KR102431839B1 - Composition for wound treatment or tissue regeneration comprising a mixture of poloxamer, hyaluronic acid, and extracellular matrix and use thereof - Google Patents

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Abstract

본 출원은 폴록사머, 히알루론산, 및 탈세포화된 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)의 혼합물을 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 상처 부위에 안정적으로 고정되어 외부환경으로부터 보호하고, 습윤 환경을 조성 및 유지할 수 있는 것은 물론, 세포외기질의 전달을 증가시켜 상처 치료, 조직 재생 등에 있어서 우수한 창상 회복 효과를 나타낼 수 있다.The present application relates to a composition for wound treatment or tissue regeneration comprising a mixture of poloxamer, hyaluronic acid, and decellularized extracellular matrix (ECM). The composition is stably fixed to the wound site to protect it from the external environment, and can create and maintain a wet environment, as well as increase the delivery of the extracellular matrix, thereby exhibiting an excellent wound recovery effect in wound healing, tissue regeneration, etc.

Description

폴록사머, 히알루론산, 및 탈세포화된 세포외기질의 혼합물을 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물 및 이의 용도 {Composition for wound treatment or tissue regeneration comprising a mixture of poloxamer, hyaluronic acid, and extracellular matrix and use thereof}Composition for wound treatment or tissue regeneration comprising a mixture of poloxamer, hyaluronic acid, and extracellular matrix and use thereof }

폴록사머, 히알루론산, 및 탈세포화된 세포외기질의 혼합물을 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.It relates to a composition for wound healing or tissue regeneration comprising a mixture of poloxamer, hyaluronic acid, and decellularized extracellular matrix, and use thereof.

창상 치료에 있어서 사용되는 재료는 상처 부위에 고정될 수 있는 기계적 물성, 상처와의 접촉면에서 적당한 습기의 유지 능력, 상처 분비물의 조절 능력, 및 인체에 대한 무독성이 요구되며, 2차 감염률 (secondary infection rate)이 낮고 제조 및 저장이 용이하고, 체외에서 쉽게 조작 및 이용할 수 있어야 하며, 활성물질의 전달이 용이하여야 한다. Materials used in wound treatment require mechanical properties that can be fixed on the wound site, the ability to maintain adequate moisture on the contact surface with the wound, the ability to control wound secretions, and non-toxicity to the human body, and have a secondary infection rate (secondary infection). rate), easy to manufacture and store, easy to manipulate and use in vitro, and easy to deliver active substances.

한편, 하이드로겔 (hydrogel)은 물 또는 체액 내에서 가교된 격자 안으로 많은 양의 물 또는 체액을 흡수하여 팽윤되며, 물속에서도 흩어지지 않고 삼차원 구조를 유지하는 재료를 의미한다. 팽윤된 이후에도, 열역학적으로 안정하게 존재하여 액체와 고체의 중간 형태에 해당하는 기계적 및 물리화학적 특성을 갖는다. 이러한 하이드로겔은 대개 우수한 생체 적합성, 높은 다공성 및 산소 투과도를 보이며, 생체 연조직과 비슷한 물리적 특성을 나타내고 인체에 안전하여, 습윤 창상 치유 (moist wound healing)를 비롯하여 조직 재생분야, 약물전달분야 등 다양한 분야에 사용되고 있다. 대한민국 등록특허 제 2083002 호는 프로바이오틱스를 함유하는 하이드로겔/하이드로콜로이드 이중층 습윤드레싱제의 창상 및 화상 등의 상처 치료 효과에 대하여 개시하고 있다.On the other hand, a hydrogel refers to a material that absorbs a large amount of water or body fluid into a crosslinked lattice in water or body fluid and swells, and maintains a three-dimensional structure without dispersing in water. Even after swelling, it is thermodynamically stable and has mechanical and physicochemical properties corresponding to an intermediate form between liquid and solid. These hydrogels usually show excellent biocompatibility, high porosity, and oxygen permeability, exhibit physical properties similar to those of living soft tissues, and are safe for the human body, so that in various fields such as moist wound healing, tissue regeneration, drug delivery, etc. is being used in Korean Patent Registration No. 2083002 discloses the effect of a hydrogel/hydrocolloid double-layer wet dressing containing probiotics for treating wounds and burns.

다만, 기존의 일반적인 하이드로겔 제제는 제한적인 물리적 특성으로 인해 체내에 적용하기 위해서는 외과적 수술이 요구되고, 창상 또는 상처 부위와 같은 피부에 적용하는 경우에도, 하이드로겔 제제의 제조, 보관, 체외에서 조작 등에 있어서 용이하지 않다는 문제점이 있다. 또한, 활성물질을 하이드로겔에 적용하는데 제약이 따르며, 하이드로겔에 적용된 활성물질이라도, 고 분자량의 활성물질 (단백질, 유전자)은 하이드로겔 상 (phase)에서 분포되는데 확산의 제한성을 가지므로, 활성물질의 전달에 있어서 한계가 있다는 문제점이 있다.However, conventional general hydrogel formulations require surgical operation to be applied to the body due to limited physical properties, and even when applied to the skin such as wounds or wounds, the preparation, storage, and in vitro use of the hydrogel formulation There is a problem that it is not easy in operation and the like. In addition, there are restrictions in applying the active material to the hydrogel, and even if the active material is applied to the hydrogel, the active material (protein, gene) of high molecular weight is distributed in the hydrogel phase, and since it has a limitation of diffusion, the active material There is a problem that there is a limit in the delivery of substances.

이런 배경 하에서, 본 발명자들은 하이드로겔 제제를 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물로서, 활성물질의 적용, 제조, 보관, 체외에서 조작 등의 경우에는 용액 상태로 존재하다가, 피부의 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 그 부위에서 고정되어 습윤 환경을 조성 및 유지할 수 있는 것은 물론이고, 포함된 활성물질의 피부 전달을 증가시킬 수 있는 제형, 즉 연고 형태로 젤화 (gelation)될 수 있는 조성물을 개발하였다. 또한, 탈세포화된 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)이 혼합된 상기 조성물의 우수한 창상 회복 효과를 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.Under this background, the present inventors have developed a composition for wound treatment or tissue regeneration comprising a hydrogel formulation, which exists in a solution state in the case of application, preparation, storage, and in vitro manipulation of the active substance, and then on the skin wound or wound site. When applied to a formulation that can be fixed at the site to create and maintain a wet environment, as well as increase the skin delivery of the included active material, a composition that can be gelled in the form of an ointment has been developed. . In addition, by confirming the excellent wound recovery effect of the composition mixed with decellularized extracellular matrix (ECM), the present application was completed.

일 양상은 폴록사머 (poloxamer), 히알루론산 (hyaluronic acid), 및 탈세포화된 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)의 혼합물을 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물로서, 상기 조성물은 32℃ 내지 40℃의 주위 온도에서, 45 내지 80 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖는 것인, 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.One aspect is a composition for wound treatment or tissue regeneration comprising a mixture of poloxamer, hyaluronic acid, and decellularized extracellular matrix (ECM), wherein the composition is 32° C. to 40 It is to provide a composition for wound treatment or tissue regeneration, which will have a viscosity of 45 to 80 Pascal seconds (Pa·s) at an ambient temperature of °C.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.Other objects and advantages of the present application will become more apparent from the following detailed description in conjunction with the appended claims and drawings. Content not described in this specification will be omitted because it can be sufficiently recognized and inferred by those skilled in the technical field or similar technical field of the present application.

본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.Each description and embodiment disclosed in this application may also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed in this application fall within the scope of this application. In addition, it cannot be seen that the scope of the present application is limited by the specific descriptions described below.

일 양상은 폴록사머, 히알루론산, 및 탈세포화된 세포외기질의 혼합물을 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물로서, 상기 조성물은 32℃ 내지 40℃의 주위 온도에서, 45 내지 80 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖는 것인, 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.One aspect is a composition for wound healing or tissue regeneration comprising a mixture of poloxamer, hyaluronic acid, and decellularized extracellular matrix, wherein the composition is at an ambient temperature of 32°C to 40°C, 45 to 80 Pascal seconds (Pa· It is to provide a composition for wound treatment or tissue regeneration, which has a viscosity of s).

본 명세서의 용어, "폴록사머 (poloxamer)"는 Poly (oxyethylene)-poly (oxypropylene)-poly (oxyethylene) [POE-POP-POE]의 중합체를 의미한다. 상기 폴록사머는 하이드로겔 재료 중 하나로서, 폴록사머 용액은 낮은 온도에서는 액상의 하이드로겔 전구체 용액 상태로 존재할 수 있고, 온도가 올라가면 점도가 증가하여 젤 상태의 하이드로겔 상태로 존재할 수 있다. 즉, 상기 폴록사머는 온도감응성 졸 (sol) - 젤 (gel) 상 전이의 성질을 나타낼 수 있다.As used herein, the term “poloxamer” refers to a polymer of Poly (oxyethylene)-poly (oxypropylene)-poly (oxyethylene) [POE-POP-POE]. The poloxamer is one of the hydrogel materials, and the poloxamer solution may exist as a liquid hydrogel precursor solution at a low temperature, and as the temperature increases, the viscosity may increase to exist as a gel-like hydrogel. That is, the poloxamer may exhibit a property of temperature-sensitive sol-gel phase transition.

본 명세서의 용어, "졸 (sol)"은 액체 내에 고체 입자가 분산되어 있는 것이며, "젤 (gel)"은 졸을 가열 또는 냉각했을 때 고체 또는 반고체 상태의 일정한 형태를 갖춘 것을 의미할 수 있다.As used herein, the term "sol" refers to solid particles dispersed in a liquid, and "gel" may mean that the sol has a certain shape in a solid or semi-solid state when heated or cooled. .

본 명세서의 용어, "하이드로겔 (hydrogel)"은 수용성 고분자가 물리적 (수소결합, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용, 혹은 고분자의 결정) 혹은 화학적 (공유결합)인 결합으로 3차원의 가교를 형성하고 있는 망상 구조를 유지하는 재료를 의미한다. 상기 하이드로겔은 물 또는 체액 내에서 가교된 격자 안으로 많은 양의 물 또는 체액을 흡수하여 팽윤되며, 물속에서도 흩어지지 않고 삼차원 구조를 유지할 수 있다. 따라서, 상기 하이드로겔은 팽윤된 이후에도, 열역학적으로 안정하게 존재하여 액체와 고체의 중간 형태에 해당하는 기계적 및 물리화학적 특성을 가질 수 있다.As used herein, the term "hydrogel" refers to a three-dimensional cross-linking of a water-soluble polymer by a physical (hydrogen bond, van der Waals force, hydrophobic interaction, or polymer crystal) or chemical (covalent bond) bond. It refers to the material that maintains the network structure. The hydrogel is swelled by absorbing a large amount of water or body fluid into a crosslinked lattice in water or body fluid, and can maintain a three-dimensional structure without dispersing in water. Therefore, even after swelling, the hydrogel may be thermodynamically stable and have mechanical and physicochemical properties corresponding to an intermediate form between a liquid and a solid.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상기 폴록사머를 15 중량% 내지 25 중량% 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상기 폴록사머를 15 중량% 내지 17 중량%, 15 중량% 내지 19 중량%, 15 중량% 내지 21 중량%, 15 중량% 내지 23 중량%, 17 중량% 내지 19 중량%, 17 중량% 내지 21 중량%, 17 중량% 내지 23 중량%, 17 중량% 내지 25 중량%, 19 중량% 내지 21 중량%, 19 중량% 내지 23 중량%, 19 중량% 내지 25 중량%, 21 중량% 내지 23 중량%, 21 중량% 내지 25 중량%, 또는 23 중량% 내지 25 중량% 포함하는 것일 수 있다. 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물이 상기 폴록사머를 15 중량% 미만 또는 25 중량% 초과 포함하는 경우, 상기 조성물의 32℃ 내지 40℃의 주위 온도에서의 점도가 변경될 수 있고, 상처 또는 창상 부위에 적용 시, 사용상의 불편을 초래하거나, 상처 치료 또는 조직 재생 효과, 또는 창상 회복 효과가 감소될 수 있다.The composition for wound treatment or tissue regeneration may include 15% to 25% by weight of the poloxamer. Specifically, the composition for wound treatment or tissue regeneration comprises 15 wt% to 17 wt%, 15 wt% to 19 wt%, 15 wt% to 21 wt%, 15 wt% to 23 wt%, 17 wt% of the poloxamer % to 19 wt%, 17 wt% to 21 wt%, 17 wt% to 23 wt%, 17 wt% to 25 wt%, 19 wt% to 21 wt%, 19 wt% to 23 wt%, 19 wt% to 25 wt%, 21 wt% to 23 wt%, 21 wt% to 25 wt%, or 23 wt% to 25 wt% may be included. When the composition for wound treatment or tissue regeneration contains less than 15% by weight or more than 25% by weight of the poloxamer, the viscosity at an ambient temperature of 32°C to 40°C of the composition may be changed, and the wound or wound site When applied to the skin, it may cause inconvenience in use, reduce the effect of wound healing or tissue regeneration, or reduce the effect of wound healing.

