KR102464483B1

KR102464483B1 - Pharmaceutical composition for treating thrombosis or cancer using TRAF4 binding motif

Info

Publication number: KR102464483B1
Application number: KR1020170112535A
Authority: KR
Inventors: 박현호
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-04
Filing date: 2017-09-04
Publication date: 2022-11-09
Also published as: KR20190026154A

Abstract

본 발명은 TRAF4 결합 모티프를 이용한 혈전증 또는 암질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 GPIbβ 및 GPVI로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈소판 수용체 펩타이드의 유사 화합물로서, TRAF4 결합 모티프에 대해 경쟁적으로 결합하는 혈소판 수용체 펩타이드의 유사 화합물은 혈소판 수용체와 TRAF4 간의 결합을 억제하여 혈전증 치료제로 활용할 수 있고, TGF-β 수용체 펩타이드의 유사 화합물로서, TRAF4 결합 모티프에 대해 경쟁적으로 결합하는 TGF-β 수용체 펩타이드의 유사 화합물은 TGF-β 수용체와 TRAF4 간의 결합을 억제하여 암질환 치료제로 활용할 수 있다.The present invention relates to a composition for treating thrombosis or cancer disease using a TRAF4 binding motif, wherein the composition is a compound similar to any one or more platelet receptor peptides selected from the group consisting of GPIbβ and GPVI, which competitively binds to the TRAF4 binding motif. A similar compound of the platelet receptor peptide inhibits the binding between the platelet receptor and TRAF4 and can be utilized as a therapeutic agent for thrombosis. inhibits the binding between the TGF-β receptor and TRAF4 and can be used as a therapeutic agent for cancer diseases.

Description

TRAF4 결합 모티프를 이용한 혈전증 또는 암질환 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for treating thrombosis or cancer using TRAF4 binding motif}Pharmaceutical composition for treating thrombosis or cancer disease using TRAF4 binding motif {Pharmaceutical composition for treating thrombosis or cancer using TRAF4 binding motif}

본 발명은 TRAF4 결합 모티프를 이용한 혈전증 또는 암질환 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for treating thrombosis or cancer disease using a TRAF4 binding motif.

글리코프로테인(GP) Ib-IX-V 복합체와 GPVI은 2개의 중요한 혈소판 수용체로 손상된 혈관 벽에 초기 혈소판 협착을 유도하여 혈전 형성을 시작하고 이렇게 형성된 혈전은 뇌졸중 또는 심근경색과 같은 혈전증과 관련된다.Glycoprotein (GP) Ib-IX-V complex and GPVI are two important platelet receptors that induce early platelet stenosis in the damaged vessel wall to initiate thrombus formation, which is associated with thrombosis such as stroke or myocardial infarction.

GPVI (Glycoprotein VI)은 최초 콜라겐 수용체로 알려져 있으며, GP Ib-IX-V 복합체는 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor) 및 결합인자 XI(coagulation factor XI; FXI), 인자 XII, 트롬빈(thrombin), 및 P-셀렉틴을 포함한 다양한 리간드와 결합한다. 이와 같은 GP Ib-IX-V 복합체의 다양한 리간드의 존재는 상기 수용체 복합체가 다수의 신호 과정을 통하여 혈소판 기능을 결정하는 것을 의미한다.Glycoprotein VI (GPVI) is known as the first collagen receptor, and the GP Ib-IX-V complex contains von Willebrand factor (von Willebrand factor) and coagulation factor XI (FXI), factor XII, thrombin, and various ligands including P-selectin. The presence of various ligands of the GP Ib-IX-V complex means that the receptor complex determines platelet function through a number of signaling processes.

GPIbα (the major ligand-binding subunit), GPIbβ, GPIX, 및 GPV로 구성되어진 GP Ib-IX-V 복합체는 혈소판에서 두 번째로 많은 수용체로 다른 혈소판 수용체 GPVI와 물리적 및 기능적으로 연결된다.The GP Ib-IX-V complex composed of GPIbα (the major ligand-binding subunit), GPIbβ, GPIX, and GPV is the second most abundant receptor in platelets, physically and functionally linked to other platelet receptors GPVI.

종양 괴사 인자(TNF) 수용체 관련 인자 4(TRAF4)는 포유류에서 확인된 7개의 TRAF1~TRAF7 인자 중 하나로 생쥐에서 배아 발생, 특히, 중추신경계 및 말초신경계발생의 조절 인자로 확인되었으며, 기관 발달, 신경관 및 골격 형성과도 관련있으며, 많은 유형의 암의 개시 및 진행과 관련있는 것으로 보고되어 짐에 따라, TRAF4가 암치료를 위한 새로운 표적으로 제안될 수 있다. Tumor necrosis factor (TNF) receptor-related factor 4 (TRAF4) is one of seven TRAF1-TRAF7 factors identified in mammals, and has been identified as a regulator of embryonic development in mice, in particular, central and peripheral nervous system development, organ development, neural tube and skeletal formation, and as it has been reported to be associated with the initiation and progression of many types of cancer, TRAF4 may be proposed as a new target for cancer treatment.

다른 TRAF 패밀리들과 달리 TRAF4는 핵이행신호(nuclear localization signal; NLS)를 포함하고, TNFR2, CD30 및 CD40와 같은 대표적인 TRAF 결합 수용체와 상호작용하지 않는다. 이는 TRAF4가 전형적인 TRAF 패밀리들에 의해 유도되는 세포내 신호전달에 관여하지 않는 것을 의미한다.Unlike other TRAF families, TRAF4 contains a nuclear localization signal (NLS) and does not interact with representative TRAF-binding receptors such as TNFR2, CD30 and CD40. This means that TRAF4 is not involved in intracellular signaling induced by typical TRAF families.

한편, 활성산소종(ROS)의 생성은 혈소판 수용체의 특징 중 하나로, 특히 GPIb-IX-V 복합체 및 GPVI에 의해 매개되는 신호작용은 동맥 손상 부위에서 혈전증을 유도한다. On the other hand, generation of reactive oxygen species (ROS) is one of the characteristics of platelet receptors. In particular, signaling mediated by the GPIb-IX-V complex and GPVI induces thrombosis at the site of arterial damage.

최근 연구에 따르면, GPIb-IX-V 복합체와 GPVI 신호전달을 통한 혈전증 부위에서 혈소판에 의한 ROS 생성은 TRAF4와 GPIb-IX-V 복합체 및 GPVI 사이에서 직접적인 상호작용을 매개하는 것이 확인됨에 따라, 상기 상호작용의 분열은 지혈작용에 영향을 주지 않으면서 혈전증을 예방할 수 있는 항-혈전증 치료제 개발의 새로운 타겟이 될 수 있다.According to a recent study, ROS generation by platelets at the site of thrombosis through GPIb-IX-V complex and GPVI signaling mediates a direct interaction between TRAF4 and the GPIb-IX-V complex and GPVI. Interaction disruption could be a new target for the development of anti-thrombotic therapeutics that can prevent thrombosis without affecting hemostasis.

한국공개특허 제2015-0121345호(2015.10.29 공개)Korean Patent Publication No. 2015-0121345 (published on October 29, 2015)

본 발명의 목적은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 GPIbβ 또는 GPVI 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합에 있어서, 상기 TRAF4 TRAF 도메인의 결합 모티프를 확인하고, 상기 모티프에 경쟁적으로 결합하는 GPIbβ 또는 GPVI 혈소판 수용체 펩타이드의 유사 화합물을 이용한 혈소판 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.An object of the present invention is to identify the binding motif of the TRAF4 TRAF domain in the binding between the TRAF4 protein and the GPIbβ or GPVI platelet receptor mediated by the TRAF4 TRAF domain, and the GPIbβ or GPVI platelet receptor peptide that competitively binds to the motif. An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for platelet treatment using a similar compound.

또한, 본 발명의 다른 목적은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 TGF-β 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합에 있어서, 상기 TRAF4 TRAF 도메인의 결합 모티프를 확인하고, 상기 모티프에 경쟁적으로 결합하는 TGF-β 수용체 펩타이드의 유사 화합물을 이용한 항암제 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.In addition, another object of the present invention is to identify the binding motif of the TRAF4 TRAF domain in the binding between the TGF-β receptor and the TRAF4 protein mediated by the TRAF4 TRAF domain, and a TGF-β receptor peptide that competitively binds to the motif. An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for anticancer drug treatment using a similar compound of

상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 GPIbβ 및 GPVI로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합을 억제하는 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 혈전증 치료용 약학조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating thrombosis containing, as an active ingredient, a binding inhibitor that inhibits binding between any one or more platelet receptors selected from the group consisting of GPIbβ and GPVI and TRAF4 protein.

또한, 본 발명은 GPIbβ 혈소판 수용체 펩타이드 및 TRAF4 단백질 간의 복합체 형성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈전증 치료용 약학조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating thrombosis containing an inhibitor for inhibiting the complex formation between the GPIbβ platelet receptor peptide and the TRAF4 protein as an active ingredient.

또한, 본 발명은 TGF-β 수용체 및 TRAF4 단백질 간의 결합을 억제하는 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 약학조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer diseases containing a binding inhibitor for inhibiting the binding between the TGF-β receptor and the TRAF4 protein as an active ingredient.

본 발명에 따르면, GPIbβ 및 GPVI로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈소판 수용체 펩타이드의 유사 화합물로서, TRAF4 결합 모티프에 대해 경쟁적으로 결합하는 혈소판 수용체 펩타이드의 유사 화합물은 혈소판 수용체와 TRAF4 간의 결합을 억제하여 혈전증 치료제로 활용할 수 있고, TGF-β 수용체 펩타이드의 유사 화합물로서, TRAF4 결합 모티프에 대해 경쟁적으로 결합하는 TGF-β 수용체 펩타이드의 유사 화합물은 TGF-β 수용체와 TRAF4 간의 결합을 억제하여 암질환 치료제로 활용할 수 있다.According to the present invention, as a compound similar to any one or more platelet receptor peptides selected from the group consisting of GPIbβ and GPVI, the compound similar to a platelet receptor peptide that competitively binds to a TRAF4 binding motif inhibits the binding between the platelet receptor and TRAF4 to cause thrombosis. It can be utilized as a therapeutic agent, and as a compound similar to the TGF-β receptor peptide, a compound similar to the TGF-β receptor peptide that competitively binds to the TRAF4 binding motif inhibits the binding between the TGF-β receptor and TRAF4 and can be used as a therapeutic agent for cancer diseases. can

