KR102453073B1

KR102453073B1 - Method for preparation of bispecific antibody using Pichia Pastoris and bispecific antibody prepared thereby

Info

Publication number: KR102453073B1
Application number: KR1020200102601A
Authority: KR
Inventors: 김찬길; 이승현; 원형식; 김보람; 김경민; 변규태
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2022-10-11
Also published as: KR20220021705A

Abstract

본 발명은 효모 균주인 피키아 파스토리스를 이용한 이중특이적 항체의 제조방법 및 이에 따른 이중특이적 항체에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 기존 방법에 비해 현저히 저렴한 비용으로 단시간에 고활성의 이중특이적 항체를 제조할 수 있어, 경제적인 측면에서 매우 유리하다.The present invention relates to a method for producing a bispecific antibody using a yeast strain, Pichia pastoris, and a bispecific antibody according thereto.
According to the production method of the present invention, it is possible to produce a highly active bispecific antibody in a short time at a significantly lower cost compared to the existing method, which is very advantageous in terms of economy.

Description

피키아 파스토리스를 이용한 이중특이적 항체의 제조방법 및 이에 따른 이중특이적 항체{Method for preparation of bispecific antibody using Pichia Pastoris and bispecific antibody prepared thereby}Method for preparation of bispecific antibody using Pichia Pastoris and bispecific antibody prepared thereby

본 발명은 효모 균주인 피키아 파스토리스를 이용한 이중특이적 항체의 제조방법 및 이에 따른 이중특이적 항체에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a bispecific antibody using a yeast strain, Pichia pastoris, and a bispecific antibody according thereto.

개별 세포 또는 특정 세포 유형의 선택적 파괴는 종종 다양한 임상적 환경에서 바람직하다. 예를 들면, 건강한 세포 및 조직은 손상시키지 않으면서 종양 세포를 특이적으로 파괴하는 것이 암 치료의 일차 목적이다.Selective destruction of individual cells or specific cell types is often desirable in a variety of clinical settings. For example, the primary goal of cancer treatment is to specifically destroy tumor cells without damaging healthy cells and tissues.

이를 달성하는 흥미로운 방법은 종양에 대한 면역 반응을 유도하여 면역 효과기 세포(effector cell), 예를 들면, 천연 살해(NK) 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL) 공격을 유발함으로써 종양 세포를 파괴하는 것이다. CTL은 면역계의 가장 강력한 효과기 세포를 구성하지만, 통상적인 치료 항체의 Fc 도메인에 의해 매개되는 효과기 기작에 의해 활성화될 수 없다.An interesting way to achieve this is to induce an immune response against the tumor, which destroys the tumor cells by triggering an attack on immune effector cells, such as natural killer (NK) cells or cytotoxic T lymphocytes (CTLs). . CTLs constitute the most potent effector cells of the immune system, but cannot be activated by effector mechanisms mediated by the Fc domain of conventional therapeutic antibodies.

이와 관련하여, 하나의 말단은 표적 세포 상의 표면 항원에 결합하고 다른 하나의 말단은 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화 불변 성분에 결합하도록 디자인된 이중특이적 항체가 최근에 관심을 끌고 있다. 이러한 항체와 이의 표적들 둘다의 동시적인 결합은 표적 세포와 T 세포 사이의 일시적인 상호작용을 발생시켜, 임의의 세포독성 T 세포의 활성화 및 표적 세포의 후속 용해를 야기할 것이다. 따라서, 면역 반응은 표적 세포로 방향 전환되고, CTL의 일반적인 MHC-제한된 활성화에 대해 관련되므로 표적 세포에 의한 펩티드 항원 제시 또는 T 세포의 특이성과 무관하다. 이와 관련하여, 표적 세포가 이중특이적 항체를 CTL에 제시할 때, 즉 면역학적 시냅스가 모방될 때에만 CTL이 활성화된다는 것은 매우 중요하다. 표적 세포의 효율적인 용해를 이끌어내기 위해 림프구 전처리화 또는 보조자극을 요구하지 않는 이중특이적 항체가 특히 바람직하다.In this regard, bispecific antibodies designed to bind one end to a surface antigen on a target cell and the other to the activation constant component of the T cell receptor (TCR) complex have recently attracted attention. Simultaneous binding of this antibody to both its targets will result in a transient interaction between the target cell and the T cell, resulting in activation of any cytotoxic T cells and subsequent lysis of the target cell. Thus, the immune response is redirected to the target cell and is related to the general MHC-restricted activation of CTLs and is therefore independent of peptide antigen presentation by the target cell or specificity of the T cell. In this regard, it is very important that the CTL is activated only when the target cell presents the bispecific antibody to the CTL, ie when the immunological synapse is mimicked. Bispecific antibodies that do not require lymphocyte pretreatment or costimulation to elicit efficient lysis of target cells are particularly preferred.

여러 가지의 이중특이적 항체 플랫폼이 개발되었고, 특히 T 세포 매개된 면역치료에 대한 이들의 적합성이 연구되었다. 이들 중에서 BiTE(Bi-Specific T cell Engager; 이중특이적 T 세포 관여자)는 단일고리로 연결된 두 개 항체의 절편(single-chain variable fragments, scFvs)으로 이루어진 융합단백, 또는 4개의 다른 유전자로부터 전사된 아미노산 시퀀스라고 할 수 있다. scFvs 하나는 T 세포의 CD3 수용체를 찾아서 활성화시키는 부분이고, 또 다른 부분은 백혈병 등의 종양의 세포막 항원을 표적으로 이들과 결합한다. 다른 단세포군 항체와 달리 BiTEs는 T 세포와 종양 세포를 연결해 주는 다리 역할을 한다. Several bispecific antibody platforms have been developed, and their suitability has been studied in particular for T cell mediated immunotherapy. Among them, BiTE (Bi-Specific T cell Engager) is a fusion protein consisting of single-chain variable fragments (scFvs) of two antibodies linked by a single ring, or transcribed from four different genes. It can be called an amino acid sequence. One scFvs is a part that finds and activates the CD3 receptor of T cells, and the other part binds to a cell membrane antigen of a tumor such as leukemia as a target and binds to them. Unlike other unicellular antibodies, BiTEs act as a bridge between T cells and tumor cells.

상기 BiTEs 중에서, 블리나투모맙(BLINCYTO^TM, 암젠)은 B 세포에 존재하는 CD19 항원을 표적으로 하는데, 환자 치료 목적으로 사용할 경우는 환자의 T 세포로 하여금 악성 B 세포를 인식하도록 한다. 블리나투모맙 분자는 T 세포의 CD3 부위 및 표적 B 세포의 CD19 부위와 결합할 수 있는 두 개의 결합 부위를 갖는다. 이 두 세포를 이어줌으로써 작용을 나타내는데 궁극적으로는 T 세포를 활성화하여 표적 세포에 대한 세포 독성 효과를 나타낼 수 있게 되는 것이다.Among the BiTEs, blinatumomab (BLINCYTO ^TM , Amgen) targets the CD19 antigen present on B cells, and when used for patient treatment, allows the patient's T cells to recognize malignant B cells. The blinatumomab molecule has two binding sites capable of binding to the CD3 site of T cells and the CD19 site of target B cells. It shows action by connecting these two cells, and ultimately it becomes possible to activate T cells to show cytotoxic effects on target cells.

상기 블리나투모맙은 미국 FDA와 유럽 EMA 승인을 획득한 급성림프구성 백혈병(ALL) 치료제로서 재발 불응성 ALL에 대해서도 관해 도달 효과가 있는 것으로 나타났으며, 기존의 세포독성 항암요법과 비교해 수십년만에 개발된 재발 불응성 ALL 치료제이므로 대체 치료제가 거의 없는 실정이다. 그러나 상기 블리나투모맙은 치료 2 코스의 비용이 약 17만 8000 달러로, 전 세계에서 가장 비싼 치료제 6위를 기록하였다. 이와 같이, 블리나투모맙의 가격이 고가로 책정된 이유는 상기 치료제의 생산 단가가 매우 높기 때문이다. The blinatumomab is a treatment for acute lymphocytic leukemia (ALL) that has obtained approval from the US FDA and European EMA, and has been shown to have an effect of reaching remission and refractory ALL for several decades compared to the existing cytotoxic chemotherapy. As it is a treatment for relapse-refractory ALL that was developed in the past, there are few alternative treatments. However, the cost of 2 courses of blinatumomab was about $ 178,000, ranking 6th most expensive treatment in the world. As such, the reason why the price of blinatumomab is set at a high price is because the production cost of the therapeutic agent is very high.

따라서, 상기 블리나투모맙을 보다 저비용으로 생산할 수 있는 기술이 요구된다.Therefore, there is a need for a technology capable of producing the blinatumomab at a lower cost.

근래에 유전자 재조합 기술을 이용하여 목적하는 단백질을 발현시켜 정제하는 방법은 자주 이용되어지고 있으며 또 재조합 단백질을 생산하기 적합한 다수의 숙주세포들이 개발되어 있다. 그 중 효모인 피키아 파스토리스는 성장 속도가 빨라 연속 발현 벡터 내에 인위적으로 삽입한 재조합 유전자로부터 특정 단백질을 대량 생산할 수 있고, 일반적인 진핵생물의 단백질 발현 양상을 갖고 있어 다른 진핵생물 유래 단백질을 거의 동일하게 발현시킬 수 있다. 또한, 피키아 파스토리스는 자체 단백질을 분비하는 정도가 매우 낮은 대신, 값싼 단백질 결핍배지에서 재조합 단백질을 리터당 그램 수준까지 세포 외로 분비시킬 수 있을 뿐만 아니라 발효조를 이용하여 배양할 경우, 플라스크에서보다 보통 20~100배까지 발현양이 증가될 수 있다. 또한, 몇 번의 계대 배양(신선한 배지로의 교체)만으로도 세포 유지가 가능하고, 유도제(inducer)가 필요하지 않아 공장단위의 생산시 단가가 절감된다.Recently, a method of expressing and purifying a desired protein using a genetic recombination technique is frequently used, and a number of host cells suitable for producing a recombinant protein have been developed. Among them, Pichia pastoris, a yeast, has a fast growth rate and can mass-produce a specific protein from a recombinant gene artificially inserted into a continuous expression vector. can be expressed. In addition, while Pichia pastoris secretes its own protein very low, it can secrete the recombinant protein extracellularly up to a gram per liter level in a cheap protein-deficient medium, and when cultured using a fermenter, it is more common than in flasks. The expression level can be increased by 20 to 100 times. In addition, cell maintenance is possible only with a few subcultures (replacement with a fresh medium), and since an inducer is not required, the unit cost is reduced during production in a factory unit.

상기에 언급한 바와 같이 다방면에서 그 가치를 인정받고 있는 피키아 파스토리스 발현 체계는 이미 VEGF(vascular epithelial growth factor), TNF(tumor necrosis factor), 길안텐(ghilanten) 등과 같은 치료 목적의 여러 포유동물 유래 단백질들의 발현에 이용된 바 있으나, 아직까지 BiTE 등의 이중특이적 항체 발현에 관련된 내용은 전무하다.As mentioned above, the Pichia pastoris expression system, which has been recognized for its value in various fields, is already VEGF (vascular epithelial growth factor), TNF (tumor necrosis factor), several mammals for therapeutic purposes, such as ghilanten. Although it has been used for the expression of derived proteins, there is still no content related to the expression of bispecific antibodies such as BiTE.

US 10000574 B2US 10000574 B2 KR 10-2002-0090036 AKR 10-2002-0090036 A

본 발명의 목적은 피키아 파스토리스 발현 체계를 이용한 이중특이적 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for producing a bispecific antibody using the Pichia pastoris expression system.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기한 방법에 따라 제조된 이중특이적 항체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a bispecific antibody prepared according to the above method.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 제1 결합 도메인을 통해 표적 세포 표면 항원에 결합하고 제2 결합 도메인을 통해 T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 이중특이적 항체를 제작하는 단계; (2) 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; (3) 상기 발현벡터로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 형질전환시키는 단계; 및 (4) 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 배양하여 이중특이적 항체의 발현을 유도하는 단계;를 포함하는 이중특이적 항체의 제조방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of (1) constructing a bispecific antibody that binds to a target cell surface antigen through a first binding domain and binds to a T cell surface antigen CD3 through a second binding domain; (2) constructing a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding the bispecific antibody; (3) transforming Pichia pastoris with the expression vector; And (4) inducing the expression of the bispecific antibody by culturing the transformed Pichia pastoris; provides a method for producing a bispecific antibody comprising.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 따라 제조된 이중특이적 항체를 제공한다.In addition, the present invention provides a bispecific antibody prepared according to the above method.

