KR102414947B1 - 복숭아에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 세트; 상기 프라이머 쌍을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 키트; 및 복숭아 곰팡이 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명은 다양한 지역에서 채취한 복숭아 나무로부터 5종의 곰팡이를 분리 동정하였으며, 직접 확보한 5종의 복숭아 곰팡이 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 진단의 정확성을 높일 수 있는바, 복숭아 곰팡이 진단, 무병묘 복숭아 묘목 개발 및 복숭아 나무 및 과실의 피해 예방에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 다양한 지역에서 채취한 복숭아 나무로부터 5종의 곰팡이를 분리 동정하였으며, 직접 확보한 5종의 복숭아 곰팡이 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 진단의 정확성을 높일 수 있는바, 복숭아 곰팡이 진단, 무병묘 복숭아 묘목 개발 및 복숭아 나무 및 과실의 피해 예방에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 세트; 상기 프라이머 쌍을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 키트; 및 복숭아 곰팡이 진단 방법에 관한 것이다.
복숭아 (Prunus persica (L.) Batch)는 장미과(The family Rosaceae), 벚나무속(The genus Prunus)에 속하는 과실나무이다. 전세계적으로 복숭아는 살구, 매실, 자두, 체리와 더불어 인기가 많은 핵과류(Stone fruits) 중의 하나이며, 복숭아 과실은 주로 신선한 과일 또는 캔으로 가공되어 소비된다. 현재 국내에는 다양한 종류의 수입 과일들이 대량으로 수입되어 소비되고 있으며, 기존 국내에서 생산되고 있는 많은 과일들을 대체하고 있다. 하지만 복숭아의 경우 저장의 어려움으로 인해 수입이 불가하여, 국내에서 재배되고 있는 복숭아 과실들은 수입과일과 비교하여 여름철에 좋은 경쟁력을 가지고 있다. 국내에서 재배되고 있는 복숭아 품종은 매우 다양하며, 주로 7월부터 10월까지 생산되고 있다. 그러나, 다양한 병원성 균들과 해충들이 복숭아 나무 재배에 많은 경제적 피해를 주고 있다. 그 중에서도 곰팡이병은 복숭아의 수확량뿐만 아니라 복숭아 품질에 악영향을 주고 있어, 곰팡이병을 예방하거나 조절할 수 있는 방법들에 대한 개발이 필요하다.
한편, 대부분의 복숭아 품종들은 영양번식(Clonal propagation) 방법인 접목(Grafting)을 통해 번식 및 재배되고 있다. 하지만 복숭아 나무들은 영양번식 작물들의 특징 중의 하나인, 바이러스, 세균, 곰팡이들을 비롯한 다양한 병원성 미생물에 의해 심각하게 감염되어있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 최근에는 농촌진흥청을 비롯한 국가연구기관들을 중심으로 주요 병원성 미생물에 대한 진단 방법들이 개발되었고, 알려진 병원성 미생물에 대한 진단법을 토대로 무병묘 복숭아 묘목들이 개발되고 있다. 최근까지 복숭아 나무에 병을 일으키는 다양한 종류의 곰팡이균들이 동정되었다. 대표적인 복숭아 감염 곰팡이로는 잿빛무늬병(brown rot)을 일으키는 Monilinia fructicola와 M. laxa가 있으며, gray mold (Botrytis cinerea), Alternaria spp., Aspergillus spp., Cladosporium spp.와 blue mold (Penicillium spp.)들이 복숭아 과실에 곰팡이병을 자주 일으키는 것으로 알려져있다. 또한 복숭아 과수원의 토양에는 주로 붉은 곰팡이 종(Fusarium species)들이 많이 있는 것으로 알려져있다. 다양한 복숭아 곰팡이 병 중에서도 잿빛무늬병을 일으키는 M. fructicola의 경우 복숭아 과실 생산에 많은 피해를 주고 있으며, 특히 겨울철에 미라화된(mummified) 복숭아 과실에 살아남아 꽃과 어린 슈트(shoot)를 감염시킬 수 있는 포자들을 생산한다.