도 1은 두 개의 혈소판 수용체와 TRAF4 간의 상호작용을 확인한 결과로, 도
1a는 TRAF 패밀리의 도메인 범위를 나타낸 것이며, 도 1b는 TRAF-결합 수용체 및 이미 확인된 TRAF-결합 모티프를 나타낸 것이며, 도 1c는 다양한 수용체와 상호작용에 관여하는 TRAF1, 2 및 3의 보존된 아미노산 잔기를 나타낸 것으로, 상기 TRAF1, 2 및 3의 주요 스폿은 TRAF-결합 모티프와의 결합에 사용된다. TRAF4의 아미노산 잔기는 적색으로 표시되었으며, 보존되지 않는다. 도 1d는 이미 보고된 NOD2와 두 개의 혈소판 수용체에 대해 추정된 TRAF4 결합 영역을 나타내며, 도 1e 및 1f는 TRAF4 용액에 GPIbβ(e) 및 GPVI(f) 펩타이드를 적정하여 확인한 ITC 결과이며, 도 1g 및 1h는 고정화된 TRAF4에 결합하는 GPIbβ(g) 및 GPVI(h) 펩타이드의 SPR 특성을 확인한 결과로, 각 펩타이드(6.25 μM-100 μM)를 TRAF4가 결합된 센서칩에 적용하였으며, 데이터는 독립적으로 수행된 세 번의 실험에서 얻은 평균값으로 나타낸 결과이다.
도 2는 TRAF4/GPIbβ 복합체의 결정 구조를 확인한 결과로, 도 2a는 RTRAF4/GPIbβ 복합체의 6량체(비대칭 단위의 2 개의 삼량체)의 모식도로, 사슬 A, 사슬 B 및 사슬 C가 하나의 삼량체를 구성하고, 사슬 A, 사슬 B 및 사슬 C가 또 다른 삼량체를 구성하며, 적색 점의 원형으로 표시된 세 위치는 GPIbβ 펩타이드를 나타내고 검은색 점 원형으로 표시된 1 부분에서는 불명확한 펩티드 밀도가 확인된 위치를 나타낸다. 도 2b는 결정의 비대칭 단위에서 확인된 6량체 TRAF4/GPIbβ 복합체의 측면도를 나타낸 것으로, 가장 명확한 펩타이드 모델은 체인 A 위치에 검은 박스로 표시된 부분은 가장 명확한 펩타이드 모델을 나타낸다. 도 2c는 GPIbβ 펩타이드(적색 선)가 결합된 단량체 TRAF4(파랑색)의 표면도로, 사슬 A는 대표적인 단량체 분자로 사용되었다. 도 2d는 회색 그물망으로 나타낸 GPIbβ 펩타이드 주위의 1σ 수준 경계를 나타낸 밀도 지도이며 가상의 어닐링은 생략되었다.
도 3은 상세한 TRAF4-GPIbβ 상호작용 방식 및 TRAF4- 결합 모티프를 확인한 결과들로, 도 3a는 TRAF4 TRAF 도메인에 결합된 GPIbβ 펩타이드 경계를 근접 확인한 결과로, 사슬 A에 결합된 GPIbβ 펩타이드를 확인하였으며, GPIbβ 펩티드 상호 작용에 관여하는 TRAF4 잔기를 표시하고, H-결합을 검은색 점선으로 표시하였으며, GPIbβ 펩타이드의 아미노산 위치를 R(P_-1), L(P₀), R(P₁), A(P₂) 및 R(P₃)으로 나타내었으며, * 및 **은 각각 주요 및 소수의 소수성 주머니를 의미한다. 도 3b 및 3c는 중첩을 통하여 수용체-결합된 TRAF4(녹색)와 아포 TRAF4 (황색)를 구조적으로 비교한 결과로, 도 3b의 적색 원은 GPIbβ 펩타이드와의 결합시 구조적으로 움직이는 아미노산 잔기를 나타내며, 검은색 원은 GPIbβ 펩타이드 (c)와의 결합시 무질서한 루프 (β6-β7 연결 루프 : 아미노산 421-432)를 나타낸다. 도 3d는 TRAF4/GPIbβ 펩타이드 복합체의 표면 정전기를 나타낸 것으로, 파란색 원은 GPIbβ 혈소판 수용체의 세포외 도메인을 나타낸 것으로, TRAF4에 의해 인식된 세포 내에 위치한 GPIb β 혈소판 수용체의 C-말단 꼬리를 모식화하였으며, N-term 및 C-term은 각각 TRAF4의 N-말단 및 C-말단을 의미한다. 도 3e 및 3f는 중첩실험을 통하여 TRAF4 결합 수용체 펩타이드(회색 : 펩타이드 형태의 사슬 A, 청록색 : 사슬 A의 펩티드, 적색 : 사슬 C의 펩티드)를 구조적으로 비교한 결과로, 도 3e는 펩티드의 전반적인 주사슬 형태는 거의 동일한 것을 확인한 결과이며, 도 3f는 P_-1, P₀ 및 P₂ 위치에서 측쇄 구조 및 주쇄 구조의 구조적으로 보존된 것을 확인한 결과이다. 도 3g는 TRAF4 / GPIbβ 수용체 펩타이드 복합체와 다른 TRAF / 수용체 펩타이드 복합체를 구조적으로 비교한 결과로, TRAF6 / RANK 복합체 및 TRAF4 / GPIbβ 복합체는 중첩된 TRAF2 / TNFR2 복합체를 포함하는 것을 확인한 결과이다. 도 3h는 TRAF4 / GPIb β 수용체 펩티드 복합체의 결정학적 패킹을 확인한 결과로, 비대칭 단위로 형성된 2개의 삼량체 분자는 청색으로 나타내었으며, 다른 회색 분자는 대칭 분자이다. 도 3i는 사슬 B의 5개의 C- 말단 잔기와 대칭 분자 사이의 상호 작용을 나타낸 것이며, 도 3j는 사슬 B(청색) 및 대칭 분자(회색)의 5개의 C-말단 잔기 사이에 형성된 결합 인터페이스를 확대한 것으로, 사슬 B상의 P_-2, P_-1, P₀ 및 P₁ 위치와 대칭형 분자상의 상호작용 잔기를 나타낸 것이다. 도 3k는 정렬 및 구조적으로 확인된 모티프을 이용한 서열 비교를 통하여 확인된 추정 TRAF4-결합 모티프를 나타낸 결과로, 적색과 청색은 각각 완전하거나 부분적으로 보존된 잔기를 나타낸다. 도 3l은 고정된 TRAF4에 결합하는 것으로 추정되는 TRAF4-결합 모티프를 함유하는 펩타이드의 SPR 특징을 확인한 결과로, 100 μM의 펩타이드를 TRAF4 결합 센서 칩에 적용하고, 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균값으로 나타내었다.
도 4는 구조기반 가상 스크리닝을 통한 화합물 스크리닝 모식도이다.
도 5는 TRAF4 단백질을 타겟으로 하는 결합억제 화합물들에 의한 활성산소생성 억제 효과를 확인한 결과로, chem #1 내지 chem #32는 각각 화합물 1 내지 화합물 32이다.
도 6은 활성산소종 생성 억제효과를 나타내는 화합물 9의 결합을 확인한 구조기반 가상 스크리닝 결과와 1, 5 및 10 μM 농도로 처리된 화합물 9의 혈소판 응집 저해 효과를 확인한 결과이다.1 is a result of confirming the interaction between two platelet receptors and TRAF4,
1a shows the domain range of the TRAF family, FIG. 1b shows TRAF-binding receptors and previously identified TRAF-binding motifs, and FIG. 1c shows conserved amino acids of TRAF1, 2 and 3 involved in interactions with various receptors. As residues are shown, the main spots of TRAF1, 2 and 3 are used for binding to the TRAF-binding motif. Amino acid residues of TRAF4 are shown in red and are not conserved. Figure 1d shows the previously reported NOD2 and the estimated TRAF4 binding region for two platelet receptors, Figures 1e and 1f are ITC results confirmed by titration of GPIbβ(e) and GPVI(f) peptides in TRAF4 solution, Figure 1g and 1h is the result of confirming the SPR characteristics of the GPIbβ(g) and GPVI(h) peptides that bind to immobilized TRAF4. Each peptide (6.25 μM-100 μM) was applied to a TRAF4-coupled sensor chip, and the data were independently The results are expressed as average values obtained from three experiments performed with
2 is a result of confirming the crystal structure of the TRAF4/GPIbβ complex, and FIG. 2a is a schematic diagram of a hexamer (two trimers of asymmetric units) of the RTRAF4/GPIbβ complex, in which Chain A, Chain B and Chain C are one trimer. constituting a sieve, chain A, chain B and chain C make up another trimer, the three positions indicated by the circles in red dot represent the GPIbβ peptide, and in part 1 indicated by the circles in black dots, unclear peptide density is confirmed indicates the location. Figure 2b shows a side view of the hexameric TRAF4/GPIbβ complex identified in the asymmetric unit of the crystal. The clearest peptide model is the part marked with a black box at the chain A position, the clearest peptide model. Fig. 2c is a surface view of monomer TRAF4 (blue) to which GPIbβ peptide (red line) is bound, and chain A is used as a representative monomer molecule. Figure 2d is a density map showing the 1σ level boundary around the GPIbβ peptide shown as a gray mesh, with hypothetical annealing omitted.
3 is a result of confirming the detailed TRAF4-GPIbβ interaction mode and TRAF4-binding motif. The TRAF4 residues involved in the GPIbβ peptide interaction are indicated, the H-bond is indicated by a black dotted line, and the amino acid positions of the GPIbβ peptide are R(P ₋₁ ), L(P ₀ ), R(P ₁ ), A (P ₂ ) and R(P ₃ ), where * and ** denote major and minor hydrophobic pockets, respectively. 3b and 3c are results of structural comparison of receptor-bound TRAF4 (green) and apo TRAF4 (yellow) through overlap. Black circles indicate disordered loops (β6-β7 linked loop: amino acids 421-432) upon binding to the GPIbβ peptide (c). Figure 3d shows the surface electrostatics of the TRAF4/GPIbβ peptide complex, the blue circle shows the extracellular domain of the GPIbβ platelet receptor, and the C-terminal tail of the GPIbβ platelet receptor located within the cell recognized by TRAF4 was modeled. , N-term and C-term refer to the N-terminus and C-terminus of TRAF4, respectively. Figures 3e and 3f are results of structural comparison of TRAF4 binding receptor peptides (grey: peptide chain A, cyan: chain A peptide, red: chain C peptide) through an overlap experiment. The main chain form is the result of confirming that it is almost the same, and FIG. 3f is a result confirming that the side chain structure and the main chain structure are structurally preserved at P _-1 , P ₀ and P ₂ positions. Figure 3g is a result of structural comparison of the TRAF4 / GPIbβ receptor peptide complex and other TRAF / receptor peptide complexes, TRAF6 / RANK complex and TRAF4 / GPIbβ complex is the result of confirming that the overlapping TRAF2 / TNFR2 complex. Figure 3h is the result of confirming the crystallographic packing of the TRAF4 / GPIb β receptor peptide complex, two trimeric molecules formed as asymmetric units are shown in blue, and the other gray molecules are symmetric molecules. Figure 3i shows the interaction between the five C-terminal residues of chain B and the symmetric molecule, and Figure 3j shows the binding interface formed between the five C-terminal residues of chain B (blue) and the symmetric molecule (grey). An enlarged view shows the P _-2 , P _-1 , P ₀ and P ₁ positions on chain B and the interaction residues on the symmetric molecule. Figure 3k shows the results of putative TRAF4-binding motifs identified through alignment and sequence comparison using the structurally identified motifs. Red and blue colors indicate fully or partially conserved residues, respectively. Figure 3l is the result of confirming the SPR characteristics of the peptide containing the TRAF4-binding motif presumed to bind to immobilized TRAF4. 100 μM of the peptide is applied to the TRAF4-binding sensor chip, and the data is the average value of three independent experiments. indicated as
4 is a schematic diagram of compound screening through structure-based virtual screening.
5 is a result of confirming the inhibitory effect of active oxygen production by the binding inhibitory compounds targeting the TRAF4 protein, chem #1 to chem #32 are compounds 1 to 32, respectively.
6 is a structure-based virtual screening result confirming the binding of compound 9, which exhibits an inhibitory effect on the generation of reactive oxygen species, and the results of confirming the platelet aggregation inhibitory effect of compound 9 treated with concentrations of 1, 5 and 10 μM.

본 발명은 GPIbβ 및 GPVI로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합을 억제하는 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 혈전증 치료용 약학조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for treating thrombosis containing, as an active ingredient, a binding inhibitor for inhibiting binding between any one or more platelet receptors selected from the group consisting of GPIbβ and GPVI and TRAF4 protein.

상기 결합은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 것일 수 있다.The binding may be mediated by the TRAF4 TRAF domain.

상기 TRAF4 TRAF 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프를 포함할 수 있다.The TRAF4 TRAF domain may include a TRAF4 binding motif consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

상기 TRAF4 결합 모티프는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPIbβ 혈소판 수용체 내 Arg-Leu-Arg-Ala 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPVI 혈소판 수용체 내 Arg-Leu-Arg-His와 결합하는 것일 수 있다.The TRAF4 binding motif binds to Arg-Leu-Arg-Ala in the GPIbβ platelet receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or Arg-Leu-Arg-His in the GPVI platelet receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 may be doing

상기 결합억제제는 GPIbβ 및 GPVI로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈소판 수용체 펩타이드의 유사 화합물로서, TRAF4 결합 모티프에 대해 경쟁적으로 결합하는 혈소판 수용체 펩타이드의 유사 화합물일 수 있다.The binding inhibitor is a compound similar to any one or more platelet receptor peptides selected from the group consisting of GPIbβ and GPVI, and may be a platelet receptor peptide analogue compound that competitively binds to a TRAF4 binding motif.

상기 결합억제제는 하기 화학식 1 내지 화학식 33으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.The binding inhibitor may be any one selected from the group consisting of the following Chemical Formulas 1 to 33, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 1][Formula 1]

[화학식 2][Formula 2]

[화학식 3][Formula 3]

[화학식 4][Formula 4]

[화학식 5][Formula 5]

[화학식 6][Formula 6]

[화학식 7][Formula 7]

[화학식 8][Formula 8]

[화학식 9][Formula 9]

[화학식 10][Formula 10]

[화학식 11][Formula 11]

[화학식 12][Formula 12]

[화학식 13][Formula 13]

[화학식 14][Formula 14]

[화학식 15][Formula 15]

[화학식 16][Formula 16]

[화학식 17][Formula 17]

[화학식 18][Formula 18]

[화학식 19][Formula 19]

[화학식 20][Formula 20]

[화학식 21][Formula 21]

[화학식 22][Formula 22]

[화학식 23][Formula 23]

[화학식 24][Formula 24]

[화학식 25][Formula 25]

[화학식 26][Formula 26]

[화학식 27][Formula 27]

[화학식 28][Formula 28]

[화학식 29][Formula 29]

[화학식 30][Formula 30]

[화학식 31][Formula 31]

[화학식 32][Formula 32]

[화학식 33][Formula 33]

상기 혈전증은 급성 심근 경색증, 뇌졸증, 폐 혈전증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.The thrombosis may be selected from the group consisting of acute myocardial infarction, stroke, pulmonary thrombosis, acute peripheral arterial occlusion, deep vein thrombosis, portal vein thrombosis, acute renal vein occlusion, cerebral sinus thrombosis and central retinal vein occlusion.

본 발명은 GPIbβ 혈소판 수용체 펩타이드 및 TRAF4 단백질 간의 복합체 형성을 억제하는 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈전증 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.The present invention may provide a pharmaceutical composition for treating thrombosis containing an inhibitor for inhibiting the formation of a complex between the GPIbβ platelet receptor peptide and the TRAF4 protein as an active ingredient.

상기 복합체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPIbβ 혈소판 수용체의 P_-1 위치의 Arg(R) 및 P₃위치의 Arg(R)이 TRAF4의 E406 및 N355 곁사슬과 각각 수소결합을 형성하고, P₀ 위치의 Leu(L)이 TRAF4의 F408, Y436 및 F434 곁사슬과 P₂ 위치의 Ala(A)이 TRAF4의 W414 및 F434와 상호작용하여 복합체를 형성할 수 있다.In the complex, Arg(R) at the P _-1 position and Arg(R) at the P ₃ position of the GPIbβ platelet receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 form hydrogen bonds with the E406 and N355 side chains of TRAF4, respectively, Leu (L) at the P ₀ position can interact with the F408, Y436 and F434 side chains of TRAF4 and Ala (A) at the P ₂ position with W414 and F434 of TRAF4 to form a complex.

상기 억제제는 GPIbβ 혈소판 수용체 펩타이드의 유사 화합물로서, TRAF4 단백질에 대해 경쟁적으로 결합하는 GPIbβ 혈소판 수용체 펩타이드의 유사 화합물일 수 있다.The inhibitor is a GPIbβ platelet receptor peptide analog compound, and may be a GPIbβ platelet receptor peptide analog compound that competitively binds to TRAF4 protein.

