KR102458881B1 - 콜라겐, 및 폴리카프로락톤을 포함하는 치유성이 개선된 다공성 치주조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜라겐, 및 폴리카프로락톤을 포함하는 치유성이 개선된 다공성 치주조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세히는,
본 발명 치주조직 지지는 생체 내로 부작용 없이 주입될 수 있고 또한 일정 시간 경과 후 생체 내에서 분해 흡수되는 다공성 치주조직 재생용 지지체에 관한 것으로 기존의 내부로의 조직 성장과 신생 뼈의 전달을 위한 유효공간인 기공을 효과적으로 제공하며 높은 골재생 능력으로 단시간 내 골재생이 가능하다.

Description

콜라겐, 및 폴리카프로락톤을 포함하는 치유성이 개선된 다공성 치주조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법{A POROUS SCAFFOLD COMPRISING A COLLAGEN AND A POLYCARPROLACTON FOR REGENERATING THE PERIODONTAL COMPLEX HAVING IMPROVED HEALING CHARACTERISTICS, AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 콜라겐, 및 폴리카프로락톤을 포함하는 치유성이 개선된 다공성 치주조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

골조직은 생체 내의 유일한 경조직으로서, 외상, 종양, 기형 혹은 생리적인 현상 등에 의해 손상된 뼈 조직을 골재료로 채워서 신생골을 생성시키게 되는데, 이러한 골 결손부의 회복을 위해 사용되는 보편적인 방법으로는 다른 부위의 자신의 골을 일부 채취하여 이식하는 자가골 이식방법, 다른 사람의 뼈를 화학적 처리 후 이식하는 동종골 이식방법, 사람이 아닌 동물의 뼈를 화학적 처리 후 이식하는 이종골 이식방법 등이 있다(예를 들어 하기 특허문헌 1의 것을 참조하여 이해할 수 있다). 일반적으로 가장 좋은 이식방법인 자가골 이식방법은 환자의 이차적인 수술이 필요하면서 필요한 만큼의 양을 얻기가 힘들며, 일반 개인의원에서 시행하기가 어렵다는 단점이 있다. 그리고 동종골 이식방법의 경우 이차적인 수술은 필요 없지만 면역 반응이 일어날 수 있으며, 확률은 낮지만 간염과 같은 바이러스를 환자 내로 도입할 수 있는 위험도 있다. 이종골 이식방법 역시 면역 반응의 문제점과 광우병 등의 문제가 발생할 경우 사용에 문제가 발생하게 되는 단점이 있다. 이에 충분한 양의 골을 쉽게 얻을 수 있으며, 질병에 대한 전염 가능성이 없고, 기존 이식재를 대체할 만한 성능을 갖는 생체적합성이 우수하고 이식시 적절히 흡수되어 재생골로 치환될 수 있는 골이식(bone-grafting) 재료가 요구되고 있다.

이러한 요구에 따라 개발된 합성 골이식재는 재료에 따라, 금속, 세라믹, 고분자로 구분할 수 있는데, 금속이나 세라믹과 같은 물질은 주로 치아나 뼈와 같은 경조직 대체재로 사용되고 있다. 최근에는 각 재료가 갖는 장점을 살려, 세라믹을 고분자와 복합화하거나 금속을 세라믹과 혼합하여 사용하기도 한다. 특히 세라믹 재료는 뼈와 치아의 무기성분인 아파타이트가 세라믹이라는 점에서 뼈와 화학적으로 잘 결합할 수 있는 장점이 있다.

이러한 특성이 있는 세라믹재료 중 특히 생체활성 세라믹으로는 산화칼슘(CaO)과 산화규소(SiO2)를 주성분으로 하는 생체활성 유리(bioactive glass)와, 뼈의 주요성분인 칼슘과 인으로 구성된 인산칼슘계 세라믹 등이 있다. 다양한 인산칼슘계 세라믹화합물이 인공 골이식재로 개발되어 왔으며 대표적으로 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2, hydroxyapatite: HA)가 골대체제로 상용화되어 다양한 제품으로 제공되고 있는데, 생체 안정성과 골전도 성능이 뛰어난 상기 하이드록시아파타이트는 골결손부 이식 후 중 조직과 자연스럽게 융화되어 잔존골과 생화화학적으로 결합하면서 골견손부를 수복한다. 그러나, 반영구적으로 체내에 잔류하는 하이드록시아파타이트의 특성으로 인해 주기적인 추가가 필요해짐에 따라 이식 후 생분해, 흡수되면서 신생골 생성을 유도하는 생분해성 세라믹 골이식재의 필요성이 대두되었다. 따라서, 이러한 요구에 부응하여 신생골이 되면서 인체 내에서 생분해되고 주위 조직에 흡수되는 경향이 있는 것으로 인산칼슘계 화합물로서 하이드록시아파타이트와 유사한 화학적 특성을 보이는 삼칼슘인산, 특히 베타-삼칼슘인산(β-Ca(PO4)2, β-tricalcium phosphate: β-TCP)의 사용이 제안되어 정형외과와 치과영역에서 쓰이는 경조직 대체 재료로서 널리 사용되고 있다. 이러한 베타-삼칼슘인산 은 골결손부의 수복 이후 수년 이내에 분해, 흡수되는 장점이 있어 다양한 제품에 응용되고 있다.

