KR102414138B1 - Medium Composition for Enhancing Wnt Activity - Google Patents

Abstract

본 발명은 Wnt 단백질의 활성 증진 및 오가노이드 배양을 위한 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a serum-free medium composition for enhancing Wnt protein activity and culturing organoids and a method for culturing organoids using the same.

Description

Wnt 단백질 활성 증진용 배지 조성물{Medium Composition for Enhancing Wnt Activity} Media composition for enhancing Wnt protein activity {Medium Composition for Enhancing Wnt Activity}

본 발명은 Wnt 단백질의 활성 증진 및 오가노이드 배양을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a medium composition for enhancing the activity of Wnt protein and culturing organoids, and a method for culturing organoids using the same.

오가노이드 제작기술은 이론적으로 거의 모든 종류의 장기를 줄기세포만으로 제작할 수 있기 때문에 다양한 질병에 이용 가능할 것으로 기대되고 있다. 오가노이드는 2차원에서 만든 세포 조직보다 신약의 안전성과 효능을 시험하는데 더 효과적일 수 있으며, 훼손되거나 제대로 발달하지 못한 장기에 오가노이드를 이식해 상태를 개선하는데 활용할 수 있을 것으로 여겨진다. 이에 따라 최근 재생의학 관점에서도 오가노이드 관련 연구가 더욱 활발해지는 추세에 있으며, 여러 분야에 오가노이드를 널리 이용할 수 있을 것으로 전망되고 있다.Organoid production technology is expected to be applicable to various diseases because it can theoretically produce almost all kinds of organs only with stem cells. Organoids can be more effective in testing the safety and efficacy of new drugs than cell tissues made in two dimensions, and it is believed that organoids can be used to improve the condition by transplanting organoids into damaged or underdeveloped organs. Accordingly, from the point of view of regenerative medicine, research on organoids has become more active in recent years, and it is expected that organoids will be widely used in various fields.

한편, 오가노이드 제작에 있어 필수 인자 중 하나인 Wnt 단백질은 일반적으로 보존된 Ser 잔기에 지질이 공유결합된 형태로 존재한다. Wnt 단백질은 결합되어 있는 지질로 인해 강한 소수성(hydrophobic)의 성질을 띠기 때문에 응집되어 순수한 단백질을 분리하여 사용하는데 어려움이 있어왔다. 이에 태아 소혈청(Fetal brovine serum, FBS)을 넣은 배지를 이용할 경우 안정적인 Wnt 단백질을 얻을 수 있음이 밝혀짐에 따라 오가노이드 제작에 있어 태아 소혈청을 포함하는 Wnt 단백질 을 이용해왔다.On the other hand, the Wnt protein, which is one of the essential factors in the production of organoids, is present in a form in which a lipid is covalently bonded to a generally conserved Ser residue. Since the Wnt protein has strong hydrophobic properties due to the lipids to which it is bound, it has been difficult to isolate and use the aggregated pure protein. Accordingly, as it was found that stable Wnt protein can be obtained when a medium containing fetal brovine serum (FBS) is used, Wnt protein containing fetal bovine serum has been used for organoid production.

그러나 태아 소혈청은 오가노이드 성장을 억제하는 물질을 포함하고 있어, 장기간 오가노이드를 배양할 경우에는 여전히 적합하지 않은 문제점이 있다. 이에 따라, Wnt 단백질의 활성을 유지하면서도 지속적인 성장이 가능하도록 하는 배지의 개발이 요구되고 있다. 또한, 태아 소혈청을 포함한 Wnt 생산 배지로부터 Wnt를 정제하게 되면 동물성 불순물의 오염의 피할 수 없어, 사람에게 사용할 Wnt 치료제재를 만드는데 큰 제한점이 되기 때문에, 태아 소혈청을 포함하지 않는 Wnt 생산 배지의 개발이 필요하다. However, since fetal bovine serum contains substances that inhibit organoid growth, there is still a problem in that it is not suitable for long-term culturing of organoids. Accordingly, there is a need to develop a medium that enables continuous growth while maintaining the activity of the Wnt protein. In addition, when Wnt is purified from a Wnt production medium containing fetal bovine serum, contamination of animal impurities cannot be avoided, which is a big limitation in making a Wnt therapeutic material for use in humans. development is needed

한국등록특허 제10-1966523호Korean Patent Registration No. 10-1966523

본 발명의 목적은 기본 배지, Wnt 단백질 또는 이의 발현 세포, 아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포, 및 알부민(albumin)을 유효성분으로 포함하는, 세포, 세포 응집체, 조직 단편 또는 장기 유사체의 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention for culturing cells, cell aggregates, tissue fragments, or organ analogues comprising a basal medium, Wnt protein or its expressing cells, Afamin or its expressing cells, and albumin as an active ingredient To provide a medium composition.

본 발명의 다른 목적은 상기 배지 조성물을 이용한 오가노이드 수득 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for obtaining organoids using the medium composition.

본 발명의 다른 목적은 생물학적 시료 내 Wnt 단백질의 활성 증진용 또는 안정화용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing or stabilizing the activity of Wnt protein in a biological sample.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 기본 배지, Wnt 단백질 또는 이의 발현 세포, 아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포, 및 알부민(albumin)을 유효성분으로 포함하는, 세포, 세포 응집체, 조직 단편 또는 장기 유사체의 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.One aspect of the present invention for achieving the above object is a cell, cell aggregate, tissue comprising a basal medium, Wnt protein or its expression cell, afamine (Afamin) or its expression cell, and albumin as an active ingredient It relates to a medium composition for culturing fragments or organ analogues.

본 발명에서 “배지(culture media)”는 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있도록 하는 배지를 의미하며, 세포의 배양에 적절한 것으로 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다.In the present invention, the term “culture media” refers to a medium that can support cell growth and survival, and includes all conventional media suitable for culturing cells.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 배양 배지는 무혈청 배지일 수 있다.According to a specific embodiment of the present invention, the culture medium of the present invention may be a serum-free medium.

본 발명에서, “무혈청 배지”는 혈청이 포함되지 않거나 배양환경 내에서의 혈청의 생물학적 및 생리학적 기능이 발휘될 수 있을 만큼의 유효량 미만으로만 포함된 배지를 말한다. 혈청은 FBS(fetal bovine serum), FCS(fetal calf serum), 투석우태혈청(dialyzed fetal bovine serum), 신생우아혈청(newborn calf serum, NCS) 등 통상 세포 배양에 포함되는 혈청(serum)을 통칭한다. 혈청은 광범위한 고분자 단백질, 저분자 영양분, 불용성 물질들에 대한 운반체, 호르몬 등을 포함하고 있으며 통상 기본 배지에 첨가되는 경우가 많으나, 본 발명에서의 배지 조성물은 혈청을 포함하지 않거나 유효량 미만으로만 포함하고도 오가노이드 등의 배양에 필수적인 Wnt 단백질을 활성 형태로 유지할 수 있다.In the present invention, "serum-free medium" refers to a medium that does not contain serum or contains only less than an effective amount to enable the biological and physiological functions of serum in the culture environment to be exerted. Serum refers to serum that is normally included in cell culture, such as fetal bovine serum (FBS), fetal calf serum (FCS), dialyzed fetal bovine serum, and newborn calf serum (NCS). . Serum contains a wide range of high molecular weight proteins, low molecular weight nutrients, carriers for insoluble substances, hormones, etc., and is usually added to the basal medium in many cases, but the medium composition in the present invention does not contain serum or contains only less than an effective amount. It is also possible to maintain the Wnt protein essential for culture of organoids and the like in an active form.