상기 억제제는 하기 화학식 1 내지 화학식 33으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.The inhibitor may be any one selected from the group consisting of the following Chemical Formulas 1 to 33, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 1][Formula 1]

[화학식 2][Formula 2]

[화학식 3][Formula 3]

[화학식 4][Formula 4]

[화학식 5][Formula 5]

[화학식 6][Formula 6]

[화학식 7][Formula 7]

[화학식 8][Formula 8]

[화학식 9][Formula 9]

[화학식 10][Formula 10]

[화학식 11][Formula 11]

[화학식 12][Formula 12]

[화학식 13][Formula 13]

[화학식 14][Formula 14]

[화학식 15][Formula 15]

[화학식 16][Formula 16]

[화학식 17][Formula 17]

[화학식 18][Formula 18]

[화학식 19][Formula 19]

[화학식 20][Formula 20]

[화학식 21][Formula 21]

[화학식 22][Formula 22]

[화학식 23][Formula 23]

[화학식 24][Formula 24]

[화학식 25][Formula 25]

[화학식 26][Formula 26]

[화학식 27][Formula 27]

[화학식 28][Formula 28]

[화학식 29][Formula 29]

[화학식 30][Formula 30]

[화학식 31][Formula 31]

[화학식 32][Formula 32]

[화학식 33][Formula 33]

또한, 본 발명은 TGF-β 수용체 및 TRAF4 단백질 간의 결합을 억제하는 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.In addition, the present invention can provide a pharmaceutical composition for treating cancer diseases containing a binding inhibitor for inhibiting the binding between the TGF-β receptor and the TRAF4 protein as an active ingredient.

상기 TGF-β 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 것일 수 있다.The binding between the TGF-β receptor and the TRAF4 protein may be mediated by the TRAF4 TRAF domain.

상기 TRAF4 TRAF 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프를 포함하는 것일 수 있다.The TRAF4 TRAF domain may include a TRAF4 binding motif consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

상기 TRAF4 결합 모티프는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TGF-β 수용체 내 Arg-Leu-Thr-Ala와 결합하는 것일 수 있다.The TRAF4 binding motif may bind to Arg-Leu-Thr-Ala in the TGF-β receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.

상기 결합억제제는 TGF-β 수용체 펩타이드의 유사 화합물로서, TRAF4 단백질에 대해 경쟁적으로 결합하는 TGF-β 수용체의 유사 화합물일 수 있다.The binding inhibitor is a TGF-β receptor peptide-like compound, and may be a TGF-β receptor-like compound that competitively binds to the TRAF4 protein.

상기 암질환은 대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.The cancer disease may be selected from the group consisting of colon cancer, stomach cancer, prostate cancer, breast cancer, kidney cancer, liver cancer, brain tumor, lung cancer, uterine cancer, colon cancer, bladder cancer and pancreatic cancer.

상기 화학식 1 내지 화학식 33으로 이루어진 군에서 선택된 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염은 약학적으로 허용가능한 염기성 염 또는 산성 염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있다. 염기성 염으로는 유기염기염, 무기염기염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있으며, 예를 들어 나트The compound selected from the group consisting of Chemical Formulas 1 to 33 may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and the salt may be used in the form of any one of a pharmaceutically acceptable basic salt or an acidic salt. As the basic salt, it can be used in the form of any one of an organic base salt and an inorganic base salt, for example, nat

륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염 및 아미늄(aminium)염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염, 피리디늄염 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.A lithium salt, a potassium salt, a calcium salt, a lithium salt, a magnesium salt, a cesium salt, an aminium salt, an ammonium salt, a triethylamine salt, a pyridinium salt, etc. can be used, but it is not limited to this.

또한, 산성 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 무기산으로는 염산, 유기산으로는 메탄설폰산을 사용할 수 있다.In addition, as the acid salt, an acid addition salt formed by a free acid is useful. As free acids, inorganic acids and organic acids can be used. As inorganic acids, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, sulfurous acid, phosphoric acid, etc. can be used. As organic acids, citric acid, acetic acid, maleic acid, fumaric acid, glucoic acid, methanesulfonic acid, etc. , Benzenesulfonic acid, camphorsulfonic acid, oxalic acid, malonic acid, glutaric acid, acetic acid, glycolic acid, succinic acid, tartaric acid, 4-toluenesulfonic acid, galacturonic acid, embonic acid, glutamic acid, citric acid, aspartic acid etc. can be used. Preferably, hydrochloric acid may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid may be used as the organic acid.

또한, 상기 화학식 1 내지 화학식 33으로 이루어진 군에서 선택된 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.In addition, the compound selected from the group consisting of Chemical Formulas 1 to 33 includes all salts, hydrates and solvates that can be prepared by conventional methods as well as pharmaceutically acceptable salts.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기염기를 가하거나 무기염기의 염기 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 또는 이 혼합물에서 용매나 과량의 염기를 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.The addition salt according to the present invention can be prepared by a conventional method, for example, by dissolving the compound of Formula 1 in a water-miscible organic solvent, such as acetone, methanol, ethanol, or acetonitrile, and adding an excess of an organic base; It can be prepared by precipitation or crystallization after adding an aqueous base solution of an inorganic base. Alternatively, an addition salt may be obtained by evaporating the solvent or excess base from the mixture and drying, or it may be prepared by suction filtration of the precipitated salt.

본 발명에 따른 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 외용제, 경구제, 좌제, 주사제 또는 비강분무제로 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention can use any one formulation selected from the group consisting of injections, granules, powders, tablets, pills, capsules, suppositories, gels, suspensions, emulsions, drops or liquids according to a conventional method. and, more preferably, it may be used as an external preparation, an oral preparation, a suppository, an injection, or a nasal spray.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.In addition, suitable carriers, excipients, disintegrants, sweeteners, coating agents, swelling agents, lubricants, lubricants, flavoring agents, antioxidants, buffers, bacteriostats, diluents, dispersants, and interfacial agents commonly used in the preparation of the pharmaceutical composition according to the present invention It may further include one or more additives selected from the group consisting of an activator, a binder and a lubricant.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.Specifically, carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil can be used, and solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, and capsules. agent and the like, and these solid preparations may be prepared by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like in the composition. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc can also be used. Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, and the like, and various excipients, for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, may be included. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories, and the like. Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As a base material for the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.

본 발명에 따른 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention can be administered via conventional intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, transdermal, intranasal, inhalation, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal routes. manner can be administered to the subject.

상기 화학식 1 내지 33으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.A preferred dosage of the compound represented by Formulas 1 to 33 or a pharmaceutically acceptable salt thereof may vary depending on the subject's condition and weight, the type and extent of disease, drug form, administration route and period, and may be appropriately determined by those skilled in the art. can be selected. According to an embodiment of the present invention, although not limited thereto, the daily dose may be 0.01 to 200 mg/kg, specifically 0.1 to 200 mg/kg, and more specifically 0.1 to 100 mg/kg. Administration may be administered once a day or may be administered in several divided doses, thereby not limiting the scope of the present invention.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the 'subject' may be a mammal including a human, but is not limited to these examples.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, to help the understanding of the present invention, examples will be described in detail. However, the following examples are merely illustrative of the content of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those of ordinary skill in the art.

<실시예 1> TRAF4와 혈소판 수용체의 결합 확인<Example 1> Confirmation of binding of TRAF4 and platelet receptor

1. 펩타이드 합성1. Peptide Synthesis

하기와 같은 8개의 펩타이드를 합성하였다.Eight peptides were synthesized as follows.

GPIbβ (RRLRARARARA; 서열번호 2), GPVI (KRLRHRGRAVQ); 서열번호 3), GPIbβ-5 (RLRAR), TGFBR1 (ARLTALRIKK; 서열번호 4), TGFBR2 (DRLSGRSCSE), TGFBR2’ (ARLTAQCVA), NOD2 (GPPQKSPATLGLEEL) 및 NOD2’ (ERLARKA).GPIbβ (RRLRARARARA; SEQ ID NO: 2), GPVI (KRLRHRGRAVQ); SEQ ID NO:3), GPIbβ-5 (RLRAR), TGFBR1 (ARLTALRIKK; SEQ ID NO:4), TGFBR2 (DRLSGRSCSE), TGFBR2′ (ARLTAQCVA), NOD2 (GPPQKSPATLGLEEL) and NOD2′ (ERLARKA).

2. 단백질 발현 및 정제2. Protein Expression and Purification

TRAF4 TRAF 도메인(아미노산 290-470)을 20℃에서 하룻밤 동안 E. coli BL21 (DE3)에 발현시켰다. TRAF4 The TRAF domain (amino acids 290-470) was expressed in E. coli BL21 (DE3) overnight at 20°C.

니켈 친화력 및 Superdex 200 gel filtration column 10/30 (GE healthcare)를 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피로 카복실 말단 His-tag가 포함된 단백질을 정제하였다.The protein containing the carboxyl-terminal His-tag was purified by nickel affinity and size exclusion chromatography using Superdex 200 gel filtration column 10/30 (GE healthcare).

구조 분석을 위하여 TRAF4를 9-10 mg/ml로 농축하였으며, QuikChangeTM kit (Stratagene)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 부위 특이적 돌연변이를 유도하였다.For structural analysis, TRAF4 was concentrated to 9-10 mg/ml, and site-specific mutations were induced using the QuikChangeTM kit (Stratagene) according to the manufacturer's instructions.

시퀀싱을 수행하여 돌연변이 생성을 확인하고, 상기 과정과 동일한 방법으로 돌연변이 단백질을 발현시키고 정제하였다.Sequencing was performed to confirm mutagenesis, and the mutant protein was expressed and purified in the same manner as in the above procedure.

3. 등온적정형열량계(Isothermal titration calorimetry; ITC)3. Isothermal titration calorimetry (ITC)

NanoITC(TA Instruments)를 이용하여 등온적정형열량계(ITC) 실험을 수행하였다.Isothermal titration calorimetry (ITC) experiments were performed using NanoITC (TA Instruments).

TRAF4 TRAF 도메인을 PBS 완충용액에 투석하고, GPIbβ 펩타이드(RRLRARARARA)가 포함된 8개의 동결건조된 펩타이드를 동일한 완충용액에 용해시켜 열의 희석값을 최소화하였다.The TRAF4 TRAF domain was dialyzed in PBS buffer, and eight lyophilized peptides containing the GPIbβ peptide (RRLRARARARA) were dissolved in the same buffer to minimize the dilution value of heat.

적정 전에 단백질 시료 및 펩타이드를 4℃에서 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. Before titration, protein samples and peptides were centrifuged at 13,000 rpm at 4° C. for 5 minutes to remove precipitates.

ITC에서 점진적 주입을 위해, 1 mM 농축된 펩타이드 용액 2μL를 TRAF4 TRAF 도메인이 함유된 샘플 세포 190 μL를 포함하는 샘플 세포에 ~20 μM 농도로 주입하였다. 모든 적정은 15℃에서 160초 간격으로 25번 주입되었다.For gradual injection in ITC, 2 μL of 1 mM concentrated peptide solution was injected at a concentration of ~20 μM into sample cells containing 190 μL of sample cells containing TRAF4 TRAF domain. All titrations were injected 25 times at 15°C with 160 sec intervals.

각 적정 피크하의 면적을 적분하고, 주입 횟수에 대해 플롯팅한 후, TA 기기의 소프트웨어를 이용하여 단일-사이트 독립 결합 모델에 적용하였다.The area under each titration peak was integrated, plotted against the number of injections, and then applied to the single-site independent binding model using the software of the TA instrument.

실험 결과들은 TRAF4 TRAF 도메인이 없는 완충액에 펩타이드를 주입하여 얻은 기준 값을 제외시켰다.Experimental results excluded the reference value obtained by injecting the peptide into a buffer without TRAF4 TRAF domain.

4. 표면 플라스몬 공명 (Surface plasmon resonance; SPR) 분석4. Surface plasmon resonance (SPR) analysis

펩타이드와 TRAF4 사이의 물리적 상호작용을 확인하기 위해, 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 수행하였다.To confirm the physical interaction between the peptide and TRAF4, surface plasmon resonance (SPR) analysis was performed.

6xHis-tag from Biacore T200 (GE Healthcare)를 이용하여 TRAF4를 NTA 센서 칩 위에 고정하였다. 먼저, 센서 칩 표면에 100 mM 니켈을 주입하여 코팅하였다. 그 후, PBS를 이용하여 100 μg/mL 농도로 희석된 TRAF4를 10 μL/min 유속으로 1분간 주입하여 NTA 칩 표면에 일렬로 고정화시켰다.TRAF4 was immobilized on the NTA sensor chip using 6xHis-tag from Biacore T200 (GE Healthcare). First, 100 mM nickel was injected and coated on the surface of the sensor chip. Thereafter, TRAF4 diluted to a concentration of 100 μg/mL using PBS was injected for 1 minute at a flow rate of 10 μL/min to immobilize in a line on the surface of the NTA chip.

안정화 후 약 3000 RU (Response Unit)로 확인되었다.After stabilization, it was confirmed to be about 3000 RU (Response Unit).

펩타이드의 농도 범위가 6.25 μM에서 100 μM 되도록 PBS에 희석하여 준비하고, 30 μL/min 유속으로 1분간 유량채널에 주입하고 300초의 해리 시간 후 EDTA 및 구아니딘 HCl의 혼합물로 재생시켰다.It was prepared by diluting in PBS so that the concentration range of the peptide was 6.25 μM to 100 μM, injected into the flow channel for 1 minute at a flow rate of 30 μL/min, and regenerated with a mixture of EDTA and guanidine HCl after a dissociation time of 300 seconds.

미가공 센서 그람(sensorgrams)은 기준 유동 채널 및 블랭크 주입으로부터 감산 반응을 수행하여 이중 소거하였다.Raw sensorgrams were double erased by performing a subtraction reaction from the reference flow channel and blank injection.

