KR102434595B1 - 아스피린을 유효성분으로 포함하는 모기류 알발육 억제용 조성물 및 이를 이용한 모기류 방제방법 - Google Patents

아스피린을 유효성분으로 포함하는 모기류 알발육 억제용 조성물 및 이를 이용한 모기류 방제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스피린을 유효성분으로 포함하는 모기류 억제용 조성물 및 이를 이용한 모기류 방제방법에 관한 것으로, 특히 아스피린을 유효성분으로 포함하여 모기류의 알발육을 억제할 수 있는 조성물과 이러한 조성물을 이용한 모기류 방제방법에 관한 것이다. 아스피린을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물을 모기류에 처리하면 산란수가 감소하고 산란된 알의 생존력이 낮아지므로 모기류의 방제에 유효하며, 이렇게 모기류를 방제함으로써 이러한 모기류에 의해 매개되는 질병 또한 예방할 수 있다.

Description

아스피린을 유효성분으로 포함하는 모기류 알발육 억제용 조성물 및 이를 이용한 모기류 방제방법 {Composition for inhibiting mosquitoes comprising aspirin and method for controlling mosquitoes using it}
본 발명은 모기류를 억제하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아스피린을 유효성분으로 포함하여 모기류의 알발육을 억제할 수 있는 조성물과 이러한 조성물을 이용한 모기류 방제방법에 관한 것이다.
일부 모기는 다양한 인체질환을 매개하는 해충으로 분류된다. 이들 가운데 숲모기류(Aedes) 모기는 지카바이러스, 뎅기열바이러스, 키쿤군야바이러스 등 최소한 22종의 병원 바이러스를 매개한다(Van den Hurk et al., 2016; WHO, 2018). 학질모기류(Anopheles)는 연간 백만명 이상의 치사를 일으키는 말라리아원충(Plasmodium) 원생동물 병원체를 운반한다(Zhang et al., 2016).
이러한 질환을 매개하는 모기류의 알발육은 포유류의 혈액을 섭취하여 영양분을 공급받은 후 일어나게 된다(Raikhel et al., 2002). 성충으로 우화한 모기 암컷은 인슐린신호(Wu and Brown, 2006)를 보내고 유약호르몬을 분비(Davey et al., 1994)하여 줄기세포에서 난모세포로 분화가 일어나는 초기 알발육(previtellogenesis: PV)이 일어난다. 이때 혈액을 섭취하면 엑다이손을 분비하게 하여 지방체에서 난황소단백질의 생합성을 유도하게 하고, 이를 알 내부에 축적하는 난황축적(vitellogenesis: VT)이 일어나게 된다. 난황소의 축적이 끝나면 난포세포가 난모세포를 둘러싸는 난각단백질(chorion)을 분비하여 알껍질을 만드는 난각형성(choriogenesis: CH)이 일어나게 된다. 이러한 과정에서, 초기 알발육(PV)과 난황축적(VT)의 내분비신호에 대해서는 비교적 잘 연구가 되었지만, 난각형성(CH)과 관련된 내분비신호는 정확히 밝혀지지 않았다.
대한민국 특허공개 제10-2006-0029259호 대한민국 특허공개 제10-2014-0045542호 대한민국 특허공개 제10-2015-0129797호 대한민국 특허공개 제 10-2017-0015921호 대한민국 특허공개 제 10-2017-0020804호 대한민국 특허공개 제 10-2017-0038782호 대한민국 특허공개 제 10-2017-0036676호
본 발명은 인체질환을 매개하는 모기류의 알발육에 프로스타글란딘(PG)의 내분비신호가 필요한 것을 확인하고 아스피린이 모기류의 알발육을 억제하는 효과를 확인하여 아스피린을 유효성분으로 포함하는 모기류 생식을 억제하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 아스피린을 유효성분으로 포함하는 모기류 억제용 조성물 제공한다. 상기 조성물은, 바람직하게는 상기 아스피린을 모기류의 알발육을 억제하는 유효성분으로 포함한다.
또한, 본 발명에서는 모기류의 알발육을 억제하는 유효량으로 아스피린을 처리하는 것을 포함하는 모기류 방제방법을 제공한다. 상기 방제방법은, 바람직하게는 상기 아스피린이 모기류의 알껍질을 형성하는 유전자의 발현을 억제하는 것을 포함한다.