본 발명에서 “Wnt 단백질”은 많은 세포 유형에서 증식 및 분화 사이의 균형에 영향을 미치며, 뼈 형성, 면역 조절, 암, 줄기 세포 재생 등에 관계있는 시스테인이 풍부한 분비되는 폴리펩타이드 계열의 단백질이다. 특히, 동물 세포에서 조직과 장기의 형성을 조정하는데 Wnt 단백질 의존적인 Wnt 신호전달 경로가 중요하다.In the present invention, "Wnt protein" is a protein of the cysteine-rich secreted polypeptide family that affects the balance between proliferation and differentiation in many cell types, and is involved in bone formation, immune regulation, cancer, stem cell regeneration, and the like. In particular, the Wnt protein-dependent Wnt signaling pathway is important in regulating the formation of tissues and organs in animal cells.

상기 Wnt 단백질은 오가노이드 제작에 있어 필수적인 성장인자 중 하나로서, Wnt1, Wnt2, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt4, Wnt5A, Wnt5B, Wnt6, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8A, Wnt8B, Wnt9A, Wnt9B, Wnt10A, Wnt10B, Wnt11 및 Wnt16을 포함한다. 구체적으로, 상기 Wnt 단백질은 Wnt3a 단백질일 수 있다.The Wnt protein is one of the essential growth factors in the production of organoids, Wnt1, Wnt2, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt4, Wnt5A, Wnt5B, Wnt6, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8A, Wnt8B, Wnt9A, Wnt9B, Wnt10B, Wnt10A, Wnt Wnt11 and Wnt16. Specifically, the Wnt protein may be a Wnt3a protein.

본 발명에서 “아파민(Afamin)”은 체액 중의 소수성 분자의 운반체로서 기능하는 당단백질로, Wnt1, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt5A, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8, Wnt9A, Wnt9B, Wnt10A 및/또는 Wnt10B를 포함한 지질화된 Wnt 패밀리의 활성 및 용해에 필수적인 단백질이다. 그 외에도 비타민 E와 결합하여, 지질단백질 시스템이 충분하지 않은 조건에서 비타민 E를 운반하거나, 혈액-뇌 장벽(Blood-brain barrier, BBB)를 가로질러 비타민 E를 운반하는데 관여할 수 있다.In the present invention, “Afamin” is a glycoprotein that functions as a carrier of hydrophobic molecules in body fluid, and includes Wnt1, Wnt2B, Wnt3, Wnt3A, Wnt5A, Wnt7A, Wnt7B, Wnt8, Wnt9A, Wnt9B, Wnt10A and/or Wnt10B It is an essential protein for the activity and lysis of the lipidated Wnt family, including In addition, by binding to vitamin E, it may be involved in transporting vitamin E under conditions where the lipoprotein system is insufficient, or transporting vitamin E across the blood-brain barrier (BBB).

아파민을 암호화하는 유전자, AFM 유전자는 인간 아파민(e.g., NCBI Accession No. NP_001124) 또는 마우스 아파민(NP_660128) 을 암호화하는 유전자, 예컨대, NCBI Accession No. NM_001133, NM_145146 로 표현되는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The gene encoding apamine, AFM gene, is a gene encoding human apamine (e.g., NCBI Accession No. NP_001124) or mouse apamine (NP_660128), such as NCBI Accession No. It may be a gene expressed by NM_001133 and NM_145146, but is not limited thereto.

본 발명에 따르면, 본 발명자들은 배양액 내 Wnt 단백질의 안정성과 활성 유지에 알부민과 아파민의 조합이 핵심적인 역할을 한다는 사실을 최초로 규명하였다. 본 발명의 배지에서 Wnt 단백질과 아파민은 펩타이드 형태로 배지에 첨가될 수도 있고, Wnt 단백질 및/또는 아파민 단백질을 발현하는 세포를 공배양함으로써 공급될 수도 있다.According to the present invention, the present inventors first identified the fact that the combination of albumin and apamine plays a key role in maintaining the stability and activity of the Wnt protein in the culture medium. In the medium of the present invention, Wnt protein and apamine may be added to the medium in the form of a peptide, or may be supplied by co-culturing cells expressing Wnt protein and/or apamine protein.

본 명세서에서“Wnt 단백질(아파민)을 발현하는 세포”는 Wnt 단백질(아파민)을 내재적(endogenously)으로 발현하는 세포와 유전자 전달체를 통해 각 단백질의 코딩 핵산 분자가 도입된 형질 도입(transfection) 세포를 모두 포괄한다.As used herein, the term “cell expressing Wnt protein (Apamine)” refers to a cell endogenously expressing Wnt protein (Apamine) and transfection in which the coding nucleic acid molecule for each protein is introduced through a gene delivery system. encompasses all cells.

본 명세서에서, 용어“핵산 분자”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term “nucleic acid molecule” refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides that exist in single-stranded or double-stranded form, and includes analogs of natural nucleotides unless otherwise specified (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley). , New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90:543-584 (1990)).

본 명세서에서 용어 “유전자 전달체”는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.As used herein, the term “gene carrier” refers to a medium for introducing and expressing a desired target gene into a target cell. An ideal gene delivery system should be harmless to the human body, easy to mass-produce, and capable of efficiently delivering genes.

본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 세포 및 조직 수준에서, 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.As used herein, the term “gene transfer” means that a gene is transported into a cell, and has the same meaning as intracellular transduction of a gene. At the cellular and tissue level, gene transfer has the same meaning as the spread of genes. Accordingly, the gene delivery system of the present invention can be described as a gene penetration system and a gene diffusion system.

Wnt 단백질과 아파민이 이의 발현 세포를 이용한 재조합적 형태로 공급될 경우, 두 가지 단백질이 각각의 상이한 숙주 세포를 통해 발현될 수도 있고 하나의 숙주 세포에서 공발현(co-expression)될 수도 있다. When the Wnt protein and apamine are supplied in a recombinant form using cells expressing the same, the two proteins may be expressed through different host cells or co-expressed in one host cell.

본 발명에서, “알부민(albumin)”은 혈청, 혈장 등에 포함되어 있는 단백질로서, 전체 혈청 단백질의 약 55-60%를 차지한다. 알부민은 수분을 끌어들이는 작용을 하여 혈액 속의 수분함량을 유지하는 것으로 알려져 있다. 현재 널리 사용되는 혈청으로는 FBS, FCS 등이 있으나, 인간 광우병 발병의 원인으로 보고된 바 있어 안전성 문제가 지적된 바 있다. 특히, 오가노이드 배양에 있어 혈청을 이용하는 경우 알부민 외 다른 성분 및 불순물에 의하여 오가노이드의 성장이 억제되어 오가노이드의 장기 배양이 불가능한 문제가 있어, 혈청을 포함하지 않으면서도 오가노이드 배양에 필요한 Wnt 단백질의 활성을 이끌어낼 수 있는 기술의 개발이 요구되었다.In the present invention, "albumin" is a protein contained in serum, plasma, etc., and accounts for about 55-60% of the total serum protein. Albumin is known to retain water content in the blood by attracting water. Currently widely used serum includes FBS and FCS, but it has been reported as a cause of human mad cow disease, and safety issues have been pointed out. In particular, when serum is used for culturing organoids, there is a problem that long-term culture of organoids is impossible because the growth of organoids is inhibited by components and impurities other than albumin. The development of technology that can lead to the activity of

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 알부민은 혈청 알부민(serum albumin)이다.According to a specific embodiment of the present invention, the albumin used in the present invention is serum albumin.

구체적으로, 상기 알부민은 0.1 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도로 포함되는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로 상기 알부민은 0.3 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도로 포함될 수 있으며, 가장 구체적으로 5 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도로 포함될 수 있다.Specifically, the albumin may be included in a concentration of 0.1 mg/mL to 20 mg/mL. More specifically, the albumin may be included in a concentration of 0.3 mg/mL to 20 mg/mL, and most specifically, may be included in a concentration of 5 mg/mL to 20 mg/mL.

