위해 SINA 어레이너(SINA aligner) v1.2.11로 염기서열을 정렬하고 염기서열 길이를 맞추었다. 이후, 메가(MEGA) 6.0 프로그램으로 계통학(Neighbor-joining) 알고리즘을 사용하여 계통도를 작성하였으며, 계통도의 안정성은 1000회 부트스트래핑(bootstrapping)을 수행하여 확인하였다. 상기 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 표시된다.
도 1은 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주의 자이레이스(gyrase) 유전자 염기서열을 분석하여 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
계통분석 결과 H5-9 균주는 자이레이스(gyrase) 유전자 염기서열에서 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) 41kf2bT (표준 균주)와 99.8% 유사성을 갖기 때문에 H5-9 균주를 바실러스 알티투디니스로 동정하였다.
실험예 2 : 바실러스 알티투디니스( Bacillus altitudinis ) H5-9 균주의 옥신 생성능
바실러스 알티투디니스 H5-9 균주의 옥신 생성능을 평가하기 위하여, H5-9 균주를 28ºC의 TSB(Tryptic soy broth) 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 원심분리를 통해 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주만을 회수하고, 회수한 균주를 /2 TSB(Tryptic soy broth) 배지에 트립토판 100 μg/ml을 첨가한 배지에 24시간 동안 배양하였다. 이 후 4000 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 40 μl의 상청액을 80 μl의 살코우스키(Salkowski) 용액(35% perchloric acid, 1ml의 0,5 M FeCl3)에 혼합하였다. 이후 2 μl의 10 mM 인산(phosphoric acid)(1/40 희석)을 첨가하여 10℃에서 24시간동안 배양한 후, 흡광도 530 nm에서 옥신 생성능을 측정하여 평가하였다.
실험예 3 : 바실러스 알티투디니스( Bacillus altitudinis ) H5-9 균주의 인산 가용화능
바실러스 알티투디니스 H5-9 균주의 인산가용화능을 평가하기 위하여, 상기와 같이 배양한 후 PVK(Pikovskaya) 배지(glucose 10 g, Ca3(PO4)2 5 g, (NH4)2SO4 0.5 g, NaCl 0.2 g, MgSO4.7H2O 0.1 g, KCl 0.2 g, 효모 추출물 0.5 g, MnSO4.H2O 0.002 g, FeSO4.7H2O 0.002 g, Agar 15.0 g, 증류수 1000 ml, bromo-phenol-blue 0.025 g, pH 7.0)에서 2주 동안 배양하여 환형이 형성되는지 평가하였다.
실험예 4 : 바실러스 알티투디니스( Bacillus altitudinis ) H5-9 균주의 ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid) 탈 아미노 효소활성능
ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid) 탈 아미노 효소 활성능을 평가하기 위하여, 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 상기와 같이 배양한 후 DF(Dworkin and Foster) 최소배지에 ACC(30 μmol/plate)를 도말하고 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주 현탁액을 한방울 떨어뜨려 생육 여부를 평가하였다.
실험예 5 : 바실러스 알티투디니스( Bacillus altitudinis ) H5-9 균주의 시드로포아 생성능
시드로포아 생성능을 평가하기 위하여, H5-9 균주를 상기와 같이 배양한 후, CAS 디퓨젼 에세이(diffusion assay)로 측정하여 평가하였다. 15.125 mg의 크롬 아주롤 S(chrome azurol S)를 12.5ml 탈이온수(DW; deionized water)에 용해 2.5 ml의 철(Ⅲ용액(Iron(Ⅲ) (1 mM FeCl3 6H2O, 10 mM HCl)를 혼합하고 10 ml의 탈이온수에 18.225 mg의 HDTMA(Hexadecyl-trimethylammonium)를 혼합한 수용액을 천천히 혼합하여 혼합용액 A를 만들고, 187.5 ml의 탈이온수와 3.38 g의 한천 7.56 g의 파이퍼(Pipers), 10 mM의 NaOH를 혼합한 후 pH 6.8로 조정하여 혼합용액 B를 제조하였다. 상기 혼합용액 A와 혼합용액 B를 혼합한 후, 분주하여 CAS(chrome azurol S) 배지를 제조 후, 멸균된 메스을 이용하여 배지를 2등분 하여 한쪽을 제거하고, TSA(Tryptic soy agar) 배지를 분주하여 배지를 제조하였다. TSA면에 H5-9 균주를 접종하여 28℃배양기에 10일간 배양하고 CAS 배지가 청색에서 황색으로 변색되는 부분의 길이를 측정하였다.
하기 표 1은 실험예 2 내지 실험예 5의 실험결과를 나타낸 것으로서, 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주의 생리화학적 특성을 요약하여 나타낸 표이다.