본 발명의 제조방법에 따르면, 기존 방법에 비해 현저히 저렴한 비용으로 단시간에 고활성의 이중특이적 항체를 제조할 수 있어, 경제적인 측면에서 매우 유리하다.According to the production method of the present invention, it is possible to produce a highly active bispecific antibody in a short time at a significantly lower cost compared to the existing method, which is very advantageous in terms of economy.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 pHIL-S1 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 서열번호 1로 표시되는 이중특이적 항체 유전자(D21)가 pHIL-S1 벡터에 삽입된 재조합 발현벡터(D21/pHIL-S1)의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 얻은 형질전환체를 이용하여 단백질 발현을 유도하는 방법을 나타내는 개략도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 발현된 D21의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 얻은 형질전환체(GS115-D21-105) 클론을 다양한 배양 온도 및 유도 시간으로 배양하는 경우의 D21 단백질 발현을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 D21 및 BLINCYTO의 LC-MS/MS 분석 및 PECKS^TM Software를 이용하여 수행한 펩티드 맵핑 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 얻은 D21(도 7a) 및 BLINCYTO(도 7b)의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 D21(도 8a) 및 BLINCYTO(도 8b)의 분자량을 확인하기 위한 MALDI-TOF-MS 분석 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 D21 및 BLINCYTO의 항원에 대한 친화도(affinity)를 분석한 결과이다. 친화도는 평형해리상수 K_d로 얻었다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 D21 및 BLINCYTO의 암 세포에서의 항원 결합 친화도(K_d 값)를 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 10a는 D21 및 BLINCYTO의 CD19 항원에 대한 암 세포에서의 CD19에 대한 항원 결합 친화도(K_d 값)를 나타내는 것이고, 도 10b는 D21 및 BLINCYTO의 CD3 항원에 대한 암 세포에서의 CD3에 대한 항원 결합 친화도(K_d 값)를 나타내는 것이다. 1 shows a cleavage map of the pHIL-S1 vector used in an embodiment of the present invention.
2 shows a cleavage map of a recombinant expression vector (D21/pHIL-S1) in which the bispecific antibody gene (D21) represented by SEQ ID NO: 1 is inserted into a pHIL-S1 vector according to an embodiment of the present invention.
3 is a schematic diagram showing a method of inducing protein expression using the transformant obtained in an embodiment of the present invention.
4 is an SDS-PAGE analysis result of D21 expressed according to an embodiment of the present invention.
5 is a result of SDS-PAGE analysis of D21 protein expression when the transformant (GS115-D21-105) clone obtained in an embodiment of the present invention is cultured at various incubation temperatures and induction times.
6 is a LC-MS/MS analysis of D21 and BLINCYTO according to an embodiment of the present invention and peptide mapping results performed using PECKS ^TM Software.
7 is an SDS-PAGE analysis result of D21 (FIG. 7a) and BLINCYTO (FIG. 7b) obtained in an embodiment of the present invention.
8 is a MALDI-TOF-MS analysis result for confirming the molecular weights of D21 (FIG. 8a) and BLINCYTO (FIG. 8b) according to an embodiment of the present invention.
9 is a result of analyzing the affinity (affinity) for antigens of D21 and BLINCYTO according to an embodiment of the present invention. Affinity was obtained as the equilibrium dissociation constant K _d .
10 is a result of analyzing the antigen-binding affinity (K _d value) of D21 and BLINCYTO in cancer cells according to an embodiment of the present invention. Specifically, FIG. 10A shows the antigen binding affinity (K _d value) for CD19 in cancer cells for the CD19 antigen of D21 and BLINCYTO, and FIG. 10B shows CD3 in cancer cells against the CD3 antigen of D21 and BLINCYTO. It represents the antigen-binding affinity (K _d value) for

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 (1) 제1 결합 도메인을 통해 표적 세포 표면 항원에 결합하고 제2 결합 도메인을 통해 T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 이중특이적 항체를 제작하는 단계; (2) 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; (3) 상기 발현벡터로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 형질전환시키는 단계; 및 (4) 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 배양하여 이중특이적 항체의 발현을 유도하는 단계;를 포함하는 이중특이적 항체의 제조방법에 관한 것이다.The present invention comprises the steps of (1) constructing a bispecific antibody that binds to a target cell surface antigen through a first binding domain and binds to a T cell surface antigen CD3 through a second binding domain; (2) constructing a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding the bispecific antibody; (3) transforming Pichia pastoris with the expression vector; and (4) inducing the expression of the bispecific antibody by culturing the transformed Pichia pastoris.

본 명세서에서, 용어 "이중특이적 항체"는 동일한 항원 또는 상이한 항원의 상이한 에피토프들에 각각 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다. As used herein, the term "bispecific antibody" refers to an antibody having two or more binding sites that each bind to different epitopes of the same antigen or different antigens.

본 발명의 이중특이적 항체는 BiTE(이중특이적 T 세포 관여자) 항체일 수 있다. 상기 BiTE 항체는 두 개의 유연하게 연결된 항체 유도 결합 도메인으로부터 만들어진 재조합 단백질로서, 제1 결합 도메인은 표적 세포 상의 선택된 종양-관련 표면 항원에 특이적이고; 제2 결합 도메인은 CD3, 즉, T 세포 상의 T 세포 수용체 복합체의 서브유닛에 대하여 특이적이다.The bispecific antibody of the present invention may be a BiTE (bispecific T cell actor) antibody. The BiTE antibody is a recombinant protein made from two flexibly linked antibody inducing binding domains, the first binding domain being specific for a selected tumor-associated surface antigen on a target cell; The second binding domain is specific for CD3, a subunit of the T cell receptor complex on the T cell.

본 명세서에서, "가(valent)"는 특정된 수의 결합 부위가 항체 분자에 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위가 항체 분자에 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 "2가" 항체이고, "3가" 또는 "다가"(예를 들면, "4가" 또는 "6가") 항체일 수 있다. As used herein, "valent" means that a specified number of binding sites are present in an antibody molecule. Thus, the terms “bivalent”, “tetravalent” and “hexavalent” mean that two binding sites, four binding sites and six binding sites are present in an antibody molecule, respectively. A bispecific antibody according to the invention is at least a “bivalent” antibody, and may be a “trivalent” or “multivalent” (eg, “tetravalent” or “hexavalent”) antibody.

본 발명의 항체는 2개 이상의 결합 도메인을 갖는 이중특이적 항체이다. 즉, 본 발명의 항체에는 2개를 초과하는 결합 도메인이 존재할 수 있다.Antibodies of the invention are bispecific antibodies having two or more binding domains. That is, there may be more than two binding domains in an antibody of the invention.

본 발명에 따른 이중특이적 항체의 제조방법은 종래 CHO 세포 발현 체계를 이용하여 발생되는, 생산 단가 증대 문제점을 해결하기 위하여, CHO 세포 발현 체계 대신 피키아 파스토리스 발현 체계를 이용하되, 이중특이적 항체의 대량 생산을 위해 피키아 파스토리스의 배양 조건, 즉 발현 유도 조건을 최적화함으로써 고가의 생산 단가 문제를 해결할 수 있다. The method for producing a bispecific antibody according to the present invention uses a Pichia pastoris expression system instead of a CHO cell expression system in order to solve the problem of increasing production cost, which is caused by using a conventional CHO cell expression system, By optimizing the culture conditions of Pichia pastoris, ie, expression induction conditions, for mass production of antibodies, it is possible to solve the problem of expensive production cost.

(1) 이중특이적 항체 제작 단계(1) bispecific antibody production step

본 발명은 제1 결합 도메인을 통해 표적 세포 표면 항원에 결합하고 제2 결합 도메인을 통해 T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 이중특이적 항체를 제작한다.The present invention constructs a bispecific antibody that binds to a target cell surface antigen through a first binding domain and binds to a T cell surface antigen CD3 through a second binding domain.

본 발명의 이중특이적 항체는 BiTE 항체일 수 있다. 상기 이중특이적 항체는 종양의 부위에서 특이적으로 면역 반응을 유발하여 결과적으로 표적 세포의 아폽토시스를 야기할 수 있다. The bispecific antibody of the invention may be a BiTE antibody. The bispecific antibody can induce an immune response specifically at the site of the tumor, resulting in apoptosis of the target cell.

상기 제1 결합 도메인은 CD19, CEA, MUC-1, EpCAM, HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, CA19-9, Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, CD24, CD44, E-카데린, SPARC, ErbB2 및 ErbB3 중에서 선택되는 1 종의 종양 항원에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.The first binding domain is CD19, CEA, MUC-1, EpCAM, HER1, HER2, HER3, HER4, PEM, A33, G250, CA19-9, Ley, Lex, Leb, PSMA, TAG-72, STEAP1, CD166, It may specifically bind to one type of tumor antigen selected from CD24, CD44, E-cadherin, SPARC, ErbB2 and ErbB3.

상기 제2 결합 도메인은 T 세포 표면 항원 CD3에 특이적으로 결합하는 것으로, T 세포 항원과의 상호작용을 통해 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 유발함으로써 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다. The second binding domain specifically binds to the T cell surface antigen CD3, and may induce T cell activation by inducing a signaling cascade of the T cell receptor complex through interaction with the T cell antigen.

본 발명에 따른 구체적인 실시 양태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 종양 세포 표면 항원 및 T 세포 표면 항원에 동시적으로 결합할 수 있다. 한 실시 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 종양 세포 표면 항원 및 T 세포 표면 항원에 동시적으로 결합함으로써 T 세포와 종양 세포를 가교결합시킬 수 있다. 이러한 동시적인 결합은 종양 세포의 용해 및 T 세포의 활성화를 야기할 수 있다. 한 실시 양태에서, 표적 세포 항원과의 동시적인 결합의 부재 하에서의 상기 이중특이적 항체와 T 세포 표면 항원의 결합은 T 세포 활성화를 야기하지 않는다.In a specific embodiment according to the present invention, the bispecific antibody of the present invention is capable of binding to a tumor cell surface antigen and a T cell surface antigen simultaneously. In one embodiment, the bispecific antibody is capable of cross-linking T cells and tumor cells by simultaneously binding to a tumor cell surface antigen and a T cell surface antigen. This simultaneous binding can lead to lysis of tumor cells and activation of T cells. In one embodiment, binding of said bispecific antibody to a T cell surface antigen in the absence of simultaneous binding to a target cell antigen does not result in T cell activation.

한 실시 양태에서, 상기 이중특이적 항체는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 방향 전환시킬 수 있다. 구체적인 실시 양태에서, 상기 방향 전환은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다. 구체적으로, 본 발명의 실시 양태들 중 임의의 실시 양태에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 몇몇 실시 양태에서, 상기 T 세포는 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포, 특히 CD8⁺ T 세포이다.In one embodiment, the bispecific antibody is capable of redirecting the cytotoxic activity of a T cell to a target cell. In a specific embodiment, said redirection is independent of MHC-mediated peptide antigen presentation by the target cell and/or specificity of the T cell. Specifically, the T cell according to any of the embodiments of the invention is a cytotoxic T cell. In some embodiments, the T cell is a CD4 ⁺ or CD8 ⁺ T cell, particularly a CD8 ⁺ T cell.

바람직하게는, 상기 이중특이적 항체는 CD3 및 CD19에 특이적으로 결합하는 CD3×CD19 이중특이적 항체일 수 있다. Preferably, the bispecific antibody may be a CD3×CD19 bispecific antibody that specifically binds to CD3 and CD19.

더욱 바람직하게는, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 1 및 서열번호 2 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 CD3×CD19 이중특이적 항체일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 CD3×CD19 이중특이적 항체는 D21이라고 지칭될 수 있고, 상기 서열번호 2로 표시되는 CD3×CD19 이중특이적 항체는 BLINCYTO로 지칭될 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CD3×CD19 이중특이적 항체(D21)일 수 있다. More preferably, the bispecific antibody may be a CD3×CD19 bispecific antibody represented by any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. In the present specification, the CD3×CD19 bispecific antibody represented by SEQ ID NO: 1 may be referred to as D21, and the CD3×CD19 bispecific antibody represented by SEQ ID NO: 2 may be referred to as BLINCYTO. Most preferably, the bispecific antibody may be a CD3×CD19 bispecific antibody (D21) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

상기 이중특이적 항체가 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CD3×CD19 이중특이적 항체(D21)일 경우, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항체(BLINCYTO)에 비해 항원에 대한 친화도(affinity)가 CD19 항원에 대한 친화도가 ELISA 실험에서는 더욱 높게 나왔으며, 세포를 이용한 실험 Flow cytometry 실험에서는 친화도가 유사한 수준으로 나왔다.When the bispecific antibody is a CD3×CD19 bispecific antibody (D21) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the affinity for the antigen compared to the antibody (BLINCYTO) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (affinity) ) showed higher affinity for the CD19 antigen in the ELISA experiment, and the affinity was similar in the flow cytometry experiment using cells.