상기 폴록사머는 플루로닉 F127 (Pluronic F-127), 플루로닉 P123 (Pluronic P123), 및 플루로닉 L44 (Pluronic L44)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.The poloxamer may be at least one selected from the group consisting of pluronic F127 (Pluronic F-127), pluronic P123 (Pluronic P123), and pluronic L44 (Pluronic L44).

일 구체예에서, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물에 포함된 폴록사머는 플루로닉 F127일 수 있다. 상기 플루로닉 F127은 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO)-폴리에틸렌옥사이드(PEO)로 이루어진 공중합체로서 (분자량 12,600), PEO:PPO:PEO의 조성비가 98:68:98인 고분자일 수 있다. 또한 상기 플루로닉 F127은 무독성이며 온도에 따라 졸-젤 변화의 특징을 가지는 것일 수 있다. 따라서, 상기 플루로닉 F127에 의해, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 온도감응성 졸 - 젤 상 전이의 성질을 나타낼 수 있다.In one embodiment, the poloxamer included in the composition for wound treatment or tissue regeneration may be Pluronic F127. The Pluronic F127 is a copolymer consisting of polyethylene oxide (PEO)-polypropylene oxide (PPO)-polyethylene oxide (PEO) (molecular weight 12,600), and the composition ratio of PEO:PPO:PEO is 98:68:98. can In addition, the Pluronic F127 is non-toxic and may have a characteristic of a sol-gel change depending on the temperature. Therefore, by the Pluronic F127, the composition for wound treatment or tissue regeneration may exhibit the property of temperature-sensitive sol-gel phase transition.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상기 폴록사머와 히알루론산 및 탈세포화된 세포외기질이 혼합된 혼합물을 포함할 수 있다. The composition for wound treatment or tissue regeneration may include a mixture of the poloxamer, hyaluronic acid, and decellularized extracellular matrix.

본 명세서의 용어, "점도 (viscosity)"는 유체의 흐름에서 어려움의 크기를 나타내는 양 즉, 유체가 유동하는 경우의 내부 저항의 크기를 의미한다. 구체적으로, 끈적거림의 정도를 표시하는 것으로서 유체가 유동하고 있을 때, 인접하는 유체층간에 작용하는 단위 넓이당의 전단력은 그 위치의 속도 구배에 비례하며, 이 비례 정수를 점도라고 한다. 점도의 일반적인 단위는 kg/m·s 또는 Pa·s 등이 있다.As used herein, the term “viscosity” refers to a quantity indicating the magnitude of difficulty in the flow of a fluid, that is, the magnitude of internal resistance when the fluid flows. Specifically, as an indication of the degree of stickiness, when a fluid is flowing, the shear force per unit area acting between adjacent fluid layers is proportional to the velocity gradient at the location, and this proportional constant is called viscosity. Common units for viscosity are kg/m·s or Pa·s.

일 구체예에 따르면, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물이 상기 혼합물을 포함하는 경우, 온도 증가에 따라 하이드로겔 전구체 용액 상태에서 젤 상태의 하이드로겔 상태로 상 전이될 수 있다. 즉, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 온도 증가에 따라 점도가 증가할 수 있다. 상기 점도 변화는 단계적으로 일어날 수 있고, 점도의 증가 폭이 폴록사머 하이드로겔 대비, 더 낮을 수 있다. 즉, 폴록사머 단독일 때 보다, 폴록사머, 히알루론산, 및 탈세포화된 세포외기질의 혼합물을 포함하는 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물의 경우, 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 더 낮은 점도의 물성을 갖는 연고 형태의 하이드로겔 제형으로 존재할 수 있다. According to one embodiment, when the composition for wound treatment or tissue regeneration includes the mixture, the phase may change from a hydrogel precursor solution state to a gel state hydrogel state according to an increase in temperature. That is, the composition for wound treatment or tissue regeneration may increase in viscosity as the temperature increases. The viscosity change may occur in stages, and the increase in viscosity may be lower than that of the poloxamer hydrogel. That is, in the case of the composition for wound treatment or tissue regeneration comprising a mixture of poloxamer, hyaluronic acid, and decellularized extracellular matrix, when applied to a wound or wound site, lower viscosity than when poloxamer alone It may be present in the form of an ointment with a hydrogel formulation.

이는 상기 혼합물의 히알루론산 및 탈세포화된 세포외기질 입자가, 마이셀 (micelle)을 형성하는 폴록사머 고유의 젤화 메커니즘을 적정 수준으로 억제할 수 있고, 이로 인해, 더 낮은 점도의 물성을 갖는 연고 형태의 하이드로겔 제형이 완성될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.This is because the hyaluronic acid and decellularized extracellular matrix particles in the mixture can suppress the inherent gelation mechanism of poloxamer to form micelles to an appropriate level, and thereby, ointment form with lower viscosity It can be understood that a hydrogel formulation of

이로 인해, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 폴록사머 단독일 때 보다, 사용상의 편리성이 더욱 개선될 수 있다. 또한, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 안정적으로 고정되어 외부환경으로부터 보호 효과 및 습윤 효과를 충분히 유지할 수 있는 정도의 젤 상태로 존재할 수 있으면서, 점도가 너무 과하지 않은 연고 형태의 제형을 가지므로, 상처 부위로 활성물질인 세포외기질의 전달을 향상시켜, 폴록사머 단독일 때 보다, 상처 치료 또는 조직 재생의 효과가 현저히 개선될 수 있다.For this reason, the composition for wound treatment or tissue regeneration may be more convenient in use than when the poloxamer alone is used. In addition, when the composition for wound treatment or tissue regeneration is applied to a wound or wound site, it is stably fixed and can exist in a gel state to a degree that can sufficiently maintain the protective effect and wetting effect from the external environment, and the viscosity is not too excessive. Since it has an ointment-type formulation, it improves the delivery of the active substance, the extracellular matrix, to the wound site, so that the effect of wound healing or tissue regeneration can be significantly improved compared to when poloxamer alone is used.

따라서, 일 구체예에서는 상처 치료 또는 조직 재생의 창상 치료 효과를 현저히 개선시킬 수 있는, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물의 최적화된 제형을 구현하기 위한, 폴록사머, 히알루론산, 및 탈세포화된 세포외기질의 최적 중량%를 제공한다.Accordingly, in one embodiment, poloxamer, hyaluronic acid, and decellularized cells for implementing an optimized formulation of the composition for wound treatment or tissue regeneration, which can significantly improve the wound treatment effect of wound treatment or tissue regeneration It provides the optimum weight percent of the external substrate.

본 명세서의 용어, "히알루론산 (Hyaluronic acid)"은 연골 및 연조직에 넓게 퍼져있는 생체 내 물질로, 생체 적합성이 좋으며 단일 체인으로 구성되어 있는 고분자로서, 면역반응이 없는 비부착성 글리코사민글리칸을 의미한다. 상기 히알루론산은 세포의 표면물질과 반응을 하여 세포의 생장 및 분화를 조절하는 능력도 가지고 있어, 조직공학 및 약물전달용 물질로 사용될 수 있다.As used herein, the term "hyaluronic acid (Hyaluronic acid)" is a biomaterial that is widely spread in cartilage and soft tissues, is a polymer with good biocompatibility and is composed of a single chain, and is a non-adherent glycosamine glycan without an immune response. means The hyaluronic acid also has the ability to control the growth and differentiation of cells by reacting with the surface material of the cell, so it can be used as a material for tissue engineering and drug delivery.

상기 히알루론산은 변형된 히알루론산 유도체 또는 이의 염일 수 있고, 종류, 구조, 특성 등에 있어서 제한되지 않는다.The hyaluronic acid may be a modified hyaluronic acid derivative or a salt thereof, and is not limited in kind, structure, properties, and the like.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상기 히알루론산을 1 중량% 내지 2 중량% 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상기 히알루론산을 1 중량% 내지 1.2 중량%, 1 중량% 내지 1.4 중량%, 1 중량% 내지 1.6 중량%, 1 중량% 내지 1.8 중량%, 1.2 중량% 내지 1.4 중량%, 1.2 중량% 내지 1.6 중량%, 1.2 중량% 내지 1.8 중량%, 1.2 중량% 내지 2.0 중량%, 1.4 중량% 내지 1.6 중량%, 1.4 중량% 내지 1.8 중량%, 1.4 중량% 내지 2.0 중량%, 1.6 중량% 내지 1.8 중량%, 1.6 중량% 내지 2.0 중량%, 또는 1.8 중량% 내지 2.0 중량% 포함하는 것일 수 있다. 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물이 상기 히알루론산을 1 중량% 미만 또는 2 중량% 초과 포함하는 경우, 상기 조성물의 32℃ 내지 40℃의 주위 온도에서의 점도가 변경될 수 있고, 상처 또는 창상 부위에 적용 시, 사용상의 불편을 초래하거나, 상처 치료 또는 조직 재생 효과, 또는 창상 회복 효과가 감소될 수 있다.The composition for wound treatment or tissue regeneration may include 1 wt% to 2 wt% of the hyaluronic acid. Specifically, the composition for wound treatment or tissue regeneration comprises 1 wt% to 1.2 wt%, 1 wt% to 1.4 wt%, 1 wt% to 1.6 wt%, 1 wt% to 1.8 wt%, 1.2 wt% of the hyaluronic acid % to 1.4 wt%, 1.2 wt% to 1.6 wt%, 1.2 wt% to 1.8 wt%, 1.2 wt% to 2.0 wt%, 1.4 wt% to 1.6 wt%, 1.4 wt% to 1.8 wt%, 1.4 wt% to 2.0 wt%, 1.6 wt% to 1.8 wt%, 1.6 wt% to 2.0 wt%, or 1.8 wt% to 2.0 wt% may be included. When the composition for wound treatment or tissue regeneration contains less than 1% by weight or more than 2% by weight of the hyaluronic acid, the viscosity at an ambient temperature of 32°C to 40°C of the composition may be changed, and the wound or wound site When applied to the skin, it may cause inconvenience in use, reduce the effect of wound healing or tissue regeneration, or reduce the effect of wound healing.

본 명세서의 용어, "세포외기질 (extracellular matrix, ECM)"은 조직내 또는 세포외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체를 의미한다. 세포외기질은 섬유성 단백질, 프로테오글리칸과 같은 복합 단백질, 피브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 단백질 등 세포에 의해 합성되고 세포외에 분비 축적된 다양한 종류의 분자로 구성된다. 따라서 세포외기질은 유래 세포의 종류 또는 세포의 분화 정도에 따라 그 성분이 달라질 수 있다. As used herein, the term "extracellular matrix (ECM)" refers to a complex aggregate of biopolymers filling the space inside or outside the tissue. The extracellular matrix is composed of various types of molecules synthesized by cells and secreted and accumulated outside the cell, such as fibrous proteins, complex proteins such as proteoglycans, and cell adhesion proteins such as fibronectin and laminin. Therefore, the composition of the extracellular matrix may vary depending on the type of cell derived or the degree of differentiation of the cell.

상기 세포외기질은 구체적으로 탈세포화된 세포외기질일 수 있다. The extracellular matrix may be specifically decellularized extracellular matrix.

본 명세서의 용어, "탈세포화 (decellularization)"는 세포 또는 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 핵산 등을 제거하는 것을 의미한다. As used herein, the term “decellularization” refers to the removal of other cellular components other than the extracellular matrix from cells or tissues, for example, the nucleus, cell membrane, nucleic acid, and the like.

본 명세서의 용어, "탈세포화된 세포외기질"은 조직 또는 세포로부터 핵, 세포막, 핵산과 같은 세포 성분이 제거되고 남은 세포외기질을 의미한다. 상기 탈세포화된 세포외기질은 세포 집단으로부터 세포의 핵 및 세포막 등만을 제거하여, 세포외기질 성분 전체를 활용할 수 있어, 세포가 성장 및 분화하기에 더욱 자연스러운 생체모방 미세환경을 제공할 수 있다. 본 명세서에서 상기 탈세포화된 세포외기질은 "세포외기질 (extracellular matrix, ECM)" 또는 "세포외기질 메트릭스"라고도 명명될 수 있다.As used herein, the term "decellularized extracellular matrix" refers to the extracellular matrix remaining after cell components such as nucleus, cell membrane, and nucleic acid are removed from a tissue or cell. The decellularized extracellular matrix can provide a more natural biomimetic microenvironment for cells to grow and differentiate because they can utilize the entire extracellular matrix component by removing only the nucleus and cell membrane of the cell from the cell population. In the present specification, the decellularized extracellular matrix may also be referred to as "extracellular matrix (ECM)" or "extracellular matrix matrix".

상기 탈세포화된 세포외기질은 인 비트로에서 배양된 세포로부터 수득된 것일 수 있다. 상기 탈세포화된 세포외기질은 개체내에서 형성된 조직으로부터 유래된 세포외기질보다 인 비트로에서 배양된 세포 집단으로부터 수득한 세포외기질이 더 바람직할 수 있다. 상기 탈세포화된 세포외기질은 인 비트로에서 배양된 세포로부터 얻을 경우, 조직 유래 세포외기질의 단점인 공급 문제를 해결할 수 있으며, 자가 세포를 사용할 수 있어 면역거부반응이 일어날 가능성이 낮다.The decellularized extracellular matrix may be obtained from cells cultured in vitro. As the decellularized extracellular matrix, an extracellular matrix obtained from a cell population cultured in vitro may be more preferable than an extracellular matrix derived from a tissue formed in an individual. When the decellularized extracellular matrix is obtained from cells cultured in vitro, the supply problem, which is a disadvantage of tissue-derived extracellular matrix, can be solved, and autologous cells can be used, so the possibility of immune rejection is low.

