KR102435727B1

KR102435727B1 - 알츠하이머 질환의 글루코스 대사 조절제 및 이를 스크리닝하는 방법

Info

Publication number: KR102435727B1
Application number: KR1020200058548A
Authority: KR
Inventors: 장근아; 김진호
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2022-08-23
Also published as: KR20210141195A

Abstract

본 발명은 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 제공함으로써 기존에 알려지지 않은 뇌 내 글루코스 대사를 조절, 구체적으로 뇌 내 글루코스 흡수를 줄여 뇌 내 산화 스트레스를 감소시킴으로써 세포 사멸을 감소시키고 이를 통해 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료할 수 있는 효과가 있고, 이를 스크리닝 하는 방법을 제공함으로써 신규한 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 발굴할 수 있는 효과가 있다.

Description

알츠하이머 질환의 글루코스 대사 조절제 및 이를 스크리닝하는 방법 {Modulator of glucose metabolism in Alzheimer's disease and screening method for the modulator}

본 발명은 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제 및 상기 대사 조절제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

최근 의학의 급속한 발전으로 인간의 평균수명이 늘어나고, 장노년 인구가 증가함에 따라 새로운 사회적 문제들이 부각되고 있다. 특히, 뇌졸중, 알츠하이머병 및 파킨슨병 등의 노인성 신경계 질환들은 치명적인 신경계의 기능장애로 나타나며, 현재까지는 이를 치료하기 위한 효과적인 방법이 없다.

특히, 노인성 신경계 질환 중 가장 흔하게 나타나고 있는 것이 알츠하이머(Alzheimer's disease, AD)이다. 알츠하이머는 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로 기억력, 사고력 및 행동상의 문제를 야기하는 뇌 질환이다. 치매는 일상생활을 방해할 정도로 심각한 기억력 및 기타 지적능력의 상실을 의미하는 일반 용어로서 알츠하이머는 치매 사례의 60 내지 80%를 차지한다.

이러한 알츠하이머의 주요한 병리적 소견으로 비정상적으로 축적된 아밀로이드 베타 플라크(Amyloid beta plaque, Aβ)와 세포 내 신경원 섬유 매듭(neurofibrillary tau tangles)인 것이 알려지고, 전 세계적으로 치료제를 개발하려고 하였으나, 명확한 원인이 밝혀지지 않았고, 개발된 치료제 또한 알츠하이머의 증상 완화에 불과하고, 질병의 진행을 지연시키거나 완치시키는 것에는 미진한 상태이다.

또한 알츠하이머 관련 연구로서 Aβ의 신경세포 독성의 기전을 밝히는데 연구가 집중되고 있다. Aβ와 함께 배양된 신경 세포 또는 AD 환자의 신경세포에서 전립선 아폽토시스 반응-4(Par-4), tau 단백질 키나제 1(GSK-3β, 칼세닐린 /DREAM/KChIP3 및 죽음 촉진 유전자 5(DP5)와 같은 프로 세포 사멸 유전자가 과다 발현되거나 또는 활성이 증가되는 것이 관찰되었으며, 이들의 기능을 차단시키면 Aβ에 의한 신경 사멸이 감소한다고 보고되었다(Guo, Q. et al., Nat. Med. 4:597-562, 1998; Takashima, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7789-7793, 1993; Jo, D.G. et al., FASEB J. 15:589-591, 2001; Imaizumi, K. et al., J. Biol. Chem. 274:7975-7981, 1999).

또한 이러한 알츠하이머 질환은 뇌 내 신경 세포의 주요한 에너지원인 글루코스의 대사 수준을 변화시키는 것이 알려져 있다. 구체적으로 대뇌 피질에서 뇌 내 글루코스 주요한 트랜스포터인 GLUT1의 수준이 감소되고 이러한 알츠하이머 질환의 GLUT1의 감소에 보상적으로 GLUT2의 수준이 급격하게 증가되는 것이 알려져 있다(Szablewski L., J Alzheimers Dis. 2017;55(4):1307-1320).

또한, 대한민국 등록특허공보 제10-0203456호에서는 디하이드로에보디아민-HCl(Dehydroevodiamine-HCl, DHED-HCl)을 유효성분으로 함유하는 기억항진 및 치매 치료제에 관한 것을 개시하였고, 특히 아세틸콜린 에스터레이즈(acetylcholinesterase; AchE)의 활성을 저해함으로써 기억항진 및 치매 치료제로서 사용될 수 있음을 개시하고 있다. 또한, 본 발명자의 연구자들에 의해 확인된 바와 같이, 상기 DHED-HCl의 유도체인 카복시-디하이드로에보디아민-HCl(carboxy-dehydroevodiamine-HCl) 또한 알츠하이머 모델 마우스인 5xFAD에 투여하였을 때 치료효과가 있는 것을 확인하였다(Kang et al., Frontiers in Behavioral Neuroscience, November 2018, Vol. 12, Article 273).