본 명세서에서, "친화도(affinity)"는 항체의 결합 도메인과 항원 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본 발명에서 사용된 "결합 친화도"는 항체 및 항원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 항원에 대한 항체의 친화도는 일반적으로 평형해리상수 K_d로 표시될 수 있다. As used herein, “affinity” refers to the strength of the sum total of non-covalent interactions between the binding domain of an antibody and an antigen. Unless otherwise indicated, "binding affinity" as used herein refers to an intrinsic binding affinity that reflects a 1:1 interaction between an antibody and an antigen. The affinity of an antibody for an antigen can generally be expressed as an equilibrium dissociation constant K _d .

(2) 재조합 발현벡터 제작 단계(2) Recombinant expression vector production step

상기 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작한다.A recombinant expression vector containing the polynucleotide encoding the bispecific antibody is constructed.

본 명세서에서, "폴리뉴클레오티드(들)"란 용어는 비변형 RNA 또는 DNA 또는 변형 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 단일쇄의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 명세서에 사용된, "폴리뉴클레오티드(들)"란 용어는 변형 염기 및/또는 독특한 염기, 예컨대 이노신을 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 상기 DNA 또는 RNA의 경우 공지된 유용한 목적을 제공하는 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 자명하다. 본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오티드(들)"란 용어는 이러한 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.As used herein, the term "polynucleotide(s)" means any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, which may be unmodified RNA or DNA or modified RNA or DNA. The polynucleotide of the present invention may be single-stranded DNA or RNA. As used herein, the term "polynucleotide(s)" includes DNA or RNA comprising modified bases and/or unique bases such as inosine. It is apparent that various modifications may be made to the DNA or RNA serving a known useful purpose. As used herein, the term "polynucleotide(s)" includes such chemically, enzymatically or metabolically modified polynucleotides.

당업자들은 유전자 암호의 축퇴성으로 인해 상기의 이중특이적 항체가 여러 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있음을 알고 있을 것이다. Those skilled in the art will appreciate that due to the degeneracy of the genetic code, such bispecific antibodies may be encoded by multiple polynucleotides.

본 명세서에서 용어, "발현(expression)"이란 세포에서 이중특이적 항체의 생성을 의미한다.As used herein, the term "expression" refers to the production of a bispecific antibody in a cell.

본 명세서에서 용어, "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 상기 이중특이적 항체를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.As used herein, the term "expression vector" refers to a vector capable of expressing the bispecific antibody in a suitable host cell, and refers to a genetic construct comprising essential regulatory elements operably linked to express a gene insert.

본 명세서에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결되어 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. As used herein, the term "operably linked" refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence and a polynucleotide encoding the bispecific antibody to perform a general function. For example, a promoter and a polynucleotide encoding the bispecific antibody may be operably linked to affect expression of the polynucleotide. The operative linkage with the recombinant vector can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation using enzymes generally known in the art.

본 발명의 발현벡터는 플라스미드, 벡터 또는 바이러스 벡터를 이용하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있고, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.The expression vector of the present invention may be constructed using a plasmid, vector or viral vector, but is not limited thereto. Suitable expression vectors may include expression control elements such as promoter, operator, start codon, stop codon, polyadenylation signal and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose, and the promoter of the vector may be constitutive or inducible. can

상기 발현벡터는 pGAPZαA, pPICZ, pPICZαA, pPICZαB, pPICZαC, pPICZ-E, pPICZα-E, pPIC6, pPIC6αA, pPIC6αB, pPIC6αC, pGAPZ, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pHIL-D2 및 pHIL-S1 중에서 선택되는 피키아 파스토리스 유래의 벡터를 이용하여 제조되는 것이 효과면에서 바람직하고, pHIL-S1인 것이 더욱 바람직하다. The expression vector is selected from pGAPZαA, pPICZ, pPICZαA, pPICZαB, pPICZαC, pPICZ-E, pPICZα-E, pPIC6, pPIC6αA, pPIC6αB, pPIC6αC, pGAPZ, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pHIL-D2 and pHIL-S1 Production using a vector derived from Pichia pastoris is preferable in terms of effectiveness, and pHIL-S1 is more preferable.

본 발명의 일양태에서, 유전자가 작동가능하게 결합하는 프로모터는 AOX1 프로모터, GAPDH 프로모터, PHO5 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(TDH3) 프로모터, ADHI 프로모터, MFα1 프로모터, 및 GAL10 프로모터로 구성된 군에서 선택된다. AOX1 프로모터를 포함하는 플라스미드의 예로는 발현 플라스미드 pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC9 및 pPIC9K가 있다. 이들 플라스미드는 서열중, AOX1 프로모터, 구조 유전자를 삽입시키는 제한 부위, AOX1 전사 종결 단편, HIS4(히스티디놀 탈수소효소)를 암호화하는 개방 해독틀, 암피실린 내성 유전자 등을 포함한다.In one embodiment of the present invention, the promoter to which the gene is operably linked is composed of the AOX1 promoter, the GAPDH promoter, the PHO5 promoter, the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TDH3) promoter, the ADHI promoter, the MFα1 promoter, and the GAL10 promoter. selected from the group. Examples of plasmids comprising the AOX1 promoter are the expression plasmids pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC9 and pPIC9K. These plasmids contain, among their sequences, an AOX1 promoter, a restriction site for inserting a structural gene, an AOX1 transcription termination fragment, an open reading frame encoding HIS4 (histidinol dehydrogenase), an ampicillin resistance gene, and the like.

특히, 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 염기서열의 업스트림에 피키아 파스토리스 유래 PHO-1 분비 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 경우에는 발현되는 단백질을 세포 밖으로 안정적으로 분비시킬 수 있어 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 3의 염기서열을 포함하고, 도 2에 기재된 pHIL-S1의 개열지도로 표시되는 것일 수 있다. In particular, when the base sequence encoding the PHO-1 secretion signal peptide derived from Pichia pastoris is included upstream of the base sequence encoding the bispecific antibody, the expressed protein can be stably secreted out of the cell, which is preferable. . In one embodiment of the present invention, the expression vector may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and may be represented by the cleavage map of pHIL-S1 described in FIG. 2 .

본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 3의 염기서열을 포함하고, 도 1에 기재된 pHIL-S1의 개열지도로 표시되는 발현벡터에는 발현된 단백질을 효모 밖으로 분비시키는 PHO-1 분비 신호 펩티드가 포함되어 있고, HIS4를 암호화하는 개방 해독틀, 암피실린 내성 유전자 등을 포함하고 있어서 숙주 내로의 형질 도입 여부를 확인할 수 있는 표지로 이용 가능하다. 따라서, 삽입되는 이중특이적 항체 유전자가 발현되면서 단독으로 숙주 밖으로 분비되기에, 고순도의 이중특이적 항체를 간단하게 분리할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the expression vector including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and represented by the cleavage map of pHIL-S1 shown in FIG. 1 includes a PHO-1 secretion signal peptide that secretes the expressed protein out of yeast and contains an open reading frame encoding HIS4, an ampicillin resistance gene, etc., and thus can be used as a marker to confirm whether or not transduction into a host is present. Therefore, since the inserted bispecific antibody gene is expressed and secreted out of the host alone, a high-purity bispecific antibody can be easily isolated.

(3) 형질전환 단계(3) transformation step

상기 발현벡터로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 형질전환시킨다. 이때 형질전환 방법으로는 통상의 방법인 예를 들어 전기천공법, 인산칼슘법, 스페로플라스트, 염화리튬법 등을 이용할 수 있다. Transformed into Pichia pastoris with the expression vector. In this case, as the transformation method, conventional methods, for example, electroporation, calcium phosphate, spheroplast, lithium chloride, and the like may be used.

또한, 본 발명은 상기 형질도입 단계 이전에 Zymolyase(효모 세포벽 분해효소)를 처리하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. In addition, the present invention may further include; treating Zymolyase (yeast cell wall degrading enzyme) before the transduction step.

(4) 이중특이적 항체의 발현 유도 단계(4) inducing expression of the bispecific antibody

상기 형질전환된 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 배양하여 이중특이적 항체의 발현을 유도한다(도 3 참조). The transformed Pichia pastoris is cultured to induce the expression of the bispecific antibody (see FIG. 3 ).

상기 형질 전환된 피키아 파스토리스는 배양 과정에서 이중특이적 항체를 생산하는 최적의 클론을 선별할 수 있다. The transformed Pichia pastoris can select an optimal clone for producing a bispecific antibody during the culture process.

본 발명에서, 상기 이중특이적 항체의 발현은 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 ① 종균 배양한 후, ② 메탄올 첨가를 통해 발현을 유도하는 방법에 의해 이루어질 수 있다.In the present invention, the expression of the bispecific antibody can be achieved by ① culturing the transformed Pichia pastoris as a seed, ② inducing expression through methanol addition.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 이중특이적 항체의 발현은 먼저, ① 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 buffered glycerol-complex medium(BMGY)에서 30℃ shaking incubator를 사용하여 48시간 동안 종균 배양한 다음, 원심분리하고 효모를 회수하여 다시 ② buffered methanol-complex medium(BMMY)에 분산시킨 후 배양하면서 매 24시간 마다 메탄올을 첨가하여 발현을 유도시키는 방법으로 이루어질 수 있다. 이때, 상기 BMGY 배지는 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 및 1% Glycerol로 구성된 것일 수 있다. 또한, 상기 BMMY 배지는 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 및 0.5% Methanol로 구성된 것일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the expression of the bispecific antibody is first performed by ① seed culture of the transformed Pichia pastoris in a buffered glycerol-complex medium (BMGY) at 30° C. using a shaking incubator for 48 hours. Then, after centrifugation, the yeast is recovered and again dispersed in ② buffered methanol-complex medium (BMMY), and then, methanol is added every 24 hours while culturing to induce expression. In this case, the BMGY medium may be composed of 1.34% YNB, 4x10 ^-5 % biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 and 1% Glycerol. In addition, the BMMY medium may be composed of 1.34% YNB, 4x10 ^-5 % biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 and 0.5% Methanol.

구체적으로, 본 발명은 상기 메탄올을 이용한 발현 유도 과정에서, 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 10 내지 25 ℃, 바람직하게는 12 내지 22 ℃, 더욱 바람직하게는 14 내지 20 ℃, 가장 바람직하게는 14 내지 18 ℃에서 100 내지 150 시간, 바람직하게는 110 내지 150 시간, 더욱 바람직하게는 120 내지 150 시간 동안 배양하는 것이 바람직하다.Specifically, in the present invention, in the expression induction process using the methanol, the transformed Pichia pastoris at 10 to 25 ℃, preferably 12 to 22 ℃, more preferably 14 to 20 ℃, most preferably It is preferable to incubate at 14 to 18° C. for 100 to 150 hours, preferably 110 to 150 hours, more preferably 120 to 150 hours.

상기 피키아 파스토리스의 배양 온도가 상기 하한치 미만인 경우에는 Pichia Pastoris의 생장에 문제가 생길 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 단백질 분해효소에 의해 목적하는 단백질이 분해되는 문제가 생길 수 있다.If the culture temperature of the Pichia pastoris is less than the lower limit, there may be a problem in the growth of Pichia Pastoris.

또한, 상기 배양 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 단백질이 충분히 생산되지 않으며, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 단백질 침천 및 분해되는 문제가 생길 수 있다.In addition, when the incubation time is less than the lower limit, the protein is not sufficiently produced, and when the incubation time exceeds the upper limit, there may be problems of protein precipitation and degradation.

또한, 상기 형질전환된 피키아 파스토리스의 단백질 발현을 위하여, 상기 배양 배지 내의 메탄올을 최종농도 0.5%(w/w)로 공급하는 것이 바람직하다. 또한, 배양 기간 동안 24 시간 마다 메탄올을 계속 공급하는 것이 바람직하다. In addition, for the protein expression of the transformed Pichia pastoris, it is preferable to supply methanol in the culture medium at a final concentration of 0.5% (w/w). In addition, it is preferable to continue to supply methanol every 24 hours during the incubation period.

