KR102402037B1 - 생물반응기 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
역위된 원뿔형 생물반응기는 세포 또는 미생물을 성장시키기 위해 제공된다. 생물반응기는 용기 내에 내부 공간 및 천공된 장벽을 갖고, 상기 장벽을 통해 액체는 유동할 수 있고, 여기서, 세포 또는 미생물은 천공된 장벽을 통과할 수 없다. 상기 천공된 장벽은 생물반응기의 내부 공간을 제1 챔버와 제2 챔버로 나눈다. 세포는 제2 챔버에서 성장하고 액체, 예를 들어 성장 배지를 생물반응기를 통해 재순환시킴에 의해 관류될 수 있다. 다양한 유입구 포트 및 유출구 포트는 성장 배지의 유동 파라미터를 제어할 수 있더럭 한다.
Description
생존 세포 또는 미생물을 성장키기 위해 천공된 장벽을 포함하는 생물반응기가 본원에 기재된다. 유속 조절이 상이한 밀도의 세포 또는 미생물의 성장에 사용될 수 있는, 생물반응기에서 세포 또는 미생물을 성장시키기 위한 방법이 본원에 기재된다.
생물반응기는 미생물, 및 포유동물 및 인간 세포를 포함하는 단리된 생존 세포를 억제 및 제어된 환경에서 배양하기 위해 사용된다. 많은 경우에, 미생물 및 세포의 배양은 미생물 또는 세포가 주변 환경으로부터 물리적으로 분리되고 단리되어 멸균 환경에서 유지되는 것을 요구한다. 상기 경우는 치료학적 미생물 또는 세포, 예를 들어, 백신 및 유전학적으로 변형된 세포의 개발 및 제조, 및 유전자 치료요법을 위한 바이러스, 단백질, 항체 또는 치료학적 세포와 같은 치료요법을 위한 도구의 제조를 포함할 수 있다. 추가로, 환경으로부터 미생물 또는 세포의 억제 필요성은 상기 유기체가 유해한 경우일 수 있다.
상기 미생물 및 세포의 배양 및 프로세싱은 여러 전형적인 단계들을 필요로 하고 이는 생물 반응기에 소량의 미생물 또는 세포를 접종하고, 상기 미생물 또는 세포에 영양물, 배지, 보충물, 활성화제를 일정하게 공급하고, 미생물 또는 세포수를 측정하고, 생존성을 유지하고, 미생물 또는 세포의 정체성을 유지하고, 물리적 상태를 유지하고 세포 수거를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 생물반응기에서 미생물 및 세포의 성장 및 증식 동안에, 배지 및 글루코스 소비, 산소, 배지 내 H+ 이온, 전도성 등과 같은 파라미터를 모니터링하는 것은 또한 중요하다. 추가로, 장기 배양은 일반적으로 미생물 또는 세포가 번식함에 따라 상기 미생물 또는 세포를 보다 큰 컨테이너로의 전달을 포함한다. 미생물 또는 세포의 수가 요구되는 수 또는 활성에 도달하면, 미생물 또는 세포는 일반적으로 프로세싱되고 제형화된다. 상기 프로세싱은 성장 배지의 세척, 세포 또는 미생물의 농축, 배지의 최종 보존 배지로의 대체, 또는 추가의 사용을 위한 미생물 또는 세포의 팩키징 및 동결을 포함할 수 있다.
생물반응기는 상이한 목적을 위해 생존 세포 및/또는 미생물을 성장시키고, 증식시키고 분화시키고 유지하기 위해 사용될 수 있다. 상기 생물반응기에서 성장한 세포는 전형적으로 성장 배지에 의해 관류되고, 상기 성장 배지는 영양물 및 산소를 세포에 제공하고 세포에 의해 분비되는 폐기물 및 이산화탄소를 제거한다. 전형적으로, 다양한 단계는 상기 생물반응기에서 세포 또는 미생물의 배양 전 및/또는 배양 동안에 수행될 수 있고 이는 예를 들어, 세포를 선택하고, 세포를 배양하고, 세포를 변형시키고, 세포를 활성화시키고, 세포를 증대시키고 (세포 증식에 의해), 세포를 세척하고, 세포를 농축시키고, 세포 (또는 미생물)의 최종 제형화를 포함한다.
지금까지, 번식은 통상적으로 배지를 미생물 또는 세포와 함께 상이한 컨테이너 사이에 전달함에 의해 수행되고 다양한 도구가 상기 목적을 위해 사용되고, 예를 들어, 보다 큰 성장 용기, 원심분리 튜브 또는 백 (bat), 중간 저장 컨테이너 및 최종 팩키징을 포함한다. 상기 프로세스는 전형적으로 미생물 또는 세포가 하나의 단계로부터 다른 단계로 전달되는 개방 조작을 포함할 수 있다.
상기 지정된 단계들 중 여러 단계는 생물반응기로부터 세포를 제거하고 추가로 이들을 무엇 보다 원심분리, 분리, 항온처리, 계수, 시험, 분리, 제형화 및 팩키징에 적용할 것을 요구할 수 있다. 불행하게도, 세포 또는 미생물을 반응반응기로부터 취하는 것을 포함하는 임의의 단계는 원치 않는 미생물 (예를 들어, 진균류, 세균, 마이코플라스마 또는 다른 목적하지 않는 미생물과 같은)에 의한 세포의 오염 위험을 상당히 증가시키고 이는 세포 배양 프로스세스를 불리하게 손상시킬 수 있다.
세포 또는 미생물을 생물반응기로부터 취함에 의해 세포 또는 미생물을 프로세싱할 필요성을 감소시키거나 상기 단계들 및 배양 동안에 세포와의 인간 상호작용을 감소시키거나 제거할 수 있는 밀폐된 시스템 생물반응기에 대한 오랜 염원의 필요성이 있다. 추가로, 조기 단계로부터 세포를 하나의 자동화되고 밀폐된 시스템에서 최종 생성물까지 프로세싱함에 의해 끝까지 프로세스를 자동화하고 최적화시킬 필요가 있다. 본원에 기재된 생물반응기는 이들 필요성을 해결하고 추가로 이로운 성장 조건을 제공하여 보다 높은 수율과 보다 낮은 배지의 필요성을 가능하게 한다.
하나의 양상에서, 본원에 기재된 것은 본원에서 세포 또는 미생물을 그 안에 성장시키기 위한 생물반응기이고, 상기 생물반응기는 다음을 포함한다:
- 그 안에 공간을 둘러싸는 밀폐된 용기;
- 그 안에 다수의 공극을 갖는 제1 장벽으로서, 상기 제1 장벽은 공간이 제1 챔버와 제2 챔버로 분할되도록 구성된 공간 내 밀폐적으로 배치되며, 여기서, 상기 제2 챔버는 그 안에 성장하는 세포 또는 미생물을 수용하도록 구성되어 있고 상기 공극의 직경이 제1 챔버와 제2 챔버 사이에서 그리고 그 반대에서만 유체 유동이 가능하도록 구성되어 있는, 제1 장벽,
- 유체를 상기 제1 챔버로 도입하기 위한 하나 이상의 유체 유입구 포트; 및
- 유체를 상기 제2 챔버로부터 유출하도록 하기 위한 하나 이상의 유출구 포트.
일부 관련 양상에서, 상기 제1 장벽은 용기에서 성장된 세포 또는 미생물이 제1 챔버와 제2 챔버 사이를 통과하도록 하지 않는다.
일부 관련 양상에서, 상기 제1 챔버는 보다 낮은 챔버이고 상기 제2 챔버는 보다 높은 챔버이고 여기서 상기 유체 유동은 상류 유동을 포함한다
일부 관련 양상에서, 상기 제1 챔버는 용기의 벽과 접촉하도록 배치된다.
일부 관련 양상에서, 생물반응기는 그 안에 다수의 공극을 갖는 정렬 장벽을 추가로 포함하고; 상기 정렬 장벽은 상기 제1 챔버 아래 제1 챔버의 공간 내에 배치되고; 상기 정렬 장벽은 유체 유동을 정렬하고 버블 통과를 방지하도록 구성된다.
일부 관련 양상에서, 상기 정렬 장벽은 유체 유동의 속도를 제어하도록 구성된다.
일부 관련 양상에서, 상기 정렬 장벽의 공극은 원뿔형 형태를 포함한다.
일부 관련 양상에서, 생물반응기는 그 안에 다수의 공극을 갖는 추가의 스크리닝 장벽을 추가로 포함하고; 상기 스크리닝 장벽은 상기 제2 챔버의 상부 섹션에서 제2 챔버의 공간 내에 배치되어 상기 성장하는 세포 또는 미생물은 제1 장벽과 스크리닝 장벽 사이에 수용되고; 상기 스크리닝 장벽은 세포 통과를 방지하도록 구성된다.
일부 관련 양상에서, 생물반응기 용기는 적어도 2개의 부분으로 구성된다.
일부 관련 양상에서, 생물반응기의 용기는 제2 챔버 내에 배치된 유체에서 유체 속도 구배를 제공하도록 구성되어 상기 유체의 속도는 제1 장벽으로부터 유체의 상부 표면으로의 방향에서 감소하도록 한다.
일부 관련 양상에서, 적어도 제2 챔버는 상기 제2 챔버의 바닥에서 상부까지 증가하는 횡단면적을 포함한다.
일부 관련 양상에서, 상기 횡단면의 형태는 원형, 타원형, 다각형 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 관련 양상에서, 상기 용기의 형태는 원뿔 형태, 절두원추 형태, 테이퍼링 형태, 원통형 형태, 다각형 프리즘 형태, 타원 횡단면을 갖는 테이퍼링 형태, 다각형 횡단면을 갖는 테이퍼링 형태, 원통형 부분 및 테이퍼링 부분을 갖는 형태 및 원뿔형 또는 테이퍼 부분 및 반구형 부분을 갖는 형태 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 관련 양상에서, 하나 이상의 유체 유출구 포트 중 적어도 하나는 펌프에 유동적으로 연결되도록 구성되고, 상기 펌프는 제2 챔버로부터 유체를 수용하도록 구성되고, 임의로, 여기서, 상기 펌프는 추가로 유체를 유체 유입구 포트 중 적어도 하나를 통해 제1 챔버로 다시 재순환시키도록 구성된다.
일부 관련 양상에서, 상기 제2 챔버를 통한 유체의 유동 속도는 펌프의 펌핑 속도에 의해 제어된다.
일부 관련 양상에서, 상기 유체는 성장 배지, 세척 용액, 영양 용액, 수거 용액, 수확 용액, 저장 용액 및 이들의 임의의 조합물 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 관련 양상에서, 여기서, 하나 이상의 유체 유출구 포트는 상기 제2 챔버의 높이를 따라 상이한 위치에서 개방하는 다수의 유체 유출구 포트를 포함한다.
일부 관련 양상에서, 상기 제1 장벽은 고정된 비-이동성 장벽이다.
일부 관련 양상에서, 상기 고정된 장벽은 편평한 장벽, 생물반응기의 종축으로 특정 각도로 기울어진 편평한 장벽, 용기의 상부와 대면하는 오목한 상부 표면을 갖는 오목한 장벽, 테이퍼 장벽 및 원뿔형 장벽으로부터 선택된다.
일부 관련 양상에서, 생물반응기는 추가로 생물반응기로부터 세포를 수확하도록 구성된 제1 장벽의 상부 표면에 인접하게 배치된 적어도 하나의 수확 포트를 포함한다.
일부 관련 양상에서, 생물반응기는 역위되도록 구성된다.
일부 관련 양상에서, 상기 생물반응기는 세포 또는 미생물을 지지하기 위해 제2 챔버내에 배치된 지지 매트릭스를 추가로 포함한다.
일부 관련 양상에서, 상기 생물반응기는 작동적으로 커플링되어 있고 적어도 하기 중 하나로 제어하도록 구성된 제어기를 추가로 포함한다:
상기 용기 내 유체의 하나 이상의 화학적 및/또는 물리적 성질을 감지하도록 구성된 하나 이상의 센서를 포함하는 적어도 하나의 센서 유닛;
하나 이상의 유체 유출구 포트 및 유체 유입구 포트 내 유체의 유동을 제어하도록 구성된 다수의 제거 가능하게 그리고 개방 가능하고 페쇄 가능한 밸브;
유체 저장소로부터 펌프의 유입구 포트로 새로운 액체 유체의 유동을 제어하도록 구성된 제어 가능하게 그리고 개방 가능 하고 폐쇄 가능한 밸브;
용기 내 유체를 가열하도록 구성된 가열기 유닛;
용기 내 유체를 냉각하도록 구성된 냉각 유닛; 및
산소 공급원으로부터의 산소를 포함하는 가스의 상기 용기내 배치된 가스 분산 헤드로의 유동을 제어하도록 구성된 가스 밸브.
관련 양상에서, 상기 양상 중 어느 하나에 따라 생물반응기에서 세포 또는 미생물을 성장시키기 위한 방법이 기재되고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
- 세포 또는 미생물을 생물반응기의 제2 챔버로 도입하는 단계;
- 세포 또는 미생물에 유체를 관류시키는 단계;
- 세포를 목적하는 농도까지 성장시키는 단계; 및
- 상기 생물반응기로부터 세포 또는 미생물을 수확하는 단계.
일부 관련 양상에서, 관류시키는 단계는 상기 생물반응기 내 유체의 유동 수준 및/또는 유동 속도를 제어함을 포함한다.
일부 관련 양상에서, 관류시키는 단계는 상기 제1 장벽을 통한 유체의 재순환을 포함한다.
일부 관련 양상에서, 재순환시키는 단계는 하기 중 적어도 하나를 추가로 포함한다:
- 새로운 유체의 양을 생물반응기에 첨가하는 단계; 및
- 상기 생물반응기로부터 유체의 양을 인출하는 단계.
일부 관련 양상에서,
- 관류시키는 단계는 유체를 산소화시키는 단계를 추가로 포함하거나;
- 관류시키는 단계는 상기 생물반응기 내 유체의 유동 수준 및/또는 유동 속도를 제어함을 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 제2 챔버 내 유체의 수준을 증가시키는 단계를 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 세포 또는 미생물을 세척하는 하나 이상의 단계를 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 제2 챔버 내 유체의 용적을 감소시킴에 의해 세포를 농축시키는 단계를 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 세포 매쓰 상에 적용되는 중력과 상류 유체 유동의 선택된 속도 간의 균형으로 인해, 제2 챔버 내 특정 영역에서 부유 위치에서 세포 매쓰를 유지하는 단계를 추가로 포함하거나;
이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 관련 양상에서, 세포는 접착성 세포이고 상기 방법은 세포가 제2 챔버내에 배치된 하나 이상의 표면에 부착되도록 하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 관련 양상에서, 하나 이상의 표면은 제1 장벽의 상부 표면, 제2 챔버의 벽의 표면, 상기 제2 챔버 내에 배치된 세포 지지 매트릭의 표면 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 관련 양상에서, 상기 방법은 상기 세포를 추가의 상이한 세포와 함께 동시-배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 관련 양상에서,
- 상기 세포는 T-세포이고 추가의 상이한 세포는 사이토킨 분비 세포이거나;
- 상기 세포는 T-세포이고 추가의 상이한 세포는 항원 제시 세포이거나;
- 상기 세포는 배아 줄기 세포이고 추가의 상이한 세포는 피더 세포이다.
일부 관련 양상에서, 세포를 도입하고, 관류시키고, 성장시키고, 세척하고, 수확하는 단계는 연속적이고 상기 제2 챔버에서 또는 이로부터 수행된다.
하나의 양상에서, 본원에 기재된 것은 그 안에 세포 또는 미생물을 성장시키기 위한 생물반응기이고, 상기 생물반응기는 그 안에 공간을 둘러싸는 용기 벽을 갖는 용기; 그 안에 다수의 천공을 갖는 천공된 장벽으로서, 상기 장벽은 상기 공간을 제1 챔버와 제2 챔버로 분할하기 위해 공간 내 밀폐적으로 배치되고, 여기서, 상기 천공의 직경이 제1 챔버로부터 제2 챔버로 그리고 상기 제2 챔버로부터 상기 제1 챔버로 유체 유동만을 허용하도록 구성되는 천공된 장벽, 액체를 상기 제1 챔버로 도입하기 위한 하나 이상의 유체 유입구 포트; 및 액체가 제2 챔버를 이탈하도록 하기 위한 하나 이상의 유체 유출구 포트를 포함한다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 상기 제1 챔버 내에 배치되고 하나 이상의 유체 유입구 포트에 유동적으로 커플링된 유체 임펠러를 포함한다. 일부 구현예에 따라, 상기 유체 임펠러는 액체가 하나 이상의 유체 유입구 포트로 펌핑되는 경우, 상기 제1 챔버 내 다수의 제트의 액체를 분사시키기 위해 구성된 다수의 천공 및/또는 노즐을 갖는 중공 구성원을 포함한다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 생물반응기는 산소를 액체에 제공하기 위해 구성된 가스 분배 헤드를 추가로 포함한다.
또 다른 관련 양상에서, 하나 이상의 유체 유출구 포트는 단일의 유체 유출구 포트를 포함하고 하나 이상의 유입구 포트는 단일의 유체 유입구 포트를 포함하고 여기서, 상기 유체 유입구 포트는 상기 액체를, 유체 유입구 프트에 유체적으로 연결된 펌프에 의해 제1 챔버로 도입하기 위해 구성되고, 여기서, 상기 펌프는 단일 유체 유출구 포트에 유체적으로 연결되도록 구성되고 상기 액체를 상기 제2 챔버로부터 수용하도록 구성되고 생물반응기 내에서 액체를 재순환시키기 위해 구성된다.
관련 양상에서, 상기 제2 챔버를 통한 액체의 유동 속도는 펌프에 의한 액체의 펌핑 속도를 제어함에 의해 제어된다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 액체는 성장 배지, 세척 용액, 영양 용액, 수거 용액, 수확 용액, 저장 용액 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
관련 양상에서, 하나 이상의 유체 유입구 포트는 하나의 유체 유입구 포트를 포함하고 하나 이상의 유체 유출구 포트는 상기 제2 챔버의 높이를 따라 상이한 위치에서 개방하는 다수의 유체 유출구 포트를 포함하고 여기서, 상기 다수의 유체 유출구 포트는 각각 유체 매니폴드에 유체적으로 연결될 수 있도록 구성되고, 여기서, 상기 유체 매니폴드는 하나의 펌프에 유체적으로 연결되어 상기 다수의 유체 유출구 포트의 임의의 선택된 유체 아웃풋 포트는 상기 제2 챔버로부터의 액체를 선택된 유체 아웃풋 포트를 통해 펌프로 수용하기 위해 그리고 단일의 유체 유입구 포트를 통해 제1 챔버로의 펌프에 의한 액체를 도입하기 위해 상기 유체 매니폴드에 의한 펌프로 유체적으로 제어 가능하게 연결되도록 구성되고, 여기서, 제2 챔버 내 액체의 수준은 다수의 유체 유출구 포트로부터 선택된 유체 유출구에 의해 결정된다.
또 다른 관련 양상에서, 상기 생물반응기는 다수의 밸브를 추가로 포함하고, 다수의 유체 유출구 포트의 각각의 유체 유출구 포트는 다수의 밸브 중 하나의 밸브에 유체적으로 커플링되도록 구성되고, 여기서, 상기 유체 매니폴드는 유체 유출구 포트에 연결된 밸브를 통한 다수의 유체 유출구 포트의 임의의 선택된 유체 유출구 포트에 유체적으로 선택가능하게 연결될 수 있도록 구성된다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 생물반응기는 상기 생물반응기 내에 배치된, 액체의 온도를 조절하기 위해 구성된 온도 제어 유닛을 추가로 포함한다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 온도 제어 유닛은 가열 요소, 냉각 요소, 및 가열 요소와 냉각 요소의 조합으로부터 선택된다.
관련 양상에서, 생물반응기는 제2 챔버 내에 배치된 액체에서 유체 속도 구배를 확립하기 위해 구성되어 상기 제2 챔버 내 액체의 속도는 천공된 장벽으로부터 상기 제2 챔버 내 액체의 상부 표면을 향하는 방향으로 점진적으로 감소한다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 액체 내 유체 속도 구배는 제2 챔버의 상부 부분의 횡단면적이 제2 챔버의 바닥 부분의 횡단면적 보다 더 크도록 함에 의해 성취된다.
또 다른 관련 양상에서, 상기 제2 챔버의 횡단면의 형태는 원형, 타원형, 다각형 및 정다각형으로부터 선택된다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 생물반응기의 용기 벽은 그 안에 형성된 하나 이상의 폐쇄 가능하고/하거나 밀폐 가능한 개방구를 포함한다. 또 다른 관련 양상에서, 하나 이상의 폐쇄 가능하고/하거나 밀폐 가능한 개방구는 생물반응기의 상부에 배치된 하나 이상의 개방구, 및 상기 생물반응기의 측벽에 배치된 하나 이상의 개방구 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 용기 벽에 밀폐적으로 배치되고 세포 또는 미생물을 니들을 통해 제2 챔버로 주사하기 위한 개스킷을 통한 시린지 니들의 삽입을 위해 구성된 자가-밀봉 개스킷을 추가로 포함한다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기의 형태는 원뿔 형태, 절두원추 형태, 테이퍼링 형태, 원통형 형태, 다각형 프리즘 형태, 타원 횡단면을 갖는 테이퍼링 형태, 다각형 횡단면을 갖는 테이퍼링 형태, 원통형 부분 및 테이퍼링 부분을 갖는 형태 및 원뿔형 또는 테이퍼 부분 및 반구형 부분을 갖는 형태 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
관련 양상에서, 상기 천공된 장벽은 고정된 비-이동성 천공된 장벽이다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 고정된 천공된 장벽은 편평한 천공된 장벽, 생물반응기의 종축으로 특정 각도로 기울어진 편평한 장벽, 생물반응기의 상부와 대면하는 오목한 상부 표면을 갖는 오목한 천공된 장벽, 테이퍼링 천공된 장벽 및 원뿔형 천공된 장벽으로부터 선택된다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 천공된 장벽은 이동 가능한 천공된 장벽이다. 또 다른 관련 양상에서, 이동 가능한 천공된 장벽은 고정 가능하고/하거나 스트레칭 가능한 구성원에 의해 용기 벽에 밀폐적으로 부착된 이동 가능한 천공된 장벽으로서 상기 고정 가능하고/하거나 스트레칭 가능한 구성원이 천공된 장벽의 주위에 밀폐적으로 부착되고 용기 벽에 밀페적으로 부착되어 있는 천공된 장벽, 변형될 수 있고/있거나 유연한 천공된 장벽 및 생물반응기의 상부와 대면하는 볼록한 상부 표면을 갖는 볼록한 버클링 천공된 장벽으로부터 선택된다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 천공된 장벽은 생물반응기의 외부에 배치된 자기를 사용하여 힘을 상기 천공된 장벽에 적용함에 의해 천공된 장벽의 이동 및/또는 기울어짐 및/또는 변형 및/또는 버클링을 가능하게 하기 위해 부착된 자기 구성원을 추가로 포함한다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 천공된 장벽은 용기 내에서 성장된 세포 또는 미생물이 제1 챔버로부터 제2 챔버로 및 제2 챔버로부터 제1 챔버로 천공된 장벽을 통과하지 못하도록 한다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 용기의 바닥과 상기 제1 및 제2 챔버를 분리하는 천공된 장벽 사이의 제1 챔버내 추가의 천공된 장벽, 또는 셀과 용기의 상부 사이에 제2 챔버 내 추가의 천공된 장벽, 또는 이의들 조합을 추가로 포함한다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 생물반응기로부터 세포를 수확하기 위해 구성된 천공된 장벽의 상부 표면에 인접한 용기 벽내 배치된 적어도 하나의 수확 포트 및 제2 챔버내로의 개방구를 추가로 포함한다. 관련 양상에서, 상기 생물반응기는 천공된 장벽 및 상기 천공된 장벽의 상부 표면에서 개방구에 밀페적으로 부착된 제1 말단부 및 제1 챔버의 벽 및 생물반응기 외부의 폐쇄 가능한 개방구를 통해 밀폐적으로 통과하는 제2 말단부를 갖는 중공 구성원을 포함하는 수확 포트를 추가로 포함한다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 생물반응기는 천공된 장벽의 상부 표면에 인접한 용기 벽에 배치된 적어도 하나의 수확 포트 및 제2 챔버로의 개방구를 포함하고, 상기 생물반응기는 적어도 하나의 수확 포트를 통해 세포의 수확을 원조하기 위해 수직 방향으로 특정 각도로 기울어지도록 구성된 기울어질 수 있는 생물반응기이다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 역위되도록 구성된다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 생물반응기로부터의 액체의 적어도 일부를 인출하기 위해 구성된 제1 챔버의 벽 또는 바닥 부분에 배치된 개방 가능하고.폐쇄 가능한 유출구 포트를 추가로 포함한다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 생물반응기는 유체 저장소로부터의 액체를 생물반응기에 도입하기 위해 생물반응기의 외부에 배치된 유체 저장소에 유체적으로 커플링될 수 있는 펌프에 유체적으로 연결되도록 구성된다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 액체의 하나 이상의 화학물질 및/또는 물리적 성질을 감지하기 위해 구성된 적어도 하나의 센서를 포함하는 적어도 하나의 센서 유닛을 추가로 포함한다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 생물반응기의 작동을 제어하기 위해 제어기에 작동적으로 커플링될 수 있다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 제1 챔버내에 배치되고 하나 이상의 유체 유입구 포트의 적어도 하나의 유체 유입구 포트에 유체적으로 커플링된 유체 임펠러를 추가로 포함하고, 상기 유체 임펠러는 그 안에 액체가 적어도 하나의 유체 유입구 포트로 펌핑되는 경우 제1 챔버 내 다중 제트의 액체를 분사히기 위해 구성된 다수의 천공 및/또는 유체 노즐을 갖는 중공 구성원을 포함한다. 또 다른 관련 양상에서, 하나 이상의 유체 유입구 포트 및 하나 이상의 유체 유출구 포트는 하나 이상의 유체 유입구 포트 및 하나 이상의 유체 유출구 포트를 제어 가능하게 개방하고 폐쇄시키기 위해 밸브를 포함하거나 이에 유체적으로 연결되도록 구성된다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 밸브는 제어기에 연결될 수 있는 수동 작동 가능한 밸브 및 자동으로 개방 가능한 밸브로부터 선택된다. 또 다른 관련 양상에서, 자동적으로 작동 가능한 밸브는 밸브의 개방 및 폐쇄를 자동적으로 제어하기 위해 제어기에 연결될 수 있는 전기적으로 작동되는 솔레노이드 기반 밸브이다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 세포 또는 미생물을 지지하기 위해 제2 챔버내에 배치된 지지 매트릭스를 추가로 포함한다.
하나의 양상에서, 본 출원은 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 및 상기 생물반응기내 액체를 순환시키기 위한 펌프를 포함하는 생물반응기 시스템을 기재한다.
관련 양상에서, 상기 펌프는 하나 이상의 유체 유출구 포트로부터 액체를 수용하고 상기 수용된 액체를 하나 이상의 유체 유입구 포트로 펌핑한다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 생물반응기 시스템은 새로운 액체를 제1 챔버로 펌핑될 펌프로 제어 가능하게 제공하기 위한 펌프의 유입구 포트로 유체적으로 커플링될 수 있는 유체 저장소를 추가로 포함한다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 생물반응기의 작동을 수동으로 또는 자동으로 제어하기 위한 제어기를 추가로 포함한다. 또 다른 관련 양상에서, 상기 제어기는 액체의 하나 이상의 화학적 및/또는 물리적 성질을 감지하기 위한 하나 이상의 센서를 포함하는 적어도 하나의 센서 유닛, 하나 이상의 유체 유출구 포트 유출구 내 액체의 유동을 제어하기 위한 다수의 제어 가능하게 개방될 수 있고 폐쇄 가능한 밸브, 유체 저장소로부터 펌프의 펌프의 유입구 포트로 새로운 액체의 유동을 제어하기 위한 제어 가능하게 개방될 수 있고 폐쇄 가능한 밸브, 액체를 가열하기 위한 가열기 유닛, 액체를 냉각시키기 위한 냉각 유닛, 및 생물반응기 내 배치된 가스 분배 헤드로 산소 공급원으로부터 산소를 포함하는 가스의 유동을 제어하기 위한 가스 밸브 중 하나 이상과 작동저으로 커플링된다.