상기 세포외기질을 수득하기 위한 세포는 예를 들면 섬유아세포, 연골세포, 조골세포, 혈관내피세포, 근세포, 평활근세포, 간세포, 신경세포, 심근세포, 척추 추간판세포, 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한 구체적으로 섬유아세포일 수 있으며, 일 구체예에 따르면, 인간 폐 섬유아세포일 수 있다. Cells for obtaining the extracellular matrix include, for example, fibroblasts, chondrocytes, osteoblasts, vascular endothelial cells, myocytes, smooth muscle cells, hepatocytes, nerve cells, cardiomyocytes, spinal disc cells, and mesenchymal stem cells. It may be one or more selected from the group. It may also be specifically fibroblasts, and according to one embodiment, may be human lung fibroblasts.

상기 탈세포화된 세포외기질을 수득하기 위한 탈세포화 방법은 공지된 방법 또는 이의 적절한 변형에 의해 이루어질 수 있다. 일 구체예에서 인 비트로에서 배양된 섬유아세포 집단을 비이온성 세척제 (Non-ionic detergent)인 Triton X-100을 이용해서 세포막을 깨뜨려서 세포 내 성분을 제거할 수 있다.The decellularization method for obtaining the decellularized extracellular matrix may be accomplished by a known method or an appropriate modification thereof. In one embodiment, the fibroblast population cultured in vitro can be removed by breaking the cell membrane using Triton X-100, a non-ionic detergent, to remove intracellular components.

상기 탈세포화된 세포외기질은 신생혈관형성 관련 성장 인자를 포함하는 것일 수 있다.The decellularized extracellular matrix may include angiogenesis-related growth factors.

구체적으로, 상기 신생혈관형성 관련 성장 인자는 엠피레귤린 (amphiregulin), 혈액 응고 인자 III (Coagulation Factor III), DPPIV (Dipeptidyl Peptidase IV), 엔도스타틴 (Endostatin, collagen XVIII fragment), FGF-1 (Fibroblast growth factor-acidic), FGF-2 (Fibroblast growth factor-basic), FGF7 (Fibroblast Growth Factor 7), HGF (Hepatocyte growth factor), 플라스미노겐 활성인자 억제제-1 (serpin E1), 트롬보스폰딘-1 (thrombospondin-1), 및 uPA (urokinase-type plasminogen activator)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.Specifically, the angiogenesis-related growth factors are amphiregulin, blood coagulation factor III (Coagulation Factor III), DPPIV (Dipeptidyl Peptidase IV), endostatin (Endostatin, collagen XVIII fragment), FGF-1 (Fibroblast growth factor-acidic), FGF-2 (Fibroblast growth factor-basic), FGF7 (Fibroblast Growth Factor 7), HGF (Hepatocyte growth factor), plasminogen activator inhibitor-1 (serpin E1), thrombospondin-1 ( thrombospondin-1), and uPA (urokinase-type plasminogen activator) may be at least one selected from the group consisting of.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상기 탈세포화된 세포외기질을 0.001 중량% 내지 1 중량% 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상기 탈세포화된 세포외기질을 0.001 중량% 내지 0.005 중량%, 0.001 중량% 내지 0.01 중량%, 0.001 중량% 내지 0.05 중량%, 0.001 중량% 내지 0.1 중량%, 0.001 중량% 내지 0.5 중량%, 0.005 중량% 내지 0.01 중량%, 0.005 중량% 내지 0.05 중량%, 0.005 중량% 내지 0.1 중량%, 0.005 중량% 내지 0.5 중량%, 0.005 중량% 내지 1 중량%, 0.01 중량% 내지 0.05 중량%, 0.01 중량% 내지 0.1 중량%, 0.01 중량% 내지 0.5 중량%, 0.01 중량% 내지 1 중량%, 0.05 중량% 내지 0.1 중량%, 0.05 중량% 내지 0.5 중량%, 0.05 중량% 내지 1 중량%, 0.1 중량% 내지 0.5 중량%, 0.1 중량% 내지 1 중량%, 또는 0.5 중량% 내지 1 중량% 포함하는 것일 수 있다. 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물이 상기 세포외기질을 0.001 중량% 미만 또는 1 중량% 초과 포함하는 경우, 상기 조성물의 32℃ 내지 40℃의 주위 온도에서의 점도가 변경될 수 있고, 상처 또는 창상 부위에 적용 시, 사용상의 불편을 초래하거나, 상처 치료 또는 조직 재생 효과, 또는 창상 회복 효과가 감소될 수 있다.The composition for wound treatment or tissue regeneration may include 0.001 wt% to 1 wt% of the decellularized extracellular matrix. Specifically, the composition for wound treatment or tissue regeneration contains the decellularized extracellular matrix at 0.001 wt% to 0.005 wt%, 0.001 wt% to 0.01 wt%, 0.001 wt% to 0.05 wt%, 0.001 wt% to 0.1 wt% %, 0.001% to 0.5%, 0.005% to 0.01%, 0.005% to 0.05%, 0.005% to 0.1%, 0.005% to 0.5%, 0.005% to 1%, 0.01 wt% to 0.05 wt%, 0.01 wt% to 0.1 wt%, 0.01 wt% to 0.5 wt%, 0.01 wt% to 1 wt%, 0.05 wt% to 0.1 wt%, 0.05 wt% to 0.5 wt%, 0.05 wt% % to 1 wt%, 0.1 wt% to 0.5 wt%, 0.1 wt% to 1 wt%, or 0.5 wt% to 1 wt% may be included. When the composition for wound treatment or tissue regeneration comprises less than 0.001% by weight or more than 1% by weight of the extracellular matrix, the viscosity at an ambient temperature of 32°C to 40°C of the composition may be changed, and the wound or wound When applied to the site, it may cause inconvenience in use, or reduce the effect of wound healing or tissue regeneration, or wound healing.

일 구체예에 따르면, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물이 상기 세포외기질을 0.1 중량% 포함하는 경우, 상기 조성물은 32℃ 내지 40℃의 주위 온도에서의 45 내지 80 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 유지하면서, 상처 또는 창상 부위에 적용 시, 현저히 개선된 상처 치료 또는 조직 재생 효과, 또는 창상 회복 효과를 나타낼 수 있다.According to one embodiment, when the composition for wound treatment or tissue regeneration comprises 0.1% by weight of the extracellular matrix, the composition is 45 to 80 Pascal seconds (Pa·s) at an ambient temperature of 32°C to 40°C. When applied to a wound or wound site while maintaining the viscosity of

상기 탈세포화된 세포외기질은 초음파 분산 방식에 의해 균질화된 세포외기질일 수 있다.The decellularized extracellular matrix may be an extracellular matrix homogenized by ultrasonic dispersion.

상기 초음파는 인간이 인지하지 못하는 20KHz 이상의 주파수를 가진 소리를 의미할 수 있다. 상기 초음파 분산 방식은 초음파를 용액속으로 방출시켜 용액 내부에 파동을 일으키는 것에 의한 분산 방식일 수 있다. The ultrasound may mean a sound having a frequency of 20 KHz or higher that is not recognized by humans. The ultrasonic dispersion method may be a dispersion method by emitting ultrasonic waves into a solution to generate waves in the solution.

구체적으로, 초음파에 의해 용액 내부에 파동이 발생되면, 그 파동에 의하여, 용액 내부에 버블 (bubble) 형태의 수백만개의 미세공간 (microcavity)이 발생되고, 상기 미세공간은 연속적으로 주입되는 초음파에 의하여 순간적으로 서로 뭉쳐지고, 다시 파쇄되는 과정을 반복하게 되며, 미세공간이 파쇄될 때, 용액내에서 소용돌이와 같은 격한 흐름이 발생되어 강한 충격파가 발생될 수 있다. 상기 충격파에 의해 생성된 에너지를 이용하여 용액 내부의 입자들을 안정하게 분산시킬 수 있다.Specifically, when a wave is generated inside the solution by ultrasonic waves, millions of microcavities in the form of bubbles are generated inside the solution by the wave, and the microcavities are continuously injected by ultrasonic waves. The process of instantaneously agglomerated and crushed again is repeated, and when the microcavity is crushed, a violent flow such as a vortex is generated in the solution and a strong shock wave can be generated. It is possible to stably disperse the particles in the solution by using the energy generated by the shock wave.

상기 분산은 용액 내부의 물질들이 균질한 상태로 용액 내에서 안정하게 분포되어 있는 것을 의미할 수 있다. 분산 방식으로, rotor를 고속으로 회전시켜 발생하는 에너지를 이용하여 용액 내 물질의 입자크기를 작게 만들어 분산시키는 rotor/stator 방식이 있는데, 이 방식은 물질의 입자 크기를 나노 수준 이하의 사이즈로 만들어 분산시키지 못하는 단점이 있다. 반면, 초음파를 이용하는 분산은 용액 내 물질을 나노수준으로 미세하게 만들 수 있어, 초음파 분산의 경우, 용액 내부의 물질을 더욱 균질하게 안정성이 현저히 개선된 상태로 분산시킬 수 있다.The dispersion may mean that substances in the solution are stably distributed in the solution in a homogeneous state. As a dispersion method, there is a rotor/stator method that uses the energy generated by rotating the rotor at high speed to make the particle size of the material in the solution small and disperse it. The downside is that it can't be done. On the other hand, dispersion using ultrasound can make the material in the solution fine to the nano level, and in the case of ultrasonic dispersion, the material in the solution can be more homogeneously dispersed in a state with significantly improved stability.

일 구체예에 따르면, 상기 탈세포화된 세포외기질을 물과 혼합하여 초음파 분산 방식에 의해 균질화시키는 경우, 약 200 내지 500 nm의 미세하고 균일한 입자 크기를 갖는, 분산 안정성이 현저히 개선된 세포외기질 현탁액을 수득할 수 있다.According to one embodiment, when the decellularized extracellular matrix is mixed with water and homogenized by ultrasonic dispersion method, the extracellular dispersion stability is significantly improved, having a fine and uniform particle size of about 200 to 500 nm. A substrate suspension can be obtained.

일 구체예에 따르면, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상기 초음파 분산 방식에 의해 균질화된 세포외기질을 포함하는 경우, 균질화 단계를 거치지 않은 세포외기질을 포함하는 경우 대비, 현저히 개선된 상처 치료 또는 조직 재생 효과, 또는 창상 회복 효과를 나타낼 수 있다.According to one embodiment, when the composition for wound treatment or tissue regeneration includes the extracellular matrix homogenized by the ultrasonic dispersion method, compared to the case where the composition includes the extracellular matrix that has not been subjected to the homogenization step, significantly improved wound healing Or it may exhibit a tissue regeneration effect, or a wound healing effect.

상기 초음파 분산 방식은 당업계에 공지된 일반적인 방식에 의해 이루어질 수 있고, 초음파 분산기를 이용하는 방식일 수 있다. 상기 초음파 분산기는 당업계에 공지된 일반적인 초음파 분산기일 수 있고, 그 종류나 기계적 특성에 있어서 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 초음파 분산기는 20KHz 이상의 주파수를 갖는 초음파를 이용하는 것일 수 있다.The ultrasonic dispersion method may be made by a general method known in the art, and may be a method using an ultrasonic disperser. The ultrasonic disperser may be a general ultrasonic disperser known in the art, and the type or mechanical properties are not particularly limited. Specifically, the ultrasonic disperser may use ultrasonic waves having a frequency of 20 KHz or higher.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상기 폴록사머 및 상기 히알루론산을 물에 용해하고 혼합하는 제 1 단계; 및 상기 제 1 단계 에서 수득된 혼합물과 상기 탈세포화된 세포외기질을 혼합하는 제 2 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있고, 상기 각 단계는 주위 온도가 3℃ 내지 17℃인 조건에서 수행되는 것일 수 있다.The composition for wound treatment or tissue regeneration comprises a first step of dissolving and mixing the poloxamer and the hyaluronic acid in water; and a second step of mixing the mixture obtained in the first step with the decellularized extracellular matrix, wherein each step is performed under conditions where the ambient temperature is 3°C to 17°C it may be

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 온도감응성 점도 변화 성질을 지니는 것일 수 있다. 즉, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 온도 변화에 따라 점도가 변화하는, 온도감응성 졸-젤 상 전이 제형을 가지는 것일 수 있다.The composition for wound treatment or tissue regeneration may have a temperature-sensitive viscosity change property. That is, the composition for wound treatment or tissue regeneration may have a temperature-sensitive sol-gel phase transfer formulation, the viscosity of which changes with temperature change.

구체적으로, 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 주위 온도가 32℃ 이상이면 젤 상태로 존재하고; 주위 온도가 17℃ 이하이면 졸 상태로 존재하며; 주위 온도가 17℃ 초과 내지 32℃ 미만이면 젤 상태와 졸 상태가 공존하는 것일 수 있다.Specifically, the composition for wound treatment or tissue regeneration exists in a gel state when the ambient temperature is 32° C. or higher; It exists in a sol state when the ambient temperature is 17° C. or less; If the ambient temperature is greater than 17°C and less than 32°C, the gel state and the sol state may coexist.