최근 차세대염기서열분석(Next-generation sequencing; NGS) 기술의 빠른 발달로 인해 이를 이용하여 곰팡이를 비롯한 다양한 미생물의 유전체, 전사체 정보의 확보 및 미생물 동정 등을 손쉽게 할 수 있게 되었다. 특히 NGS와 생물정보학 분석을 통해 새롭게 분리된 곰팡이균의 정확한 동정이 가능하며, 관련 유전자 정보등을 손쉽게 확보할 수 있다.
정확한 곰팡이 동정은 곰팡이병을 예방하는데 매우 중요하다. 곰팡이병을 진단하는 가장 일반적인 방법으로는 곰팡이균 배양을 통한 방법이 있다. 이 방법의 경우 특이적인 배지에 자라는 곰팡이로부터 DNA를 추출한 후, 곰팡이 특이적인 internal-transcribed-space (ITS) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한다. 증폭된 PCR 산물은 클로닝(Cloning)과 Sanger-sequencing을 통해 염기서열을 결정하고, 새롭게 결정된 ITS 염기서열은 BLAST를 이용해 기존 곰팡이 ITS 데이타베이스에 유전자 서열을 비교한 후 새롭게 동정된 곰팡이 균의 종을 결정한다. 그러나, ITS 프라이머를 이용한 방법의 경우 곰팡이 종을 동정하는데 많은 시간이 걸리며, 때때로 식물기주에서도 ITS 유전자 부분이 증폭되기 때문에 곰팡이 진단에 많은 어려움이 있다. 따라서, 곰팡이를 효과적으로 진단하기 위해서는 곰팡이 종 특이적 유전자들을 이용한 진단방법 개발이 필수적이다.
이에, 본 발명의 발명자들은 복숭아 감염 곰팡이의 진단 및 모니터링, 나아가 무병묘 복숭아 묘목 개발 및 복숭아 나무 및 과실의 피해 예방에 활용하고자, 다양한 지역에서 채취한 복숭아 나무로부터 5종의 곰팡이를 분리 동정하여, 5종의 복숭아 곰팡이 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다.
본 발명에서 용어 "복숭아 곰팡이"는 복숭아에 나타나는 질병의 원인이 되는 곰팡이를 총칭하는 것으로, 예컨대 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 및 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum) 등을 모두 포함하는 것일 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명에서는 다양한 지역에서 채취한 복숭아 나무로부터 5종의 복숭아 곰팡이인 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 및 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)을 동정하였다. 구체적으로, 동정된 곰팡이의 베타-튜불린(beta-tubulin) 유전자를 확보하여 이를 바탕으로 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 세트를 제작하였다.
본 발명에서 복숭아 곰팡이 진단용은 복숭아 곰팡이 검출용을 의미한다.
본 발명에서 상기 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머는 PCR용 프라이머 쌍을 의미한다. 본 발명의 프라이머 쌍은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하며, 구체적으로는 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma)를 진단할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina)를 진단할 수 있는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi)를 진단할 수 있는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola)를 진단할 수 있는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)을 진단할 수 있는 서열번호 9 및 서열번호 10을 진단할 수 있는 프라이머 쌍을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 복숭아 나무의 줄기, 잎, 과실로부터 동정한 5종의 복숭아 곰팡이 각각에서 베타-튜불린(beta-tubulin) 유전자 정보를 확보하여, 이를 바탕으로 PCR 방법을 이용해 각 곰팡이를 특이적으로 정확하게 진단할 수 있는 프라이머 세트를 디자인하였다.
구체적으로, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍은 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma)의 베타-튜불린 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍이고, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍은 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina)의 베타-튜불린 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍이고, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍은 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi)의 베타-튜불린 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍이고, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍은 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola)의 베타-튜불린 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍이며, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍은 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)의 베타-튜불린 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 및 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 조성물 및 이를 포함하는 복숭아 곰팡이 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로는 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트를 사용할 경우, 1회 PCR 반응 조건에서 실시하여도 검체 내에 존재하는 5종의 복숭아 곰팡이를 한번에 진단할 수 있다.