다만, 이러한 연구들에서 DHED 및 이의 유도체의 인지기능 개선의 효과는 확인하였으나, DHED의 유도체와 뇌 내 글루코스 대사의 상관관계에 대한 연구가 충분히 이루어지지 않았고, 이에 본 발명의 발명자들은 추가적인 연구를 통해 DHED 유도체가 알츠하이머 질환을 가진 뇌 내의 글루코스 대사를 조절하여 정상 수준으로 조절하여 뇌 내 글루코스 흡수를 줄여 뇌 내 산화 스트레스를 감소시킴으로써 세포 사멸을 감소시키고 이를 통해 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료할 수 있는 효과가 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료하기 위해, 뇌 내 글루코스 흡수를 줄여 뇌 내 산화 스트레스를 감소시킴으로써 세포 사멸을 감소시키는 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 상기 대사 조절제를 발굴하기 위해, DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면에서, DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델에게 피검물질을 처리하는 단계;

상기 단계의 피검물질이 처리된 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델의 뇌의 글루코스 대사를 측정하는 단계; 및

상기 단계의 측정 결과를 피검물질이 처리되지 않은 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델과 비교하여, 글루코스의 대사를 조절하는 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 제공함으로써 기존에 알려지지 않은 뇌 내 글루코스 대사를 조절하고, 구체적으로 뇌 내 글루코스 흡수를 줄여 뇌 내 산화 스트레스를 감소시킴으로써 세포 사멸을 감소시키고 이를 통해 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 상기 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 스크리닝하는 방법을 제공함으로써 신규한 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 발굴할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 대뇌 피질(cortex) 및 해마의 치상회(dentate gyrus)에서 본 발명의 DHED 발명의 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)의 변화를 확인한 도이다.
도 2는 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량을 확인한 도이다.
도 2a는 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 도 2a에서 확인되는 GLUT1의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 2c는 도 2a에서 확인되는 GLUT2의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 2d는 도 2a에서 확인되는 G6PD의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 2e는 도 2a에서 확인되는 HXK2의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량을 확인한 도이다.
도 3a는 해마에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 3b는 도 3a에서 확인되는 GLUT1의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3c는 도 3a에서 확인되는 GLUT2의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3d는 도 3a에서 확인되는 G6PD의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3e는 도 3a에서 확인되는 HXK2의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 4는 대뇌에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 글루코스 흡수량 변화를 확인하기 위한 [¹⁸F]FDG Micro-PET를 수행한 도이다.
도 4a는 대뇌에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 글루코스 흡수량 변화를 확인하기 위한 [¹⁸F]FDG Micro-PET 영상 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 도 4a에서 확인되는 대뇌 피질 내 글루코스 흡수량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 4c는 도 4a에서 확인되는 해마 내 글루코스 흡수량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 5는 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 SOD1 발현량을 확인한 도이다.
도 5a는 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 SOD1 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 5b는 도 5a에서 확인되는 SOD1의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 6은 해마에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 SOD1 발현량을 확인한 도이다.
도 6a는 해마에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 SOD1 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 6b는 도 5a에서 확인되는 SOD1의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 NeuN 및 BDNF 발현량을 확인한 도이다.
도 7a는 대뇌 피질에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 NeuN 및 BDNF 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 7b는 도 7a에서 확인되는 NeuN의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 7c는 도 7a에서 확인되는 BDNF의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 8은 해마에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 NeuN 및 BDNF 발현량을 확인한 도이다.
도 8a는 해마에서 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제의 투여 여부에 따른 NeuN 및 BDNF 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 8b는 도 8a에서 확인되는 NeuN의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 8c는 도 8a에서 확인되는 BDNF의 상대적 발현량을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 9는 새로운 개체 인식 실험(Novel object recognition test)에서 WT-S, WT-DHED, 5xFAD-S 및 5xFAD-DHED의 탐사 비율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 Y-미로 실험(Y-maze test)에서 WT-S, WT-DHED, 5xFAD 및 5xFAD-DHED의 자발적 교대 정도(%)를 나타낸 그래프이다.
도 11은 수동 회피 실험(Passive avoidance test)에서 WT-S, WT-DHED, 5xFAD-S 및 5xFAD-DHED의 지연 시간(초)를 나타낸 그래프이다.

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "DHED(Dehydroevodiamine) 유도체"는 아래의 화학식 I로 표시되는 디하이드로에보디아민(Dehydroevodiamine, 이하 DHED)의 유도체를 의미한다.

[화학식 I]

상기 DHED는 오수유로부터 추출분리된 천연추출물이거나 또는 합성물질일 수 있다. 구체적으로 상기 오수유는 Evodia rutaecarpa Benth.로써, 콜레라균, 피부사상균의 일부 및 회충을 포함한 기생충에 대하여 실험실 조건에서(in vitro) 강한 항균활성 및 살충효과를 나타내며, 자궁수축, 혈압강하 및 체온상승 등의 효과가 있고, 습진(eczema) 또는 신경피부염(neurodematitis)의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 오수유로부터 추출된 상기 구조식(Ⅰ)로 표시되는 DHED는 여러 가지 생물학적 효과가 있는 것으로 보고되어 있는 바, 예를 들면 혈압강하작용[Yang H. Y. et al., Asian Pac. J. Pharmacol. 3, 191∼196(1988)], 심박수강하작용[Yang M. C. et al., Eur. J. Pharmacol. 182, 537∼542(1990)], 이온채널억제 활성[Loh S. H. et al., Br. J. Pharmacol. 106, 517∼523(1992)], 뇌혈류증진 활성[Haji. A. et al.,Nat. Prod. 57, 387∼389(1994)] 등에 효과가 있다고 알려져 있다. 또한 AChEI가 백내장, 중증근무력증 및 폐쇄성알레우수에 유효한 약물임을 밝히는 많은 임상실험이 보고된 바 있다[Millard C. B. et al., J.Neurochem. 64, 1909∼1918(1995)].