따라서, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 주위 온도가 0℃ 초과, 17℃ 이하인 경우, 용액 상태 즉, 하이드로겔 전구체 용액 상태로 존재할 수 있어 제조, 보관, 또는 체외에서의 조작에 있어 편리성이 증가될 수 있다. 또한, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 주위 온도가 증가함에 따라, 점차적으로 점도가 증가하고, 젤화되어 창상 또는 상처 부위에 직접 바를 수 있는 하이드로겔 상태의 제형으로 상 전이될 수 있다.Therefore, the composition for wound treatment or tissue regeneration may exist in a solution state, that is, a hydrogel precursor solution state, when the ambient temperature is greater than 0 ° C. or less than 17 ° C. can be increased. In addition, the composition for wound treatment or tissue regeneration may gradually increase in viscosity as the ambient temperature increases, and may be gelled to form a hydrogel formulation that can be applied directly to a wound or wound site.

일 구체예에 따르면, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 주위 온도가 상온이면, 5 내지 14 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 주위 온도가 상온, 구체적으로 20℃ 내지 26℃인 경우, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 5 내지 14 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖는 것일 수 있다. 또한, 주위 온도가 상온, 구체적으로 20℃ 내지 24℃인 경우, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 5 내지 11 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖는 것일 수 있다. 따라서, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 폴록사머 단독 하이드로겔과는 달리, 상온에서도 일정 수준의 점도가 유지되므로, 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 피부와 접촉하지 않고 상온에 노출되는 표면은 흘러내리지 않고 더 안정적으로 형태를 유지할 수 있다.According to one embodiment, the composition for wound treatment or tissue regeneration may have a viscosity of 5 to 14 Pascal seconds (Pa·s) when the ambient temperature is room temperature. Specifically, when the ambient temperature is room temperature, specifically 20° C. to 26° C., the composition for wound treatment or tissue regeneration may have a viscosity of 5 to 14 Pascal seconds (Pa·s). In addition, when the ambient temperature is room temperature, specifically, 20° C. to 24° C., the composition for wound treatment or tissue regeneration may have a viscosity of 5 to 11 Pascal seconds (Pa·s). Therefore, unlike the poloxamer alone hydrogel, the composition for wound treatment or tissue regeneration maintains a certain level of viscosity even at room temperature, so when applied to a wound or wound site, the surface exposed to room temperature without contact with the skin flows It can maintain its shape more stably without falling down.

일 구체예에 따르면, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 주위 온도가 26℃ 초과, 31℃ 미만인 경우, 12 내지 32 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖는 것일 수 있다. According to one embodiment, the composition for wound treatment or tissue regeneration may have a viscosity of 12 to 32 Pascal seconds (Pa·s) when the ambient temperature is greater than 26°C and less than 31°C.

일 구체예에 따르면, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 주위 온도가 31℃ 내지 40℃이면, 30 내지 80 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 주위 온도가 32℃ 내지 40℃이면, 45 내지 80 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖는 젤 상태인 하이드로겔 상태로 존재할 수 있다. According to one embodiment, the composition for wound treatment or tissue regeneration may have a viscosity of 30 to 80 Pascal seconds (Pa·s) when the ambient temperature is 31°C to 40°C. Specifically, the composition for wound treatment or tissue regeneration may exist in a gel-like hydrogel state having a viscosity of 45 to 80 Pascal seconds (Pa·s) when the ambient temperature is 32°C to 40°C.

따라서, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 피부 온도에 의해 주위 온도가 상승하면, 점차적으로 점도가 증가하고, 주위 온도가 32℃ 내지 40℃인 경우, 상기 조성물은 젤 상태인 하이드로겔 상태로 존재하여 창상 또는 상처 부위에 고정될 수 있고, 외부환경으로부터 보호 효과 및 습윤 효과를 유지하면서도 상처 부위로 활성물질인 세포외기질의 전달을 향상시켜 상처 치료 또는 조직 재생의 효과를 증가시킬 수 있다.Therefore, when the composition for wound treatment or tissue regeneration is applied to a wound or wound site, when the ambient temperature is increased by the skin temperature, the viscosity gradually increases, and when the ambient temperature is 32°C to 40°C, the composition is It exists in a hydrogel state, which is a gel state, and can be fixed to a wound or wound site, and while maintaining a protective effect and a wetting effect from the external environment, it improves the delivery of the extracellular matrix, an active material, to the wound site, thereby improving the effect of wound healing or tissue regeneration can increase

즉, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 연고 형태의 제형으로 존재할 수 있다. 이는 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 폴록사머 단독 하이드로겔보다 더 낮은 점도의 물성을 가지는 것을 의미할 수 있다. 이로 인해, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 폴록사머 단독 하이드로겔보다 사용상의 편리성이 더 개선될 수 있고, 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 안정적으로 고정되어 해당 부위를 외부로부터 보호하고 습윤 효과를 유지하기에 충분한 점도이면서, 너무 과도하지 않은 수준의 점도를 갖는 연고 형태의 제형으로 존재할 수 있어, 활성물질인 세포외기질의 목적 부위로의 전달이 더욱 증가될 수 있다.That is, the composition for wound treatment or tissue regeneration may be present in the form of an ointment when applied to a wound or wound site. This may mean that when applied to a wound or wound site, the composition for wound treatment or tissue regeneration has a lower viscosity than the poloxamer alone hydrogel. For this reason, the composition for wound treatment or tissue regeneration may be more convenient to use than the poloxamer alone hydrogel, and when applied to a wound or wound site, it is stably fixed to protect the site from the outside and has a wetting effect. It may be present in the form of an ointment having a viscosity sufficient to maintain the viscosity and not too excessive, so that the delivery of the active substance, the extracellular matrix, to the target site can be further increased.

또한, 일 구체예에 따르면, 폴록사머 단독 하이드로겔은 특정 온도 구간에 이르면 즉, 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 점도가 최고 수준으로 수직 상승하는 양상을 보이는 것과는 달리, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물의 경우, 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 점차적으로 점도가 증가되면서 젤화가 이루어질 수 있다. In addition, according to one embodiment, when the poloxamer-only hydrogel reaches a specific temperature range, that is, when applied to a wound or wound site, the viscosity vertically rises to the highest level, whereas for the wound treatment or tissue regeneration In the case of the composition, when applied to a wound or wound site, gelation may be achieved while the viscosity is gradually increased.

이는 폴록사머 단독 하이드로겔은 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 즉시 또는 매우 짧은 시간 내에, 매우 높은 수준으로 점도가 증가하여, 활성물질이 피부에 흡수되기도 전에 젤화되어 활성물질의 피부 흡수를 방해할 수 있는 반면, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물의 경우, 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 점차적으로 점도가 증가되면서 젤화가 이루어질 수 있고, 젤화되는 동안 활성물질인 세포외기질이 피부에 충분히 흡수될 수 있음을 의미할 수 있다. This is because when applied to a wound or wound site, the poloxamer-only hydrogel increases its viscosity to a very high level, immediately or within a very short time, so that the active material is gelled even before it is absorbed into the skin, preventing the skin absorption of the active material. On the other hand, in the case of the composition for wound treatment or tissue regeneration, when applied to a wound or wound site, gelation can be achieved while the viscosity is gradually increased, and the extracellular matrix, an active material, can be sufficiently absorbed into the skin during gelation. may mean that there is

따라서, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 폴록사머 단독 하이드로겔 대비 현저히 증가된 창상 회복 효과, 상처 치료 효과, 조직 재생 효과, 표피 재생 효과, 진피 재생 효과, 신생혈관 재생 효과, 또는 피부부속기관 재생 효과를 나타내는 것일 수 있다.Therefore, the composition for wound treatment or tissue regeneration has significantly increased wound recovery effect, wound healing effect, tissue regeneration effect, epidermal regeneration effect, dermal regeneration effect, new blood vessel regeneration effect, or skin accessory organ regeneration compared to poloxamer alone hydrogel. It may indicate an effect.

상기 상처 또는 창상 (wound)은 생체가 손상된 상태를 말하는 것으로서, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관, 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄할 수 있다. 구체적으로 상기 상처 또는 창상은 좌상 (contusion or bruise), 열상 (laceration), 결출상 (avulsion), 관통상 (penetrated wound), 비-치유 외상성 창상, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상 (abrasion), 골괴저, 총상 (gun shot wound), 절상, 화상, 동상, 피부궤양, 피부 건조, 피부각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부사상균증에 의한 통증, 수술상, 혈관질환 창상, 각막창상 등의 창상, 욕창, 와창, 당뇨병, 또는 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상, 또는 여드름 등의 개체의 일부에 대한 손상을 포괄적으로 의미할 수 있다. The wound or wound (wound) refers to a state in which a living body is damaged, and a tissue constituting the internal or external surface of the living body, for example, skin, muscle, nerve tissue, bone, soft tissue, internal organ, or vascular tissue is divided or destroyed. pathological conditions may be covered. Specifically, the wound or wound is a contusion or bruise, laceration, avulsion, penetrated wound, non-healing traumatic wound, tissue destruction by irradiation, abrasion, Oste gangrene, gun shot wounds, cuts, burns, frostbite, skin ulcers, dry skin, keratosis, cracks, cracks, dermatitis, pain due to dermatophytosis, surgical wounds, vascular disease wounds, corneal wounds, etc. It can comprehensively refer to damage to a part of an individual, such as bedsores, colic, diabetes, or conditions related to poor circulation, chronic ulcers, suture sites after plastic surgery, spinal injuries, gynecological wounds, chemical wounds, or acne. have.

상기 조직 재생은 손상된 조직과 장기의 신생혈관을 생성하거나, 조직 및 장기를 구성하는 세포를 재생 혹은 복원시키거나, 그 조직 및 장기의 고유기능을 담당하는 조직을 재생시켜 그 기능을 복원하는 것을 의미할 수 있다. 상기 조직 재생은 표피 재생, 진피 재생, 신생혈관 재생, 또는 피부부속기관 재생 등을 포함할 수 있다.The tissue regeneration refers to generating new blood vessels of damaged tissues and organs, regenerating or restoring cells constituting tissues and organs, or restoring the functions by regenerating tissues responsible for the unique functions of the tissues and organs. can do. The tissue regeneration may include epidermal regeneration, dermal regeneration, neovascularization, or skin appendage regeneration.

본 명세서의 용어, "치료 (treatment)"는 상기 조성물에 의해 상처 또는 창상 상태가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. As used herein, the term “treatment” refers to any action in which a wound or wound condition is improved or beneficially changed by the composition.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상기 폴록사머, 히알루론산, 및 탈세포화된 세포외기질의 혼합물과 상처 치료 또는 조직 재생 등의 창상 회복 효과를 가지는 유효성분을 1 종 이상 더 포함할 수 있다.The composition for wound treatment or tissue regeneration may further include a mixture of the poloxamer, hyaluronic acid, and decellularized extracellular matrix, and one or more active ingredients having a wound healing effect such as wound treatment or tissue regeneration.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다. The composition for wound treatment or tissue regeneration may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive includes starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, phosphoric acid. Calcium hydrogen, lactose, mannitol, syrup, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, Opadry, sodium starch glycolate, carnauba wax, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate , calcium stearate, sucrose, etc. may be used.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다.Carriers, excipients, and diluents that may be included in the composition for wound treatment or tissue regeneration include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin , calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 비경구투여에 적합하도록 제조될 수 있다. The composition for wound treatment or tissue regeneration may be prepared to be suitable for parenteral administration.

따라서, 상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제등을 포함할 수 있고, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. Accordingly, the composition for wound treatment or tissue regeneration may include a sterile aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion, a freeze-dried preparation, a suppository, and the like, and the suspension includes propylene glycol, polyethylene glycol, and olive. Vegetable oils such as oils, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used.

상기 비경구투여는 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 사용하여 이루어질 수 있다.The parenteral administration can be made by using an injection method for external application to the skin or intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 피부 외용제의 형태로 제조될 수 있다. The composition for wound treatment or tissue regeneration may be prepared in the form of an external preparation for skin.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 목적하는 신체 부위에 따라 그 제형이 특별히 한정되지 않으며, 당업계의 공지기술을 참조하여 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 오일제, 왁스제, 유탁액제, 현탁액제, 겔제 또는 에어로졸제 등 형태로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The composition for wound treatment or tissue regeneration is not particularly limited in its formulation depending on a desired body part, and may be prepared in any formulation conventionally prepared with reference to known techniques in the art. For example, it may be used in the form of a liquid, ointment, cream, lotion, spray, patch, oil, wax, emulsion, suspension, gel, or aerosol, but is not limited thereto.