상기 모기류는 바람직하게는 숲모기류(Aedes) 또는 학질모기류(Anopheles)를 포함한다.
본 발명에서는 프로스타글란딘이 모기류 알발육에 필수적인 신호물질인 것을 확인하고 아스피린이 알발육에 필수적인 신호물질인 프로스타글란딘의 생합성을 억제하여 모기 알껍질을 형성하는 유전자들의 발현을 억제함으로써 모기류의 알발육을 저해하는 효과를 가지는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 아스피린을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인체에 유해한 질병을 매개하는 모기류에 섭식 등의 방법으로 처리하면 산란수가 감소하고 산란된 알의 생존력이 낮아지므로 모기류의 방제에 유효하게 사용할 수 있으며, 모기류를 방제함으로써 이러한 모기류에 의해 매개되는 질병을 예방할 수 있다.
도 1은 흰줄숲모기 암컷의 난모세포 발달과정을 나타낸 것이다.
도 2는 흰줄숲모기의 알발육에 대한 에이코사노이드 생합성 저해제의 효과 및 프로스타글란딘의 구제효과를 확인한 결과이다.
도 3은 흰줄숲모기의 알발육에 대한 아스피린의 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 흰줄숲모기의 외난각단백질형성과 관련된 옐로우 유전자의 발현에 대한 아스피린의 저해효과를 확인한 결과이다.
도 5는 학질모기의 알발육에 대한 아스피린의 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 흰줄숲모기 PGE2 수용체의 분자적 특성을 나타낸 것이다.
도 7은 흰줄숲모기의 PGE2 수용체의 발현을 분석한 결과이다.
도 8은 흰줄숲모기의 알발육에서 Aa-PGE2R의 RNA 간섭(RNAi) 효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 아스피린을 유효성분으로 포함하는 모기류 억제용 조성물 및 이러한 조성물을 이용하여 모기를 방제하는 방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 조성물은 인체질환을 매개하는 대표적인 모기류인 숲모기류(Aedes)와 학질모기류(Anopheles)를 포함하여 다양한 모기류를 대상으로 한다.
본 발명의 실시예에서는 아스피린을 포함하는 본 발명의 조성물을 모기류 암컷에 투여하여 알발육을 억제하는 것을 확인하였다. 아스피린을 모기류에 투여하면 산란수가 감소하고 산란된 알의 생존력이 낮아진다.
아스피린의 알발육 억제효과는 알발육에 필수적인 신호물질인 프로스타글란딘의 생합성을 억제하여 모기 알껍질을 형성하는 유전자들의 발현을 억제함으로써 생기는 것으로 확인된다. 즉, 아스피린을 주입하거나 섭식시킨 후 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 첨가하면 아스피린의 알발육 억제효과가 감소하는 것으로 보아 아스피린이 프로스타글란딘의 생합성을 억제하여 모기의 알발육을 억제하는 것으로 확인된다.
본 발명에서는 상기 조성물을 모기류에 투여하여 모기류를 방제한다.
따라서 본 발명의 아스피린을 유효성분으로 포함하는 조성물을 인체에 유해한 질병을 매개하는 모기류에 처리하면 산란수가 감소하고 산란된 알의 생존력이 낮아지므로 모기류의 방제에 유효하게 사용할 수 있으며, 모기류를 방제함으로써 이러한 모기류에 의해 매개되는 질병을 예방할 수 있다.
본 조성물을 모기류에 처리하는 방법은, 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 먹이에 처리할 수 있다. 모기류의 먹이에 처리할 경우 아스피린을 기준으로 10ppm 이상으로 처리한다. 모기 성충을 대상으로 이들 먹이에 10 ppm 이상의 아스피린을 처리할 경우 암컷의 알발육을 억제하게 된다. 바람직하게는 모기류의 먹이에 아스피린을 기준으로 10~10,000 ppm으로 처리한다. 특히 바람직하게는 암컷 성충이 우화하여 흡혈하기 전까지의 시기에 10~10,000 ppm으로 아스피린을 먹이에 처리한다. 그러나 처리 농도는 모기 종류 및 집단 특성에 따라 달라질 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실험예]
공시충
공시충으로는 흰줄숲모기(Aedes albopictus)와 말라리아 매개 학질모기(Anopheles gambiae)를 사용하였다.