관련 양상에서, 상기 생물반응기는 세포 또는 미생물을 지지하기 위해 제2 챔버내에 배치된 지지 매트릭스를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 주요 과제는 특히 명세서의 결론 부분에서 지적되고 명백히 청구된다. 그러나, 본원에 기재된 생물반응기는 작동 구성 및 방법 둘 다에 관하여 이의 목적, 특징 및 이점과 함께 하기의 첨부된 도면과 함께 하기의 상세한 설명과 함께 최상으로 이해될 수 있다:
도 1은 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 일부 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고, 여기서, 상기 시스템은 천공된 장벽을 포함하는 생물반응기를 포함하고;
도 2는 생물반응기내 성장 배지의 수준을 제어 가능하게 조정하기 위한 다수의 유체 유출구 포트와 함께 생물반응기를 포함하는 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 일부 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 3은 천공된 장벽을 포함하는 원통형 형태를 갖는 생불반응기를 포함하는 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 일부 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 4a-4i는 천공된 장벽 (12)을 포함하는 생물반응기의 형태의 일부 구현예를 도시하는 개략적인 단면도이고; 도 4a는 원통형 부분 (304A) 및 절두원추 부분 (304B)를 갖는 형태를 갖는 생물반응기 (300)를 제공하고; 도 4b는 원통형 부분 (314A) 및 테이퍼링 부분 (314B)을 갖는 형태를 갖는 생물반응기 (310)를 나타내고; 도 4c는 원통형 부분 (324A) 및 테이퍼 부분 (324B)을 갖는 형태를 갖는 생물반응기 (320)의 또 다른 구현예를 나타내고; 도 4d는 테이퍼링 형태를 갖는 생물반응기 (330)를 나타내고; 도 4e는 테이퍼링 형태를 갖는 생물반응기 (340)의 또 다른 구현예를 나타내고; 도 4f는 원뿔형 부분 (354A) 및 절두원추 부분 (354B)을 갖는 형태를 갖는 생물반응기 (350)를 나타내고; 도 4g는 원통형 형태를 갖는 생물반응기 (360)를 나타내고; 도 4h는 반구 형태의 제1 챔버 (374A) 및 절두원추 부분 형태의 제2 챔버 (374B)를 포함하는, 성배와 유사한 형태를 갖는 생물반응기 (370)를 나타내고; 도 4i는 수직 벽 부분 (380H) 및 비스듬한 벽 부분 (380E)을 포함하는 생물반응기 (380)를 나타내고;
도 4j는 도 4i에 도시된 생물반응기 (380)의 도식적 상면도이고;
도 5는 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 일부 구현예에 따라, 생물반응기 시스템 (400)의 구성요소들을 도시하는 개략적 블록 다이아그램이고;
도 6a 및 6b는 기울어질 수 있는 생물반응기 (510)의 가능한 위치적 상태의 2개의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고; 도 6a에서, 상기 생물반응기 (510)는 수직 상태로 있고; 도 6b에서, 생물반응기 (510)는 기울어진 상태로 있고;
도 6c 및 6d는 고정된 비스듬한 천공된 장벽을 갖는 생물반응기 (550)의 2개의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 7-9는 생물반응기 (각각 610, 710, 및 810)의 3개의 상이한 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고, 상기 생물반응기는 3개의 상이한 유형의 비-평면 (편평하지 않은) 천공된 장벽 (각각 612, 712, 및 812)을 포함하고;
도 10a 및 10b는 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)을 포함하는 생물반응기 (910)의 상이한 상태의 2개의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 11a 및 11b는 버클링 천공된 장벽 (1012)을 포함하는 생물반응기 (1010)의 상이한 상태의 2개의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 12a 및 12b는 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 기울어질 수 있는 천공된 장벽 (1112)을 포함하는 생물반응기 (1110)의 상이한 작동 상태의 2개의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 13은 천공된 장벽 (12) 및 세포 캐리어 매트릭스 (1260)를 갖는 생물반응기 (10)를 포함하는 생물반응기 시스템 (1250)의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 14a-14c는 세포를 배양하기 위해 사용되는 생물반응기의 구현예의 도식(도 14a) 및 도 14a의 생물반응기를 사용하여 성장된 세포의 성장 곡선 (일수에 대한 세포의 수)의 도식을 보여주고; 도 14b는 T75 플라스크 (청색선) 및 생물반응기 (오렌지)에서 5일 후 성장 곡선을 보여주고; 도 14c는 배지의 변화와 함께 (청색선) 및 변화 없이 (회색선) T75 플라스크에서 성장한 세포와 비교하여, 생물반응기 (황색선)에서 성장 14일 후 성장 곡선을 보여주고;
도 15a-15d는 생물반응기에서 성장한 세포의 프로세싱의 구현예를 나타내고; 도 15a는 하나의 액체를 또 다른 하나로 대체하는, 예를 들어, 성장 배지를 세척 완충액으로 대체하는 구현예를 나타내고; 도 15b는 하나의 액체를 또 다른 액체로 대체하는 또 다른 구현예를 나타내고, 여기서, 상기 생물반응기는 세포 수준 위에 제2 (상부 챔버) 내의 위치에 위치된 제2 장벽 (장벽 2)을 포함하고; 도 15b에 나타낸 생물반응기 용기는 상기 이미지에 역위되고; 도 15c 및 도 15d는 2개의 천공된 장벽에 의해 3개의 챔버로 나누어진 2개의 절두원추 부분으로 구성된 생물반응기의 대표적인 다이아그램을 나타내고, 여기서 도 l5c는 세포 성장 단계 동안에 생물반응기를 입증하고, 도 15d는 세척 단계 동안에 이의 뒤집어진 위치의 생물반응기를 입증하고;
도 16은 유체 속도를 제어하도록 구성된 천공된 장벽을 도시하는 개략적인 단면도이다.
도해의 단순성과 명료함을 위해 도면에 나타낸 요소들은 필연적으로 스케일로 도시된 것이 아님을 이해할 것이다. 예를 들어, 요소들의 일부 치수는 명료함을 위해 다른 요소에 비해 과장될 수 있다. 추가로, 적당한 것으로 고려되는 경우, 참조 번호는 도면 중에서 상응하거나 유사한 요소들을 지적하기 위해 반복될 수 있다.
도 1은 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 일부 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고, 여기서, 상기 시스템은 천공된 장벽을 포함하는 생물반응기를 포함하고;
도 2는 생물반응기내 성장 배지의 수준을 제어 가능하게 조정하기 위한 다수의 유체 유출구 포트와 함께 생물반응기를 포함하는 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 일부 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 3은 천공된 장벽을 포함하는 원통형 형태를 갖는 생불반응기를 포함하는 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 일부 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 4a-4i는 천공된 장벽 (12)을 포함하는 생물반응기의 형태의 일부 구현예를 도시하는 개략적인 단면도이고; 도 4a는 원통형 부분 (304A) 및 절두원추 부분 (304B)를 갖는 형태를 갖는 생물반응기 (300)를 제공하고; 도 4b는 원통형 부분 (314A) 및 테이퍼링 부분 (314B)을 갖는 형태를 갖는 생물반응기 (310)를 나타내고; 도 4c는 원통형 부분 (324A) 및 테이퍼 부분 (324B)을 갖는 형태를 갖는 생물반응기 (320)의 또 다른 구현예를 나타내고; 도 4d는 테이퍼링 형태를 갖는 생물반응기 (330)를 나타내고; 도 4e는 테이퍼링 형태를 갖는 생물반응기 (340)의 또 다른 구현예를 나타내고; 도 4f는 원뿔형 부분 (354A) 및 절두원추 부분 (354B)을 갖는 형태를 갖는 생물반응기 (350)를 나타내고; 도 4g는 원통형 형태를 갖는 생물반응기 (360)를 나타내고; 도 4h는 반구 형태의 제1 챔버 (374A) 및 절두원추 부분 형태의 제2 챔버 (374B)를 포함하는, 성배와 유사한 형태를 갖는 생물반응기 (370)를 나타내고; 도 4i는 수직 벽 부분 (380H) 및 비스듬한 벽 부분 (380E)을 포함하는 생물반응기 (380)를 나타내고;
도 4j는 도 4i에 도시된 생물반응기 (380)의 도식적 상면도이고;
도 5는 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 일부 구현예에 따라, 생물반응기 시스템 (400)의 구성요소들을 도시하는 개략적 블록 다이아그램이고;
도 6a 및 6b는 기울어질 수 있는 생물반응기 (510)의 가능한 위치적 상태의 2개의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고; 도 6a에서, 상기 생물반응기 (510)는 수직 상태로 있고; 도 6b에서, 생물반응기 (510)는 기울어진 상태로 있고;
도 6c 및 6d는 고정된 비스듬한 천공된 장벽을 갖는 생물반응기 (550)의 2개의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 7-9는 생물반응기 (각각 610, 710, 및 810)의 3개의 상이한 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고, 상기 생물반응기는 3개의 상이한 유형의 비-평면 (편평하지 않은) 천공된 장벽 (각각 612, 712, 및 812)을 포함하고;
도 10a 및 10b는 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)을 포함하는 생물반응기 (910)의 상이한 상태의 2개의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 11a 및 11b는 버클링 천공된 장벽 (1012)을 포함하는 생물반응기 (1010)의 상이한 상태의 2개의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 12a 및 12b는 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 기울어질 수 있는 천공된 장벽 (1112)을 포함하는 생물반응기 (1110)의 상이한 작동 상태의 2개의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 13은 천공된 장벽 (12) 및 세포 캐리어 매트릭스 (1260)를 갖는 생물반응기 (10)를 포함하는 생물반응기 시스템 (1250)의 구현예를 도시하는 개략적인 부분 단면도이고;
도 14a-14c는 세포를 배양하기 위해 사용되는 생물반응기의 구현예의 도식(도 14a) 및 도 14a의 생물반응기를 사용하여 성장된 세포의 성장 곡선 (일수에 대한 세포의 수)의 도식을 보여주고; 도 14b는 T75 플라스크 (청색선) 및 생물반응기 (오렌지)에서 5일 후 성장 곡선을 보여주고; 도 14c는 배지의 변화와 함께 (청색선) 및 변화 없이 (회색선) T75 플라스크에서 성장한 세포와 비교하여, 생물반응기 (황색선)에서 성장 14일 후 성장 곡선을 보여주고;
도 15a-15d는 생물반응기에서 성장한 세포의 프로세싱의 구현예를 나타내고; 도 15a는 하나의 액체를 또 다른 하나로 대체하는, 예를 들어, 성장 배지를 세척 완충액으로 대체하는 구현예를 나타내고; 도 15b는 하나의 액체를 또 다른 액체로 대체하는 또 다른 구현예를 나타내고, 여기서, 상기 생물반응기는 세포 수준 위에 제2 (상부 챔버) 내의 위치에 위치된 제2 장벽 (장벽 2)을 포함하고; 도 15b에 나타낸 생물반응기 용기는 상기 이미지에 역위되고; 도 15c 및 도 15d는 2개의 천공된 장벽에 의해 3개의 챔버로 나누어진 2개의 절두원추 부분으로 구성된 생물반응기의 대표적인 다이아그램을 나타내고, 여기서 도 l5c는 세포 성장 단계 동안에 생물반응기를 입증하고, 도 15d는 세척 단계 동안에 이의 뒤집어진 위치의 생물반응기를 입증하고;
도 16은 유체 속도를 제어하도록 구성된 천공된 장벽을 도시하는 개략적인 단면도이다.
도해의 단순성과 명료함을 위해 도면에 나타낸 요소들은 필연적으로 스케일로 도시된 것이 아님을 이해할 것이다. 예를 들어, 요소들의 일부 치수는 명료함을 위해 다른 요소에 비해 과장될 수 있다. 추가로, 적당한 것으로 고려되는 경우, 참조 번호는 도면 중에서 상응하거나 유사한 요소들을 지적하기 위해 반복될 수 있다.
하기의 상세한 설명에서, 다수의 특이적 세부 사항은 본원에 기재된 생물반응기 및 이의 용도의 완전한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 다른 경우에, 널리 공지된 방법, 과정 및 구성요소들은 본원에 기재된 생물반응기 및 이의 용도를 모호하게 하지 않도록 하기 위해 상세히 기재되지 않았다.
본원은 단리로부터 개시하여 최종 제형화까지 밀도 및 적응성 배양 용적을 변화시키는데 있어서 세포 및 미생물의 배양을 위해 디자인된 생물반응기 및 생물반응기 시스템을 포함하는 세포 배양 프로세싱 및 조작 시스템을 기재한다. 본원에 기재된 생물반응기는 하나의 단일 유닛에서 선택, 배양, 변형, 활성화, 확장, 세척, 농축 및 제형화의 모든 필요한 단계를 연속으로 가능하도록 구성된다. 일부 구현예에 따라, 생물반응기는 배치 방식, 유가 방식 및 관류 방식으로 사용될 수 있고 폐쇄된 무균 환경에서 완전히 제어될 수 있고 다중 사이클 사용을 위한 것 뿐만 아니라 단일 사용 (하나의 배양 사이클 후 배치될)을 위해 수행될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 및 이의 시스템의 다양한 구현예를 상세히 설명하기 전에, 기재된 생물반응기 및 이의 시스템은 이의 적용에서 하기 기재에서 제시되고/되거나 도면 및/또는 실시예에서 설명된 성분들 및/또는 방법의 구성 및 정렬의 세부 사항에 이의 적용에서 필연적으로 제한되지 않는 것으로 주지된다. 본원에 기재된 생물반응기 및 이의 시스템은 다른 구현예 또는 다양한 방식으로 실행되거나 수행되는 것을 포괄할 수 있다.
이의 일부 구현예에서 본원은 "배지", "액체", "가스", "세척 완충액", "용액" 또는 "유체"의 유동 또는 스트림을 기재한다. 당업자는 이들 용어들이 대안적으로 사용되고 적용된 압력 및/또는 적용된 전단 응력하에서 연속으로 변형되는 (유동하는) 물질의 특징을 가짐을 이해할 것이다.
이의 일부 구현예에서 본원은 생존 세포 또는 미생물을 성장시키기 위한 생물반응기 및 단리로부터 최종 제형화까지 모든 배양 단계를 포함하는 이들 생물반응기에서 세포 또는 미생물을 성장시키기 위한 방법을 기재한다.
당업자는 용어 "세포" 및 "세포들"이 임의의 생존 세포를 포괄할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기에서 성장할 수 있는 세포들은 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기에서 성장할 수 있는 세포들은 단세포 및 다세포 미생물, 예를 들어, 세균, 고세균, 바이러스, 효모 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포들를 포함한다.
일부 구현예에서, 진핵 세포는 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포 또는 진균류를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 조직 배양 세포, 1차 세포 또는 생식 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조직 배양 세포 또는 1차 세포는 줄기 세포, 성인 세포, 전환분화된 세포, 탈분화된 세포 또는 분화된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물 세포는 포유동물 세포를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 세포는 비비(baboon), 물소, 고양이, 닭, 소, 개, 염소, 기니아 피그, 햄스터, 말, 인간, 몽키, 마우스, 돼지, 메추라기, 또는 토끼로부터 기원하는 세포들을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 줄기 세포, 배아 세포, 성인 세포, 전환분화된 세포, 탈분화된 세포 또는 분화된 세포를 포함하는 1차 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 줄기 세포, 배아 세포, 성인 세포, 전환분화된 세포, 탈분화된 세포 또는 분화된 세포를 포함하는 조직 배양 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기에서의 성장에 적합할 수 있는 세포 유형은 줄기 세포, 소포 세포, 지방세포, 잇몸 세포, 에나멜아세포 (Ameloblast), 섬유 고리 세포 (Annulus Fibrosus Cell), 거미막 세포 (Arachnoidal cell), 성상세포, 배반엽, 두개관 세포, 암 세포 (선암종, 섬유육종, 신경교아종, 간종양, 흑색종, 골수 백혈병, 신경아세포종, 골육종, 육종), 심근세포, 연골세포, 척색종 세포, 크롬친화성 세포 (Chromaffin Cell), 적운 세포 (Cumulus Cell), 내피 세포, 내피 유사 세포, 초성화 세포 (Ensheathing cell), 상피 세포, 섬유아세포, 섬유아세포 유사 세포, 생식 세포, 간세포, 하이브리드마, 인슐산 생산 세포, 기술적주기 세포 (Intersticial Cell), 섬세포, 각질 세포, 림프구 세포, 마크로파아지, 비만 세포, 멜라닌 세포, 반월판 세포, 혈관간막 세포, 간엽 전구체 세포, 단핵구, 단핵성 세포, 골수아세포, 근아세포, 근섬유아세포, 신경 세포, 핵 세포, 조치 세포, 난모세포, 골아세포, 골아세포 유사 세포, 파골세포, 파골세포 전구체 세포, 난형 세포, 유두 세포 (Papilla cell), 유조직 세포 (Parenchymal cell), 주위세포, 치주 인대 세포 (Peridontal Ligament Cell), 골막 세포 (Periosteal cell), 혈소판, 폐포세포, 전구지방세포, 전구심외막 세포, 신장 세포, 살리스피어 세포 (Salisphere cell), 슈완 세포 (Schwann cell), 분비 세포, 평활근 세포, 정자 세포, 성상세포, 줄기 세포, 줄기 세포 유사 세포, 정자형성 세포, 기질 세포, 활막 세포, 윤활막세포, T 세포, 힘줄세포, T-림프아세포, 세포영양막세포, 천연 킬러 세포, 수지상 세포, 제대혈 세포, 유리체 세포, 등; 예를 들어 하기의 조직 중 어느 하나로부터, 제한 없이 기원하는 세포를 포함하고, 조직은: 지방 조직, 부신, 양수, 양막낭, 대동맥, 동맥 (경동맥, 관상동맥, 폐동맥), 담즙관, 방광, 혈액, 골, 골수, 뇌 (대뇌 피질을 포함하는), 유방, 기관지, 연골, 자궁 경관, 융모막융모, 결장, 결막, 연결 조직, 각막, 치수, 십이지장, 경막, 귀, 자궁내막 낭종, 자궁내막, 식도, 눈, 포피, 담낭, 결절종, 잇몸, 두경부, 심장, 심장 판막, 해마, 장골, 척추사이원반, 관절, 목정맥, 신장, 무릎, 눈물기관, 인대, 간, 폐, 림프절, 유선, 하악골, 뇌척수막, 중배엽, 미세혈관, 점막, 근육 유래 (MD), 골수 백혈병, 골수종, 비강, 비인두, 신경, 수핵, 경구 점막, 난소, 췌장, 이하선 (Parotid Gland), 음경, 태반, 전립선, 신장, 호흡관, 망막, 침샘, 대복재 정맥, 좌골신경, 골격근, 피부, 소장, 조임근, 척추, 비장, 위, 활막, 치아, 힘줄, 고환, 갑상선, 편도, 기관, 제대 동맥, 탯줄, 탯줄 혈액, 탯줄 정맥, 탯줄 (와르톤 젤리 (Wartons Jelly)), 뇨관, 자궁, 혈관계, 심실, 성대 주름 및 세포, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기에서 성장한 세포는 상이한 세포 유형의 조합을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 일부 구현예에서 용어 "세포" 및 "미생물"은 모두 동일한 의미와 질을 갖고 상호교환적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기에서 성장한 세포 또는 미생물의 생성물은 예를 들어, 수거된 단백질, 펩타이드, 항생제 또는 아미노산이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재되고 세포 또는 미생물에 의해 합성된 생물반응기에서 대규모 방식으로 성장된 세포 또는 미생물의 임의의 생성물은 수거될 수 있다.
본원에 기재된 생물반응기로서 이의 비제한적인 예는 도 1 (10), 도 2 (110), 도 3 (210), 도 4a (300), 도 4b (310), 도 4c (320), 도 4d (330), 도 4e (340), 도 4f (350), 도 4g (360), 도 4h (370), 도 4i (380), 도 6a 및 6b (510), 도 6c 및 6d (550), 도 7 (610), 도 8 (710), 도 9 (810), 도 10a 및 10b (910), 도 11a 및 11b (1010), 도 12a 및 12b (1110), 및 도 14에 제공되고, 용기 내 내부 용적 또는 공간을 제1 (하부) 챔버 및 제1 챔버 위에 배치된 제2 (상부) 챔버로 나누는 천공된 장벽을 포함하는 중공 용기 형태일 수 있다.
일부 구현예에 따라, 세포 또는 미생물을 성장시키기 위해 본원에 기재된 생물반응기로서, 상기 생물반응기는:
- 그 안에 공간을 둘러싸는 밀폐된 용기;
- 그 안에 다수의 천공을 갖는 장벽으로서, 상기 장벽은 공간을 제1 챔버와 제2 챔버로 분할하도록 구성된 공간 내 밀폐적으로 배치되며, 여기서, 상기 제2 챔버는 그 안에 성장하는 세포 또는 미생물을 수용하도록 구성되어 있고 상기 천공의 직경이 제1 챔버와 제2 챔버 사이에서 그리고 그 반대에서만 유체 유동이 가능하도록 구성되어 있는, 장벽,
- 유체를 상기 제1 챔버로 도입하기 위한 하나 이상의 유체 유입구 포트; 및
- 유체를 상기 제2 챔버로부터 유출하도록 하기 위한 하나 이상의 유출구 포트를 포함한다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 용기는 적어도 2개의 부분으로 구성될 수 있다. 그리고 일부 구현예에 따라, 상기 장벽은 2개 부분 사이에 부착될 수 있다. 일부 구현예에 따라, 보다 천공된 장벽은 일부 경우에 용기의 상이한 부분 사이에 제공될 수 있다. 일부 구현예에 따라, 상기 장벽은 용기의 벽과 접촉된 상태로 배치된다 (도 1-4, 6-13, 15-16에서 입증된 바와 같이).
일부 구현예에 따라, 제1 챔버는 하부 챔버이고 제2 챔버는 상부 챔버이고 여기서, 상기 유체 유동은 상부 챔버를 향하는 (중력 방향과 반대로) 하부 챔버로부터의 상류 유동이다.
제한되는 것 없이, 일부 구현예에서, 생물반응기는 확대 형태, 예를 들어, 절두원추 형태, 또는 이들의 일부를 포함하고, 유체 속도의 감소를 유도하도록 구성된 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 천공된 장벽에 의해 나누어진 2개 부분의 챔버를 포함하고, 여기서, 상기 장벽은 예를 들어, 유체 성장 배지로 제한되지 않는 일정한 유체 유동을 가능하게 하고 상기 세포는 제2 (상부) 챔버에 보유된다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 제2 챔버 (상부)에서 유체의 유동의 감소된 속도 및 용기 전반에 걸쳐 유체의 균일하고 약한 유동을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 (상부) 챔버에서 감소된 속도와 조합된 약하고 균일한 유동은 세포의 매쓰 (세포 매쓰)와 "부유 케이크"로서 공지된 일정한 세포의 매쓰를 유도하는 유체 간에 균형을 유도한다. 일부 구현예에서, 세포의 부유 케이크는 제2 (상부) 챔버의 하부 부분에 위치한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기의 사용은 일정한 유체 유동을 유도한다. 일부 구현예에서, 생물반응기의 사용은 배양 공정 동안에 성장 배지 및 세포 피딩의 일정한 유동을 유도한다. 일부 구현예에서, 유체, 예를 들어, 성장 배지는 배양 동안에 교환될 수 있고, 여기서, 매우 소량의 용적 및/또는 매우 대량의 용적은 적응성 및 최적의 세포 피딩을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기의 사용은 생물반응기 챔버를 개방할 필요 없이 매우 약하고 효율적인 방식으로 선택된 배지로의 세포 세척 및 수확을 포함한다. 일부 구현예예에서, 본원에 기재된 생물반응기의 사용은 최적이고 적응성 배양을 제공하고, 여기서, 세포 또는 미생물의 조작은 폐쇄된 시스템에서 수행되고, 여기서, 조작은 자동화될 수 잇고 여기서 세포는 최소의 전단력을 경험한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기의 사용은 세포 또는 미생물의 고밀도 성장을 지지한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기에 의해 성취된 밀도는 표준 배양 조건을 사용하여 관찰되는 것의 10배 초과일 수 있다.
당업자는 용어 "천공된 장벽"이 모두 동일한 질 및 의미를 갖는 용어 "필터" 또는 "막" 또는 "천공된 플레이트"와 상호교환적으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 상기 천공된 장벽은 액체, 예를 들어, 성장 배지의 천공된 장벽의 천공을 통한 양방향의 유동이 가능하도록 구성된 다수의 천공을 포함하여 액체는 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 또한 제2 챔버에서 제1 챔버로 유동할 수 있다.
당업자는 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제1 챔버"가 일부 구현예에서 모두 동일한 의미 및 이의 질을 갖는 용어 "하부 챔버"와 상호교환가능하게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제2 챔버"가 일부 구현예에서 모두 동일한 의미 및 이의 질을 갖는 용어 "상부 챔버"와 상호교환가능하게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 생물반응기 용기의 제2 챔버내에서 배양한다.
일부 구현예에서, 상기 천공된 장벽은 천공된 장벽의 천공을 통한 추가의 인자들을 포함하는 액체의 양방향의 유동이 가능하도록 구성되어 액체 및 추가의 인자 또는 인자들은 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 제2 챔버에서 제1 챔버로 유동할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 천공 직경은 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 제2 챔버에서 제1 챔버로만 액체 유동이 가능하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 천공 직경은 인자 또는 인자들을 포함하는 액체가 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 제2 챔버에서 제1 챔버로만 유동이 가능하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 인자 또는 인자들은 세포 또는 미생물을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 천공된 장벽은 다수의 천공을 포함하고, 이들은 생물반응기의 용기 내에서 성장한 세포 또는 미생물이 천공된 장벽을 통과하지 못하도록 한다.
당업자는 유동이 성장 배지, 세척 용액, 영양물 용액, 선택 용액, 효소 혼합물 용액, 수거 용액, 최종 제형 용액, 저장 용액 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 액체 유체의 유동을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 액체는 성장 배지, 세척 용액, 영양물 용액, 수거 용액, 수확 용액, 저장 용액 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 액체는 추가의 인자들을 포함하고, 여기서, 첨가될 수 있는 인자들의 비제한적인 예는 영양물, 가스, 활성화 인자들, 유도 인자들, 항생제들, 항진균제 및 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템에서 세포 또는 미생물의 성장 및 수거를 위해 이로운 임의의 인자는 액체에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 인자는 액체 내에 용해하고 여기서, 상기 액체는 용매를 나타내고 인자는 용액을 형성하는 용질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 인자는 액체 내 미립자로서 남아 있다.
당업자는 용어 "다수"가 천공된 장벽에서 천공들 (공극들)의 수를 포괄할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 다수의 천공은 제1 챔버에서 제2 챔버로, 또는 제2 챔버에서 제1 챔버로 유동하는 배지 또는 다른 액체의 교환의 요구되는 속도를 기준으로 결정된다. 일부 구현예에서, 다수의 천공은 제1 챔버에서 제2 챔버로, 또는 제2 챔버에서 제1 챔버로 유동하는 배지 또는 다른 액체의 교환의 유속을 기준으로 결정된다. 일부 구현예에서, 다수의 천공은 제1 챔버에서 제2 챔버로, 또는 제2 챔버에서 제1 챔버로 유동하는 배지 또는 다른 액체의 유동 패턴을 기준으로 결정된다.
일부 구현예에서, 천공된 장벽 내 천공의 정렬은 제1 챔버에서 제2 챔버로, 또는 제2 챔버에서 제1 챔버로 유동하는 배지 또는 다른 액체의 유동 패턴에 영향을 미치도록 구성된다. 일부 구현예에서, 천공된 장벽은 균일하게 분포된 다수의 천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 천공된 장벽은 불균일하게 분포된 다수의 천공을 포함한다.
일부 구현예에서, 천공된 장벽 내 평균 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 생물반응기에서 성장한 세포 또는 미생물이 천공된 장벽을 통과하지 못하도록 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 천공 직경의 크기의 결정은 세포 또는 미생물 크기를 측정하고 세포 또는 미생물 형태를 결정하고, 세포 또는 미생물이 선택된 공극 크기를 갖는 천공된 장벽을 통과하지 못하는 천공 직경 (천공 공극 크기)을 선택함을 포함한다.
일부 관련 구현예에 따라, 천공된 장벽 내 천공의 평균 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 120 마이크로미터, 또는 100 마이크로미터 또는, 75 마이크로미터, 또는 50 마이크로미터, 또는 25 마이크로미터, 또는 15 마이크로미터 미만이도록 선택된다. 일부 관련 구현예에 따라, 천공된 장벽 내 천공의 평균 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 0.1 마이크로미터, 또는 0.2 마이크로미터, 또는 0.3 마이크로미터 또는, 0.45 마이크로미터, 또는 0.75 마이크로미터 또는, 1.0 마이크로미터를 초과하도록 선택된다. 일부 관련 구현예에 따라, 천공된 장벽 내 천공의 평균 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 0.1 마이크로미터 내지 120 마이크로미터이도록 선택된다. 일부 관련 구현예에 따라, 천공된 장벽에서 천공의 평균 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 세포 또는 미생물이 하나의 챔버에서 제2 챔버로 통과하지 못하도록 한다. 예를 들어, 천공된 장벽에서 천공의 평균 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 상부 챔버에서 성장한 세포 또는 미생물이 하부 챔버로 통과될 수 없도록 선택된다.
일부 구현예에서, 세포 또는 미생물은 구형을 갖고 따라서 세포 또는 미생물의 직경은 천공 크기를 결정하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 세포 또는 미생물은 구형을 가질 수 없다. 일부 구현예에서, 세포 또는 미생물은 비-대칭 형태를 포함할 수 있고, 예를 들어, 그러나 어떠한 방식으로든지 막대 형태로 제한되지 않는다. 여기서, 세포 또는 미생물은 비대칭 형태를 갖고, 공극 크기를 결정하기 위한 측정은 세포에 의해 제공되는 최소 직경을 기준으로 한다. 일부 구현예에서, 세포는 형태를 변화시키는 능력을 가질 수 있다. 여기서, 세포 또는 미생물은 형태를 변화시키는 능력을 갖고, 공극 크기를 결정하기 위한 측정은 공극을 통해 세포 또는 미생물의 통과를 가능하게 하는, 세포 또는 미생물에 의해 제공되는 최소 직경을 기준으로 한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 미생물은 변형될 수 있다. 여기서, 세포 또는 미생물은 변형될 수 있고, 세포 크기 결정은 변형된 세포 또는 미생물의 직경을 고려한다.
일부 구현예에서, 다수의 천공은 모든 동일한 크기의 천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 천공은 모두 동일한 크기가 아닌 천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 상이한 크기의 천공은 무작위 분포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상이한 크기의 천공의 분포는 제1 챔버에서 제2 챔버로, 또는 제2 챔버에서 제1 챔버로의 액체 유동으로부터의 유체 유동 패턴을 기준으로 결정된다.
일부 구현예에서, 천공의 형태는 대칭이다. 일부 구현예에서, 천공의 형태는 비대칭이다. 일부 구현예에서, 천공의 형태는 환형, 불규칙한 형태, 타원형 또는 다각형을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 천공은 모든 동일한 형태의 천공을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 천공은 상이한 형태의 천공을 포함한다.
일부 구현예에서, 천공된 장벽 내 천공의 평균 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 또한 제2 챔버에서 제1 챔버로의 액체의 유동이 가능하도록 구성된 직경을 선택함에 의해 결정되고, 생물반응기에서 성장한 세포 또는 미생물이 천공된 장벽을 통과하지 못하도록 한다. 일부 구현예에서, 천공된 장벽 내 천공의 평균 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 또한 제2 챔버에서 제1 챔버로 추가의 인자를 포함하는 액체의 유동을 허용하는 직경을 선택함에 의해 결정되고, 생물반응기에서 성장한 세포 또는 미생물이 천공된 장벽을 통과하지 못하도록 한다. 일부 구현예에서, 천공된 장벽 내 천공의 평균 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 또한 제2 챔버에서 제1 챔버로의 액체의 유동을 허용하는 직경을 선택함에 의해 결정되고, 생물반응기에서 성장한 세포 또는 미생물이 천공된 장벽을 통과하지 못하도록 한다.