구분 특성
작물 생육촉진 관련 특성 옥신류 생성 +
ACC 탈 아미노 효소활성능 +
인산가용화 +
시드로포아 -
형태학적 특성 세포크기(직경~폭) 0.67±0.13
0.378±0.07
콜로니 크기(3일 배양) 0.972±0.04
콜로니 색 흰색
생육환경 생육온도 범위 15℃℃
NaCl 내성 1%-10%
탄소 이용능 Casein +
Starch, Lipid(Tributyrin) -
기타 Catalase, Oxidase 활성 +
실험예 6 : 온실 조건에서 바실러스 알티투디니스( Bacillus altitudinis ) H5-9 균주의 양파 건조 내성 증진 효과
온실 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 후, 양파의 생육 증진 효과를 확인하기 위해 양파 종자(품종 : 천주중고황)를 상토가 담긴 9cm 플라스틱 포트에 파종한 후 온실에서 약 2주 동안 재배하였다. 2엽이 나올 때 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주 현탁액(OD600=0.25) 20 ml를 관주 처리하고, 2달간 재배하였다. 건조 스트레스 조건의 경우 상기 표기된 바와 같이 2주간 재배 및 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주 현탁액 처리 후, 4일 후 40중량%의 폴리에틸렌글리콜-6000(PEG-6000)으로 건조 스트레스를 유발하였고, 3주 후 양파의 생체중을 측정하였다.
도 2a는 온실 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 생육 증진 효과를 나타낸 것이고, 도 2b는 온실 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 건조 내성 효과를 나타낸 것이다(Con(P)는 건조 스트레스를 가한 대조군, Con(N)은 건조 스트레스를 가하지 않은 대조군).
실험 결과, 온실 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 생체중은 3.0g이고 대조군 양파의 생체중은 2.45g이다. 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 생체중은 대조군 양파의 생체중과 비교하여 통계적으로 유의하게 약 23.1% 증가하였다.
양파에 건조 스트레스를 유발한 조건에서는 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 생체중이 0.5g이고, 대조군 양파(Con(P))의 생체중은 0.44g이다. 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 생체중은 대조군 양파의 생체중과 비교하여 통계적으로 유의하게 약 14.5% 증가하였다.
실험예 7 : 비닐하우스 조건에서 바실러스 알티투디니스( Bacillus altitudinis ) H5-9 균주의 양파 건조 내성 증진 효과
비닐하우스 재배 조건에서 H5-9 균주를 관주 처리한 후 자연 건조 조건에서 양파 생육을 측정하였다. 양파(품종: 카타마루)를 스티로폼 상자(내경 기준 가로 49.5 X 31 X 22 cm, 토양 25 kg)에 파종한 후 비닐하우스에서 재배하였다. 이식 1달간 적응기간을 거친 후 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주 현탁액(OD600=0.5 기준 1/100) 45 ml를 관주 처리하고, 이 후 4주 동안 양파를 건조한 조건에서 스트레스를 가한 후 양파의 수확량(g)과 직경(mm)을 측정하였다.
도 3a는 비닐하우스 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 수확량(g)을 나타낸 것이고, 도 3b는 비닐하우스 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 구 직경(mm)을 나타낸 것이다.
실험 결과, 비닐하우스 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 수확량(g)은 4.2g이고, 대조군 양파(CD; Control(Drought)의 수확량은 3.6g이다. 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 수확량은 대조군 양파의 수확량과 비교하여 약 16% 증가하였다.
비닐하우스 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 구 직경(mm)은 54mm이고, 대조군 양파(CD; Control(Drought)의 수확량은 50.5mm이다. 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 수확량은 대조군 양파의 수확량과 비교하여 약 7% 증가하였다.
도 4a는 비닐하우스 조건에서 수분을 공급한 대조군 양파를 나타낸 사진이고, 도 4b는 비닐하우스 조건에서 수분을 공급하지 않은 대조군 양파를 나타낸 사진이며, 도 4c는 비닐하우스 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파를 나타낸 사진이다.
실험예 8 : 노지 포장 조건에서 바실러스 알티투디니스( Bacillus altitudinis ) H5-9 균주의 양파 수확량 및 구 직경 증진 효과
노지 포장 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 후 생육을 측정하였다. 노지에서 양파(품종: 카타마루)를 경엽신장기까지 재배한 후 1주 간격으로 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주 현탁액(OD600=0.5 기준 1/100) 45 ml를 관주 처리하고, 수확기에 양파 수확량과 양파의 직경을 측정하였다.
도 5는 노지 포장 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 수확량(g)을 나타낸 것이다.
실험 결과, 노지 포장 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 수확량(g)은 10.2kg/10a이고, 대조군 양파의 수확량은 9.2kg/10a이다. 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 수확량은 대조군 양파의 수확량과 비교하여 약 11% 증가하였다.
노지 포장 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 구직경(mm)은 1650mm이고, 대조군 양파의 구직경은 1587mm이다. 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 관주 처리한 양파의 구직경은 대조군 양파의 구직경과 비교하여 약 4% 증가하였다.
도 6a는 노지 포장 조건에서 대조군 양파를 나타낸 사진이고, 도 6b는 노지 포장 조건에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파를 나타낸 사진이다.
상기와 같이 노지 포장 조건에서 재배한 양파의 상품성을 '국립농산물품질관리원고시 제 2018-44호(19.1.1.)'에 따라, 양파의 지름이 6cm 미만인 경우 소형, 6cm 내지 8cm인 경우 중형, 8cm 내지 9cm 인 경우 대형, 9cm 이상인 경우 특대형로 구분하였다.