경북대학교 김동흔 교수로부터 분양받은 실내 누대 사육된 흰줄숲모기는 실내조건{27℃, 70±10% 상대습도, 12:12h(L:D) 광주기}에서 사육하였다. 유충은 0.5~1ℓ의 증류수가 담긴 사육용기(12×8×5cm)에 넣고 물고기 조각(Ilsung, Daegu, Korea)을 먹이로 제공하였다. 성충에게는 솜뭉치에 흡수된 10% 설탕물을 먹이로 제공하였다. 우화(post-adult emergence: PE)하고 4~5일 경과된 암컷은 마우스(SLC, Shizuoka, Japan)를 이용하여 주당 2회 혈액섭취(blood feeding: BF)를 하도록 하였다. 각 혈액섭취는 오후 2~6시 사이에 1시간 동안 진행되었다. 젖은 종이타월을 물이 채워진 페트리디쉬(직경 9cm)에 담가 산란을 유도하였다.
학질모기(Anopheles gambiae, Keele strain)는 실내조건{27℃, 80% 상대습도, 14:10h (L:D) 광주기}에서 사육하였다. 유충에게는 물고기 조각(Tetra, Blacksburg, VA, USA)을 먹이로 제공하고, 성충에게는 10% 설탕물을 먹이로 제공하였다.
공시화합물
아스피린(ASP), 데사메타손(examethasone, DEX; (11β,16a)-9-fluoro-11,17,21-trihydroxy-16-methylpregna-1,4-diene-3), 이부프로펜(ibuprofen, IBU; α-methyl-4-isobutyl phenylacetic acid), 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2; 5Z,11a,13E,15S-11,15-dihydroxy-9-oxoprosta-5,13-dienoic acid), 나프록센(naproxen, NAP; 6-methoxy-α-methyl-2-naphthaleneacetic acid), 류코트리엔 B4(leukotriene B4, LTB4); 5,12-dihydroxy-6,8,10,14-eicosatetraenoic acid) 및 14,15-EET(14,15-epoxyeicosatrienoic acid)를 Sigma-Aldrich Korea(Seoul, Korea)에서 구매하여 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 실험에 사용하였다.
혈강주입방법
혈액섭취하기 10분 전 처리 암컷을 이산화탄소로 마취시키고 1㎕의 공시약제를 모기의 혈강에 주입하였다. 이때 피코펌프(PV830, World Precision Instrument, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 유리 모세관(10㎕ quartz, World Precision Instrument)의 끝을 <20㎛의 직경으로 날카롭게 하여 모기 혈강 주입에 이용하였다. 아스피린에 의해 억제된 알발육을 구제하기 위하여, 아스피린을 처리하고 12시간 경과한 후 1㎕의 PGE2, 14,15-EET 또는 LTB4 10㎍을 주입하였다. 처리된 암컷은 혈액섭취를 시켰고 이후 3일이 경과하면 난소를 적출하여 알발육을 분석하였다. 각 처리는 10마리의 암컷으로 반복하였다.
약제 섭식방법
상이한 농도의 아스피린을 10% 설탕물에 녹여 성충의 먹이로 제공하였다. 흰줄숲모기의 경우 혈액섭취 3시간 전에 아스피린이 처리된 설탕물 5㎖를 10마리의 성충이 들어 있는 상자에 제공하였다. 혈액섭취 후 암컷에 아스피린 처리된 설탕물을 3일 동안 추가로 섭식시키고 이후 난소를 적출하였다. 학질모기의 경우 새로 우화된 성충을 대상으로 3일 동안 아스피린을 처리하였다. 이후 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스의 혈액을 섭취하도록 하고 추가로 설탕물만 72시간 동안 섭식하도록 한 후 알발육 분석에 사용하였다.
통계처리
표준편차 막대 위의 다른 문자들은 Type I error = 0.05에서 평균들 사이의 유의성있는 차이를 나타내고, 표준편차 막대 위의 별표는 Type I error = 0.05에서 평균들 사이의 유의성있는 차이를 나타낸다(LSD test).
<실험예 1>
모기류의 알발육(난형성) 분석
흰줄숲모기 암컷을 사용하여 모기류의 알발육(난형성)을 분석하였다.