한편, 상기한 특성을 가지는 세라믹 골이식재는 면역반응이 없고 주위 조직에 대한 부작용이 없기 때문에 안전하게 사용할 수 있는 골 대체 재료지만 세라믹 특성상 다양한 형태의 골결손부에 맞추어 성형하거나 가공할 수 없어 주로 그래뉼(Granules) 형태로 활용되고 있다. 또한, 형태 가공 혹은 성형성의 부재로 인해 자기경화 형태의 골이식재가 개발되어 있다. 초기 자기경화형 골이식재로는 경화 후 뼈의 미네랄성분과 동일한 하이드록시아파타이트를 주성분으로 하는 제품이었으며, 현재까지도 하이드록시아파타이트를 주성분으로 하는 다양한 자기경화형 골이식재가 제품화 되어 있다.

또한 골이식재의 구성요소 중 가장 중요한 것은 기공성으로, 평균 직경 150~850㎛의 기공을 포함하는 이식재가 신생골의 성장과 주위 조직 및 혈관 생성에 도움이 되어 가장 바람직하다. 따라서, 대부분의 세라믹 골이식재들은 성분에 관계없이 다공성의 제품이 상용화 되고 있으며 자기경화형 골이식재도 기공율이 높은 형태로 개발되고 있다. 소결에 의해 제조되는 세라믹 골이식재는 스폰지 제조법이나 발포법 등을 활용하여 직경 50㎛ 이상의 거대기공을 형성시킬 수 있다. 그러나, 자기경화형 골이식재는 수화반응에 의해 최종 구조가 결정되기 때문에 인위적인 거대기공을 제품 내부에 형성시킬 수 없어 나노 내지 수 마이크로 단위의 미세기공을 포함하는 제품으로 개발되고 있다. 이는 골이식재 내부로의 조직 성장과 신생 뼈의 전달을 위한 유효공간인 거대기공을 제공할 수 없는 단점이 있어 골대체제로 활용하기 위한 구조적 개선이 필요한 실정이다.

그리고 낮은 골재생 능력으로 인해 이식 후 치유시간이 긴 단점이 있어 이것에 대한 개선도 필요하다.

KR 10-1574646 B1 (2015.11.30.)

본 발명은 기존의 치주조직 재생용 지지체가 가지고 있던 문제점인 경화성은 가지지만 거대기공을 가지지 못해 골재생 효과가 떨어지는 문제와 스펀지 제조법이나 발포법을 통해 거대기공은 가지지만 경화성을 가지지 못하여 재료 소실됨에 따라 골재생 효과가 떨어지는 문제 및 낮은 치유능력으로 인해 치유시간이 긴 문제를 해결하기 위해 연구를 거듭하였다.

이에 기존에 사용되던 지주조직 재생용 세라믹 재료인 베타-삼칼슘인산과 합성고분자 재료인 폴리카프로락톤을 특정 함량으로 혼합한 후 기공성을 부여하는 공정을 진행하면 높은 기공률과 거대기공과 함께 임플란트 식립시 높은 골재생 능력으로 짧은 시간에 골재생이 가능한 치주조직 지지체가 형성됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 상기 치추재생 지지체 조성물은 신골재생 유도물질로 콜라겐 경화를 위한 구조물질로 폴리카프로락톤으로 이루어진 치주조직 지지체 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 치주재생 지지체 조성물을 용액화하는 단계; (b) 상기 용액화된 지지체 조성물을 저온 혼합하여 슬러리화하는 단계; 및 (c) 상기 슬러리 조성물을 동결건조하는 단계를 포함하는 치주재생 조직 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명 치주조직 지지는 생체 내로 부작용 없이 주입될 수 있고 또한 일정 시간 경과 후 생체 내에서 분해 흡수되는 다공성 치주조직 재생용 지지체에 관한 것으로 기존의 내부로의 조직 성장과 신생 뼈의 전달을 위한 유효공간인 기공을 효과적으로 제공하며 높은 골재생 능력으로 단시간 내 골재생이 가능하다.