도 7은 노지 포장 조건에서 대조군 양파와 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종한 양파의 상품성 증진 효과를 나타낸 것이다.
노지 포장에서 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종하여 양파를 재배한 경우, 10%가 소형, 85%가 중형, 5%가 대형으로 분류되었다. 이와 달리, 대조군의 경우, 23%가 소형, 77%가 중형으로 분류되었으며, 대형으로 분류된 양파는 존재하지 않았다. 이를 통해, 바실러스 알티투디니스 H5-9 균주를 접종하여 양파를 재배한 경우, 양파의 상품성이 크게 증가한다는 점을 확인하였다.
국립농업과학원 KACC92279P 20191014
<110> REPUBLIC OF KOREA, REPUBLIC OF KOREA <120> PROMOTES ONION GROWTH AND DROUGHT TOLERANCE BY BACILLUS ALTITUDINIS H5-9 AND USES THEREOF <130> FP-2010063-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1272 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bacillus altitudinis H5-9 gyrB <400> 1 actagtgatt agagggtacg gatgtgcgag ccgtcgacat cggcatcggt catgatcaca 60 attttgtgat aacgtgcttt ctctaaagtg aagtcttctc cgattccagt ccctagcgct 120 gtaatcattg aacgaacctc gttgttagat aaaattttat ctagtcgtgc tttttcaacg 180 tttaggatct tccctcttaa cggtaagatc gcttggaaat gtcgatcacg accttgctta 240 gcagatccgc ccgcagaatc tccctctacg atataaagct cagagatgga aggatcttta 300 gaagaacagt ctgccagttt cccaggcaag ctagagactt ccagtgcact tttacgtctt 360 gtcagctcac gtgccttttt ggcagccatt cttgcacgag ctgccatcac acctttctcc 420 acaattttct ttgcagcatc agggttctct aagaggaatt tctcaagtgc ttcggagaag 480 agggagtcgg taatggttct tgcttctgag ttaccgagct ttgtcttcgt ttgtccttcg 540 aattgagggt ctggatgttt gatagagata atggctgcta agccttctcg tacatcttct 600 ccgctcaaat tcgagtcacc atcttcgaat acgccatttt tacgagcata atcattgatg 660 acacgcgtca gaccggtttt aaagccagct tcgtgtgatc cgccttcata tgtgttgatg 720 ttgttggcga aagaataaat attgcttgta taggaatcgt tgtattgcag tgtaacttta 780 acggtgactc cgtctttttc accctcgatg taaactggtt cttcatgaac gacttccttc 840 gagcgattca aatgttctac atagctctta ataccgcctt catagcagta ttcgtttctt 900 cgctctttgc cttcacgtaa gtcttcaatg atgatgttga cgccttttgt taagaaagct 960 aactcacgta cacggttagc aagtgtgtcg taatcaaatt caatggtttc agtgaaaatt 1020 tctggatctg gcacaaaatg agtggttgtc cctgttacat ctgtttcacc aatgatctct 1080 aaatctccaa ctggaacacc gcgtttgaat tgttgataat gaattttccc atcacggtat 1140 acagtcacgt ctaaggtcct agataacgca ttaacaacag atgcccctac gccatgcaaa 1200 ccgccagata ctttataacc gctgccgccg aatttcccac ctgcgtgcag aacggtcatg 1260 atgacttcaa tc 1272

Claims (13)

  1. 양파의 건조 스트레스 저감용 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P).
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 자이레이스(gyrase) 유전자 염기서열을 갖는 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P).
  3. 삭제
  4. 양파의 생육 증진용 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P).
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 자이레이스(gyrase) 유전자 염기서열을 갖는 바실러스 알티투디니스(Bacillus altitudinis) H5-9 균주(KACC 92279P).
  6. 삭제
  7. 제1 항 또는 제4 항에 따른 균주(KACC 92279P), 상기 균주의 배양액, 및 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 양파 건조 스트레스 저감 및 양파 생육 증진용 조성물.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 조성물은 양파 성장 조절제, 양파 성장 자극제 및 양파 영양제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는, 양파 건조 스트레스 저감 및 양파 생육 증진용 조성물.
  9. 제8 항에 따른 양파 건조 스트레스 저감 및 양파 생육 증진용 조성물을 양파, 양파 주변 영역, 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 양파 종자의 생육 증진 방법.
  10. 삭제
  11. 제1 항 또는 제4 항에 따른 균주, 상기 균주의 배양액, 및 이들의 혼합물 중 적어도 하나를 양파, 양파 모종 주변 영역, 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 양파의 건조 스트레스 저감 방법.
  12. 제7 항에 따른 양파 건조 스트레스 저감 및 양파 생육 증진용 조성물을 양파, 양파 모종 주변 영역, 또는 이들 모두에 처리하는 단계를 포함하는 양파의 건조 스트레스 저감 방법.

  13. 삭제
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