본 발명 일 실시예에서는 Wnt3가 포함된 조건배지, Wnt3a 및 아파민이 포함된 조건배지에서 알부민의 첨가량이 증가할수록 농도 의존적으로 Wnt 단백질의 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2). 또한, 소혈청 알부민 뿐 아니라 인간 알부민을 포함한 경우에도 농도 의존적으로 Wnt 단백질의 활성이 증가하였다(도 3).In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the Wnt protein activity increased in a concentration-dependent manner as the amount of albumin was increased in the conditioned medium containing Wnt3 and the conditioned medium containing Wnt3a and apamine ( FIGS. 1 and 2 ). In addition, the activity of Wnt protein was increased in a concentration-dependent manner even when human albumin was included as well as bovine serum albumin (FIG. 3).

이는 오가노이드의 장기 배양에 장애가 되는 FBS 등의 혈청을 포함하지 않더라도 본 발명의 조성물을 이용하여 오가노이드 배양에 필요한 Wnt 단백질의 활성을 나타낼 수 있음을 나타내는 것이다.This indicates that the Wnt protein activity required for organoid culture can be exhibited using the composition of the present invention even if it does not contain serum such as FBS, which is an obstacle to long-term culture of organoids.

이에 따라, 상기 본 발명의 배지 조성물은 Wnt 단백질의 활성 증진용인 것일 수 있다.Accordingly, the medium composition of the present invention may be for enhancing the activity of Wnt protein.

또한 구체적으로, 본 발명의 배지 조성물은 혈청을 포함하지 않더라도 오가노이드 배양에 필요한 Wnt 단백질의 활성을 나타냄을 확인하였는 바, 본 발명의 배지 조성물은 오가노이드 배양용인 것일 수 있다.In addition, specifically, since it was confirmed that the medium composition of the present invention exhibits the activity of Wnt protein necessary for organoid culture even if it does not contain serum, the medium composition of the present invention may be for organoid culture.

본 발명에서 “오가노이드”는 줄기세포나 장기 기원 세포로부터 분리한 세포를 다시 배양을 통해 응집, 재조합하여 만들어진 세포집합체를 의미하는 것으로, 서스펜션 세포 배양물로부터 형성된 오가노이드 또는 세포 클러스터를 포함할 수 있다. 예를 들면, 위 오가노이드, 소장 오가노이드, 결장 오가노이드, 간 오가노이드, 갑상선 오가노이드, 폐 오가노이드, 또는 뇌 오가노이드 일 수 있으며, 조직 부위에 따라 달리 적용될 수 있다.In the present invention, "organoid" refers to a cell aggregate made by aggregation and recombination of cells isolated from stem cells or organ origin cells through re-cultivation, and may include organoids or cell clusters formed from suspension cell culture. have. For example, it may be a stomach organoid, small intestine organoid, colon organoid, liver organoid, thyroid organoid, lung organoid, or brain organoid, and may be applied differently depending on the tissue site.

본 발명에서 “오가노이드 수득”은 오가노이드를 생성하거나 유지시킬 수 있는 모든 행위를 포함한다. 예를 들어 오가노이드를 생존, 성장 또는 증식시키는 것일 수 있으며, 줄기세포 또는 특정 조직으로부터 분리된 세포가 특정 기능을 갖는 조직이나 기관 세포로 분화시키는 것일 수 있다.In the present invention, "obtaining an organoid" includes any activity capable of generating or maintaining an organoid. For example, the organoid may survive, grow, or proliferate, and stem cells or cells isolated from a specific tissue may be differentiated into tissue or organ cells having a specific function.

또한 구체적으로, 본 발명에서, “기본 배지”는 동물 세포의 배양에 통상적으로 사용되는 공지의 배지들로서, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 페니실린-스트렙토마이신과 같은 항생제, 또는 보충제 등이 더 첨가된 것일 수 있다.Also specifically, in the present invention, the “basic medium” is a known medium commonly used for culturing animal cells, and includes DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI. 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A Medium, AmnioMax, AminoMaxⅡ It may be one or more selected from the group consisting of complete Medium and Chang's Medium MesemCult-XF Medium, but is not limited thereto. In addition, if necessary, antibiotics such as penicillin-streptomycin, or supplements may be further added.

또한 구체적으로, 상기 배지 조성물은 상피 성장 인자(EGF), 노긴(Noggin), 티아조비빈, CHIR99021 및 CHIR99021의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, specifically, the medium composition may further include one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts of epidermal growth factor (EGF), Noggin, thiazovivin, CHIR99021 and CHIR99021, limited thereto. it's not going to be

상기 CHIR99021은 하기 화학식 1의 화합물로서, 6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴(CAS 번호 252917-06-9)을 말한다.The CHIR99021 is a compound of Formula 1, 6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidi nyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile (CAS No. 252917-06-9).

[화학식 1][Formula 1]

본 발명의 다른 측면은, 상기 본 발명의 배지 조성물에서 줄기세포, 줄기세포의 집단, 줄기세포로부터 분화된 세포 또는 단리된 조직단편을 배양하는 단계를 포함하는, 오가노이드 수득 방법에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a method for obtaining an organoid, comprising culturing stem cells, a population of stem cells, cells differentiated from stem cells, or tissue fragments isolated from the medium composition of the present invention.

예를 들면, 다분화성 줄기세포, 성체 줄기세포를 배양 및 분화되도록 하여 오가노이드를 배양할 수 있으며, 상기 다분화성 줄기세포는 배아줄기세포 또는 역분화줄기세포일 수 있다.For example, organoids may be cultured by culturing and differentiating multipotent stem cells and adult stem cells, and the multipotent stem cells may be embryonic stem cells or dedifferentiated stem cells.

상기 오가노이드 배양에 사용되는 배지 조성물은 상피 성장 인자(EGF), 노긴(Noggin), 티아조비빈, CHIR99021 및 CHIR99021의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것 은 아니다.The medium composition used for culturing the organoid may further include at least one selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts of epidermal growth factor (EGF), Noggin, thiazolinib, CHIR99021 and CHIR99021, It is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포 및 알부민(albumin)을 유효성분으로 포함하는 생물학적 시료 내 Wnt 단백질의 활성 증진용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for enhancing the activity of Wnt protein in a biological sample comprising Afamin or its expression cells and albumin as active ingredients.

본 발명에서 이용되는 아파민 및 알부민에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.Apamine and albumin used in the present invention have already been described above, and thus description thereof will be omitted to avoid excessive duplication.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, Wnt 단백질 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 모든 시료로서, 조직, 기관, 기관 유사체, 세포 또는 이들의 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. As used herein, the term “biological sample” refers to any sample obtained from mammals including humans, including Wnt protein or cells expressing the same, and includes, but is not limited to, tissues, organs, organ analogues, cells, or cultures thereof. does not

본 발명에서,“Wnt 단백질의 활성 증진”은 대조군에 비하여 Wnt 단백질의 양 또는 생체 내 고유한 기능이 측정 가능할 정도로 유의하게 증가하는 것을 말한다. 활성(activity)의 증가는 단순한 기능(function)의 증가 뿐 아니라 안정성(stability)의 증가로 기인한 궁극적인 활성 증가를 포함한다. 후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 아파민과 알부민을 포함하는 본 발명의 조성물은 Wnt 단백질의 시료 내 양 뿐 아니라 그 활성을 유지 및 증가시키고 Wnt 단백질을 활성형의 가용성 형태(soluble form)로 유지하여 응집(aggregation)을 차단함으로써 구조적 안정성을 증가시킨다. 이에, 본 발명의 용어 “활성 증진용 조성물”은“안정성 증진용 조성물”또는“안정화용 조성물”로 표현될 수도 있다. In the present invention, “enhancement of Wnt protein activity” refers to a significant increase in the amount of Wnt protein or a measurable intrinsic function in vivo compared to the control group. An increase in activity includes not only an increase in function, but also an eventual increase in activity due to an increase in stability. As will be seen in Examples to be described later, the composition of the present invention comprising apamine and albumin maintains and increases the amount of Wnt protein in the sample as well as its activity and maintains the Wnt protein in an active soluble form. to increase structural stability by blocking aggregation. Accordingly, the term “composition for enhancing activity” of the present invention may be expressed as “composition for enhancing stability” or “composition for stabilization”.

