KR102413699B1 - 아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법 - Google Patents
아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법에 관한 것으로서, 포포나무 잎 추출물에 극성이 다른 유기용매를 혼합하여 분리물을 제조하고, 상기 제조된 분리물은 실리카겔을 고정상으로 하여 관-크로마토그램 기법을 수행하여 아세토제닌 성분과 항염증 활성 분리물을 각각 분리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법은 항염증 활성을 나타내는 기능성 분리물을 포포나무 잎 추출물로부터 제조하고, 분리물에 존재할 수 있는 신경독성 물질인 아세토제닌 성분을 효율적으로 분리하는 방법을 통해, 기능성 식품, 기능성 화장품 및 의약품 등에 다양하게 적용될 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따른 아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법은 항염증 활성을 나타내는 기능성 분리물을 포포나무 잎 추출물로부터 제조하고, 분리물에 존재할 수 있는 신경독성 물질인 아세토제닌 성분을 효율적으로 분리하는 방법을 통해, 기능성 식품, 기능성 화장품 및 의약품 등에 다양하게 적용될 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법에 관한 것으로서, 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가지는 분리물을 제조하기 위한 최적 조건을 선정하여 분리하고, 상기 분리된 분리물 성분 중 항염증 활성과 관계없고 신경독성을 나타내는 아세토제닌 성분을 분리함으로써, 포포나무 잎 추출물이 더욱 안전한 기능성 식품, 기능성 화장품 및 의약품 등의 원료로 사용될 수 있는 아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법에 관한 것이다.
포포나무(Asimina triloba)는 미국에서 paw paw tree로 알려져 있으며, 미국 동부가 원산지이고, 동부의 네브래스카주(Nebraska)에서 중부의 오클라호마주(Oklahoma)에 걸쳐 분포한다. 포포나무의 식물학적 연구를 통해, 그 과일과 씨앗으로부터 오일(oil), 지질(lipid), 지방산(fatty acid), 단백질(protein)이 분리되었고, 타닌(tannin), 시토스테롤(sitosterol), 카페익산(caffeic acid)과 프로시아니딘(procyanidin), 퀘르세틴(quercetin), 퀘르세틴 글리코시드(quercetin glycoside) 같은 플라보노이드(flavonoid)류 그리고 상당수의 이소퀴놀린알칼로이드(isoquinoline alkaloid)가 분리되었다.
포포나무 열매와 종자를 중심으로 다양한 종류의 아세토제닌(acetogenin) 성분과 관련된 약리학적 연구와 보고가 진행되고 있으며, 아세토제닌(acetogenin) 외에도 카테킨(catechin)이나 에피카테킨(epicatechin) 등의 플라보노이드(flavonoid)류 성분이 확인되었다. 국내에서도 재배가 가능한 것으로 알려지기 시작하면서 최근 전남 보성 등 일부 지역을 중심으로 도입되기 시작함에 따라 국내에서 생산된 포포나무 원료에 대한 연구 및 제품개발이 필요할 것으로 보인다.
특히 이미 활용이 일정 수준 이상으로 이루어지고 있는 열매 부위 외에도 잎이나 가지 등의 부위가 이용 가능한 것으로 알려지고 있으므로 해당 부위에 대한 연구 및 기술 개발이 필요하다. 또한, 포포나무 잎 추출물 중 다량으로 포함되어 있는 루틴은 항산화 및 항균, 항당뇨, 항암 활성 등에 관여하는 물질로서 포포나무 잎을 활용한 제품이나 기술개발에 중요한 지표로서 활용될 수 있다.
상기와 같은 생리활성 가능성에도 불구하고 국내에 알려지거나 도입되기 시작한 지 얼마 되지 않아 아직까지 포포나무 관련 기술이 많지 않으므로, 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 안전한 분리물의 개발이 요구된다.
본 발명은 상기 종래기술이 갖는 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가지는 분리물을 제조하기 위한 최적 조건을 선정하여 분리하고, 상기 분리된 분리물 성분 중 항염증 활성과 관계없고 신경독성을 나타내는 아세토제닌 성분을 분리함으로써, 포포나무 잎 추출물이 더욱 안전한 기능성 화장품, 의약품 등의 원료로 사용될 수 있도록 함에 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법은 포포나무 잎 추출물에 극성이 다른 유기용매를 혼합하여 분리물을 제조하고, 상기 제조된 분리물은 실리카겔을 고정상으로 하여 관-크로마토그램 기법을 수행하여 아세토제닌 성분과 항염증 활성 분리물을 각각 분리하는 것을 특징으로 한다.