원하는 단백질을 생산하는 상기 피키아 파스토리스 세포주는 현탁 배양 또는 다양한 고체 지지체 상에서 대량으로 증식될 수 있다. 상기 지지체의 예는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스를 기초로 한 마이크로 캐리어, 또는 중공 파이버 형태 또는 다양한 세라믹 재료 형태의 고체 지지체이다. 세포 현탁 배양에서 증식되거나 마이크로 캐리어에서 증식될 때, 상기 세포주의 배양은 배쓰(bath) 배양 또는 장시간에 걸쳐 조건 배지가 연속 생산되는 관류 배양으로서 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 상기 세포주는 원하는 상기 항체 단백질을 생산하기 위한 산업용 공정의 개발에 매우 적합하다.The Pichia pastoris cell line producing the desired protein can be expanded in large quantities in suspension culture or on various solid supports. Examples of such supports are microcarriers based on dextran or collagen matrices, or solid supports in the form of hollow fibers or in the form of various ceramic materials. When propagated in a cell suspension culture or grown in a microcarrier, the culture of the cell line can be performed as a bath culture or a perfusion culture in which a conditioned medium is continuously produced over a long period of time. Therefore, according to the present invention, the cell line is very suitable for the development of an industrial process for producing the desired antibody protein.

일 구체예에서, 본 발명은 상기의 방법에 따라 제조되는 이중특이적 항체를 제공한다. 본 명세서에서, 상기 이중특이적 항체에 대한 내용은 전술한 바와 같다.In one embodiment, the present invention provides a bispecific antibody prepared according to the above method. In the present specification, the content of the bispecific antibody is the same as described above.

본 발명에 따른 이중특이적 항체는 CD3 및 CD19에 특이적으로 결합하는 CD3×CD19 이중특이적 항체일 수 있다. The bispecific antibody according to the present invention may be a CD3×CD19 bispecific antibody that specifically binds to CD3 and CD19.

더욱 바람직하게는, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 1 및 서열번호 2 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 CD3×CD19 이중특이적 항체일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 이중특이적 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CD3×CD19 이중특이적 항체(D21)일 수 있다. More preferably, the bispecific antibody may be a CD3×CD19 bispecific antibody represented by any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Most preferably, the bispecific antibody may be a CD3×CD19 bispecific antibody (D21) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

상기 이중특이적 항체가 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CD3×CD19 이중특이적 항체(D21)일 경우, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항체(BLINCYTO)에 비해 항원에 대한 친화도(affinity)가 더욱 증대된 것을 구체적인 시험예를 통해 확인하였다.When the bispecific antibody is a CD3×CD19 bispecific antibody (D21) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the affinity for the antigen compared to the antibody (BLINCYTO) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (affinity) ) was further increased through specific test examples.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 재조합 발현벡터를 제공한다. In addition, the present invention provides a recombinant expression vector represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.In addition, the present invention provides a host cell transformed with the recombinant expression vector represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

상기 숙주세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다.The host cell may be Pichia pastoris .

또한, 본 발명은 상기 이중특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 이중특이적 항체에 대한 내용은 전술한 바와 같다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the bispecific antibody as an active ingredient. The content of the bispecific antibody is the same as described above.

상기 암은 유방암, 대장암, 결장암, 간암, 비-호지킨 림프종, 림프종, 췌장암, 폐암, 위암, 전립선암, 뇌종양, 망막아세포종, 난소암, 자궁경부암, 조혈 악성종양, 식도암, 신장 세포 암종, 편평상피 세포 암종, 신경교종 및 백혈병 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 백혈병일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 급성림프구성백혈병(ALL)일 수 있다. The cancer is breast cancer, colorectal cancer, colon cancer, liver cancer, non-Hodgkin's lymphoma, lymphoma, pancreatic cancer, lung cancer, gastric cancer, prostate cancer, brain tumor, retinoblastoma, ovarian cancer, cervical cancer, hematopoietic malignancy, esophageal cancer, renal cell carcinoma, It may be at least one selected from squamous cell carcinoma, glioma, and leukemia, preferably leukemia, and more preferably acute lymphoblastic leukemia (ALL).

본 명세서에서 용어 "유효성분으로 함유하는"이란 상기 이중특이적 항체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 이중특이적 항체의 1일 투여량은, 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg(예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)일 수 있다. 이중특이적 항체의 한 예시적 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 (예를 들면, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 이중특이적 항체를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 초기 보다 높은 적재 용량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체의 투여량의 상기 하한치 미만인 경우에는 암의 개선 또는 치료 효과가 원하는 정도로 나타나지 않을 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 투여량이 증가하는 만큼 암의 치료 효과가 증가하지 않거나 독성이 있을 수 있어 바람직하지 않다. 한편, 동물 실험 결과, 본 발명의 이중특이적 항체의 투여량이 상기 범위인 경우에는 유의적인 효과가 나타나면서도 세포독성 등의 부작용이 나타나지 않았다.As used herein, the term “containing as an active ingredient” means including an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the bispecific antibody. The daily dose of the bispecific antibody of the present invention may be 1 μg/kg to 100 mg/kg (eg, 0.1 mg/kg to 10 mg/kg). One exemplary dose of the bispecific antibody would be in the range of about 0.05 mg/kg to about 10 mg/kg. Accordingly, one or more doses of about 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg or 10 mg/kg (or any combination thereof) may be administered to the patient. Such doses may be administered intermittently, eg, weekly or every 3 weeks (eg, such that the patient receives from about 2 to about 20, or eg, about 6 doses of the bispecific antibody). can An initial higher loading dose may be administered followed by one or more lower doses. If the dosage of the bispecific antibody of the present invention is less than the lower limit, the improvement or therapeutic effect of cancer may not appear to the desired degree, and if it exceeds the upper limit, the therapeutic effect of cancer does not increase as much as the dosage increases, or It can be toxic and is not recommended. On the other hand, as a result of animal experiments, when the dose of the bispecific antibody of the present invention was within the above range, a significant effect was exhibited, but side effects such as cytotoxicity did not appear.

본 발명의 용어 "예방"이란, 상기 암을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 것을 의미한다.As used herein, the term “prevention” refers to anything that inhibits or delays the cancer.

본 발명의 용어 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 암을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. As used herein, the term "treatment", unless otherwise stated, means reversing, ameliorating, inhibiting the progression, or preventing the cancer.

상기 약학 조성물에서, 이중특이적 항체에 관한 것과 암에 대한 효과는 전술한 바와 같다.In the pharmaceutical composition, the effect on the bispecific antibody and the cancer is the same as described above.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvant includes an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, a swelling agent, a lubricant, and a lubricant. agent or flavoring agent, etc. may be used.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.Formulations of the pharmaceutical composition may be granules, powders, tablets, coated tablets, capsules, suppositories, solutions, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions. For formulation, for example, in the form of tablets or capsules, the active ingredient may be combined with an orally, non-toxic, pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water, and the like. In addition, if desired or required, suitable binders, lubricants, disintegrants and color-developers may also be included in the mixture. Suitable binders include, but are not limited to, starch, gelatin, natural sugars such as glucose or beta-lactose, corn sweeteners, natural and synthetic gums such as acacia, tracacanth or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzoate, sodium acetate, sodium chloride, and the like. Disintegrants include, but are not limited to, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum, and the like.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.In the composition formulated as a liquid solution, acceptable pharmaceutical carriers are sterile and biocompatible, and include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostats may be added as needed. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to form an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.

더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.Furthermore, it can be preferably formulated according to each disease or component using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA by an appropriate method in the art.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. A suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration mode, age, weight, sex, morbidity, food, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity of the patient, usually Thus, a skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment or prevention.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in a unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient, or may be prepared by internalizing in a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or stabilizer.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited by the following examples.

<실시예><Example>

실시예 1: 이중특이적 항체(D21)의 제조Example 1: Preparation of bispecific antibody (D21)

(1) 이중특이적 항체(D21)의 제작(1) Construction of the bispecific antibody (D21)

서열번호 1로 표시되는 이중특이적 항체(D21)를 코스모진텍(주)(대전)에 의뢰하여 합성하였다.The bispecific antibody (D21) represented by SEQ ID NO: 1 was synthesized at the request of Cosmogene Tech Co., Ltd. (Daejeon).

(2) D21 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터의 제작(2) Construction of a recombinant expression vector containing the D21 gene

E.Coli DH5α를 플라스미드 벡터의 증식을 위한 숙주로 사용하였고, 플라스미드 벡터를 구축하고 클로닝하기 위해 pHIL-S1 플라스미드 벡터(Invitrogen)를 골격 벡터로 사용하였다. E.Coli DH5α was used as a host for propagation of the plasmid vector, and the pHIL-S1 plasmid vector (Invitrogen) was used as a backbone vector for constructing and cloning the plasmid vector.

상기 (1)에서 합성된 항체 유전자를 XhoI과 BamHI 효소로 37℃에서 반응시켜 절단한 다음, T4 DNA ligase(미국 Promega사)를 이용하여 동일한 제한효소로 처리된 pHIL-S1 벡터(서열번호 3으로 표시; 도 1 참조)와 ligation함으로써 재조합 발현벡터 D21/pHIL-S1(도 2 참조)을 제조하였다. The antibody gene synthesized in (1) was cleaved by reaction at 37° C. with XhoI and BamHI enzymes, and then treated with the same restriction enzyme using T4 DNA ligase (Promega, USA) with the pHIL-S1 vector (SEQ ID NO: 3). A recombinant expression vector D21/pHIL-S1 (see FIG. 2) was prepared by ligation with the mark; see FIG. 1).

도 2는 본 발명에 따른 D21/pHIL-S1 발현벡터의 개열지도이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 아미노산 서열(D21)은 헥사 히스티딘(6x His) 태그를 갖는 AOX1 프로모터의 제어 하에 pHIL-S1 벡터의 XhoⅠ(주황색)/BamHⅠ(청색) 효소 절단 부위에 삽입되었다. 2 is a cleavage map of the D21/pHIL-S1 expression vector according to the present invention. As shown in Fig. 2, the amino acid sequence (D21) of the present invention was inserted into the XhoI (orange)/BamHI (blue) enzyme cleavage site of the pHIL-S1 vector under the control of the AOX1 promoter with a hexahistidine (6x His) tag. .

(3) 형질전환(3) transformation

Pichia Pastoris GS115(his4) 및 Pichia Pastoris KM71(arg4, his4, aox1 :: AGR4)(Invitrogen)을 상기 (1)에서 합성된 D21 유전자의 발현 및 정제를 위한 숙주세포로 사용하였다. Pichia Pastoris GS115 (his4) and Pichia Pastoris KM71 (arg4, his4, aox1::AGR4) (Invitrogen) were used as host cells for expression and purification of the D21 gene synthesized in (1) above.

상기 (2) 단계에서 제조한 D21/pHIL-S1 발현벡터를 Zymolyase를 이용한 형질도입법으로 피키아 파스토리스 GS115 및 피키아 파스토리스 KM71에 각각 도입하여 형질전환체 GS115-D21 및 KM71-D21을 수득하였다.Transformants GS115-D21 and KM71-D21 were obtained by introducing the D21/pHIL-S1 expression vector prepared in step (2) into Pichia pastoris GS115 and Pichia pastoris KM71, respectively, by transduction using Zymolyase. did.

상기 Zymolyase를 이용한 형질도입법의 구체적인 내용은 다음과 같다. Zymolyase는 yeast의 세포벽을 부분적으로 pore를 형성하며 용해시킨다. Yeast의 전체 세포벽의 70% 수준으로 용해되었을 때 zymolyase의 반응을 멈추고, D21/pHIL-S1 발현벡터를 처리하면 용해된 세포벽 사이로 발현벡터가 유입되어 형질전환이 이루어지는 시스템이다. 이후, 선택 배지 플레이트에 도말하게 되면 형질 전환된 Yeast만 세포벽을 회복하여 살아남게 되고, 군집(colony)을 이루게 된다.Specific details of the transduction method using the Zymolyase are as follows. Zymolyase partially pore-forms and dissolves the yeast cell wall. When the zymolyase reaction is stopped when lysed to a level of 70% of the entire cell wall of yeast, and the D21/pHIL-S1 expression vector is treated, the expression vector is introduced into the lysed cell wall and transformation is performed. Thereafter, when plated on a selective medium plate, only the transformed yeast survives by recovering the cell wall, and forms a colony.