상기 조성물 및 키트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍과, 추가로 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적 상 상기 키트에서 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로 DNA 폴리머라제(polymerase), dNTPs, Taq 중합효소 및 PCR 완충액 등을 포함할 수 있으며, 또한 PCR 산물의 증폭 여부를 확인하기 위해 전기영동(electrophoresis)의 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 나아가, 필요한 경우 RNase 억제제, DEPC-water 및 멸균수 등이 포함될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 시료로부터 복숭아 곰팡이 핵산을 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 제1항의 프라이머 쌍을 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 시료는 본 발명의 복숭아 곰팡이 존재 여부를 확인하기 위해 필요한 핵산, 구체적으로는 RNA를 추출하기 위한 미지의 물질을 의미하는 것으로, 예컨대 상기 바이러스가 감염된 복숭아 나무의 잎, 줄기, 과실, 뿌리 등을 포함할 수 있으며, 그밖에도 식품, 천연물(예컨대, 물) 또는 생물학적 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 표적 핵산을 증폭하는 단계는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 수행할 수 있으며, 구체적으로 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, PCR 조건으로 94℃에서 3분, 이어서 94℃에서 20초, 60℃에서 40 초 (어닐링 온도는 모든 프라이머에서 동일함), 및 72℃에서 40초 동안 35회 사이클이었으며, 72℃에서 5분 동안 최종 신장(final extension)하였다.
상기 (c) 단계에서 증폭된 표적 핵산의 검출은 모세관 전기영동(capillary electrophoresis), DNA 칩, 겔 전기영동(gel electrophoresis), 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, 증폭된 PCR 산물을 겔 전기 영동에 이어 EtBr 염색으로 확인하였으며, 나아가 pGEM-T-Easy Vector(Promega, Wisconsin, US)에서 증폭된 PCR 산물을 클로닝 한 후 Sanger 시퀀싱하여 증폭된 PCR 산물의 서열을 확인하였다.
본 발명은 다양한 지역에서 채취한 복숭아 나무로부터 5종의 곰팡이를 분리 동정하였으며, 직접 확보한 5종의 복숭아 곰팡이 각각에 선택적, 특이적으로 결합 가능한 프라이머 쌍을 설계하여 진단의 신속성 및 정확성을 높일 수 있는바, 복숭아 곰팡이 진단, 무병묘 복숭아 묘목 개발 및 복숭아 나무 및 과실의 피해 예방에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 5 종의 복숭아 곰팡이로부터 추출한 DNA, template 및 디자인한 곰팡이 특이적 프라이머를 사용하여 얻어진 증폭된 PCR 산물을 1% 아가로스젤 전기영동을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100 bp DNA 마커를 나타내고, 1번부터 5번 레인은 각각 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 및 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)을 나타내며, 화살표는 곰팡이 특이적 프라이머로부터 증폭된 PCR 산물을 표시한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 복숭아 곰팡이 연구를 위한 샘플 수집 및 곰팡이 분리 동정
복숭아 감염 곰팡이를 식별하고자, 5개 지역(경북 상주, 전북 전주, 전남 장성, 전북 완주 및 경기도 장호원)에서 줄기마름병, 줄기썩음병, 잿빛무늬병 또는 역병 증상을 보이는 복숭아 줄기들을 수집하였다. 수집된 샘플에서 총 5종의 곰팡이 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 및 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)을 분리 동정하였고(표 1), 이렇게 분리 동정된 곰팡이들은 total RNA 추출에 사용하였다.
균주번호 | 기주식물 | 분리지역 | 곰팡이 | 병징 |
18-484 | 복숭아 | 경북 상주 | Cytospora leucostoma | 줄기마름병 |
19-016 | 복숭아 | 전북 전주 | Macrophomina phaseolina | 줄기썩음병 |
19-168 | 복숭아 | 전남 장성 | Diaporthe helianthi | 줄기마름병 |
19-382 | 복숭아 | 전북 완주 | Monillinia fructicola | 잿빛무늬병 |
19-435 | 복숭아 | 경기도 장호원 | Phytophthora cactorum | 역병 |
실시예 2: Total RNA 추출 및 라이브러리 제작
분리 동정된 5종의 각 곰팡이들을 potato dextrose agar (PDA)배지에서 28°C에서 키운 후 곰팡이 균사체(mycelia)를 수확하여 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출한 총 RNA를 기초로 Illumina사의 TruSeq RNA Library Prep Kit v2를 이용하여 라이브러리를 제작하였다. 제작된 라이브러리는 Illumina사의 NovaSeq6000 시스템을 이용하여 paired-end (100bp X 2) sequencing을 수행하였다.