도 1은, 본 발명 실시예 1-1의 SEM 사진이다.
도 2는, 본 발명 실시예 2-1의 SEM 사진이다.
도 3은, 본 발명 실시예 3-1의 SEM 사진이다.
도 4는, 본 발명 실시예 4-1의 SEM 사진이다.
도 5는, 본 발명 실시예 5-1의 SEM 사진이다.
도 6은, 본 발명 실시예 6-1의 SEM 사진이다.
도 7은, 본 발명 실시예 2-1의 FT-IR 그래프이다.
도 8은, 본 발명의 실시예 2-1, 3-1, 4-1, 5-1, 6-1의 세포증식성 실험결과를 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명의 일측면은,

구조물질과 신골재생 유도물질로 이루어진 치주재생 지지체로서, 상기 구조물질로서 폴리카프로락톤을, 상기 신골재생 유도물질은 콜라겐을 포함한다.

본 발명의 신골재생 유도물질은 생체적합성 및 골재생에 우수한 생체고분자인 콜라겐을 이용할 수 있고, 상기 콜라겐의 소실을 방지하기 위해 우수한 생분해 합성 고분자인 폴리카프로락톤과 혼합하여 보다 적합한 치주조직 재생용 지지체를 제조할 수 있다.

특히, 폴리카프로락톤 : 콜라겐 = 1 : 0.9 ~ 1.1 중량비인 것, 더 바람직하게는 폴리카프로락톤 : 콜라겐 = 1 : 1 중량비인 것으로서, 우수한 세포증식성을 나타낼 수 있어, 치유성이 개선된 다공성 치주조식 재생용 지체를 제공할 수 있다.

상기 콜라겐은 분자량 5 ~ 15 kDa 범위 이내인 것, 더 바람직하게는 분자량 약 10 kDa 내인 것으로서, 분해기간이 바람직할 뿐 아니라 지지체 역할에 적합한 높은 인장강도를 나타내면서도 세포증식성이 우수하다.

본 발명의 치주조직 재생용 지치체의 다공성 구조는 스펀지 형태이 바람직하다.

본 발명의 다른 측면은,

구조물질과 신골재생 유도물질로 이루어진 치주재생 지지체의 제조방법으로서,

(a) 치주재생 지지체 조성물을 용액화하는 단계;

(b) 상기 용액화된 지지체 조성물을 저온 혼합하여 슬러리화하는 단계; 및

(c) 상기 슬러리 조성물을 동결건조하는 단계를 포함하되,

상기 (a) 단계는, 폴리카프로락톤 : 콜라겐 = 1 : 0.9 ~ 1.1 중량비로, 유기용매 상에서 폴리카프로락톤, 및 콜라겐을 혼합하여 용액화하는 것을 특징으로 한다.

상기 유기용매는 아세트산(acetic acid), 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 및 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)에서 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 아세트산이 선택될 수 있다.

상기 (c) 동결건조 단계는 지지체 최종 물성에 영향을 줄 수도 있는데, 일반적인 건조와 달리 동결건조는 용매가 휘발하여 건조되더라도 재료의 부피 변화없이 용매가 있던 자리는 공극으로 남게 되어 균일하고 양질의 기공을 확보하는데 유리할 수 있다.

본 발명에서 있어서, 동결건조 조건이 특별히 제한되는 것은 아니고, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 동결건조 조건을 설정할 수 있으나, -40℃, 5 mTorr의 진공 조건 하에서 진행하는 것이 바람직하고, 24 내지 122시간 동안 진행하거나, 더 바람직하게 48 내지 96시간, 더더욱 바람직하게 72 시간 내지 96시간 동안 진행할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이하의 실시예는 발명의 상세한 설명을 위한 것일 뿐, 이에 의해 권리범위를 제한하려는 의도가 아님을 분명히 해둔다.

실시예

폴리카프로락톤 ( PCL : Polycarprolactone ) 분자량 선정

폴리카프로락톤(PCL)은 분자량에 따라 분해기간이 상이한 것을 확인하였고, 이에 따라 본원발명 다공성 치주조직 재생용 지지체 목적에 부합하는 폴리카프로락톤을 선정하기 위해 폴리카프로락톤 스펀지를 제조하여 분해기간을 당해 기술분야의 통상의 방법으로 측정하였다.

결과는 표 1과 같았다.