5. 결정화, 펩타이드 침지 및 데이터 수집5. Crystallization, Peptide Immersion and Data Acquisition

펩타이드 침지를 위한 TRAF4 TRAF의 결정화를 TRAF4의 구조 연구를 위해 사전에 확인된 조건을 이용하여 행잉 드롭 증기 확산법(hanging drop vapor-diffusion method)으로 20℃에서 수행하였다. TRAF4 for peptide immersion Crystallization of TRAF was performed at 20°C by a hanging drop vapor-diffusion method using conditions previously identified for structural study of TRAF4.

X-선 회절법 연구를 위한 최종 결정을 단백질 용액 (9-10 mg/mL protein in 20 mM Tris-HCl at pH 8.0 and 150 mM NaCl) 1 μL, 0.14 M 마그네슘 포름산염 디하이드레이트가 포함된 저장액 1 μL 및 저장액의 0.4 ml에 대한 13% 폴리에틸렌 글리콜 3350를 포함하는 혼합액을 평형화하여 플레이트상에서 성장시켰다. Final crystals for X-ray diffraction studies were prepared in stock solution containing 1 µL of protein solution (9-10 mg/mL protein in 20 mM Tris-HCl at pH 8.0 and 150 mM NaCl), 0.14 M magnesium formate dihydrate. A mixture containing 13% polyethylene glycol 3350 for 1 μL and 0.4 ml of stock solution was equilibrated and grown on a plate.

결정은 0.1 × 0.2 × 0.2 mm의 최대 면적으로 3일간 성장시켰다.Crystals were grown for 3 days with a maximum area of 0.1 × 0.2 × 0.2 mm.

성장시킨 결정을 100 μM GPIbβ 펩타이드가 포함된 완충용액에 24시간 동안 침지시키고 액체 질소로 냉각시켰다.The grown crystals were immersed in a buffer solution containing 100 μM GPIbβ peptide for 24 hours and cooled with liquid nitrogen.

포항가속기연구소(Pohang Accelerator Laboratory; PAL)의 SB-II (5C) 빔라인으로 회절 데이터를 수집하고, HKL200026를 이용하여 데이터 가공 및 스케일링을 수행하였다.Diffraction data were collected with the SB-II (5C) beamline of Pohang Accelerator Laboratory (PAL), and data processing and scaling were performed using HKL200026.

6. 6. in vitroin vitro 에서 TRAF4와 혈소판 수용체 간의 결합 확인Confirmation of binding between TRAF4 and platelet receptors in

TRAF 패밀리의 중요한 기능은 다양한 신호전달이므로, 이들 단백질의 기능적, 구조적 및 생화학적 분석은 주요 초점이 되어왔다.As important functions of the TRAF family are diverse signaling, the functional, structural and biochemical analysis of these proteins has been a major focus.

집중적인 연구를 통하여 TRAF7을 제외한 TRAF 패밀리는 도 1a와 같이 C-말단에 보존된 TRAF 도메인을 포함하고 있는 것이 밝혀졌으며, 상기 도메인은 상부 수용체와 하부 효과기와 상호작용을 매개한다.Through intensive studies, it was found that the TRAF family except for TRAF7 contains a TRAF domain conserved at the C-terminus as shown in FIG. 1a, which mediates interactions with upstream receptors and downstream effectors.

TRAF 도메인의 구조적 유사성에도 불구하고 서로 다른 TRAF 단백질의 각 도메인은 상부 수용기와 특이적으로 상호작용한다.Despite the structural similarity of TRAF domains, each domain of different TRAF proteins specifically interacts with upstream receptors.

일 예로, 도 1b와 같이 TRAF6의 TRAF 도메인은 consensus 결합 모티프인 PxExxZ (Z: acidic or aromatic residues)와 특이적으로 결합하고 TRAF1, 2, 3 및 5 는 Px(Q/E)E, Px(Q/E)xxD 및 Px(Q/E)xT를 포함한 다른 결합 모티프를 인식한다.For example, as shown in FIG. 1b, the TRAF domain of TRAF6 specifically binds to a consensus binding motif, PxExxZ (Z: acidic or aromatic residues), and TRAF1, 2, 3 and 5 are Px(Q/E)E, Px(Q). Recognizes other binding motifs including /E)xxD and Px(Q/E)xT.

최근에 TRAF4 TRAF 도메인 구조가 결정되었으나, TRAF4가 제한된 상호작용 인터페이스를 이용하여 다양한 수용체를 수용하는 방법에 대해서는 전혀 확인되지 않았다.Recently, the structure of the TRAF4 TRAF domain has been determined, but how TRAF4 accommodates a variety of receptors using a restricted interaction interface has not been identified.

흥미롭게도, 다른 TRAF 패밀리 구성원과의 서열 비교를 통하여 도 1c와 같이 TRAF4에는 수용체 상호작용 핫 스팟이 보존되지 않는 것이 확인되었다.Interestingly, through sequence comparison with other TRAF family members, it was confirmed that receptor interaction hot spots were not conserved in TRAF4 as shown in FIG. 1c .

상기 결과는 TRAF4가 다른 수용체와 결합하기 위해 새로운 상호작용 방식을 사용하는 것을 의미함에 따라, TRAF4 상호작용 수용체 및 TRAF4에 의해 매개되는 신호전달 사건을 확인한 연구들을 기초로, NOD2 및 두 개의 혈소판 수용체 GPIbβ와 GPVI를 후보 수용체를 확인하였다.As these results indicate that TRAF4 uses a novel interaction mode to bind to other receptors, NOD2 and two platelet receptors GPIbβ and GPVI identified candidate receptors.

그 결과, 도 1d와 같이 NOD2에 추정되는 TRAF4 상호작용 영역은 전형적인 TRAF 결합 모티프와 유사한 모티프(PxQxS)를 포함하며, TRAF4 결합 영역으로 맵핑된 두 개의 혈소판 수용체의 양성 전하를 띠는 영역에는 알려지지 않은 TRAF 결합 모티프가 포함되지 않는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 1d , the TRAF4 interaction region presumed to NOD2 contains a motif (PxQxS) similar to a typical TRAF binding motif, and the positively charged region of the two platelet receptors mapped to the TRAF4 binding region is unknown. It was confirmed that the TRAF binding motif was not included.

이에 따라, TRAF4에 의한 수용체 인식의 분자 메커니즘과 이를 이용한 치료방법을 개발하기 위해 몇 개의 알려진 수용체를 가진 TRAF4의 구조연구를 수행하였다.Accordingly, in order to develop a molecular mechanism of receptor recognition by TRAF4 and a treatment method using the same, structural studies of TRAF4 with several known receptors were conducted.

먼저, TRAF4와 NOD2 및 두 개의 혈소판 수용체와의 상호작용이 확인됨에 따라, 이전 연구를 기초로 수용체 펩타이드를 합성하고, TRAF4와 하기 수용체 펩타이드 사이의 상호작용을 표면 플라스몰 공명(SPR)을 이용하여 정량적으로 분석하였다: NOD2 및 두 혈소판 수용체, NOD2 (GPPQKSPATLGLEEL), GPIbβ (RRLRARARARA) 및 GPIV (KRLRHRGRAVQ) 사전 상호작용 연구로 in vitro에서 50 μM로 농도 고정된 3가지 펩타이드와 TRAF4의 상호작용을 확인하였다.First, as the interaction between TRAF4 and NOD2 and two platelet receptors was confirmed, a receptor peptide was synthesized based on previous studies, and the interaction between TRAF4 and the following receptor peptide was investigated using surface plasmol resonance (SPR). Quantitatively analyzed: NOD2 and two platelet receptors, NOD2 (GPPQKSPATLGLEEL), GPIbβ (RRLRARARARA), and GPIV (KRLRHRGRAVQ), the interaction of TRAF4 with three peptides fixed at a concentration of 50 μM in vitro was confirmed by a prior interaction study. .

초기 스크리닝 결과, GPIbβ와 GPIV는 TRAF4와 상호작용하는 것이 확인된 반면, NOD2는 상호작용하지 않는 것을 확인하였다.As a result of the initial screening, it was confirmed that GPIbβ and GPIV interact with TRAF4, whereas NOD2 does not.

상기 사전 결합 데이터를 기초로 TRAF4와 혈소판 수용체 GPIbβ 및 GPIV 사이의 상호작용을 등온적정형열량계(ITC) 및 표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용하여 자세히 분석하였다.Based on the pre-binding data, the interaction between TRAF4 and the platelet receptors GPIbβ and GPIV was analyzed in detail using isothermal titration calorimetry (ITC) and surface plasmon resonance (SPR).

GPIbβ 및 GPIV 펩타이드(1 mM)를 각각 TRAF4 20 μM에 적정하고 증분식 ITC 실험을 위해 25번 주입하였다.GPIbβ and GPIV peptides (1 mM) were each titrated to 20 μM of TRAF4 and injected 25 times for incremental ITC experiments.

그 결과, 도 1e 및 1f와 같이 두 펩타이드 모두 이상적인 상호작용 값에 해당하는 방출열이 나타났으며, 상기 결과로부터 상호작용에서 뚜렷한 협력 없이 단일 유형의 결합 사이트가 존재하는 것이 확인되었다.As a result, as shown in FIGS. 1E and 1F, both peptides exhibited heat of emission corresponding to ideal interaction values, and from the results, it was confirmed that a single type of binding site existed without apparent cooperation in the interaction.

또한, 결합 펩타이드 없이 수행된 대조군 적정을 측정하고 각 실험 적정 곡선에서 감하였다.In addition, control titrations performed without binding peptide were measured and subtracted from each experimental titration curve.

그 결과, GPIbβ 및 GPIV의 결합계수는 각각 2.167 × 10⁴ M^-1및 2.008 × 10⁴ M^-1로 확인되었으며, 해리상수는 각각 46 μM 및 49 μM로 확인되었다.As a result, the binding coefficients of GPIbβ and GPIV were confirmed to be 2.167 × 10 ⁴ M ⁻¹ and 2.008 × 10 ⁴ M ⁻¹ , respectively, and the dissociation constants were confirmed to be 46 μM and 49 μM, respectively.

상기 결과로부터 GPIbβ 및 GPIV 펩타이드 모두 유사한 친화도를 나타내는 TRAF4와 상호작용하는 것을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that both the GPIbβ and GPIV peptides interact with TRAF4 showing similar affinity.

표면 플라스몬 공명(SPR) 실험을 위해, His-tag affinity system을 이용하여 6xHis가 태그된 TRAF4를 Ni-NTA 센서칩에 결합시켰다.For surface plasmon resonance (SPR) experiments, 6xHis-tagged TRAF4 was bound to a Ni-NTA sensor chip using a His-tag affinity system.

각 펩타이드를 1 μM에서 100 μM 범위 내 다른 농도로 TRAF4와 결합시켜 분석하였다.Each peptide was analyzed by binding to TRAF4 at different concentrations ranging from 1 μM to 100 μM.

그 결과, 도 1g 및 1h와 같이 GPIbβ 및 GPIV은 명확한 농도 의존적 상호작용을 나타내었다. As a result, as shown in FIGS. 1g and 1h, GPIbβ and GPIV showed a clear concentration-dependent interaction.

GPIV 데이터는 피팅되지 못하였으나, GPIbβ 펩타이드는 데이터 피팅을 수행한 결과, GPIbβ 펩타이드 상호작용의 K_D 값이 11.5 μM로 나타났다.The GPIV data could not be fitted, but data fitting was performed for the GPIbβ peptide. As a result, the K _D value of the GPIbβ peptide interaction was found to be 11.5 μM.

7. TRAF4 복합체 구조를 이용한 상호작용 확인7. Confirmation of interaction using TRAF4 complex structure

in vitro 상호작용 연구는 TRAF4와 알려진 TRAF 결합 모티프가 포함되지 않은 합성된 혈소판 수용체 펩타이드 사이의 상호작용을 확인했기 때문에 실제로 TRAF4가 복잡한 구조를 해결하여 상기 펩타이드를 어떻게 인식하는지 확인하였다.Since the in vitro interaction study confirmed the interaction between TRAF4 and a synthesized platelet receptor peptide that does not contain a known TRAF binding motif, it was confirmed how TRAF4 actually recognizes the peptide by resolving a complex structure.

각각 다른 시간 척도로 TRAF4 결정을 다양한 농도의 혈소판 수용체 펩타이드에 침지시켰다. TRAF4 crystals were immersed in various concentrations of platelet receptor peptide at different time scales.

100 μM GPIbβ 펩타이드에 24시간 동안 침지된 결정은 2.5 Å 회절되었으며, 분자 치환작용에 의한 구조 풀림 후 펩타이드 밀도를 정확하게 확인하였다.Crystals immersed in 100 μM GPIbβ peptide for 24 hours were diffracted by 2.5 Å, and the peptide density was accurately confirmed after the structure was resolved by molecular substitution.

그 결과, 도 2a와 같이 TRAF4 결정은 천연구조를 생성하는 결정과 유사한 완충 조건에서 얻어졌지만 복합 구조 연구를 위해 펩타이드 침지된 결정은 동일한 공간 그룹에서 약간 큰 세포 크기를 나타냈으며, 6 분자(두 개의 삼량체)를 포함하는 것으로 확인되었다: 비대칭 단위(asymmetric unit, ASU)에서 체인 A, B, 및 C로 이루어진 하나의 삼량체와 체인 A', B' 및 C'로 이루어진 다른 하나의 삼량체가 확인되었다.As a result, as shown in Fig. 2a, TRAF4 crystals were obtained under buffer conditions similar to crystals that generate natural structures, but for complex structure studies, peptide-immersed crystals exhibited slightly larger cell sizes in the same spatial group, and 6 molecules (two trimer): in an asymmetric unit (ASU), one trimer consisting of chains A, B, and C and another trimer consisting of chains A', B' and C' are identified became

구조는 R_work = 21.1% 및 R_free = 26.4%로 정제되었으며, 결정학 및 정제 통계치는 표 1과 같이 확인되었다.The structure was purified to R _work = 21.1% and R _free = 26.4%, and crystallography and purification statistics were confirmed as shown in Table 1.