일부 구현예에서, 천공 직경 (공극 크기) 또는 유효 평균 직경은 약 0.1 내지 40 마이크로미터를 포함한다. 일부 구현예에서, 천공 직경 (공극 크기) 또는 유효 평균 직경은 약 0.2 내지 10 마이크로미터를 포함한다. 일부 구현예에서, 천공 직경 (공극 크기) 또는 유효 평균 직경은 약 10 내지 40 마이크로미터를 포함한다. 일부 구현예에서, 천공 직경 (공극 크기) 또는 유효 평균 직경은 40 마이크로미터 초과이다. 일부 구현예에서, 천공 직경 (공극 크기) 또는 유효 평균 직경은 약 40 내지 60 마이크로미터를 포함한다. 일부 구현예에서, 천공 직경 (공극 크기) 또는 유효 평균 직경은 약 60 내지 100 마이크로미터를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 천공 직경 (공극 크기) 또는 유효 평균 직경은 세포 또는 미생물이 공극을 통과하지 못하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 비드에 결합된 세포 또는 미생물이 공극을 통과하지 못하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 그 안에 다수의 천공을 갖는 천공된 장벽의 천공의 공극 직경은 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 제2 챔버에서 제1 챔버로만 액체 유동이 가능하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 액체는 용질 및/또는 부가된 인자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 그 안에 다수의 천공을 갖는 천공된 장벽의 천공의 천공의 공극 직경은 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 제2 챔버에서 제1 챔버로만 액체 유동이 가능하도록 구성되고, 여기서, 상기 공극 직경은 세포 또는 미생물이 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 제2 챔버에서 제1 챔버로 통과하지 못하도록 구성된다.
일부 구현예에서, 상기 천공된 장벽은 예를 들어, 반응기 내에서 성장한 세포를 제2 챔버로 국한시키고 세포를 수확하기 위해 구성되고 이에 유용하다. 일부 구현예에 따라, 본 출원은 또한 생물반응기를 포함하는 생물반응기 시스템, 및 단리로부터 최종 제형화까지 상기 생물반응기 및 생물반응기 시스템에서 세포 또는 미생물을 성장시키기 위한 방법을 기재한다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 천공된 장벽 (12) (이는 상부 챔버의 바닥에 존재한다) 아래에 추가의 하부 천공된 장벽 (12D)을 포함하고; 예를 들어, 도 1 (12)를 참조하고, 여기서 상기 천공된 장벽 (12)은 상부 챔버의 바닥을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 하부 천공된 장벽 (12D)은 용기의 바닥 표면 (하부 챔버에서)과 천공된 장벽 (12)(이는 상부 챔버의 바닥 표면을 형성하는) 사이; 예를 들어, 도 1의 10B 및 12 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 하부 챔버에서 상부 챔버로의 액체의 상류 유동은 2개의 천공된 장벽 12 및 12D를 통과한다. 추가의 하부 천공된 장벽 (12D)은 이것이 상부 챔버의 바닥을 포함하는 천공된 장벽 (12)에 도달하기 전에 액체의 유동 정렬 (여기로 협소해지고, 선형 및 균일한 유동을 제공하는)을 원조하도록 구성된다. 상기 정렬은 액체의 유동의 선형 (및 균일성)을 개선시키도록 구성된다. 일부 구현예에 따라, 스트림의 정렬은 천공된 장벽의 상이한 방사상 위치를 따라 대략적으로 균일한 종축 유동 속도를 제공함을 포함하고
또는 다른 말로 유동 속도는 실질적으로 천공된 장벽의 기하학적 중심의 모든 거리에서 균등하다. 일부 구현예에 따라, 하부 천공된 장벽은 하부 챔버의 벽에 밀폐적으로 부착되고, 여기서, 이의 공극 크기는 세포 또는 미생물의 통과를 방지하도록 구성된다. 일부 구현예에 따라, 천공된 장벽 (12) 및 하부 천공된 장벽 (12D) 둘 다는 액체 유동 속도를 정렬하도록 구성된다. 일부 관련 구현예에 따라, 하부 천공된 장벽 (12D) 내 천공의 평균 천공 직경 또는 유효 평균 직경은 0.1 마이크로미터 내지 1 밀리미터이도록 선택된다.
일부 구현예에 따라, 하부 천공된 장벽 (12D)은 유체 속도를 제어하도록 구성된다. 상기 속도 제어 장벽 (1600)에 대한 비제한적인 예는 도 16에 상세히 기재되어 있다. 도 16에서 입증된 바와 같이, 속도 제어 천공된 장벽 (1600)의 공극 (1601)은 원뿔 형태를 포함할 수 있고; 공극의 원뿔 형태는 상이한 공극 간에 유사하거나 상이할 수 있고, 일부 공극은 유사하고 일부는 상이할 수 있다. 일부 구현예에 따라, 원뿔 공극의 보다 넓은 베이스는 장벽의 바닥 측면에 위치하고; 상기 구성은 장벽의 상부 측면을 향한 증가된 유동 속도와 함께 유동을 제공할 수 있다. 일부 구현예에 따라, 장벽의 중심에 보다 가까운 공극 (1602)은 주변 공극 (1601)의 것 보다 장벽의 상부 측면에서 보다 넓은 원뿔 또는 보다 넓은 개방구를 가질 수 있고; 상기 구성은 천공된 장벽 (1600)의 상이한 방사상 위치
를 따라 대략적으로 균일한 종축 유동 속도를 제공할 수 있다. 상기 구현예에 따라, 유체 임펠러는 요구되지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 추가의 하부 천공된 장벽 (12D)의 존재는 상부 천공된 장벽 (12)의 천공을 통한 유동을 막고 차단하며 유동의 선형 및 균일성을 방해하는 공기 버블, 공기 클러스터 및 잔해들을 포집하도록 구성된다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 천공된 장벽 (제1 천공된 장벽) (1512) (이는 상부 챔버의 바닥에 존재한다) 위에 추가의 스크리닝 천공된 장벽 (1502)을 포함하고, 상기 스크리닝 천공된 장벽은 상부 챔버의 벽에 밀폐적으로 배치되어 있다. 도 15a는 제1 천공된 장벽 (1512), 및 세포 매쓰 (3) 수준 위에 위치된 추가의 스크리닝 천공된 장벽 (1502)을 입증한다. 일부 구현예에 따라, 추가의 스크리닝 천공된 장벽 (1502)은 세포 또는 미생물 통과를 방지, 예를 들어, 상기 생물반응기를 이탈하지 못하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 생물반응기 용기는 역위된 위치 (또한 하기 실시예 3을 참조한다)에 있고, 액체의 유동은 상부 (제2 (1540)) 챔버로부터 하부 (제1 (1550)) 챔버로의 하류 (1520) (대략적으로 중력 방향으로)이다. 상기 구성은 일부 구현예에서 세포 매쓰에 의한 장벽의 막힘을 감소시킬 수 있는, 보다 넓은 표면적 장벽을 허용하는 세포의 세척 또는 배지 또는 액체 용액의 교환 동안에 사용되도록 구성된다.
관련 구현예에 따라, 생물반응기는 3개의 천공된 장벽을 포함한다:
- 생물반응기 용기의 상부와 하부 챔버 (1540, 1550) 간을 분리하고 이들 사이의 세포와 미생물의 통과를 방지하도록 구성되는 1차 천공된 장벽 (1512) (도 15a);
- 세포와 미생물의 통과를 방지하도록 구성된 세포 매쓰 (3) 위의 상부 챔버 (1540) 내에 위치하여 세포 매쓰가 1차 및 상부 천공된 장벽 (1512, 1502) 사이에 유지되도록 하는 상부 천공된 장벽 (1502) (도 15a); 및
- 1차 천공된 장벽 (12) 아래에 제1 챔버 (14a)에 위치하여 1차 천공된 장벽 (12)에 도달하기 전에 유체 유동을 정렬하고/하거나 제어하도록 구성된 하부 천공된 장벽 (12D) (도 1).
일부 관련 구현예에 따라, 1차 및 상부 천공된 장벽 (1512, 1502, 도 15a)은 세포 또는 미생물의 통과를 방지하도록 구성된 유사한 공극 크기를 포함한다.
일부 구현예에 따라, 하부 천공된 장벽 (12D, 도 1)의 공극의 크기는 1차 및 상부 장벽 (1512, 1502, 도 15a)의 공극 크기와 유사하거나 상이할 수 있다.
당업자는 공극의 범위, 형태 및 분포가 상이한 천공된 장벽 간에 유사하거나 상이할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 추가의 천공된 장벽의 천공 (공극)의 직경 또는 유효 직경은 제1 및 제2 챔버를 분리하는 천공된 장벽에 존재하는 것과 상이한 공극의 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 천공된 장벽의 천공 (공극)의 직경 또는 유효 직경은 제1 및 제2 챔버를 분리하는 천공된 장벽 보다 작은 공극 크기를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 천공된 장벽의 천공 (공극)의 형태는 제1 및 제2 챔버를 분리하는 천공된 장벽에 존재하는 것과 상이한 공극 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 천공된 장벽의 천공 (공극)의 형태는 제1 및 제2 챔버를 분리하는 천공된 장벽과 유사한 공극 형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 천공된 장벽의 천공 (공극)의 분포는 제1 및 제2 챔버를 분리하는 천공된 장벽에 존재하는 것과 상이한 공극 분포를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 천공된 장벽의 천공 (공극)의 분포는 제1 및 제2 챔버를 분리하는 천공된 장벽과 유사한 공극 분포를 포함한다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 세포 위의 제2 챔버를 갖는 추가의 장벽 및 제1 및 제2 챔버를 분리하는 장벽 아래에 제1 챔버 내 추가의 장벽을 포함한다.
당업자는 추가의 천공된 장벽의 표면적이 제1 챔버를 제2 챔버로부터 분리하는 장벽의 표면적을 초과하거나 미만일 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 추가의 천공된 장벽은 제1 챔버를 제2 챔버로부터 분리하는 장벽의 표면적 보다 큰 표면적을 갖는다. 일부 구현예에서, 추가의 천공된 장벽은 제1 챔버를 제2 챔버로부터 분리하는 장벽의 표면적 보다 작은 표면적을 갖는다.
상기된 생물반응기 및 생물반응기 시스템은 오염의 위험을 최소화하고 효율적인 프로세싱을 가능하게 하는 하나의 폐쇄된 단일 또는 다중 용도 시스템에서 세포 또는 다른 미생물을 성장시키고, 프로세싱시키고 제형화하도록 한다. 일부 구현예에 따라, 본원에 기재된 생물반응기는 세포 또는 다른 미생물을 목적하는 농도로의 성장을 가능하도록 구성된다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기는 멸균 환경을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템은 멸균 환경을 제공한다. 추가로, 세포 또는 미생물이 배양되고 번식함에 따라, 이들은 보다 많은 배지 및 영양물 및 보다 큰 배양 용적을 요구한다. 이후에 기재된 생물반응기의 일부 구현예는 세포 또는 미생물을 보다 큰 컨테이너에 전달할 필요 없이 적응성 제어된 용적 변화 (다양한 생물반응기 용적) 및 배지 재생을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 출원의 생물반응기는 성장 배지에 현탁된, 비-접착 세포의 성장을 위해 사용되도록 구성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기는 적합한 세포 지지 매트릭스를 생물반응기의 제2 챔버로 포함시키거나 첨가함에 의해 접착 세포의 성장을 위해 사용되도록 구성된다. 세포 지지 매트릭스는 세포가 접착할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 유형의 세포 지지 매트릭스일 수 있다. 상기 세포 지지 매트릭스가 생물반응기에 사용되는 경우, 당업계에 공지된 탈착 방법을 사용함에 의해 세포를 세포 지지 매트릭스로부터 탈착시킬 필요가 있을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 일부 구현예에서 용어 "세포 지지 매트릭스" 및 "세포 캐리어 매트릭스"는 모두 동일한 의미와 질을 갖고 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 출원의 생물반응기는 고정된 용적 또는 가변 용적을 갖도록 구성된다. 당업자는 일부 구현예에서 용어 "생물반응기" 및 "용기"가 모두 동일한 의미와 질을 갖고 상호교환적으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 생물반응기가 고정된 용적을 포함하는 구현예에서, 액체, 예를 들어, 성장 배지의 유동 속도는 제어될 수 있지만 액체, 예를 들어, 생물반응기 내 성장 배지의 수준 및 용적은 실질적으로 고정된다. 생물반응기가 가변 용적을 포함하는 구현예에서, 액체, 예를 들어, 성장 배지의 유동 속도는 제어될 수 있고, 생물반응기 내 수준 및 용적은 가변적일 수 있다. 일부 구현예에서, 가변 액체 수준, 예를 들어, 성장 배지 수준은 생물반응기의 벽 길이를 따라 다양한 상이한 높이에서 생물반응기의 제2 챔버에 대한 다중 유체 유출구 포트 개방구를 사용함에 의해 성취될 수 있다. 이의 비제한적인 예는 도 2에 제공한다.
일부 구현예에서, 배지의 작동 용적은 낮고, 여기서 세포는 고밀도 배양물로 성장한다. 작동 용적이 낮은 일부 구현예에서, 유동 속도는 또한 낮거나 전혀 유동하지 않는다. 일부 구현예에서, 유동 속도는 낮다. 일부 구현예에서, 제1 챔버에서 제2 챔버로 또는 제2 챔버에서 제1 챔버로의 유동이 없다. 일부 구현예에서, 제1 챔버에서 제2 챔버로 및 제2 챔버에서 제1 챔버로의 유동이 없다. 작동 용적이 낮은 일부 구현예에서, 배지는 세포의 고밀도 성장을 위해 최적화된다. 작동 용적이 낮은 일부 구현예에서, 세포 성장은 다른 생물반응기에서 성취될 수 있는 것 보다 높은 수율 및 보다 낮은 필요성을 위해 최적화된다.
일부 구현예에서, 배양물이 소수의 세포, 예를 들어 본원에 기재된 생물반응기에서 배양될 수 있는 최대 수 미만의 세포를 포함하는 경우, 세포는 낮은 용적의 성장 배지에서 배양되고 세포가 증식하고 세포 수가 증가함에 따라 세포를 포함하는 챔저 내 용적은 증가될 수 있다. 특정 지점에서 유동 사이클이 수행될 수 있고, 여기서, 액체, 예를 들어, 성장 배지의 유동은 증가함에 따라 세포의 양이 증가한다. 일부 구현예에서, 영양물은 세포 성장 필요성을 기준으로 액체, 예를 들어, 성장 배지에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기 내 세포의 배양은 생물반응기 내에서 액체, 예를 들어, 성장 배지의 용적을 조정함에 의해 세포 밀도 범위 내에 세포를 유지한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 유동 사이클의 사용은 균등한 수의 세포를 배양하기 위해 성장 배지 필요성을 저하시킨다. 일부 구현예에서, 유동 사이클은 본원에 기재된 생물반응기에서 사용되고, 여기서, 성장 배지의 공급은 세포의 필요성을 기준으로 조절된다. 다른 말로, 세포는 요구되는 경우에만 영양 공급된다. 일부 구현예에서, 상기 유동 사이클은 세포의 증식 속도를 제어한다.
일부 구현예에 따라, 다중 유출구 포트 각각은 그 안에 밸브를 갖도록 구성되고 통상의 매니폴드 영양 공급 펌프에 유체적으로 연결되거나 연결을 끊도록 구성된다. 액체, 예를 들어, 상기 구현예의 생물반응기 내 성장 배지의 수준은 적절하게, 선택된 유출구 포트의 밸브를 개방하고 나머지 유체 유출구 포트의 모든 밸브를 폐쇄시킴에 의해 다양해질 수 있다. 일부 구현예에 따라, 액체, 예를 들어, 생물반응기 내 성장 배지의 용적을 제어하는 것은 이롭게도 세포가 계속 증식함에 따라 배양의 확장을 허용하여 생물반응기를 개방할 필요가 없고 예를 들어, 세포 계대 및 디쉬/컨테이너 대체와 같은 다른 생물반응기 시스템에서 사용되는 방법을 사용할 필요가 없다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 생물반응기 용기의 제1 (하부) 챔버에 배치된 유체 임펠러 또는 유체 분배기를 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 성장 배지를 산소화시키기 위한 산소화 시스템을 포함하도록 구성된다.
버블은 특정 구현예에서 산소화 시스템에 의해 생성될 수 있다. 하부 챔버에서 버블은 일부 구현예에서 버블이 천공된 장벽에 부착되어 하나의 챔버에서 다음 챔버로의 유동을 방해할 수 있기 때문에 생물반응기에 대해 부정적인 영향을 미친다. 추가로. 장벽의 천공을 통과하는 나노 버블은 세포를 상승시키는 경향이 있어 부유 세포 케이크의 고밀도 성장을 방해할 수 있다.
일부 구현예에 따라, 보다 낮은 천공된 12D (도 1)는 하부 챔버에서 생성되거나 이에 형성된 버블, 예를 들어, 산소화 시스템에 의해 생성된 버블의 통과를 방지하여 천공된 장벽 (12)에 도달하여 이를 차단시키지 못하도록 구성된다. 일부 구현예에 따라, 대략 수 나노미터의 직경을 갖는 버블은 보다 낮은 천공된 장벽 (12D) 및 천공된 장벽 (12)을 통과하고 세포 또는 미생물을 액체의 유동 위로 상승시키는데 일조한다.
일부 구현예에 따라, 본원에 기재된 생물반응기는 다양한 상이한 형태를 갖도록 구성되고 제2 챔버를 한정하는 생물반응기의 벽의 적어도 일부는 직선 (수직)이도록 구성되거나 수직에 대해 특정 각도로 비스듬하게 구성 (또는 생물반응기의 종축에 대하여 비스듬한)된다. 일부 구현예에서, 제2 챔버를 둘러싸는 벽의 일부는 수직이도록 구성되고 벽의 일부는 비스듬하게 구성된다. 생물반응기 용기의 형태의 비제한적인 예는 도 4a (304A 및 304B), 도 4b (314A 및 314B), 도 4c (324A 및 324B), 도 4d (334A 및 334B), 도 4e (344A 및 344B), 도 4f (354A 및 354B), 도 4g (364A 및 364B), 도 4h (374A 및 374B), 도 4i (384A 및 308B)에 제공된다.
상기 구현예에서 제2 챔버의 상향으로 증가하는 횡단면은 수직 방향을 따라 (생물반응기의 종축을 따라) 유체 속도 구배가 확립될 수 있도록 구성되어 성장 배지 유동속도는 횡단면 증가와 함께 감소한다. 일부 구현예에 따라, 성장 배지에 현탁된 세포 상에 작용하는 중력 힘과 조합된 상기 유동 속도 구배는 제2 챔버 내 함유된 성장 배지의 용적 내 일부 목적하는 영역에서 세포를 현탁시키는데 일조한다. 일부 구현예에서, 배지의 유동 속도의 조절은 생물반응기 내 목적하는 위치에 세포를 유지시킨다. 일부 구현예에서, 배지의 유동 속도의 조절은 생물반응기 내 목적하는 위치에 세포를 유지시킨다. 일부 구현예에서, 생물반응기의 반경에 상대적인 유동 속도의 조절은 생물반응기 내 목적하는 위치에 세포를 유지시킨다.
일부 구현예에서, 목적하는 위치는 유출구 포트 보다 낮다. 예를 들어, 액체 내 현탁된 세포가 분당 1 mm의 유동 속도 (화살표 37B의 중간 세트)로 상부 챔버내에서 상승하는 경우 도 1을 참조하고, 보다 낮은 부분에서 예를 들어, 분당 3 mm의 유동 속도 (장벽 37A의 수준에서의 화살표)일 수 있고, 중앙에서, 분당 1 mm (37B)및 이의 몇 cm 초과의 유동 속도는 배지가 포트/밸브를 통해 챔버로부터 유출하도록 하고 유동 속도는 분당 0.2 mm일 수 있다 (이는 화살표 37C의 상부 세트 초과 및 유출구 포트 (26)의 수준 초과이다). 일부 구현예에서, 세포의 위치는 유동 속도에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 세포의 위치는 유출구 포트 보다 낮다. 유출구 포트 보다 낮은 세포에 대한 위치는 세포를 세척하는 경우, 세포의 아집단을 제거하는 경우, 액체를 교환하는 경우, 인자를 첨가하는 경우 또는 이의 조합인 경우 요구될 수 있다.
당업자는 세포 집단이 상이한 크기, 하전 및 매쓰의 세포를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 세포는 크기, 하전 및 매쓰를 포함하는 세포 특징을 기준으로 본원에 기재된 생물반응기 내 상이한 위치 내에서 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 크기, 하전 및 매쓰를 포함하는 세포 특징을 기반으로 본원에 기재된 생물반응기 내 상이한 위치 내에서 유지된다.
당업자는 세포 크기가 세포 유형을 기준으로 다양함을 이해할 것이다. 예를 들어, 적혈구 세포는 직경이 약 6-8 mm이고, T-림프구는 직경이 약 9-12 mm이고, 중간엽줄기 세포 (MSC)는 직경이 약 15-21 mm이고, 마크로파아지는 직경이 약 50 mm이다. 세포 간의 용적은 또한 급격히 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템은 유동 속도를 조절함에 의해 혈액 세포를 분리하는데 사용되도록 구성된다.
일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 분당 약 0.01 mm 내지 분당 50 mm의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 유동 속도는 약 0.01 mm/min 내지 0.1 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 0.1 mm/min 내지 1.0 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 1.0 mm/min 내지 2.0 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 2.0 mm/min 내지 3.0 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 3.0 mm/min 내지 4.0 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 4.0 mm/min 내지 5.0 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 5.0 mm/min 내지 10.0 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 10 mm/min 내지 15 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 15 mm/min 내지 20 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 20 mm/min 내지 25 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 25 mm/min 내지 30 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 30 mm/min 내지 35 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 35 mm/min 내지 40 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 40 mm/min 내지 45 mm/min의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 유동 속도는 약 45 mm/min 내지 50 mm/min의 범위를 포함한다.
일부 구현예에서, 생물반응기 내 유동 속도는 생물반응기 내 상이한 위치에서 상이하다 (예를 들어, 도 1 및 아래에 이의 수반된 설명, 및 대표적인 유동 속도 화살표 37A, 37B, 및 37C, 또는 도 13 및 대표적인 유동 속도 화살표 37A 및 37C를 참조한다).
일부 구현예에서, 세포 집단의 크기, 하전 및/또는 매쓰는 인위적으로 변화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 비드와 함께 배양될 수 있고, 여기서, 상기 세포는 비드에 결합하여 보다 높은 매쓰 및 상이한 형태를 갖는 세포-비드 복합체를 생성함에 이어서 세포는 비드에 부착되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포 100%가 비드에 결합된다. 일부 구현예에서, 세포의 서브-세트가 비드에 결합된다. 일부 구현예에서, 세포의 적어도 90%, 세포의 80%, 세포의 70%, 세포의 60%, 세포의 50%, 세포의 40%, 세포의 30%, 세포의 20%, 또는 세포의 10%는 비드에 결합된다. 일부 구현예에서, 10% 미만의 세포가 비드에 결합된다.
일부 구현예에서, 비드에 결합된 세포는 최종 세포 집단의 수거로부터 배제된다. 일부 구현예에서, 비드에 결합되는 세포는 최종 세포 집단으로서 수거하고자 하는 세포이다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 세포의 아집단이 특정 양상으로 비드에 결합된 비드의 하기의 첨가는 유동 속도가 증가하면 비드에 결합된 세포와 비교하여 증가된 속도에서 상승하는 비드에 결합되지 않는 세포를 유도함에 따라서, 이들 비-결합된 세포는 유출구 포트로부터 용기 챔버로부터 유출될 수 있고, 여기서, 결합된 세포는 유출구 포트 보다 낮은 위치에 잔류한다. 일부 구현예에서, 비-결합된 세포는 생물반응기 챔버로부터 유출시 수거된다. 일부 구현예에서, 비-결합된 세포는 생물반응기 챔버로부터 유출시 처분되고 결합된 세포는 수확된다.
일부 구현예에서, 비드의 표면은 항체, 수용체 리간드, 탄수화물 결합 분자, 렉틴, 또는 결합 쌍의 성분, 예를 들어, 비오틴을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드의 표면은 양성 표면 전하를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드와 세포 또는 이의 아집단 간의 결합은 가역적이다. 일부 구현예에서, 비드와 세포 또는 이의 아집단 간의 결합은 비가역적이다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 천공된 장벽에 인접한 제2 챔버에 개방하도록 구성된 하나 이상의 수확 포트를 포함하도록 구성되거나, 대안적으로, 천공된 장벽의 상부 표면에 개방하도록 구성된다. 제2 챔버로 또는 천공된 장벽의 상부 표면에서 개방하도록 구성된 수확 포트의 비제한적인 예는 도 1 (21), 도 2 (127), 도 6a 및 도 6b (521), 도 6c 및 6d (531), 도 7 (627), 도 8 (727), 도 9 (827), 도 10a 및 10b (927), 도 11a 및 11b (927), 및 도 12a 및 12b (1127)에 나타낸다.
일부 구현예에 따라, 전체 반응기 또는 천공된 장벽은 세포의 수확을 원조하기 위해 수직에 대해 일정 각도로 기울어질 수 있도록 구성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기에서 성장한 세포, 미생물, 또는 이의 생성물의 수확은 세포, 미생물 또는 이의 생성물의 멸균 수확을 포함한다. 천공된 장벽의 비제한적인 예는 도 1 (12), 도 7 (612), 도 8 (712), 도 9 (812), 도 10a 및 10b (912), 도 11a 및 11b (1012), 및 도 12a 및 12b (1112)에 제공된다.
생물반응기의 일부 구현예에 따라, 천공된 장벽은 고정된 (비-이동성) 장벽이도록 구성된다. 일부 구현예에서, 고정된 천공된 장벽은 용기 벽에 밀폐적으로 부착된다. 일부 다른 구현예에 따라, 천공된 장벽은 이동할 수 있고/있거나 기울어질 수 있는 천공된 장벽이도록 구성된다. 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 상기 고정된 천공된 장벽은 편평한 천공된 장벽, 생물반응기의 종축으로 특정 각도로 기울어진 편평한 천공된 장벽, 생물반응기의 상부와 대면하는 오목한 상부 표면을 갖는 오목한 천공된 장벽, 테이퍼링 천공된 장벽 또는 원뿔형 천공된 장벽, 또는 이들의 임의의 조합이도록 구성된다.
생물반응기의 일부 구현예에 따라, 이동 가능한 천공된 장벽은 고정 가능하고/하거나 스트레치 가능한 구성원에 의해 생물반응기의 용기 벽에 필폐적으로 부착된 이동 가능한 천공된 장벽이도록 구성된다. 고정 가능하고/하거나 스트레치 가능한 구성원은 천공된 장벽의 주변에 밀폐적으로 부착되고 용기 벽에 밀폐적으로 부착된다. 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 이동 가능한 천공된 장벽은 변형될 수 있고/있거나 고정될 수 있는 천공된 장벽, 또는 생물반응기의 상부에 대면하는 볼록한 상부 표면을 갖는 볼록한 버클링 천공된 장벽이도록 구성된다.
당업자는 용어 "밀폐적으로" 및 이의 상이한 문접적으로 형태가 천공을 통하지 않는다면 어떠한 종류의 물질의 장벽을 통한 흐름이 없는 장벽과 용기 벽 간의 부착을 언급하는 것임을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본원의 생물반응기를 포함하는 생물반응기 시스템은 또한 온도 제어 시스템, 성장 배지를 순환시키기 위한 펌프, 성장 배지 및/또는 세포 성장을 위해 필요한 영양물 및/또는 임의의 다른 물질의 수준을 유지하기 위해 요구되는 첨가제 및/또는 물질의 용적을 도입하기 위해 생물반응기에 연결될 수 있는 하나 이상의 유체 저장소를 포함하도록 구성된다.