상기 오수유로부터 추출분리는 공지의 방법으로 이루어질 수 있고, 구체적으로 오수유(Evodia rutaecarpa Benth.)를 80% 메탄올로 추출한 다음, 메탄올 추출물로부터 디클로로메탄으로 다시 추출하여 분획을 수득하고, 수득한 분획을 실리카겔 크로마토그래피하여 얻은 것일 수 있다(대한민국 등록특허공보 제10-0203456호에 공보). DHED의 합성은 아래와 같은 반응식을 통해 합성되는 것일 수 있다.

[반응식 1]

상기 DHED 유도체는 DHED로부터 유도되는 물질들로 구체적으로 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) 또는 DHED.HCl(Dehydroevodiamine.HCl) 인 것일 수 있고, 구체적으로 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)일 수 있다. 상기 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)는 화학식 II, DHED.HCl(Dehydroevodiamine.HCl)는 화학식 III일 수 있다.

[화학식 II]

[화학식 III]

상기 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) 또는 DHED.HCl(Dehydroevodiamine.HCl)와 같은 DHED 유도체는 상기 화학식 I의 DHED에 비하여 용해도가 높아 생체이용율(bioavailability)이 우수한 효과가 있다. 구체적으로 종래 화학식 I의 DHED는 수용성이 낮아 약제로서 이용이 어렵고, 목적하는 혈중농도에 도달하기 어려운 문제점이 있었다. 반면 본 발명의 DHED 유도체, 특히, cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)의 경우 DHED보다 물에 대한 용해도가 2,000배 이상 높아 생체이용율(bioavailability)이 우수하여 약제로서 이용이 용이하며, 알파 세크레타제 활성화 효과도 있어 약리효과도 보다 우수한 장점이 있다. 이러한 약리효과의 개선은 알츠하이머와 같은 뇌-혈관 장벽(Blood Brain Barrier, BBB)으로 인해 DHED 유도체의 수용성의 증가할수록 대뇌 피질이나 해마와 같이 뇌 내 목적하는 위치까지 이동이 용이해짐에 따른 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "대사 조절제" 인체의 생체 대사 기작을 조절하는 물질을 의미하는 것이고, 구체적으로, 일반적으로 하나 이상의 대사 경로를 조절, 즉 조절, 촉진 또는 저해하는 작용을 하는 작용제를 지칭한다. 본 발명에서의 대사 조절제는 상기한 바와 같이 DHED 유도체를 포함하는 것으로, 구체적으로 글루코스 대사를 조절하는 대사 조절제를 의미한다.

상기 글루코스 대사 조절제는 글루코스 대사와 관련된 글루코스 흡수, 세포 내외이동 및 세포 내 글루코스 대사를 조절하는 것일 수 있다. 구체적으로, GLUT1(Glucose transporter 1), GLUT2(Glucose transporter 2) 및 G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)로부터 선택되는 하나 이상의 대사를 조절하는 것으로, 더욱 구체적으로 GLUT1(Glucose transporter 1) 발현의 증가, GLUT2(Glucose transporter 2) 발현의 감소 및 G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 발현의 감소 중 어느 하나 이상의 방식으로 글루코스 대사를 조절하는 것일 수 있다.

상기 GLUT1는 글루코스를 전달하는 세포막 수송 단백질로서 주로 태아 세포, 적혈구, 뇌에서 발현된다. GLUT1은 알츠하이머 질환에 걸린 환자의 경우, 특히 대뇌 피질 및/또는 해마에서, 정상인에 비하여 그 발현 및/또는 활성의 수준이 감소되는 것으로 알려져 있다(Szablewski L., J Alzheimers Dis. 2017;55(4):1307-1320). 그러나, 상기한 바와 같이 본 발명의 글루코스 대사 조절제를 투여할 경우 GLUT1의 발현량이 유의미하게 상승하여, 결국 감소된 GLUT1의 발현 및/또는 활성의 수준이 회복되는 것을 알 수 있다.

상기 GLUT2 또한 글루코스를 전달하는 세포막 수송 단백질로서 주로 간, 췌장, 장 또는 시상하부 등에서 주로 발현된다. GLUT2는 알츠하이머 질환에 걸린 환자의 경우, 특히 대뇌 피질 및/또는 해마에서, 정상인에 비하여 상기한 GLUT1의 감소에 상보적으로 그 발현 및/또는 활성의 수준이 증가하는 것으로 알려져 있다(Szablewski L., J Alzheimers Dis. 2017;55(4):1307-1320). 그러나, 상기한 바와 같이 본 발명의 글루코스 대사 조절제를 투여할 경우 GLUT2의 발현량이 유의미하게 감소하여 상승된 GLUT2의 발현 및/또는 활성의 수분이 회복되는 것을 알 수 있다.