흰줄숲모기 암컷의 난소를 적출하고 얻어진 난소소관을 대상으로 난모세포(oocyte)를 알껍질의 형성 유무에 따라 난황축적(VT) 상태와 난각형성(CH) 상태로 나누었다. 난모세포의 발육정도는 형광분석기술로 진행하였다. 적출된 난소를 3.7% 파라포름알데하이드로 60분 동안 고정하고, 다시 0.2% Troton X-100으로 세포막을 투과처리를 하고, 5% 탈지분유(MB cell, Seoul, Korea)로 60분 동안 처리하였다. 이후 FITC가 연결된 팔로이딘(FITC-tagged phalloidin)을 1시간 동안 처리하였다. 추가로 핵 염색을 위해 DAPI(1mg/㎖)를 2분 동안 처리하였다. 이렇게 처리된 난모세포는 형광현미경(DM2500, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 200배의 배율에서 확인하였다.
이와 같이 확인한 흰줄숲모기 암컷의 난모세포 발달과정을 도 1에 나타내었다.
도 1의 (A)는 난모세포의 3가지 발달단계를 나타낸 것이다. 난모세포를 FITC가 연결된 팔로이딘(green)과 DAPI(blue)로 염색하여 위상차(differential interference contrast, DIC)로 관찰한 결과, 알발육(PV) 단계, 난황축적(VT) 단계 및 난각형성(CH) 단계에서 난소들이 관찰되었다. 갓 우화한 암컷 성충은 알발육(PV) 상태의 난모세포를 보였고, 난포(Follicles, F)는 알발육(PV) 단계에서 관찰되었다. 난포에는 여러 개의 핵이 관찰되어 이들 내부에서 세포분열이 일어나고 있는 것을 알 수 있다. 난황형성(VT) 단계에서, 난모세포(oocyte, OC)와 영양세포(nurse cell, NC)는 포린 피막(follicular epithelium, FE)으로 둘러싸여 있다. 난각형성(CH) 단계에서, 난모세포는 장막(chorion, CO)으로 둘러싸여 있다.
도 1의 (B)는 성체발생 후(post-adult emergence, PE) 또는 혈액섭취 후(post-blood feeding, PBF) 난소들에서 난포 성장(follicle growth)을 나타낸 것이다. 혈액섭취 이후에는 난모세포의 난황축적(VT)이 일어나고 크기 성장도 급격히 일어나 혈액을 섭취하고 24시간이 지나면 일부 난모세포는 알껍질에 둘러싸이는 난각형성(CH)형의 난모세포로 나타나기 시작했다. 혈액을 섭취하고 3일이 경과되면 대부분이 난각형성(CH)형의 난모세포가 되었다.
도 1의 (C)는 난모세포의 발달을 나타낸 것이다. 혈액섭취 후 96시간 이내에 선택한 3시점에서 입체현미경(stereomicroscope) 하에서 총 난황축적(VT) 난모세포와 난각형성(CH) 난모세포를 계산하였다. 각 처리에서, 난포 성장과 난모세포 발달에 10마리의 암컷을 사용하였다. 도 1의 (C)에서 확인되는 바와 같이 암컷 마리당 난황축적(VT) 난모세포수는 혈액을 섭취한 후 48시간까지는 증가하다가 그 이후 감소하였다. 그러나, 난각형성(CH) 난모세포수는 혈액섭취 24시간 후부터 증가하기 시작하여 72시간까지 증가하다가 그 이후 감소하였다.
<실험예 2>
흰줄숲모기 알발육에 대한 에이코사노이드 생합성 저해제의 효과 및 프로스타글란딘의 구제효과
흰줄숲모기의 알발육에 대한 에이코사노이드 생합성 저해제(eicosanoid biosynthesis inhibitors)의 효과를 확인하였다.