실시예 3: 전사체 조립 및 곰팡이 식별
각 곰팡이로부터 얻어진 raw sequence data는 Trinity 프로그램에서 전사체 조립을 위해 사용되었다. 각 곰팡이별로 조립된 콘티그(contigs)를 확인하기 위해, NCBI의 non-redundant (NR) 단백질 데이터베이스에서 DIAMOND 프로그램을 이용해 BLAST를 수행하였다. MEGAN6 프로그램을 이용해 BLAST결과를 분석하여 5종 곰팡이의 정확한 종을 확인하였다.
실시예 4: 복숭아 곰팡이의 베타-튜불린(beta-tubulin) 유전자 동정
BLAST 결과를 이용하여 각 곰팡이별로 베타-튜불린 유전자를 동정하였다. 그 결과, 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 및 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)의 베타-튜불린 유전자는 각각 서열번호 11 내지 15인 것으로 확인되었다. 각 곰팡이 전사체로부터 동정된 beta-tubulin partial 유전자의 크기는 1,672 bp에서 2,427 bp 이었으며, 각 beta-tubulin 유전자 서열을 가지고, NCBI nucleotide 데이터베이스에 BLASTN를 수행하였다(표 2).
균주번호 | Size (bp) | Description | Query Cover | E value | Identity | Accession No. |
18-484 | 2,427 | Cytospora sp. CN-2019b strain MFLUCC 18-1226 | 40.00% | 0 | 98.38% | MH986791.1 |
19-016 | 1,705 | Paracoccidioides brasiliensis strain Pb18 | 73.00% | 0 | 77.29% | XM_010759883.1 |
19-168 | 2,050 | Colletotrichum scovillei strain TJNH1 | 65.00% | 0 | 92.42% | XM_035477032.1 |
19-382 | 1,767 | Botrytis cinerea strain B05.10 | 99.00% | 0 | 93.72% | XM_024690731.1 |
19-435 | 1,672 | Phytophthora parasitica strain INRA-310 | 99.00% | 0 | 90.37% | XM_008912133.1 |
수행결과 Cytospora leucostoma의 경우 40%의 낮은 coverage로 기존 Cytospora sp.과 유사성을 보여주었다. Macrophomina phaseolina는 Paracoccidioides brasiliensis와 73% coverage와 77.29% 염기서열 identity를 보여주었다. Diaporthe helianthi 의 경우 Colletotrichum scovillei 와 65%의 낮은 coverage를 보여주었다. Monillinia fructicola와 Phytophthora cactorum는 각각 Botrytis cinerea와 Phytophthora parasitica에 99%의 높은 염기서열 coverage를 보여주었지만, 염기서열의 identity는 93.72%와 90.37%로 밝혀졌다. 이 결과들을 보았을 때 본 연구에서 동정된 곰팡이는 기존 곰팡이와 매우 다른 것을 알 수 있었으며, 특히 5종 곰팡이로 동정된 beta-tublin 유전자 정보가 현재 NCBI GenBank 데이터베이스에 전혀 없다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 5종 복숭아 곰팡이의 특이적 진단을 위한 PCR 프라이머 개발
5종 복숭아 곰팡이 전사체 분석을 통해 각 곰팡이별로 베타-튜불린(Beta-tubulin) 유전자들을 동정하여 유전자서열을 확보하였다. 확보된 베타-튜불린 유전자 서열을 바탕으로 각 곰팡이를 특이적으로 진단할 수 있는 PCR 프라이머를 디자인하였다. 5종의 곰팡이들을 하나의 PCR 반응을 통해 진단할 수 있는 Multiplex PCR을 위해 증폭되는 PCR 산물의 길이를 서로 다르게 하여 다양한 프라이머들을 디자인하였다.
곰팡이로부터 추출한 DNA를 template과 상기 디자인된 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과를 바탕으로 각 곰팡이 특이적으로 증폭되는 프라이머를 최종적으로 선발하였다.