	분자량(Da)	분해기간
PCL sponge	10,000	6개월
	20,000	8개월
	40,000	1년
	80,000	1년 6개월

임플란트 시술기간, 세포 재생시간 등의 여러 제반여건을 고려하면, 지지체 골격구조를 형성하는 PCL의 분해기간은 대략 6개월 내지 1년 사이 정도의 것을 고려할 수 있고, 약 8개월 내외인 것이 바람직하므로, 폴리카프로락톤(PCL)은 약 20,000인 것을 선정하여 사용하였다.

콜라겐(Collagen), 폴리카프로락톤 ( PCL : Polycarprolactone ) 용액 제조

본 발명에서는 구성성분들을 하기 표 2에 기재된 비율에 따라 혼합하고 25 ℃에서 아세트산 용매에서 하루 동안 교반하여 균질화하였다.

(1) 구조물질: 신골 재생물질이 소실을 방지하며 자기 경화를 부여하는 재료로 폴리카프로락톤(PCL)을 사용하였다.

(2) 유기용매: 치주 재생용 지지체 제조 용액을 만들기 위하여 아세트산을 사용하였다.

(3) 신골 재생물질: 치조골 재생효과를 위한 재료로 콜라겐을 사용하되, 분자량이 서로 다른 5가지 종류의 것을 사용하였다.

실시예	아세트산(mL)	폴리카프로락톤(mg)	콜라겐(mg)*
1-1	40	200	400 (1kDa)
1-2			400 (3kDa)
1-3			400 (5kDa)
1-4			400 (10kDa)
1-5			400 (30kDa)
2-1		400	400 (1kDa)
2-2			400 (3kDa)
2-3			400 (5kDa)
2-4			400 (10kDa)
2-5			400 (30kDa)
3-1		800	400 (1kDa)
3-2			400 (3kDa)
3-3			400 (5kDa)
3-4			400 (10kDa)
3-5			400 (30kDa)
4-1		1200	400 (1kDa)
4-2			400 (3kDa)
4-3			400 (5kDa)
4-4			400 (10kDa)
4-5			400 (30kDa)
5-1		1600	400 (1kDa)
5-2			400 (3kDa)
5-3			400 (5kDa)
5-4			400 (10kDa)
5-5			400 (30kDa)
6-1		2000	400 (1kDa)
6-2			400 (3kDa)
6-3			400 (5kDa)
6-4			400 (10kDa)
6-5			400 (30kDa)
* 콜라겐은 분자량이 다른 5가지 종류를 사용하였고, 분자량이 다른 콜라겐의 번호는 각 실시예들의 가지번호로 함(1: 1kDa, 2: 3kDa, 3: 5kDa, 4: 10kDa, 5: 30kDa)

상기 용액을 준비하는 단계에는 유기용매에 폴리카프로락톤을 첨가한 후 12 내지 72시간 동안 300 내지 500 rpm의 속도로 교반하였다.상기 폴리카프로락톤에 첨가된 유기용매는 아세트산(acetic acid), 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 또는 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 사용할 수 있으나 아세트산을 사용하는 것이 바람직하다.

폴리카프로락톤 ( PCL : Polycarprolacton ), 콜라겐(Collagen) 저온 혼합

상기 제조한 치주재생 지지체를 슬러리화 하기 위하여 100㎖ 유리병에 각각실시예들은 가한 후 4℃ 조건에서 12 내지 72시간 동안 300 내지 500rpm의 속도로 교반하였다.

동결건조

상기 제조한 냉동된 치주재생 지지체 용액 동결건조기를 이용하여 -40℃, 5 mTorr의 진공 조건 하에서, 72 내지 96시간 동결건조를 진행하여 스펀지 형태의 기공 부여하였다.

SEM 및 FT-IR을 통한 표면 확인

상기 제조된 치주재생 지지체 다공성을 SEM을 통하여 확인하였다.

실시예 1-1 내지 1-5의 콜라겐 대 폴리카프로락톤의 비율이 50% 이하에서는 콜라겐을 바인딩하지 못하며, 스펀지 형태가 아닌 가루 형태가 나타났다(도 1 참조).

반대로 실시예 2-1 내지 2-5, 3-1 내지 5, 4-1 내지 4-5, 5-1 내지 5-5, 및 6-1 내지 6-5에서는 스펀지 형태의 기공구조가 나타났다(도 2 내지 6 참조). 다만, 평균 기공의 크기와 기공도, 기공의 형태 등에서 실시예들 상호 간에 다소 차이가 있었는데, 이는 후술할 세포증식에 영향을 미칠 것으로 보인다.