TRAF4/GPIbβTRAF4/GPIbβ Data collectiondata collection Space groupspace group P2P2 _1One Cell dimensionsCell dimensions a, b, c (Å) a, b, c (Å)
α, β, γ (°) α, β, γ (°) 56.7, 88.6, 120.756.7, 88.6, 120.7
90.0, 93.6, 90.090.0, 93.6, 90.0 Resolution (Å)Resolution (Å) 50.0 - 2.550.0 - 2.5 RR _symsym (%) (%) 7.7 (26.9)7.7 (26.9) ^†† Mean I/s (I)Mean I/s (I) 21.7 (3.4)21.7 (3.4) ^†† Completeness (%)Completeness (%) 95.0 (95.9)95.0 (95.9) ^†† RedundancyRedundancy 3.1 (3.1)3.1 (3.1) ^†† RefinementRefinement Resolution (Å)Resolution (Å) 33.0 - 2.533.0 - 2.5 Molecules/auMolecules/au ^**
No. reflections No. reflections 6 (proteins) and 3(peptides) 6 (proteins) and 3 (peptides)
28,763 28,763 RR _workwork / / RR _freefree (%) (%) 21.1 / 26.421.1 / 26.4 No. atomsNo. atoms Protein Protein 7,8057,805 Water Water 2929 Average B-factors (ÅAverage B-factors (Å ²² )) Chain A Chain A 49.149.1 Chain B Chain B 60.460.4 Chain CChain C 55.155.1 Chain DChain D 52.652.6 Chain EChain E 56.156.1 Chain FChain F 55.055.0 Chain GChain G 58.758.7 Chain IChain I 60.760.7 Chain KChain K 84.884.8 Water Water 52.752.7 R.M.S. deviationsR.M.S. deviations Bond lengths (Å) Bond lengths (Å) 0.0100.010 Bond angles (°) Bond angles (°) 1.3901.390 Ramachandran plot (%)Ramachandran plot (%)
Most favored regions Most favored regions
Additional allowed regions Additional allowed regions
96.196.1
3.93.9

^†† Statistics for the highest-resolution shell are shown in parenthesesStatistics for the highest-resolution shell are shown in parentheses

또한, 도 2a 및 2b와 같이 6 사슬 중 사슬 A, A' 및 C'은 다른 TRAF 패밀리 구성원의 전형적인 수용체 상호작용 지역에 GPIbβ 펩타이드를 포함하고 있었으며, 도 2c에서 확인된 깊은 홈은 수용체 결합 주머니로 수용체 펩타이드는 상기 주머니에 결합되었다.In addition, as shown in Figs. 2a and 2b, 6 heavy chains A, A' and C' contained GPIbβ peptides in receptor interaction regions typical of other TRAF family members, and the deep grooves identified in Fig. 2c were identified as receptor binding pockets. A receptor peptide was bound to the pocket.

도 2d와 같이 각 펩타이드의 전자 밀도의 길이 및 간격은 차이가 있었으나, 체인 A 내 GPIbβ 펩타이드가 가장 명확하게 모형화되었다. 또한, 펩타이드로 추측되는 추적할 수 없는 작은 전자 밀도가 사슬 C에서 확인되었다.As shown in FIG. 2D , there was a difference in the length and spacing of the electron density of each peptide, but the GPIbβ peptide in Chain A was modeled most clearly. In addition, a small untraceable electron density presumed to be a peptide was identified in chain C.

GPIbβ 수용체 펩타이드에 대해 아미노산 서열 RRLRARARAR을 설계, 합성 및 사용하였으나, 오직 RLRAR 부분만이 상호작용의 중심 부분이며, 낮은 전자 밀도를 갖기 때문에 도 2d와 같이 모델링되었다.The amino acid sequence RRLRARARAR was designed, synthesized and used for the GPIbβ receptor peptide, but only the RLRAR portion was the central portion of the interaction and was modeled as in Figure 2d because it has a low electron density.

기존의 TRAF 패밀리와 다양한 복합체의 구조 연구를 통하여, TRAF-결합 모티프에서 가장 보호된 아미노산은 P₀또는 TRAF-결합 모티프의 제로 위치인 것으로 확인되어 레이블링 전략에 따라, 도 3a와 같이 GPIbβ 수용체 펩타이드에서 RLRAR 모티프는 R (P_-1), L (P₀), R (P₁), A (P₂) 및 R (P₃)로 명명되었다.Through structural studies of the existing TRAF family and various complexes, it was confirmed that the most protected amino acid in the TRAF-binding motif is P ₀ or the zero position of the TRAF-binding motif. RLRAR motifs were named R (P ₋₁ ), L (P ₀ ), R (P ₁ ), A (P ₂ ) and R (P ₃ ).

또한, 본 발명의 복합체 구조를 통하여 GPIbβ 수용체 내 R (P_-1), L (P₀), A (P₂) 및 R (P₃) 곁사슬이 TRAF4 상호작용에 관련된 것이 확인되었다. P_-1 위치의 R 및 P₃위치의 다른 R은 TRAF4의 E406 및 N355 곁사슬과 각각 수소결합을 형성한다. In addition, through the complex structure of the present invention, it was confirmed that the R (P _-1 ), L (P ₀ ), A (P ₂ ) and R (P ₃ ) side chains in the GPIbβ receptor are involved in the TRAF4 interaction. R in the P _-1 position and the other R in the P ₃ position form hydrogen bonds with the E406 and N355 side chains of TRAF4, respectively.

도 3a를 참고하면, 중심이 되는 안정한 소수성 상호작용은 GPIbβ P₀의 L과 TRAF4의 F408, Y436 및 F434에 의해 형성되며, 두 번째로 중요한 소수성 주머니는 GPIbβ P₂의 A와TRAF4의 W414 및 F434의 상호작용에 의해 형성되는 것이 확인되었다. Referring to Figure 3a, the central stable hydrophobic interaction is formed by L of GPIbβ P ₀ and F408, Y436 and F434 of TRAF4, and the second most important hydrophobic pocket is with A of GPIbβ P ₂ It was confirmed that it is formed by the interaction of W414 and F434 of TRAF4.

본 발명의 복합체 구조에서 TRAF4와 GPIbβ 수용체 펩타이드 사이의 상호작용을 확인하기 위해, 상기 복합체 구조에서 상호작용이 파괴된 6개의 돌연변이(N355R, S357E, Y366R, F434R 및 Y436R)를 발생시키고, ITC 및 SPR 분석을 수행하여 GPIbβ 수용체 펩타이드와 TRAF4 및 이들의 돌연변이 사이의 상호작용을 확인하였다. In order to confirm the interaction between TRAF4 and the GPIbβ receptor peptide in the complex structure of the present invention, six mutations (N355R, S357E, Y366R, F434R and Y436R) in which the interaction was disrupted in the complex structure were generated, and ITC and SPR Assays were performed to confirm the interaction between the GPIbβ receptor peptide and TRAF4 and their mutants.

그 결과, 표 2와 같이 N355R, Y366R 및 Y436R 세 개의 돌연변이에서는 상호작용의 파괴가 확인된 반면, S357E 및 F434R 돌연변이에서는 상호작용 친화성의 감소가 확인되었다. As a result, as shown in Table 2, disruption of the interaction was confirmed in the three mutants N355R, Y366R and Y436R, whereas a decrease in interaction affinity was confirmed in the S357E and F434R mutants.

상기 결과로부터 GPIbβ 수용체 펩타이드는 TRAF4의 N355, S357, Y366, F434 및 Y436에 의해 형성된 얕은 결합 주머니와 상호작용하는 것이 확인되었다.From the above results, it was confirmed that the GPIbβ receptor peptide interacts with the shallow binding pockets formed by N355, S357, Y366, F434 and Y436 of TRAF4.

MutationsMutations PeptidesPeptides SPRSPR ITCITC InteractionInteraction Wildtypewildtype GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ)GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ) K_D = 11.2 μM

N.D.K _D = 11.2 μM

ND K_D = 46.1 μM

K_D = 49.8 μMK _D = 46.1 μM

K _D = 49.8 μM Interact

InteractInteract

Interact F434RF434R GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ)GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ) K_D = 27.2 μM

K_D = 16.6 μMK _D = 27.2 μM

K _D = 16.6 μM K_D = 82.6 μM

K_D = 108.2 μMK _D = 82.6 μM

K _D = 108.2 μM ReducedReduced S357ES357E GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ)GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ) K_D = 90.6 μM

N.D.K _D = 90.6 μM

ND K_D = 95.8 μM

N.D.K _D = 95.8 μM

ND ReducedReduced Y366RY366R GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ)GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ) N.R.

N.RNR

NR N.R

N.RNR

NR DisruptDisrupt Y436RY436R GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ)GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ) N.R.

N.RNR

NR N.R

N.RNR

NR DisruptDisrupt E406RE406R GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ)GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ) N.R.

N.RNR

NR N.R

N.RNR

NR DisruptDisrupt N355RN355R GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ)GPIbβ (RRLRARARAR)

GPVI (KRLRHRGRAVQ) N.R.

N.RNR

NR N.R.

N.RNR

NR DisruptDisrupt Wildtypewildtype NOD2 (GPPQKSPATLGLEEL)

NOD2' (ERLARKA)NOD2 (GPPQKSPATLGLEEL)

NOD2' (ERLARKA) N.R.

N.R.NR

NR N.R.

N.R.NR

NR Not interact

Not interactNot interact

Not interact Wildtypewildtype TGFBR1 (ARLTALRIKK)TGFBR1 (ARLTALRIKK) N.D.N.D. K_D = 115.3 μM
K _D = 115.3 μM
interactinteract Wildtypewildtype TGFBR2 (DRLSGRSCSE)

TGFBR2' (ARLTAQCVA)TGFBR2 (DRLSGRSCSE)

TGFBR2' (ARLTAQCVA) N.D.

N.D.ND

ND N.D.

N.D.
ND

ND
Interact
(low affinity)
Interact
(Low affinity)Interact
(low affinity)
Interact
(Low affinity)

N.R. and N.D. indicate no-response and not determined, respectively.N.R. and N.D. indicate no-response and not determined, respectively.

한편, GPIbβ 펩타이드의 결합에 따른 TRAF4의 구조 변화를 분석하기 위해, 종래에 확인된 TRAF4 자연상태의 구조(PDBid: 4K8U)와 본 발명에서 확인된 TRAF4/GPIbβ 복합체 구조를 중첩시켰다.On the other hand, in order to analyze the structural change of TRAF4 according to the binding of the GPIbβ peptide, the structure of the TRAF4 natural state (PDBid: 4K8U) confirmed previously and the structure of the TRAF4/GPIbβ complex identified in the present invention were superimposed.

그 결과, 도 3b와 같이 TRAF4 및 TRAF4/GPIbβ 펩타이드 복합체의 전체 구조가 거의 동일한 것으로 확인되었으며, 평균 제곱근 편차가 0.8 Å인 것으로 확인되었다. As a result, it was confirmed that the overall structures of the TRAF4 and TRAF4/GPIbβ peptide complexes were almost identical as shown in FIG. 3b, and the root mean square deviation was found to be 0.8 Å.

반면, 도 3b를 참고하면 GPIbβ 결합 상의 상호작용 인터페이스에서 W414 및 F434가 포함된 TRAF4 잔기의 곁사슬의 정확한 움직임이 확인되었다.On the other hand, referring to FIG. 3B , the correct movement of the side chain of TRAF4 residues including W414 and F434 at the interaction interface on GPIbβ binding was confirmed.

F408, Y436 및 F434에 의해 형성된 중심 주머니 및 W414와 F434에 의해 형성된 작은 주머니와 같은 두 개의 소수성 주머니는 수용체 상호작용 없이 사전에 형성된다. 일단 GPIbβ가 상호작용하면, W414 및 F434의 곁사슬이 이동하여 GPIbβ 펩타이드의 P₀위치의 L 및 P₂위치의 A를 수용하고 소수성 상호작용을 통하여 도 3b와 같은 두 개의 소수성 주머니가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.Two hydrophobic pockets, such as the central pocket formed by F408, Y436 and F434 and the small pocket formed by W414 and F434, are preformed without receptor interaction. Once the GPIbβ interacts, the side chains of W414 and F434 move to accommodate the L and P ₂ positions of the P ₀ position of the GPIbβ peptide and form two hydrophobic pockets as shown in FIG. 3b through the hydrophobic interaction. could

상기 결과로부터 GPIbβ 결합은 수용체 수용을 위해 TRAF4의 구조적 변형을 유도하는 것이 확인되었다.From the above results, it was confirmed that GPIbβ binding induces structural modification of TRAF4 for receptor acceptance.

펩타이드 결합된 TRAF4 구조의 다른 특징은 도 3c와 같이 매우 무질서한 β6-β7 연결 루프가 존재하는 것이며, 상기 β6-β7 연결 루프는 TRAF4/펩타이드 복합체 구조 내 낮은 밀도로 존재하기 때문에 본 발명에서는 모델링되지 않았으나, 자연적인 TRAF4 구조에서는 명확하게 확인되며, 수용체와 결합을 통해 β6-β7 연결 루프의 유연성이 증가되는 것은 신호 전달에 중요할 수 있으므로 추가로 확인되어야 한다.Another characteristic of the peptide-bound TRAF4 structure is that a very disordered β6-β7 linked loop exists as shown in FIG. 3c, and the β6-β7 linked loop is present at a low density in the TRAF4/peptide complex structure, so it was not modeled in the present invention. , is clearly identified in the native TRAF4 structure, and the increased flexibility of the β6-β7 linking loop through receptor binding may be important for signal transduction and should be further confirmed.

한편, 도 3d와 같이 TRAF4의 표면 정전기적 특징은 소수성 수용체 결합 홈과 마찬가지로 분산된 전하 잔기로 구성되어 있다. GPIbβ의 TRAF4 결합 부위는 막 관통영역의 오른쪽에 위치하며, TRAF4는 GPIbβ와 GPIV에 의해 매개된 혈소판 신호 전달 과정 동안 세포내 막 근처에 위치하는 것으로 확인되었다. On the other hand, as shown in Fig. 3d, the surface electrostatic characteristics of TRAF4 consist of dispersed charge residues like the hydrophobic receptor binding groove. The TRAF4 binding site of GPIbβ was located to the right of the transmembrane region, and TRAF4 was confirmed to be located near the intracellular membrane during platelet signaling mediated by GPIbβ and GPIV.