상기 선택 배지는 RDB로 이루어진 플레이트를 말한다. 형질 전환된 Yeast는 발현벡터에 포함된 His4 유전자에 의해 필수 아미노산인 Histidine을 합성할 수 있게 되고, 이는 선택 배지에 없는 histidine을 스스로 합성하여 살아남을 수 있다는 것을 의미한다.The selective medium refers to a plate consisting of RDB. The transformed yeast can synthesize histidine, an essential amino acid, by the His4 gene included in the expression vector, which means that it can survive by synthesizing histidine, which is not present in the selective medium.

(4) 발현 유도(4) induction of expression

상기 (3) 단계에서 제조된 형질전환체 GS115-D21 및 KM71-D21를 각각 RDB 아가 플레이트에 도말한 후 적절한 크기의 군집이 형성될 때까지 배양하였다. 이때, RDB 배지는 1 M sorbitol, 2% dextrose, 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 0.005% 아미노산, +/- 0.004% histidine 및 2% agarose로 구성된 것이다.Transformants GS115-D21 and KM71-D21 prepared in step (3) were spread on RDB agar plates, respectively, and then cultured until colonies of an appropriate size were formed. At this time, the RDB medium is composed of 1 M sorbitol, 2% dextrose, 1.34% YNB, 4x10 ^-5 % biotin, 0.005% amino acids, +/- 0.004% histidine and 2% agarose.

이후, 상기 각각의 플레이트에서 각각 800개의 콜로니를 선별한 후, 가장 발현이 잘되는 콜로니 5개를 125 mL의 BMGY(buffered glycerol-complex medium) 배지가 들어 있는 250 mL 삼각 플라스크에서, 30 ℃에서 18 시간 동안 종균 배양(seed culture)하였다. 이때, BMGY 배지는 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 및 1% Glycerol로 구성된 것이다.Then, after selecting 800 colonies from each plate, the 5 colonies with the highest expression were collected in a 250 mL Erlenmeyer flask containing 125 mL of BMGY (buffered glycerol-complex medium) medium, at 30 °C for 18 hours. During the seed culture (seed culture). At this time, the BMGY medium is composed of 1.34% YNB, 4x10 ^-5 % biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 and 1% Glycerol.

다음으로, 상기 배양액들을 원심분리(3,000xg, 10 mins)하여 각각의 형질전환체를 회수한 후 다시 25 mL의 BMMY(buffered methanol-complex medium) 배지가 들어 있는 150 mL 삼각 플라스크에 분산시킨 다음, 15 ℃에서 120 시간 동안 배양하되, 매 24 시간 마다 메탄올을 첨가하여 발현을 유도시켰다(도 3 참조). 상기 BMMY 배지는 1.34% YNB, 4x10^-5% biotin, 2% peptone, 1% Yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 및 0.5% Methanol로 구성된 것이다. Next, the culture medium was centrifuged (3,000xg, 10 mins) to recover each transformant and then dispersed in a 150 mL Erlenmeyer flask containing 25 mL of BMMY (buffered methanol-complex medium) medium again, Incubated at 15° C. for 120 hours, but expression was induced by adding methanol every 24 hours (see FIG. 3). The BMMY medium is composed of 1.34% YNB, 4x10 ^-5 % biotin, 2% peptone, 1% yeast extract, 0.1 M Potassium phosphate buffer pH 6.0 and 0.5% Methanol.

(5) 분리 및 정제(5) separation and purification

상기 (4) 단계에서 얻은 배양액들을 원심분리(3,000xg, 10 mins)하여 상등액을 분리한 후 0.22㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. 상기 여과액을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 수지(Thermo Scientific, Cat # 88222)로 정제하였다. 상기 Ni-NTA 수지는 세척 완충액(10mM PBS pH 7.4, 0.05 % 트리톤 X-100)으로 예비-평형화시켰다. 이후, 상기 여과액과 예비-평형화된 Ni-NTA 수지를 3 시간 동안 반응시키고 완충액으로 3 회 세척한 후, D21 단백질을 10mM PBS pH 7.4, 0.05 % Triton X-100, 200mM 이미다졸로 용리시켰다. 용리된 분획을 수집하고 12 % SDS-PAGE 겔로 분석 하였다. 상기 D21은 쿠마시 블루 R250에 의해 확인되었다(도 4 참조).The culture solution obtained in step (4) was centrifuged (3,000xg, 10 mins) to separate the supernatant, and then filtered using a 0.22㎛ filter. The filtrate was purified with Ni-NTA affinity chromatography resin (Thermo Scientific, Cat # 88222). The Ni-NTA resin was pre-equilibrated with wash buffer (10 mM PBS pH 7.4, 0.05 % Triton X-100). Thereafter, the filtrate and the pre-equilibrated Ni-NTA resin were reacted for 3 hours and washed three times with a buffer, and then the D21 protein was eluted with 10 mM PBS pH 7.4, 0.05% Triton X-100, 200 mM imidazole. The eluted fractions were collected and analyzed on a 12% SDS-PAGE gel. The D21 was confirmed by Coomassie Blue R250 (see FIG. 4).

상기 SDS-PAGE 분석 결과(도 4)에서, 변형되지 않은 GS115 및 KM71은 음성대조군으로 이용되었고, GS115-HSA는 BMMY 배지로 분비 처리한 것으로 HSA (인간 혈청 알부민; 63 kDa)를 생산하고 있으며 양성대조군으로 이용되었다. 이때, D21 발현율이 가장 높은 "GS115-D21-105" 클론이 추가 연구를 위한 샘플로 이용되었다.In the SDS-PAGE analysis result (FIG. 4), unmodified GS115 and KM71 were used as negative controls, and GS115-HSA was secreted and treated with BMMY medium to produce HSA (human serum albumin; 63 kDa) and was positive. was used as a control. At this time, the "GS115-D21-105" clone with the highest D21 expression rate was used as a sample for further study.

시험예 1: D21 - 배양 온도에 따른 발현량 분석Test Example 1: Analysis of expression level according to D21-culture temperature

본 발명의 실시예에서 얻은 형질전환체(GS115-D21-105) 클론을 다양한 배양 온도 및 유도 시간으로 배양한 경우의 D21 단백질 발현을 SDS-PAGE로 분석하여 도 5에 나타내었다. 상기 단백질 발현은 상기 D21을 12% SDS-PAGE 겔로 분리하고, 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색한 후 분석하였다.The D21 protein expression when the transformant (GS115-D21-105) clone obtained in Examples of the present invention was cultured at various incubation temperatures and induction times was analyzed by SDS-PAGE and shown in FIG. 5 . The protein expression was analyzed after separating the D21 using a 12% SDS-PAGE gel, staining with Coomassie Brilliant Blue R250.

종래 피키아 파스토리스를 이용하는 단백질 발현 시스템에서는 효모 배양 권장 온도인 30 ~ 31 ℃에서 배양하도록 되어 있다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 이중특이적 항체의 경우 피키아 파스토리스를 이용한 단백질 발현 시스템을 이용하는 경우 10 내지 25 ℃의 저온에서 배양하는 경우에 단백질 발현 효율이 가장 높은 것을 발견하였고, 도 5에 나타낸 바와 같이 10 내지 25 ℃에서 100 내지 150 시간 동안 배양한 경우(도 5a)에는, 기존 조건(30 ℃, 96 시간)에서 배양한 경우(도 5b)에 비해 D21 단백질 발현량이 현저히 높은 것을 구체적으로 확인하였다. In the conventional protein expression system using Pichia pastoris, it is to be cultured at 30 ~ 31 °C, which is the recommended yeast culture temperature. However, the inventors of the present invention found that, in the case of a bispecific antibody, when a protein expression system using Pichia pastoris was used, the protein expression efficiency was highest when cultured at a low temperature of 10 to 25 ° C. As shown, in the case of incubation for 100 to 150 hours at 10 to 25 ° C (Fig. 5a), it was specifically confirmed that the D21 protein expression level was significantly higher than when cultured under the existing conditions (30 ° C., 96 hours) (Fig. 5b). did.

하기 표 1은 GS115-D21-105 클론을 15 ℃에서 120 시간 동안 배양한 경우 및 30 ℃에서 96 시간 동안 배양한 경우의 D21의 발현수준을 상대적 밴드 밀도(%기존조건(30 ℃, 96 시간))로 정량화하여 나타낸 것이다. 이때, 젤 이미지는 Gel-Doc Imaging System (Bio-Rad)에 의해 스캔되었고, 밴드 밀도는 Image J software를 사용하여 측정하였다.Table 1 below shows the relative band density (% conventional conditions (30 °C, 96 hours) of the expression level of D21 when the GS115-D21-105 clone was cultured at 15 °C for 120 hours and at 30 °C for 96 hours. ) and quantified. At this time, the gel image was scanned by Gel-Doc Imaging System (Bio-Rad), and the band density was measured using Image J software.

배양 온도incubation temperature 배양 시간incubation time D21
(% of 기존조건(30 ℃, 96 시간))D21
(% of existing conditions (30 ℃, 96 hours)) 30 ℃30 ℃ 96 시간96 hours 100100 120 시간120 hours 122122 15 ℃15 ℃ 96 시간96 hours 207207 120 시간120 hours 415415 37 ℃37 ℃ 96 시간96 hours 6363 120 시간120 hours 4444

이하에서는, CD3×CD19 이중특이적 항체들 중에서, 본 발명의 실시예(피키아 파스토리스 발현 시스템 이용)에 따른 항체(D21) 및 종래 방법(CHO 세포 발현 시스템 이용; 미국등록특허 제10,000,574호 참조)에 따른 항체(BLINCYTO^TM, Amgen Inc.)의 특성을 구체적으로 비교하였다.Hereinafter, among the CD3×CD19 bispecific antibodies, an antibody (D21) according to an embodiment of the present invention (using a Pichia pastoris expression system) and a conventional method (using a CHO cell expression system; see US Patent No. 10,000,574) ) according to the antibody (BLINCYTO ^TM , Amgen Inc.) was specifically compared.

시험예 2: 경제성 분석Test Example 2: Economic Analysis

본 발명의 실시예(피키아 파스토리스 발현 시스템 이용)에 의한 항체(D21) 및 종래 방법(CHO 세포 발현 시스템 이용)에 따른 항체(BLINCYTO^TM, Amgen Inc.)의 생산 수율, 생산 비용, 생산 기간 등을 간단히 비교하여 하기 표 2에 나타내었다.Production yield, production cost, and production period of the antibody (D21) according to the embodiment of the present invention (using the Pichia pastoris expression system) and the antibody (BLINCYTO ^TM , Amgen Inc.) according to the conventional method (using the CHO cell expression system) It is shown in Table 2 below for simple comparison.

구분division 실시예(D21)Example (D21) BLINCYTOBLINCYTO 발현 시스템expression system 피키아 파스토리스Pichia Pastoris Expi CHO-S 세포Expi CHO-S cells 아미노산 개수number of amino acids 505505 504504 분자량Molecular Weight 54250.72 Da54250.72 Da 54096.53 Da54096.53 Da 생산수율production yield 400 ㎍/L400 μg/L 2 ㎎/L2 mg/L 생산비용production cost 약 23,000원/1 mgApprox. 23,000 won/1 mg 약 2,610,000원/1 mgAbout KRW 2,610,000/1 mg 생산기간production period 4 일4 days 13 일13 days

상기 표 2를 살펴보면, 본 발명의 실시예에 따르면 기존 방법에 따르는 경우에 비해 생산 비용을 약 135 배 이상 저감할 수 있고, 생산기간 또한 약 3 배 이상 단축시킬 수 있음을 알 수 있다.Referring to Table 2, it can be seen that according to the embodiment of the present invention, the production cost can be reduced by about 135 times or more, and the production period can also be shortened by about 3 times or more compared to the case according to the existing method.