에이코사노이드 생합성 저해제로는 PLA2 저해제인 덱사메타손(dexamethasone: DEX), COX 저해제인 이부프로펜(ibuprofen: IBU)과 아스피린(aspirin: ASP) 및 LOX 저해제인 나프록센(naproxen: NAP)을 사용하였다. 5일된 암컷에 혈액섭취(BF) 하기 10분 전에 덱사메타손, 이부프로펜, 아스피린 및 나프록센을 1mg/개체의 투여량으로 주입하였다. 저해제를 용해시키는데 사용한 디메틸술폭사이드(dimethylsulfoxide)를 대조구(CON)로 주입하였다. 각 처리는 10마리의 암컷을 사용하였다. 각 저해제를 처리하였을 때, 혈액섭취(BF)를 하고 72시간 후 암컷당 난각형성된 난모세포의 수를 확인한 결과를 도 2의 (A)에 나타내었다.
도 2의 (A)에서와 같이, PLA2 저해제인 덱사메타손(DEX), COX 저해제인 이부프로펜(IBU) 및 아스피린(ASP)을 처리하였을 때 알발육이 억제되었으며, 아스피린을 처리하였을 때 알발육 억제효과가 가장 높았다. 그러나 LOX 저해제인 나프록센(NAP)은 알발육에 영향을 주지 않았다.
도 2의 (B)는 암컷에 아스피린(1mg/개체)을 처리하고 12시간이 경과한 후 PGE2(10mg/개체)를 처리했을 때 암컷의 난각형성(CH)에서의 PGE2의 구제효과(rescue effect)를 나타낸 것이다. 혈액섭취(BF) 후 48시간과 72시간에 난소를 관찰하였으며, 아스피린을 처리하면 알발육이 일어나지 않지만, 다시 PGE2를 처리하면 알발육이 일어나는 것을 알 수 있다.
도 2의 (C)는 아스피린으로 처리된 암컷의 알발육에 대한 PGE2의 특이적 구제효과를 나타낸 것이다. 아스피린은 1㎍/개체의 투여량으로 주입하고, 아스피린으로 처리된 암컷에 10㎍/개체의 투여량으로 PGE2, 14,15-EET 또는 LTB4를 주입하였다. 혈액섭취(BF) 후, 각 반복실험에서 3마리의 암컷을 한마리의 수컷과 짝짓기하였다. 각 처리는 3회 반복하였다. 혈액섭취(BF) 후 6일 동안 낳은 알의 수를 세었다. PGE2를 처리하였을 때 알발육이 회복되는 것이 산란수로 확인되었으나, 다른 에이코사노이드인 EET 또는 LT를 처리하였을 때에는 이러한 구제효과가 나타나지 않았다.
도 2의 (D)는 1㎍/개체의 아스피린이 처리된 암컷이 낳은 알의 부화율 감소와 10㎍/개체의 PGE2를 첨가하였을 때 나타나는 구제효과를 나타낸 것이다. 각 반복실험에서 100개의 알을 사용하였고, 각 처리는 3회 반복하였다. 아스피린을 처리하였을 때 알의 부화율이 감소하였고, PGE2를 첨가하였때 부화율이 다시 증가한 것을 확인할 수 있다.
이와 같이, 암컷에 에이코사노이드 생합성 저해제를 처리하고 혈액을 섭취시킨 후 차세대 알 부화율을 분석하였을 때 덱사메타손(DEX), 이부프로펜(IBU) 및 아스피린(ASP)을 처리하였을 때 알발육이 감소한 것이 확인되었고, 이들을 처리한 후 PGE2(10㎍/개체)를 첨가하였을 때 알발육 억제에 대한 구제효과가 있는 것이 확인되었다.
이러한 결과로부터, 모기의 알발육에 프로스타글란딘이 관여하고 아스피린이 모기의 알발육을 저해하는 것을 확인할 수 있다.
<실험예 3>
흰줄숲모기의 알발육에 대한 아스피린의 효과
흰줄숲모기의 알발육에 대한 아스피린(ASP)의 억제효과를 상이한 농도의 아스피린으로 분석하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 (A)는 혈액낭 주입(Hemocoelic injection)을 한 경우이다. 혈액섭취(BF)하기 10분 전에 5일된 암컷에 아스피린을 주입하였다. 혈액섭취(BF)하고 72시간 후 처리된 암컷의 난소를 PBS에 모아 난각형성된 난모세포의 수를 세었다. 혈강에 주입하는 아스피린 처리 농도가 높아질수록 알발육 억제효과가 증가하는 것이 확인되었다.