수확하기 위해 세포를 성장시키고/시키거나 유지하고, 세척하고/하거나 증식시키고/시키거나 분화시키고/시키거나 활성화시키고/시키거나 탈착시키는 임의의 단계를 위해 요구되는 다른 물질은 또한 다양한 효소, 성장 인자, 활성화 인자, 분화 인자, 세척 완충액, pH 조정, 용존 산소 조정, 영양물 또는 또는 임의의 다른 필요한 물질 또는 화합물을 포함하는 상기 유체 저장소를 통해 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 생존 세포는 또한 생물반응기 내에서 세포와 동시배양하거나 세포를 활성화시키기 위해 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 생성물 또는 미생물 생성물을 유도하고/하거나 이들의 유도를 유지하기 위해 요구되는 다른 물질은 또한 생물반응기 내 배지에 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템은 또한 생물반응기의 작동을 제어하기 위한, 생물반응기의 다양한 상이한 밸브를 개방시키고/시키거나 폐쇄하기 위한, 펌프 및/또는 다양한 상이한 밸브를 제어함에 의해 생물반응기를 통한 성장 배지 또는 다른 유체의 유동을 제어하기 위한 제어기를 포함하도록 구성된다. 본원에 사용된 바와 같은, 당업자는 용어 "유동 속도 (flow velocity)"가 모두 동일한 의미 및 질을 갖는 "유동 속도 (flow rate)"와 상호교환적으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, 당업자는 용어 "천공"이 모두 동일한 의미 및 질을 갖는 "공극"과 상호교환적으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 유동 속도는 직간접적으로 본원에 기재된 생물반응기에서 배양된 세포의 밀도에 영향을 준다. 일부 구현예에서, 낮은 유동 속도는 매우 높은 밀도의 세포 배양물을 배양하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템 및 생물반응기는 또한 성장 배지 내 다양한 물리적 및/또는 화학적 파라미터 (예를 들어, 온도, pH, 글루코스 농도, 용존 산소 농도, 용존 이산화탄소의 농도 또는 HCO3- 이온의 농도, 락테이트의 농도 및 이온 강도와 같은) 모니터링하고.하거나 조절하기 위한 제어기에 적합하게 연결된 하나 이상의 센서를 포함하도록 구성되고, 모두는 생물반응기 및/또는 생물반응기 헤드공간에서 및/또는 생물반응기로 연결될 수 있는 유체 저장소에서 및/또는 다양한 유입구 또는 유출구 포트에서 감지되고, 모니터링되고 제어될 수 있다. 일부 구현예에서, 센서는 생물반응기에 성장한 세포 또는 미생물에 의해 합성된 생성물을 검출하기 위해 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 특성 중 일부의 제어는 성장 배지의 혼합을 요구할 수 있고, 상기 혼합은 유체 저장소에서 제공될 수 있다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에서 사용된 모든 기술적 및/또는 과학적 용어는 생물반응기 및 이의 시스템이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 도 1-16 및 이의 수반된 기재는 생물반응기 및 이의 시스템의 다양한 구현예를 제공한다. 당업자는 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 다른 방법 및 재료가 본원에 기재된 구현예의 수행 또는 시험에 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 추가로, 재료, 방법 및 예는 단지 설명을 위한 것이고 필수적으로 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 기재된 생물반응기 및 이의 시스템의 구현예의 방법 및/또는 시스템의 수행은 수동으로, 자동으로 또는 이의 조합으로 선택된 작업을 수행하거나 완료함을 포함할 수 있다. 더욱이, 본원에 기재된 방법 및/또는 시스템의 구현예의 실제 기구 및 장비에 따라, 여러 선택된 작업은 하드웨어에 의해, 소프트웨어에 의해 또는 펌웨어에 의해 또는 작동 시스템을 사용한 이의 조합에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에 다른 선택된 작업을 수행하기 위한 하드웨어는 칩 또는 서킷으로서 수행될 수 있다. 소프트웨어로서, 일부 구현예에 따른 선택된 작업은 임의의 적합한 작동 시스템을 사용하는 컴퓨터에 의해 수행되는 다수의 소프트웨어 지침서와 같이 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및/또는 시스템에 따른 하나 이상의 작업은 다수의 지침서를 실행하기 위한 컴퓨터 플랫폼과 같은 데이터 프로세서에 의해 수행될 수 있다. 임의로, 상기 데이터 프로세서는 지침서, 및/또는 데이터를 저장하기 위한 소멸성 메모리, 및/또는 비-소멸성 저장장치, 예를 들어, 지침서 및/또는 데이터를 저장하기 위한 자기 하드-디스크 및/또는 제거가능한 매체를 포함한다. 임의로, 네트워크 연결이 또한 제공된다. 디스플레이 및/또는 사용자 입력 장치, 예컨대 키보드 또는 마우스가 또한 임의로 제공된다.
지금 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 천공된 장벽을 갖는 생물반응기를 포함하는 생물반응기 시스템을 설명하는 도식적 부분 횡단 다이아그램인 도 1을 참조한다. 일부 구현예에 따라, 생물반응기 시스템 (50)은 생물반응기 (10), 펌프 (4), 제어기 (30) 및 성장 배지 저장소 (20)를 포함한다.
펌프 (4)는 당업계에 공지되고 펌프의 유입구 포트에 수용된 성장 배지와 같은 유체를 수용할 수 있고 성장 배지의 멸균성을 손상시키는 것 없이 제어 가능한 펌핑 속도로 이를 유출구 포트를 통해 펌핑하는 임의의 유형의 유체 펌프일 수 있다. 예를 들어, 펌프 (4)는 예를 들어, 제조원 (Watson-Marlow fluid technology group (Uk))으로부터 시판되는 모델 530 프로세스 펌프 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 유형의 펌프와 같은 다양한 유동 속도 연동 펌프일 수 있다.
생물반응기 (10)는 바닥 부분 (10B) 및 상부 부분 (1OC)을 갖는 생물반응기 벽 (10A)을 갖는다. 도 1에 제공된 생물반응기의 구현예에서, 생물반응기 (10)는 나삿니가 있는 커버 (10D)가 밀폐적으로 나사로 고정되는 나낫니가 있는 개방구 (10E)를 갖는 상부 (10C)를 포함한다. 커버 (10D)는 또한 (임의로) 거기에 예를 들어, 센서 유닛 (22)이 생물반응기 (10)의 벽 (10A) 내에 내포된 용적으로 밀폐적으로 삽입되도록 구성되는 개방구 (10F)와 같은 하나 이상의 개방구를 갖도록 구성된다. 일부 구현예에 따라, 나삿니가 있는 개방구 (10G)는 사용 중에 있지 않는 경우 나삿니가 있는 밀폐 캡 (10H)에 의해 밀폐되도록 구성된다. 생물반응기 커버 (10D)는 (임의로) 여러 추가의 밀폐될 수 있는 개방구 (도 1에 나타내지 않음)를 포함하도록 구성되고, 상기 개방구는 거기에 추가의 센서 (도 1에 나타내지 않음), 또는 예를 들어, 가열 유닛(나타내지 않음)), 산소화 유닛 (나타내지 않음), 온도계 (나타내지 않음) 또는 생물반응기 (10)를 작동시키고/시키거나 생물반응기 (10)의 내용물을 모니터링하기 위해 요구되는 임의의 다른 장치 및/또는 샘플링을 허용하고 재료의 생물반응기 (10)의 내용물로로의 도입을 가능하게 하는 포트와 같은 다른 요구되는 장치를 삽입하기 위해 사용되도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (10)는 당업계에 공지된 임의의 적합한 생물적합성 재료, 예를 들어, 적합하게 생물적합성 플라스틱 또는 중합체 기반 재료로부터 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서, 반응기 (10)는 작동자가 생물반응기 (10)의 내용물을 볼 수 있도록 투명한 재료로부터 만들어진다. 일부 구현예에서, 생물반응기 (10)의 구성에 사용될 수 있는 재료의 비제한적인 예는 폴리스티렌, 스테인레스 강, 폴리에테르에테르케톤 (PEEK), 폴리설폰, 및 다양한 유형의 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 플라스틱, 예를 들어 Rulon®을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기의 구성에 사용하기 위한 재료는 이들의 낮은 마찰 계수, 우수한 내마모성, 감마 방사선 멸균화, 광범위한 작동 온도, 또는 화학적 불활성 또는 이들의 임의의 조합을 기준으로 선택된다.
생물반응기 (10)는 생물반응기 (10)의 벽 (10A)에 밀폐적으로 부착된 천공된 장벽 (12)을 추가로 포함한다. 상기 천공된 장벽 (12)은 생물반응기 (10) 내에 내포된 용적을 제1 (하부) 챔버 (14A)와 제2 (상부) 챔버 (14B)로 나눈다. 천공된 장벽 (12)은 그 안에 다수의 천공을 갖는 재료로부터 만들어진다. 천공된 장벽 (12)에 형성된 천공의 평균 직경은 성장 배지 (2)에 현탁된 세포 (3) (또는 미생물)가 천공된 장벽 (12)의 천공으로 침투할 수 없고 성장 배지 (2)는 천공 내로 및 이를 통해 유동할 수 있도록 선택된다. 천공된 장벽 (12)은 성장 배지 (2)가 이를 통해 유동하고 통과할 수 잇게 하면서 세포 (또는 미생물) 장벽으로서 작동한다. 일부 구현예에 따라, 천공된 장벽 (12)의 구성은 또한 배지 유동을 정렬하도록 구성된다. 일부 구현예에 따라, 상기 정렬은 세포 매쓰 (3)를 향하고 상부 챔버 전반에 걸쳐 선형성 및 균일성을 개선시킴을 포함한다.
천공된 장벽 (12)은 예를 들어, 적합한 생물적합성 플라스틱 또는 선택된 천공 평균 천공 (또는 공극) 직경을 갖는 중합체 기반 재료와 같은 임의의 적합한 천공된 생물적합성 재료로부터 만들어질 수 있다. 천공된 장벽 (12)의 두께 및 강도, 및 천공된 장벽 (12)을 위해 선택된 천공된 재료의 유형은 예를 들어, 생물반응기 (12)에서 성장될 세포 또는 미생물의 평균 크기, 생물반응기를 통과하는 성장 배지 (2)의 목적하는 유동 속도, 제1 챔버 (14A) 내 성장 배지의 허용되는 최대 압력 수준, 또는 생물반응기의 디자인에서 수행된 바와 같이 세포 또는 미생물을 수확하는 방법, 또는 이의 임의의 조합에 의존할 수 있다. 예를 들어, 천공된 장벽이 이하에서 상세히 기재된 바와 같이 고정될 필요가 있는 경우 (예를 들어, 도 7-8 참조), 보다 얇은 천공된 장벽이 사용을 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 천공된 장벽이 만들어질 수 있는 재료의 유형은 셀룰로스 니트레이트, 셀룰로스 아세테이트, 폴리테트라플루오르에틸렌 (PTFE), 소수성 PTFE, 친수성 PTFE, 지방족 또는 반-방향족 폴리아미드- 예를 들어 Nylon®, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴, 스테인레스 강, 및 재생된 셀룰로스를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 천공된 장벽 (12)의 두께는 0.5 내지 5.0 밀리미터의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 보다 얇은 천공된 장벽은 적용 분야, 천공된 장벽이 만들어지는 재료의 기계적 성질, 천공된 장벽의 총 표면적 및 형태 및 다른 고려 사항에 의존하여 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 보다 두꺼운 천공된 장벽은 적용 분야, 천공된 장벽이 만들어지는 재료의 기계적 성질, 천공된 장벽의 총 표면적 및 형태 및 다른 고려 사항에 의존하여 사용될 수 있다.
생물반응기 (10)는 이를 통해 성장 배지 (2)가 제1 챔버 (14A)로 펌핑될 수 있는 유체 유입구 포트 (16)를 갖는다. 유체 유입구 포트 (16)는 생물반응기 시스템 (50)의 펌프 (4)로부터 압력 하에 성징 배지 (2)를 수용하도록 구성된다. 유체 유입구 포트 (16)에 진입하는 성장 배지는 제1 챔버 (14A) 내 배치된 유체 임펠러 (18)를 통과할 수 있다. 상기 (임의의) 유체 임펠러 (18)는 그 안에 다수의 통로 (18P)를 갖는 중공 디스크 유사 천공된 구성원이도록 구성된다.
유체 임펠러 (18)는 유입구 포트 (16)로부터 성장 배지 (2)를 수용하고 챔버 (14A) 내 배치된 성장 배지 (2)와 함께 유입구 포트 (16)에 진입하는 성장 배지 (2)의 혼합을 증진시키기 위해 성장 배지의 다중 제트 (19)에서 다수의 천공 (18P)을 통해 성장 배지 (2)를 분배하기 위해 구성된다. 도 1에 도해된 유체 임펠러 (18)의 특이적 구조는 유체 임펠러의 하나의 구현예이고 절대 필요한 것이 아닌 것으로 주지된다. 다양한 상이한 형태, 구조, 치수를 갖고 통로 및/또는 노즐을 사용하는 유체 임펠러/분배기의 많은 다른 상이한 유형은 핀치 블레이드 또는 마린 (marine) 유형과 같은 임펠러 유형을 포함하는 당업계에 널리 공지된 바와 같이 사용될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 시스템 (50)의 작동에서, 세포 (또는 미생물)은 성장 배지에 현탁되고 상기 현탁된 세포를 개방구 (10E)를 통해 또는 커버 (10D) (이는 이어서 캡 (10H)를 사용하여 밀봉될 수 있다)의 개방구 (10G)를 통해 삽입함에 의해 생물반응기 (10)의 제2 (상부) 챔버 (14B) 내에 위치시킨다. 대안적으로, 세포 현탁액은 예를 들어, 천공된 장벽 (12)의 표면 (12A) 바로 위에 제2 챔버 (14B)로의 수확 포트 (21)와 같은 임의의 다른 적합한 포트를 통해 제2 (상부) 챔버 (14B)에 삽입될 수 있다. 유체 임펠러 (18)에 의해 챔버 (14B)로 주사된 성장 배지 (2)는 제1 챔버 (14A)에서 성장 배지 (2)의 압력을 증가시키고 성장 배지 (2)가 천공된 구성원 (12)의 천공을 통해 성장 챔버 (14B) 내에 유지된 성장 배지 (2) 내 현탁된 세포 매쓰 (3)를 효과적으로 관류시키는 제2 챔버 (14B)로 유동하도록 한다. 성장 배지 (2)는 제2 챔버 (14B) 내에서 세정하고 유체 유입구 (26)의 수준에 도달하고, 이것은 생물반응기 (10)로부터 인출되고 도관 (28)에 의해 펌프 (4)로 운반되고 여기서, 이것은 유입구 포트 (16)를 통해 생물반응기 (12)로 재순환된다.
일부 구현예에서, 생물반응기 (10)는 일반적으로 절두원추 형태를 갖는다. 바닥 부분 (10B)의 직경은 상부 (10C)의 직경 보다 작고 벽 (10A)은 경사진다. 생물반응기의 절두원추 형태로 인해, 생물반응기의 직경은 성장 배지가 생물반응기내에서 상향 (상부 (10D)를 향해)으로 이동함에 따라 증가한다.
펌프 (4)가 성장 배지를 일정 유동 속도로 유입구 포트 (16)로 밀어냄에 따라, 천공된 장벽 (12)의 표면 (12A)에 인접한 성장 배지 (2)의 유동 속도 (유체 속도)는 상부 (10D) 부근에서 성장 배지의 유동 속도 보다 더 높아, 생물반응기 (10)의 종축 (35)을 따라 유체 유동 속도 구배를 효과적으로 확립시킨다. 유동 속도 구배는 도식적으로 실선 화살표 37A, 37B 및 37C의 길이 및 두께에 의해 지적된다. 화살표 37A에 의해 제공된 유동 속도는 화살표 37B에 의해 제공된 유동 속도 보다 크고 화살표 37B에 의해 제공된 유동 속도는 화살표 37C에 의해 제공된 유동 속도 보다 크다.
상기 현탁된 세포 (3)는 세포 (3)에 작용하는 중력으로 인해 하향 이동하여 표면 (12A)에 침강하는 성장 배지 (2)의 세포 (3)의 경향 (성장 배지 (2)의 비중 보다 높은 비중을 갖는)에 반대로 작용하는, 성장 배지 (2)의 상향 이동하는 유동에 의해 상향으로 운반된다. 성장 배지의 유동 속도는 따라서 제2 챔버 (14B) 내에 함유하는 성장 배지 (2)의 용적 내 세포의 적당한 현탁을 유도하여 천공된 장벽 (12)의 표면 (12A) 상에 세포 (3)의 침강을 회피하도록 제어되고 조정될 수 있고 성장 배지 (2)에 현탁된 대부분의 세포 (3)를 챔버 (14B) 내 특정 영역에서 잔류시키며, 상기 챔버 (14B)는 성장 배지 (2)의 상부 표면 (2A) 보다 적당히 낮아서 유체 유출구 포트 (26) (세포 (3)의 손실을 크게 감소시키는)에 진입하는 세포의 수를 최소화하거나 적절히 감소시킨다. 일부 구현예에 따라, 유출구 포트 (26)는 세포 또는 미생물이 생물반응기를 이탈하지 못하도록 구성된, 천공된 장벽 또는 필터 (나타내지 않음)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 챔버 (14B)를 통한 성장 배지 (2)의 유동 속도는 충분히 낮아서 세포 (3)에 해로울 수 있는 상당한 전단력을 회피한다.
생물반응기 (10)를 통한 성장 배지 (2)의 적당한 유동 속도가 확립된 경우, 펌프 (4)는 폐쇄된 루프에서 유체 유입구 포트 (16)를 통해 유체 유출구 포트 (26)로 배출되는, 임의의 성장 배지 (2)를 펌핑함에 의해 생물반응기 (10)의 용적을 통해 임의의 성장 배지 (2)를 순환시킨다. 세포 성장 동안에, 새로운 영양물을 성장 배지 (2)에 첨가하고 (세포로의 흡수에 의해 이의 고갈을 보충하기 위해) 또는 활성화 물질 또는 임의의 다른 첨가제 또는 물질을 성장 배지 (2)에 첨가할 필요성이 발생하는 경우, 이것은 배지 튜브 (38)에 의해 시스템 (50)의 배지 저장소 (20)로부터 일부 새로운 성장 배지 (2)를 유동시킴에 의해 수행될 수 있다.
배지 저장소 (20)는 적합한 중공 도관 (38)에 의해 펌프 (4)의 유입구 포트 (4A)에 연결되도록 구성된다. 적합한 제어 가능한 밸브 (또는 마개) (39)는 도관 (38) 및 펌프 유입구 (4A) 사이에 부착되도록 구성되어 유체 저장소 (20)로부터 펌프 유입구 포트 (4A)로 성장 배지의 이동이 제어될 수 있도록 한다. 밸브 (39)는 유체 저장소 (20)로부터 펌프 유입구 포트 (4A)로의 유체의 공급을 중지시키기 위해 제어 가능하게 폐쇄되도록 구성되거나 유체 저장소 (20)로부터 펌프 유입구 포트 (4A)로 유체 공급을 허용하여 배지 신선도 및 고밀도 세포 배양을 가능하게 하기 위해 개방되도록 구성된다.
일부 구현예에서, 유동 속도의 조절은 성장하고 번식하는 세포의 밀도와 상호관련된다. 일부 구현예에서, 매우 낮은 유동 속도는 본원에 기재된 생물반응기에서 세포의 고밀도 배양을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포가 성장하는 배지의 작업 용적은 세포의 고밀도 배양의 유지를 허용하는 유동 속도와 같이 낮다. 상기 낮은 작업 용적 및 낮은 유동 속도는 특정 구현예에서 보다 높은 수율 및 보다 낮은 배지 필요성을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기 및 이의 사용 방법은 보다 높은 수율 및 보다 낮은 배지 필요성을 유도하는, 세포 또는 유기체의 고밀도 배양을 성취하고 유지하는 이들의 능력으로 인해 당업계에 공지된 다른 생물반응기와 비교하여 유리하다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기는 생물반응기 크기를 최소화함으로써 배지 사용을 최소화하는 보다 작은 물리적 풋프린트를 포함한다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (10)는 또한 (임의로) 생물반응기의 바닥 부분 (10B)에서 개방하는 추가의 유출구 포트 (27)를 포함하도록 구성된다. 유출구 포트 (27)는 필요하다면 생물반응기 (10)의 제1 챔버 (14A)로부터 일정 양의 성장 배지 (2)의 인출이 가능하도록 구성된 밸브 (또는 마개) (25)를 포함한다. 예를 들어, 일정 양의 새로운 성장 배지 (2)가 유체 저장소 (20)로부터 생물반응기 (10)에 첨가되는 경우, 유사한 양의 성장 배지는 제2 챔버 (14B) 내에서 성장 배지 (2)의 수준을 회복하기 위해 생물반응기 (10)로부터 배출될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 성장 배지 (2)는 또한 세포 수확을 위해 세포 (3)를 농축시키기 위해 제2 챔버 (14B) 내 성장 배지 (2)의 총 용적을 감소시키는 것이 요구되는 경우 유출구 포트 (25)를 통해 생물반응기 (10)로부터 배출될 수 있다. 상기 세포 농축이 수행되는 경우, 제2 챔버 (14B)의 하부에 잔류하는 성장 배지 (2)의 용적이 보다 작은 경우 세포 (3)는 천공된 장벽 (12)을 통과할 수 없고 따라서 농축되기 때문에 세포 수 (성장 배지의 ml 당 세포에서)는 보다 높아진다. 챔버 (14B)에 잔류하는 세포 (3)의 농축된 현탁액은 이어서 도 1에 도해된 바와 같이 밸브 (또는 마개) (23)를 포함하도록 구성된 수확 포트 (21)를 통해 수확될 수 있다.
일부 구현예에서, 천공된 장벽 (12)의 막힘을 방지하기 위해, 대부분의 성장 배지는 유출구 포트 (126A-126D) (하기에 상세히 기재된 바와 같이) 중 적어도 하나를 통해 인출될 수 있고 단지 최소 용적의 성장 배지가 유출구 포트 (25)를 통해 인출될 수 있다.
임의의 목적하는 첨가제 및/또는 물질은 상기 물질 및/또는 첨가제를 유체 저장소 (20) 내에 유지된 성장 배지 (2)로 도입하고 상기 물질 및/또는 첨가제를 포함하는 성장 배지 (2)의 용적이 상기에 기재된 바와 같이 챔버 (14A)로 유동하도록 함에 의해 생물반응기 (10)로 도입될 수 있으면서 또한 적합한 고농도의 물질 및/또는 첨가제를 포함하는 비교적 작은 용적의 유체 또는 성장 배지를 생물반응기 (10)의 임의의 적합한 개방구 또는 유입구 포트를 통해 도입하고 첨가된 작은 용적이 목적하는 농도에 도달하도록 반응기내 순환하는 성장 배지 (2)의 용적과 혼합함에 의해 상기 물질 및/또는 첨가제를 생물반응기에 직접 도입할 수 있는 것으로 주지된다. 예를 들어, 첨가제 및/또는 물질을 포함하는 상기 작은 용적의 유체 또는 성장 배지는 캡 (10H)을 일시적으로 제거하고 개방구 (10G)를 재밀봉함에 의해 개구부 (10G)를 통해 도입될 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 캡 (10H)은 당업계에 공지되고 주사 가능한 액체 제형을 함유하는 병에 통상적으로 사용되는 바와 같은 고무, 라텍스 또는 임의의 다른 적합한 밀봉재로부터 만들어진 침투성 밀봉 가로막 (도 1에 상세히 나타내지 않음)을 포함하도록 구성되고 물질 및/또는 첨가제와 함께 작은 용적의 유체는 멸균된 니들을 갖는 멸균 시린지에 로딩될 수 있고 여기서, 상기 니들은 이것이 밀봉 가로막을 침투할때까지 캡의 밀봉 가로막으로 밀어내도록 구성되고, 시린지의 내용물은 이어서 제2 챔버 (14B) 내 성장 배지 (2)로 주사될 수 있고 주사기의 니들은 당업계에 공지된 바와 같이 밀봉 막으로부터 인출될 수 있다. 상기 방법은 임의의 목적하지 않은 미생물에 의한 성장 배지의 오염 위험을 유리하게 감소시킬 수 있다. 추가로, 캡 (10H)은 멸균 방식으로 배지 샘플링을 허용하는 하나 방식의 밀봉재와 성장 배지 (2)를 접촉시키는 깊은 튜브를 갖도록 구성된다.
일부 다른 구현예에서, 캡 (10H)은 필터 (도 1에 나타내지 않음)를 포함하도록 구성된다. 캡의 필터는 공기의 헤드공간 (생물반응기 상부 (10C) 및 배지의 표면 사이의 공간)으로의 유동을 가능하게 하거나 헤드공간으로부터 감압을 위해 구성된다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 시스템 (50)은 시스템의 작동을 모니터링하기 위해 제어기 (30) 및 센서 유닛 (22)을 사용하도록 구성된다. 센서 유닛 (22)은 센서 또는 다중 센서들 (개별 센서들은 도해를 명료하게 하기 위해 도 1에 상세히 나타내지 않는다)을 포함하도록 구성되고, 상기 센서는 예를 들어, 성장 배지 (2)에 침지된 센서 유닛 (22)의 말단 부분 (22A)을 통해, 또는 유출구 포트 (126A-126D) 중 적어도 하나를 통해, 또는 수확 포트 (21)를 통해, 또는 유입구 포트 (116)를 통해, 또는 유출구 포트 (27)를 통해 또는 측벽 (10A) 또는 이들의 임의의 조합을 통해 여러 위치에 배치될 수 있다. 센서 유닛 (22)의 센서(들)은 예를 들어, H+ 이온의 농도 (성장 배지 (2)의 pH를 결정하기 위해), 성장 배지 (2) 내 용존 산소의 농도, 성장 배지 (2) 내 용존 이산화탄소의 농도 또는 성장 배지 (2) 내 HCO3 - 이온의 농도, 글루코스의 농도, 락테이트의 농도 및 이온 강도와 같은 성장 배지 (2) 내 여러 화학물질 종의 농도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 센서 또는 센서들은 벽을 침투할 필요 없이 감광을 사용한 단일 용도의 센서일 수 있거나 액체와 접촉하는 10A 상에 위치할 수 있다. 일부 구현예에 따라, 센서 유닛 (22)의 센서들은 또한 이에 제한되지 않지만 상징 배지 (2)의 온도 및/또는 탁도 및/또는 광학 밀도, 및/또는 전도성, 전기용량, 압력, 유동 속도, 점도, 탁도 등과 같은 성장 배지 (2)의 임의의 다른 목적하는 물리적 파라미터와 같은 성장 배지 (2)의 물리적 파라미터를 감지하기 위한 센서이도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 센서에 의해 감지되는 화학적 및/또는 물리적 파라미터 중 어느 하나를 제공하는 센서 유닛 (22)으로부터의 신호(들)은 적합한 전기 전도체 (또는 전도체 쌍) (22B)에 의해 제어기 (30)로 공급될 수 있다. 제어기 (30)는 당업계에 널리 공지된 바와 같이 감지된 파라미터 값을 결정하기 위해 상기 센서 신호를 프로세싱하기 위해 구성된다.
일부 구현예에 따라, 제어기 (30)는 예를 들어, 마이크로프로세서 또는 마이크로제어기 또는 디지탈 신호 프로세서, 퍼스널 컴퓨터 또는 수용된 신호를 프로세싱하기 위한 임의의 다른 적합한 수단 생물반응기의 모든 결정된 센서 데이터 및 작동 이력 (생물반응기 (10)을 통한 성장 배지 (2)의 유동 속도, 유체 저장소 (20)로부터 성장 배지의 도입 시간 및 용적, 시스템 (50)의 작동 동안에 임의의 다른 첨가된 물질 또는 첨가제의 도입 시간 및 용적 및 농도를 포함하지만 이에 제한되지 않는)의 오프-라인 및 온-라인 제공을 목적으로 그 안에 임의의 컴퓨터 데이터를 저장하기 위한 당업계에 공지된 요구되는 임의의 유형의 메모리 장치와 같은 하나 이상의 프로세싱 장치이도록 구성되거나 이를 포함하도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 제어기 (30)는 또한 프로세싱된 결과 및 임의의 감지된 파라미터의 값을 시스템 (50)의 작동자 또는 사용자에게 디스플레이하기 위해 당업계에 공지된 임의의 디스플레이 장치를 포함하도록 구성된다. 제어기 (30)는 또한 데이터 및/또는 적합한 명령을 제어기 (30)에 입력하기 위해 시스템 (50)의 사용자 또는 작동자에 의해 사용되도록 구성되는 하나 이상의 사용자 인터페이스 장치 (이에 제한되지 않는 마우스, 광펜, 포인팅 장치, 키보드, 접촉 민감성 스크린, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 입력 장치와 같은)를 포함하도록 구성된다. 예를 들어, 사용자는 적합한 명령을 제어기 (30)에 입력하여 적합한 제어 신호가 제어기 (30)에 의해 제어기 (30) 및 펌프 (4)를 연결하는 통신선 (29)을 통해 펌프 (4)로전송되도록 함에 의해 생물반응기 (10)를 통한 성장 배지 (2)의 유동 속도를 제어할 수 있다.
본원의 시스템의 일부 구현예에서, 시스템 (50)의 밸브 (23), (24), (25), 및 (39)는 수동으로 폐쇄되거나 개방될 수 있는 수동 밸브 또는 마개이도록 구성된다. 일부 다른 구현예에서, 하나 이상의 밸브 (23), (24), (25), 및 (39)는 제어기 (30)로부터 적당한 명령 신호를 수용함에 의해 작동될 수 있는 전기적으로 작동되는 밸브이도록 구성된다.
예를 들어, 임의의 밸브 (23), (24), (25), 및 (39)는 전기적으로 작동 가능한 솔레노이드 기반 밸브일 수 있고, 이는 적합한 전압 또는 전류 신호를 제어기 (30)에 의해 솔레노이드로 적용함에 의해 제어적으로 및/또는 자동적으로 개방되고/되거나 폐쇄될 수 있다. 도해를 명료하게 하기 위해, 제어기 (30)와 임의의 밸브 (23), (24), (25) 및 (39) 사이에 연결된 임의의 전선은 도 1에 나타내지 않음을 주지한다. 그러나, 상기 임의의 연결은 도 5의 개략적인 다이아그램에 나타낸다.
생물반응기 시스템 (50)에서, 제2 챔버 (14B) 내 성장 배지 (2)의 상부 표면 (2A)의 수준은 고정되지만, 이것은 절대 필요한 것은 아니고 생물반응기 시스템의 일부 구현예에서, 생물반응기 내 성장 배지의 수준 (높이)은 제어 가능하게 변화될 수 있는 것으로 주지된다.
지금 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 생물반응기 내 성장 배지의 수준을 제어 가능하게 조정하기 위한 다중 유체 유출구 포트와 함께 생물반응기를 갖는 생물반응기 시스템을 설명하는 도식적 부분 횡단 다이아그램인 도 2를 참조한다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 시스템 (150)은 생물반응기 (110), 상기 상세히 기재된 바와 같은 제어기 (30), 상기 상세히 기재된 바와 같은 펌프 (4) 및 상기 상세히 기재된 바와 같은 유체 저장소 (20)를 포함한다. 생물반응기 시스템 (150)은 또한 산소화 시스템 (160)을 포함하도록 구성된다. 생물반응기 (110)는 생물반응기 (110)에 대해 상기 상세히 기재된 임의의 재료로부터 만들어질 수 있다. 생물반응기 (110)는 생물반응기 벽 (110A), 바닥 부분 (11OB) 및 생물반응기 상부 부분 (11OC)을 갖는다. 일부 구현예에 따라, 상부 부분 (110C)은 그것을 나삿니가 있는 센서 유닛 (122)을 통해 거기에 밀봉적으로 삽입하기 위해 거기에 나삿니가 있는 개방구 (110F)를 갖도록 구성된다. 생물반응기 (110D)의 상부에서 상부 개방구는 캡 (110E)을 사용하여 효과적으로 폐쇄될 수 있고, 여기서, 생물반응기의 헤드 플레이트 내 개방구의 밀봉은 110G로 나타낸다.