본 발명의 배지조성물은 Wnt 단백질의 활성을 혈청 없이도 현저히 증가시킬 수 있는 바, 장기간 오가노이드 배양하는데 활용할 수 있다.Since the medium composition of the present invention can significantly increase the activity of Wnt protein without serum, it can be used for long-term organoid culture.

본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.The effect of the present invention is not limited to the above effect, but it should be understood to include all effects that can be inferred from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.

도 1은 Wnt3a가 포함된 조건배지에서의 소혈청 알부민(BSA) 농도에 따른 Wnt단백질의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Wnt3a 및 아파민이 포함된 조건배지에서의 소혈청 알부민(BSA) 농도에 따른 Wnt 단백질의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 각 조건배지에서의 인간 알부민(rhALB) 농도에 따른 Wnt 단백질의 활성을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것으로, Wnt3a가 포함된 조건배지(도 3a) 및 Wnt3a 및 아파민이 포함된 조건배지(도 3b)에서의 결과를 각각 보여준다.
도 4a와 도 4c는 아파민 및 Wnt3a를 발현하는 세포(L3a-Afa)를 5mg/mL 농도의 소혈청 알부민(BSA)(-) 및 (+) 조건에서 5일간 배양한 후 생성한 조건배지의 안정도를 나타내는 결과이다. 도 4a는 생성된 배지를 37℃에서 0, 24 또는 48시간 동안 배양한 후 측정한 Wnt3a 단백질 양을 보여주는 웨스턴 블럿 결과이며, 도 4c는 생성된 배지를 37℃에서 0, 24 또는 48시간 동안 배양한 후 측정한 Wnt 단백질의 시간별 활성 변화를 보여주는 결과이다. 도 4b는 Wnt3a 만을 발현하는 세포(L3a)에 10%의 태아 소혈청(FBS)를 넣고 5일간 배양한 후 생성한 배지의 안정도를 나타내는 결과로서, 생성된 배지를 37℃에서 0, 24 또는 48 시간 동안 배양한 후 Wnt3a 단백질 양을 웨스턴 블럿으로 측정한 결과(왼쪽, 오른쪽 검은 선) 및 Wnt 단백질의 시간별 활성 변화(오른쪽 빨간 선)를 각각 보여준다. 도 4d는 L3a-Afa 세포를 BSA(-) 및 (+) 조건으로 5일간 배양하여 생성한 조건배지를 수크로스 구배 원심분리를 하여 총 13개의 분획을 얻은 후, 각각의 분획에서의 Wnt3a 당백질 양을 웨스턴 블롯을 통해 본 결과이다.
도 5는 L3a-Afa 세포를 BSA(-) 및 (+) 조건으로 5일간 배양하여 생산한 조건배지를 이용하여 인간 대장 오가노이드를 배양함으로써 오가노이드 형성 효율을 측정한 결과를 보여준다.1 shows the results of measuring the activity of Wnt protein according to the concentration of bovine serum albumin (BSA) in a conditioned medium containing Wnt3a.
2 shows the results of measuring the activity of Wnt protein according to the concentration of bovine serum albumin (BSA) in a conditioned medium containing Wnt3a and apamine.
3 is a graph showing the results of measuring the activity of Wnt protein according to the human albumin (rhALB) concentration in each conditioned medium. The results in Fig. 3b) are respectively shown.
4a and 4c show cells expressing apamine and Wnt3a (L3a-Afa) at a concentration of 5 mg/mL bovine serum albumin (BSA) (-) and (+) for 5 days after culturing the conditioned medium The result is an indication of stability. Figure 4a is a western blot result showing the amount of Wnt3a protein measured after incubating the resulting medium at 37 °C for 0, 24 or 48 hours, Figure 4c is a cultured medium for 0, 24 or 48 hours at 37 °C. It is a result showing the time-dependent activity change of the Wnt protein measured after the test. 4B is a result showing the stability of the medium produced after adding 10% fetal bovine serum (FBS) to cells expressing only Wnt3a (L3a) and culturing for 5 days. After culturing for a period of time, the results of measuring the amount of Wnt3a protein by Western blot (left and right black lines) and the change in Wnt protein activity over time (right red line) are respectively shown. Figure 4d shows a total of 13 fractions by sucrose gradient centrifugation on a conditioned medium produced by culturing L3a-Afa cells under BSA (-) and (+) conditions for 5 days, and then, Wnt3a glycoprotein in each fraction. This is the result of looking at the sheep by Western blot.
5 shows the results of measuring organoid formation efficiency by culturing human colon organoids using a conditioned medium produced by culturing L3a-Afa cells under BSA (-) and (+) conditions for 5 days.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples. However, the following examples only illustrate the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

실시예 1. Human Afamin(hAfamin) 발현 세포 제작을 위한 플라스미드 구축Example 1. Plasmid construction for constructing cells expressing Human Afamin (hAfamin)

hAfamin을 발현하는 세포를 제작하기 위한 플라스미드를 구축하였다.A plasmid was constructed for constructing cells expressing hAfamin.

먼저, pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clontech)의 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라아제(puromycin acetyltransferase) 유전자를 블라스티시딘-S디아미나아제(Blasticidin S deaminase) 유전자로 교체하여 pLVX-EIBla를 제작하였다. 이후 인간 아파민 코딩 시퀀스(human Afamine CDS)를 PCR하여 플라스미드에 삽입하였다.First, pLVX-EIBla was prepared by replacing the puromycin acetyltransferase gene of pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clontech) with the blasticidin S deaminase gene. Then, the human Afamine coding sequence (human Afamine CDS) was inserted into the plasmid by PCR.

pCR-BluntII-TOPO-Afamin (MHS6278-211689548, Dharmacon)을 주형으로, 서열 2,3을 프라이머로 하여 pfu DNA polymerase(Solgent)로 증폭하였다. 준비된 PCR 기계에 샘플을 넣어 70℃ 정지(Pause), 95℃ 2 분 이후, 95℃ 20초, 50℃ 20초, 68℃ 2분 조건으로 5회 싸이클(cycle) 및 , 95℃ 20초, 60℃ 20초, 68℃ 2분 조건으로 20회 싸이클 반복 후, 68℃ 3분, 4℃ 정지 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR이 진행되는 동안 1% 아가로즈 겔(agarose gel)을 준비한 후 반응이 끝난 샘플들을 1% 아가로즈 겔에 내려 사이즈를 분리하였으며, 겔 추출(gel extraction)과정을 통해 hAfamin을 수득하였다. hAfamin 절편은 Xba1 제한효소로 절단하였으며 이후, pLVXEIBla 플라스미드의 Xba1 제한효소 자리에 삽입하여 pLVX-EIBla-hAfamin 플라스미드를 제작하였다.pCR-BluntII-TOPO-Afamin (MHS6278-211689548, Dharmacon) was used as a template and SEQ ID NOs: 2 and 3 were used as primers and amplified with pfu DNA polymerase (Solgent). Put the sample in the prepared PCR machine, 70 ℃ Pause, 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 20 sec, 50 ℃ 20 sec, 68 ℃ 2 min condition 5 cycles (cycle) and , 95 ℃ 20 sec, 60 After repeating the cycle 20 times under conditions of ℃ 20 sec and 68 ℃ 2 min, PCR was performed under conditions of 68 ℃ 3 min and 4 ℃ stop condition. During PCR, a 1% agarose gel was prepared and the reaction samples were dropped on a 1% agarose gel to separate the sizes, and hAfamin was obtained through gel extraction. The hAfamin fragment was digested with an Xba1 restriction enzyme and then inserted into the Xba1 restriction enzyme site of the pLVXEIBla plasmid to prepare a pLVX-EIBla-hAfamin plasmid.

hAfamin 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 나타내었으며, PCR에 사용된 프라이머 쌍은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.The hAfamin polynucleotide is shown in SEQ ID NO: 1, and the primer pairs used in PCR are as shown in Table 1 below.