시험예 3: 트립신 분해 펩티드 맵핑(peptide mapping)Test Example 3: Trypsin-digested peptide mapping (peptide mapping)

단일클론 항체와 같은 바이오 치료제는 바이오 의약품 산업에서 가장 빠르게 성장하고 있는 단백질 기반 의약품 종류 중 하나지만, 이것은 단백질 의약품의 비동질성으로 인해 통합적인 특성 규명 분석을 필요로한다. 펩티드 맵핑은 단백질 의약품에 대한 광범위한 특성 규명을 수행하기 위해 사용되며, 1차 아미노산 시퀀스 확인과 더불어 탈아미드화, 산화, 절단, 인산화, 메틸화, 니트로실화, 유비퀴틴화, 지질화, 당화, 이성질체화 등과 같은 PTM의 식별 및 정량화 등이 가능하게 한다. 돌연변이 또는 PTM(post-translational modification)으로 인해 2개 펩티드 사이에 야기되는 단 하나의 아미노산 차이도 펩티드의 물리적 특성을 변화시키며, 의약 완제품의 안전성 및/또는 효능에 잠재적으로 변화를 일으킬 수 있기 때문에, 펩티드 맵핑은 매우 중요한 분석 툴에 해당한다. Biotherapeutics, such as monoclonal antibodies, are one of the fastest growing class of protein-based drugs in the biopharmaceutical industry, but they require integrative characterization analysis due to the heterogeneity of protein drugs. Peptide mapping is used to perform a wide range of characterizations for protein pharmaceuticals, in addition to primary amino acid sequence identification, deamidation, oxidation, cleavage, phosphorylation, methylation, nitrosylation, ubiquitination, lipidation, glycosylation, isomerization, etc. It enables identification and quantification of the same PTM. Because even a single amino acid difference caused between two peptides due to mutation or post-translational modification (PTM) changes the physical properties of the peptide and can potentially cause changes in the safety and/or efficacy of the finished drug product; Peptide mapping is a very important analytical tool.

본 발명의 실시예(피키아 파스토리스 발현 시스템 이용)에 따라 제조된 D21 및 종래 방법(CHO 세포 발현 시스템 이용)으로 제조된 BLINCYTO의 펩티드 맵핑을 통해 서열 컨센서스를 분석하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 D21 및 BLINCYTO를 대상으로 LC-MS/MS 분석 및 PECKS^TM Software에 의한 펩티드 맵핑을 수행하였다(도 6 참조). Sequence consensus was analyzed through peptide mapping of D21 prepared according to an example of the present invention (using a Pichia pastoris expression system) and BLINCYTO prepared by a conventional method (using a CHO cell expression system). To this end, LC-MS/MS analysis and peptide mapping by PECKS ^TM Software were performed on the D21 and BLINCYTO (see FIG. 6).

먼저, D21 및 BLINCYTO를 각각 트립신으로 분해한 후 LC-MS/MS(질량분석기; 한국기초과학지원연구원, 한국 서울)에 주입하여 분석하였다. 상기 LC-MS/MS를 통해 검출된 피크를 분석한 결과, 상기 D21은 Arginine이 한 개 추가된 것을 제외하고는 BLINCYTO의 서열과 일치하는 것을 확인하였다. First, D21 and BLINCYTO were digested with trypsin, respectively, and then injected into LC-MS/MS (mass spectrometer; Korea Institute of Basic Science, Seoul, Korea) for analysis. As a result of analyzing the peak detected through LC-MS/MS, it was confirmed that D21 was identical to the sequence of BLINCYTO except that one arginine was added.

도 6은 PECKS^TM Software를 이용하여 D21 및 BLINCYTO의 서열 매칭(펩티드 맵핑)을 수행한 결과를 나타내는 것이다. 상기 서열 매칭(펩티드 맵핑) 기술은 액체 크로마토그래피보다 단백질을 보다 효과적으로 구별할 수 있게 하며, 식별하기 어려운 차이를 드러내는 효과가 있다. 6 shows the result of performing sequence matching (peptide mapping) of D21 and BLINCYTO using PECKS ^TM Software. The sequence matching (peptide mapping) technique allows proteins to be distinguished more effectively than liquid chromatography, and has the effect of revealing differences that are difficult to identify.

상기 도 6에서, 각 서열의 밑 부분에 파란색으로 표시된 부분은 상기 서열 매칭(펩티드 맵핑) 분석 결과 및 LC_MS/MS에서 분석된 결과 중에서 완전히 일치되는 서열을 표시한 것이다. 도 6의 서열 매칭을 통해 확인한 결과, D21의 서열과 상기 트립신으로 분해한 후 LC_MS/MS을 통해 검출된 피크로 동정되는 서열은 아미노산 Arginine으로부터 시작되지만 BLINCYTO 같은 경우 아미노산 Aspartic acid부터 시작되는 것으로 보아, D21은 BLINCYTO 서열의 N-말단부위에 Arginine이 추가되어있다는 것을 알 수 있어 서열이 다른 것을 알 수 있다. 참고로, 도 6에서 나타낸 post-translational modification은 단백질 절편을 만들기 위해 처리한 트립신에 의해 생기는 것이다. In FIG. 6 , a part marked in blue at the bottom of each sequence indicates a completely matching sequence among the sequence matching (peptide mapping) analysis results and the results analyzed by LC_MS/MS. As a result of confirming through the sequence matching in Figure 6, the sequence of D21 and the sequence identified as the peak detected through LC_MS/MS after digestion with trypsin starts from the amino acid arginine, but in the case of BLINCYTO, it seems to start from the amino acid aspartic acid, In D21, it can be seen that arginine is added to the N-terminal region of the BLINCYTO sequence, so it can be seen that the sequence is different. For reference, the post-translational modification shown in FIG. 6 is caused by trypsin treated to make a protein fragment.

본 발명에 따른 D21은 BLINCYTO의 서열에 Arginine이 한 개 추가된 것으로, 피키아 파스토리스 발현 시스템을 통해 발현되었기 때문에 BLINCYTO와는 PTM(post-translational modification)의 부위가 다른 점을 확인할 수 있고, 이로 인해 상기 D21 및 BLINCYTO는 펩티드의 특성이 다를 것임을 유추할 수 있다. In D21 according to the present invention, one arginine was added to the sequence of BLINCYTO, and since it was expressed through the Pichia pastoris expression system, it can be confirmed that the site of post-translational modification (PTM) is different from that of BLINCYTO. It can be inferred that D21 and BLINCYTO will have different properties of the peptide.

시험예 4: 단백질 정제 및 분자량 분석Test Example 4: Protein purification and molecular weight analysis

본 발명의 실시예에 따른 D21 및 BLINCYTO을 정제한 후 각각의 분자량을 측정 및 비교하고자 하였다.After purification of D21 and BLINCYTO according to an embodiment of the present invention, the molecular weight of each was measured and compared.

이를 위하여, 본 발명의 실시예에서 얻은 형질전환체(GS115-D21-105)로부터 발현된 D21를 Ni-NTA 수지(Thermo Scientific, Cat NO. 88222)를 이용하여 정제하였다. 구체적으로, 상기 형질전환체(GS115-D21-105)를 5 mL의 YPD 배지에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 상기 배지를 20 mL의 BMGY 배지로 교체하고, 흡광도(OD₆₀₀)가 5(Log-phase)가 될 때까지 배양한 후, 메탄올 유도를 위해 상기 배지를 100 mL의 BMMY 배지로 교체하였다(Start OD₆₀₀: 1.0). 상기 형질전환체(GS115-D21-105)의 메탄올 유도 및 배양은 96 시간 동안 계속되었고, 24 시간마다 메탄올을 첨가해주었다(최종 메탄올 농도 : 0.5%). 이후, 상기 배양액들을 원심분리(3,500xg, 10 mins)하여 상등액을 분리한 후 0.22㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. 상기 여과액과 예비-평형화된 Ni-NTA 수지를 3 시간 동안 반응시키고 완충액으로 3 회 세척한 후, D21 단백질을 10mM PBS pH 7.4, 0.05 % Triton X-100, 200mM 이미다졸로 용리시켰다. 용리된 분획을 수집하고 12 % SDS-PAGE 겔로 분석 하였다. 상기 D21은 쿠마시 블루 R250에 의해 확인되었다. To this end, D21 expressed from the transformant (GS115-D21-105) obtained in Examples of the present invention was purified using Ni-NTA resin (Thermo Scientific, Cat NO. 88222). Specifically, the transformant (GS115-D21-105) was cultured overnight in 5 mL of YPD medium. The next day, the medium was replaced with 20 mL of BMGY medium, and the absorbance (OD ₆₀₀ ) was cultured until 5 (Log-phase), and then the medium was replaced with 100 mL of BMMY medium for methanol induction. (Start OD ₆₀₀ : 1.0). Methanol induction and culture of the transformant (GS115-D21-105) was continued for 96 hours, and methanol was added every 24 hours (final methanol concentration: 0.5%). Then, the culture medium was centrifuged (3,500xg, 10 mins) to separate the supernatant, and then filtered using a 0.22㎛ filter. The filtrate and the pre-equilibrated Ni-NTA resin were reacted for 3 hours and washed 3 times with buffer, and then D21 protein was eluted with 10 mM PBS pH 7.4, 0.05 % Triton X-100, 200 mM imidazole. The eluted fractions were collected and analyzed on a 12% SDS-PAGE gel. The D21 was identified by Coomassie Blue R250.

도 7은 본 발명의 일 실시예에서 얻은 D21(도 7a) 및 BLINCYTO(도 7b)의 SDS-PAGE 분석 결과이다. 이때, 단백질 발현은 상기 D21 및 BLINCYTO를 12% SDS-PAGE 겔로 분리하고, 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색하여 분석한 것이다. 도 7a에서, 레인 M은 prestained 단백질 마커(Kanpro Research. KP-PR001)이고; 레인 1은 0.5 % 메탄올에 의해 발현 유도되고 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 D21을 나타낸다. 또한, 도 7b에서, 레인 M은 prestained 단백질 마커(Kanpro Research. KP-PR001)이고; 레인 1은 정제되기 전의 BLINCYTO 100 ng이며, 레인 2는 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 수지 결합이 생략된 분획이고; 레인 3은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 수지 세척이 생략된 분획이며; 레인 4는 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 용리 분획을 나타내는 것이다. 7 is an SDS-PAGE analysis result of D21 (FIG. 7a) and BLINCYTO (FIG. 7b) obtained in an embodiment of the present invention. At this time, protein expression was analyzed by separating the D21 and BLINCYTO using a 12% SDS-PAGE gel and staining with Coomassie Brilliant Blue R250. 7A , lane M is a prestained protein marker (Kanpro Research. KP-PR001); Lane 1 shows D21 expression induced by 0.5% methanol and purified by Ni-NTA affinity chromatography. In addition, in FIG. 7B , lane M is a prestained protein marker (Kanpro Research. KP-PR001); Lane 1 is 100 ng of BLINCYTO before purification, Lane 2 is the fraction in which Ni-NTA affinity chromatography resin binding is omitted; Lane 3 is the fraction in which Ni-NTA affinity chromatography resin wash is omitted; Lane 4 shows the Ni-NTA affinity chromatography eluted fraction.

상기와 같이 최종적으로 정제한 D21 protein을 SDS-PAGE gel로 확인한 결과 순도가 95% 이상인 것을 확인하였다.As a result of confirming the finally purified D21 protein by SDS-PAGE gel as described above, it was confirmed that the purity was 95% or more.

한편, D21 및 BLINCYTO의 분자량을 비교하기 위하여, D21 및 BLINCYTO의 분자량을 MALDI-TOF-MS 분석기(MALDI-TOF/TOF^TM 5800 system, 한국기초과학지원연구원, 한국 서울)로 각각 측정하여 도 8에 나타내었다.On the other hand, in order to compare the molecular weights of D21 and BLINCYTO, the molecular weights of D21 and BLINCYTO were respectively measured with a MALDI-TOF-MS analyzer (MALDI-TOF/TOF ^TM 5800 system, Korea Basic Science Institute, Seoul, Korea) and shown in FIG. indicated.

상기 도 8을 살펴보면, 본 발명에 따른 D21은 Arginine이 하나 더 있는 만큼 분자량이 54.25 kDa로 나타나, BLINCYTO 분자량인 54.1 kDa에 비해 더 큰 것을 확인할 수 있다. Referring to FIG. 8, D21 according to the present invention has a molecular weight of 54.25 kDa as there is one more arginine, and it can be confirmed that it is larger than the BLINCYTO molecular weight of 54.1 kDa.

시험예 5: 항원에 대한 친화도(affinity) 분석 - ELISA 분석Test Example 5: Affinity analysis for antigen - ELISA analysis

본 발명의 실시예에 따른 D21 및 BLINCYTO의 항원에 대한 친화도(결합력)를 알아보기 위하여 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA)를 수행하였다.In order to examine the affinity (binding affinity) of D21 and BLINCYTO to antigens according to an embodiment of the present invention, an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was performed.