일부 구현예에 따라, 센서 유닛 (122)은 센서 유닛 (122)의 말단 (122A)이 침지될 수 있는 성장 배지 (2)의 임의의 목적하는 화학적 또는 물리적 성질을 감지하기 위한 센서 유닛 (122)의 말단 (122A)에 부착되거나 포함되는 임의의 수의 센서 (개별적으로 도해를 명료하게 하기 위해 도 2에 나타재지 않음)를 포함하도록 구성된다. 말단 (122A)의 위치는 나삿니가 있는 개방구 (110F) 내에 상하로 센서 유닛 (122)을 나사로 연결함에 의해 변화될 수 있어 말단 (122A)은 생물반응기 (110) 내에 성장 배지 (2)의 임의의 수준에서 성장 배지 (2)에 침지될 수 있음을 주지한다.
천공된 장벽 (112)은 생물반응기 (110)의 벽 (110A)에 밀봉적으로 부착되어 천공된 장벽 (112)은 생물반응기 시스템 (150)의 생물반응기 (110)의 내부 용적을 생물반응기 (10) 및 천공된 장벽 (12)에 대해 상기 상세히 기재된 바와 같이 제1 (하부) 챔버 (114A) 및 제2 (상부) 챔버 (114B)로 나눈다. 일부 구현예에 따라, 천공된 장벽 (112)은 유사한 물질(들)로 만들어질 수 있고 천공된 장벽 (12)에 대해 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같은 유사한 천공 평균 크기를 가질 수 있다.
그러나, 일부 구현예에 따라, 생물반응기 (10) (도 1의)는 제2 챔버 (14B) 내 단일 유체 유출구 포트 (26)를 갖지만, 생물반응기 (110)는 상이한 높이에서 다수의 상이한 유체 유출구 포트 및 상응하는 밸브. 예를 들어. 제2 챔버 (114B) 내 4개의 상이한 유체 유출구 포트 (126A), (126B), (126C) 및 (126D)를 갖는다. 유출구 포트 (126A), (126B), (126C) 및 (126D)는 상이한 위치에서 제2 챔버 (114B)의 길이를 따라 배치되고 유체 유출구 포트 (126A), (126B), (126C) 및 (126D) 각각은 여기에 부착된 상응하는 밸브 (124A), (124B), (124C) 및 (124D) (각각)를 갖는다. 밸브 (124A), (124B), (124C) 및 (124D)는 유체적으로 펌프 (4)에 연결되는 통상의 유체 매니폴드 (128)에 유체적으로 연결되어 있다. 상이한 위치에서 4개의 밸브 (124A), (124B), (124C) 및 (124D)의 정렬은 성장 배지 (2)의 수준이 점선 A, B 및 C 및 선 D에 의해 도 2에 도식적으로 제공된 4개의 상이한 수준으로부터 선택되도록 한다.
일부 구현예에서, 밸브 (124D)가 개방되고 밸브 (124A), (124B), (124C)가 폐쇄되는 경우 (도 2에 도해된 바와 같이), 성장 배지 (2)는 실선 D에 의해 나타낸 수준에 도달하고 유체 유출구 포트 (126D)를 통한 제2 챔버 (114B)를 이탈하는 성장 배지 (2)는 매니폴드 (128)에 진입하고 펌프 유출구 (4B)를 통해 펌프 유입구 포트 (116)로 및 천공 (19)을 통해 유체 임펠러 (18)로 성장 배지 (2)를 펌핑하는 펌프 (4)에 의해 생물반응기 (110)로 재순환된다.
일부 구현예에서, 제2 챔버 (114B)에서 성장 배지 (2)의 수준을 증가시키고자 하는 경우, 밸브 (126A), (126B) 및 (126D)는 폐쇄될 수 있고 밸브 (126C)는 개방될 수 있고 밸브 (39)는 일정 기간 동안 개방되어 성장 배지 (2)의 수준이 이 시점에서 밸브 (39)가 폐쇄되고 성장 배지 (2)가 유체 유출구 포트 (126C)를 통해 제2 챔버를 이탈하는 점선 C에 의해 나타낸 수준에 도달할 때까지 저장소 (20)로부터 일정 양의 성장 배지 (2)가 펌프 (4)에 의해 제1 챔버 (114A)로 펌핑될 수 있도록 한다.
유사하게, 일부 구현예에서, 제2 챔버 (114B)에서 성장 배지 (2)의 수준을 추가로 증가시키고자 하는 경우, 밸브 (126A), (126C) 및 (126D)는 폐쇄될 수 있고 밸브 (126B)는 개방될 수 있고 밸브 (39)는 일정 기간동안 성장 배지 (2)의 수준이 이 시점에서 밸브 (39)가 폐쇄될 수 있고 성장 배지 (2)가 유체 유출구 포트 (126B)를 통해 이탈하는 점선 B에 의애 나타낸 수준에 도달할 때까지 저장소 (20)로부터 추가 양의 성장 배지 (2)가 펌프 (4)에 의해 제1 챔버 (114A)로 펌핑되도록 개방될 수 있다.
추가로, 제2 챔버 (114B)에서 성장 배지의 수준을 심지어 추가로 증가시키고자 하는 경우, 일부 구현예에 따른 밸브 (126B), (126C) 및 (126D)는 폐쇄될 수 있고 밸브 (126A)는 개방될 수 있고 밸브 (39)는 일정 기간동안 성장 배지 (2)의 수준이 이 시점에서 밸브 (39)가 폐쇄될 수 있고 성장 배지 (2)가 유체 유출구 포트 (126A)를 통해 제2 챔버를 이탈하는 점선 A에 의해 나타낸 수준에 도달할 때까지 저장소 (20)로부터 추가 양의 성장 배지 (2)가 펌프 (4)에 의해 제1 챔버 (114A)로 펌핑되도록 개방될 수 있다.
생물반응기 (110)는 4개의 상이한 수준을 허용하는 4개의 유체 유출구 포트 (126A), (126B), (126C) 및 (126D) 수준을 포함하지만, 이것은 성장 배지 (2)의 폐쇄된 루프 관류 (재순환) 동안에 성장 배지 (2)가 성취되기에 절대 필요한 것은 아니고, 이것이 결코 절대 필요한 것으로 의도되지 않음을 당업자는 이해할 것이다. 차라리, 본원의 생물반응기의 일부 구현예에서, 생물반응기의 제2 챔버로 개방하는 유출구 포트 (및 여기에 부착된 상응하는 밸브)의 수는 필요에 따라 다양할 수 있고 4개 미만 또는 초과 (요구되는 수의 밸브를 수용하기 위한 매니폴드 (128)의 적합한 변형과 함께)일 수 있고, 이러한 방식으로 임의의 요구되는 실제 수의 성장 배지 (2) 수준이 상기 상세히 기재된 바와 같이 밸브의 적합한 개방 및 폐쇄에 의해 생물반응기의 제2 챔버에 성취되도록 한다.
생물반응기의 제2 챔버 내 성장 배지 (2)의 상이한 수준을 설정할 수 있는 이점은 이것이 필요하다면 생물반응기 내에서 성장될 수 있는 세포 (또는 미생물)의 수를 증가시키기 위해(또는 각각 감소시키기 위해) 제2 챔버 (114B) 내 성장 배지 (2)의 총 용적의 증가 또는 감소를 허용할 수 있다는 것이다. 상기 기전은 세포가 증식함에 따라 세포를 고밀도로 배양하고 배지 및 영양물의 신선도를 조정하도록 하여 계대 및 디쉬/컨테이너 대체를 위한 필요성을 감소시키거나 제거한다.
일부 구현예에 따라, 상이한 높이 및 이들의 상응하는 밸브와 함께 다수의 상이한 유체 유출구 포트 중 적어도 일부는 또한 유체 유입구 포트로서 구성된다. 일부 구현예에서, 다수의 상이한 유체 유출구/유입구 포트는 생물반응기로부터 세포 또는 미생물의 일부를 순환시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, 세포 또는 미생물은 세포를 프로세싱하기 위해 생물반응기의 상부 챔버로부터 순환될 수 있고 여기서, 상기 프로세싱된 세포는 이어서 생물반응기로 다시 재순환된다 (나타내지 않음). 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어, 특이적 세포 유형을 고갈시키거나 집적시킴에 의해 또는 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 이전에 발현되지 않은 폴리펩타이드 또는 단편을 발현시키거나 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 발현을 증가시키거나 감소시키기 위해 유전학적으로 변형시킴에 의해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로세싱은 세포가 특이적 유전자 또는 유전자 변이체의 발현을 증가시키거나 감소시키도록 유도함을 포함한다. 유전학적 변형 및 유전자 발현 제어 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 형질전환 (유전학적으로 변형된)될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 폴리펩타이드 발현이 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 변형되도록 프로세싱될 수 있다. 관련 구현예에서, 유출구/유입구 유체 포트 및 이들의 상응하는 밸브는 세포 매쓰 현재 수준 (높이)에 따라 세포 매쓰를 순환하도록 선택된다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (110)의 절두원추 형태가 세포 매쓰 (3)를 약하게 부유시키고 세포 매쓰 (3)의 대부분이 제2 챔버 (114B) 내 함유된 성장 배지 (2)의 한정된 영역 내 현탁된 상태로 유지되도록 하여 천공된 장벽 (112)의 상부 표면 (112A) 상에 세포 축적 (및/또는 여기로의 부착)을 회피할 뿐만 아니라 성장 배지 (2)의 재순환을 위해 사용되는 유체 유출구 포트를 통한 유출에 에 의한 세포 손실을 감소시키기 위해 생물반응기 (110)의 길이를 따라 유체 속도 구배의 확립을 가능하게 하는 것으로 주지된다.
일부 구현예에 따라, 상기 제공된 생물반응기는 세포 (또는 미생물) 성장 매쓰가 배지의 상향 유동 (중력 방향에 반대로) 및 압력 평형 (매쓰 중력 대 상향 액체 유동)으로 인해 보다 큰 표면으로 부유하고 상승하도록 구성된 역위된 절두원추 형태를 갖는 용기 또는 적어도 상부 챔버를 포함한다. 추가로, 일정한 용적-유동으로 인해, 배지의 보다 느린 유동은 역위된 절두원추 형태의 상부 및 보다 큰 면적에서 세포 (또는 미생물) 매쓰를 관통하고, 이는 세포 매쓰의 농축에 일조하고 배지의 유동에 의해 적용된 전단력을 감소시킨다.
도 1의 생물반응기 (10)에서와 같이, 용기 벽 (110A)은 도 2의 부분 종축 횡단면에서 알 수 있는 바와 같이, 생물반응기 (110)의 종축 (135)에 대해 일정 각도에서 비스듬하게 되어 있음을 주지한다. 일부 구현예에 따라, 용기 벽 (110A)이 종축 (135)에 대해 비스듬하게 구성되는 각도는 0 내지 175도 범위로 있을 수 있다. 그러나, 보다 크거나 보다 낮은 비스틈한 각도는 또한 특히 특정 적용에 의존하여 사용될 수 있다. 본원의 생물반응기의 모든 벽은 비스듬할 필요는 없고 벽의 단지 일부만이 생물반응기의 특정 형태 (예를 들어, 이후 본원에서 도 41의 생물반응기를 참조한다)에 의존하여 비스듬하도록 구성된다. 따라서, 점선 A로 나타낸 수준에서 취해진 생물반응기의 횡단면의 면적은 수준 D에서 취한 횡단면의 면적 보다 크다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (110)의 횡단면적은 제2 챔버 (114B) 내에서 종축 (135)을 따라 상향으로 이동함에 따라 보다 커져서 성장 배지 (2) 내 유체 속도 구배의 확립을 유도하여 성장 배지 (2)의 유체 속도는 상부 부분 (110C)을 향하여 표면 (112A)으로부터 상향 방향으로 이동함에 따라 점진적으로 감소한다.
상기 유체 속도 구배는 세포 또는 미생물 대부분을 제2 챔버 (114B)의 성장 배지 (2) 내 특정 구역 또는 영역에서 현탁시키는데 일조하고, 여기서, 세포 (3) (또는 미생물)에 대해 하향 작용하는 중력은 생물반응기 (10)에 대해 상기 본원에서 상세히 기재된 바와 같이 상향 유동 성장 배지 (2)에 의해 세포에 대해 작용하는 평균 상향 지시된 힘과 균형을 이룬다. 따라서, 생물반응기 (110)에서, 성장 배지 (2)의 유동 속도의 제어 (펌프 유동 속도를 제어함에 의해)와 함께 제2 챔버 (114B) 내 성장 배지 (2)의 수준 (또는 높이)의 제어는 유리하게 세포 대부분이 제2 챔버 (2)에 현탁되어 있는 구역 또는 영역의 보다 미세한 제어를 가능하게 할 수 있다. 추가로, 유동 속도 제어는 세포에 도입된 전단력을 최소화하고 세포 증식 및 밀도와 상호관련하여 배지를 최적화하고 신선하게 하여 세포 고밀도 배양을 유도할 수 있는 능력을 유지시킨다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (110)의 천공된 장벽 (112)은 편평한 (평면) 장벽이다. 일부 구현예에 따라, 수확 포트 (127)는 생물반응기 (110)로부터 세포의 수확을 위해 사용되도록 구성된다. 일부 구현예에 따라, 수확 포트 (127)는 제1 중공 부분 (127A) 및 제2 중공 부분 (127B)을 포함하는 중공 구성원 또는 튜브와 같은 형태이다. 부분 (127A)은 천공된 장벽 (112)에 밀폐적으로 부착되고 (일부 구현예에서 천공된 장벽 (112)의 중심에) 천공된 장벽의 상부 표면 (112A)에서 제2 챔버 (114B)로 개방하는 개방구 (127C)를 갖는다.
제2 중공 부분 (127B)은 제1 중공 구성원 (127A)과 연속되어 있고 거기에서 특정 각도로 굽어서 이는 제1 챔버 (114A)의 용기 벽 (110A)을 통과하고 용기 벽 (110A)에 밀폐적으로 부착되어 있다. 제2 부분 (127B)은 용기 벽 (110A)을 이탈하여 생물반응기 (110) 외부로 연장한다. 제2 부분 (127B)은 생물반응기 (110) 외부로 연장하는 제2 부분 (127B)의 일부 내에 배치된 밸브 (또는 마개) (123)를 포함한다. 생물반응기로부터 세포 (3)를 수확하고자 하는 경우, 이것은 제2 챔버 (114B) 내 성장 배지 (2)의 수준을 감소시켜 세포를 농축시킴에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, 성장 배지 (2)의 수준은 선 D에 의해 나타낸 수준으로 되거나 대안적으로 생물반응기 (110)의 바닥 부분 (110B)에 배치된 적합한 유출구 포트 (예를 들어, 도 1에 도해된 유출구 포트 (27) 또는 포트 (126A-126D)와 유사한 유출구 포트) (도 2에 나타내지 않음)를 통해 제1 챔버로부터 추가의 성장 배지를 인출함에 의해 선 D 보다 낮은 수준으로 될 수 있다. 세포 (3)가 농축된 후, 성장 배지 (2)에서 세포 (3)의 현탁액은 밸브 (123)를 개방시키고 적당한 수거 용기 (나타내지 않음)에서 현탁액을 수용함에 의해 수확 포트 (127)를 통해 수확될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 밸브 (126A), (126B), (126C), (126D), (39) 및 (123)는 수동 밸브 (또는 마개)일 수 있지만, 생물반응기 (110)의 일부 구현예에 따라, 도 1의 밸브 (24), (23), (25) 및 (39)와 관련하여 상기 상세히 기재된 바와 같이 제어 가능하게 및/또는 자동적으로 작동될 수 있다. 예를 들어, 임의의 밸브 (126A), (126B), (126C), (126D), (39) 및 (123)는 생물반응기 시스템 (150)의 제어기 (30)에 의해 개방되고 폐쇄되도록 구성될 수 있는 전기적으로 작동될 수 있는 솔레노이드 밸브이도록 구성된다 (밸브가 실제로 솔레노이드 기반 밸브로서 수행되는 경우. 임의의 밸브 (126A), (126B), (126C), (126D), (39) 및 (123)를 제어기 (30)에 연결하는 임의의 선은 도해를 명료하게 하기 위해 도 2에 나타내지 않는 것으로 주지된다. 그러나, 상기 도식적 선은 이후 도 5에 보다 상세하게 나타낸다). 일부 구현예에 따라, 제어기 (20)는 도 1의 센서 유닛 (22)에 대해 상기 본원에서 상세히 기재된 바와 같이 성장 배지 (2)의 임의의 화학적 및/또는 물리적 성질을 감지하기 위한 임의의 수의 센서를 포함하도록 구성되는 와이어 (22B)를 센서 유닛 (122)에 연결함을 통해 적합게 연결되도록 구성된다. 센서 유닛 (22)의 말단 (22A)의 위치는 고정될 수 있지만, 생물반응기 (10)의 제2 챔버 (14B)에서 성장 배지 (2)의 수준은 관류 동안에 상당히 변화하지 않기 때문에, 센서 유닛 (122)은 센서 유닛 (22) 보다 상당히 길도록 구성되고, 센서 유닛 (122)의 말단 (122A)의 위치가 필요한 경우, 제2 챔버 (114B) 내 성장 배지 (2)의 표면의 수준에서 임의의 변화를 수용하기 위해 변화될 수 있는 방식으로 수행되도록 구성되는 것으로 주지된다.
예를 들어, 센서 유닛 (122) 길이의 상당 부분은 나사로 연결될 수 있고, 센서 유닛 (122)이 피팅되는 개방구 (110F)는 또한 내부적으로 나사로 연결되어 필요시 센서 (122)를 내부 또는 외부로 적합하게 나사못으로 조임에 의해 제2 챔버 내 말단 (122A)의 위치를 변화시킬 수 있다. 대안적으로, 센서 유닛 (122)의 표면은 부드러울 수 있고 센서 (122)의 말단 (122A)의 위치는 개방구 (110F)와 센서 유닛 (122) 사이에 밀폐적으로 배치된 적합한 개스킷 (도 2에 나타내지 않음) 내에서 센서 유닛 (122)을 밀폐적으로 밀고 당김에 의해 다양해질 수 있다.
일부 구현예에 따라, 시스템 (150)의 산소화 시스템 (160)은 생물반응기 (110), 및 제1 챔버 (114A) 내 (임의로) 배치된 가스 분배 헤드 (160)에 산소 가스를 공급하기 위한 산소 공급원 (160A)을 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에 따라, 산소 공급원 (160A)은 예를 들어, 적합한 중공 유연성 튜빙과 같은 생물반응기 (110)의 벽 (110A)을 통해 밀폐적으로 통과하는 적합한 중공 구성원 (160C)에 의해 가스 밸브 (160D)를 통해 가스 분배 헤드로 연결되도록 구성된다. 대안적으로, 일부 구현예에 따라, 산소 공급원 (160A)은 가스 분배 헤드가 적합하게 부착될 수 있는 벽 (110A)의 통합 부분으로서 형성되는 고정된 유입구로 적합한 가스 밸브 (160D)를 통해 적합하게 연결되도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 가스 밸브 (160D)는 작동자에 의해 수동으로 개방되거나 폐쇄되는 수동으로 작동되는 밸브이도록 구성된다. 그러나, 일부 구현예에서, 가스 밸브 (160D)는 제어기 (30)로부터 적합한 전기 명령 신호를 수용함에 의해 적합하게 개방되거나 폐쇄될 수 있는 액추에이터 제어된 밸브이도록 구성될 수 있다(제어기 (30)를 가스 밸브 (160D)와 연결하는 임의의 명령 선은 도해를 명료하게 하기 위해 도 2에 나타내지 않는다. 일부 구현예에 따라, 산소 공급원 (160A)은 당업계에 공지된 바와 같이 압축된 산소 탱크일 수 있지만 대안적으로 이에 제한되지 않지만 당업계에 공지된 전기용해 산소 발생기 또는 가스 산소의 임의의 다른 공급원과 같은 당업계에 공지된 임의의 유형의 산소 발생기일 수 있다. 대안적으로, 산소 공급원은 상당량의 산소를 함유하는 임의의 가스 혼합물 (예를 들어, 공기, 산소 및 질소의 혼합물, 산소, 질소 및 이산화탄소의 혼합물, 또는 당업계에 공지된 바와 같이 성장 배지의 산호화 목적을 위해 적합한 가스의 임의의 다른 적합한 혼합물과 같은)의 공급원일 수 있다. 일부 다른 구현예에 따라, 액체 배지의 산소화는 액체의 저장소 (20)에서 제공된다.
가스 밸브 (160D)가 개방된 경우, 산소 공급원 (160A)으로부터 산소 가스는 가스 분배 헤드 (160B)를 통해 통과하고 제1 챔버 (114A) 내에서 상승하는 작은 산소 함유 버블 형태로 분배된다. 가스 분배 헤드 (160B)는 그 안에 천공을 포함하고 작은 버블 형태로 액체 (예를 들어, 성장 배지 (2)와 같은)를 통해 통과하는 가스를 분배할 수 있는 임의의 유형의 헤드일 수 있다. 예를 들어, 가스 분배 헤드 (160B)는 천공된 세라믹 재료의 블록, 천공된 스테인레스강의 블록, 천공된 티타늄의 블록, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 유형의 멸균가능한 분배 헤드일 수 있다 (상기 가스 분배 헤드는 구성 및 작동에서 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 물을 산소화시키기 위해 사용되는 가스 분배 헤드와 유사할 수 있다).
도 2에 도해된 산소화 시스템 (160)은 생물반응기 (110)의 제1 (하부) 챔버 (114A) 내 성장 배지에 산소를 직접 공급하지만, 이것은 어떠한 방식으로든 본원에 기재된 생물반응기 또는 생물반응기 시스템을 실행하기 위해 절대 필요한 것은 아닌 것으로 주지된다. 예를 들어, 산소화 시스템 (160)은 산소를 예를 들어, 제2 챔버 (114B)로 또는 매니폴드 (128)로 또는 유체 저장소 (20)로와 같은 생물반응기 시스템 (150)의 다른 상이한 부분으로 제공할 수 있거나 산소를 생물반응기 시스템 (150)의 하나 초과의 부분 (예를 들어, 제2 챔버 (114A) 및 유체 저장소 (20) 둘 다와 같은)으로 산소를 제공할 수 있다.
대안적으로, 상기 배지 내 산소 수준은 확산에 의해 산화를 허용하는 생물반응기 상부 (110C)와 배지 (D) 간의 헤드공간 내 산소 수준을 제어함에 의해 제어될 수 있다. 이것은 산소 분배 헤드 (160B)를 상기 시스템의 목적하는 부분에 위치시키거나 산소 공급원 (160A)에 연겨되고 상기 부분에 배치된 임의의 성장 배지를 산소화시키기 위한 생물반응기 시스템 (150)의 임의의 선택된 부분에 배치된 모든 적합한 여러 산소 분배 헤드를 제공함에 의해 수행될 수 있다. 모든 상기 대안적 산소 공급 방법은 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 및/또는 생물반응기 시스템의 일부 구현예에 사용하기 위해 고려된다.
추가로, 센서, 예를 들어, 용존 산소 센서는 생물반응기 (상기 언급된 바와 같이)의 유입구 및 유출구에 위치될 수 있기 때문에, 성장 배지 내 용존 산소 농도의 모니터링은 임의의 시점 또는 공정 단계에서 (연속적으로 또는 프리세트 및/또는 프로그램가능하고/하거나 프로그램된 시간 간격으로) 가능한 것으로 주지된다. 따라서, 성장 배지에서 용존 산소의 목적하는 수준을 유지하기 위한 분배 헤드 (160B) (또는 시스템 (150) 1개 초과의 항기 헤드가 있는 경우의 헤드)를 통한 산소 (또는 산소 함유 가스 혼합물)의 가스 유동의 속도를 자동적으로 조절함에 의해 생물반응기 (110) 내 성장 배지 (2)의 산소화를 자동화시킬 수 있다. 일부 구현예에 따라, 생물반응기 용기에서 배지 산소 수준의 증가는 저장소에서 배지의 산소 수준을 증가시킴에 의해 그리고 제1 챔버에서 배지의 관류 속도를 증가시킴에 의해 제공될 수 있다.
본원의 생물반응기의 형태는 도 1-2에 도해된 바와 같이 절두원추 형태에 제한되지 않는 것으로 주지된다. 예를 들어, 생물반응기는 특히 원뿔 형태, 절두원추 형태, 테이퍼링 형태, 원통형 형태, 다각형 프리즘 형태, 타원체 횡단면을 갖는 테이퍼링 형태, 다각형 횡단면을 갖는 테이퍼링 형태, 원통형 부분 및 테이퍼링 부분을 갖는 형태, 및 원뿔 또는 테이퍼 부분 및 반구 부분을 갖도록 구성된다. 그러나, 다른 상이한 생물반응기 형태는 또한 특히 특정 적용 및 제조 고려사항에 의존하여, 생물반응기의 일부 구현예에 따라 수행될 수 있다.
생물반응기의 여러 가능한 예시적 형태는 도식적으로 도 3 및 도 4a-4i에서 도해되어 있다. 지금 본원의 생물반응기의 또 다른 구현예에 따라, 천공된 장벽을 포함하는 원통형 형태를 갖는 생물반응기 시스템을 도해하는 도식적 부분 횡단 다이아그램인 도 3을 참조한다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 시스템 (250)은 생물반응기 (210), 상기 상세히 기재된 바와 같은 제어기 (30), 상기 상세히 기재된 바와 같은 펌프 (4) 및 상기 상세히 기재된 바와 같은 유체 저장소 (20)를 포함한다. 일부 구현예에 따라, 생물반응기 시스템 (250)은 또한 상기 본원에서 상세히 기재된 바와 같은 산소화 시스템 (160)을 포함한다. 생물반응기 (210)는 생물반응기 (10) 및 (110)에 대해 상기 상세히 기재된 임의의 재료로부터 만들어질 수 있다. 생물반응기 (210)는 용기 벽 (210A), 바닥 부분 (210B) 및 생물반응기 상부 부분 (21OC)을 갖는다. 상부 부분 (210C)은 거기에 개방구 (210G)를 가질 수 있고 자가-밀봉 개스킷 (211)은 개방구를 밀폐시키기 위해 개방구 내 배치될 수 있다. 자가-밀봉 개스킷 (211)은 성장 배지 내 세포 또는 미생물의 현탁액, 또는 임의의 물질 또는 첨가제를 함유하는 임의의 다른 유체 또는 용액을 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같은 생물반응기 (210)에 도입하기 위해 니들 (도 3에 나타내지 않음)에 의해 밀봉적으로 침투될 수 있다.
세포 또는 미생물은 또한 생물반응기의 벽 또는 상부에 배치된 임의의 적합한 일방향 밸브 (도 3에 나타내지 않음)를 통해 생물반응기의 제2 챔버로 도입되어 상기 일방향 밸브는 생물반응기의 멸균성을 손상시키는 것 없이 생물반응기의 제2 챔버를 통해서 및 제2 챔버로 세포 현탁액 또는 미생물 현탁액의 주사를 가능하게 하는 것으로 주지된다.
생물반응기의 하나의 구현예에 따라, 일방향 밸브는 세포 또는 미생물 현탁액을 함유하는 표준 시린지의 말단을 수용하는 형태를 가질 수 있는 밸브와 같은 루어-락 (luer-lock)일 수 있다. 상기 일방향 밸브의 사용은 밸브의 오리피스가 현탁액이 생물반응기로 주사되는 경우 세포에 영향을 주는 전단력을 감소시키기에 충분히 크게 만들어질 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 본원의 임의의 생물반응기는 상기 개방구(들), 자가-밀봉 개스킷(들) 및 일방향 밸브(들)의 임의의 조합을 갖도록 구성됨을 주지한다.
일부 구현예에 따라, 용기 벽 (210A)은 나삿니가 있는 센서 유닛 (222)을 통해 거기에 밀봉적으로 삽입하기 위해 개방구 (210F)를 갖도록 구성된다. 센서 유닛 (222)은 도 2에서 센서 유닛 (122)에 관하여 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같은 성장 배지 (2)의 임의의 목적하는 화학적 또는 물리적 성질을 감지하기 위해 센서 유닛 (222)에 부착되거나 포함되는 임의의 수의 센서 (도해를 명료하게 하기 위해 도 3에 개별적으로 나타내지 않음)을 포함하도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 천공된 장벽 (212)은 생물반응기 (210)의 용기 벽 (210A)에 밀봉적으로 부착되어 도 1의 생물반응기 시스템 (50)의 생물반응기 (10) 및 천공된 장벽 (12)에 대해 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이 천공된 장벽 (212)이 생물반응기 (210)의 내부 용적을 제1 (하부) 챔버 (214A) 및 제2 (상부) 챔버 (214B)로 나눈다. 천공된 장벽 (212)은 유사한 재료(들)로부터 제조될 수 있고 도 1의 천공된 장벽, 예를 들어 (12)에 대해 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이 유사한 천공 평균 크기를 가질 수 있다. 그러나, 생물반응기 (10) (도 1의)는 제2 챔버 (14B) 내 단일 유체 유출구 포트 (26)를 갖고, 생물반응기 (210)는 제2 챔버 (214B)에 여러 상이한 유체 유출구 포트 (나타내지 않음)를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 유출구 포트는 개별 유출구 및 밸브 (나타내지 않음)를 포함한다.