또, 상기 포포나무 잎 추출물은, 포포나무 잎 100중량부에 대하여 50% 에탄올 2,000~3,000중량부를 혼합하여 60~90℃의 온도에서 3~4시간 동안 추출하여 여과한 후, 감압농축하여 동결건조시켜 제조된 것을 특징으로 한다.
또, 상기 분리물은, 포포나무 잎 추출물에 순차적으로 n-hexane, chloroform, ethylacetate를 혼합하여 용매별 분획을 실시한 후, 여과와 감압농축을 통해 제조되는 것을 특징으로 한다.
또, 상기 제조된 분리물을 메탄올에 용해시킨 후, 실리카겔을 고정상으로 하여 관-크로마토그램 기법을 수행하되, n-hexane을 용출 용매로 하여 아세토제닌 성분을 분리한 후, 메탄올을 용출 용매로 하여 항염증 활성 분리물을 분리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법은 항염증 활성을 나타내는 기능성 분리물을 포포나무 잎 추출물로부터 제조하고, 분리물에 존재할 수 있는 신경독성 물질인 아세토제닌 성분을 효율적으로 분리하는 방법을 통해, 기능성 식품, 기능성 화장품 및 의약품 등에 다양하게 적용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 포포나무 잎 추출물의 제조공정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 포포나무 잎 추출물로부터 분리물의 제조공정을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 분리물로부터 아세토제닌 성분의 분리 공정을 나타낸 도면이다.
도 4은 본 발명에 따른 추출 조건별 포포나무 잎 추출물의 항염증 활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 분리물의 항염증 활성을 나타낸 도면이다.
도 6는 본 발명에 따른 분리물의 아세토제닌 함량을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명에 따른 아세토제닌 분리 공정 전후의 아세토제닌 성분 함량을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 아세토제닌 분리 공정 전후의 항염증 활성 분리물의 주요 성분 함량을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 포포나무 잎 추출물로부터 분리물의 제조공정을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 분리물로부터 아세토제닌 성분의 분리 공정을 나타낸 도면이다.
도 4은 본 발명에 따른 추출 조건별 포포나무 잎 추출물의 항염증 활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 분리물의 항염증 활성을 나타낸 도면이다.
도 6는 본 발명에 따른 분리물의 아세토제닌 함량을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명에 따른 아세토제닌 분리 공정 전후의 아세토제닌 성분 함량을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 아세토제닌 분리 공정 전후의 항염증 활성 분리물의 주요 성분 함량을 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법에 관한 것이다.
더 상세하게는, 포포나무 잎 추출물에 극성이 다른 유기용매를 혼합하여 분리물을 제조하고, 상기 제조된 분리물은 실리카겔을 고정상으로 하여 관-크로마토그램 기법을 수행하여 아세토제닌 성분과 항염증 활성 분리물을 각각 분리하는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 포포나무 잎 추출물의 제조공정을 나타낸 도면이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 포포나무 잎 추출물의 분리물을 제조하기 위하여 먼저 포포나무 잎 추출물을 제조한다.
포포나무 잎은 추출효율을 높이기 위하여, 수분함량이 5% 이하가 되도록 건조하여 10~40mesh의 크기로 분쇄하여 사용한다.
포포나무 잎 추출물을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 용매 추출, 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출, 여과법 등 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명에서는 환류냉각 추출에 의해 추출하는 것으로, 본 발명에서 사용하는 추출용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들 유기용매를 혼합하여 선택될 수 있으며, 바람직하게는 50% 에탄올을 사용한다.
더 상세하게는, 상기 포포나무 잎 추출물은 포포나무 잎 100중량부에 대하여 50% 에탄올 2000~3000중량부를 혼합하고, 60~90℃의 온도에서 3~4시간 동안 추출하여 여과한 후, 감압농축하여 동결건조시켜 추출하는 것이다.