최근 보고된 바에 따르면, TRAF4는 악성 유선 종양 상피 세포(MECs)의 단단한 접합을 불안정하게 만들고, 세포 내 막에서 포스파티딜이노시톨(phosphoinositide; PIP) 결합을 통하여 종양 진행을 위한 세포 이동을 증가시키는 것으로 확인되었다.According to a recent report, TRAF4 was found to destabilize tight junctions of malignant mammary tumor epithelial cells (MECs) and to increase cell migration for tumor progression through phosphatidylinositol (phosphoinositide; PIP) binding in the intracellular membrane. .

상기 결과들은 본 발명에서 확인된 TRAF4가 신호 전달 과정에서 적절한 수용체와 세포막에 부착된다는 사실을 뒷 받침한다.The above results support the fact that TRAF4 identified in the present invention is attached to appropriate receptors and cell membranes during signal transduction.

A, A' 및 C' 사슬 내 세 개의 펩타이드의 구조를 비교하기 위해, 비대칭 유닛 상의 6 분자들을 중첩시켰다. To compare the structures of the three peptides in the A, A' and C' chains, 6 molecules on the asymmetric unit were superimposed.

그 결과, 도 3e와 같이 6 분자들의 구조는 거의 동일하였으며, 분자 사이의 R.M.S.D는 0.84 ~ 1.82 Å로 확인되었다. TRAF4 구조에서 A, A' 및 C'의 백본은 동일하였으며, R.M.S.D.는 0.2 Å 보다 작았다. As a result, as shown in FIG. 3E , the structures of the six molecules were almost identical, and the R.M.S.D between the molecules was found to be 0.84 to 1.82 Å. In the TRAF4 structure, the backbones of A, A' and C' were identical, and the R.M.S.D. was smaller than 0.2 Å.

상기 결과로부터 수용체 펩타이드의 주요 사슬의 입체구조는 구조적으로 보존되는 것을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that the three-dimensional structure of the main chain of the receptor peptide is structurally conserved.

또한, 주요 사슬 입체구조는 전체적으로 보존되는 반면, 곁사슬의 입체구조는 다양하다. 도 3f를 참고하면, 펩타이드에 존재하는 5 잔기들 중 P_-1, P₀, 및 P₂ 위치에 존재하는 세 잔기의 곁사슬 입체구조는 매우 잘 보존된 반면, P₁ 및 P₃위치에 존재하는 다른 두 잔기의 곁사슬 입체구조는 가변적이다.Also, the conformation of the main chain is entirely conserved, while the conformation of the side chains varies. Referring to FIG. 3f , of the 5 residues present in the peptide, the side chain conformations of three residues at positions P _-1 , P ₀ , and P ₂ are very well conserved, whereas those present at positions P ₁ and P ₃ are very well preserved. The side chain conformations of the other two residues are variable.

TRAF4 내 보존되지 않은 아미노산 잔기들은 다양한 수용체와의 상호작용을 위해 중요하며, 이러한 TRAF4의 새로운 수용체 특이성에 따른 TRAF4와 이의 수용체 GPIbβ 구조내 새로운 결합 방식이 확인되었다. Unconserved amino acid residues in TRAF4 are important for interaction with various receptors, and a novel binding mode in the structure of TRAF4 and its receptor GPIbβ was identified according to the novel receptor specificity of TRAF4.

도 3g를 참고하면, GPIbβ 수용체 펩타이드의 하부(P₁, P₂ 및 P₃)는 TRAF2와 수용체 펩타이드가 결합하는 부위와 유사한 위치에서 TRAF4와 결합하는 반면, 상부는 TRAF2가 결합하는 수용체 펩타이드 결합 부위로부터 38°떨어진 부위에서 결합하였다. 또한, TRAF6의 수용체 결합 부위와 비교한 결과, TRAF4의 GPIbβ 펩타이드 결합 부위와 TRAF6의 RANK 펩타이드는 포개지지 않았다.Referring to FIG. 3G , the lower portion (P ₁ , P ₂ and P ₃ ) of the GPIbβ receptor peptide binds to TRAF4 at a position similar to the site where TRAF2 and the receptor peptide bind, whereas the upper portion is the receptor peptide binding site to which TRAF2 binds. It was bound at a site 38° away from it. In addition, as a result of comparison with the receptor binding site of TRAF6, the GPIbβ peptide binding site of TRAF4 and the RANK peptide of TRAF6 did not overlap.

상기 결과로부터 TRAF4와 관련된 수용체의 방식은 TRAF6와 완전히 다른 것을 확인할 수 있었다.From the above results, it was confirmed that the receptor method related to TRAF4 was completely different from that of TRAF6.

TRAF4의 표면에 존재하는 두 개의 소수성 주머니는 다른 TRAF 패밀리 구성들의 수용체 결합과 비교하여 완전히 다른 방식을 유도하는 결정적인 인자이다. The two hydrophobic pockets on the surface of TRAF4 are critical factors that induce a completely different manner compared to receptor binding of other TRAF family members.

도 3h 및 3i를 참고하면, 펩타이드와 유사한 전자 밀도는 사슬 B 및 B'의 수용체 펩타이드 결합 부위에서 확인되며, 대칭적인 분자가 원인이 된다. Referring to FIGS. 3H and 3I , an electron density similar to that of a peptide is confirmed at the receptor peptide binding sites of chains B and B', and is caused by a symmetric molecule.

또한, 사슬 B (465-PRKIL-469)의 C-말단으로부터 5개의 잔기는 대칭적인 분자 내 다른 사슬 B의 전형적인 펩타이드 수용체 결합 부위에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.In addition, it was confirmed that 5 residues from the C-terminus of chain B (465-PRKIL-469) are present in the typical peptide receptor binding site of other chain B in the symmetric molecule.

흥미롭게도 결정학적인 포장에 의해 형성된 상호작용 방식은 TRAF4와 GPIbβ 수용체 펩티드 사이의 상호작용 방식과 유사한 것을 확인할 수 있었다.Interestingly, it was confirmed that the interaction mode formed by the crystallographic packaging was similar to the interaction mode between TRAF4 and the GPIbβ receptor peptide.

도 3j를 참고하면, 사슬 B의 I468는 TRAF4와 GPIbβ 수용체 펩타이드의 상호 작용에 중요한 소수성 주머니의 형성에 관여하는 대칭적인 분자인 F408, F434 및 Y436에 의해 형성된 소수성 주머니에 둘러싸여 있다.Referring to Figure 3j, I468 of chain B is surrounded by a hydrophobic pocket formed by F408, F434 and Y436, which are symmetric molecules involved in the formation of a hydrophobic pocket important for the interaction of TRAF4 with the GPIbβ receptor peptide.

TRAF4에서 E406과 수소 결합을 형성하기 위해 P_-1위치의 R을 사용하는 TRAF4-GPIbβ 수용체 펩타이드 상호 작용과 달리, TRAF와 대칭분자간의 상호작용은 P_-2위치의 R을 사용하여 TRAF4의 E406과 수소 결합을 형성한다.In contrast to the TRAF4-GPIbβ receptor peptide interaction, which uses R at the P _-1 position to form a hydrogen bond with E406 in TRAF4, the interaction between TRAF and a symmetric molecule uses R at the P _-2 position to form a hydrogen bond with E406 of TRAF4. form hydrogen bonds.

또한, P_-2위치의 하전된 잔기와 P₀위치의 Ile은 TRAF4-결합 모티프의 대안이 될 수 있다.In addition, the charged residue at the P _-2 position and the Ile at the P0 position can be an alternative to the _TRAF4 -binding motif.

본 발명의 복합체 구조에서 P_-2위치의 GPIbβ 수용체 펩타이드의 R은 포함되어 있지 않지만, 두 개의 혈소판 수용체로부터의 두 펩타이드는 P_-2위치에 R을 포함하며, P_-2위치에 R을 포함하지 않는 펩타이드 보다 높은 친화력을 가졌다.In the complex structure of the present invention, R of the GPIbβ receptor peptide at the P _-2 position is not included, but the two peptides from the two platelet receptors contain R at the P- ₂ position and do not include the R at the P _-2 position. It had a higher affinity than the non-peptide.

상기 결과로부터 P_-2위치의 양성 전하를 갖는 잔기는 적절한 친화력과 특이성에 중요할 수 있다.From the above results it can be seen that residues with a positive charge at the P _-2 position may be important for proper affinity and specificity.

다양한 신호작용 과정에서 TRAF 패밀리의 생물학적 중요성 때문에, 구조 연구에서 TRAF-결합 수용체의 TRAF-결합 컨센서스 모티프는 확인되어 졌으나, 아직까지 TRAF4-결합 모티브에 대해서는 확인되어지지 않았다.Because of the biological importance of the TRAF family in various signaling processes, the TRAF-binding consensus motif of TRAF-binding receptors has been identified in structural studies, but the TRAF4-binding motif has not yet been identified.

이에 따라, 현재까지의 TRAF4-GPIbβ 수용체 복합체 구조 및 구조-기반 서열 정렬에 기초하여, TRAF4-결합 컨센서스 모티프를 확인하였다.Accordingly, based on the structure of the TRAF4-GPIbβ receptor complex to date and the structure-based sequence alignment, a TRAF4-binding consensus motif was identified.

<실시예 2> TRAF4와 TGF-β 수용체의 결합 확인<Example 2> Confirmation of binding of TRAF4 and TGF-β receptor

이전 연구를 통하여 NOD2와 TGF-β 수용체가 TRAF4 결합 수용체로 확인되어 짐에 따라, 아미노산 서열 분석을 수행한 결과, 도 3k와 같이 C 말단 부위에서 GPIbβ 수용체 펩티드 유사 서열이 확인되었다.As NOD2 and TGF-β receptors were identified as TRAF4-coupled receptors through previous studies, amino acid sequence analysis was performed, and as shown in FIG. 3K , a GPIbβ receptor peptide-like sequence was identified at the C-terminal region.

이에 따라, NOD2, TGF-β 수용체 1 (TGFBR1) 및 추정되는 TRAF4-결합 모티프를 포함하는 TGF-β 수용체 2 (TGFBR2)를 펩타이드로 제작한 후 SPR를 수행하여 TRAF4와 결합하는지 확인하였다.Accordingly, NOD2, TGF-β receptor 1 (TGFBR1), and TGF-β receptor 2 (TGFBR2) containing the putative TRAF4-binding motif were prepared as peptides and then SPR was performed to confirm whether they bind to TRAF4.

그 결과, 도 3i와 같이 TGF-β 수용체 1 (ARLTALRIKK)은 높은 반응 단위로 TRAF4와 결합하는 것으로 확인된 반면, NOD2 (ERLARKA)은 TRAF4와 결합하지 않는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 3i , it was confirmed that TGF-β receptor 1 (ARLTALRIKK) binds to TRAF4 in a high response unit, whereas NOD2 (ERLARKA) does not bind to TRAF4.

또한, 두 개의 TGF-β 수용체 2 펩타이드 (TGFBR2: DRLSGRSCSE 및 TGFBR2': ARLTAQCVA)는 TRAF4와 낮은 반응 단위로 상호작용하는 것이 확인되었다.In addition, it was confirmed that two TGF-β receptor 2 peptides (TGFBR2: DRLSGRSCSE and TGFBR2': ARLTAQCVA) interact with TRAF4 at low response units.

상기 결과들은 이전에 세포 기반의 상호작용 연구에서 확인된 결과와 일치하였으며, 상기 결과로부터 활성화된 TGF-β 수용체와 관련된 TRAF4는 TGF-β 수용체 2 보다 TGF-β 수용체 1과 높은 친화력을 갖는 것이 확인되었다.The above results were consistent with the results previously confirmed in cell-based interaction studies, and from the above results, it was confirmed that TRAF4 related to activated TGF-β receptor has a higher affinity for TGF-β receptor 1 than TGF-β receptor 2. became

한편, 사전에 수행된 상호작용 연구에 기초하여, SPR 및 ITC를 수행하여 TRAF4와 TGF-β 수용체 1 (ARLTALRIKK)간의 상호작용을 적량적으로 분석하였다. On the other hand, based on the previously performed interaction study, SPR and ITC were performed to quantitatively analyze the interaction between TRAF4 and TGF-β receptor 1 (ARLTALRIKK).

SPR를 위해, His-tag affinity system을 사용하여 정제된 6xHis-태그된 TRAF4와 Ni-NTA 센서 칩을 결합시켰다. For SPR, purified 6xHis-tagged TRAF4 and a Ni-NTA sensor chip were combined using a His-tag affinity system.

각 펩타이드들을 6.25 내지 100 μM 범위의 다양한 농도로 TRAF4가 고정된 센서 칩에 처리하여 결합을 확인한 결과, 농도의존적으로 상호작용하는 것이 확인되었다. TGF-β 수용체 1 펩타이드(ARLTALRIKK)를 TRAF4에 적정하여 방출된 열은 이상적인 상호작용 값과 일치하였으며, 상기 결과로부터 상호작용에 있어서, 특징적인 협력없이 단일 유형의 결합부위가 존재하는 것이 확인되었다.Each peptide was treated on a sensor chip immobilized with TRAF4 at various concentrations ranging from 6.25 to 100 μM. As a result, binding was confirmed, and concentration-dependent interactions were confirmed. The heat released by titration of TGF-β receptor 1 peptide (ARLTALRIKK) to TRAF4 coincided with the ideal interaction value, and from the above results, it was confirmed that a single type of binding site existed without characteristic cooperation in the interaction.