일부 구현예에 따라, 밸브는 펌프 (4)에 유체적으로 연결된 통상의 유체 매니폴드 (280A)에 유체적으로 연결된다. 도 2에 도해된 바와 같은 상이한 위치에서 4개 밸브의 정렬은 성장 배지 (2)의 수준이 4개의 상이한 수준으로부터 선택되도록 한다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기의 제2 챔버로 개방하는 유출구 포트 (및 여기에 부착된 상응하는 밸브)의 수는 다양할 수 있고 (유출구 포트의 수는 4개 미만 또는 초과일 수 있고, 요구되는 밸브의 수를 수용하기 위해 매트폴드 (280)가 적합하게 변형된다) 이러한 방식으로 임의의 요구되는 실제 수의 성장 배지 (2) 수준이 상기 상세히 기재된 바와 같이 밸브의 적합한 개방 및 폐쇄에 의해 생물반응기의 제2 챔버에 성취되도록 한다
일부 구현예에 따라, 시스템 (250)의 산소화 시스템 (160)은 생물반응기 (110), 및 제1 챔버 (214A) 내 (임의로) 배치된 가스 분배 헤드 (160)에 산소 가스를 공급하기 위한 산소 공급원 (160A)을 포함한다. 산소 공급원 (160A)은 예를 들어, 중공 유연성 튜빙과 같은 생물반응기 (110)의 벽 (210A)을 통해 밀폐적으로 통과하는 적합한 중공 구성원 (160C)에 의해 가스 밸브 (160D)를 통해 가스 분배 헤드에 연결되도록 구성된다. 대안적으로, 산소 공급원 (160A)은 가스 분배 헤드가 적합하게 부착될 수 있는 벽 (210A)의 통합 부분으로서 형성되는 고정된 유입구로 적합한 가스 밸브 (160D)를 통해 적합하게 연결되도록 구성된다. 추가로, 산소의 농도는 또한 상부 (210C)와 액체 수준 D 사이의 헤드 공간에 산소 농도를 제어하여 확산을 통해 성장 배지 (2)의 산소화를 허용함에 의해 제어될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 pH는 조정될 수 있다. 예를 들어, CO2 농도를 제어하는 것에 제한되지 않지만 pH는 확산을 통해 헤드공간에서 CO2 농도를 제어함에 의해 제어될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 가스 밸브 (160D)는 작동자에 의해 수동으로 개방되거나 폐쇄되는 수동으로 작동되는 밸브이도록 구성된다. 그러나, 일부 구현예에서, 가스 밸브 (160D)는 제어기 (30)로부터 적합한 전기 명령 신호를 수용함에 의해 적합하게 개방되거나 폐쇄될 수 있는 액추에이터 제어된 밸브이도록 구성된다 (제어기 (30)를 가스 밸브 (160D)와 연결하는 임의의 명령 선은 도해를 명료하게 하기 위해 도 3에 나타내지 않는다. 일부 구현예에 따라, 산소 공급원 (160A)은 당업계에 공지된 바와 같이 압축된 산소 탱크일 수 있지만 대안적으로 이에 제한되지 않지만 당업계에 공지된 전기용해 산소 발생기 또는 가스 산소의 임의의 다른 공급원과 같은 당업계에 공지된 임의의 유형의 산소 발생기일 수 있다.
대안적으로, 산소 공급원은 상당량의 산소를 함유하는 임의의 가스 혼합물(예를 들어, 공기, 산소 및 질소의 혼합물, 산소, 질소 및 이산화탄소의 혼합물, 또는 당업계에 공지된 바와 같이 성장 배지의 산호화 목적을 위해 적합한 가스의 임의의 다른 적합한 혼합물과 같은)의 공급원일 수 있다. 가스 밸브 (160D)가 개방된 경우, 산소 공급원 (160A)으로부터 산소 가스는 가스 분배 헤드 (160B)를 통해 통과하고 제1 챔버 (214A) 내에서 상승하는 작은 산소 함유 버블 형태로 분배된다. 가스 분배 헤드 (160B)는 그 안에 천공을 포함하고 작은 버블 형태로 액체 (예를 들어, 성장 배지 (2)와 같은)를 통해 통과하는 가스를 분배할 수 있는 임의의 유형의 헤드일 수 있다.
예를 들어, 가스 분배 헤드 (160B)는 천공된 세라믹 재료의 블록, 천공된 스테인레스강의 블록, 천공된 티타늄의 블록, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 유형의 멸균가능한 분배 헤드일 수 있다 (상기 가스 분배 헤드는 구성 및 작동에서 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 물을 산소화시키기 위해 사용되는 가스 분배 헤드와 유사할 수 있다).
지금 본원의 생물반응기의 여러 구현예에 따라 천공된 장벽을 포함하는 생물반응기의 여러 예시적 형태를 도해하는 도식적 횡단 다이아그램인 도 4a-4i를 참조한다. 도해를 명료하게 하기 위해, 도 4a-4i의 개략적인 도면은 생물반응기 및 거기에 포함되는 천공된 장벽의 벽의 일반적인 형태만을 도해하고, 생물반응기의 형태를 이해하는데 중요하지 않은 생물반응기 또는 생물반응기 시스템의 임의의 추가의 성분들의 임의의 세부 사항 (예를 들어, 생물반응기의 벽 내 다양한 개구부, 센서 유닛, 유체 유입구 포트, 유체 유출구 포트, 인출 포트, 수확 포트, 가열 유닛, 냉각/가열 유닛, 유체 임펠러, 가스 분배 헤드, 밸브, 펌프, 제어기, 자가-밀봉가능한 개스킷, 유체 매니폴드 또는 임의의 다른 성분들과 같은)을 보여주지 않음을 주지한다. 도 4a-4i에 나타내지 않는 임의의 상기 성분들은 본원에서 상세히 기재된 바와 같고 도면에 도해된 바와 같이, 도 4a-4i에 도식적으로 도해된 임의의 생물반응기에서 임의의 비-상호적으로 배제된 조합 및/또는 순열로 포함될 수 있음은 당업자가 이해할 것이다.
도 4a-4i에 도해된 천공된 장벽은 편평한 고정된 천공된 장벽으로서 도해되지만 이것은 단지 예시로서 나타낸 것임을 추가로 주지하고 도 4a-4i에 기재된 바와 같은 형태를 갖는 임의의 생물반응기는 또한 본원에 기재된 임의의 유형의 천공된 장벽 (임의의 편평하거나 편평하지 않은 고정되고 이동 가능한 천공된 장벽, 버클링 천공된 장벽 및 본원에 기재된 모든 다른 천공된 장벽 형태를 포함하는)으로서 수행될 수 있는 것으로 고려된다.
도 4a를 다시 참조하여, 생물반응기 (300)는 생물반응기 (300)를 생물반응기 (300)의 원통형 부분의 형태를 갖는 제1 챔버 (30A)와 생물반응기 (300)의 절두원추 부분의 형태를 갖는 제2 챔버 (304B)로 나누는 상기된 바와 같은 천공된 장벽 (12)을 포함한다. 따라서, 생물반응기 (300)는 원통형 부분과 절두원추 부분을 갖는 형태를 갖는다.
도 4b를 다시 참조하여, 생물반응기 (310)는 생물반응기 (310)를 생물반응기 (300)의 원통형 부분의 형태를 갖는 제1 챔버 (314A)와 생물반응기 (300)의 테이퍼 부분의 형태를 갖는 제2 챔버 (314B)로 나누는 상기된 바와 같은 천공된 장벽 (12)을 포함한다. 따라서, 생물반응기 (300)는 원통형 부분과 절두원추 부분을 갖는 형태를 갖는다. 제2 챔버 (314B)의 테이퍼링 벽 (308)은 볼록한 외부 표면 (308A)을 갖는다.
도 4c를 다시 참조하여, 생물반응기 (320)는 생물반응기 (320)를 생물반응기 (320)의 원통형 부분의 형태를 갖는 제1 챔버 (324A)와 생물반응기 (320)의 테이퍼 부분의 형태를 갖는 제2 챔버 (324B)로 나누는 상기된 바와 같은 천공된 장벽 (12)을 포함한다. 생물반응기 (320)는 원통형 부분과 테이퍼 부분을 갖는 형태를 갖는다. 제2 챔버 (324B)의 테이퍼링 벽 (328)은 볼록한 외부 표면 (328A)을 갖는다.
도 4d를 다시 참조하여, 생물반응기 (330)는 생물반응기 (330)를 생물반응기 (330)의 테이퍼 부분의 형태를 갖는 제1 챔버 (334A)와 생물반응기 (330)의 테이퍼 부분의 형태를 갖는 제2 챔버 (334B)로 나누는 상기된 바와 같은 천공된 장벽 (12)을 포함한다. 생물반응기 (330)는 테이퍼링 형태를 갖는다. 생물반응기 (330)의 테이퍼링 벽 (338)은 볼록한 외부 표면 (338A)을 갖는다.
도 4e를 다시 참조하여, 생물반응기 (340)는 생물반응기 (340)를 생물반응기 (340)의 테이퍼 부분의 형태를 갖는 제1 챔버 (344A)와 생물반응기 (300)의 테이퍼 부분의 형태를 갖는 제2 챔버 (344B)로 나누는 상기된 바와 같은 천공된 장벽 (12)을 포함한다. 생물반응기 (340)는 테이퍼링 형태를 갖는다. 생물반응기 (340)의 테이퍼링 벽 (348)은 볼록한 외부 표면 (348A)을 갖는다.
도 4f를 다시 참조하여, 생물반응기 (350)는 생물반응기 (350)를 생물반응기 (350)의 원뿔 부분의 형태를 갖는 제1 챔버 (354A)와 생물반응기 (300)의 절두원추 부분의 형태를 갖는 제2 챔버 (354B)로 나누는 상기된 바와 같은 천공된 장벽 (12)을 포함한다. 생물반응기 (350)는 원뿔 형태를 갖는다.
도 4g를 다시 참조하여, 생물반응기 (360)는 생물반응기 (360)를 생물반응기 (360)의 원통형 부분의 형태를 갖는 제1 챔버 (364A)와 생물반응기 (360)의 원통형 부분의 형태를 갖는 제2 챔버 (364B)로 나누는 상기된 바와 같은 천공된 장벽 (12)을 포함한다. 생물반응기 (360)는 원통형 형태를 갖는다.
도 4h를 다시 참조하여, 생물반응기 (370)는 생물반응기 (370)를 생물반응기 (370)의 반구 부분의 형태를 갖는 제1 챔버 (374A)와 생물반응기 (370)의 절두원추 부분의 형태를 갖는 제2 챔버 (374B)로 나누는 상기된 바와 같은 천공된 장벽 (12)을 포함한다. 생물반응기 (370)는 성배와 유사한 형태를 갖는다.
도 4i를 다시 참조하여, 생물반응기 (380)는 생물반응기 (380)를 제1 챔버 (384A)와 제2 챔버 (384B)로 나누는 상기된 바와 같은 천공된 장벽 (12)을 포함한다. 생물반응기 (380)는 생물반응기 (380)의 바닥 부분 (380B)에 직각인 수직 벽 부분 (380H) (벽 부분 (380H)은 바닥 부분 (380B)과 90도의 각도를 형성한다) 및 벽 부분 (380H)에 상대적인 각도에서 경사진 비스드한 벽 부분 (380E) (점선 (385)은 수직 벽 부분 (380H)과 평행이다)을 포함한다. 전형적으로 각도 α1 <90°이고 일부 구현예에서 그러나 절대적으로 α1 <45°는 아니다.
지금부터 도 4i의 생물반응기 (380)의 상면도인 도 4j를 참조한다. 생물반응기 (380)의 상부 부분 (380C)은 이것이 반원형 부분 (380E), 2개의 직선 부분 (380F) 및 (380G) 및 직선 부분 (380H)을 갖도록 하는 형태이다. 생물반응기 (380)의 바닥 부분 (380B) (도 4j에서 점선 (380B)에 의해 도식적으로 도해되는)은 상부 부분의 형태 또는 윤곽과 유사한 형태 또는 윤곽을 가질 수 있지만 벽 부분 (380E)의 경사로 인해 상부 부분 (380C)의 횡단 면적 보다 작은 횡단 면적을 갖는다.
생물반응기 (380)의 상부 부분 (380C)의 형태는 도 4j와 관련하여 상기된 바와 같고, 이것은 절대적인 것은 아니고 상부 부분 (380C)과 바닥 부분 (380B)의 다른 상이한 형태는 비스듬한 벽 일부 또는 부분을 갖는 생물반응기의 일부 구현예에 사용될 수 있음을 주지한다. 비스듬한 벽 일부 및 비스듬하지 않는 벽 일부를 갖는 생물반응기의 일부 구현예에서, 생물반응기의 상부 및/또는 하부 부분은 반-타원 형태, 반원 형태, 직사각 형태, 정사각 형태, 사다리꼴 형태, 다각 형태 또는 임의의 다른 적합한 규칙적 또는 비규칙적 형태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다른 목적하는 형태를 가질 수 있다.
상기 기재된 생물반응기의 여러 구현예에서, 생물반응기의 횡단면은 환형일 수 있고, 본원의 생물반응기의 다른 구현예에서, 생물반응기의 횡단면은 타원 형태, 다각 형태, 규칙적 다각 형태 또는 임의의 다른 적합한 형태를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 형태를 가질 수 있음을 주지한다.
추가로, 본원에 기재된 생물반응기의 일부에서, 생물반응기의 종축을따라 상이한 위치에서 취해진 상이한 횡단면은 상이한 형태를 가질 수 있음을 주지한다. 예를 들어, 도 4c로 다시 참조하면, 선 I-I 및 II-II (이 둘 다는 종축 (335)에 직각이다)을 따라 취해진 횡단면은 둘 다 형태에서 환형일 수 있고, 생물반응기의 또 다른 구현예에 따라, 선 I-I를 따라 취해진 횡단면은 형태에서 환형일 수 있고 선 II-II를 따라 취해진 횡단면은 형태에서 타원일 수 있다.
추가로, 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 생물반응기의 형태는 원뿔 형태, 절두원추 형태, 테이퍼링 형태, 원통형 형태, 다각형 프리즘 형태, 타원 횡단면을 갖는 테이퍼링 형태, 다각형 횡단면을 갖는 테이퍼링 형태, 원통형 부분 및 테이퍼링 부분을 갖는 형태 및 원뿔형 또는 테이퍼 부분 및 반구형 부분을 갖는 형태일 수 있다.
지금 본원에 기재된 생물반응기 시스템의 일부 구현예에 따라, 생물반응기 시스템의 성분들을 도해하는 개략적 블록 다이아그램인 도 5를 참조한다. 생물반응기 시스템 (400)은 생물반응기 (410), 펌프 (404)를 포함하고, 생물반응기 시스템은 또한 N+1 제어 가능한 밸브 424A-424N (여기서, N은 정수이다) 및 또 다른 제어 가능한 밸브 (439)를 포함할 수 있다. 생물반응기 시스템은 또한 (임의의) 제어기 (430), (임의의) 유체 저장소 (420), (임의의) 유체 임펠러 (418), (임의의) 산소화 시스템 (460) 및 (임의의) 가열기/냉각기 유닛 (470)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 생물반응기 시스템은 제어기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기 시스템은 추가로 유체 저장물을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기 시스템은 추가로 유체 임펠러를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기 시스템은 추가로 산소화 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기 시스템은 추가로 가열기 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 액체 배지 상에서의 가열은 가열 재킷 또는 임의의 제공된 생물반응기 주변 환경 (나타내지 않음)을 통해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 생물반응기 시스템은 추가로 냉각기 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기 시스템은 추가로 가열기 유닛 및 냉각기 유닛을 포함한다. 일부 구현예에 따라, 액체의 온도는 액체의 저장소에서 제어될 수 있다 (목적하는 온도로 가열되고/냉각됨).
일부 구현예에서, 생물반응기 시스템은 유출구 밸브 (426)로의 제어 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기 시스템은 펌프를 위한 제어 신호 (439A)를 포함한다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (410)는 제1 (하부) 챔버 및 제2 (상부) 챔버 (상기 제1 및 제2 챔버는 도 5의 개략적 블록 다이아그램에서 상세하게 나타내지 않았지만 예를 들어, 도 2에 도해된 바와 같이 알 수 있다)를 포함하는 다수의 유체 유출구 포트 (본원에 기재되고 도면에 도해된 바와 같이)를 갖는 임의의 생물반응기일 수 있다. 제2 챔버 (명료하게 하기 위해 도 5의 개략적인 다이아그램에 나타내지 않음)로의 두사의 유체 유출구 포트 각각은 각각의 N 밸브 424A-424N의 하나를 통해 유체 매니폴드 (428)에 유체적으로 연결될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 유체 매니폴드 (428)는 생물반응기 (410)의 제1 챔버로 개방하는 유체 유입구 포트 (448)를 통해 생물반응기 (410)의 제1 챔버로 성장 배지를 다시 펌핑하도록 구성된 펌프 (404)로, 생물반응기 (410)의 제2 챔버로부터 수거된 성장 배지를 공급하도록 구성된다. 유체 입구 포트 (448)는 도 2와 관련하여 상기 본원에서 상세히 기재된 바와 같이 성장 배지를 (임의의) 유체 임펠러(418)로 (임의로) 공급하도록 구성된다. 센서 유닛 (422)은 임의의 센서 유닛 (22), (122) 및 (222) (각각 도 1, 2 및 3의)과 관련하여 상기 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 유체 저장소 (420)는 상기 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 (410) 외부의 유체 저장소일 수 있고 밸브 (439)를 통해 펌프 (404)로 유체적으로 및 제어 가능하게 커플링되도록 구성된다. N 밸브 404A-404N 각각은 임의의 밸브 424A-424N을 개방시키거나 폐쇄시키기 위한 제어기로부터 제어 신호를 수용하기 위해 각각의 통신선 (429A-429N)에 의해 제어기 (430)에 적합하게 연결된다. 밸브 (439)는 밸브 (39) (도 1의)에 대해 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이 성장 배지가 저장소 (420)로부터 펌프 (404)로 및 거기로부터 생물반응기 (410)로 유동하도록 하기 위해 밸브 (439)를 개방하거나 폐쇄시키기 위해 거기로부터 제어 신호를 수용하기 위한 적합한 통신선에 의해 제어기 (430)로 연결된다.
일부 구현예에 따라, 펌프 (404)는 펌프 (404)의 작동을 제어하기 위해 적합한 통신선에 의해 제어기 (430)로 적합하게 연결되도록 구성된다. 예를 들어, 상기 제어 신호는 펌프를 가동시키거나 중단시킬 수 있고 또한 펌프 (404)를 통한 성장 배지의 유동 속도 (또는 펌프 (404)에 의한 성장 배지의 펌핑 속도)를 제어할 수 있다.
일부 구현예에 따라, (임의의) 가열기/냉각기 (470)는 생물반응기 (410) 내에서 성장 배지를 가열하거나 냉각시켜 상기 성장 배지의 목적하는 온도를 유지하기 위해 생물반응기 (410)에 배치되도록 (일부 구현예에서, 이의 제1 챔버내) 구성된다. 임의로, 물 재킷 (나타내지 않음) 또는 블랭킷 (나타내지 않음) 또는 임의의 다른 제어된 온도 환경은 생물반응기의 온도 제어를 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 센서 유닛 (422)이 온도 센서를 포함하는 경우, 감지된 온도를 나타내는 신호는 온도 센서로부터 통신 선(들) (422A)을 통해 제어기 (430)로 전송될 수 있다. 제어기 (430)는 온도 제어 분야에 널리 공지된 바와 같이 생물반응기내 목적하는 온도, 또는 설정 온도 또는 예비설정 온도를 유지하기 위해 상기 신호를 프로세싱하여 적당한 신호를 가열기/냉각기 (470)로 전송하도록 구성된다. 센서 유닛 (422) 내 포함되는 임의의 다른 센서들은 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 생물반응기 (410) 내 성장 배지의 임의의 감지된 물리적 또는 화학적 파라미터를 나타내는 센서 신호를 통신 선(들) (422A)을 통해 (임의로) 전송하도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 제어기 (430)는 임의의 상기 센서 신호를 프로세싱하여 성장 배지의 상태를 결정하도록 구성되고 또한 상기에 상세히 기재된 바와 같이, 제어기 (430)에 포함되는 (임의의) 사용자 인터페이스 (431) 내 포함되는 (임의의) 디스플레이 유닛 (도 5에 상세히 나타내지 않음)에 의해 생물반응기 시스템 (400)의 작동자 또는 사용자에게 상태 데이터 또는 임의의 모니터링되거나 감지된 물리적 또는 화학적 파라미터를 디스플레이하기 위해 프로세싱된 것을 사용할 수 있다.
예를 들어, 센서 유닛이 생물반응기 (430) 내 성장 배지에서 용존 산소의 양을 감지하기 위해 용존 산소 센서를 포함하는 경우에, 센서 신호는 제어기 (430)에 의해 프로세싱될 수 있고 용존 산소의 농도가 목적하는 세트, 예비설정 또는 미리결정된 값과 상이한 경우, 제어기 (430)는 용존 산소 수준을 목적하는 수준으로 적합하게 조정하기 위해 생물반응기 시스템 (400)의 특정 수행에 의존하여, 생물반응기 (430) (또는 유체 저장소 (420) 내) 성장 배지로의 산소 함유 가스의 도입을 중지시키거나 개시하기 위해 산소화 시스템 (460)으로 제어 신호를 전송하도록 구성된다.
제어기 (30) (도 1의)와 관련하여 상기 상세히 기재된 바와 같이, 제어기 유닛 (430)은 생물반응기 (430)의 작동 또는 이의 작동 기능 중 적어도 일부를 자동으로 또는 반자동으로 제어하기 위해 적합한 소프트웨어에 의해 작동될 수 있는 임의의 유형의 적합한 프로세서 (디지탈 및/또는 아날로그)를 포함하도록 구성됨을 주지한다. 예를 들어, 생물반응기 (410)의 제2 챔버 내 성장 배지 수준 및 유동 속도의 결정은 사용자 인터페이스 (431)를 사용함에 의해 작동자가 수동으로 설정할 수 있고, 성장 배지 내 생물반응기의 온도 및/또는 용존 산소 농도의 조절은 제어기 (430) 상에서 적합한 소프트웨어 작동에 의해 자동으로 제어될 수 있다 유사하게, 저장소 (420)로부터 새로운 성장 배지 양의 첨가는 (404)를 중단시키고 인출 밸브 (425)를 개방하고 이어서 인출 밸브 (425)를 폐쇄시키고, 밸브 (439)를 개방하고 새로운 성장 배지가 제1 챔버로 펌핑되도록 하는 펌프 (404)를 가동시킴에 이어서 성장 배지가 생물반응기 (410)를 통한 재순환을 재개시하도록 밸브 (439)를 폐쇄시킴에 의해 인출 포트 (427)를 통한 제1 챔버로부터 성장 배지의 양을 주기적으로 인출함에 의해 완전히 자동화될 수 있다. 유사한 방법은 배지를 새롭게 하는 저장소 (430)에 사용될 수 있다.
생물반응기 내에서 성장한 세포 또는 미생물이 수확될 필요가 있는 경우, 상기 수확은 생물반응기의 특정 구조에 따라 상이한 방식으로 수행될 수 있다.
생물반응기 (예를 들어, 도 1의 생물반응기 (10)에서와 같은)의 일부 구현예에서, 천공된 장벽은 생물반응기 및 수확의 벽에 고정되고 이동가능하지 않게 부착된다. 상기 생물반응기에서 세포의 수확은 생물반응기의 용기 벽 및 천공된 장벽의 상부 표면에 인접한 제2 챔버로의 개방구 내 배치된 하나 이상의 수확 포트 (예를 들어, 도 1의 천공된 장벽 (12)의 표면 (12A)에 인접한 제2 챔버 (14B)로 개방하는 생물반응기 (10)의 단일 수확 포트 (21)와 같은)를 사용함에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 생물반응기 (10)의 편평한 표면 (12A)은 수확 동안에 수평이기 때문에, 상기 수확은 어느 정도 세포 (3)의 일부가 수확 포트 (21)의 개방구에 도달할 수 없으므로 방해받을 수 있다.
지금 본원의 생물반응기의 여러 구현예에 따라 기울어질 수 있는 생물반응기의 2개의 가능한 위치적 상태를 도해하는 도식적 부분 횡단 다이아그램인 도 6a-6b를 참조한다
도 6a-6b의 생물반응기 (510)는 단지 개요적으로 도식적으로 도해되고 이의 수확 작동을 이해하기 위해 필요한 성분들만을 상세히 나타냄을 주지한다. 기울기 작용 및 세포 수확의 이해를 위해 필요하지 않은 생물반응기 (510)의 다른 성분들은 도해를 명료하게 하기 위해 도 6a-6b에 나타내지 않고 도 1-5의 생물반응기 또는 본원에 기재된 임의의 다른 생물반응기에 대해 상세히 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 도 6a의 기울어질 수 있는 생물반응기 (510)에서, 생물반응기는 용기 벽 (510A), 상부 부분 (510C) 및 하부 부분 (510B)을 포함한다. 생물반응기 (510) 내 공간은 천공된 장벽 (512)에 의해 제1 챔버 (514A) 및 제2 챔버 (514B)로 나누어진다. 도 6a-6d에 상세히 나타내지 않은 생물반응기 (510)의 임의의 다른 성분들은 도 1의 생물반응기 (10)와 관련하여 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같을 수 있다. 도 6a에서, 생물반응기 (510)는 수직 상태이고, 여기서, 생물반응기 (510)의 종축 (535)은 수직이다(도 6a에서, 이것은 수직 축 V를 따라 정렬되는 종축 (535)에 의해 나타낸다). 생물반응기 (510)는 수확 포트 (521) 및 밸브 (523)를 포함한다.
도 6a에서, 밸브 (523)는 폐쇄된 상태로 나타내고 생물반응기 (510)는 소량의 성장 배지 (2)를 함유하도록 나타내고, 여기서, 수확될 세포 (3)는 성장 배지 (2)의 대부분 (전부는 아님)이 밸브 (525)를 개방시킴에 의해 제1 챔버 (514A)로 개방하는 유출구 포트 (527)를 통해 생물반응기 (510)로부터 인출된 후 현탁된다. 인출 동안에, 일부 구현예에 따라, 제2 챔버 (514B)에 유지된 성장 배지 (2)의 일부는 천공된 방벽의 천공을 통해 하류로 제1 챔버 (514A)로 통과시키고 유출구 포트 (527)로부터 유출되지만 세포 (3)는 이들이 천공된 장벽의 천공을 통해 통과할 수 없기 때문에 제2 챔버 (514B)에 보유된다. 일부 구현예에 따라, 인출은 또한 깊은 튜브가 세포 매쓰 농축기 위에 위치되는 한, 예를 들어, 유출구 포트 (126A-126D) (도 2에 나타냄) 중 하나를 통해 상부 챔버에 삽입될 수 있는 깊은 튜브 (나타내지 않음)를 통해 제공될 수 있다. 일부 구현예에 따라, 인출은 또한 유출구 포트가 세포 매쓰 농축기 위에 위치하는 한, 유출구 포트 (126A-126D) (도 2에 나타냄) 중 하나의 밸브를 개방함에 의해 제공될 수 있다. 이것은 제2 챔버에 잔류하는 성장 배지 (2) 양의 감소로 인해 제2 챔버 (514B) 내 세포를 농축시킨다. 제2 챔버 (514B) 내 성장 배지 (2)의 수준이 충분히 감소된 경우, 상기 밸브 (525)는 폐쇄될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 세포 수확을 수행하기 위해, 생물반응기 (510)는 지금 기울어진 상태로 생물반응기 (510)를 도해하는 도 6b에 도해된 바와 같이 기울어진다. 기울어진 상태에서, 생물반응기 (510)의 종축 (535)은 수직 방향으로 일정 각도에서 기울어진다 (수직 점선 V에 의해 도 6b에 나타냄). 상기 각도 α는 0<α<90도 범위 내 임의의 간편한 각도일 수 있다. 생물반응기 (510)가 기울어진 후 (예를 들어, α =45 도로), 현탁된 세포 (3)는 도 6b에 도해된 바와 같이 밸브 (523)를 개방함에 의해 시험 튜브 (511)와 같은 적합한 수거 용기로 수확될 수 있다. 상기 기울어질 수 있는 생물반응기의 이점은 수확 동안에, 수거된 세포의 수율이 도 1의 생물반응기 (10)와 같은 기울어질 수 없는 생물반응기에서 수행되는 수확 수율과 비교하여 보다 높을 수 있다. 도 6b, 6c, 및 6d는 도 6a의 생물반응기 (510)의 구현예임으로, 도 6a에 대해 상기 확인된 도 6b, 6c, 및 6d에서의 요소들은 도 6a 내 이들 요소들과 동일한 의미 및 질을 갖는다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (510)의 기울기 작용 (또는 본원에 기재된 바와 같이 수행되는 기울어 질 수 있는 임의의 다른 유형의 생물반응기의)은 이에 제한되지 않지만 생물반응기 (510)를 유지하는 임의의 기계적 지지 구조체 (나타내지 않음) 내에서 생물반응기를 기울임에 의해서와 같이 당업계에 공지된 임의의 기계적 수단에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 생물반응기의 일부 추가의 구현예에 따라, 생물반응기 (510)는 생물반응기 (510)가 지지될 수 있는 브래킷을 기울어질 수 있게 유지하는 2개의 반대 아암을 갖는 포크 유사 겐트리 (나타내지 않음) 내 기울어질 수 있게 지지되도록 구성된다. 이것이 수직으로 정렬되거나 수직에 대해 임의의 목적하는 각도로 기울어질 수 있도록 하는 용기를 기울어 질 수 있게 유지하기 위한 상기 기계적 구조는 당업계에 널리 공지되어 있고 따라서 이후 상세히 기재되지 않는다.
지금 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 고정된 비스듬한 천공된 장벽을 갖는 생물반응기를 도해하는 도식적 부분 횡단면인 도 6c 및 6d를 참조한다;
도 6c-6d의 생물반응기 (550)는 단지 개요적으로 도식적으로 도해되고 이의 수확 작동을 이해하기 위해 필요한 성분들만을 상세히 나타냄을 주지한다. 세포 수확 방법의 이해를 위해 필요하지 않은 생물반응기 (550)의 다른 성분들은 도해를 명료하게 하기 위해 도 6c-6d에 나타내지 않고 도 1-2 및 5의 생물반응기 또는 본원에 기재된 임의의 다른 생물반응기에 대해 상세히 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
도 6c의 생물반응기 (550)는 용기 벽 (550A), 상부 부분 (550C) 및 하부 부분 (550B)을 포함한다. 생물반응기 (550) 내 공간은 천공된 장벽 (512)에 의해 제1 챔버 (520A) 및 제2 챔버 (520B)로 나누어진다. 도 6c 및 6d에 상세히 나타내지 않은 생물반응기 (550)의 임의의 다른 성분들은 도 1의 생물반응기 (10)와 관련하여 상기 상세히 기재되어 있다. 천공된 장벽 (522)은 밀봉적으로 및 고정적으로 용기 벽 (550A)에 부착되어 있고 생물반응기 (550)의 수평 평면 (H)에 상대적으로 각도 β로 비스듬하게 있다 (수평 평면은 도 6c 및 6d에서 점선 H에 의해 도식적으로 나타낸다). 각도 β는 0.2< β <45 도 범위의 임의의 각도일 수 있지만, 상기 범위 보다 작거나 높은 다른 각도가 특히 적용 분야에 따라 사용될 수 있다. 전형적인 적용 분야에서, 각도 β는 0.2< β <15 도의 범위에 있을 수 있다.