서열번호SEQ ID NO: 프라이머primer 서열order 22 XbaI-hAfamin U1XbaI-hAfamin U1 tctaga gccacc atgg TGAAACTACTAAAACTTACAGGtctaga gccacc atgg TGAAACTACTAAAACTTACAGG 33 hAfamin -XbaI L1hAfamin-XbaI L1 tatat tctaga T TCAGTTGCCAATTTTTGGACtatat tctaga T TCAGTTGCCAATTTTTGGAC

실시예 2. hAfamin 발현 세포 제작을 위한 렌티바이러스 제작Example 2. Production of lentiviruses for hAfamin-expressing cells

HEK293T 세포를 6 웰(well) 플레이트에 4x105 cells/well의 농도로 플레이팅한 후, 24시간 후 pLVX-EIBla-hAfamin : pxPAX2(addgene 12260) : pMD2.G(addgene 12259) = 4 : 3 : 1의 비율로 총 2 μg DNA를 형질전환 시켰다. 다음날 배지를 교체한 후 48시간 동안 배양한 배지를 수집하였다. 렌티바이러스가 포함된 이 배지를 0.45 μm 필터를 통과시킨 후, 4℃에 보관하였다.HEK293T cells were plated in a 6-well plate at a concentration of 4x105 cells/well, and 24 hours later, pLVX-EIBla-hAfamin: pxPAX2(addgene 12260): pMD2.G(addgene 12259) = 4: 3: 1 A total of 2 μg DNA was transformed at a ratio of After replacing the medium the next day, the culture medium was collected for 48 hours. This medium containing the lentivirus was passed through a 0.45 μm filter and stored at 4°C.

실시예 3. 아파민 발현세포(L-Wnt3a-Afamin, L3a-Afa) 제작Example 3. Apamine-expressing cells (L-Wnt3a-Afamin, L3a-Afa) production

L-Wnt3a(이하 L3a) 세포를 Dr. Hans Clevers(위트레흐트 연구소, 네덜란드)로부터 받아서 사용하였다. 상기 L3a 세포는 Wnt3a가 발현되도록 제작된 세포이다. 24 웰(well) 플레이트에 30% 컨플루언시(confluency)가 되도록 L3a 세포를 배양한 후, 깨끗한 배지(fresh medium) 200 μL 및 pLVX-EIBla-hAfamin 바이러스 200 μL를 섞어 감염시켰다. 12시간 감염시킨 후 배지를 교체하였으며, 72시간 경과 후, 60mm 디쉬(dish)로 옮기면서 블라스티시딘(blasticidin) 10 ug/mL를 처리하여 1주일 간 선별하여 아파민 발현세포(L3a-Afa)를 얻었다.L-Wnt3a (hereinafter L3a) cells were transformed into Dr. It was obtained from Hans Clevers (Utrecht Institute, The Netherlands) and used. The L3a cells are cells designed to express Wnt3a. After culturing L3a cells to 30% confluency in a 24-well plate, 200 µL of fresh medium and 200 µL of pLVX-EIBla-hAfamin virus were mixed and infected. After 12 hours of infection, the medium was changed, and after 72 hours, it was transferred to a 60 mm dish and treated with 10 ug/mL of blasticidin for 1 week and selected for 1 week to obtain apamine-expressing cells (L3a-Afa). got

실시예 4. 인간 알부민(human albumin)의 준비Example 4. Preparation of human albumin

인간 알부민(human albumin)은 Sigma에서 구입하여 사용하였다(Catalog Number A9731).Human albumin was purchased from Sigma (Catalog Number A9731).

실시예 5. Conditioned media(조건배지) 제조Example 5. Conditioned media (conditioned media) preparation

L3a 세포 배양에 의한 Wnt3a가 포함된 조건배지 및 L3a-Afa 세포 배양에 의한 Wnt3a 및 아파민이 포함된 조건배지를 각각 수득하였으며, 각 조건배지에는 소혈청 알부민 또는 인간 알부민이 농도를 달리하여 첨가되도록 하였다.A conditioned medium containing Wnt3a by L3a cell culture and a conditioned medium containing Wnt3a and apamine by L3a-Afa cell culture were obtained, respectively, and bovine serum albumin or human albumin was added at different concentrations to each conditioned medium. .

5-1. 소혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA)이 포함된 조건배지의 제조5-1. Preparation of conditioned medium containing bovine serum albumin (BSA)

L3a 세포 및 L3a-Afa 세포 각각을 100 mm 디쉬(dish)에서 90%에 이를 때까지 배양시켰다. 12 mL PBS로 2회 세척시킨 후 소혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA)을 0, 0.3, 1, 2, 5, 10 및 20 mg/mL로 각각 첨가한 DMEM/F12 배지 및 10% FBS를 포함한 DMEM로 각각 교체하였다. 이후 5일 간 배양한 조건배지를 걷어서 1,000rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 제거한 후, 0.45 μm 필터로 여과하였다.Each of L3a cells and L3a-Afa cells was cultured in 100 mm dishes until reaching 90%. After washing twice with 12 mL PBS, DMEM/F12 medium containing bovine serum albumin (BSA) at 0, 0.3, 1, 2, 5, 10 and 20 mg/mL, respectively, and 10% FBS were added. Each was replaced with DMEM. Then, the conditioned medium cultured for 5 days was removed, centrifuged at 1,000 rpm for 3 minutes to remove cells, and then filtered with a 0.45 μm filter.

5-2. 인간 알부민(human albumin)이 포함된 조건배지의 제조5-2. Preparation of conditioned medium containing human albumin

소혈청 알부민에 포함된 불순물이 Wnt 단백질 활성에 영향을 줄 수 있는 점을 고려하여, 상기 실시예 4에서 제작한 인간 알부민을 이용한 조건배지를 제조하였다. 구체적으로, L3a 세포 및 L3a-Afa 세포 각각을 100 mm 디쉬(dish)에서 90%에 이를 때까지 배양시켰다. 12 mL PBS로 2회 세척시킨 후 인간 알부민을 0, 5 mg/mL로 첨가한 DMEM/F12 배지로 교체하였다. 이후 5일간 배양한 조건 배지(conditioned medium)를 걷어서 1,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 제거한 후, 0.45 μm필터로 여과하였다.Considering that impurities contained in bovine serum albumin may affect Wnt protein activity, a conditioned medium using human albumin prepared in Example 4 was prepared. Specifically, L3a cells and L3a-Afa cells were each cultured in 100 mm dishes until they reached 90%. After washing twice with 12 mL PBS, it was replaced with DMEM/F12 medium supplemented with human albumin at 0 and 5 mg/mL. Then, the conditioned medium cultured for 5 days was removed, centrifuged at 1,000 rpm for 3 minutes to remove cells, and then filtered with a 0.45 μm filter.