도 3의 (B)는 경구섭식한 경우이다. 다른 농도의 아스피린을 10% 설탕물로 제조하였다. 설탕-아스피린 용액(5㎖)을 혈액섭취(BF)하기 3시간 전에 10마리의 암컷이 있는 성충 케이지에 제공하였다. 혈액섭취(BF) 후, 암컷에 3일 동안 지속적으로 설탕-아스피린 용액을 공급하고, 난각형성된 난모세포의 발달을 평가하였다. 아스피린의 알발육 억제효과는 성충의 먹이에 혼합하여 섭식처리하여도 나타났으며 이러한 결과는 처리 농도에 비례하였다.
<실험예 4>
옐로우 유전자의 발현분석
아스피린을 처리하였을 때 외난각단백질 형성(exochorion formation)과 관련된 옐로우 유전자(Yellow gene; Yellow-g and Yellow-g2)의 발현에 대한 아스피린(ASP)의 저해효과를 1㎍/㎕의 아스피린을 처리한 암컷을 사용하여 확인하였다. Yellow-g와 Yellow-g2 유전자는 흰줄숲모기의 외난각단백질의 경화에 관여하는 것으로 알려졌다(Noh et al., 2020).
모든 처리는 독립적으로 3회 반복하였으며, 유전자를 분석한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 (A)는 아스피린 처리된 암컷이 낳은 알의 기형인 난각단백질을 나타낸 SEM 사진이다. 알은 산란 후 48~72시간에 모아 SEM 이미지화에 사용하였으며, 암컷이 산란한 알이 붕괴되는 모습이 확인되었다.
도 4의 (B)는 Yellow-g(left panel)와 Yellow-g2(right panel) 유전자의 RT-qPCR 결과를 나타낸 그래프이다. 아스피린이 처리된 암컷의 경우 이들 두 유전자의 유전자 발현이 크게 둔화된 것을 확인할 수 있다.
<실험예 5>
학질모기 알발육에 대한 아스피린 효과
학질모기(An. gambiae)의 알발육에 대한 아스피린 섭식의 효과를 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 데이터는 GraphPad Prism 6.0을 이용한 Mann-Whitney 테스트로 분석하였다. 실험은 독립적으로 3회 반복하여 실시하였으며, 3회의 평균±SE로 나타내었다.
도 5의 결과에서와 같이, 아스피린의 모기 알발육에 대한 억제효과가 학질모기(An. gambiae)에서도 나타났다.
도 5의 (A)는 혈액섭취(BF) 72시간 후에 아스피린(10,000ppm) 또는 10% 설탕물(대조구)을 섭식한 모기의 절개한 난소이다. 스케일 바는 1mm를 나타낸다. 아스피린을 섭식한 모기의 난소가 작아진 것을 확인할 수 있다.
도 5의 (B)는 10% 설탕물 대조구와 비교하였을 때 아스피린을 섭식하였을 때 난각형성된 난모세포의 발달이 상당히 제한된 것을 보여준다.
도 5의 (C)는 아스피린 섭식이 모기의 번식력을 손상시켜 혈액섭취(BF) 144시간 후에 낳은 알의 수가 감소한 것을 보여준다.
도 5의 (D)는 혈액섭취 144시간 후에 아스피린을 섭식하였을 때 유충 부화율이 상당히 감소한 것을 보여준다.
이와 같이, 혈액섭취 전 학질모기 암컷에 10,000ppm의 아스피린을 처리한 경우 난모세포의 크기가 감소하고, 산란수와 부화율이 크게 감소하였다.
<실험예 6>
흰줄숲모기 PGE 2 수용체의 분자적 특성
아스피린 및 이부프로펜에 대한 모기류 알발육이 억제되는 것은 이러한 생식과정에 프로스타글란딘(PG)이 관여한다는 것을 의미한다. PGE2에 의하여 저해제에 대한 구제효과가 나타난다는 것은 PGE2 및 이 호르몬 세포내 신호가 난모세포에서 일어나는 것을 의미한다. 이를 확인하기 위하여, 흰줄숲모기에서 PGE2 수용체(Aa-PGE2R: GenBank accession number: XP_029736412.1)의 분자적 특성을 확인하여 도 6에 나타내었다.