또한, 측정된 해리 상수는 115.3 μM이었으며, 상기 값을 통하여 TRAF4와 GPIbβ 수용체 펩타이드 (RRLRARARARA)간의 상호작용보다 낮은 친화성을 갖는 것으로 확인되었다.In addition, the measured dissociation constant was 115.3 μM, and through this value, it was confirmed that it had a lower affinity than the interaction between TRAF4 and the GPIbβ receptor peptide (RRLRARARARA).

상기 결과들로부터 P_-1및 P₀위치에서 Arg-Leu 모티프가 TRAF4 상호 작용에 중요하며, P₂위치의 Ala 잔기가 친화력에 영향을 미치는 것이 확인되었다. From the above results, it was confirmed that the Arg-Leu motif at the P _-1 and P ₀ positions is important for TRAF4 interaction, and the Ala residue at the P ₂ position affects the affinity.

도 3k를 참고하면, P₂위치의 Ala 잔기를 His (GPVI peptide) 및 Gly (TGF-β 수용체 2 펩타이드)로 대체할 경우, TRAF4와의 결합 친화력이 감소되고, Arg (NOD2 펩타이드)로 대체될 경우 상호작용이 파괴되었다.Referring to FIG. 3k , when the Ala residue at the P ₂ position is replaced with His (GPVI peptide) and Gly (TGF-β receptor 2 peptide), the binding affinity to TRAF4 is reduced, and Arg (NOD2 peptide) is replaced. Interaction is broken.

상기 결과로부터 Arg-Leu-Xaa-Ala(서열번호 1)의 P_-1에서 P₂ 대한 TRAF4 결합 모티프가 확인되었으며, 상기 Xaa는 임의의 아미노산일 수 있으며, Ala는 작고 전하를 띄지 않은 잔기로 대체될 수 있다.From the above results, a TRAF4 binding motif was identified for P _-1 to P ₂ of Arg-Leu-Xaa-Ala (SEQ ID NO: 1), wherein Xaa may be any amino acid, and Ala is replaced with a small, uncharged residue can be

본 발명에 따른 구조 및 생화학적 연구를 통하여, TRAF4는 2개의 혈소판 수용체인 GPIb-IX-V 복합체 및 GPVI와 직접적인 상호작용을 통하여 혈소판 매개 혈전증에 관여하는 분자적 기작이 확인되었으며, TGF-β 수용체와의 상호작용하여 암 시작 및 진행에 관여하는 것으로 확인됨에 따라, TRAF4의 수용체 결합 특이성, TRAF4 매개 신호과정 및 관련 질병의 추가 이해, 혈전증 및 암 치료를 위한 약물 개발에 중요하고 새로운 타켓이 될 수 있다.Through structural and biochemical studies according to the present invention, the molecular mechanism involved in platelet-mediated thrombosis was confirmed through direct interaction of TRAF4 with two platelet receptors, the GPIb-IX-V complex and GPVI, and the TGF-β receptor. As it has been confirmed to be involved in cancer initiation and progression by interacting with have.

<실시예 3> 구조기반 virtual 스크리닝 <Example 3> Structure-based virtual screening

분자 docking-based 가상 스크리닝을 이용하여 ChemBridge database (8.4 × 105 compounds)를 스크리닝하였다. 화합물의 가상 결합을 위해 Glide software program (Schrodinger, LLC, USA)을 이용하였으며, grid 기반 리간드 결합과 에너지 알고리즘을 이용하였다. 상기 가상 스크리닝을 위해, TRAF4/GPIb의 결정 구조를 시작 모델로 사용하였다.ChemBridge database (8.4 × 105 compounds) was screened using molecular docking-based virtual screening. For virtual binding of compounds, the Glide software program (Schrodinger, LLC, USA) was used, and a grid-based ligand binding and energy algorithm was used. For the virtual screening, the crystal structure of TRAF4/GPIb was used as a starting model.

Protein Preparation Wizard tool of the Maestro software package (Version 9.6, Schrodinger, LLC, USA)를 이용하여 수소 원자, 결합 차수 및 형식전자가 첨가된 단백질 구조를 얻었다. Protein preparation wizard tool of the Maestro software package (Version 9.6, Schrodinger, LLC, USA) was used to obtain a protein structure with added hydrogen atoms, bond orders and formal electrons.

모든 원자력 필드의 액체 시뮬레이션을 위해 최적화된 전위를 이용하여 단백질 리간드 구조에서 에너지 최소화를 확인하였다.Energy minimization was confirmed in the protein ligand structure using potentials optimized for liquid simulation of all atomic fields.

결합된 분자의 결합 친화성은 결합 점수에 직접적으로 비례하여 간주될 수 있으므로, 높은 결합 점수(Glide score < -10)를 갖는 32개 분자들을 TRAF4/GPIb 상호작용의 잠재적 억제자로 선택하였으며, PyMol molecular graphics package (http://www.pymol.org)를 이용하여 분자 그래픽을 얻었다.Since the binding affinity of bound molecules can be considered directly proportional to the binding score, 32 molecules with high binding scores (Glide score < -10) were selected as potential inhibitors of the TRAF4/GPIb interaction, and PyMol molecular graphics Molecular graphics were obtained using package (http://www.pymol.org).

그 결과, 도 4와 같은 구조 기반 가상 스크리닝을 통하여 총 32종의 화합물을 확인할 수 있었다.As a result, a total of 32 compounds could be identified through the structure-based virtual screening as shown in FIG. 4 .

<< 실시예Example 4> 혈소판 내 활성산소종(ROS) 생성 억제 효과 4> Inhibitory effect on the production of reactive oxygen species (ROS) in platelets

1) 혈액 수집1) blood collection

실험은 Helsinki 선언에 따라 인간 관련 연구 윤리에 관한 모나쉬 대학 상임위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.Experiments were conducted with the approval of the Monash University Standing Committee on Human Relevant Research Ethics in accordance with the Declaration of Helsinki.

혈소판이 풍부한 혈장(plasma; PRP)를 혈액으로부터 얻어 3.2% (w/v) 시트르산 삼나트륨(trisodium citrate)에 넣고 실온에서 160×g로 20분간 원심분리하였다.Platelet-rich plasma (PRP) was obtained from blood, put in 3.2% (w/v) trisodium citrate, and centrifuged at room temperature at 160×g for 20 minutes.

2) 활성 2) active 산소종oxygen species (( ROSROS ) 분석) analysis

억제제 존재 또는 비존재 하에서 혈소판 내 활성산소종(ROS) 생성을 확인하기 위해, 건강한 공여자로부터 받은 혈장 내 혈소판에 2’,7’-디클로르플루오레세인(H2DCFDA; Sigma)를 충분히 처리하였다. 세포 투과성 비형광 염료인 H2DCFDA는 세포 내 에스테라아제에 의해 H2DCF로 분해되어 막을 통과하지 못하게 된 후 ROS 존재 시 형광에너지를 방출한다.To confirm the generation of reactive oxygen species (ROS) in platelets in the presence or absence of inhibitors, platelets in plasma from healthy donors were sufficiently treated with 2',7'-dichlorfluorescein (H2DCFDA; Sigma). H2DCFDA, a cell-permeable non-fluorescent dye, is decomposed into H2DCF by intracellular esterase and cannot pass through the membrane, and then emits fluorescence energy in the presence of ROS.

37℃에서 30분간 H2DCF-DA(10 μM 최종농도)와 인큐베이션된 PRP에 1-10 μg mL^-1 CRP, 0.1 μg mL^-1 convulxin, 5-20 μM ADP (in the presence or absence of 0.02 U mL^- ¹apyrase), 2-10 μM TRAP, 또는 5 μg mL^-114A2 (in the presence or absence of 10 μg mL^-1 IV.3)를 처리한 후 0.1% (w/v) BSA 및 10 μM H2DCF-DA가 포함된 Ca2+-free Tyrode’s buffer (0.36 mM NaH2PO4, 5mM HEPES, 137 mM NaCl, 5.6 mM glucose, 2.7 mM KCl, pH 7.4)로 10배 희석시켜 FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 분석을 수행하였다.1-10 μg mL ^-1 CRP, 0.1 μg mL ^-1 convulxin, 5-20 μM ADP (in the presence or absence of 0.02 U mL) in PRP incubated with H2DCF-DA (10 μM final concentration) for 30 min at 37°C ^- ¹ apyrase), 2-10 μM TRAP, or 0.1% (w/v) BSA and 10 μM H2DCF after treatment with 5 μg mL ^-1 14A2 (in the presence or absence of 10 μg mL ^-1 IV.3) -DA-containing Ca2+-free Tyrode's buffer (0.36 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5.6 mM glucose, 2.7 mM KCl, pH 7.4) diluted 10-fold with FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) Analysis was performed.

상기 방법은 다른 세포 유형에 따른 활성산소종 발생, 염색제의 세포 외 산화 또는 산화된 염료의 누출로 인한 잠재적인 문제들을 극복할 수 있기 때문에 세포 내 활성산소종만 측정되고, 혈소판은 전방/측부 산란을 기반으로 특이적으로 통과되고 H2DCF-DA는 희석된 버퍼에 포함시키므로 염료 누출이 나타나지 않는다.Since the method can overcome potential problems due to the generation of reactive oxygen species according to different cell types, extracellular oxidation of the dye, or leakage of oxidized dye, only intracellular reactive oxygen species are measured, and platelets are subjected to forward/side scatter. Dye leakage does not appear as the substrate is specifically passed through and H2DCF-DA is included in the diluted buffer.

다양한 억제제의 존재 또는 비존재 하에서 콜라겐 관련 펩타이드 (CRP: GPVI-specific agonist) 처리에 따른 혈소판 활성산소종 생성을 확인하기 위해, 염료가 적재된 혈소판 현탁액에 CRP를 혼합하고 2분 후 상기 방법과 같이 10배 희석하였다.In order to confirm the generation of platelet reactive oxygen species following the treatment of collagen-related peptide (CRP: GPVI-specific agonist) in the presence or absence of various inhibitors, CRP was mixed with the dye-loaded platelet suspension and 2 minutes later, as in the above method. It was diluted 10-fold.

활성산소종 생성 억제에 대한 화합물의 영향을 확인하기 위해, 10 μM 화합물 1 내지 32를 혈소판 현탁액에 15분간 전처리한 후 CRP를 2분간 처리하고, 희석하여 20분 후 혈소판 활성산소종 수준을 확인하고, 그 결과 값을 백그라운드 수준 이상의 DCF-양성 세포의 수를 나타내는 게이트 영역(M) 내의 수를 평균 백분율로 나타내었다.In order to confirm the effect of the compound on the inhibition of reactive oxygen species production, 10 μM compounds 1 to 32 were pretreated in platelet suspension for 15 minutes, then treated with CRP for 2 minutes, diluted to check the platelet reactive oxygen species level after 20 minutes, , the resulting values are expressed as average percentages of the number in the gate region (M) representing the number of DCF-positive cells above the background level.

그 결과, 도 5와 같이 32개의 화합물 모두 ROS 형성 억제효과가 확인되었으며, 특히 3, 9, 10, 12, 16, 21, 25, 29 및 31번 화합물의 ROS 형성 억제효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 5, all of the 32 compounds were confirmed to have an inhibitory effect on ROS formation, and in particular, it was confirmed that the compounds 3, 9, 10, 12, 16, 21, 25, 29 and 31 had excellent ROS formation inhibitory effects. .

<실시예 5> 혈소판 응집 억제 효과<Example 5> Platelet aggregation inhibitory effect

활성산소 생성 억제 효과를 갖는 화합물의 혈소판 응집 효과를 확인하기 위해, 구연산 처리된 혈액을 원심분리하여 얻은 혈소판이 풍부한 사람의 혈장(PRP)에서 혈소판 응집을 확인하였다.In order to confirm the platelet aggregation effect of the compound having the inhibitory effect on reactive oxygen species, platelet aggregation was confirmed in platelet-rich human plasma (PRP) obtained by centrifuging citrate-treated blood.

간략하게 자동 계수기로 혈소판 수를 확인하여 3 × 10⁸ cells/mL의 PRP와 혈소판이 부족한 혈장(PPP)를 준비하였다.Briefly, 3 × 10 ⁸ cells/mL of PRP and platelet-deficient plasma (PPP) were prepared by checking the platelet count with an automatic counter.

광투과율 내에서 변화를 확인하기 위해, PRP 시료 200 mL를 37℃에서 2분간 교반하여 인큐베이션시키고 1, 5, 및 10 μM 농도의 화합물 9를 처리 또는 비 처리한 후 37℃에서 5분간 혈소판 작용물질 20 μL를 처리하였다.In order to confirm the change in light transmittance, 200 mL of PRP sample was incubated at 37°C with stirring for 2 minutes, treated with or untreated with compound 9 at concentrations of 1, 5, and 10 μM, and platelet agonist at 37°C for 5 minutes. 20 μL was treated.

5분간의 광 투과도를 응집측정기(MCM Hematracer 313M, Model:PAM-12C, SSR Engineering, Tokyo, Japan)를 사용하여 확인하였다.Light transmittance for 5 minutes was confirmed using a coagulometer (MCM Hematracer 313M, Model: PAM-12C, SSR Engineering, Tokyo, Japan).

기준선을 PRP로 설정하고 광투과 내에서 가능한 최대의 증가(혈소판 응집률 : 100 %)를 PPP로 설정하였다.The baseline was set as PRP and the maximum possible increase in light transmission (platelet aggregation rate: 100%) was set as PPP.

적절한 완충액 대조군에 대한 실험 시료의 최대 응집율을 기초로하여 억제 백분율을 계산하였다.Percent inhibition was calculated based on the maximal aggregation rate of the experimental samples relative to the appropriate buffer control.

그 결과, 도 6과 같이 화합물 9의 농도의존적으로 혈소판 응집저해 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the platelet aggregation inhibitory effect appeared in a concentration-dependent manner of compound 9 as shown in FIG. 6 .