실험예 1. Wnt 단백질 활성 확인Experimental Example 1. Confirmation of Wnt protein activity

1-1. 소혈청 알부민 포함 조건배지 적용시의 Wnt 단백질 활성 확인1-1. Confirmation of Wnt protein activity when conditioned medium containing bovine serum albumin is applied

상기 실시예 5-1에서 제조한 조건배지에서의 배양시의 Wnt 단백질의 활성을 측정하였다. 구체적으로, 293-STF (ATCC) 세포를 이용한 리포터 에세이(reporter assay)를 실시하였다. 0.05% poly-L-lysine으로 코팅한 96 웰(well) 플레이트에 293-STF 세포를 70% 컨플루언시(confluency)가 되도록 플레이팅하고, 다음날 깨끗한 배지(fresh medium) 100 μL로 배지를 교체한 후, 조건배지 50 μL를 첨가하였다. 10-14 시간 경과 후, 통상적인 루시퍼레아제 에세이(luciferase assay)를 수행하였으며, 측정한 Wnt 단백질의 활성은 FBS(fetal bovine serum)를 넣었을 때의 활성에 대한 %로 나타내었다.The activity of Wnt protein during culture in the conditioned medium prepared in Example 5-1 was measured. Specifically, a reporter assay using 293-STF (ATCC) cells was performed. Plate 293-STF cells to 70% confluency in a 96-well plate coated with 0.05% poly-L-lysine, and replace the medium with 100 µL of fresh medium the next day. After that, 50 μL of conditioned medium was added. After 10-14 hours, a conventional luciferase assay was performed, and the measured Wnt protein activity was expressed as a percentage of the activity when FBS (fetal bovine serum) was added.

그 결과, Wnt3가 포함된 조건배지를 가한 경우, 소혈청 알부민의 첨가량이 증가할수록 Wnt 단백질의 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 소혈청 알부민을 5 mg/mL 이상 첨가한 경우, 소혈청 알부민 미첨가(0 mg/mL)된 조건배지를 가한 경우에 비해 눈에 띄게 Wnt 단백질의 활성이 증가되어 있음을 확인하였다(도 1).As a result, it was confirmed that when a conditioned medium containing Wnt3 was added, the activity of the Wnt protein increased as the amount of bovine serum albumin increased. In particular, it was confirmed that when 5 mg/mL or more of bovine serum albumin was added, the activity of Wnt protein was significantly increased compared to the case where the conditioned medium without bovine serum albumin (0 mg/mL) was added (Fig. One).

또한, Wnt3a 및 아파민이 포함된 조건배지를 가한 경우, Wnt3만 포함된 조건 배지에 비해 Wnt 단백질의 활성이 현저히 증가됨을 확인하였다. 특히, 소혈청 알부민까지 추가된 경우 FBS가 가해진 수준까지 Wnt 단백질의 활성이 증가되었다(도 2). 이로부터 오가노이드의 장기 배양에 장애가 되는 FBS 등의 혈청을 포함하지 않더라도 본 발명의 조성물을 이용하여 오가노이드 배양에 필요한 Wnt 단백질의 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.In addition, it was confirmed that when a conditioned medium containing Wnt3a and apamine was added, the activity of the Wnt protein was significantly increased compared to the conditioned medium containing only Wnt3. In particular, when bovine serum albumin was added, the activity of the Wnt protein was increased up to the level to which FBS was added ( FIG. 2 ). From this, it was confirmed that the Wnt protein activity necessary for organoid culture can be exhibited using the composition of the present invention even if it does not contain serum such as FBS, which is an obstacle to long-term culture of organoids.

1-2. 인간 알부민 포함 조건배지 적용시의 Wnt 단백질 활성 확인1-2. Confirmation of Wnt protein activity when conditioned medium containing human albumin is applied

상기 실시예 5-2에서 제조한 조건배지에서의 배양시의 Wnt 단백질의 활성을 측정하였다. 측정 방법은 상기 실험예 1-1의 방법과 동일하다.The activity of Wnt protein was measured when cultured in the conditioned medium prepared in Example 5-2. The measurement method is the same as that of Experimental Example 1-1.

그 결과, 소혈청 알부민을 첨가하였을 때와 유사하게 인간 알부민을 첨가한 배지에서 Wnt3a 단백질 활성이 증가함을 확인하였다. 나아가 아파민 및 인간 알부민을 5mg/mL을 모두 포함하는 배지에서 아파민을 포함하지 않는 배지에 비해, Wnt3a 단백질 활성이 더욱 증가된 효과를 나타내었다(도 3).As a result, it was confirmed that Wnt3a protein activity was increased in the medium to which human albumin was added, similarly to when bovine serum albumin was added. Furthermore, the Wnt3a protein activity was further increased in the medium containing both apamine and human albumin 5 mg/mL compared to the medium not containing apamine ( FIG. 3 ).

상기 결과는 소혈청 알부민 뿐 아니라, 인간 알부민을 이용할 수 있으며, 소혈청 알부민의 불순물로 인한 영향까지 배제시킴으로써 Wnt 단백질 활성을 더욱 증대시킬 수 있음을 시사한다.The above results suggest that not only bovine serum albumin but also human albumin can be used, and Wnt protein activity can be further enhanced by excluding the effect of impurities of bovine serum albumin.

실험예 2. 배지 조성에 따른 Wnt 단백질의 양 및 활성 측정Experimental Example 2. Measurement of the amount and activity of Wnt protein according to the composition of the medium

L3a-Afa 세포를 BSA(-) 및 (+) 조건으로 5일간 배양함으로써 Wnt3a와 아파민이 축적된 조건배지를 제작하였다. 상기 제작된 Wnt3a 및 아파민 축적 조건배지를 37℃에서 0, 24 또는 48시간 동안 배양 후 Wnt3a 단백질 양을 사람 혹은 쥐의 항-Wnt3a 또는 항-Wnt3 항체를 이용한 웨스턴 블럿을 통해 측정을 하였고(도 4a, 왼쪽), 시간 별 Wnt3a 단백질 양의 변화를 그래프로 도식화하였다(도 4a, 오른쪽). 그 결과, BSA(+)배지에서는 Wnt3a 양이 유지되는 반면 BSA(-) 배지에서는 배양 48시간 째에 Wnt3a 양이 50% 미만으로 감소함을 확인하였다. 이를 통해 배지 내에 아파민이 존재하더라도 알부민이 함께 존재할 경우에만 Wnt 단백질의 양이 유지됨을 알 수 있었다(도 4a).By culturing L3a-Afa cells under BSA (-) and (+) conditions for 5 days, a conditioned medium in which Wnt3a and apamine were accumulated was prepared. After culturing the prepared Wnt3a and apamine accumulation conditioned medium at 37° C. for 0, 24 or 48 hours, the amount of Wnt3a protein was measured by Western blot using human or mouse anti-Wnt3a or anti-Wnt3 antibody (Fig. 4a, left), the change in the amount of Wnt3a protein over time was plotted as a graph (Fig. 4a, right). As a result, it was confirmed that the amount of Wnt3a was maintained in the BSA(+) medium, whereas the amount of Wnt3a decreased to less than 50% at 48 hours of culture in the BSA(-) medium. Through this, it was found that the amount of Wnt protein was maintained only when albumin was present even in the presence of apamine in the medium (FIG. 4a).

또한 동일한 조건 배지를 사용하여 37℃에서 0, 24, 또는 48시간 동안 배양을 한 후 시간 별 Wnt 단백질 활성 변화를 TOPflash 어세이를 수행하여 측정하였다 (도 4c). 요약하면, Wnt 신호전달에 반응하는 루시퍼레이즈 발현 세포인 HEK 293 STF를 5 x 10⁵/mL로 96웰 플레이트에 씨딩하고 24시간 동안 배양한 후, 상기 제작한 조건 배지를 넣었다. 이후 12 내지 24시간 후 루시퍼레이즈 어세이를 통해 Wnt 활성을 측정하였다. 그 결과, BSA(+)배지에서는 48시간 째에도 Wnt3a의 활성이 약 70% 수준으로 유지되는 반면 BSA(-) 배지에서는 배양 대부분의 활성이 소실됨을 확인하였다. 이를 통해 Wnt 단백질의 양 뿐 아니라 활성에 있어서도 아파민과 알부민의 조합이 필수적임을 알 수 있었다(도 4c). In addition, after incubation for 0, 24, or 48 hours at 37°C using the same conditioned medium, the change in Wnt protein activity by time was measured by performing a TOPflash assay ( FIG. 4c ). Briefly, HEK 293 STF, a luciferase-expressing cell that responds to Wnt signaling, was seeded in a 96-well plate at 5 x 10 ⁵ /mL and cultured for 24 hours, and then the prepared conditioned medium was added. After 12 to 24 hours, Wnt activity was measured through a luciferase assay. As a result, it was confirmed that the activity of Wnt3a was maintained at about 70% level even at 48 hours in the BSA(+) medium, whereas most of the culture activity was lost in the BSA(-) medium. Through this, it was found that the combination of apamine and albumin was essential not only in the amount of Wnt protein but also in the activity (FIG. 4c).