도 6의 (A)는 PGE2 수용체의 도메인을 분석한 결과이다. PGE2 수용체는 전형적인 GPCR의 구제를 지닌 세포막 수용체이다. 신호 펩타이드(signal peptide)의 절단부위(23잔기)를 가위로 표시하였고, 7개의 막횡단 도메인(transmembrane domains)은 위치에 따라 인지질 이중층에 표시하였다. N-글리코실레이션(N-glycosylation) 위치는 오렌지색 원으로 나타내고 인산화(phosphorylation) 위치는 파란색 삼각형으로 표시하였다.
도 6의 (B)는 PGE2 수용체를 기존에 알려진 프로스타글란딘(PG) 수용체들과 분자계통분석(phylogenetic analysis)한 결과이다. 소프트웨어 패키지 MEGA6.0을 사용한 최대공산 가계도법으로 가계도를 만들고, 푸아송 보정법을 사용하여 진화적 거리를 계산하였다. 단봉낙타(C. dromedarius)에 대한 KAB1277535.1 (DP2), 호모사피엔스(H. sapiens)에 대한 NP_000944.1 (DP2), 집쥐(R. norvegicus)에 대한 NP_071577.1 (DP2), 호로새(N. meleagris)에 대한 XP_021258611.1 (DP2), 호모사피엔스에 대한 AAI12966.1 (FP), 침팬지(P. troglodytes)에 대한 JAA36212.1 (FP), 물소(B. bubalis)에 대한 AAZ08074.1 (FP), 집쥐에 대한 EDL82480.1 (FP), 생쥐(M. musculus)에 대한 NP_032993.2 (IP), 소(B. Taurus)에 대한 NP_001015622.2 (IP), 집쥐에 대한 EDM08294.1 (IP), 초원들쥐(M. ochrogaster)에 대한 XP_005361096.1 (IP), 생쥐에 대한 NP_001345441.1 (TXA), 소에 대한 NP_001161391.1 (TXA), 침팬지에 대한 JAA33130.1 (TXA), 호모사피엔스에 대한 AAH74749.1 (TXA), 호모사피엔스에 대한 NP_000946.2 (EP1), 집쥐에 대한 NP_001265404.1 (EP1), 생쥐에 대한 NP_038669.1 (EP1), 소에 대한 NP_001179077.1 (EP1), 호모사피엔스에 대한 NP_000947.2 (EP2), 집쥐에 대한 NP_112350.1 (EP2), 생쥐에 대한 NP_032990.1 (EP2), 소에 대한 NP_777013.1 (EP2), 호모사피엔스에 대한 NP_942007.1 (EP3), 집쥐에 대한 NP_036836.1 (EP3), 생쥐에 대한 NP_001346674.1 (EP3), 소에 대한 NP_851375.1 (EP3), 호모사피엔스에 대한 NP_000949.1 (EP4), 집쥐에 대한 NP_114465.3 (EP4), 생쥐에 대한 NP_001129551.1 (EP4), 및 소에 대한 NP_777014.1 (EP4)의 자료번호(accession numbers)로 GenBank에서 다른 PGE2R의 아미노산 서열을 검색하였다.
그 결과, 흰줄숲모기의 PGE2 수용체는 EP4 계통으로 확인되었다.
<실험예 7>
흰줄숲모기의 PGE 2 수용체의 발현분석
흰줄숲모기의 PGE2 수용체의 발현을 분석하였다.
난각형성 유전자인 Aa-PGE2R를 대상으로 발현프로파일을 확인하고, 레퍼런스 유전자(reference gene)인 액틴(actin)의 발현을 RT-qPCR에서 유전자 발현수준을 정규화(normalize)하기 위하여 사용하였다.
RNA 추출 및 cDNA 제조는 공지의 방법(Al Baki and Kim, 2019)을 따랐다. 전사체 정량분석은 실시간 qPCR로 진행하였으며 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 각 주기 당 95℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 30초의 증폭조건으로 40회 반복 실시하였다.