또한, G6PD는 세포 내 단백질로서 D-글루코스-6-포스페이트(D-glucose-6-phosphate)와 NADP+를 6-phospho-D-글루코노-1,5-락톤(6-phospho-D-glucono-1,5-lactone), NADPH와 H+로 가역적 변화시킨다. 이러한 G6PD는 알츠하이머 질환에 걸린 환자의 경우, 특히 대뇌 피질 및/또는 해마에서, 정상인에 비하여 그 발현 및/또는 활성의 수준이 증가하는 것이 확인되었다. 그러나, 상기한 바와 같이 본 발명의 글루코스 대사 조절제를 투여할 경우 G6PD 발현량이 유의미하게 감소하여 상승된 G6PD의 발현 및/또는 활성의 수분이 회복되는 것을 알 수 있다.

또한, HXK2(Hexokinase 2)는 글루코스를 글루코스-6-포스페이트(Glucose-6-phosphate)로 변환시키는 단백질로서 주로 근육 및 뇌에서 발현되고, 암 세포에서 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다.

또한, 상기한 본 발명의 글루코스 대사 조절제는 뇌 내에서 작용하는 것일 수 있고, 대뇌 피질(cortex) 및 해마(hippocampus) 중 어느 하나 이상의 글루코스 대사를 조절하는 것일 수 있다. 구체적으로 실험예 2에서 확인되는 바와 같이 대뇌 피질 및 해마에서 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 GLUT1의 발현은 감소, GLUT2 및 G6PD의 발현은 증가되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 대뇌 피질에서의 글루코스 대사가 변화되는 것을 알 수 있고, 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, GLUT1의 발현이 증가, GLUT2 및 G6PD의 발현이 감소되어 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다.

구체적으로, 상기 DHED 유도체는 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) 또는 DHED.HCl(Dehydroevodiamine.HCl)인 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)인 것일 수 있다.

상기 글루코스 대사 조절은 구체적으로, GLUT1, GLUT2 및 G6PD로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 더욱 구체적으로, GLUT1 발현의 증가, GLUT2 발현의 감소 및 G6PD 발현의 감소로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한, 상기 글루코스 대사 조절제는 구체적으로, 뇌 내 글루코스 흡수를 줄이는 것일 수 있고, 이를 통해 뇌 내 산화 스트레스(oxidative stress)를 감소시켜 뇌 내 세포 자멸을 감소시키는 것일 수 있다.

또한, 상기 글루코스 대사 조절제는 알츠하이머 환자의 뇌 내 글루코스 대사를 조절하는 것일 수 있다.

또한, 상기 글루코스 대사 조절제는 구체적으로 대뇌 피질 및 해마 중 어느 하나 이상에 작용하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델에게 피검물질을 처리하는 단계;

상기 단계의 측정 결과를 피검물질이 처리되지 않은 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델과 비교하여, 글루코스의 대사를 조절하는 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 글루코스 대사를 측정하는 단계는 알츠하이머 질환을 가진 마우스 모델의 대뇌 피질 및 해마 중 어느 하나 이상의 글루코스 대사를 측정할 수 있다.

구체적으로, 상기 글루코스 대사를 측정하는 단계는 GLUT1(Glucose transporter 1) 발현의 증가, GLUT2(Glucose transporter 2) 발현의 감소 및 G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 발현의 감소로부터 선택되는 하나 이상의 대사 조절을 측정하는 것일 수 있다.

또한, 상기 글루코스 대사를 측정하는 단계에서 피검물질에 의한 글루코스 대사 조절은 뇌 내 글루코스 흡수를 줄이는 것일 수 있다.

또한, 상기 글루코스 대사를 측정하는 단계에서 피검물질에 의한 글루코스 대사 조절은 상기 피검물질에 의해 뇌 내 글루코스 흡수를 줄여 뇌 내 산화 스트레스(oxidative stress)를 감소시키는 것일 수 있다.

그 결과, 본 발명의 글루코스 대사 조절제를 통해 뇌 내 아밀로이드 플라크가 감소할 수 있고(도 1 참조), 글루코스 수송체와 관련된 GLUT1의 발현량은 증가하고, GLUT2 및 G6PD의 발현량은 감소하여(도 2 및 3 참조), 뇌 내 글루코스 대사를 조절할 수 있음을 확인할 수 있고(도 4 참조), 산화 스트레스의 간접적인 확인을 위한 SOD1의 발현량이 증가됨을 확인하고(도 5 및 6 참조), 신경세포의 변화를 위한 NeuN 및 BDNF의 발현량이 증가됨을 확인함으로써(도 7 및 8 참조), 뇌 내 산화 스트레스를 감소시켜 세포 사멸을 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있고, 결핍된 인지 및 기억 능력을 향상시킬 수 있는 효과가 있음을 확인할 수 있다(도 9, 10 및 11 참조). 이를 통해 알츠하이머 질환의 예방 및/또는 치료할 수 있다.