아울러, Wnt 단백질의 형태를 조사하기 위해 L3a-Afa 세포를 BSA(-) 및 (+) 조건으로 5일간 배양함으로써 제작된 조건배지를 수크로스 구배 원심분리를 하고 이후 각 분획물에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 4d에서 보는 바와 같이, 알부민이 결핍된 시료에서는 Wnt 단백질이 응집되어 불활성화되는 반면(분획 13), 알부민이 존재하는 시료는 가용성의 기능적 형태(functional form)가 유지됨을 관찰하여(분획 2 내지 6), Wnt 단백질의 활성 형태 유지에 있어서도 아파민과 알부민의 조합이 중요함을 알 수 있었다. In addition, in order to investigate the morphology of the Wnt protein, the conditioned medium prepared by culturing L3a-Afa cells under BSA (-) and (+) conditions for 5 days was subjected to sucrose gradient centrifugation, followed by Western blot analysis for each fraction. carried out. As shown in Fig. 4d, it was observed that the Wnt protein was aggregated and inactivated in the albumin-deficient sample (fraction 13), while the soluble functional form was maintained in the sample with albumin (fraction 2 to 6), it was found that the combination of apamine and albumin is important in maintaining the active form of the Wnt protein.

실험예 3. 배지 조성에 따른 Wnt 단백질의 인간 오가노이드 형성 효율 측정Experimental Example 3. Measurement of Wnt Protein Human Organoid Formation Efficiency According to Medium Composition

L3a-Afa 세포를 BSA(-) 및 (+) 조건으로 5일간 배양함으로써 제작된 조건배지를 이용하여 인간 대장 오가노이드를 배양하였다. 인간 대장 오가노이드에는 조건배지 외에 N-아세틸시스테인(1mM), B-27 보충제 (2%), R-스폰딘-1 조건배지 (10%), EGF (50ng/ml), 노긴 (100ng/ml), 니코틴아마이드(10mM), TGFβ 억제제 (A83-01, 500nM), p38 억제제(10uM)를 포함시켰다. 대장의 성체 줄기세포를 매트리젤 돔(matrigel dome)안에 넣고, 여기에 상기 배지를 첨가하여 오가노이드를 배양하였다. 대장 오가노이드는 10일에 한번씩 계대배양(passage)하게 되며, 계대배양시마다 세포수를 세어 오가노이드 형성 및 성장 효율을 측정하였다. 그 결과, BSA(+) 배지에서는 계대를 거듭하며 지속적으로 오가노이드 형성이 유지되는 반면, BSA(-) 배지에서는 조기에 성장이 중지됨을 관찰하였다. 이를 통해 아파민과 알부인의 조합에 의해 Wnt 단백질의 활성이 유지되어야만 오가노이드가 효율적으로 형성됨을 알 수 있었다 (도 5).Human colon organoids were cultured using a conditioned medium prepared by culturing L3a-Afa cells under BSA (-) and (+) conditions for 5 days. Human colon organoids contain N-acetylcysteine (1 mM), B-27 supplement (2%), R-spondin-1 conditioned medium (10%), EGF (50 ng/ml), Noggin (100 ng/ml) in addition to conditioned medium. ), nicotinamide (10 mM), TGFβ inhibitor (A83-01, 500 nM), p38 inhibitor (10 uM). The adult stem cells of the colon were placed in a matrigel dome, and the medium was added thereto to culture the organoids. Colonic organoids were passaged once every 10 days, and cell number was counted at each passage to measure organoid formation and growth efficiency. As a result, it was observed that the organoid formation was continuously maintained with repeated passages in the BSA(+) medium, whereas the growth was stopped early in the BSA(-) medium. Through this, it was found that organoids were efficiently formed only when the activity of the Wnt protein was maintained by the combination of apamine and albumin (FIG. 5).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.The above description of the present invention is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive. For example, each component described as a single type may be implemented in a distributed manner, and likewise components described as distributed may also be implemented in a combined form.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the following claims, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be construed as being included in the scope of the present invention.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> SERUM-FREE MEDIUM FOR ENHANCING WNT ACTIVITY <130> 19PP30336 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAfamin <400> 1 atggtgaaac tactaaaact tacaggtttt atttttttct tgtttttttt gactgaatcc 60 ctaaccctgc ccacacaacc tcgggatata gagaacttca atagtactca aaaatttata 120 gaagataata ttgaatacat caccatcatt gcatttgctc agtatgttca ggaagcaacc 180 tttgaagaaa tggaaaagct ggtgaaagac atggtagaat acaaagacag atgtatggct 240 gacaagacgc tcccagagtg ttcaaaatta cctaataatg ttttacagga aaaaatatgt 300 gctatggagg ggctgccaca aaagcataat ttctcacact gctgcagtaa ggttgatgct 360 caaagaagac tctgtttctt ctataacaag aaatctgatg tgggatttct gcctcctttc 420 cctaccctgg atcccgaaga gaaatgccag gcttatgaaa gtaacagaga atccctttta 480 aatcactttt tatatgaagt tgccagaagg aacccatttg tcttcgcccc tacacttcta 540 actgttgctg ttcattttga ggaggtggcc aaatcatgtt gtgaagaaca aaacaaagtc 600 aactgccttc aaacaagggc aatacctgtc acacaatatt taaaagcatt ttcttcttat 660 caaaaacatg tctgtggggc acttttgaaa tttggaacca aagttgtaca ctttatatat 720 attgcgatac tcagtcaaaa attccccaag attgaattta aggagcttat ttctcttgta 780 gaagatgttt cttccaacta tgatggatgc tgtgaagggg atgttgtgca gtgcatccgt 840 gacacgagca aggttatgaa ccatatttgt tcaaaacaag attctatctc cagcaaaatc 900 aaagagtgct gtgaaaagaa aataccagag cgcggccagt gcataattaa ctcaaacaaa 960 gatgatagac caaaggattt atctctaaga gaaggaaaat ttactgacag tgaaaatgtg 1020 tgtcaagaac gagatgctga cccagacacc ttctttgcga agtttacttt tgaatactca 1080 aggagacatc cagacctgtc tataccagag cttttaagaa ttgttcaaat atacaaagat 1140 ctcctgagaa attgctgcaa cacagaaaac cctccaggtt gttaccgtta cgcggaagac 1200 aaattcaatg agacaactga gaaaagcctc aagatggtac aacaagaatg taaacatttc 1260 cagaatttgg ggaaggatgg tttgaaatac cattacctca tcaggctcac gaagatagct 1320 ccccaactct ccactgaaga actggtgtct cttggcgaga aaatggtgac agctttcact 1380 acttgctgta cgctaagtga agagtttgcc tgtgttgata atttggcaga tttagttttt 1440 ggagagttat gtggagtaaa tgaaaatcga actatcaacc ctgctgtgga ccactgctgt 1500 aaaacaaact ttgccttcag aaggccctgc tttgagagtt tgaaagctga taaaacatat 1560 gtgcctccac ctttctctca agatttattt acctttcacg cagacatgtg tcaatctcag 1620 aatgaggagc ttcagaggaa gacagacagg tttcttgtca acttagtgaa gctgaagcat 1680 gaactcacag atgaagagct gcagtctttg tttacaaatt tcgcaaatgt agtggataag 1740 tgctgcaaag cagagagtcc tgaagtctgc tttaatgaag agagtccaaa aattggcaac 1800 tga 1803 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI-hAfamin U1 <400> 2 tataatctag agccaccatg gtgaaactac taaaacttac agg 43 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAfamin -XbaI L1 <400> 3 tatattctag attcagttgc caatttttgg ac 32 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> SERUM-FREE MEDIUM FOR ENHANCED WNT ACTIVITY <130> 19PP30336 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAfamin <400> 1 atggtgaaac tactaaaact tacaggtttt atttttttct tgtttttttt gactgaatcc 60 ctaaccctgc ccacacaacc tcgggatata gagaacttca atagtactca aaaatttata 120 gaagataata ttgaatacat caccatcatt gcatttgctc agtatgttca ggaagcaacc 180 tttgaagaaa tggaaaagct ggtgaaagac atggtagaat acaaagacag atgtatggct 240 gacaagacgc tcccagagtg ttcaaaatta cctaataatg ttttacagga aaaaatatgt 300 gctatggagg ggctgccaca aaagcataat ttctcacact gctgcagtaa ggttgatgct 360 caaagaagac tctgtttctt ctataacaag aaatctgatg tgggatttct gcctcctttc 420 cctaccctgg atcccgaaga gaaatgccag gcttatgaaa gtaacagaga atccctttta 480 aatcactttt tatatgaagt tgccagaagg aacccatttg tcttcgcccc tacacttcta 540 actgttgctg ttcattttga ggaggtggcc aaatcatgtt gtgaagaaca aaacaaagtc 600 aactgccttc aaacaagggc aatacctgtc acacaatatt taaaagcatt ttcttcttat 660 caaaaacatg tctgtggggc acttttgaaa tttggaacca aagttgtaca ctttatatat 720 attgcgatac tcagtcaaaa attccccaag attgaattta aggagcttat ttctcttgta 780 gaagatgttt cttccaacta tgatggatgc tgtgaagggg atgttgtgca gtgcatccgt 840 gacacgagca aggttatgaa ccatatttgt tcaaaacaag attctatctc cagcaaaatc 900 aaagagtgct gtgaaaagaa aataccagag cgcggccagt gcataattaa ctcaaacaaa 960 gatgatagac caaaggattt atctctaaga gaaggaaaat ttactgacag tgaaaatgtg 1020 tgtcaagaac gagatgctga cccagacacc ttctttgcga agtttacttt tgaatactca 1080 aggagacatc cagacctgtc tataccagag cttttaagaa ttgttcaaat atacaaagat 1140 ctcctgagaa attgctgcaa cacagaaaac cctccaggtt gttaccgtta cgcggaagac 1200 aaattcaatg agacaactga gaaaagcctc aagatggtac aacaagaatg taaacatttc 1260 cagaatttgg ggaaggatgg tttgaaatac cattacctca tcaggctcac gaagatagct 1320 ccccaactct ccactgaaga actggtgtct cttggcgaga aaatggtgac agctttcact 1380 acttgctgta cgctaagtga agagtttgcc tgtgttgata atttggcaga tttagttttt 1440 ggagagttat gtggagtaaa tgaaaatcga actatcaacc ctgctgtgga ccactgctgt 1500 aaaacaaact ttgccttcag aaggccctgc tttgagagtt tgaaagctga taaaacatat 1560 gtgcctccac ctttctctca agatttattt acctttcacg cagacatgtg tcaatctcag 1620 aatgaggagc ttcagaggaa gacagacagg tttcttgtca acttagtgaa gctgaagcat 1680 gaactcacag atgaagagct gcagtctttg tttacaaatt tcgcaaatgt agtggataag 1740 tgctgcaaag cagagagtcc tgaagtctgc tttaatgaag agagtccaaa aattggcaac 1800 tga 1803 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI-hAfamin U1 <400> 2 tataatctag agccaccatg gtgaaactac taaaacttac agg 43 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAfamin -XbaI L1 <400> 3 tatattctag attcagttgc caatttttgg ac 32