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 통상적인 첨가제, 예를 들어 보존제, 의약 침투를 보조하는 용매, 연고 및 크림의 경우 연화제 등을 포함할 수 있으며, 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 통상적 담체를 함유할 수 있다.The composition for wound treatment or tissue regeneration may include conventional additives, for example, preservatives, solvents to aid drug penetration, emollients in the case of ointments and creams, and may contain a conventional carrier such as ethanol or oleyl alcohol. can

상기 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 상술한 성분에 한정되지 않고, 필요에 따라 통상의 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물에 배합되는 다른 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기 또는 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한 (制汗)제, 정제수 등을 포함할 수 있다.The composition for wound treatment or tissue regeneration is not limited to the above-described components, and may include other components that are blended into a conventional cosmetic composition or pharmaceutical composition, if necessary. For example, oils and fats, moisturizing agents, emollients, surfactants, organic or inorganic pigments, organic powders, ultraviolet absorbers, preservatives, disinfectants, antioxidants, plant extracts, pH adjusters, alcohols, pigments, fragrances, blood circulation promoters, It may include a cooling agent, a limiting agent, purified water, and the like.

일 양상에 따른, 폴록사머, 히알루론산, 및 탈세포화된 세포외기질의 혼합물을 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물은 온도 변화에 따라 졸 (sol) 상태에서 젤 (gel) 상태로 제형의 상 전이 (phase transition)가 일어날 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 특정 온도에서 용액 상태로 존재하여, 세포외기질의 적용, 제조, 보관, 또는 체외에서의 조작에 있어 편리성이 증가될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 해당 부위에 안정적으로 고정되어, 외부환경으로부터 보호하고, 습윤 환경을 조성하여 유지할 수 있는 것은 물론, 피부로의 세포외기질의 전달을 증가시킬 수 있다. 이를 통해, 상기 조성물은 상처 치료, 조직 재생 등에 있어서 우수한 창상 회복 효과를 나타낼 수 있다. According to one aspect, the composition for wound treatment or tissue regeneration comprising a mixture of poloxamer, hyaluronic acid, and decellularized extracellular matrix is a phase transition of the formulation from a sol state to a gel state according to a change in temperature (phase transition) may occur. Accordingly, the composition may exist in a solution state at a specific temperature, thereby increasing the convenience of application, preparation, storage, or in vitro manipulation of the extracellular matrix. In addition, when the composition is applied to a wound or wound site, it is stably fixed to the site, protects it from the external environment, can create and maintain a moist environment, and can increase the delivery of the extracellular matrix to the skin. . Through this, the composition may exhibit an excellent wound recovery effect in wound treatment, tissue regeneration, and the like.

일 양상에 따른, 상기 조성물은 창상 회복용, 상처 치료용, 조직 재생용, 피부 재생용, 유착방지용, 의료용 필러 주사제, 성형외과용 필러 주사제, 의료용 충전제, 보형물 등의 용도로 사용될 수 있다.According to one aspect, the composition may be used for wound recovery, wound treatment, tissue regeneration, skin regeneration, anti-adhesion, medical filler injection, plastic surgery filler injection, medical filler, implants, and the like.

도 1은 플루로닉 F-127, 히알루론산, 및 세포외기질 (ECM)을 포함하는 혼합물 (PHE 혼합물)의 제조 방법, PHE 혼합물 제형의 졸-젤 상 전이, 및 주입형 PHE 혼합물의 창상 또는 상처 부위로의 적용을 나타내는 모식도이다.
도 2a는 인간 폐 섬유아세포를 배양한 후, 탈세포화를 수행하여 얻어진 인간 폐 섬유아세포 유래 세포외기질 (Human lung fibroblast-derived matrix, hFDM)에 대하여 면역형광염색 및 DAPI 형광염색을 수행한 후 촬영한 사진을 나타내는 도면이다.
도 2b는 혈관신생 분석 키트 (angiogenesis array kit)를 통해 hFDM에 포함된 신생혈관형성 관련 성장 인자를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 초음파 분산기를 이용해 균질화된 hFDM 현탁액을 육안으로 확인하여 촬영한 사진을 나타내는 도면이다.
도 3b는 균질화된 hFDM 현탁액 내의 hFDM 입자의 크기 분포를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 플루로닉 F-127, 히알루론산, 및 hFDM을 포함하는 혼합물 (PHE 혼합물)의 온도에 따른 졸-젤 상 전이를 나타내는 사진 및 상 전이에 따른 PHE 혼합물의 내부 변화를 나타내는 모식도이다.
도 4b는 20% (w/v) 플루로닉, PH 혼합물, 및 PHE 혼합물의 온도 변화에 따른 점도의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 상기 도 4b의 그래프에서 20 내지 24℃의 온도 구간의 결과만을 확대하여 나타내는 그래프이다.
도 5a는 PH 혼합물 또는 PHE 혼합물을 마우스의 창상에 주입하는 모습을 촬영한 사진을 나타내는 도면이다.
도 5b는 균질화된 hFDM을 다른 농도로 포함하는 3종의 PHE 혼합물 (실시예 3 내지 실시예 5)을 각각 마우스의 창상에 적용한 경우, 적용 후 시간 증가에 따른 창상 크기의 변화를 촬영한 사진을 나타내는 도면이다. hFDM을 포함하지 않는 PH 혼합물은 비교예로서 사용되었다.
도 5c는 상기 도 5b의 창상 크기의 변화를 정량적으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5d는 균질화된 hFDM을 다른 농도로 포함하는 3종의 PHE 혼합물 (실시예 3 내지 실시예 5)을 각각 마우스의 창상에 적용한 후 14 일차에 수득한 피부조직을 절개 후 얇게 절편하여 헤마톡실린-에오신 (Hematoxylin&Eosin, H&E) 염색을 수행하여 촬영한 사진을 나타내는 도면이다. hFDM을 포함하지 않는 PH 혼합물은 비교예로서 사용되었다.
도 5e는 상기 도 5d의 피부조직 염색 후 촬영한 사진으로부터 재생된 표피의 두께를 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 비교군으로 정상 조직의 표피 두께를 분석하였다.
도 6a는 비균질 hFDM을 포함하는 PHE 혼합물 (PHE-ns (0.1), 비교예) 및 균질화된 hFDM을 포함하는 PHE 혼합물 (PHE (0.1), 실시예 4)을 각각 마우스의 창상에 적용한 경우, 적용 후 시간 증가에 따른 창상 크기의 변화를 촬영한 사진을 나타내는 도면이다.
도 6b는 상기 도 6a의 창상 크기의 변화를 정량적으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6c는 PHE-ns (0.1) (비교예) 및 PHE (0.1) (실시예 4)을 각각 마우스의 창상에 적용한 후 14 일차에 수득한 피부조직을 절개 후 얇게 절편하여 H&E 염색을 수행하여 촬영한 사진을 나타내는 도면이다.
도 6d는 상기 도 6c의 피부조직 염색 후 촬영한 사진으로부터 재생된 표피의 두께를 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 비교군으로 정상 조직의 표피 두께를 분석하였다.
도 6e는 상기 도 6c의 피부조직 염색 후 고 배율에서 촬영하여 얻어진, 진피 내 신생혈관 재생을 확인할 수 있는 사진을 나타내는 도면이다.
도 6f는 상기 도 6e의 고 배율 촬영 사진으로부터 진피 내에서 재생된 신생혈관의 밀도를 정량적으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.1 is a method for preparing a mixture (PHE mixture) comprising pluronic F-127, hyaluronic acid, and extracellular matrix (ECM), sol-gel phase transition of a PHE mixture formulation, and an injection-type PHE mixture wound or It is a schematic diagram showing application to a wound site.
Figure 2a is taken after culturing human lung fibroblasts and performing immunofluorescence staining and DAPI fluorescence staining on the human lung fibroblast-derived matrix (hFDM) obtained by performing decellularization. It is a drawing representing a picture.
2B is a graph showing the results of analysis of angiogenesis-related growth factors included in hFDM through angiogenesis array kit.
Figure 3a is a view showing a photograph taken by visually confirming the homogenized hFDM suspension using an ultrasonic disperser.
3B is a graph showing the results of analyzing the size distribution of hFDM particles in the homogenized hFDM suspension.
Figure 4a is a pluronic F-127, hyaluronic acid, and a sol according to the temperature of a mixture (PHE mixture) containing hFDM - a schematic diagram showing the internal change of the PHE mixture according to the phase transition and a photograph showing the gel phase transition.
Figure 4b is a 20% (w / v) pluronic, PH mixture, and a graph showing the results of analyzing the change in viscosity according to the temperature change of the PHE mixture.
4C is an enlarged graph showing only a result of a temperature range of 20 to 24° C. in the graph of FIG. 4B.
Figure 5a is a view showing a photograph of the state of injecting the PH mixture or PHE mixture into the wound of the mouse.
Figure 5b is a photograph of the change in wound size with increasing time after application when three types of PHE mixtures (Examples 3 to 5) containing homogenized hFDM at different concentrations were applied to the wounds of mice, respectively. It is a drawing showing A PH mixture without hFDM was used as a comparative example.
Figure 5c is a graph showing the results of quantitative analysis of the change in the size of the wound of Figure 5b.
FIG. 5D shows that three types of PHE mixtures (Examples 3 to 5) containing homogenized hFDM at different concentrations were applied to the wounds of mice, respectively, and the skin tissue obtained on the 14th day was incised and sliced thinly to obtain hematoxylin - It is a drawing showing a photograph taken by performing eosin (Hematoxylin&Eosin, H&E) staining. A PH mixture without hFDM was used as a comparative example.
5E is a graph showing the results of quantitative analysis of the thickness of the epidermis regenerated from the photograph taken after the skin tissue staining of FIG. 5D. As a comparison group, the epidermal thickness of normal tissues was analyzed.
6a is a PHE mixture containing heterogeneous hFDM (PHE-ns (0.1), Comparative Example) and a PHE mixture containing homogenized hFDM (PHE (0.1), Example 4), respectively, when applied to the wound of the mouse It is a diagram showing a photograph of a change in the size of a wound according to an increase in post time.
Figure 6b is a graph showing the results of quantitative analysis of the change in the size of the wound of Figure 6a.
Figure 6c is after applying PHE-ns (0.1) (Comparative Example) and PHE (0.1) (Example 4) to the wounds of mice, respectively, the skin tissue obtained on the 14th day was cut and sliced thinly, followed by H & E staining. It is a drawing representing a picture.
6D is a graph showing the results of quantitative analysis of the thickness of the epidermis regenerated from the photograph taken after the skin tissue staining of FIG. 6C. As a comparison group, the epidermal thickness of normal tissues was analyzed.
FIG. 6e is a view showing a photograph confirming the regeneration of new blood vessels in the dermis obtained by photographing at a high magnification after staining the skin tissue of FIG. 6c.
FIG. 6f is a graph showing the results of quantitative analysis of the density of new blood vessels regenerated in the dermis from the high-magnification photograph of FIG. 6e.

이하 본 발명을 실험예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through experimental examples and examples. However, these Experimental Examples and Examples are for illustrative purposes of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these Experimental Examples and Examples.

또한, 본 명세서에서 특별한 정의가 없으면, 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다.In addition, unless specifically defined herein, all scientific and technical terms used herein may have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.

실시예 1. 인간 폐 섬유아세포 유래 세포외기질 (Human lung fibroblast-derived matrix, hFDM)의 제조Example 1. Preparation of human lung fibroblast-derived matrix (hFDM)

본 실시예에서는, 인간 폐 섬유아세포 유래 세포외기질 (Human lung fibroblast-derived matrix, hFDM)을 제조하기 위하여, 인간 폐 섬유아세포를 배양한 후, 탈세포화를 수행하였다.In this example, in order to prepare human lung fibroblast-derived matrix (hFDM), human lung fibroblasts were cultured and then decellularized.

구체적으로, 인간 폐 섬유아세포 (CCL-75, ATCC)를 100 mm 세포 배양 용기에 2 x 104 cell/cm2의 양으로 접종하였다. 상기 세포가 접종된 배양용기에 10% (v/v)의 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS), 100 U/ml의 페니실린, 및 100 μl/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)를 첨가하고, 일반 배양 조건 (5% CO2, 37℃)에서 약 2 내지 3 일 간격으로 배지를 교체하면서 약 7 일 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 인산염 완충 식염수 (phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하였다. 그 후, 세척된 세포에 0.25% (v/v) Triton-X 100과 50 mM NH4OH (Sigma)를 첨가하고, 뒤이어 50 U/ml의 DNase I (Invitrogen) 및 2.5 μl/ml의 RNase A (Invitrogen)를 첨가하고 37℃에서 2 시간 동안 배양하여 세포를 탈세포화시켰다. 상기 탈세포화된 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)을 PBS로 세척하여 hFDM를 수득하였다. 상기 수득된 hFDM는 곧바로 사용되거나 약 2 주까지 PBS에서 약 4℃ 조건으로 보관되었다.Specifically, human lung fibroblasts (CCL-75, ATCC) were inoculated in an amount of 2 x 10 4 cell/cm 2 in a 100 mm cell culture vessel. Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin, and 100 μl/ml streptomycin in the culture vessel inoculated with the cells (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) was added, and cultured for about 7 days under normal culture conditions (5% CO 2 , 37° C.) while changing the medium at intervals of about 2 to 3 days. The cultured cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS). Then, 0.25% (v/v) Triton-X 100 and 50 mM NH 4 OH (Sigma) were added to the washed cells, followed by 50 U/ml of DNase I (Invitrogen) and 2.5 μl/ml of RNase A (Invitrogen) was added and the cells were decellularized by incubation at 37°C for 2 hours. The decellularized extracellular matrix (ECM) was washed with PBS to obtain hFDM. The obtained hFDM was used immediately or stored at about 4° C. in PBS for up to about 2 weeks.