이하에서는 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스의 제조

1-1. 실험 마우스의 준비

5가지의 Human APP 및 PS1 유전자(3가지 APP 유전자: Swedish mutation: K670N, M671L; Florida mutation: I716V; London mutation V717I, 두가지 PS1 유전자 M146L, L286V)를 발현하는 5xFAD 형질전환 마우스를 알츠하이머 질환 모델로서 사용하였고, 대조군으로 야생형 마우스를 사용하였다. 이들 각각 4개월령인 것을 사용하였다. 마우스의 사육은 12시간 간격으로 명/암을 조절하고, 실내온도 및 습도는 각각 상온(22±2℃), 50±10% 수준으로 유지하였으며, 물과 사료는 자유롭게 먹게 하였다(ad libitum). 모든 동물실험은 가천대학교 이길여 암 당뇨 연구원의 International Animal Care and Use Committee의 승인 하에 이루어졌다.

1-2. DHED(Dehydroevodiamine) 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스의 제조

DHED(Dehydroevodiamine) 유도체로서 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)를 사용하였고, 상기 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl)는 0.9% 식염수에 현탁하여 사용하였으며, 상기 실시예 1-1에서 준비한 5xFAD 형질전환 마우스에 상기 cx-DHED.HCl(Carboxy-Dehydroevodiamine.HCl) 현탁된 것을 1mg/kg의 양으로 8주간 주 5회 복강(intraperitoneal, i.p.) 투여하여 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED, n=3)를 제작하였다.

대조군으로서 0.9%의 식염수를 5xFAD-cx-DHED 마우스와 동일한 양 횟수로 투여한 야생형 마우스(WT, n=3) 및 5xFAD 형질전환 마우스(5xFAD, n=3)를 제작하였다.

<실시예 2> 대뇌 피질(cortex) 및 해마(hippocampus) 조직 준비

야생형 마우스(WT), 알츠하이머 질환 모델 마우스(5xFAD) 및 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)를 Rompun 및 Zoletil로 마취(1μg/g, i.p.)하였고, 경심관류(transcardially)로 헤파린을 포함하는 차가운 식염수를 관류시켰다. 뇌는 후술되는 웨스턴 블랏을 위해 반으로 나누고 반쪽 뇌는 4% 포름알데하이드에서(4% PFA) 24시간 고정하여 파라핀으로 굳힌 후 형광 조직 염색 하였으며, 나머지 반 뇌는 급속 냉동하여 피질과 해마를 해부하였다. 해부, 급속 냉동된 피질과 해마는 웨스턴 블랏 진행을 위해 무게를 측정한 후 단백질 추출시약(RIPA buffer)을 첨가하여 추출하였다.

<실험예 1> DHED 유도체 투여에 따른 아밀로이드 플라크(amyloid plaque) 감소 확인

알츠하이머 치매 동물 모델(5xFAD)에서 나타나는 아밀로이드 플라크(amyloid plaque) 및 DHED 유도체 투여에 의한 아밀로이드 플라크 감소를 확인하기 위해 야생형 마우스(WT), 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD) 및 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD-cx-DHED) 총 3개 그룹에서 형광 조직 염색을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 2의 파라핀으로 굳힌 조직을 마이크로톰(Microtome)으로 섹션(section)하여 슬라이드에 올린 후, 염색을 진행하였다. 아밀로이드 플라크를 검출하기 위한 티오플라빈 S(Thioflavin S) 및 신경세포 검출을 위한 NeuN(1:500)을 공동염색(Co-staining)하여 형광카메라(Nikon ECLIPSE Ts2)를 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 아밀로이드 플라크에서 발현되는 티오플라빈 S 염색은 알츠하이머 치매 동물 모델의 대뇌 피질 및 해마의 치상회(Dentate gyrus)에서 발견되었으며, 글루코스 대사 조절제가 투여된 알츠하이머 마우스(5xFAD-cx-DHED)의 대뇌 피질 및 해마의 치상회에서는 조절제가 투여되지 않은 그룹에 비해 확연한 감소를 보였다(도 1). 반면, 야생형(WT)에서는 티오플라빈 S 염색이 발현되지 않았다. 이는, 대뇌 피질 및 해마의 치상회에서 치매 유발 물질에 해당하는 아밀로이드 플라크의 발현이 DHED 유도체에 의해 억제될 수 있음을 제시한다.

<실험예 2> DHED 유도체 투여에 따른 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량 변화 확인

2-1. 대뇌 피질에서의 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량 변화 확인

대뇌 피질(cortex)에서, 글루코스 수송체와 관련된 GLUT1, GLUT2 및 G6PD의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다.

구체적으로, 통상적인 방법에 따라, 실시예 2의 조직을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, PVDF 막으로 이동시켰다. 상기 막에 GLUT1(1:1000), GLUT2(1:1000) 및 G6PD(1:1000) 단백질에 대한 1차 항체를 각각의 비율로 희석하여 첨가하였다. 여기에 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(Bio-rad, USA)를 첨가하고 반응시킨 뒤, ECL 플러스 용액(Amersham Pharmacia, Sweden)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 검출된 밴드의 강도를 Quantity One 소프트웨어 4.6.5(BioRad, USA)를 사용하여 측정함으로써 단백질의 양을 정량하였다. 평균 발현량은 임의의 단위(arbitrary unit, AU)를 이용하여 나타내었다.