Claims (11)

기본 배지, Wnt 단백질 또는 이의 발현 세포, 아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포, 및 혈청 알부민(serum albumin)을 유효성분으로 포함하고,
상기 혈청 알부민은 소혈청 알부민(BSA) 또는 인간 혈청 알부민(HSA)이고,
상기 혈청 알부민은 2 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포, 세포 응집체, 조직 단편 또는 장기 유사체의 배양용 무계면활성제 및 무혈청 배지 조성물
A basal medium, Wnt protein or its expressing cells, Afamin or its expressing cells, and serum albumin as active ingredients,
wherein the serum albumin is bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA);
The serum albumin is a surfactant-free and serum-free medium composition for culturing cells, cell aggregates, tissue fragments or organ analogues, characterized in that it is contained in a concentration of 2 mg/mL to 20 mg/mL
제1항에 있어서,
상기 Wnt 단백질은 Wnt3a 단백질인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
The method of claim 1,
The Wnt protein is characterized in that the Wnt3a protein, the medium composition.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 장기 유사체는 오가노이드인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
The method of claim 1,
The medium composition, characterized in that the organ analog is an organoid.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 기본 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete Medium, AminoMaxⅡ complete Medium, Chang's Medium 및 MesenCult-XF Medium으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
The method of claim 1,
The basal medium is DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium) ), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A medium, AmnioMax complete Medium, AminoMaxII complete Medium, Chang's Medium and MesenCult-XF Medium, characterized in that at least one selected from the group consisting of which is a medium composition.
제1항에 있어서,
상기 배지 조성물은 상피 성장 인자(EGF), 노긴(Noggin), 티아조비빈, CHIR99021 및 CHIR99021의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
The method of claim 1,
The medium composition is characterized in that it further comprises at least one selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts of epidermal growth factor (EGF), Noggin, thiazovivin, CHIR99021 and CHIR99021.
제1, 2, 4, 6, 7항 중 어느 한 항의 배지 조성물에서 줄기세포, 줄기세포의 집단, 줄기세포로부터 분화된 세포 또는 단리된 조직단편을 배양하는 단계를 포함하는, 오가노이드 수득 방법.
A method for obtaining an organoid comprising the step of culturing stem cells, a population of stem cells, cells differentiated from stem cells, or tissue fragments isolated from stem cells in the medium composition of any one of claims 1, 2, 4, 6, and 7.
제8항에 있어서,
상기 배지 조성물은 상피 성장 인자(EGF), 노긴(Noggin), 티아조비빈, CHIR99021 및 CHIR99021의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것인, 오가노이드 수득 방법.
9. The method of claim 8,
The medium composition further comprises one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts of epidermal growth factor (EGF), Noggin, thiazovivin, CHIR99021 and CHIR99021.
아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포 및 혈청 알부민(serum albumin)을 유효성분으로 포함하고,
상기 혈청 알부민은 소혈청 알부민(BSA) 또는 인간 혈청 알부민(HSA)이고,
상기 혈청 알부민은 2 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료 내 Wnt 단백질의 활성 증진용 조성물.
Afamin or its expression cells and serum albumin (serum albumin) as an active ingredient,
wherein the serum albumin is bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA);
The composition for enhancing the activity of Wnt protein in a biological sample, characterized in that the serum albumin is contained in a concentration of 2 mg/mL to 20 mg/mL.
아파민(Afamin) 또는 이의 발현 세포 및 혈청 알부민(serum albumin)을 유효성분으로 포함하고,
상기 혈청 알부민은 소혈청 알부민(BSA) 또는 인간 혈청 알부민(HSA)이고,
상기 혈청 알부민은 2 mg/mL 내지 20 mg/mL 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료 내 Wnt 단백질의 안정화용 조성물.
Afamin or its expression cells and serum albumin (serum albumin) as an active ingredient,
wherein the serum albumin is bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA);
The composition for stabilizing Wnt protein in a biological sample, characterized in that the serum albumin is contained in a concentration of 2 mg/mL to 20 mg/mL.

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