여기서, 상기 추출용매의 혼합량, 추출온도 및 추출시간을 벗어나면 추출효율이 떨어지거나 성분의 변화가 생길 수 있다.
도 2는 본 발명에 따른 포포나무 잎 추출물로부터 분리물의 제조공정을 나타낸 도면이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 상기의 방법으로 제조된 포포나무 잎 추출물에 대해 물과 섞이지 않는 극성이 다른 유기용매를 활용하여 분리물을 제조한다.
더 상세하게는, 상기 분리물은 포포나무 잎 추출물을 증류수에 용해 및 분산시킨 후, 순차적으로 n-hexane, chloroform, ethylacetate를 혼합하여 용매별 분획을 실시한 후, 여과와 감압농축을 통해 제조되도록 한다.
도 3은 본 발명에 따른 분리물로부터 아세토제닌 성분의 분리 공정을 나타낸 도면이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 상기의 방법으로 제조된 분리물을 메탄올에 용해시킨 후, 실리카겔(silica-gel)을 고정상으로 하여 관-크로마토그램 기법을 수행하되, n-hexane을 용출 용매로 하여 아세토제닌 성분을 분리시킨 후, 메탄올을 용출 용매로 하여 항염증 활성 분리물을 분리시키도록 한다.
상기의 방법으로 분리된 항염증 활성 분리물은 신경독성을 나타낼 수 있는 아세토제닌 성분이 제거된 안전한 조성물로서, 기능성 식품, 기능성 화장품 및 의약품 등에 다양하게 적용될 수 있다.
전체 조성물에 대하여, 상기의 방법으로 분리된 항염증 활성 분리물은 1~30중량%를 유효성분으로 포함하는 것이 바람직하다.
이는 최소한의 항염증 활성 성분 효과를 달성할 수 있도록 조성물의 함량이 상기 최소치 이상인 것이 바람직하며, 또한 과량 첨가에 따른 사용감 저하 및 각종 제형에의 적용가능성을 고려하여 조성물의 함량이 상기 최대치 이하인 것이 바람직하다.
이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하 기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것이 아님은 통상의 기술자에게 있어서 명백한 사실이다. 즉, 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 통상의 기술자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
실시예 1 : 추출물 제조
1) 원료
실험에 사용된 포포나무 잎은 전남 보성군에서 재배되고 있는 것을 제공받은 것이다.
2) 추출물 제조
건조 후 분쇄된 포포나무 잎에 표 1과 같은 조건을 적용하여 추출물을 제조하였다. 가열 온도는 각 조건의 용매가 끓을 수 있도록 하였으며, 가열 시간은 용매가 끓기 시작한 후부터 3시간으로 하였다. 추출방법 및 조건에 따른 추출물은 도 1과 같은 과정을 거쳐 얻어진 추출물 양을 바탕으로 수율을 산출하였다.
| 추출물 구분 | 정제수 | 주정(95%) | 추출 수율(%) |
| 열수(DW) | 100 | - | 26.8 |
| 25% 주정(25E) | 75 | 25 | 28.1 |
| 50% 주정(50E) | 50 | 50 | 32.0 |
| 75% 주정(75E) | 25 | 75 | 24.2 |
| 95% 주정(95E) | - | 100 | 18.2 |
실시예 2 : 분리물 제조
도 2와 같이 항염증 활성이 가장 우수한 50% 에탄올 추출물을 증류수에 분산시킨 후 순차적으로 n-hexane, chloroform, ethylacetate를 혼합하여 용매별 분획을 실시한 후 여과와 감압농축을 거쳐 분리물을 확보하였으며, 각 분리물의 분리 수율은 표 2와 같다.
| 분리물 구분 | 분리 수율(%) |
| n-Hexane 분리물(HF) | 0.84 |
| Chloroform 분리물(CF) | 1.82 |
| Ethyl acetate 분리물(EF) | 5.42 |
| 물 분리물(AF) | 91.92 |
실시예 3 : 아세토제닌 성분 분리를 위한 관-크로마토그래피
비극성 용매에 선택성을 가지는 아세토제닌 성분의 특성을 고려하여 메탄올에 용해시킨 항염증 활성이 높은 분리물을 극성의 silica-gel을 고정상으로 채운 관(column)에 로딩한 후, 비극성 용매인 n-hexane을 1차 용출 용매로 하여 아세토제닌 성분을 분리하였다. 이후 메탄올을 2차 용출 용매로 하여 항염증 활성 성분을 용출하였으며, 각 용출액은 감압농축을 실시한 후 최종 활성 분리물과 아세토제닌 성분 분리물을 각각 획득하였으며, 각 과정은 도 3과 같이 실시하였다.