구체적으로, 상기 D21 및 BLINCYTO를 각각 Ni-NTA 정제를 수행하고, K_d값 측정을 위해 연속 희석하여 최종 농도를 400 nM로 조정하였다. 다음으로, 인간 CD19 및 CD3 항원이 각각 0.5 ㎍/mL 농도로 코팅(coating buffer; carbonate/bicarbonate buffer)되어 있는 플레이트를 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 이후, 상기 버퍼는 버리고, 상기 플레이트를 PBST(0.05% tween20)로 4회 세척하였다. 그리고, 1% BSA(in PBS pH 7.4) 200 ㎕로 블로킹한 후 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 버퍼는 버리고, 1차 항체로서 D21 및 BLINCYTO(184.84 nM, in PBS pH 7.4)를 각각 100 ㎕씩 첨가한 후 실온에서 7 시간 동안 배양하였다. 이후, 용액은 버리고, 상기 플레이트를 PBST(0.05% tween20)로 4회 세척하였다. 그리고, 2차 항체로서 항-His 태그 마우스 lgG 항체(HRP conjugated 모노클로날 항체, in PBS pH 7.4, 1/1000 희석)를 100 ㎕ 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 이후, 용액은 버리고, 상기 플레이트를 PBST(0.05% tween20)로 4회 세척하였다. 그리고, 발색을 위한 기질로서 TMB(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine 용액; Ultra TMB, Pierce, Cat # 34028, USA) 100 ㎕를 첨가하고 3분 동안 배양한 후 1 M의 HCl을 100 ㎕ 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이후, 분광광도계(Thermo scientific, Multiskan GO, USA)를 이용하여 O.D _450nm에서 흡광도를 측정하였다. Specifically, Ni-NTA purification was performed on D21 and BLINCYTO, respectively, and the final concentration was adjusted to 400 nM by serial dilution for K _d value measurement. Next, a plate coated with human CD19 and CD3 antigens at a concentration of 0.5 μg/mL, respectively (coating buffer; carbonate/bicarbonate buffer) was incubated at 4° C. overnight. Then, the buffer was discarded and the plate was washed 4 times with PBST (0.05% tween20). Then, after blocking with 200 μl of 1% BSA (in PBS pH 7.4), incubated at room temperature for 1 hour. Thereafter, the buffer was discarded, and 100 μl of each of D21 and BLINCYTO (184.84 nM, in PBS pH 7.4) were added as primary antibodies and incubated at room temperature for 7 hours. The solution was then discarded and the plate washed 4 times with PBST (0.05% tween20). Then, as a secondary antibody, 100 μl of an anti-His tag mouse IgG antibody (HRP conjugated monoclonal antibody, in PBS pH 7.4, diluted 1/1000) was added and incubated at room temperature for 2 hours. The solution was then discarded and the plate washed 4 times with PBST (0.05% tween20). Then, 100 μl of TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine solution; Ultra TMB, Pierce, Cat # 34028, USA) was added as a substrate for color development, and incubated for 3 minutes, 1 M HCl was added to 100 The reaction was terminated by addition of μl. Then, the absorbance was measured at OD _{450 nm} using a spectrophotometer (Thermo scientific, Multiskan GO, USA).

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 D21 및 BLINCYTO의 항원 친화도 분석 결과이다. 구체적으로, 도 9a는 D21 및 BLINCYTO의 CD19 항원에 대한 친화도(affinity)를 나타내는 것이고, 도 9b는 D21 및 BLINCYTO의 CD3 항원에 대한 친화도(affinity)를 나타내는 것이다. 9 is a result of antigen affinity analysis of D21 and BLINCYTO according to an embodiment of the present invention. Specifically, FIG. 9a shows the affinity (affinity) of D21 and BLINCYTO to the CD19 antigen, and FIG. 9b shows the affinity (affinity) of D21 and BLINCYTO to the CD3 antigen.

또한, 도 9 c는 D21 및 BLINCYTO의 ELISA 실험 결과를 나타내는 Plate 사진이며, 구체적으로 plate에 CD19 및 CD3를 coating하고, D21 protein 및 BLINCYTO를 처리하여 항원에 결합시킨 후, 발광하는 효소가 결합된(HRP, Horseradish Peroxidase) 2차 항체를 추가 처리하여 TMB solution을 통해 반응시킨 plate 사진으로서, D21 및 BLINCYTO의 처리 농도에 따른 plate 색상의 진하기 정도에 따라 항원 친화도를 확인하도록 한 것이다. 또한, 도 9d는 ELISA 실험에 사용한 D21 protein 및 BLINCYTO를 BSA(Bovine Serum Albumine) 정량적 컨트롤과 함께 Loading하여 SDS-PAGE를 통해 정량적으로 같은 양 및 농도의 단백질이 사용되었다는 것을 확인한 것이다. In addition, FIG. 9 c is a photograph of a plate showing the results of ELISA experiments on D21 and BLINCYTO. Specifically, the plate was coated with CD19 and CD3, treated with D21 protein and BLINCYTO to bind to the antigen, and then a luminescent enzyme was bound ( This is a photograph of a plate in which secondary antibodies (HRP, Horseradish Peroxidase) were additionally treated and reacted with TMB solution, and the antigen affinity was checked according to the depth of plate color according to the concentration of D21 and BLINCYTO. In addition, FIG. 9d shows that D21 protein and BLINCYTO used in the ELISA experiment were loaded together with BSA (Bovine Serum Albumine) quantitative control, and it was confirmed that the same amount and concentration of protein was quantitatively used through SDS-PAGE.

상기 도 9를 살펴보면, 본 발명의 D21의 항원 결합 친화도(K_d 값)가 BLINCYTO에 비해 약 1.93배 높은 것을 확인할 수 있다. Referring to FIG. 9, it can be seen that the antigen-binding affinity (K _d value) of D21 of the present invention is about 1.93 times higher than that of BLINCYTO.

시험예 6: 암 세포에 대한 표적화 능력 분석 - Flow Cytometry 분석Test Example 6: Analysis of targeting ability to cancer cells - Flow Cytometry analysis

본 발명의 실시예에 따른 D21 및 BLINCYTO의 암 세포에 대한 표적화 능력을 알아보기 위하여 유세포 분석(Flow cytometry analysis: FCM analysis)을 수행하였다.In order to examine the targeting ability of D21 and BLINCYTO to cancer cells according to an embodiment of the present invention, flow cytometry analysis (FCM analysis) was performed.

구체적으로, 상기 D21 및 BLINCYTO를 각각 Ni-NTA 정제를 수행하고, Kd 값 측정을 위해 연속 희석하여 최종 농도를 조정하였다. 구체적으로, CD19 항원 결합 친화도를 검출하기 위해서는, D21 및 BLINCYTO의 최종 농도를 각각 250 nM로 조정하였고, CD3 항원 결합 친화도를 검출하기 위해서는, D21 및 BLINCYTO의 최종 농도를 각각 1 uM로 조정하였다. Specifically, Ni-NTA purification was performed on D21 and BLINCYTO, respectively, and the final concentration was adjusted by serial dilution for Kd value measurement. Specifically, to detect CD19 antigen-binding affinity, the final concentrations of D21 and BLINCYTO were adjusted to 250 nM, respectively, and to detect CD3 antigen-binding affinity, the final concentrations of D21 and BLINCYTO were adjusted to 1 uM, respectively. .

각각의 Raji 세포 및 Jurkat 세포는 배양 중인 플레이트에서 2X10⁶ cells/ml의 농도로 FACs buffer(PBS, 1% NaN₃, 2% FBS)에 희석하여 준비하였다. 각각의 세포주를 96-well plate 각각의 well에 1X10⁵ 세포수 만큼 분주하고, D21 및 BLINCYTO를 Jurkat 세포는 1 uM의 농도를 최고농도로 처리하였으며 농도 의존적으로 처리하여 최저 농도를 1.9 nM로 처리하였다. 또한 Raji 세포는 최고농도를 250 nM을 최고 농도로 처리하였으며 농도 의존적으로 처리하여 최저 농도를 488 pM의 농도로 처리하였다. 이후, 1시간동안 반응시간을 주었으며 FACs buffer로 3번 세척하였다. 그리고, 2차 항체로서 anti-His tag FITC가 결합된 단일 클론 마우스 항체 (Invitrogen, MA1-81891, in PBS pH 7.4, 1/20 희석)를 100 ㎕ 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 반응하였다. 이후, 용액은 버리고, 상기 플레이트를 FACs buffer로 3회 세척하였다. 이후, 유세포분석기를 이용하여 FITC 발광을 측정하였다.Each of Raji cells and Jurkat cells was prepared by diluting in FACs buffer (PBS, 1% NaN ₃ , 2% FBS) at a concentration of 2X10 ⁶ cells/ml in the culture plate. Each cell line was aliquoted as much as 1X10 ⁵ cells in each well of a 96-well plate, and Jurkat cells with D21 and BLINCYTO were treated with the highest concentration of 1 uM, and the lowest concentration was treated with 1.9 nM in a concentration-dependent manner. . In addition, Raji cells were treated with the highest concentration of 250 nM as the highest concentration, and the lowest concentration was treated with a concentration of 488 pM in a concentration-dependent manner. After that, the reaction time was given for 1 hour and washed 3 times with FACs buffer. Then, as a secondary antibody, 100 μl of an anti-His tag FITC-conjugated monoclonal mouse antibody (Invitrogen, MA1-81891, in PBS pH 7.4, diluted 1/20) was added and reacted at room temperature for 2 hours. Then, the solution was discarded, and the plate was washed 3 times with FACs buffer. Then, FITC luminescence was measured using a flow cytometer.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 D21 및 BLINCYTO의 암 세포에서의 항원 결합 친화도(K_d 값)를 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 10a는 D21 및 BLINCYTO의 CD19 항원에 대한 Raji 세포에서의 CD19에 대한 항원 결합 친화도(K_d 값)를 나타내는 것이고, 도 10b는 D21 및 BLINCYTO의 CD3 항원에 대한 Jurkat 세포에서의 CD3에 대한 항원 결합 친화도(K_d 값)를 나타내는 것이다. 10 is a result of analyzing the antigen-binding affinity (K _d value) of D21 and BLINCYTO in cancer cells according to an embodiment of the present invention. Specifically, FIG. 10A shows the antigen binding affinity (K _d value) for CD19 in Raji cells for the CD19 antigen of D21 and BLINCYTO, and FIG. 10B shows CD3 in Jurkat cells against the CD3 antigen of D21 and BLINCYTO. It represents the antigen-binding affinity (K _d value) for

상기 도 10을 살펴보면, 본 발명의 D21의 암세포 항원에 대한 표적화 능력(K_d 값)이 BLINCYTO에 비해 약 1.17배 높은 것을 확인할 수 있으며 D21의 T 세포 항원에 대한 표적화 능력(K_d 값)이 BLINCYTO에 비해 약 0.93배 낮은 것을 확인할 수 있다. Referring to FIG. 10, it can be seen that the targeting ability (K _d value) of D21 to the cancer cell antigen of the present invention is about 1.17 times higher than that of BLINCYTO, and the targeting ability (K _d value) of D21 to the T cell antigen is BLINCYTO It can be seen that it is about 0.93 times lower than that of .

상기 실험 결과들로부터, 본 발명에 따르는 경우 현저히 저렴한 비용으로 단시간에 항원 결합 친화도가 높은 이중특이적 항체를 제조할 수 있다는 것을 알 수 있다.From the above experimental results, it can be seen that, according to the present invention, a bispecific antibody having high antigen-binding affinity can be produced in a short time at a significantly low cost.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.Although the present invention has been described as the above-mentioned preferred embodiment, it is possible to make various modifications and variations without departing from the spirit and scope of the invention. It is also intended that the appended claims cover such modifications and variations as fall within the scope of the present invention.