그 결과, 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 GLUT1의 발현이 유의적으로(p<0.05) 감소(도 2b), GLUT2(p<0.001) 및 G6PD(p<0.001)의 발현은 증가되는 것으로(도 2c 및 2d), 이러한 결과를 통해 알츠하이머 질환에 의해 대뇌 피질에서의 글루코스 대사가 변화되는 것을 알 수 있었다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, GLUT1의 발현이 증가, GLUT2(p<0.001) 및 G6PD(p<0.001)의 발현이 감소되어 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 2b, 2c 및 2d). 또한, 야생형 마우스(WT)의 발현량을 기준으로 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 HXK2 발현량이 유의적으로(p<0.01) 감소하였고, 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 HXK2의 발현량이 증가(p<0.05)됨을 확인하였다(도 2e). 이는, DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 투여함으로써 글루코스 수용체의 발현을 조절하여 뇌 내 글루코스 흡수를 조절하는 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.

2-2. 해마에서의 GLUT1, GLUT2, G6PD 및 HXK2 발현량 변화 확인

해마(hippocampus)에서, 글루코스 수송체와 관련된 GLUT1, GLUT2 및 G6PD의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 실험 방법은 해마 조직이라는 점을 제외하고는, 실험예 2-1의 방법과 동일하게 수행하였다.

그 결과, 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 GLUT1의 발현은 감소(도 3b), GLUT2(p<0.0001) 및 G6PD(p<0.0001)의 발현은 증가되는 것을 확인할 수 있다(도 3c 및 3d). 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 해마에서의 글루코스 대사가 변화되는 것을 알 수 있다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, GLUT1의 발현이 증가, GLUT2(p<0.0001) 및 G6PD(p<0.0001)의 발현이 감소되어 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 3b, 3c 및 3d) 또한, 야생형 마우스(WT)의 발현량을 기준으로 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 HXK2 발현량이 유의적으로(p<0.05) 감소하였고, 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여에도 HXK2 의 발현량이 증가되지 않음을 확인할 수 있다(5xFAD-cx-DHED)(도 3e). 이는 실험예 2-1과 마찬가지로, DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제를 투여함으로써 글루코스 수용체의 발현을 조절하여 뇌 내 글루코스 흡수를 조절하는 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.

<실험예 3> DHED 유도체 투여에 따른 뇌 내 글루코스 흡수 변화 확인

DHED 유도체 투여에 따른 뇌 내 글루코스 흡수의 변화를 확인하기 위해 양전자단층촬영(Micro-PET)을 수행하였다.

구체적으로, 야생형 마우스(WT), 알츠하이머 질환 모델 마우스(5xFAD) 및 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)를 호흡 마취(Isoflurane)하였고, 약 200uCi 농도의 [¹⁸F]FDG 추적자(tracer)를 꼬리정맥 투여하였으며 30분간 흡수(uptake)를 진행하였다. 투여 30분 후, 마우스는 양전자단층촬영 장비에서 호흡 마취 상태로 30분간 촬영을 진행하였다. 촬영이 끝난 후, 영상 결과를 얻어 PMOD 프로그램을 통해 영상 분석을 진행하였다(도 4a).

그 결과, 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)의 대뇌 피질 및 해마의 글루코스 흡수량이 증가하였으며(p<0.05), 이러한 결과를 통해 알츠하이머 질환에 의해 대뇌 피질 및 해마에서의 글루코스 양이 변화되는 것을 알 수 있었다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, 글루코스 흡수량이 감소되었으며(p<0.05), 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여 증가하여 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 4b 및 4c). 이는 실험예 2의 글루코스 수용체 발현의 변화로 뇌 내 글루코스 흡수량이 조절되는 효과가 있음을 제시한다.

<실험예 4> DHED 유도체 투여에 따른 뇌 내 산화 스트레스 감소 확인

4-1. 대뇌 피질에서의 SOD1(Superoxide dismutase 1)의 발현량 확인

대뇌 피질에서, 산화 스트레스의 간접적인 확인을 위한 초산화물 효소 SOD1(Superoxide dismutase 1)의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. SOD1은 체내 활성산소에 의해 발생하는 산화 스트레스(oxidative stress)를 억제시켜 유해산소에 의한 해로운 영향을 억제하는데, 알츠하이머 치매 동물모델(5xFAD)에서는 SOD1이 감소되어 산화적 스트레스에 의한 뇌 내 단백질 변화 및 관련 메커니즘의 변화로 질환이 발생한다.

구체적으로, 통상적인 방법에 따라, 실시예 2의 조직을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, PVDF 막으로 이동시켰다. 상기 막에 SOD1에 대한 1차 항체를 1:1000의 비율로 희석하여 첨가하였다. 여기에 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(Bio-rad, USA)를 첨가하고 반응시킨 뒤, ECL 플러스 용액(Amersham Pharmacia, Sweden)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 검출된 밴드의 강도를 Quantity One 소프트웨어 4.6.5(BioRad, USA)를 사용하여 측정함으로써 SOD1의 양을 정량하였다. 평균 발현량은 임의의 단위(arbitrary unit, AU)를 이용하여 나타내었다.