실험 1 : Nitric oxide 생성 억제 효과 측정을 통한 항염증 활성의 측정
Nitric oxide(산화질소)는 생체 내에서 합성 효소에 의해 L-arginine(엘-아르기닌)으로부터 생성되는 자유 라디칼이며, 염증반응의 매개체로써 시간이 지나면 nitrite(아질산염), nitrate(질산염) 등의 안정한 화합물로 존재하며, 이 과정에서 형성되는 peroxynitrite anion(퍼옥시니트리트 음이온)으로 인해 혈관투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐 아니라, cyclooxygenase(시클로옥시게나아제)를 활성화하여 prostaglandin(프로스타글란딘)과 같은 염증 매개체의 생합성을 촉진함으로써 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다. 추출물 및 분리물 시료의 nitric oxide 생성억제 효과를 측정하기 위하여 미리 배양된 Raw 264.7 세포를 96 well plate에 2*104 cells/well이 되도록 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 각 시료를 4∼200㎍/㎖의 농도로 처리한 후, lipopolysaccharide(리포 다당류, LPS, 2㎍/㎖)를 혼합하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배지 상등액 100㎕와 Griess reagent(그리스 시약) 100㎕를 혼합하여 상온에서 15분간 반응시킨 다음 microplate reader를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료 대신 PBS를 처리한 대조구의 흡광도를 기준으로 시료별 NO 생성억제 활성을 산출하였다.
포포나무 잎 추출물과 분리물의 항염증 활성을 확인하기 위한 nitric oxide 생성 억제 효과를 측정한 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다. Nitric oxide 생성 억제 효과에서 50% 생성을 억제하는 농도(SC50)를 산출하여 각 시료의 활성을 비교하였으며, 결과값이 낮을수록 우수한 활성을 가지는 것으로 나타났다. 각 추출물의 측정 결과에서 50% 에탄올 추출물과 75% 에탄올 추출물이 각각 0.309mg/mL와 0.317mg/mL의 SC50 값을 나타냄으로써 다른 추출 조건에 비해 우수한 항염증 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 가장 활성이 높았던 50% 에탄올 추출물을 도 2와 같은 과정을 통해 분리한 1차 분리물의 nitric oxide 생성억제 효과 측정 결과에서 ethyl acetate 분리물(EF)의 SC50 값이 0.106mg/mL를 나타냄으로써 다른 분리물에 비해 현저히 높은 항염증 활성을 가지는 것으로 확인되었다.
실험 2 : 추출물 및 분리물 중 성분 분석 조건
신경독성을 유발할 수 있는 아세토제닌 성분과 항염증 활성을 가지는 분리물의 주요 성분인 quercetin, rutin의 함량 비교 분석을 위해 표 3과 같은 조건이 적용된 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS/MS)를 사용한 분석을 실시하였다. 아세토제닌 성분 분석을 위한 세부 질량분석 조건은 표 4와 같았으며, 항염증 활성 성분인 quercetin과 rutin의 분석을 위한 세부 질량분석 조건은 표 5와 같았다.