한편, 상기 제조된 치주재생 지지체가 혼합이 잘 이루어진 지지체임을 확인하기 위하여 을 FT-IR 분석을 통하여 구성요소를 확인하였다(도 7).

2900 1700에서 보이는 peak가 PCL이 존재함을 보여주고 있고 1500에서 보이는 peak가 확인됨으로써 collagen 존재함이 확인되었다. 이것은 혼합이 잘 되었음을 보여준다.

세포증식성 확인

상기 제조된 치주재생 지지체에 대한 세포증식성을 확인하기 위하여 세포실험을 진행하여 확인하였다. 다만, 실시예1-1 내지 1-5의 경우 가루 형태로 세포실험에서는 제외하였다.

결과는 도 8에 나타낸 바와 같았고, 실시예 2-1에서 세포 증식이 가장 뛰어나며 3일차 이후부터 유일하게 조직 분화가 일어남을 확인할 수 있었다. 이로써, 폴리카프로락톤 : 콜라겐 = 1 : 1 비율이 세포증식성 측면에서 가장 바람직한 것임을 확인할 수 있었다.

인장강도 및 분해기간 확인

세포증식성 측면에서 가장 효과 우수한 실시예 2-1 내지 2-5를 대상으로 제품화를 위해서 중요한 물성인 인장강도, 분해기간 등의 물성을 측정하였다.

측정결과는 하기 표 3와 같았다.

실시예	분자량 [kDa]	인장강도 [MPa]	분해기간 [weeks]	cell proliferation [%]
2-1	1	1	1	120
2-2	3	2	2	130
2-3	5	3	4	140
2-4	10	6	12	160
2-5	30	6	22	130

상기 표 3에 나타나 있듯이, 콜라겐의 인장강도는 분자량에 따라 증가하는 경향을 나타내기는 하지만 정비례하지는 않으며 분자량이 높아질수록 분자량 증가분에 따른 인장강도 증가효과는 점차 떨어지는 것으로 확인되었다.

아울러, 분자량이 약 10kDa 내외에서 세포 지지체 역할로 적당하며, 분해기간이 12주인 10 kDa이 골이식재로 사용하기에 가장 적합함을 확인하였다.

Claims (10)

1. 구조물질과 신골재생 유도물질로 이루어진 치주재생 지지체에 있어서,
   상기 구조물질은 폴리카프로락톤을 포함하고,
   상기 신골재생 유도물질은 콜라겐을 포함하며,
   폴리카프로락톤 : 콜라겐 = 1 : 0.9 ~ 1.1 중량비인 것으로서,
   지지체는 다공성 구조를 가진 것이고,
   상기 콜라겐은 분자량 5 ~ 15 kDa 범위 이내인 것을 특징으로 하는 치주조직 재생용 지지체.
2. 청구항 1에 있어서, 폴리카프로락톤 : 콜라겐 = 1 : 1 중량비인 것을 특징으로 하는 치주조직 재생용 지지체.
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서, 상기 콜라겐은 분자량 10 kDa인 것을 특징으로 하는 치주조직 재생용 지지체.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 다공성 구조는 스펀지 형태인 것을 특징으로 하는 치주조직 재생용 지지체.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리카프로락톤은 분자량 20,000 Da인 것을 특징으로 하는 치주조직 재생용 지지체.
7. 구조물질과 신골재생 유도물질로 이루어진 치주재생 지지체의 제조방법으로서,
   (a) 치주재생 지지체 조성물을 용액화하는 단계;
   (b) 상기 용액화된 지지체 조성물을 저온 혼합하여 슬러리화하는 단계; 및
   (c) 상기 슬러리화 된 치주재생 지지체 조성물을 동결건조하는 단계를 포함하되,
   상기 (a) 단계는, 폴리카프로락톤 : 콜라겐 = 1 : 0.9 ~ 1.1 중량비로, 유기용매 상에서 폴리카프로락톤, 및 콜라겐을 혼합하여 용액화하는 것이고,
   상기 콜라겐은 분자량 5 ~ 15 kDa 범위 이내인 것을 특징으로 하는 치주재생 지지체의 제조방법.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 유기용매는 아세트산(acetic acid), 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 및 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 치주재생 지지체의 제조방법.
9. 청구항 7에 있어서, 상기 (c) 단계는 -40℃, 5 mTorr의 진공 조건 하에서 동결건조 하는 것을 특징으로 하는 치주재생 지지체의 제조방법.
10. 청구항 7에 있어서, 상기 (c) 단계는 24 내지 122시간 동안 동결건조 하는 것을 특징으로 하는 치주재생 지지체의 제조방법.

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