생물반응기 (550)는 밸브 (533)를 갖는 수확 포트 (531)를 포함한다. 수확 포트 (531)의 밸브 (533)는 폐쇄된 상태로 도 6c에 도해되고 생물반응기 (550)는 성장 배지 (2)에 현탁된 세포 (3)를 포함하는 성장 배지 (2)의 양을 함유하는 것으로 나타난다.
지금 도 6d를 다시 참조하면, 세포 (3)는 수확될 필요가 있는 경우, 성장 배지 (2)의 대부분 (전부는 아님)은 유출구 포트 (527)의 밸브 (525)를 개방시킴에 의해 제1 챔버 (520A)로 개방되는 유출구 포트 (527)를 통해 생물반응기 (550)로부터 인출된다. 인출 동안에, 성장 배지 (2) (또는 세포 (3)를 세척하기 위해 사용되는 세척 완충액)는 천공된 장벽 (522) 내 천공을 통과함에 의해 제1 챔버 (520A)로 유동하고 유출구 포트 (527)로부터 유출되지만 세포 (3)은 이들이 천공된 장벽 내 천공을 통해 통과할 수 없으므로 제2 챔버 (520B) 내 보유된다. 이것은 제2 챔버 (520B)에 잔류하는 성장 배지 (2) 양의 감소로 인해 제2 챔버 (520B) 내 세포 (3)를 농축시킨다. 제2 챔버 (520B) 내 성장 배지 (2)의 수준이 충분히 감소된 경우, 상기 밸브 (525)는 폐쇄될 수 있다.
도 6d를 참조하면, 생물반응기 (550)는 목적하는 양의 성장 배지가 생물반응기 (550)로부터 인출될 때까지 유출구 포트의 밸브 (525)를 개방하고 이어서 밸브 (525)를 폐쇄시키고/시키거나 깊은 튜브 (상기 언급된 바와 같이) 및/또는 제2 챔버 유출구 포트 (상기 언급된 바와 같이) 중 하나를 통해 성장 배지 (2)의 대부분이 제2 챔버 (520B)로부터 인출된 후 제2 챔버 (520B) 내 잔류하는 소량의 성장 배지 (2)에 농출된 세포 (3)를 함유하는 제2 챔버 (520B)와 함께 도해된다. 세포의 수확은 수확 포트 (531)의 밸브 (533)를 개방하고 수확 포트 (531)의 말단으로 수거 용기 (511)를 연결시킴에 의해 수행될 수 있다.
지금 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라 비-평면 (편평하지 않은) 천공된 장벽의 3개의 상이한 유형을 포함하는 생물반응기의 3개의 상이한 구현예를 도해하는 도식적 부분 횡단 다이아그램인 도 7-9를 참조한다. 도해를 명료하게 하기 위해, 도 7-9의 개략적인 도면은 단지 생물반응기의 벽의 일반적인 형태 및 거기에 포함되는 천공된 장벽 및 천공된 장벽과 연합된 수확 포트의 형태만을 도해하고, 생물반응기의 나타낸 천공된 장벽의 형태를 이해하는데 중요하지 않은 생물반응기 또는 생물반응기 시스템의 임의의 추가의 성분들의 임의의 세부 사항 (예를 들어, 생물반응기의 벽 내 다양한 개구부, 센서 유닛, 유체 유입구 포트, 유체 유출구 포트, 인출 포트, 수확 포트, 가열 유닛, 냉각/가열 유닛, 유체 임펠러, 가스 분배 헤드, 밸브, 펌프, 제어기, 자가-밀봉가능한 개스킷, 유체 매니폴드 또는 임의의 다른 성분들과 같은)을 보여주지 않음을 주지한다. 도 7-9에 나타내지 않는 임의의 상기 성분들은 본원에서 상세히 기재된 바와 같고 도면에 도해된 바와 같이, 도 7-9에 도식적으로 도해된 임의의 생물반응기에서 임의의 비-상호적으로 배제된 조합 및/또는 순열로 포함될 수 있음은 당업자가 이해할 것이다.
도 7을 참조하면, 생물반응기 (610)는 용기 벽 (610A)을 갖고, 곡선의 천공된 장벽 (612)은 고정적으로 (이동가능하지 않게) 및 밀봉적으로 용기 벽 (610A)에 부착되어 있고, 생물반응기 (610) 내 공간을 제1 챔버 (614A) 및 제2 챔버 (614B)로 나눈다. 생물반응기 (610)는 밸브 (623)를 포함하는 중공 구성원인 수확 포트 (627)를 추가로 포함한다. 수확 포트 (627)는 구조에서 도 2의 수확 포트 (127)와 유사하다. 수확 포트 (627)는 곡선의 천공된 장벽 (612)으로 밀봉적으로 부착되어 있고 표면 (612A)에서 제2 챔버 (614B)로 개방된다.
수확 포트 (127) (도 2의)에 대해 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 수확 포트 (627)는 밀봉적으로 용기 벽 (610A)을 통해 통과하여 생물반응기 (610)로부터 배출된다. 생물반응기 (610)의 상부 부분 (610C)과 대면하는 곡선의 천공된 장벽 (612)의 상부 표면 (612A)은 오목하고, 이는 고정된 (이동 가능하지 않은) 편평한 (평면) 천공된 장벽 (예를 들어, 도 2의 생물반응기 (110)와 같은)을 갖는 생물반응기에서 수확된 세포의 수율과 비교하여 수확된 세포의 수율을 유리하게 증가시킬 수 있다.
도 8을 참조하면, 생물반응기 (710)는 용기 벽 (710A)을 갖고, 원뿔 천공된 장벽 (712)은 고정적으로 (이동가능하지 않게) 및 밀봉적으로 용기 벽 (710A)에 부착되어 있고, 이는 생물반응기 (710) 내 공간을 제1 챔버 (714A) 및 제2 챔버 (714B)로 나눈다. 생물반응기 (710)는 밸브 (723)를 포함하는 중공 구성원인 수확 포트 (727)를 추가로 포함한다. 수확 포트 (727)는 구조에서 도 2의 수확 포트 (127)와 유사하다. H는 생물반응기 (710)의 수평 평면 H를 나타낸다.
일부 구현예에 따라, 수확 포트 (727)는 원뿔의 천공된 장벽 (712)으로 밀봉적으로 부착되어 있고 표면 (712A)에서 제2 챔버 (714B)로 개방된다. 수확 포트 (127) (도 2의)에 대해 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 수확 포트 (727)는 밀봉적으로 용기 벽 (710A)을 통해 통과하여 생물반응기 (710)로부터 배출된다. 생물반응기 (710)의 상부 부분 (710C)과 대면하는 원뿔의 천공된 장벽 (712)의 상부 표면 (712A)은 오목한 표면이고, 이는 고정된 (이동 가능하지 않은) 편평한 (평면) 천공된 장벽 (예를 들어, 도 2의 생물반응기 (110)와 같은)을 갖는 생물반응기에서 수확된 세포의 수율과 비교하여 수확된 세포의 수율을 유리하게 증가시킬 수 있다.
도 9를 참조하면, 생물반응기 (810)는 용기 벽 (810A)을 갖고, 테이퍼링 천공된 장벽 (812)은 고정적으로 (이동가능하지 않게) 및 밀봉적으로 용기 벽 (810A)에 부착되어 있고, 생물반응기 (810) 내 공간을 제1 챔버 (814A) 및 제2 챔버 (814B)로 나눈다. 생물반응기 (810)는 밸브 (823)를 포함하는 중공 구성원인 수확 포트 (827)를 추가로 포함한다. 수확 포트 (827)는 구조에서 도 2의 수확 포트 (127)와 유사하다. 수확 포트 (827)는 테이퍼링 천공된 장벽 (812)으로 밀봉적으로 부착되어 있고 표면 (812A)에서 제2 챔버 (814B)로 개방된다.
수확 포트 (127) (도 2의)에 대해 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 수확 포트 (827)는 밀봉적으로 용기 벽 (810A)을 통해 통과하여 생물반응기 (810)로부터 배출된다. 생물반응기 (810)의 상부 부분 (810C)과 대면하는 테이퍼링 천공된 장벽 (812)의 상부 표면 (812A)은 테이퍼링 표면이고, 이는 고정된 (이동 가능하지 않은) 편평한 (평면) 천공된 장벽 (예를 들어, 도 2의 생물반응기 (110)와 같은)을 갖는 생물반응기에서 수확된 세포의 수율과 비교하여 수확된 세포의 수율을 유리하게 증가시킬 수 있다.
본원에서 상기 기재되고 도 1-3, 4a-4i, 6a-6b 및 7-9에 도시된 모든 생물반응기는 고정된 이동가능하지 않는 천공된 장벽을 포함하지만 이것은 본원에 기재된 생물반응기 또는 이의 시스템을 사용하여 수행하는 것이 절대적인 것은 아니고 일부 구현예에 따라, 생물반응기는 이동 가능한 (비-고정된) 장벽 또는 기울어질 수 있는 천공된 장벽을 포함하도록 구성됨을 주지한다.
지금 이동가능하고/하거나 기울어질 수 있는 천공된 장벽을 갖는 반응기의 일부 구현예를 도해하는 도 10a-10b, 11a-11b 및 12a-12b를 참조한다. 도 10a-10b는 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라 변형될 수 있는 천공된 장벽을 포함하는 생물반응기의 상이한 상태를 도해하는 도시적 부분 횡단 다이아그램이다.
도 11a-11b는 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라 버클링 천공된 장벽을 포함하는 생물반응기의 2개의 상이한 상태를 도해하는 도시적 부분 횡단 다이아그램이고, 도 12a-12b는 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라 기울어질 수 있는 천공된 장벽을 포함하는 생물반응기의 2개의 상이한 상태를 도해하는 도시적 부분 횡단 다이아그램이다. 도해를 명료하게 하기 위해 도 10a-10b, 11a-11b 및 12a-12b의 개략적인 도면은 단지 생물반응기의 벽의 일반적인 형태 및 거기에 포함되는 이동할 수 있거나 변형될 수 있거나 기울어질 수 있거나 버클링 천공된 장벽 및 천공된 장벽과 연합된 수확 포트의 형태만을 도해하고, 생물반응기의 나타낸 천공된 장벽의 형태를 이해하는데 중요하지 않은 생물반응기 또는 생물반응기 시스템의 임의의 추가의 성분들의 임의의 세부 사항 (예를 들어, 생물반응기의 벽 내 다양한 개구부, 센서 유닛, 유체 유입구 포트, 유체 유출구 포트, 인출 포트, 수확 포트, 가열 유닛, 냉각 유닛, 유체 임펠러, 가스 분배 헤드, 밸브, 펌프, 제어기, 자가-밀봉가능한 개스킷, 유체 매니폴드 또는 임의의 다른 성분들과 같은)을 보여주지 않음을 주지한다. 도 10a-10b, 11a-11b 및 12a-12b에 나타내지 않는 임의의 상기 성분들은 본원에서 상세히 기재된 바와 같고 도면에 도해된 바와 같이, 도 10a-10b, 11a-11b, 12a-12b 및 13에 도식적으로 도해된 임의의 생물반응기에서 임의의 비상호적으로 배제된 조합 및/또는 순열로 포함될 수 있음은 당업자가 이해할 것이다.
도 10a-10b를 참조하면, 생물반응기 (910)는 용기 벽 (910A)을 갖고, 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)은 고정적으로 및 밀봉적으로 용기 벽 (910A)에 부착되어 있고, 이는 제1 챔버 (914A) 및 제2 챔버 (914B)로 나눈다. 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)은 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이 다수의 천공을 포함하고, 성장 배지 (2)가 거기를 이를 통해 양방향으로 (제1 챔버 (914A)로부터 제2 챔버 (914B)로 및 그 반대로) 통과하도록 하지만 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이 거기를 이를 통한 세포 또는 유기체의 통과는 차단한다. 일부 구현예에 따라, 상기 천공된 장벽 (912)은 세포 또는 미생물의 성장을 위해 생물적합할 수 있는 재료로부터 만들어질 수 있고 또한 천공된 장벽 (912)에 적용되는 힘이 이의 형태를 변형시킬 수 있도록 유연하거나 변형될 수 있다.
생물반응기 (910)는 밸브 (923)를 포함하는 중공 구성원인 수확 포트 (927)를 추가로 포함한다. 수확 포트 (927)는 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)으로 밀봉적으로 부착되어 있고 표면 (912A)에서 제2 챔버 (914B)로 개방된다. 수확 포트 (927)는 생물반응기 (910)로부터 나오기 위해 용기 벽 (910A)을 밀봉적으로 통과한다. 수확 포트 (927)는 제1 챔버 (914A) 내에 배치된 제1 강성의 (이동가능하지 않은) 부분 (또는 일부) (927A)를 갖는 중공 구성원이다. 제1 강성 부분 (927A)은 용기 벽 (910A)을 통해 밀봉적으로 통과하고 생물반응기 (910) 외부로 나온다. 제1 강성 부분 (927A)은 수확 포트 (927)를 개방하거나 폐쇄하기 위해 거기에 밸브 (923)를 갖는다. 일부 구현예에 따라, 상기 수확 포트 (927)는 이의 하나의 말단에서 제1 부분 (927A)으로 밀봉적으로 부착된 제2의 유연하고/하거나 압축가능한 부분 (또는 일부) (927B)을 추가로 포함한다. 유연하고/하거나 압축가능한 부분 (927B) 및 강성 부분 (927A)은 함께 연결되어 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)에 밀봉적으로 부착되고 이의 표면 (912A)에서 개방되는 유연성 부분 (927B)의 말단에서 제2 챔버 (914B)로 개방되는 중공 구성원을 형성한다.
본원의 일부 구현예에 기재된 수확 포트는 천공된 장벽의 상부 표면에서 개방되고, 대안적 구현예는 얇은 밀봉 막에 의해 천공된 장벽으로 연결되는 이들의 말단에서 폐쇄되거나 밀봉된 수확 포트 (나타내지 않음)를 포함할 수 있음을 주지한다. 상기 구현예에서, 수확 포트가 생물반응기의 제2 챔버로부터 세포를 수확하기 위해 사용될 필요가 있는 경우, 밀봉 막은 예리한 멸균 와이어 유사 기구를 수확 포트를 통해 삽입하고 밀봉 막을 파열함에 의해 또는 생물반응기의 상부 부분에서 임의의 개방구를 통해 제2 챔버로 삽입하고 멸균 막을 파열함에 의해 개방 파열되도록 구성된다. 임의의 다른 기계적 또는 자기 기전은 또한 당업계에 공지된 바와 같이 상기 밀봉된 수확 포트의 밀봉 막을 파열시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (910)는 도 10a-10b에 도해된 바와 같이, 제2 압축가능한 (또는 유연성 부분) (927B)에 부착된 자기 구성원 (915)을 포함한다. 대안적으로, 생물반응기 (910)의 여전히 또 다른 구현예에 따라, 자기 구성원 (915)은 일부 구현예에서 천공된 장벽 (912) (도 10a-10b에 나타내지 않음)의 중앙 부분 근처에서 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)에 부착되도록 구성된다. 자기 구성원 (915)은 영구적으로 자기화된 재료로부터 만들어진 환형 구성원 형태 (임의로)이도록 구성된다.
예를 들어, 자기 구성원 (915)은 FeNdB (Iron Neodymium Boron) 영구적 자기, 사마륨-코발트 영구적 자기 또는 예를 들어, 철과 같은 당업계에 공지된 임의의 다른 자기 또는 상자성 재료로부터 만들어질 수 있다. 필요한 경우, 자기 구성원 (915)은 예를 들어, 생물적합성 플라스틱 또는 임의의 적합한 생물적합성 중합체 기반 재료, 생물적합성 세라믹 층 또는 임의의 다른 적합한 생물적합성 및 (일부 구현예에서) 멸균성 재료와 같은 생물적합성 재료로 코팅될 수 있거나 여기에 매립될 수 있다.
지금 도 10b를 참조하면, 세포 (3)가 생물반응기 (910)로부터 수확될 필요가 있는 경우, 성장 배지 (2)의 양은 잔류 성장 배지 (2)에서 세포 (3)를 농축시키기 위해 상기 본원에 기재된 바와 같이 적합한 유출구 포트 (도해를 명료하게 하기 위해 도 10a-10b에 나타내지 않지만 도 1의 유출구 포트 (27)와 유사하거나 도 3의 유출구 포트 (227)와 유사한)를 통해 생물반응기 (910)의 제1 챔버 (914A)로부터 인출될 수 있다. 강한 자기 M은 이어서 도 10b에 도해된 바와 같이 생물반응기 (910) 근처에 적합하게 위치할 수 있다. 자기 M은 당업계에 공지된 임의의 적합한 영구적 자기 또는 전자기일 수 있다. 생물반응기 (910) 근처에 자기 M의 위치는 자기 M을 향해 지시되는 화살표 F에 의해 나타낸 자기 힘을 발취한다. 상기 힘은 제2 부분 (927B)을 하향으로 당겨내어 제2 압축가능한 부분 (927)에 부착된 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)이 또한 하향으로 당겨져 변형된다.
자기력이 제2 압축가능한 (또는 유연성 또는 단축성) 부분 (927B)에 작용하는 경우, 제2 압축가능한 부분 (927)은 압축되어 이의 길이는 단축되고 제2 부분 (927B)에 부착된 천공된 장벽 (912)의 일부가 하향으로 이동하도록 하여 천공된 장벽의 형태가 변형된 상태 (도 10b에 도해된 바와 같이)로 변형되도록 한다. 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)의 변형은 변형된 상태에서 천공된 장벽 (912)의 상부 표면 (912A)이 거의 약간 곡선의 형태로 추정되는 천공된 장벽 (912)을 유도하여 파라볼로이드형 표면과 거의 유사할 수 있도록 약간 곡선 형태를 추정하는 천공된 장벽 (912)을 유도한다.
도 10a를 다시 참조하면, 생물반응기 (910)는 편평한 변형되지 않은 상태에서 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)과 함께 나타낸다. 상기 변형되지 않은 상태에서, 천공된 장벽 (912)의 상부 표면 (912A)은 실질적으로 평면 (편평한)이다. 상기 상태에서, 세포 (3)는 상기 본원에 기재된 다른 생물반응기 구현예에 대해 상세히 기재된 바와 같이 제2 구성원 (914B)에서 성장시킬 수 있다.
지금 도 10b를 다시 참조하면, 생물반응기 (910)는 변형된 상태에서 변형될 수 있는 천공된 장벽 (912)과 함께 도해된다. 상기 변형된 상태에서, 천공된 장벽 (912)의 상부 표면 (912A)은 곡선 표면이다. 상기 변형된 상태에서, 성장 배지 (2)에 현탁된 농축된 세포 (3)는 수확 포트 (927)의 밸브 (923)를 개방하고 성장 배지 (2)에 현탁된 세포 (3)를 상기 본원에 기재된 바와 같이 수거 용기 (511)에 수거함에 의해 수거될 수 있다. 변형된 천공된 장벽 (912)의 곡선 형태의 오목한 표면 (912A)은 고정된 (이동 가능하지 않은) 편평한 (평면) 천공된 장벽 (예를 들어, 도 2의 생물반응기 (110)와 같은)을 갖는 생물반응기에서 수확된 세포의 수율과 비교하여 수확된 세포의 수율을 유리하게 증가시킬 수 있다.
지금 도 11a-11b를 참조하면, 생물반응기 (1010)는 용기 벽 (1010A)을 갖는다. 버클링 천공된 장벽 (1012)은 고정적으로 및 밀봉적으로 용기 벽 (1010A)에 부착되어 있고, 생물반응기 (1010) 내 공간을 제1 챔버 (1014A) 및 제2 챔버 (1014B)로 나눈다. 버클링 천공된 장벽 (1012)은 상기 본원에 상세히 기재되어 있는 바와 같이 다수의 천공을 포함하고 성장 배지 (2)가 거기를 이를 통해 양방향으로 (제1 챔버 (1014A)로부터 제2 챔버 (1014B)로 및 그 반대로) 통과하도록 하지만 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이 거기를 이를 통한 세포 또는 미생물의 통과는 차단한다. 일부 구현예에 따라, 버클링 천공된 장벽 (1012)은 세포 또는 미생물의 성장을 위해 생물적합성인 딱딱하지만 유연성인 재료로부터 만들어질 수 있다.
일부 구현예에 따라, 버클링 천공된 장벽 (1012)의 둘레는 밀봉적으로 용기 벽 (1010A)에 부착되어 있어 버클링 천공된 장벽 (도 11a에 도해된)에서, 천공된 장벽 (1012)은 형태가 볼록하고 생물반응기 (1010)의 상부 부분 (1010C)과 대면하는 천공된 장벽 (1012)의 상부 표면 (1012A)은 볼록한 표면이다. 일부 구현예에 따라, 충분히 큰 힘이 버클링 전공된 장벽 (1012)에 적용되는 경우, 버클링 천공된 장벽 (l012)은 제2 안정한 상태 (도 11b에 도해된)로 전환된다. 도 11a에서 장벽 (1012)과 비교하여, 도 11b에서 장벽 (1012)은 생물반응기 용기의 바닥을 향해 약간 기울어져 있다. 천공된 장벽 (1012)의 제2 상태에서, 천공된 장벽 (1012)은 형태가 오목하고 생물반응기 (1010)의 상부 부분 (1010C)에 대면하는 천공된 장벽 (1012)의 상부 표면 (1012A)은 오목한 표면이다.
일부 구현예에 따라, 버클링 천공된 장벽 (1012)은 버클링 천공된 장벽의 2개의 안정한 상태 간의 전이가 천공된 장벽 (1012)으로 충분한 힘의 적용을 요구하는 2개의 안정한 구성에 있도록 구성된다. 일부 구현예에 따라, 생물반응기 (910)는 추가로 밸브 (923)를 포함하는 중공 구성원인 수확 포트 (927)를 포함한다. 수확 포트 (927)는 버클링 천공된 장벽 (1012)으로 밀봉적으로 부착되어 있고 상부 표면 (1012A)에서 제2 챔버 (1014B)로 개방된다. 수확 포트 (927)는 생물반응기 (1010)로부터 나오기 위해 용기 벽 (1010A)을 밀봉적으로 통과한다. 수확 포트 (927)는 제1 챔버 (1014A) 내에 배치된 제1 강성의 (이동가능하지 않은) 부분 (또는 일부) (927A)를 갖는 중공 구성원이다.
일부 구현예에 따라, 제1 강성 부분 (927A)은 용기 벽 (1010A)을 통해 밀봉적으로 통과하고 생물반응기 (1010) 외부로 나온다. 제1 강성 부분 (927A)은 수확 포트 (927)를 개방하거나 폐쇄하기 위해 거기에 밸브 (923)를 갖는다. 일부 구현예에 따라, 상기 수확 포트 (927)는 이의 하나의 말단에서 제1 부분 (927A)으로 밀봉적으로 부착된 제2의 유연하고/하거나 압축가능한 부분 (또는 일부) (927B)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따라, 유연하고/하거나 압축가능한 부분 (927B) 및 강성 부분 (927A)은 함께 연결되어 버클링 천공된 장벽 (1012)에 밀봉적으로 부착되고 이의 표면 (1012A)에서 개방되는 유연성 부분 (927B)의 말단에서 제2 챔버 (1014B)로 개방되는 중공 구성원을 형성한다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (1010)는 자기 구성원 (1015)을 포함한다. 자기 구성원 (1015)은 도 11a-11b에 도해된 바와 같이 변형될 수 있는 천공된 장벽 (1012)에 부착된 환형 형태의 자기 구성원을 (임의로) 갖도록 구성된다. 대안적으로, 생물반응기 (1010)의 여전히 또 다른 구현예에 따라, 자기 구성원 (1015)은 수확 포트(927) (본 구현예는 도 10a-10b에 나타내지 않음)의 제2 압축 가능한 (또는 유연성) 부분 (927B)에 부착되도록 구성된다. 그러나, 자기 구성원 (1015)은 적절히 하향 지시된 힘을 버클링 천공된 장벽에 또는 수확 포트 (927)의 제2 압축가능한 (또는 유연성) 부분 (927B) (자기 구성원 (1015)이 상기된 상이한 대안적 구현예에서 부착된 부분에 의존하여)에 적용하기 위해 적합한 임의의 다른 형태를 가질 수 있다.
일부 구현예에 따라, 자기 구성원 (1015)은 영구 자기화된 재료로부터 또는 상자성 재료로부터 또는 자기 구성원 (1015)과 관련하여 상세히 상기 기재된 바와 같은 임의의 다른 자기화될 수 있는 재료료부터 만들어질 수 있다. 필요한 경우, 자기 구성원 (1015)은 자기 구성원 (915)와 관련하여 상기 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 생물적합성 플라스틱 또는 임의의 적합한 생물적합성 중합체 기반 재료, 생물적합성 세라믹 층 또는 임의의 다른 적합한 생물적합성 및 (일부 구현예에서) 멸균성 재료와 같은 생물적합성 재료로 코팅될 수 있거나 여기에 매립될 수 있다.
지금 도 11b를 참조하면, 세포 (나타내지 않음)가 생물반응기 (1010)로부터 수확될 필요가 있는 경우, 성장 배지 (나타내지 않음)의 양은 잔류 성장 배지에서 세포를 농축시키기 위해 상기 본원에 기재된 바와 같이 적합한 유출구 포트 (도해를 명료하게 하기 위해 도 11a-11b에 나타내지 않지만 도 1의 유출구 포트 (27)와 유사하거나 도 3의 유출구 포트 (227)와 유사한)를 통해 생물반응기 (1010)의 제1 챔버 (1014A)로부터 인출될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 자기 M은 이어서 도 11b에 도해된 바와 같이 생물반응기 (1010) 근처에 적합하게 위치하도록 구성된다. 자기 M은 상기 본원에서 도 10b를 참조로 상세히 기재된 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 적합한 영구적 자기 또는 전자기일 수 있다. 생물반응기 (1010) 근처의 자기 M의 위치는 자기 M을 향해 지시되는 화살표 F에 의해 나타낸 자기 구성원 (1015) 상에 자기력을 발휘한다. 상기 자기력은 화살표 F로 나타낸 방향으로 버클링 천공된 장벽 (1012)을 하향으로 당긴다. 일부 구현예에 따라, 자기력은 버클링 천공된 장벽 (1012)이 제1 안정한 (볼록한) 상태에서 제2 안정한 (오목한) 상태로 전환시키기에 충분한 것 이상의 힘을 갖는다 (도 11a-11b에 도해된 바와 같이). 일부 구현예에 따라, 천공된 장벽 (1012)이 제1 상태에서 제2 상태로 전환되는 경우, 버클링 천공된 장벽 (1012)의 중앙 부분은 하향으로 이동하고 제2 압축 가능한 부분 (927B)이 압축되도록 하여 부분 (927B)의 길이는 단축되어 제2 부분 (927B)에 부착된 버클링 천공된 장벽 (1012)의 부분이 하향 이동하도록 한다.
일부 구현예에 따라, 버클링 천공된 장벽 (1012)의 제1 상태에서 제2 상태로의 전환은 또한 하나의 말단에서 버클링 천공된 장벽 (1012)에 부착되도록 구성된 윌 (weal) (나타내지 않음) 또는 수직 막대형 밀고/당기는 구성원 (나타내지 않음)을 사용하여 기계적으로 성취될 수 있고 이의 제2 말단은 생물반응기 (1010)의 상부 부분 (1010C)에서 개방구 (나타내지 않음)에 배치된 적합한 밀봉 캐스킷 (나타내지 않음)을 통해 밀봉적으로 및 미끌어질 수 있게 통과한다.
일부 구현예에 따라, 버클링 천공된 장벽 (1012)이 제1 상태에서, 상기 밀고/당기는 구성원을 하향으로 밀어내는 것은 버클링 천공된 장벽 (1012)을 제1 상태에서 제2 상태로 전환키도록 구성된다. 그러나, 임의의 다른 기계적 또는 자기 또는 전자기 기전 또는 상기 기전의 조합을 사용하여 버클링 천공된 장벽을 제1 상태에서 제2 상태로 전환시킬 수 있고 모든 상기 기전 또는 기전의 조합이 본원의 구현예의 범위 내에 포함되는 것으로 간주됨을 당업자는 이해할 것이다.
도 11b에서, 생물반응기 (1010)는 제2 안정한 상태에 있는 버클링 천공된 장벽 (1012)과 함께 도해된다. 상기 제2 상태에서, 버클링 천공된 장벽 (1012)의 상부 표면 (1012A)은 오목한 곡선의 표면이다. 상기 상태에서, 제2 챔버 (1014B) 내 성장 배지 (나타내지 않음)에 현탁된 농축된 세포 (나타내지 않음)는 수확 포트 (927)의 밸브 (923)를 개방하고 세포 현탁액을 상기 본원에 기재된 바와 같이 수거 용기 (나타내지 않음)로 수거함에 의해 수확될 수 있다. 일부 구현예에 따라, 제2 안정한 상태에서 버클링 천공된 장벽 (1012)의 오목한 표면 (1012A)은 고정된 (이동 가능하지 않은) 편평한 (평면) 천공된 장벽 (예를 들어, 도 2의 생물반응기 (110)과 같은)을 갖는 생물반응기에서 수확된 세포의 수율과 비교하여 수확된 세포의 수율을 유리하게 증가시킬 수 있다.