| 기기 | LCMS-8050(Shimadzu, japan) |
| 컬럼 | phenomenex Kinetex C18(150mm*2.1mm, 2.6㎛) |
| 이동상 조건 |
A : 0.1% formic acid 포함 물 B : Acetonitrile  |
| 유속 | 0.3㎖/min |
| 검출기 | 전자분무 이온화 장치를 장착한 질량분석기 |
| 주입량 | 5㎕ |
| 아세토제닌 성분 | Formula | 분자량 | ESI | Precursor ion | Product ion |
| type-I | C35H62O7 | 594.9 | + | 617.4 | 505.4 |
| type-II | C35H64O7 | 596.9 | + | 619.4 | 507.4 |
| type-III | C37H66O7 | 622.9 | + | 645.4 | 533.4 |
| type-IV | C37H66O8 | 638.9 | + | 661.4 | 549.4 |
| 활성 성분 | Formula | 분자량 | ESI | Precursor ion | Product ion |
| Quercetin | C15H10O7 | 302.2 | - | 301.1 | 151.1 |
| Rutin | C27H30O16 | 610.5 | - | 609.2 | 300.1 |
분리물을 대상으로 실시한 아세토제닌 성분 분석 결과 도 6과 같이 나타났다. 가장 높은 함량을 가지는 것으로 확인된 n-hexane(HF) 분리물의 함량을 100%로 하여 산출한 상대 함량에서 항염증 활성이 높게 나타났던 ethyl acetate 분리물(EF)의 아세토제닌 성분 함량이 5.62% 수준으로 확인되었다.
또한, 아세토제닌 성분의 소량으로도 신경독성 등을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있으므로 추출물이나 분리물에서 제거하여 안전성을 확보할 필요가 있다. 상기 분리물 중 항염증 활성이 높은 것으로 확인된 ethyl acetate 분리물(EF, before CC)과 도 3과 같은 공정을 실시하여 얻은 최종 활성 분리물(EF, after CC)의 아세토제닌 성분의 비교 분석 결과는 도 7에 나타내었다. 분리 정제 공정 전 함량 수준(EF, before CC)을 100%로 하여 비교한 결과, 정제 후의 함량이 0.94% 수준으로 나타남에 따라 99% 이상의 아세토제닌 성분 분리 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있다.
아세토제닌 성분을 분리하는 과정에서 항염증 활성 성분의 소실이 어느 정도 발생되었는지 확인하기 위해 1차 ethyl acetate 분리물(EF, before CC)과 분리 공정 후 ethyl acetate 분리물(EF, after CC)의 quercetin과 rutin 함량을 비교 분석하여 도 8에 나타내었다. Quercetin의 경우 100%에서 95.6%로 4.4% 수준의 감소를 보였으며, rutin은 100%에서 99.4%로 0.6% 수준의 감소를 나타냈다. 이와 같은 수준의 미량의 활성 성분 감소는 아세토제닌 성분 제거 수준을 감안하면 양호한 것으로 판단된다.
Claims (4)
- 포포나무 잎 추출물에 극성이 다른 유기용매를 혼합하여 분리물을 제조하고, 상기 제조된 분리물은 실리카겔을 고정상으로 하여 관-크로마토그램 기법을 수행하여 아세토제닌 성분과 항염증 활성 분리물을 각각 분리하되,
상기 포포나무 잎 추출물은,
포포나무 잎 100중량부에 대하여 50% 에탄올 2,000~3,000중량부를 혼합하여 60~90℃의 온도에서 3~4시간 동안 추출하여 여과한 후, 감압농축하여 동결건조시켜 제조되고,
상기 분리물은,
포포나무 잎 추출물에 순차적으로 n-hexane, chloroform, ethylacetate를 혼합하여 용매별 분획을 실시한 후, 여과와 감압농축을 통해 제조되며,
상기 제조된 ethylacetate 분리물을 메탄올에 용해시킨 후, 실리카겔을 고정상으로 하여 관-크로마토그램 기법을 수행하되, n-hexane을 용출 용매로 하여 아세토제닌 성분을 분리한 후, 메탄올을 용출 용매로 하여 항염증 활성 분리물을 분리하고,
전체 조성물에 대하여, 상기의 방법으로 분리된 항염증 활성 분리물은 1~30중량%를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 아세토제닌 성분이 분리된 포포나무 잎 추출물로부터 항염증 활성을 가진 분리물의 제조방법. - 삭제
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|---|---|---|---|---|
| KR101943300B1 (ko) * | 2017-04-27 | 2019-01-29 | 코스맥스 주식회사 | 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 개선하기 위한 조성물 |
| KR20180125757A (ko) | 2017-05-16 | 2018-11-26 | 김은경 | 포포나무 유효성분의 추출 방법 및 그 추출물을 포함하는 조성물 |
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|---|
| Pesticide science, 1997, 49(4), 372-378* |
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