대뇌 피질 조직을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과(도 5a), 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 SOD1의 발현은 유의적으로 증가(p<0.05)되는 것을 확인할 수 있다(도 5b). 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 해마에서의 산화 스트레스에 대한 저항성이 약해짐을 알 수 있다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, SOD1이 유의적으로 증가하는 경향을 보였으며, 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 5b). 이는, DHED 유도체 투여를 통하여 알츠하이머 질환에 의한 대뇌 피질에서의 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 제시한다.

4-2. 해마에서의 SOD1 발현량 확인

해마에서, 산화 스트레스의 간접적인 확인을 위한 SOD1의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 실험 방법은 해마 조직이라는 점을 제외하고는, 실험예 4-1의 방법과 동일하게 수행하였다.

해마 조직을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과(도 6a), 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 SOD1의 발현은 감소되는 경향을 확인할 수 있다(도 6b). 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 해마에서의 산화 스트레스에 대한 저항성이 약해짐을 알 수 있다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, SOD1(p<0.05)가 유의적으로 증가하는 경향을 보였으며, 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 6b). 이는, DHED 유도체 투여를 통하여 알츠하이머 질환에 의한 해마에서의 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 제시한다.

<실험예 5> DHED 유도체 투여에 따른 신경세포의 사멸 억제 및 회복 확인

5-1. 대뇌 피질에서의 NeuN 및 BDNF 발현량 확인

대뇌 피질에서, 신경세포의 변화를 위한 NeuN 및 BDNF의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다.

구체적으로, 통상적인 방법에 따라, 실시예 2의 조직을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, PVDF 막으로 이동시켰다. 상기 막에 NeuN(1:2000) 및 BDNF(1:2000) 단백질에 대한 1차 항체를 각각의 비율로 희석하여 첨가하였다. 여기에 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(Bio-rad, USA)를 첨가하고 반응시킨 뒤, ECL 플러스 용액(Amersham Pharmacia, Sweden)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 검출된 밴드의 강도를 Quantity One 소프트웨어 4.6.5(BioRad, USA)를 사용하여 측정함으로써 단백질의 양을 정량하였다. 평균 발현량은 임의의 단위(arbitrary unit, AU)를 이용하여 나타내었다.

대뇌 피질 조직을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과(도 7a), 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 NeuN(p<0.001)의 발현은 유의적으로 감소하였으며(도 7b), BDNF는 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 7c). 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 대뇌 피질에서의 신경세포 사멸 발생을 알 수 있다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, NeuN의 발현이 유의적으로 증가(p<0.0001)하고, BDNF이 증가하는 경향을 보였으며, 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 7b 및 7c). 이는, DHED 유도체 투여를 통하여 알츠하이머 질환에 의한 대뇌 피질에서의 신경세포의 사멸을 억제할 수 있음을 제시한다.

5-2. 해마에서의 NeuN 및 BDNF 발현량 확인

해마에서, 신경세포의 변화를 위한 NeuN 및 BDNF의 발현량을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 실험 방법은 해마 조직이라는 점을 제외하고는, 실험예 5-1의 방법과 동일하게 수행하였다.

해마 조직을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과(도 8a), 야생형 마우스(WT)에 비하여 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)는 NeuN(p<0.001)의 발현은 유의적으로 감소하였으며(도 8b), BDNF는 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다(도 8c). 이러한 결과를 통해, 알츠하이머 질환에 의해 해마에서의 신경세포 사멸 발생을 알 수 있다. 이러한 변화에 대하여 본 발명의 DHED 유도체를 포함하는 뇌 내 글루코스 대사 조절제가 투여된 마우스(5xFAD-cx-DHED)는 알츠하이머 모델 마우스(5xFAD)에 비하여, NeuN의 발현이 유의적으로 증가(p<0.01)하고 BDNF(p<0.05)도 유의적으로 증가하는 경향을 보였으며, 야생형 마우스(WT) 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있다(도 8b 및 8c). 이는, DHED 유도체 투여를 통하여 알츠하이머 질환에 의한 해마에서의 신경세포의 사멸을 억제할 수 있음을 제시한다.

<실험예 6> DHED 유도체 투여에 따른 인지 및 기억 능력 향상 확인

cx-DHED(cx-DD)가 AD의 인지 장애에 대한 치료 효과를 갖는지 여부를 확인하기 위해, 먼저 WT-v(wild type mouse-vehicle), WT-cx-DD(wild type mouse-cx-DHED), Tg-v(transgenic mouse-vehicle) 및 Tg-cx-DD(transgenic mouse-cx-DHED)의 5xFAD 마우스 그룹(6개월 령 마우스)를 준비하고 해당 마우스 그룹으로 3가지 행동 실험(새로운 개체 인식 실험, Y-미로 실험 및 수동 회피 실험)을 수행하였다.