PCR 반응을 수행하기 위해, 50 ml PCR 튜브에 DNA template 1 μL, Forward primer (10 pmol/ul) 1 μL, Reverse primer (10 pmol/ul) 1 μL, 10 X Buffer 3 μL, dNTP (2.5 mM) 4 μL, EX-Taq 0.5 μL를 넣고 최종적으로 증류수로 최종 볼륨을 30 μL로 맞췄다. Genomic DNA의 경우 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하였다. PCR은 Solg 2X Multiplex PCR Series (SolGent, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 곰팡이 PCR 조건은 94℃ 에서 3분, 이어서 94℃에서 20초, 60℃에서 40초 (어닐링 온도는 모든 프라이머에서 동일함), 및 72℃에서 40초 동안 35 사이클이었으며, 72℃에서 5분 동안 최종 신장(final extension)하였다.
증폭된 PCR 결과물들은 전기 영동 후 EtBr 염색을 통해 확인하였다(도 1). PCR 수행 결과 각 곰팡이 특이적 프라이머들은 타겟 곰팡이에서만 PCR 증폭산물(amplicon)을 나타내었다. 또한 증폭된 PCR 산물 사이즈는 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma) 100 bp, 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina) 549 bp, 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi) 200 bp, 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola) 300 bp, 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum) 400 bp로 나타났다. 추가적으로 증폭된 모든 PCR 산물들을 pGEM-T-Easy Vector (Promega, Wisconsin, US)에서 클로닝 한 후 Sanger 시퀀싱하여 증폭된 PCR 산물의 서열을 확인하였다. 곰팡이 특이적 프라이머로 증폭된 베타-튜불린 유전자의 partial 염기서열은 서열번호 16 내지 20에 나타내었다.
최종적으로, PCR 결과를 바탕으로 선발된 복숭아 곰팡이 특이적 프라이머를 아래 표 3에 나타내었다.
곰팡이 | 프라이머 이름 | 5'-프라이머 서열-3' | PCR 산물 크기 | 서열번호 |
Cytospora leucostoma | 18-484-tub-F2 | CCAAGGGTCTCAAGATGTCC | 100 | 1 |
18-484-tub-R2 | CGACGGAACATAGCACTGAA | 2 | ||
Macrophomina phaseolina | 19-016-tub-F1 | ATCGCATGATGGCTACGTTT | 549 | 3 |
19-016-tub-R1 | TTCGACCTCCTTTGTGGAAA | 4 | ||
Diaporthe helianthi | 19-168-tubb-F2 | TCTTTTCTCCCAGACCCAGA | 200 | 5 |
19-168-tubb-R2 | AGGTTGGACGACGCTATTGT | 6 | ||
Monilinia fructicola | 19-382-tub-F3 | TTGAGTGGATCCCTAACAACG | 300 | 7 |
19-382-tub-R3 | GGGCCTCCTCTTCATACTCC | 8 | ||
Phytophthora cactorum | 19-435-tub-F3 | CACGCTAGCCTTGATGTTGT | 400 | 9 |
19-435-tub-R3 | CACCTACGGTGACCTGAACC | 10 |
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> Primer sets for diagnosing five fungi infecting peach and
diagnostic methods using thereof
<130> KPA01554
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18-484-tub-F2
<400> 1
ccaagggtct caagatgtcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18-484-tub-R2
<400> 2
cgacggaaca tagcactgaa 20
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<211> 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19-016-tub-R1
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19-168-tubb-R2
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aggttggacg acgctattgt 20
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ttgagtggat ccctaacaac g 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19-382-tub-R3
<400> 8
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19-435-tub-F3
<400> 9
cacgctagcc ttgatgttgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 19-435-tub-R3
<400> 10
cacctacggt gacctgaacc 20
<210> 11
<211> 2427
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Cytospora leucostoma_18-484_beta-tubulin
<400> 11
ccacctccag accggccaat gcggtaacca aatcggtgct gctttctggt gcgtaccagc 60
cttcgaccac ggcagcaaac gatacgcgac agtaatcatg tcgaaggatt gaaactgacc 120