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those of ordinary skill in the art, it is clear that this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Pharmaceutical composition for treating thrombosis or cancer using TRAF4 binding motif <130> ADP-2017-0350 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> TRAF4 binding motif <400> 1 Arg Leu Xaa Ala 1 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> GPIb-beta <400> 2 Arg Arg Leu Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> GPVI <400> 3 Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala Val Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> TGF-beta receptor 1 <400> 4 Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 206 <212> PRT <213> Human GPIb <400> 5 Met Gly Ser Gly Pro Arg Gly Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Pro Pro Ser Arg Pro Ala Ala Gly Cys Pro Ala Pro Cys Ser Cys 20 25 30 Ala Gly Thr Leu Val Asp Cys Gly Arg Arg Gly Leu Thr Trp Ala Ser 35 40 45 Leu Pro Thr Ala Phe Pro Val Asp Thr Thr Glu Leu Val Leu Thr Gly 50 55 60 Asn Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Gly Leu Leu Asp Ala Leu Pro Ala 65 70 75 80 Leu Arg Thr Ala His Leu Gly Ala Asn Pro Trp Arg Cys Asp Cys Arg 85 90 95 Leu Val Pro Leu Arg Ala Trp Leu Ala Gly Arg Pro Glu Arg Ala Pro 100 105 110 Tyr Arg Asp Leu Arg Cys Val Ala Pro Pro Ala Leu Arg Gly Arg Leu 115 120 125 Leu Pro Tyr Leu Ala Glu Asp Glu Leu Arg Ala Ala Cys Ala Pro Gly 130 135 140 Pro Leu Cys Trp Gly Ala Leu Ala Ala Gln Leu Ala Leu Leu Gly Leu 145 150 155 160 Gly Leu Leu His Ala Leu Leu Leu Val Leu Leu Leu Cys Arg Leu Arg 165 170 175 Arg Leu Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg Ala Ala Ala Arg Leu Ser Leu 180 185 190 Thr Asp Pro Leu Val Ala Glu Arg Ala Gly Thr Asp Glu Ser 195 200 205 <210> 6 <211> 339 <212> PRT <213> Human GPVI <400> 6 Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala 20 25 30 Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys 35 40 45 Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser 50 55 60 Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg 65 70 75 80 Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp 85 90 95 Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala 130 135 140 Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp 145 150 155 160 Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly 165 170 175 Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser 180 185 190 Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr 195 200 205 Pro Ser Arg Leu Pro Thr Glu Pro Pro Ser Pro Val Ala Glu Phe Ser 210 215 220 Glu Ala Thr Ala Glu Leu Thr Val Ser Phe Thr Asn Glu Val Phe Thr 225 230 235 240 Thr Glu Thr Ser Arg Ser Ile Thr Ala Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser 245 250 255 Pro Ala Gly Pro Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg 260 265 270 Ile Cys Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala 275 280 285 Glu Asp Trp His Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala 290 295 300 Val Gln Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Leu Thr Arg Lys 305 310 315 320 Ser Asn Gly Gly Gln Asp Gly Gly Arg Gln Asp Val His Ser Arg Gly 325 330 335 Leu Cys Ser <210> 7 <211> 503 <212> PRT <213> Human TGF-beta receptor <400> 7 Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr 20 25 30 Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys 35 40 45 Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys 50 55 60 Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg 65 70 75 80 Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr 85 90 95 Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro 100 105 110 Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala 115 120 125 Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met 130 135 140 Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn 145 150 155 160 Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr 165 170 175 Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln 195 200 205 Glu Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp 210 215 220 Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg 225 230 235 240 Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His 245 250 255 Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr 260 265 270 Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu 275 280 285 Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys 290 295 300 Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile 305 310 315 320 Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser 325 330 335 Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu 340 345 350 Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala 355 360 365 Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu 370 375 380 Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp 385 390 395 400 Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser 405 410 415 Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val 420 425 430 Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln 435 440 445 Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu 450 455 460 Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala 465 470 475 480 Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser 485 490 495 Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met 500 <110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Pharmaceutical composition for treating thrombosis or cancer using TRAF4 binding motif <130> ADP-2017-0350 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> TRAF4 binding motif <400> 1 Arg Leu Xaa Ala One <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> GPIb-beta <400> 2 Arg Arg Leu Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> GPVI <400> 3 Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala Val Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> TGF-beta receptor 1 <400> 4 Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 206 <212> PRT <213> Human GPIb <400> 5 Met Gly Ser Gly Pro Arg Gly Ala Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Pro Pro Ser Arg Pro Ala Ala Gly Cys Pro Ala Pro Cys Ser Cys 20 25 30 Ala Gly Thr Leu Val Asp Cys Gly Arg Arg Gly Leu Thr Trp Ala Ser 35 40 45 Leu Pro Thr Ala Phe Pro Val Asp Thr Thr Glu Leu Val Leu Thr Gly 50 55 60 Asn Asn Leu Thr Ala Leu Pro Pro Gly Leu Leu Asp Ala Leu Pro Ala 65 70 75 80 Leu Arg Thr Ala His Leu Gly Ala Asn Pro Trp Arg Cys Asp Cys Arg 85 90 95 Leu Val Pro Leu Arg Ala Trp Leu Ala Gly Arg Pro Glu Arg Ala Pro 100 105 110 Tyr Arg Asp Leu Arg Cys Val Ala Pro Pro Ala Leu Arg Gly Arg Leu 115 120 125 Leu Pro Tyr Leu Ala Glu Asp Glu Leu Arg Ala Ala Cys Ala Pro Gly 130 135 140 Pro Leu Cys Trp Gly Ala Leu Ala Ala Gln Leu Ala Leu Leu Gly Leu 145 150 155 160 Gly Leu Leu His Ala Leu Leu Leu Val Leu Leu Leu Cys Arg Leu Arg 165 170 175 Arg Leu Arg Ala Arg Ala Arg Ala Arg Ala Ala Ala Arg Leu Ser Leu 180 185 190 Thr Asp Pro Leu Val Ala Glu Arg Ala Gly Thr Asp Glu Ser 195 200 205 <210> 6 <211> 339 <212> PRT <213> Human GPVI <400> 6 Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala 20 25 30 Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys 35 40 45 Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser 50 55 60 Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg 65 70 75 80 Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp 85 90 95 Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala 130 135 140 Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp 145 150 155 160 Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly 165 170 175 Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser 180 185 190 Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr 195 200 205 Pro Ser Arg Leu Pro Thr Glu Pro Pro Ser Pro Val Ala Glu Phe Ser 210 215 220 Glu Ala Thr Ala Glu Leu Thr Val Ser Phe Thr Asn Glu Val Phe Thr 225 230 235 240 Thr Glu Thr Ser Arg Ser Ile Thr Ala Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser 245 250 255 Pro Ala Gly Pro Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg 260 265 270 Ile Cys Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala 275 280 285 Glu Asp Trp His Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala 290 295 300 Val Gln Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Leu Thr Arg Lys 305 310 315 320 Ser Asn Gly Gly Gln Asp Gly Gly Arg Gln Asp Val His Ser Arg Gly 325 330 335 Leu Cys Ser <210> 7 <211> 503 <212> PRT <213> Human TGF-beta receptor <400> 7 Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr 20 25 30 Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys 35 40 45 Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys 50 55 60 Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg 65 70 75 80 Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr 85 90 95 Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro 100 105 110 Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala 115 120 125 Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met 130 135 140 Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn 145 150 155 160 Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr 165 170 175 Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln 195 200 205 Glu Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp 210 215 220 Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg 225 230 235 240 Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His 245 250 255 Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr 260 265 270 Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu 275 280 285 Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys 290 295 300 Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile 305 310 315 320 Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser 325 330 335 Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu 340 345 350 Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala 355 360 365 Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu 370 375 380 Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp 385 390 395 400 Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser 405 410 415 Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val 420 425 430 Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln 435 440 445 Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu 450 455 460 Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala 465 470 475 480 Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser 485 490 495 Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met 500

Claims

GPIbβ 및 GPVI로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혈소판 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합을 억제하는 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 혈전증 치료용 약학조성물로써,
상기 결합억제제는 하기 화학식 9의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 혈전증 치료용 약학조성물:
[화학식 9]

As a pharmaceutical composition for the treatment of thrombosis containing as an active ingredient a binding inhibitor that inhibits binding between any one or more platelet receptors selected from the group consisting of GPIbβ and GPVI and TRAF4 protein,
The binding inhibitor is a pharmaceutical composition for the treatment of thrombosis, characterized in that the compound of Formula 9 or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
[Formula 9]

청구항 1에 있어서, 상기 결합은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료용 약학조성물.The pharmaceutical composition for treating thrombosis according to claim 1, wherein the binding is mediated by the TRAF4 TRAF domain.

청구항 2에 있어서, 상기 TRAF4 TRAF 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료용 약학조성물.The pharmaceutical composition for treating thrombosis according to claim 2, wherein the TRAF4 TRAF domain comprises a TRAF4 binding motif consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

청구항 3에 있어서, 상기 TRAF4 결합 모티프는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPIbβ 혈소판 수용체 내 Arg-Leu-Arg-Ala 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPVI 혈소판 수용체 내 Arg-Leu-Arg-His와 결합하는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료용 약학조성물.The method according to claim 3, wherein the TRAF4 binding motif is Arg-Leu-Arg-Ala in the GPIbβ platelet receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or Arg-Leu- in the GPVI platelet receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 A pharmaceutical composition for the treatment of thrombosis, characterized in that it binds to Arg-His.

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청구항 1에 있어서, 상기 혈전증은 급성 심근 경색증, 뇌졸증, 폐 혈전증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료용 약학조성물.The method according to claim 1, wherein the thrombosis is selected from the group consisting of acute myocardial infarction, stroke, pulmonary thrombosis, acute peripheral arterial occlusion, deep vein thrombosis, portal vein thrombosis, acute renal vein occlusion, cerebral vein sinus thrombosis, and central retinal vein occlusion. A pharmaceutical composition for the treatment of thrombosis.

GPIbβ 혈소판 수용체 펩타이드 및 TRAF4 단백질 간의 복합체 형성을 억제하는 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 혈전증 치료용 약학조성물로써,
상기 결합억제제는 하기 화학식 9의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 혈전증 치료용 약학조성물:
[화학식 9]

As a pharmaceutical composition for the treatment of thrombosis containing as an active ingredient a binding inhibitor that inhibits the formation of a complex between GPIbβ platelet receptor peptide and TRAF4 protein,
The binding inhibitor is a pharmaceutical composition for the treatment of thrombosis, characterized in that the compound of Formula 9 or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
[Formula 9]

청구항 8에 있어서, 상기 복합체는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GPIbβ 혈소판 수용체의 P_-1 위치의 Arg(R) 및 P₃위치의 Arg(R)이 TRAF4의 E406 및 N355 곁사슬과 각각 수소결합을 형성하고, P₀ 위치의 Leu(L)이 TRAF4의 F408, Y436 및 F434 곁사슬과 P₂ 위치의 Ala(A)이 TRAF4의 W414 및 F434와 상호작용하여 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료용 약학조성물.The method according to claim 8, wherein the complex has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Arg(R) at the P _-1 position and Arg(R) at the P ₃ position of the GPIbβ platelet receptor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is hydrogen with the E406 and N355 side chains of TRAF4, respectively. Thrombosis characterized in that a bond is formed, and Leu (L) at position P ₀ interacts with F408, Y436 and F434 side chains of TRAF4, and Ala (A) at position P ₂ interacts with W414 and F434 of TRAF4 to form a complex. A therapeutic pharmaceutical composition.

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청구항 8에 있어서, 상기 혈전증은 급성 심근 경색증, 뇌졸증, 폐 혈전증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈전증 치료용 약학조성물.The method according to claim 8, wherein the thrombosis is selected from the group consisting of acute myocardial infarction, stroke, pulmonary thrombosis, acute peripheral arterial occlusion, deep vein thrombosis, portal vein thrombosis, acute renal vein occlusion, cerebral vein sinus thrombosis, and central retinal vein occlusion. A pharmaceutical composition for the treatment of thrombosis.

TGF-β 수용체 및 TRAF4 단백질 간의 결합을 억제하는 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암질환 치료용 약학조성물로써,
상기 결합억제제는 하기 화학식 9의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 암질환 치료용 약학조성물:
[화학식 9]

As a pharmaceutical composition for the treatment of cancer diseases containing a binding inhibitor that inhibits the binding between TGF-β receptor and TRAF4 protein as an active ingredient,
The binding inhibitor is a pharmaceutical composition for the treatment of cancer diseases, characterized in that the compound of Formula 9 or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
[Formula 9]

청구항 13에 있어서, 상기 TGF-β 수용체와 TRAF4 단백질 간의 결합은 TRAF4 TRAF 도메인에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 암질환 치료용 약학조성물.The pharmaceutical composition according to claim 13, wherein the binding between the TGF-β receptor and the TRAF4 protein is mediated by the TRAF4 TRAF domain.

청구항 14에 있어서, 상기 TRAF4 TRAF 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TRAF4 결합 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 암질환 치료용 약학조성물.The pharmaceutical composition for treating cancer diseases according to claim 14, wherein the TRAF4 TRAF domain comprises a TRAF4 binding motif consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

청구항 15에 있어서, 상기 TRAF4 결합 모티프는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 TGF-β 수용체 내 Arg-Leu-Thr-Ala와 결합하는 것을 특징으로 하는 암질환 치료용 약학조성물.The pharmaceutical composition for treating cancer diseases according to claim 15, wherein the TRAF4 binding motif binds to Arg-Leu-Thr-Ala in the TGF-β receptor consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

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청구항 13에 있어서, 상기 암질환은 대장암, 위암, 전립선암, 유방암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암질환 치료용 약학조성물.The pharmaceutical for treating cancer diseases according to claim 13, wherein the cancer disease is selected from the group consisting of colon cancer, stomach cancer, prostate cancer, breast cancer, kidney cancer, liver cancer, brain tumor, lung cancer, uterine cancer, colon cancer, bladder cancer and pancreatic cancer composition.