상기 수득된 hFDM를 면역형광염색 및 DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) 형광염색을 통해 확인하였다.The obtained hFDM was confirmed by immunofluorescence staining and DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) fluorescence staining.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 상기 수득된 hFDM에서 피브로넥틴 (fibronectin)과 제 1 형 콜라겐 (collagen type Ⅰ)을 확인할 수 있었고, 반면, DAPI로 염색된 세포는 거의 발견할 수 없었다. 이를 통해, 인간 폐 섬유아세포 유래의 탈세포화된 세포외기질을 수득하였음을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 2A , fibronectin and collagen type I could be identified in the obtained hFDM, whereas cells stained with DAPI were hardly found. Through this, it was confirmed that decellularized extracellular matrix derived from human lung fibroblasts was obtained.

실험예 1. 제조된 hFDM에 포함된 성장 인자의 확인Experimental Example 1. Identification of growth factors included in the prepared hFDM

본 실험예에서는, 상기 실시예 1에서 제조된 hFDM 내에 포함되어 있는 신생혈관형성 (angiogenesis) 관련 성장 인자를 스크리닝 하기 위해, 혈관 신생 분석 (angiogenesis assay)을 수행하였다.In this experimental example, in order to screen for angiogenesis-related growth factors contained in the hFDM prepared in Example 1, an angiogenesis assay was performed.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 hFDM은, 엠피레귤린 (amphiregulin), 혈액 응고 인자 III (Coagulation Factor III), DPPIV (Dipeptidyl Peptidase IV), 엔도스타틴 (Endostatin, collagen XVIII fragment), FGF-1 (Fibroblast growth factor-acidic), FGF-2 (Fibroblast growth factor-basic), FGF7 (Fibroblast Growth Factor 7), HGF (Hepatocyte growth factor), 플라스미노겐 활성인자 억제제-1 (serpin E1), 트롬보스폰딘-1 (thrombospondin-1), uPA (urokinase-type plasminogen activator) 등의 다수의 신생혈관형성과 관련된 주요 성장 인자들을 포함하고 있음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 2B , the hFDM prepared in Example 1 is amphiregulin, blood coagulation factor III (Coagulation Factor III), DPPIV (Dipeptidyl Peptidase IV), endostatin (Endostatin, collagen XVIII) fragment), FGF-1 (Fibroblast growth factor-acidic), FGF-2 (Fibroblast growth factor-basic), FGF7 (Fibroblast Growth Factor 7), HGF (Hepatocyte growth factor), plasminogen activator inhibitor-1 (serpin) E1), thrombospondin-1, and uPA (urokinase-type plasminogen activator) were confirmed to contain a number of major growth factors related to angiogenesis.

실시예 2 - 실시예 5. 폴록사머 (poloxamer), 히알루론산 (hyaluronic acid, HA), 및 hFDM을 포함하는 온도감응성 혼합물의 제조 Example 2 - Example 5. Preparation of a thermosensitive mixture comprising poloxamer, hyaluronic acid (HA), and hFDM

2-1. 균질화된 hFDM의 제조2-1. Preparation of homogenized hFDM

본 실시예에서는, 온도감응성 혼합물을 제조하기 위하여, 먼저, 균질화된 hFDM 현탁액을 제조하였다.In this example, in order to prepare a temperature-sensitive mixture, first, a homogenized hFDM suspension was prepared.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 hFDM에서 PBS를 제거 후 멸균된 3차 증류수를 첨가하고 (100 mm 세포 배양용기당 1 ml의 증류수를 넣음), 세포 스크랩퍼 (cell scraper)를 이용하여 1.5 ml 튜브에 hFDM 현탁액을 수집하였다. 이어서, 튜브에 옮겨진 hFDM 현탁액을 초음파 분산기 (Fisher Scientific, model 500 Sonic Dismembrator)를 이용하여 (진폭: 10%, 작동 간격: 3 초 (on)/3 초 (off)) 약 10 내지 20 초 (작동 시간 기준)동안 균질화하였다. Specifically, after removing PBS from the hFDM prepared in Example 1, sterile tertiary distilled water was added (1 ml of distilled water per 100 mm cell culture vessel was put), and 1.5 using a cell scraper. The hFDM suspension was collected in ml tube. Then, the hFDM suspension transferred to the tube was transferred using an ultrasonic disperser (Fisher Scientific, model 500 Sonic Dismembrator) (amplitude: 10%, operation interval: 3 sec (on)/3 sec (off)) about 10 to 20 sec (actuation) time basis).

상기에서 제조된 균질화된 hFDM 현탁액을 육안으로 확인하였고, Zetasizer Nano (Malvern Panalytical)를 이용하여 현탁액 내의 hFDM 입자 크기 및 분포도를 측정하였다. 또한, hFDM 현탁액의 농도는 BCA assay를 통하여 결정하였다. hFDM 현탁액에서 hFDM의 평균 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml인 것으로 확인되었다.The homogenized hFDM suspension prepared above was visually confirmed, and the size and distribution of hFDM particles in the suspension were measured using a Zetasizer Nano (Malvern Panalytical). In addition, the concentration of hFDM suspension was determined through BCA assay. The average concentration of hFDM in the hFDM suspension was found to be about 1 mg/ml to about 5 mg/ml.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 균질화 전과 비교하여, 초음파 분산처리한 hFDM 현탁액 내에서 hFDM 입자가 더 균질하게 분산되어 있음을 육안으로 확인하였다. 또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 초음파 분산처리한 hFDM 현탁액 내에서 hFDM 입자 크기는 약 200 내지 500 nm의 범위 내에서 측정되었다. 이를 통해, 입자 크기가 작고 균일하여, 분산 안정성이 높은 균질화된 hFDM을 수득하였음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 3a , it was visually confirmed that the hFDM particles were more homogeneously dispersed in the ultrasonically dispersed hFDM suspension as compared to before homogenization. In addition, as shown in FIG. 3B , the hFDM particle size in the ultrasonically dispersed hFDM suspension was measured in the range of about 200 to 500 nm. Through this, it was confirmed that the homogenized hFDM having a small and uniform particle size and high dispersion stability was obtained.

2-2. 폴록사머 (poloxamer)와 히알루론산 (hyaluronic acid, HA)의 혼합 비율 최적화를 통한 온도감응성 PH 혼합물의 제조2-2. Preparation of temperature-sensitive PH mixture by optimizing the mixing ratio of poloxamer and hyaluronic acid (HA)

본 실시예에서는, 폴록사머와 히알루론산의 혼합 비율을 최적화하여 온도감응성 PH 혼합물을 제조하였다. In this example, a temperature-sensitive PH mixture was prepared by optimizing the mixing ratio of poloxamer and hyaluronic acid.

구체적으로, 폴록사머의 한 종류인 플루로닉 F-127 (Pluronic F-127; 분자량: 12.6 kDa) 파우더와 히알루론산 (분자량: 약 1,000,000)을 멸균된 증류수에 넣고, 교반기 (magnetic stirrer)를 이용하여 500 rpm, 4℃ 조건에서 6 시간 동안 파우더를 균일하게 용해하였다.Specifically, one kind of poloxamer, Pluronic F-127 (Pluronic F-127; molecular weight: 12.6 kDa) powder and hyaluronic acid (molecular weight: about 1,000,000) are put in sterile distilled water, and a magnetic stirrer is used. Thus, the powder was uniformly dissolved at 500 rpm and 4° C. for 6 hours.

그 결과, 20% (w/v) 플루로닉 F-127과 1.5% (w/v) 히알루론산을 포함하는 Pluronic/HA (PH) 혼합물 (용액)을 수득하였다. 수득된 PH 혼합물은 4℃에서는 용액 상태, 37℃에서는 젤 상태로 존재하는 온도감응성 혼합물이다.As a result, a Pluronic / HA (PH) mixture (solution) containing 20% (w / v) Pluronic F-127 and 1.5% (w / v) hyaluronic acid was obtained. The obtained PH mixture is a temperature-sensitive mixture that exists in a solution state at 4°C and a gel state at 37°C.

2-3. PH 혼합물 및 hFDM을 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물의 제조2-3. Preparation of temperature-sensitive PHE mixture comprising PH mixture and hFDM

본 실시예에서는, 상기 실시예 2-1 및 2-2에서 제조된, 균질화된 hFDM과 PH 혼합물을 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물을 제조하였다. In this example, a temperature-sensitive PHE mixture including the homogenized hFDM and PH mixture prepared in Examples 2-1 and 2-2 was prepared.

구체적으로, 4℃ 조건에서 상기 실시예 2-1 및 2-2에서 제조된 균질화된 hFDM과 PH 혼합물 (용액)을 혼합하여, hFDM의 최종농도를 달리하는 하기 표 1에 기재된 3 종류의 PHE 혼합물 용액을 제조하였다. Specifically, by mixing the homogenized hFDM and the PH mixture (solution) prepared in Examples 2-1 and 2-2 at 4° C., the three types of PHE mixtures described in Table 1 below with different final concentrations of hFDM A solution was prepared.

최종 농도 (%, w/v)Final concentration (%, w/v) 실시예 3Example 3 실시예 4Example 4 실시예 5Example 5 플루로닉 F-127Pluronic F-127 2020 2020 2020 히알루론산hyaluronic acid 1.51.5 1.51.5 1.51.5 hFDM hFDM 0.010.01 0.10.1 1One 증류수Distilled water up to 100up to 100 up to 100up to 100 up to 100up to 100

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 4℃ (구체적으로는 17℃ 이하)에서는 용액 상태의 하이드로겔 전구체 용액 상태였다가 37℃ (구체적으로는 32℃ 이상)에서는 젤 (구체적으로는 연고 형태의 제형) 상태의 하이드로겔 상태로 존재할 수 있는, 즉, 온도 변화에 따라 제형의 상 전이가 일어나는 온도감응성 연고형 하이드로겔 혼합물인, 온도감응성 Pluronic/HA/ECM (PHE) 혼합물을 완성하였다. As a result, as shown in Fig. 4a, at 4 ℃ (specifically, 17 ℃ or less), the hydrogel precursor solution was in a solution state, and at 37 ℃ (specifically, 32 ℃ or more), the gel (specifically, ointment form) Formulation) that can exist in a hydrogel state, that is, a temperature-sensitive ointment-type hydrogel mixture in which the phase transition of the formulation occurs according to temperature change, a temperature-sensitive Pluronic / HA / ECM (PHE) mixture was completed.

상기 PHE 혼합물은 주위 온도가 4℃ (구체적으로는 17℃ 이하)를 유지할 경우, 용액 상태의 하이드로겔 전구체 용액 상태로 존재할 수 있어 세포외기질의 적용, 제조, 보관, 또는 체외에서의 조작에 있어 편리성이 증가될 수 있다. 또한, 37℃ (구체적으로는 32℃ 이상) 에서는 젤 상태의 하이드로겔 상태 즉, 연고 형태의 제형으로 존재할 수 있어 상처에 직접 바를 수 있으며, 상처 부위에 안정적으로 고정되어 외부환경으로부터 보호 효과 및 습윤 효과를 유지하면서도 상처 부위로 활성물질인 세포외기질의 전달을 향상시켜 상처 치료 또는 조직 재생의 효과를 증가시킬 수 있다.The PHE mixture may exist in a solution state of a hydrogel precursor solution when the ambient temperature is maintained at 4 °C (specifically, 17 °C or less), so it is convenient for application, preparation, storage, or in vitro manipulation of the extracellular matrix sex may be increased. In addition, at 37°C (specifically, 32°C or higher), it can exist in a gel-state hydrogel state, that is, in the form of an ointment, so that it can be applied directly to the wound, and is stably fixed to the wound to provide a protective effect and wetness from the external environment. It is possible to increase the effect of wound healing or tissue regeneration by improving the delivery of the extracellular matrix, which is an active material, to the wound site while maintaining the effect.