유전자 프라이머 서열(5'-3') 어닐링
온도(℃)		 목적
Aa-PGE2R CCAACATGCACCACTTCT 57 RT-PCR
RT-qPCR
GGAACTGCCTTCGCATCT
TAATACGACTCACTATAGGGAGACCAACATGCACCACTTCT 57 RNAi
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAACTGCCTTCGCATCT
Actin GATCTGGCATCACACATTCTA 55 RT-PCR
RT-qPCR
CACGTTCAGTCAGGATCTTC
확인된 Aa-PGE2R의 발현 프로파일을 도 7에 나타내었다. 모든 처리는 독립적으로 3회 반복하였다. 표준편차 막대 위의 다른 문자들은 Type I error = 0.05에서 평균들 사이의 유의성있는 차이를 나타낸다(LSD test).
도 7의 (A)는 알에서 수컷 및 암컷 성충으로의 여러 발육태에서의 발현을 확인한 것으로 모든 발육태에서 이 유전자의 발현이 나타난 것을 확인할 수 있다.
도 7의 (B)는 혈액섭취(BF) 3일 후 흰줄숲모기의 여러 신체부위인 머리(HD), 가슴(thorax)(TH), 난소(OV) 및 복부(ABD)에서의 발현을 확인한 것이다. 성충에서는 난소에서 가장 크게 발현한 것을 알 수 있다.
도 7은 (C)는 혈액섭취 후 Aa-PGE2R의 발현수준과 난각형성된 난모세포의 수 사이의 관계를 나타낸 것이다. 난소의 경우 혈액섭취 이후 난모세포 발육과 비례하여 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있다.
<실험예 8>
흰줄숲모기 알발육에서의 RNA 간섭효과
흰줄숲모기의 알발육에서 PGE2 수용체인 Aa-PGE2R의 RNA 간섭(RNAi)효과를 확인하여 PGE2 수용체를 통한 PGE2 신호가 알발육에 관여하는지를 분석하였다.
이중가닥 RNA(Double strand RNA, dsRNA)의 제조 및 주입기술은 기존(Al Baki and Kim, 2019)의 연구방법을 따랐다.
혈액섭취(BF) 10분 전에 5일된 흰줄숲모기 암컷에게 1㎍의 Aa-PGE2R 유전자-특이적 dsRNA (dsPGE2R) 또는 대조구 dsRNA (dsCON)를 주입하여 RNAi를 실시하였다. dsPGE2R 또는 dsCON을 주입하고 72시간 후에 표적 유전자의 발현수준을 정규화하기 위한 레퍼런스 유전자로 액틴을 사용한 RT-qPCR으로 mRNA 수준의 변화를 평가하였다. 각 처리는 3회 반복하였다.
dsRNA를 주입하고 12시간 후 1㎕의 PGE2 (암컷당 10mg)를 RNAi-처리된 흰줄숲모기 성충에 주입하였다. 혈액섭취 72시간 후에 난각형성된 난모세포의 총 수를 입체현미경 하에서 세었다. 각 처리에는 10마리의 암컷을 사용하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다.
Aa-PGE2R에 대한 RNA 간섭효과를 확인한 결과를 도 8의 (A)에 나타내었다. 도 8의 (A)에서 dsPGE2R을 주입하였을 때 Aa-PGE2R 유전자의 발현이 감소된 것을 확인할 수 있다.
난각형성에 대한 RNAi의 영향을 확인한 결과를 도 8의 (B)에 나타내었다. 도 8의 (B)에서 알 수 있듯이, 이렇게 처리된 암컷의 경우 알발육이 억제되었고, PGE2를 처리하여도 이러한 억제현상은 구제되지 않았다.

Claims (8)

  1. 아스피린을 유효성분으로 포함하는 모기류 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 모기류는 숲모기류(Aedes) 또는 학질모기류(Anopheles)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 모기류 억제용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 아스피린을 모기류의 알발육을 억제하는 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 모기류 억제용 조성물.
  4. 모기류의 알발육을 억제하는 유효량으로 아스피린을 처리하는 것을 포함하는 모기류 방제방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 모기류는 숲모기류(Aedes) 또는 학질모기류(Anopheles)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 모기류 방제방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 아스피린이 모기류의 알껍질을 형성하는 유전자의 발현을 억제하는 것을 포함하는, 모기류 방제방법.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 아스피린은 모기류 성충의 먹이에 10~10,000ppm의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는, 모기류 방제방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 아스피린은 모기류의 암컷 성충이 우화하여 흡혈하기 전까지의 시기에 성충의 먹이에 처리되는 것을 특징으로 하는, 모기류 방제방법.
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