<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> Method for preparation of bispecific antibody using Pichia Pastoris and bispecific antibody prepared thereby <130> HPC-9249 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 505 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D21 <400> 1 Arg Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr 20 25 30 Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro 50 55 60 Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile 65 70 75 80 His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser 85 90 95 Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser 130 135 140 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 165 170 175 Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 180 185 190 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 195 200 205 Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 210 215 220 Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 225 230 235 240 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 260 265 270 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 275 280 285 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 290 295 300 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 305 310 315 320 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 325 330 335 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 340 345 350 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 355 360 365 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 370 375 380 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser 385 390 395 400 Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 405 410 415 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser 420 425 430 Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 435 440 445 Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 450 455 460 Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 465 470 475 480 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 485 490 495 Glu Leu Lys His His His His His His 500 505 <210> 2 <211> 504 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BLINCYTO <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 115 120 125 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val 130 135 140 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met 145 150 155 160 Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln 165 170 175 Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 210 215 220 Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 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Met Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser 260 265 270 Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr 275 280 285 Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 290 295 300 Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 305 310 315 320 Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 325 330 335 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 340 345 350 Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Tr p Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 370 375 380 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro 385 390 395 400 Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg 405 410 415 Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly 420 425 430 Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly 435 440 445 Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 450 455 460 Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 465 470 475 480 Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 485 490 495 Leu Lys His His His His His His 50 0 <210> 3 <211> 8260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pHIL-S1 <400> 3 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60 gtccattctc acacataagt t ggccattctc acacataagt gccaggacct acct ggccattctc acacataagt tcgaaaaacc 180 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggtcat gtttgtttat 300 ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag ggctttctga 360 gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccaa atggcccaaa actgacagtt taaacgctgt 420 cttggaacct aatatgacaa aagcgtgatc tcatccaaga tgaactaagt ttggttcgtt 480 gaaatgctaa cggccagttg gtcaaaaaga aacttccaaa agtcgccata ccgtttgtct 540 tgtttggtat tgattgacga atgctcaaaa ataatctcat taatgcttag cgcagtctct 600 ctatcgcttc tgaacccggt ggcacctgtg ccgaaacgca aatggggaaa caacccgctt 660 tttggatgat tatgcattgt cctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720 gctgatagct taaccagttact t gatcaccatagtact t gatcaccatagtact cat aaca gaaggaagct gccctgtctt aaaccttttt ttttatcatc attattagct 840 tactttcata attgcgactg gttccaattg acaagctttt gattttaacg acttttaacg 900 acaacttgag aagatcaaaa aacaactaat tattcgaaac gatgttctct ccaattttgt 960 ccttggaaat tattttagct ttggctactt tgcaatctgt cttcgctcga gaattccccg 1020 ggatccttag acatgactgt tcctcagttc aagttgggca cttacgagaa gaccggtctt 1080 gctagattct aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc aggcttcatt 1140 tttgatactt ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca ttttgtttct 1200 tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc ttgtggtagg 1260 ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc ctcttcagag 1320 tacagaagat taagtgagaa gttcgtttgt gcaagcttat cgataagctt taatgcggta 1380 gtttatcaca gttaaattgc taacgcagtc aggcaccgtg tatgaaatct aacaatgcgc 1440 tcatcgtcat cctcggcacc gtcaccctgg atgctgtagg cataggcttg gttatgccgg 1500 tactgccggg cctcttgcgg gatatcgtcc attccgacag catcgccagt cactatggcg 1560 tgctgctagc gctatatgcg ttgatgcaat ttctatgcgc acccgttctc ggagcactgt 1620 ccgaccgctt tggc cgccgc ccagtcctgc tcgcttcgct acttggagcc actatcgact 1680 acgcgatcat ggcgaccaca cccgtcctgt ggatctatcg aatctaaatg taagttaaaa 1740 tctctaaata attaaataag tcccagtttc tccatacgaa ccttaacagc attgcggtga 1800 gcatctagac cttcaacagc agccagatcc atcactgctt ggccaatatg tttcagtccc 1860 tcaggagtta cgtcttgtga agtgatgaac ttctggaagg ttgcagtgtt aactccgctg 1920 tattgacggg catatccgta cgttggcaaa gtgtggttgg taccggagga gtaatctcca 1980 caactctctg gagagtaggc accaacaaac acagatccag cgtgttgtac ttgatcaaca 2040 taagaagaag cattctcgat ttgcaggatc aagtgttcag gagcgtactg attggacatt 2100 tccaaagcct gctcgtaggt tgcaaccgat agggttgtag agtgtgcaat acacttgcgt 2160 acaatttcaa cccttggcaa ctgcacagct tggttgtgaa cagcatcttc aattctggca 2220 agctccttgt ctgtcatatc gacagccaac agaatcacct gggaatcaat accatgttca 2280 gcttgagaca gaaggtctga ggcaacgaaa tctggatcag cgtatttatc agcaataact 2340 agaacttcag aaggcccagc aggcatgtca atactacaca gggctgatgt gtcattttga 2400 accatcatct tggcagcagt aacgaactgg tttcctggac caaatatttt gtcacactta 2460 ggaacagttt ctgttccgta agccatagca gctactgcct gggcgcctcc tgctagcacg 2520 atacacttag caccaacctt gtgggcaacg tagatgactt ctggggtaag ggtaccatcc 2580 ttcttaggtg gagatgcaaa aacaatttct ttgcaaccag caactttggc aggaacaccc 2640 agcatcaggg aagtggaagg cagaattgcg gttccaccag gaatatagag gccaactttc 2700 tcaataggtc ttgcaaaacg agagcagact acaccagggc aagtctcaac ttgcaacgtc 2760 tccgttagtt gagcttcatg gaatttcctg acgttatcta tagagagatc aatggctctc 2820 ttaacgttat ctggcaattg cataagttcc tctgggaaag gagcttctaa cacaggtgtc 2880 ttcaaagcga ctccatcaaa cttggcagtt agttctaaaa gggctttgtc accattttga 2940 cgaacattgt cgacaattgg tttgactaat tccataatct gttccgtttt ctggatagga 3000 cgacgaaggg catcttcaat ttcttgtgag gaggccttag aaacgtcaat tttgcacaat 3060 tcaatacgac cttcagaagg gacttcttta ggtttggatt cttctttagg ttgttccttg 3120 gtgtatcctg gcttggcatc tcctttcctt ctagtgacct ttagggactt catatccagg 3180 tttctctcca cctcgtccaa cgtcacaccg tacttggcac atctaactaa tgcaaaataa 3240 aataagtcag cacattccca ggctatatct tccttggatt tagcttctgc aagttcatca 3300 gcttcctccc taattttagc gttca acaaa acttcgtcgt caaataaccg tttggtataa 3360 gaaccttctg gagcattgct cttacgatcc cacaaggtgg cttccatggc tctaagaccc 3420 tttgattggc caaaacagga agtgcgttcc aagtgacaga aaccaacacc tgtttgttca 3480 accacaaatt tcaagcagtc tccatcacaa tccaattcga tacccagcaa cttttgagtt 3540 gctccagatg tagcaccttt ataccacaaa ccgtgacgac gagattggta gactccagtt 3600 tgtgtcctta tagcctccgg aatagacttt ttggacgagt acaccaggcc caacgagtaa 3660 ttagaagagt cagccaccaa agtagtgaat agaccatcgg ggcggtcagt agtcaaagac 3720 gccaacaaaa tttcactgac agggaacttt ttgacatctt cagaaagttc gtattcagta 3780 gtcaattgcc gagcatcaat aatggggatt ataccagaag caacagtgga agtcacatct 3840 accaactttg cggtctcaga aaaagcataa acagttctac taccgccatt agtgaaactt 3900 ttcaaatcgc ccagtggaga agaaaaaggc acagcgatac tagcattagc gggcaaggat 3960 gcaactttat caaccagggt cctatagata accctagcgc ctgggatcat cctttggaca 4020 actctttctg ccaaatctag gtccaaaatc acttcattga taccattatt gtacaacttg 4080 agcaagttgt cgatcagctc ctcaaattgg tcctctgtaa cggatgactc aacttgcaca 4140 ttaacttgaa gctcagtcga ttgagtgaac ttgatcaggt tgtgcagctg gtcagcagca 4200 tagggaaaca cggcttttcc taccaaactc aaggaattat caaactctgc aacacttgcg 4260 tatgcaggta gcaagggaaa tgtcatactt gaagtcggac agtgagtgta gtcttgagaa 4320 attctgaagc cgtattttta ttatcagtga gtcagtcatc aggagatcct ctacgccgga 4380 cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac 4440 atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg tttcggcgtg 4500 ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt gcatgcacca 4560 ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac tgggctgctt cctaatgcag 4620 gagtcgcata agggagagcg tcgagtatct atgattggaa gtatgggaat ggtgataccc 4680 gcattcttca gtgtcttgag gtctcctatc agattatgcc caactaaagc aaccggagga 4740 ggagatttca tggtaaattt ctctgacttt tggtcatcag tagactcgaa ctgtgagact 4800 atctcggtta tgacagcaga aatgtccttc ttggagacag taaatgaagt cccaccaata 4860 aagaaatcct tgttatcagg aacaaacttc ttgtttcgaa ctttttcggt gccttgaact 4920 ataaaatgta gagtggatat gtcgggtagg aatggagcgg gcaaatgctt accttctgga 4980 ccttcaagag gtatgtaggg tttgtagata ctgatg ccaa cttcagtgac aacgttgcta 5040 tttcgttcaa accattccga atccagagaa atcaaagttg tttgtctact attgatccaa 5100 gccagtgcgg tcttgaaact gacaatagtg tgctcgtgtt ttgaggtcat ctttgtatga 5160 ataaatctag tctttgatct aaataatctt gacgagccaa ggcgataaat acccaaatct 5220 aaaactcttt taaaacgtta aaaggacaag tatgtctgcc tgtattaaac cccaaatcag 5280 ctcgtagtct gatcctcatc aacttgaggg gcactatctt gttttagaga aatttgcgga 5340 gatgcgatat cgagaaaaag gtacgctgat tttaaacgtg aaatttatct caagatctct 5400 gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg 5460 tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg 5520 gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata 5580 ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga 5640 aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct 5700 cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 5760 ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 5820 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg g cgtttttcc ataggctccg 5880 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 5940 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 6000 cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 6060 atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 6120 gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 6180 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 6240 agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 6300 tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 6360 tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 6420 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 6480 gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 6540 aaggatcttc acctagatcc ttttacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg 6600 tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg 6660 ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaa gct ctaaatcggg 6720 ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt 6780 agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt 6840 tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta 6900 tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa 6960 atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt 7020 aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 7080 gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 7140 gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 7200 cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 7260 gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 7320 gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca 7380 ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 7440 tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 7500 ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat gg cagcactg 7560 cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 7620 accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca 7680 cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 7740 tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 7800 cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 7860 acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 7920 atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 7980 tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 8040 aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 8100 cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagat ttctcatgtt tgacagctta tcatcgaatt 8160 aattctcatg tttgacagct tatcatcgat aagctgactc atgttggtat tgtgaaatag 8220acgcagatcg ggaacactga aaaataacag ttattattcg 8260

Claims

(1) 제1 결합 도메인을 통해 표적 세포 표면 항원에 결합하고 제2 결합 도메인을 통해 T 세포 표면 항원 CD3에 결합하는 이중특이적 항체를 제작하는 단계;
(2) 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하는 단계;
(3) 상기 발현벡터로 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 형질전환시키는 단계; 및
(4) 상기 형질전환된 피키아 파스토리스를 배양하여 이중특이적 항체의 발현을 유도하는 단계;를 포함하는 이중특이적 항체의 제조방법으로서,
상기 이중특이적 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것으로 CD3 및 CD19에 특이적으로 결합하고,
상기 형질전환된 피키아 파스토리스는 10 내지 25 ℃에서 100 내지 150 시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체의 제조방법.(1) constructing a bispecific antibody that binds to a target cell surface antigen through a first binding domain and binds to a T cell surface antigen CD3 through a second binding domain;
(2) constructing a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding the bispecific antibody;
(3) transforming Pichia pastoris with the expression vector; and
(4) inducing the expression of the bispecific antibody by culturing the transformed Pichia pastoris; a method for producing a bispecific antibody comprising:
The bispecific antibody specifically binds to CD3 and CD19 as represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
The transformed Pichia pastoris is a method for producing a bispecific antibody, characterized in that incubated for 100 to 150 hours at 10 to 25 ℃.

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제1항에 있어서,
상기 재조합 발현벡터는 pGAPZαA, pPICZ, pPICZαA, pPICZαB, pPICZαC, pPICZ-E, pPICZα-E, pPIC6, pPIC6αA, pPIC6αB, pPIC6αC, pGAPZ, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pHIL-D2 및 pHIL-S1 중에서 선택되는 어느 하나의 피키아 파스토리스 유래의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체의 제조방법.According to claim 1,
The recombinant expression vector is selected from pGAPZαA, pPICZ, pPICZαA, pPICZαB, pPICZαC, pPICZ-E, pPICZα-E, pPIC6, pPIC6αA, pPIC6αB, pPIC6αC, pGAPZ, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pHIL-D2 and pHIL-D2 A method for producing a bispecific antibody, characterized in that it comprises a vector derived from any one of the Pichia pastoris.

제1항에 있어서,
상기 재조합 발현벡터는 상기 이중특이적 항체를 코딩하는 염기서열의 업스트림에 피키아 파스토리스 유래 PHO-1 분비 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체의 제조방법.According to claim 1,
The recombinant expression vector is a method for producing a bispecific antibody, characterized in that it comprises a nucleotide sequence encoding the PHO-1 secretion signal peptide derived from Pichia pastoris upstream of the nucleotide sequence encoding the bispecific antibody.

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