실험예 2. hFDM을 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물 제형의 유동학적 분석Experimental Example 2. Rheological analysis of temperature-sensitive PHE mixture formulation containing hFDM

본 실험예에서는, 상기 실시예 2-3에서 제조된 hFDM을 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물 제형의 유동학적 분석을 위해, 레오미터기 (MCR102, Anton Paar)를 통해 온도 변화에 따른, 점도 변화를 측정하였다. 비교군으로 20% (w/v) 플루로닉 및 상기 실시예 2-2에서 제조된 PH 혼합물을 사용하였다. In this experimental example, for the rheological analysis of the temperature-sensitive PHE mixture formulation containing hFDM prepared in Example 2-3, the change in viscosity with the change of temperature was measured through a rheometer (MCR102, Anton Paar). . As a comparison group, 20% (w/v) pluronic and the PH mixture prepared in Example 2-2 were used.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 상온을 초과하는 온도 구간에서는 비교군 대비 PHE 혼합물의 점도가 전반적으로 더 낮은 수준임을 확인하였고, 또한 PHE 혼합물은 온도 상승에 따라 점차적으로 점도가 증가하여 36℃ 에서 가장 높은 수준의 점도를 가짐을 확인하였다. 구체적으로, 일반적인 피부 온도인 31℃ 및 그 이상의 온도에서 상기 PHE 혼합물의 점도는, 30 내지 80 파스칼초 (Pa·s)인 것으로 확인되었고, 32℃ 내지 40℃의 온도에서는, 45 내지 80 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖는 젤 상태의 하이드로겔 상태로 존재할 수 있음을 확인하였다. 이러한 PHE 혼합물의 점도는, 상온을 초과하는 온도 범위에서, 같은 온도에서의 비교군 대비 더 낮은 수준이나, 안정적인 연고 형태로 젤화되는데 적합한 수준임을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 4b, it was confirmed that the viscosity of the PHE mixture was generally lower than that of the comparative group in the temperature range exceeding room temperature, and the viscosity of the PHE mixture gradually increased as the temperature increased to 36 ° C. It was confirmed that it had the highest level of viscosity. Specifically, the viscosity of the PHE mixture at a temperature of 31° C. and higher, which is a general skin temperature, was found to be 30 to 80 Pascal seconds (Pa·s), and at a temperature of 32°C to 40°C, 45 to 80 Pascal seconds It was confirmed that it may exist in a gel state hydrogel state having a viscosity of (Pa·s). The viscosity of the PHE mixture was confirmed to be at a level suitable for gelation in the form of a stable ointment, although at a lower level than the comparative group at the same temperature in a temperature range exceeding room temperature.

반면, 비교군 (20% (w/v) 플루로닉, PH 혼합물)의 경우, PHE 혼합물 대비 상온을 초과하는 온도 구간에서 현저히 더 높은 수준의 점도를 나타내었다. 구체적으로, 일반적인 피부 온도인 31℃ 및 그 이상의 온도에서 20% (w/v) 플루로닉의 점도는, 119 내지 127 파스칼초 (Pa·s)인 것으로 확인되었고, PH 혼합물의 점도는 95 내지 109 파스칼초 (Pa·s)인 것으로 확인되었다. 또한, 비교군 (20% (w/v) 플루로닉, PH 혼합물)의 경우, 온도 상승에 따라 점도가 점차적으로 증가하는 것이 아니고, 특정 온도 구간에 이르면 점도가 최고 수준으로 수직 상승하는 양상을 보였다. 구체적으로, 20% (w/v) 플루로닉의 경우, 20 내지 27℃의 온도 구간에서는 점도가 최저 수준으로 거의 일정하게 유지되다가, 27 내지 28℃의 온도 구간에 이르면 점도가 최고 수준으로 수직 상승하였다. 마찬가지로, PH 혼합물의 경우, 20 내지 29℃의 온도 구간에서는 점도가 최저 수준으로 거의 일정하게 유지되다가, 29 내지 31℃의 온도 구간에 이르면 점도가 최고 수준으로 수직 상승하였다.On the other hand, in the case of the comparative group (20% (w / v) pluronic, PH mixture), it exhibited a significantly higher level of viscosity in the temperature range exceeding room temperature compared to the PHE mixture. Specifically, the viscosity of 20% (w / v) pluronic at a temperature of 31 ° C. and higher, which is a general skin temperature, was found to be 119 to 127 Pascal seconds (Pa s), and the viscosity of the PH mixture was 95 to It was confirmed to be 109 Pascal seconds (Pa·s). In addition, in the case of the comparative group (20% (w / v) pluronic, PH mixture), the viscosity does not increase gradually as the temperature rises, but when it reaches a specific temperature section, the viscosity rises vertically to the highest level. seemed Specifically, in the case of 20% (w / v) pluronic, the viscosity is maintained almost constant at the lowest level in the temperature range of 20 to 27 ℃, and reaches the temperature range of 27 to 28 ℃, the viscosity is vertical to the highest level rose. Similarly, in the case of the PH mixture, the viscosity was maintained almost constant at the lowest level in the temperature range of 20 to 29 °C, and then vertically increased to the highest level when the temperature range of 29 to 31 °C was reached.

이러한 결과는, 비교군 (20% (w/v) 플루로닉, PH 혼합물)의 경우, 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 즉시 또는 매우 짧은 시간 내에, 매우 높은 수준으로 점도가 증가하여, 활성물질이 피부에 흡수되기도 전에 젤화될 수 있으며, 이는 활성물질의 흡수를 방해할 수 있음을 지지한다. 또한, 상기 비교군의 특정 온도 이상에서의 젤화는 현저히 높은 수준의 점도를 갖는 제형을 만들 수 있고, 이러한 제형은 활성물질의 전달을 오히려 감소시킬 수 있고, 상처에 사용 시 사용감, 발림성 등의 측면에서 불편함을 초래할 수 있음을 지지한다.These results show that, in the case of the comparative group (20% (w/v) pluronic, PH mixture), when applied to a wound or wound site, immediately or within a very short time, the viscosity increases to a very high level, so that the active substance It may gel even before being absorbed into the skin, suggesting that this may interfere with the absorption of the active substance. In addition, gelation at a specific temperature or higher in the comparative group can make a formulation having a remarkably high level of viscosity, and this formulation can rather reduce the delivery of the active material, and aspects such as feeling of use and spreadability when used on a wound support that it may cause discomfort in

반면, PHE 혼합물의 경우, 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 점차적으로 점도가 증가되면서 젤화가 이루어질 수 있고, 젤화되는 동안 활성물질이 피부에 충분히 흡수될 수 있음을 지지한다. 또한, 너무 높지 않은 적당한 수준의 점도로 인해, 안정적인 연고 형태로 젤화되어, 상처에 사용 시, 안정적으로 고정되어, 외부환경으로부터 보호 및 습윤 효과를 유지하면서도, 활성물질의 전달을 더 증가시키고, 사용상의 편리성을 증가시킬 수 있음을 지지한다. On the other hand, in the case of a PHE mixture, when applied to a wound or wound site, gelation can be achieved while the viscosity is gradually increased, which supports that the active material can be sufficiently absorbed into the skin during gelation. In addition, due to a moderate level of viscosity that is not too high, it is gelled in the form of a stable ointment, and when used on a wound, it is stably fixed, while maintaining a protective and wetting effect from the external environment, and further increases the delivery of the active material, support that it can increase the convenience of

또한, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 상온, 예컨대 20℃ 내지 24℃의 온도 구간에서, PH 혼합물과 PHE 혼합물은 20% (w/v) 플루로닉 (구체적으로, 0.1 내지 2 파스칼초 (Pa·s))보다 더 높은 수준의 점도 (구체적으로, 5 내지 11 파스칼초 (Pa·s))를 나타내었다. 이러한 결과는, 상기 제조된 PHE 혼합물은 상온에서도 일정 수준의 점도가 유지되므로, 피부에 도포된 PHE 혼합물의 표면, 즉 피부와 접촉하지 않고 상온에 노출되는 표면은, 플루로닉과 달리, 흘러내리지 않고 더 안정적으로 형태를 유지할 수 있음을 지지한다.In addition, as shown in Figure 4c, at room temperature, for example, in a temperature range of 20 ° C. to 24 ° C., the PH mixture and the PHE mixture are 20% (w / v) pluronic (specifically, 0.1 to 2 Pascal seconds (Pa · s)) at a higher level of viscosity (specifically, 5 to 11 Pascal seconds (Pa·s)). As a result, since the prepared PHE mixture maintains a certain level of viscosity even at room temperature, the surface of the PHE mixture applied to the skin, that is, the surface exposed to room temperature without contact with the skin, unlike Pluronic, does not flow down It supports the ability to maintain the shape more stably without

본 실험예를 통해, 상기 제조된 PHE 혼합물은 온도 증가에 따라 안정적인 점도를 갖는 연고 형태의 제형으로 젤화될 수 있음을 확인하였다. 이로 인해, 상기 제조된 PHE 혼합물은 창상 또는 상처 부위에 적용 시, 안정적으로 고정되어, 외부환경으로부터 보호 및 습윤 효과를 유지하면서도 상처 부위로 활성물질인 세포외기질을 충분히 전달하여, 상처 치료 또는 조직 재생의 효과를 증가시킬 수 있음을 확인하였다.Through this experimental example, it was confirmed that the prepared PHE mixture can be gelled into an ointment-type formulation having a stable viscosity according to an increase in temperature. For this reason, the prepared PHE mixture is stably fixed when applied to a wound or wound site, and while maintaining the protection and wetting effect from the external environment, it sufficiently delivers the extracellular matrix, an active material, to the wound site, thereby treating wounds or tissues. It was confirmed that the effect of regeneration can be increased.

실험예 3. hFDM을 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물의 상처 치료능 및 조직 재생능 평가Experimental Example 3. Evaluation of wound healing and tissue regeneration ability of temperature-sensitive PHE mixture containing hFDM

3-1. 상처 치료능 평가3-1. wound healing ability

본 실험예에서는, hFDM을 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물의 상처 치료능을 평가하기 위해, 6 주 령의 마우스에 6 mm 직경의 전지층 창상 (full-thickness wound)을 유도한 후, hFDM을 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물을 환부에 주입하였다. In this experimental example, in order to evaluate the wound healing ability of a temperature-sensitive PHE mixture containing hFDM, a 6-mm-diameter full-thickness wound was induced in a 6-week-old mouse, followed by hFDM containing A temperature-sensitive PHE mixture was injected into the affected area.

구체적으로, 4 종류의 혼합물 즉, i) 비교예 (PH: 플루로닉 및 히알루론산을 포함하는, 상기 실시예 2-2에서 제조된 PH 혼합물); ii) 실시예 3 (PHE (0.01): 상기 PH 혼합물에 추가하여, hFDM을 0.01% 포함하는 PHE 혼합물); iii) 실시예 4 (PHE (0.1): 상기 PH 혼합물에 추가하여, hFDM을 0.1% 포함하는 PHE 혼합물); 및 iv) 실시예 5 (PHE (1): 상기 PH 혼합물에 추가하여, hFDM을 1% 포함하는 PHE 혼합물)를 제조하였다. 상기 4 종류의 혼합물에서 플루로닉과 히알루론산의 농도는 각각 20%와 1.5%로 동일하게 적용하였다. 그 후, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 연고 형태의 제형을 갖는 상기 4 종류의 혼합물 각각을 창상 부위에 적용한 후, 3, 7, 10, 14일차에 각각 상처 수복 정도를 관찰하여 각 실험군 사이에서의 치료 효능을 비교 평가하였다. Specifically, four types of mixtures, i.e., Comparative Examples (PH: PH mixture prepared in Example 2-2, including pluronic and hyaluronic acid); ii) Example 3 (PHE (0.01): PHE mixture comprising 0.01% hFDM in addition to the PH mixture); iii) Example 4 (PHE (0.1): PHE mixture comprising 0.1% hFDM in addition to the above PH mixture); and iv) Example 5 (PHE (1): PHE mixture containing 1% hFDM in addition to the above PH mixture) was prepared. The concentrations of pluronic and hyaluronic acid in the four types of mixture were equally applied to 20% and 1.5%, respectively. Then, as shown in Figure 5a, after applying each of the four types of mixtures having the formulation in the form of an ointment to the wound site, the degree of wound repair was observed on the 3rd, 7th, 10th, and 14th days, respectively, and there was a difference between each experimental group. The therapeutic efficacy was evaluated comparatively.

그 결과, 도 5b 및 5c에 나타낸 바와 같이, hFDM을 포함하는 PHE 혼합물을 적용한 경우, PH 혼합물을 적용한 경우 대비 더 빠른 창상 회복을 나타냄을 확인하였다. 특히, PHE (0.1) (실시예 4)을 적용한 경우, 10 일차까지 가장 빠른 회복률을 나타냄을 확인하였다.As a result, as shown in Figures 5b and 5c, when the PHE mixture containing hFDM was applied, it was confirmed that the wound recovery was faster than when the PH mixture was applied. In particular, when PHE (0.1) (Example 4) was applied, it was confirmed that the fastest recovery rate was exhibited until the 10th day.

3-2. 조직 재생능 평가3-2. Tissue regenerative ability evaluation

본 실험예에서는, hFDM을 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물의 조직 재생능을 평가하기 위해, 6 주 령의 마우스에 6 mm 직경의 전지층 창상을 유도한 후, 상기 실험예 3-1의 4 종의 혼합물 각각을 환부에 주입하고, 창상 부위 조직의 조직학적 특성을 비교 분석하였다.In this Experimental Example, in order to evaluate the tissue regeneration ability of the temperature-sensitive PHE mixture containing hFDM, after inducing a 6 mm diameter full-layer wound to a 6-week-old mouse, the four types of Experimental Example 3-1 Each of the mixtures was injected into the affected area, and histological characteristics of the wound site tissue were compared and analyzed.

구체적으로, 상기 실험예 3-1의 4 종의 혼합물 각각을 환부에 적용 후 14 일차에 각 환부의 창상 부위 조직을 확보하였다. 상기 확보된 조직에 대하여 파라핀 고정을 수행하여 매우 얇은 조직 절편을 수득하였다. 상기 조직 절편에 대하여 헤마톡실린-에오신 (Hematoxylin & Eosin, H&E) 염색을 수행하여 조직학적 특성을 비교 분석하였다.Specifically, on the 14th day after applying each of the four mixtures of Experimental Example 3-1 to the affected area, the wound site tissue of each affected area was obtained. Paraffin fixation was performed on the obtained tissue to obtain a very thin tissue section. Hematoxylin & Eosin (Hematoxylin & Eosin, H&E) staining was performed on the tissue sections to compare and analyze histological characteristics.