6-1. 새로운 개체 인식 실험(Novel object recognition test) 수행

인지 기억은 새로운 개체 인식 실험(Novel object recognition test, NOR) 실험을 사용하여 평가되었다. 각 마우스 그룹은 개방형 상자(가로 40cm x 세로 40cm x 높이 40cm)에서 진행되었다. 실험하는 동안, 물체에 접촉하는 시간 및 빈도와 이동 경로(거리), 속도 등의 환경 설정은 EthoVision Maze task system(Noldus Information Technology, Wageningen, the Netherlands)을 사용하여 기록되었다.

첫 번째 날, 훈련에서 똑같은 물체 2개에 대한 인지 정도를 측정하였다. 2일째 되는 날, 1개의 물체를 새로운 물체로 바꾸어 준 다음 테스트를 진행하였다. 각 마우스 그룹의 이동 속도가 다르지 않음에도 Tg-v 마우스(30.68±10.43)는 감소된 새로운 물체 인지 정도를 나타내었다. 또한, Tg-cx-DD 마우스(80.04±4.59)는 Tg-v 마우스(30.68±10.43)와 비교하여 새로운 물체에 대한 인지 정도가 향상됨을 나타냈다(도 9). 이러한 결과는, Tg-v 마우스와 비교하여 cx-DHED를 투여한 Tg-cx-DD 마우스에서 인지 기억이 상당히 개선되었음을 제시한다.

6-2. Y-미로 실험(Y-maze test) 수행

Y-미로 실험(Y-maze test)은 길이 40cm, 폭 5cm, 높이 10cm인 3개의 가지(A, B, C)로 구성되어 있으며 120°의 각도에서 이루어진다. 각 마우스 그룹을 미로에 8분 동안 놓았고, 꼬리가 각 가지에 들어간 빈도를 가지마다 세었다. 동물이 가지에 들어온 횟수(A, B, C 순서)도 세어 1점(실제 변경, 실제 교대)을 부여했다. 변경 조치 수행 능력(%)의 계산 공식은 하기와 같다.

변경 조치 수행 능력(%) = 실제 변경(실제 교대)/최대 변경(최대 교대)Х100(최대 변경: 총 출입 수-2).

그 결과, Y-미로 실험에서 자발적인 변경 속도는 Tg-v 마우스(52.73±13.26)와 비교하여 Tg-cx-DD(80.37±5.41)에서 현저히 개선되었다(도 10). 이는, Tg-v 마우스와 대비하여 cx-DHED를 투여한 Tg-cx-DD 마우스가 공간 및 절차적인 기억 능력이 향상되었음을 제시한다.

6-3. 수동 회피 실험(Passive avoidance test) 수행

수동 회피 실험(Passive avoidance test)은 회피 학습 박스(Gemini Passive avoidance System; San Diego Instruments, SD, USA)를 사용하여 수행되었다. 수동 회피 장치(폭 42.5cm, 길이 35.5cm)는 밝고 어두운 칸막이가 있는 2개의 상자로 구성되어 있고, 조명 부분은 LED house 조명(6W)으로 전기 그리드 바닥이 장착된 어두운 챔버에 연결되었다. 각 마우스 그룹들은 첫날에 두 구획을 탐험하도록 하였고, 다음 날, 동물의 암실 입구는 발에 전기 충격(2초간 2mA)을 가하도록 하였다. 기억 검사(retention test)는 상기 실험 후 24시간 후에 수행되었고 마우스에 충격을 주지 않았다는 점을 제외하고는 절차적으로 상기 실험과 유사하였다. 기억 능력의 척도는 각 마우스 그룹이 밝은 방에 머무른 시간(단계 간 대기 시간)으로 측정하였다.

그 결과, Tg-cx-DD(239.3±11.11)의 스텝스루(step-through) 지연 시간은 Tg-v 마우스(91.2±41.86)와 비교하여 감소하였다(도 11). 이는, cx-DHED를 처리함에 따라 결핍되었던 단기 기억 능력이 회복될 수 있음을 제시한다.

Claims

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(1) 알츠하이머 질환을 가진 마우스로부터 분리한 시료에 분석하고자 하는 피검물질을 처리하는 단계:
(2) 상기 시료에서 GLUT1(Glucose transporter 1), GLUT2(Glucose transporter 2), G6PD(Glucose-6-phosphate dehydrogenase), SOD1(Superoxide dismutase 1), NeuN (neuronal nuclei) 및 BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(3) 상기 GLUT1, SOD1, NeuN 및 BDNF의 발현 수준이 상기 피검물질을 처리하기 전에 비해 증가되고, 상기 GLUT2 및 G6PD 의 발현 수준이 상기 피검물질을 처리하기 전에 비해 감소되는 피검물질을 선별하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뇌 내 글루코스 대사 조절제 스크리닝 방법.
제11항에 있어서,
상기 시료는 대뇌 피질 및 해마로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 뇌 내 글루코스 대사 조절제 스크리닝 방법.
제11항에 있어서,
상기 피검물질은 뇌 내 글루코스 흡수를 감소시키고, 산화 스트레스를 감소시키며, 신경세포의 사멸을 억제시키고, 결핍된 인지 및 기억 능력을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 뇌 내 글루코스 대사 조절제 스크리닝 방법.
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