ccgattaaac aggcaaacca tctctggcga gcacggtctc gacagcaatg gagtttacaa 180
cggcacttct gagctccagc tggagcgcat gaacgtctac ttcaacgagg cttccggcaa 240
caagtatgtt cctcgcgctg tcctcatcga tctcgagccc ggtaccatgg acgccgtccg 300
tgccggtcct ttcggccagc tgttccgtcc cgacaacttc gttttcggcc agtccggtgc 360
tggaaacaac tgggccaagg gtcactacac tgagggtgcg gagctggtcg accaggtcct 420
ggatgtcgtc cgtcgcgagg ctgagggttg cgactgcctg cagggcttcc agatcaccca 480
ctccctgggt ggtggtaccg gtgccggtat gggtactctg ctcatctcca agattcgcga 540
ggagttcccc gaccgcatga tggctacctt ctccgtcatg ccctctccca aggtctccga 600
caccgtcgtt gagccctaca acgccaccct ctccgtccac cagctggtcg agaactcgga 660
cgagactttc tgtatcgaca acgaggccct ctacgacatt tgcatgcgga cgctgaagct 720
gtccaacccc tcttacggtg accttaacta cctggtgtcg gctgtcatgt ccggcgtcac 780
cgtctcgctg cgtttccccg gtcagctgaa ctctgacctc cgcaagctgg ctgtgaacat 840
ggtgccgttc cctcgtctgc acttcttcat ggttggcttc gctcccctga ccagccgtgg 900
cgcccactcc ttccgcgctg tcaccgtccc tgagctcacc cagcagatgt tcgaccccaa 960
gaacatgatg gctgcgtctg acttccgtaa cggtcgctac ctgacgtgct ctgccatctt 1020
gtgagtcctc ccgcccccaa gtgtctctat ccgtgcttgt ggtgctaatt atgtttccag 1080
ccgtggcaag gtctccatga aggaggttga ggaccagatg cgcaacgtcc agagcaagaa 1140
ctcgtcctac ttcgtcgagt ggatccccaa caacgtccag accgccctct gctctattcc 1200
ccccaagggt ctcaagatgt cctcgacctt cgttggtaac tcgactgcta tccaggagct 1260
gttcaagcgt gtcggcgagc agttcagtgc tatgttccgt cgcaaggctt tcttgcattg 1320
gtacactggt gagggtatgg acgagatgga gttcaccgag gctgagtcca acatgaacga 1380
tcttgtctcg gaataccagc agtaccagga tgccagcatc gacgaggagg aggaggagta 1440
cgaggaggag gctccccttg aggaggagtg aactatggtg tgattaaaaa gtgtttcccg 1500
gcggtcttga tggccaagga cctatgtcca taatttgtca ccttgggtac ccacggcact 1560
tcccgcatgt attctgcttg tgtgggttgt gtgtcacgtt tgcgtgggta gctatgcgat 1620
ccggagatgg gttctggtaa tcgattggcc gtatgaacaa agggacacaa cattgatttg 1680
aaatatacct cttgtagttg accctttacc acgaatacaa aatcggacaa agccgtccac 1740
atgatagccc caagcgtgtg tgatacaata tcagtagtaa cgatttgcca aacagaggcc 1800
aagattgtct taatccactt gcttgagtcc ataccacagg ggaccttgca ccgcctcttc 1860
tacgtaggta ttgcaggtaa tcctagggca gtgcagttga ctttgatagt cgcttgaggc 1920
tggtagtatg ttccactatc gtgatctagc ccatggcacc cacaactggt caaggagagg 1980
ctgaaaggca tcgccgactt tcagcggcag gcggccgacc agcggcgtaa actggaaatg 2040
tagattgtgc gcgaggtcac ccgagatcaa aatctcatgc tgatcagcgt atcaggcgcc 2100
tattaagcgc tatagtgact gactgactgc accgatatgt agtaggtagg taggcccagc 2160
ccaccttagg gacagattac aggcaccgaa ccggatacct actaagtcgt caggtatgta 2220
atgtgtgaat ctgtgtgggc ttcacatagg ctaagttagg tagtgtagat aagcggcaag 2280
gaggatgcgg cattgccatg cgttgatcaa taaatcctcc tagtcactca tctttccccc 2340
ttctgttata gatctgatgt aagcgctgaa ggaggtgaga ggcagcctgc gtgtcagttt 2400
tcttacggta tagtgtatgc gtgtgac 2427
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<212> DNA
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cgtctgcaac caatttgcgc tgtccacctc acagaaccca caacagacgt gatcaattcg 60
tcacccgctg ccaatatgcg cgagattatc catgttcagg ctggccaatg tggtaaccaa 120
atcggatctg ctttctggca gacgatctgc aaagagcatg gtgtcgatag ctctggaaac 180