그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, 상기 4 종의 혼합물을 각각 적용한 실험군 대부분에서 표피와 진피의 재생이 확인되었다. 특히, PHE (0.1) (실시예 4) 또는 PHE (1) (실시예 5)을 적용한 실험군의 경우, 다른 실험군 대비, 신생혈관과 피부부속기관 (skin adnexa)의 재생이 더 뚜렷하게 관찰되었다.As a result, as shown in FIG. 5D , regeneration of the epidermis and dermis was confirmed in most of the experimental groups to which the mixtures of the four types were respectively applied. In particular, in the case of the experimental group to which PHE (0.1) (Example 4) or PHE (1) (Example 5) was applied, the regeneration of new blood vessels and skin adnexa was more distinctly observed compared to other experimental groups.

또한, 상기 4 종의 혼합물 각각을 적용한 각 창상 조직에 있어서, 재생된 표피 두께를 정량적으로 분석하였다. In addition, in each wound tissue to which each of the above four mixtures was applied, the regenerated epidermal thickness was quantitatively analyzed.

그 결과, 도 5e에 나타낸 바와 같이, PHE (0.1) (실시예 4) 또는 PHE (1) (실시예 5)을 적용한 경우, 다른 실험군 대비, 정상 조직의 표피 두께와 가장 유사한 수준으로 표피 재생이 이루어졌음을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 5e, when PHE (0.1) (Example 4) or PHE (1) (Example 5) was applied, compared to other experimental groups, epidermal regeneration was achieved at a level most similar to that of normal tissue. confirmed that it was done.

본 실험예를 통해, 다른 실험군 대비 hFDM을 0.1% 또는 1% 포함하는 PHE 혼합물을 적용한 실험군의 경우, 현저히 향상된 창상 회복 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, hFDM을 0.1% 포함하는 경우, hFDM을 1% 포함하는 경우 대비 더 개선된 창상 회복 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서 hFDM을 0.1% 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물 (실시예 4)이 창상 회복을 위한 최적의 제형이 될 수 있음을 확인하였다.Through this experimental example, it was confirmed that the experimental group to which the PHE mixture containing 0.1% or 1% of hFDM was applied compared to other experimental groups exhibited a significantly improved wound recovery effect. In particular, it was confirmed that when 0.1% of hFDM was included, a more improved wound recovery effect was exhibited compared to when 1% of hFDM was included. Therefore, it was confirmed that the temperature-sensitive PHE mixture (Example 4) containing 0.1% hFDM can be an optimal formulation for wound healing.

실험예 4. 균질 또는 비균질 hFDM을 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물의 상처 치료능 및 조직 재생능 평가Experimental Example 4. Evaluation of wound healing and tissue regeneration ability of temperature-sensitive PHE mixture containing homogeneous or heterogeneous hFDM

4-1. 상처 치료능 평가4-1. wound healing ability

본 실험예에서는, 균질 또는 비균질 (non-sonication) hFDM을 포함하는 온도감응성 PHE 혼합물의 상처 치료능을 비교 분석하였다. In this experimental example, the wound healing ability of the temperature-sensitive PHE mixture containing the homogeneous or non-sonication hFDM was comparatively analyzed.

구체적으로, 상기 실험예 3에 기재된 바와 동일하게 마우스에 전지층 창상을 유도하였다. 상기 창상 부위에, i) 비교예 (PHE-ns (0.1): 상기 실시예 2-1에 기재된 초음파 분산 처리를 수행하지 않은 비균질 hFDM을 0.1% 포함하는 PHE 혼합물) 또는 ii) 실시예 4 (PHE (0.1): 상기 실시예 2-1에 기재된 초음파 분산 처리를 수행하여 균질화 처리된 hFDM을 0.1% 포함하는 PHE 혼합물)를 각각 적용하여, 상기 실험예 3-1과 동일한 방식으로 실험 및 관찰하여 비교 분석하였다.Specifically, the battery layer wound was induced in the mouse in the same manner as described in Experimental Example 3 above. In the wound site, i) Comparative Example (PHE-ns (0.1): PHE mixture containing 0.1% of heterogeneous hFDM without ultrasonic dispersion treatment described in Example 2-1 above) or ii) Example 4 (PHE) (0.1): A PHE mixture containing 0.1% of hFDM homogenized by performing the ultrasonic dispersion treatment described in Example 2-1) was respectively applied, and compared by experimenting and observing in the same manner as in Experimental Example 3-1 analyzed.

그 결과, 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, PHE-ns (0.1) (비교예)를 적용한 경우 대비, PHE (0.1) (실시예 4)를 적용한 경우 더 빠른 창상 회복을 나타냄을 확인하였다.As a result, as shown in Figures 6a and 6b, compared to the case where PHE-ns (0.1) (Comparative Example) was applied, it was confirmed that faster wound recovery was exhibited when PHE (0.1) (Example 4) was applied.

4-2. 조직 재생능 평가4-2. Tissue regenerative ability evaluation

본 실험예에서는, 균질 또는 비균질 (non-sonication) hFDM을 포함하는 PHE 혼합물의 조직 재생능을 비교 분석하였다.In this experimental example, tissue regeneration ability of a PHE mixture containing homogeneous or non-sonication hFDM was comparatively analyzed.

구체적으로, 상기 실험예 3에 기재된 바와 동일하게 마우스에 전지층 창상을 유도하였다. 상기 창상 부위에 상기 실험예 4-1에서 적용된 것과 동일한 i) 비교예 (PHE-ns (0.1)) 또는 ii) 실시예 4 (PHE (0.1))를 각각 적용하였다. 그 후, 상기 실험예 3-2과 동일한 방식으로 창상 부위 조직을 확보 및 처리하여, 조직학적 특성을 분석하였다.Specifically, the battery layer wound was induced in the mouse in the same manner as described in Experimental Example 3 above. The same i) Comparative Example (PHE-ns (0.1)) or ii) Example 4 (PHE (0.1)) as applied in Experimental Example 4-1 was applied to the wound site, respectively. Thereafter, the wound site tissue was obtained and processed in the same manner as in Experimental Example 3-2, and histological characteristics were analyzed.

그 결과, 도 6c 및 6d에 나타낸 바와 같이, PHE-ns (0.1) (비교예)를 적용한 경우 대비, PHE (0.1) (실시예 4)를 적용한 경우 정상 조직의 표피 두께와 가장 유사한 수준으로 표피 재생이 이루어졌음을 확인하였다.As a result, as shown in FIGS. 6c and 6d, when PHE-ns (0.1) (comparative example) was applied, when PHE (0.1) (Example 4) was applied, the epidermis was at a level most similar to the epidermal thickness of normal tissue. It was confirmed that playback was made.

또한, H&E 염색한 조직의 일부분을 고 배율에서 촬영하여 육안으로 진피 내 신생혈관 재생을 확인하였고, 고 배율로 촬영한 사진 내의 신생혈관 면적과 그 수를 기반으로 신생혈관 밀도를 계산하여 정량적으로 진피 내 신생혈관 재생을 평가하였다. In addition, a part of the H&E-stained tissue was photographed at high magnification to visually confirm the regeneration of new blood vessels in the dermis, and the density of new blood vessels was quantitatively calculated based on the area and number of new blood vessels in the photograph taken at high magnification to quantitatively determine the dermis. My neovascularization was assessed.

그 결과, 도 6e 및 6f에 나타낸 바와 같이, PHE-ns (0.1) (비교예)를 적용한 경우 대비, PHE (0.1) (실시예 4)를 적용한 경우 신생혈관 재생이 더 증가하여, 더 효과적인 창상 회복이 나타났음을 확인하였다. As a result, as shown in Figures 6e and 6f, compared to the case where PHE-ns (0.1) (comparative example) was applied, when PHE (0.1) (Example 4) was applied, neovascularization was more increased, resulting in a more effective wound It was confirmed that recovery appeared.

본 실험예를 통해, PHE 혼합물이 같은 농도로 hFDM을 포함하는 경우라도, 상기 포함된 hFDM이 초음파 분산에 의해 균질화되었는지에 따라 창상 회복 효과가 달라질 수 있음을 확인하였다. 즉, 초음파 분산에 의해 균질화된 hFDM을 포함하는 PHE 혼합물이 더 우수한 창상 회복 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.Through this experimental example, it was confirmed that even when the PHE mixture includes hFDM at the same concentration, the wound recovery effect may vary depending on whether the included hFDM is homogenized by ultrasonic dispersion. That is, it was confirmed that the PHE mixture containing hFDM homogenized by ultrasonic dispersion can exhibit a better wound healing effect.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

Claims (12)

폴록사머 (poloxamer), 히알루론산 (hyaluronic acid), 및 탈세포화된 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)의 혼합물을 포함하는 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물로서,
상기 조성물은 상기 폴록사머를 15 중량% 내지 25 중량%, 상기 히알루론산을 1 중량% 내지 2 중량%, 및 상기 탈세포화된 세포외기질을 0.001 중량% 내지 1 중량% 포함하고,
상기 조성물은 상온의 주위 온도에서, 5 내지 14 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖고, 31℃ 내지 40℃의 주위 온도에서, 30 내지 80 파스칼초 (Pa·s)의 점도를 갖는 것인, 상처 치료 또는 조직 재생용 조성물. As a composition for wound treatment or tissue regeneration comprising a mixture of poloxamer, hyaluronic acid, and decellularized extracellular matrix (ECM),
The composition comprises 15% to 25% by weight of the poloxamer, 1% to 2% by weight of the hyaluronic acid, and 0.001% to 1% by weight of the decellularized extracellular matrix,
wherein the composition has a viscosity of 5 to 14 Pascal seconds (Pa·s) at ambient temperature at room temperature and a viscosity of 30 to 80 Pascal seconds (Pa·s) at an ambient temperature of 31°C to 40°C. , a composition for wound healing or tissue regeneration. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은, 상기 폴록사머 및 상기 히알루론산을 물에 용해하고 혼합하는 제 1 단계; 및 상기 제 1 단계에서 수득된 혼합물과 상기 탈세포화된 세포외기질을 혼합하는 제 2 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 조성물로서,
상기 각 단계는 주위 온도가 3℃ 내지 17℃인 조건에서 수행되는 것인, 조성물.The method according to claim 1, wherein the composition, the first step of dissolving and mixing the poloxamer and the hyaluronic acid in water; And as a composition prepared by a method comprising a second step of mixing the mixture obtained in the first step and the decellularized extracellular matrix,
Wherein each of the steps is carried out under the condition that the ambient temperature is 3 ℃ to 17 ℃, the composition. 삭제delete 삭제delete 청구항 1에 있어서, 상기 폴록사머는 플루로닉 (Pluronic)인 것인, 조성물.The composition of claim 1, wherein the poloxamer is Pluronic. 청구항 1에 있어서, 상기 탈세포화된 세포외기질은 인 비트로에서 배양된 세포로부터 수득된 것인, 조성물.The composition of claim 1, wherein the decellularized extracellular matrix is obtained from cells cultured in vitro. 청구항 6에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포, 연골세포, 조골세포, 혈관내피세포, 근세포, 평활근세포, 간세포, 신경세포, 심근세포, 척추 추간판세포, 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물. The method according to claim 6, wherein the cell is one selected from the group consisting of fibroblasts, chondrocytes, osteoblasts, vascular endothelial cells, myocytes, smooth muscle cells, hepatocytes, neurons, cardiomyocytes, spinal disc cells, and mesenchymal stem cells. More than that, the composition. 청구항 1에 있어서, 상기 탈세포화된 세포외기질은 인간 폐 섬유아세포 유래의 탈세포화된 세포외기질 (Human lung fibroblast-derived matrix, hFDM)인 것인, 조성물.The method according to claim 1, wherein the decellularized extracellular matrix is human lung fibroblast-derived decellularized extracellular matrix (Human lung fibroblast-derived matrix, hFDM), the composition. 청구항 1에 있어서, 상기 탈세포화된 세포외기질은 초음파 분산 방식에 의해 균질화된 세포외기질인 것인, 조성물.The composition of claim 1, wherein the decellularized extracellular matrix is an extracellular matrix homogenized by an ultrasonic dispersion method. 청구항 1에 있어서, 상기 탈세포화된 세포외기질은 신생혈관형성 관련 성장 인자를 포함하는 것인, 조성물.The composition of claim 1, wherein the decellularized extracellular matrix comprises angiogenesis-related growth factors. 삭제delete 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 창상 회복 효과, 상처 치료 효과, 조직 재생 효과, 표피 재생 효과, 진피 재생 효과, 신생혈관 재생 효과, 또는 피부부속기관 재생 효과를 나타내는 것인, 조성물.The composition of claim 1, wherein the composition exhibits a wound healing effect, a wound healing effect, a tissue regeneration effect, an epidermal regeneration effect, a dermal regeneration effect, an angiogenic regeneration effect, or a skin accessory organ regeneration effect.
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