tacaacggca catcggatct ccaactcgag cgcatgaatg tctatttcaa tgagccttcg 240
agcaagaaat tcgtaccccg cgccgtgctc gttgatcttg aacccggcac catggatgcc 300
gttcgtgccg gcccagctgg acggctcttc cgccccgaca attttgtttt cgggcagtct 360
ggagccggaa acaactgggc aaaaggccat tacaccgaag gcgctgagct ggtggatcag 420
gttcttgatg ttgtgcgccg ggagtccgaa ggttgcgatt ccctgcaagg gtttcaaatc 480
actcattcgt tgggcggcgg cactggctcc ggcatgggca ccttgctcac ggctaagatt 540
cgggaagagt ttccggatcg catgatggct acgttttcgg tcatgccttc gccgaaggtg 600
tccgaggtcg ttgttgagcc ctacaatgct actctgtcga ttcatgagtt ggttgaaaat 660
gccgatgaga cgttctgcat cgacaacgag gcgctgtatg atatctgtag gcgcacgctc 720
aaactcgacc atccatcgta cggagatctc aactcgctcg tgtccaccgt catgtccggc 780
gtcaccaccg gcttccgctt tcctggccaa ctcaattcag atctccggaa actggccgtg 840
aacatggtcc cgtttcctcg tcttcacttc tttacggttg gctttgcgcc tctcacggcc 900
cgcggtggca gctcattccg caattcatcc gtgtcagact tgacgcagca actgttcgac 960
ccaaggaaca tgatggccgc cgccgacttc cggaatggca ggtacttgac gtgctcgact 1020
ttcttccgtg gcaacgtttc cacaaaggag gtcgaagatc aaatgatcaa gttgcaagac 1080
aagaactctt cctatttcgt cgaatggatt ccgaacaatt tccaaaccgc cgtgtgctcc 1140
gtccccccgc caggcttgaa aatgtctgcc acctttgttg ggaataccac ttctattcag 1200
gagctcttca agcgtgtcgg agatcagttc actgccatgt tccgccgcaa agccttcttg 1260
cattggtata ccgccgaagg aatggacgag atggaattca cggaggcaga gtccaatatg 1320
aatgatctcg tggcggagta tcagcagtac caggaggcct cgatcagcga caccgaagac 1380
tacgatgagg aagctccatt ggaagaggag gaggagtgag gaagtgtacg acaaacgtta 1440
ctctgattgt ctgtcgtcat ttgttgcatc tttgagaaga caagaaccat atagcgtacc 1500
actagcgaat catcattgaa ttgcgccaac gtatcacctc attcatctcg ttgaccatga 1560
tccgtcctat gtacctattc aaacttcaaa ttgggcattt ttcgtagtag atcttgcacc 1620
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gacacttctc actcatttct tgtgtgcgtg tgcgcgcgtg tgcgaatgtg tgggacgctt 1800
gaagctggtg tgaatagcta ttcgattcat gattcgggag gagcgggggt gttctggtaa 1860
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gccggtcctt tcggtcaact cttccgcccc gataacttcg tcttcggtca atccggtgct 420
ggtaacaact gggctaaggg tcattacact gagggtgctg agcttgttga ccaagttctt 480
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Claims (6)
- 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는,
시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 및 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 프라이머 세트.
- 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단용 조성물.
- 제2항의 조성물을 포함하는, 복숭아 곰팡이 진단용 키트.
- 제3항에 있어서, 상기 키트는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트 및 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 복숭아 곰팡이 진단용 키트.
- (a) 시료로부터 복숭아 곰팡이 핵산을 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 핵산을 주형으로 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
시토스포라 레우코스토마(Cytospora leucostoma), 마크로포미나 파세올리나(Macrophomina phaseolina), 디아포르테 헬리안티(Diaporthe helianthi), 모닐리니아 프룩티콜라(Monilinia fructicola), 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 복숭아 곰팡이 진단 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 (b) 표적 핵산을 증폭하는 단계는 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)에 의해 수행되는 것인, 진단 방법.
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