지금 도 12a-12b를 참조하면, 생물반응기 (1110)는 용기 벽 (1110A)을 갖는다. 기울어질 수 있는 천공된 장벽 (1112)은 밀봉적으로 용기 벽 (1110A)에 부착되어 있고, 생물반응기 (1110) 내 공간을 제1 챔버 (1114A) 및 제2 챔버 (1114B)로 나눈다. 기울어질 수 있는 천공된 장벽 (1112)의 둘레는 밀봉적으로 유연성 및/또는 변형될 수 있고/있거나 스트레치 가능한 환형 구성원 (1113)에 부착되어 있다. 전형적으로, 환형 시트 (1113)는 거기에 임의의 천공을 갖지 않는다. 상기 환형 구성원 (1113)은 예를 들어, 고무 또는 라텍스 또는 유연성 폴리실란 기반 얇은 재료와 같은 유연성 또는 휘어질 수 있고/있거나 스트레치 가능한 재료로부터 만들어질 수 있고 또한 밀봉적으로 생물반응기 (1110)의 용기 벽 (1110A)에 부착되어 있다. 일부 구현예에서, 환형 구성원은 세포 (3) 및 성장 배지 (2)에 비침투성일 수 있다.
기울어질 수 있는 천공된 장벽 (1112)은 상기 본원에 상세히 기재되어 있는 바와 같이 다수의 천공을 포함하고 성장 배지 (2)가 거기를 이를 통해 양방향으로 (제1 챔버 (1114A)로부터 제2 챔버 (1114B)로 및 그 반대로) 통과하도록 하지만 상기 본원에 상세히 기재된 바와 같이 거기를 이를 통한 세포 또는 미생물의 통과는 차단한다. 일부 구현예에 따라, 천공된 장벽 (1112)은 (임의로) 세포 또는 미생물의 성장을 위해 생물적합성인 딱딱하거나 강성인 재료로부터 만들어질 수 있다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (1110)는 밸브 (1123)를 포함하는 중공 구성원인 수확 포트 (1127)를 추가로 포함한다. 수확 포트 (1127)의 제1 말단 (1127A)은 제1 챔버 (1114A) 내 배치되고 환경 구성원 (1113)에 밀봉적으로 부착되어 말단 (1127A)은 환형 구성원 (1113)의 상부 표면 (1113A) 상에 개방구 (1113B)를 통해 제2 챔버 (1114B)로 개방된다. 수확 포트 (1127)는 생물반응기 (1110)로부터 나오기 위해 용기 벽 (1110A)을 밀봉적으로 통과한다. 상기 수확 포트 (1127)는 중공 구성원이다. 수확 포트 (1127)의 제2 말단 (1127B)은 생물반응기 (1110) 외부에 배치되고 수확 포트 (1127)를 개방하거나 폐쇄하기 위해 거기에 밸브 (1123)를 포함한다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (1110)는 또한 자기 구성원 (1115)을 포함한다. 자기 구성원 (1115)은 도 12a-12b에 도해된 바와 같이 천공된 장벽 (1112)의 둘레 근처에 천공된 장벽 (1112)에 부착된 (임의로) 막대 형태의 자기 구성원이도록 구성된다. 그러나, 자기 구성원 (1115)은 적당히 하향 지시된 힘을 기울어질 수 있는 천공된 장벽 (1112)에 적용하기 위해 적합한 임의의 다른 형태를 가질 수 있다. 어떠한 힘도 기울어질 수 있는 천공된 장벽 (1112)에 적용되지 않는 경우, 천공된 장벽 (1112)은 도 12a에 도해된 바와 같이 수평이거나 거의 수평이다.
일부 구현예에 따라, 자기 구성원 (1115)은 영구 자기화된 재료로부터 또는 상자성 재료로부터 또는 강자성 재료로부터 또는 임의의 다른 자기성 재료로부터 만들어질 수 있고 자기 구성원 (915)과 관련하여 상세히 상기 기재된 바와 같이 생물적합성 재료로 (임의로) 코팅되거나 여기에 매립될 수 있다.
지금 도 12b를 참조하면, 세포 (3)가 생물반응기 (1110)로부터 수확될 필요가 있는 경우, 성장 배지 (나타내지 않음)의 양은 잔류 성장 배지 (2)에서 세포를 농축시키기 위해 상기 본원에 기재된 바와 같이 적합한 유출구 포트 (도해를 명료하게 하기 위해 도 12a-12b에 나타내지 않지만 도 1의 유출구 포트 (27)와 유사하거나 도 3의 유출구 포트 (227)와 유사한)를 통해 생물반응기 (1110)의 제1 챔버 (1114A)로부터 인출될 수 있다. 자기 M은 도 12b에 도해된 바와 같이 생물반응기 (1110) 근처에 적합하게 위치할 수 있다. 자기 M은 상기 본원에서 도 10b를 참조로 상세히 기재된 바와 같이, 당업계에 공지된 임의의 적합한 영구적 자기 또는 전자기일 수 있다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (1110) 근처에 자기 M의 위치는 자기 M을 향해 지시된 화살표 F에 의해 나타낸 자기 구성원 (1115)에 대해 자기력을 발휘한다. 자기력은 자기 구성원이 화살표 F에 의해 나타낸 방향으로 하향으로 부착된 천공된 장벽 (1112)의 측면 (1112B)을 당긴다. 적용된 자기력 F의 결과로서, 상기 천공된 장벽 (1112)은 기울어져 천공된 장벽 (1112)의 측면 (1112B)은 천공된 구성원 (1112)의 측면 (1112A) 보다 낮아진다.
도 12b에서, 생물반응기 (1110)는 자기력이 자기 M에 의해 자기 구성원 (1115)에 적용된 후 기울어진 상태로 있는 천공된 장벽 (1112)과 함께 도해된다. 상기 기울어진 상태에서, 제2 챔버(1114B)내에서 성장 배지 (2)에 현탁된 농축된 세포 (3)는 수확 포트 (1127)의 밸브 (1123)를 개방하고 세포 현탁액을 상기 본원에 기재된 바와 같이 수거 용기 (나타내지 않음)로 수거함에 의해 수확될 수 있다. 기울어질 수 있는 천공된 장벽 (1112)의 기울기 (수평선에 상대적으로)는 고정된 (이동 가능하지 않은) 편평한 (평면) 천공된 장벽 (예를 들어, 도 2의 생물반응기 (110)와 같은)을 갖는 생물반응기에서 수확된 세포의 수율과 비교하여 수확된 세포의 수율을 유리하게 증가시킬 수 있다.
본원의 생물반응기 및 생물반응기 시스템을 작동시키는데 있어서, 액체, 예를 들어, 성장 배지는 관류 (상세히 기재된 바와 같이 재순환에 의한 배지의 일정한 대체)에 의해 또는 유가식 (성장 배지 (2)로 특정 영양물의 첨가)에 의해 또는 배치식 (필요한 경우, 주기적으로 성장 배지의 또는 성장 배지 일부의 대체)에 의해 공급될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 본원의 생물반응기에서 성장한 세포/미생물의 수확 동안에, 수확되는 세포를 추가로 농축시킬 필요성이 발생할 수 있다. 상기 농축은 수확 포트에 연결된 인라인 농축 필터를 사용함에 의해 수확된 세포를 오염시킬 가능성을 불리하게 증가시킬 수 있는 생물반응기 외부에서의 추가의 작업 (예를 들어, 원심분리기에서 원심분리와 같은)을 수행할 필요 없이 성취될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 내 세포의 세척은 성장 배지 (2)를 당업계에 공지된 바와 같이 세척 완충액으로 대체함에 의해 수행될 수 있다. 성장 배지 (2)의 대체는 생물반응기로부터 성장 배지 (2)를 인출하고 생물반응기에 새로운 세척 완충액을 수회 충전시킴에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현예에 따라, 상기 인출은 임의의 생물반응기의 제1 (하부) 챔버에 포함된 임의의 인출 포트 (예를 들어, 도 1의 생물반응기 (10)의 유출구 포트 (27) 또는 도 3의 생물반응기 (210)의 유출구 포트 (227)와 같은)를 사용함에 의해 또는 생물반응기의 제2 챔버 내 성장 배지의 수준의 제어를 가능하게 하는 생물반응기 구현예에 포함된 제2 (상부 ) 챔버로 개방되는 유출구 포트 (예를 들어, 도 2의 생물반응기 (110)의 유출구 포트 (126D)와 같은)를 사용함에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 본원의 생물반응기는 세포 분리 및/또는 세포 선택이 가능하도록 구성된다. 자기 비드 결합 또는 항체 결합과 같은 세포 분리는 당업계에 널리 공지된 바와 같은 자기 비드 방법을 사용함에 의해 생물반응기의 일부 구현예의 제2 챔버 내부에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에 따라, 자기 비드(예를 들어, 자기 세포 특이적 항체-코팅된 비드와 같은)는 생물반응기의 상부 부분에서 임의의 폐쇄 가능한 개방구 (예를 들어, 도 2의 생물반응기 (110)의 개방구 (110E)를 통해서와 같이)를 통해 제2 챔버에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에 따라, 세포가 비드에 결합되면, 상기 비드는 당업계에 널리 공지된 자기를 사용함에 의해 또는 비드 크기와 세포 간을 선택하기 위해 적응된 대형 필터를 사용함에 의해 수거될 수 있다. 상기 필터는 필터 공극 크기를 기준으로 양성 또는 음성 선택제일 수 있다. 예를 들어, 비드에 부착된 세포는 필터를 통과하지 못하는 반면 비드에 부착되지 않는 음성 세포는 필터 내 공극을 통해 통과한다.
임의로, 일부 구현예에 따라, 필터는 비드에 친화성을 갖도록 구성되고 비드와 비드에 부착된 세포를 필터 상에 보유할 수 있으면서 부착되지 않은 세포는 필터를 통해 통과되도록 한다. 대안적으로, "티 백" 내 공극을 통해 미결합된 세포의 자유로운 통과를 허용하지만, 임의의 항체 코팅된 비드 및 "티 백" 내 비드에 결합된 세포를 보유하는 세포 특이적 항체로 코팅된 비드를 내포하는 "티 백" 형태의 봉입물을 사용할 수 있다. 일부 구현예에 따라, 세포는 "티 백" 막을 통해 통과할 수 있지만 비드는 보다 크고 백 내에 체류한다. 일부 구현예에 따라, 비드에 부착된 세포는 "티 백"내 보유될 수 있고 생물반응기로부터 제거될 수 있거나 의도된 용도 및 적용에 의존하여 부유될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기는 추가로 이의 상부 챔버 (도 6a에서 입증된)에서 3D 중공 컨테이너 (예를 들어, 칼슘형 컨테이너 (560)에 제한되지 않는)를 포함할 수 있고, 상기 컨테이너는 세포 분류; 비제한적인 예를 위해, 자기 비드로 CAR-T 세포를 침전시키기 위해 사용되도록 구성된다.
일부 구현예에서, 상부 챔버 (제2 챔버)는 특정 결합 활성을 갖는 세포 또는 미생물을 선택하기 위해 고정화된 매트릭스 및 또는 비드를 포함하도록 구성된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 성장 배지 또는 세척 배지로 제한되지 않는, 유체에 포함되는 세포 또는 미생물은 고정화된 매트릭스 또는 비드를 포함하는 내부 3D 컨테이너를 통해 순환될 수 있다. 일부 구현예에서, 컨테이너 벽은 컨테이너 내부 또는 외부로 세포 및 배지가 유동하도록 하지만 비드 및 비드에 결합된 세포 또는 고정화된 매트릭스는 컨테이너로부터 이탈되지 않도록 한다. 일부 구현예에서, 컨테이너는 고정화 매트릭스를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 이들의 표면 상에 친화성 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 분자는 폴리펩타이드, 또는 이의 일부 또는 펩타이드 또는 탄수화물 결합 분자를 포함한다. 일구 구현예에서, 친화성 분자는 항체, 비오틴, 아비딘, 수용체 또는 이의 일부, 아글루티닌, 렉틴, 또는 세포 또는 미생물이 결합할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 다른 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 비드는 자기 비드를 포함한다. 자기의 경우에, 자기 비드는 음성 세포를 재순환시키면서 자기를 컨테이너 근처에 위치시키고 컨테이너 내 자기 비드에 부착된 양성 세포를 보유함에 의해 컨테이너에 보유시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 고정화된 매트릭스는 이의 표면 상에 친화성 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 분자는 폴리펩타이드, 또는 이의 일부 또는 펩타이드 또는 탄수화물 결합 분자를 포함한다. 일구 구현예에서, 친화성 분자는 항체, 비오틴, 아비딘, 수용체 또는 이의 일부, 아글루티닌, 렉틴, 또는 세포 또는 미생물이 결합할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 다른 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 컨테이너를 통해 통과하고, 여기서, 세포 또는 미생물이 비드 또는 고정화된 매트릭스에 존재하는 표면 마커에 대한 결합 파트너를 소유하는 경우, 세포는 비드 또는 고정화된 매트릭스에 결합할 수 있고 컨테이너 내에 보유될 수 있다.
일부 구현예에서, 컨테이너는 "티 백"형 구조를 포함하고, 여기서, 측면은 유연성이도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 레트로-멕틴과 같은 재료는 CAR T를 위해 통상적으로 사용되는 바와 같은 레토르 또는 렌티 바이러스와 같은 바이러스의 감염 속도를 증진시키기 위해 장벽 또는 친화성 매트릭스에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에 따라, 장벽 및/또는 친화성 매트릭스는 관련 항체로 코팅될 수 있다.
예를 들어, T 세포와 같은 세포의 활성화는 사이토킨 및 활성화 신호를 성장 배지 (2)에 첨가함에 의해 또는 T-세포를 상기 본원에 기재된 바와 같이 천공된 장벽으로 또는 임의의 다른 유형의 적합한 캐리어에 접착될 수 있거나 "티 백"에 접착되거나 "티 백"에서 부유하거나 자기 비드 상에 부착될 수 있는 사이토킨 분비 세포와 동시 배양함에 의해 성취될 수 있다. 추가로, T-세포의 활성화는 T-세포를 당업계에 공지된 바와 같이 항원 제공 세포와 동시-배양함에 의해 수행될 수 있다. 상이한 유형의 세포들의 동시-배양은 단지 세포 활성화로 제한되지 않음을 주지한다. 비제한적인 예를 위해, 항 CD3/CD28 접합된 비드는 또한 T 세포를 활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 항 CD3 및 CD28 항체는 또한 T 세포를 활성화시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 본원의 생물반응기는 또한 다른 결과를 성취하기 위해 다른 유형의 세포를 동시-배양하기 위해 사용되도록 구성된다. 예를 들어, 배아 줄기 세포를 배양하는 경우, 본원의 생물반응기는 또한 성장 배지로, 줄기 세포의 성장 및 증식을 유지하고/하거나 줄기 세포의 분화를 유도하기 위해 필요한 물질 및/또는 인자를 방출할 수 있는 피더 세포 (예를 들어, 섬유아세포와 같은)와 배아 줄기 세포를 동시 배양하기 위해 사용되도록 구성된다.
수확 효율을 증가시키기 위해, 상기 본원에 기재된 생물반응기의 전체 제2 (상부) 챔버 또는 상기 생물반응기 내 포함된 천공된 장벽의 상부 표면은 제2 챔버의 상부 또는 바닥으로부터 생물반응기의 제2 챔버로 관류되거나 첨가될 수 있는 성장 배지에 의해 세척될 수 있다(예를 들어, 생물반응기 (110)의 개구부 (110E)를 통해 또는 도 1의 생물반응기 (10)의 상부 부분 (1OC)에서 개구부 (10G)를 통해 성장 배지를 첨가함에 의해, 또는 멸균 성장 배지 2로 충전된 시린지를 사용하여 도 3의 생물반응기 (210)의 자가-밀봉 개스킷 (211)을 통해 성장 배지를 주사함에 의해). 제2 챔버 및/또는 천공된 장벽의 벽의 상기 세척은 상기 본원에 기재된 바와 같이 생물반응기의 제2 (상부) 챔버로 개방되는 임의의 수확 포트의 개구부를 향해 세포를 밀어낼 수 있다.
일부 구현예에 따라, 본원에 기재된 생물반응기 내에서 성장한 세포는 라인 상에 계수되고 원뿔 형태의 농축 필터와 함께 순환 루프를 사용하여 용적을 감소시킴에 의해 농축될 수 있다. 세포 계수는 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같이 전기용량 측정, 광학 밀도 측정 및/또는 다른 광학 센서를 사용함에 의한 간접적 측정에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 본원의 생물반응기는 천공된 장벽 상에 캐리어 팩킹된 베드 또는 심지어 총회 표면와 같은 부착 표면 상에서 접착 세포의 배양이 가능하도록 구성된다. 천공된 장벽에 접착된 세포의 탈착은 당업계에 널리 공지된 바와 같이 효소적으로 수행될 수 있다. 상기 효소적 처리는 또한 성장 배지 또는 세척 완충액을 사용한 접착 표면의 세정 및/또는 접착 표면으로의 진동 적용과 조합될 수 있다.
지금 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 천공된 장벽 및 세포 캐리어 매트릭스를 갖는 생물반응기를 포함하는 생물반응기 시스템을 도해하는 개략적인 부분 단면 다이아그램인 도 13을 참조한다. 하기 본원에 구체적으로 기재되지 않은 도 13에 제공된 요소들의 기재는 상기 도 1의 기재에 제공된다.
생물반응기 시스템 (1250)은 생물반응기 시스템 (1250)의 생물반응기 (10)가 제2 챔버 (14B) 내 배치된 지지 매트릭스 (1260)를 추가로 포함함을 제외하고는 도 1의 생물반응기 시스템 (50)과 유사하다. 시스템 (1250)의 지지 매트릭스 (1260)가 성장 배지 (2) 내 침지된 용적의 단지 일부를 차지하고, 생물반응기 시스템의 다른 구현예에서, 지지 매트릭스는 성장 배지 (2)의 표면 (2A)까지 연장하도록 구성되고 또한 천공된 장벽 (12)의 상부 표면 (12A)을 향해 하향으로 연장될 수 있다. 지지 매트릭스 (1260)에 의해 차지된 용적은 특히 특이적 적용, 성장 배지 (2)의 유동에 대한 세포 지지 매트릭스 (1260)의 내성, 요구되는 세포 또는 미생물의 최종 양 및 다른 고려 사항에 의존할 수 있다.
일부 구현예에 따라, 본원의 생물반응기 시스템 (1250)은 예를 들어, 천공된 장벽 상에 세포 캐리어 매트릭스 팩킹된 베드 또는 심지어 총회 표면와 같은 부착 표면 상에서 접착 세포의 배양이 가능하도록 구성된다. 일부 구현예에 따라, 세포 지지 매트릭스 (1260)의 팩킹된 베드는 생물반응기 (10)의 천공된 장벽 (12) 상에 위치하여 성장 배지 (또는 다른 용액)가 세포 지지 매트릭스 (1260)의 표면 (들)에 부착된 세포를 공급하기 위해 고정 (또는 덜 이동성) 세포 지지 매트릭스 (1260)를 통해 순환하도록 구성된다.
상기 정렬은 세포 지지 매트릭스 (1260)에 부착된 세포의 일정한 공급을 가능하게 하고, 이는 세포 (3)를 일정하게 공급하면서, 표면 대 용적 비율이 높고 쉬어 포스가 매우 낮은 고밀도 세포 배양을 가능하게 한다. 상기 세포 지지 매트릭스 (1260)는 특히, 직물 및 부직포 섬유, 전기스핀-메쉬, 플라스틱 비드, 플라스틱 표면, 예를 들어, 알기네이트와 같은 생분해성 재료, 또는 당업계에 널리 공지된 바와 같은 2차원 및/또는 3차원 표면(들)를 갖는 임의의 다른 적합한 매트릭스 또는 캐리어를 포함할 수 있다.
일부 구현예에 따라, 세포 지지 매트릭스 (1260)에 부착된 세포를 수확할 필요가 있다면, 세포 (3)는 당업계에 널리 공지된 바와 같이 세포 지지 매트릭스 (1260)의 팩킹된 표면(들)로부터 효소적으로 탈착될 수 있다. 상기 효소적 처리는 성장 배지 또는 세척 완충액을 사용한 접착 표면의 세정 및/또는 접착 세포의 탈착을 촉진시키기 위한 표면의 진동과 조합될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 접착된 세포의 효소적 탈착은 성장 배지 (2)에 하나 이상의 효소를 첨가하고 규정된 시기 동안 효소 함유 성장 배지 내에서 접착 세포의 항온처리에 의해 수행될 수 있다. 세포 탈착을 수행하기 위해 유용한 효소는 프로테아제 (예를 들어, 트립신, 펩신 또는 파페인과 같은) 또는 적합한 콜라겐아제, 또는 콜라겐아제와 프로테아제의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 세포가 접착 표면으로부터 수확되는 경우, 세포의 세척 및 프로세싱은 초기에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
추가로, 본원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 본원에 기재된 임의의 생물반응기의 제2 (상부) 챔버는 또한 생물반응기의 상부 부분에서 가용한 임의의 개방구 (예를 들어, 도 2의 생물반응기 (110)의 폐쇄 가능한 개방구 (110E)를 통해)를 통해 제2 챔버로 도입되도록 구성되는 상기된 세포 지지 매트릭스 (1260)와 유사한 세포 지지 매트릭스를 포함하도록 구성된다. 세포가 성장 배지에 현탁되고 전형적으로 표면에 접착하지 않은, 본원에 기재된 생물반응기 내에서 비-접착 세포를 성장시키면서, 본원에 기재된 생물반응기는 또한 여기에 접착하는 일부 표면 또는 기재를 요구하는 접착 세포를 성장시키기 위해 사용되도록 구성된다. 상기 접착 세포가 생물반응기의 천공된 장벽에 접착할 수 있으면서, 상기 접착 세포를 위해 가용한 표면적을 증가시켜 세포 수율을 증가시키는 것이 요구될 수 있다. 따라서, 본 원의 생물반응기의 일부 구현예에 따라, 본원에 기재된 임의의 생물반응기는 생물반응기의 제2 챔버 내 배치된 적합한 세포 지지 매트릭스를 포함하도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 세포 지지 매트릭스는 세포가 접착할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 유형의 세포 지지 매트릭스일 수 있다. 예를 들어, 세포 지지 매트릭스는 콜라겐 기반 매트릭스, 직물 및 부직포 섬유, 전기-스핀 메쉬, 플라스틱 (중합체 기반) 비드, 플라스틱 (중합체 기반) 입자 표면, 예를 들어, 알기네이트와 같은 생분해성 재료, 임의의 유형의 콜라겐 또는 당업계에 널리 공지된 바와 같은 표면 대 표적 비율이 높은 2차원 및/또는 3차원 표면(들)을 갖는 임의의 다른 적합한 매트릭스 또는 세포 캐리어를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 생물반응기 및 생물반응기 시스템은 특히 세균 또는 임의의 다른 단일 세포 또는 다세포 미생물과 같은 미생물, 곤충으로부터의 생존 세포, 무척추동물의 생존 세포, 척추동물의 생존 세포, 생존 포유동물 세포 및 다양한 상이한 유형의 인간 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 단리된 생존 세포의 성장을 포함하는 많은 상이한 응용을 위해 사용되도록 구성됨을 주지한다. 상기 본원에 기재된 생물반응기 및 생물반응기 시스템의 다양한 구현예의 총 용적, 형태 및 다른 성분 및/또는 특징은 각각의 특정 응용으로 스케일되고 적응되도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 생물반응기 (1250)는 동시 배양을 필요로 하는 접착 및 비-접착 현탁된 세포와 함께 동시 배양하기 위해 사용되도록 구성되고, 상기 접착 세포는 세포 지지 매트릭스 (1260)에 부착되어 있고 상기 현탁된 비-접착 세포는 천공된 장벽 (12) 위 및 세포 지지 매트릭스 (1260) 아래의 배지에 현탁되어 있다. 예를 들어, 생물반응기 (1250) 또는 세포 지지 매트릭스를 함유하는 임의의 다른 생물반응기는 접착 섬유아세포와 같은 피터 세포와, 현탁된 비-접착 세포인 배아 줄기 세포의 배양을 위해 사용되도록 구성된다.
생물반응기 및 생물반응기 시스템의 하나의 예시적 적용은 세포 치료요법을 위해 세포를 성장시키는 것이다. 세포 치료요법은 세포가 치료제로서 사용되는 진보 산업이다. 세포는 자가조직 공급원 (환자로부터) 또는 동종이계 공급원 (상이한 개별 공여자)으로부터 수득될 수 있다. 자가조직 세포를 사용하는 경우에, 예를 들어, 면역-세포 치료요법 (T 세포 및/또는 B 세포 및/또는 수지상 세포, 및/또는 천연 킬러 세포를 사용하는) 및/또는 간엽성 줄기 세포이다. 치료학적 용량은 전형적으로 수 리터 (1 내지 20L)의 용적에서 배양되는 수백만 세포 내지 수십억만 세포의 범위일 수 있다. 동종이계 치료요법에서, 치료학적 제제의 생물-제조는 생물반응기 당 최대 수천리터의 용량에 도달할 수 있다.
점진적 증가 용적 변화, 배지 관류 및 신선도 및 고밀도 배양 (이에 제한되지 않지만 도 2의 생물반응기 (20)와 같은)을 가능하게 하는 적응성 배양 (다양한 배지 수준을 사용한)을 제공하는 본원의 생물반응기의 일부 구현예에서, 작동 용적 및 생물반응기 크기는 선행 기술의 생물반응기와 비교하여 약 2 내지 100 배까지 급격히 감소될 수 있다. 예를 들어, 1 내지 2 리터 범위의 총 용적을 갖는 전형적 생물반응기는 자가조직 치료요법을 위해 요구되는 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 상기 상대적으로 작은 생물반응기 용적은 수십억 세포의 성장을 가능하게 할 수 있다.
일부 구현예에 따라, 본원의 상대적으로 작은 생물반응기를 사용하는 능력은 동일한 작업공간에서 매우 작은 생물반응기의 사용을 허용하고, 공통된 서비스를 공유하기 위해 많은 작은 생물반응기를 허용함에 의해 (예를 들어, 중앙 산소화 공급 공간을 공유하고, 컴퓨터, 제어기 및/또는 작업공간 온도 제어 장치 및 공기 제어 장치 및 다른 공유 가능한 장치 및 시스템을 공유함에 의해서와 같은) 시설내 공간을 유리하게 절약하고 작동 비용을 상당히 감소시킬 수 있다.
유사한 작업공간 감소 및 비용 절약은 또한 보다 큰 생물반응기 용적이 요구되는 동종이계 배양에 사용하도록 적응된 보다 큰 생물반응기에 수득될 수 있음을 주지한다. 상기 동종이계 세포 배양은 10 내지 1000 리터 범위 (절대적인 것은 아니지만 전형적인 예로서 약 100 리터와 함께)에서 생물반응기 용적을 갖는 본원에 기재된 생물반응기의 구현예를 사용할 것을 요구할 수 있다.
동종이계 세포 및/또는 자가조직 세포를 성장시키는 적용 둘다에서 모든 상기된 생물반응기 용적 범위는 단지 예시적인 것이고 절대적인 것이 아님을 주지한다. 따라서, 상기 범위 보다 크거나 작은 용적을 갖는 생물반응기는 또한 특정 적용에 사용될 수 있고 본원의 생물반응기의 용적 공간 내에 포함된다. 예를 들어, 바이오연료 또는 다른 생성물을 수득하기 위한 조류, 세균 또는 다른 미생물을 성장시키는 것과 같은 일부 적용에서, 본원의 임의의 생물반응기의 용적은 1000리터 초과의 용적으로 스케일 업되도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 상기 언급된 생물반응기를 사용한 상기 언급된 세척 방법은 본래에 상이한 생물반응기에서 항온처리된다 하더라도 임의의 제공된 세포 매쓰에 적용될 수 있다.
일부 구현예에 따라, 상기 언급된 바와 같은 생물반응기의 디자인은 생물반응기 챔버를 개방하거나 이에 대한 중재 필요 없이 매우 부드럽고 효율적인 방식으로 세포 세척 및 제형화가 가능하도록 구성된다.
일부 구현예에 따라, 상기 언급된 바와 같은 생물반응기의 디자인은 모두 세포 매쓰 상으로 적용되는 최소의 쉬어 포스와 함께 폐쇄되고 자동화된 생물반응기에서 용적 변화, 공급 계획, 활성화, 조정, 세척 및 제형화에서 연속, 최적 및 적응성 세포 배양이 가능하도록 구성된다.
명료하게 하기 위해, 별도의 구현예와 관련하여 기재된, 본원에 개시된 생물반응기 및 이의 시스템의 특정 특성은 또한 단일 구현예에서 조합으로 제공될 수도 있는 것으로 이해된다. 간략하게 하기 위해 단일 구현예와 관련하여 기재된, 본원에 개시된 생물반응기 및 이의 시스템의 다양한 특성은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 서브-조합, 또는 본원에 개시된 생물반응기 및 이의 시스템의 임의의 다른 기재된 구현예에서 적합한 바와 같이 제공될 수 있다. 다양한 구현예와 관련하여 기재된 특정 특성은 상기 구현예가 상기 요소들 없이는 작동하지 않는 한, 상기 구현예의 필수 특성인 것으로 간주되지 않아야 한다.
본원에 기재된 생물반응기 및 이의 시스템이 이의 특정 구현예와 연계하여 기재되었지만, 많은 대안, 변형 및 변화가 당업자에게 자명할 것임은 명백하다. 따라서, 첨부된 청구항의 취지 및 광범위한 범위 내에 속하는 모든 상기 대안, 변형 및 변화를 포괄하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원 은 본원에 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원은 특이적으로 및 개별적으로 참조로 인용된 것과 동일한 정도로 전문이 본원에 참조로 인용된다. 추가로, 본원에서 임의의 참조문헌의 인용 또는 확인은 상기 참조문헌이 본원에 기재된 생물반응기 및 이의 시스템에 대해 선행 기술로서 가용함을 인정하는 거으로 해석되지 말아야 한다. 섹션 표제가 사용되는 정도로, 이들은 필수적으로 제한하는 것으로 해석되지 말야야 한다.
본원에서 사용된 바와 같은 단수형 용어 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는다면, 복수형 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이의 혼합물을 포함하는 다수의 화합물을 포함할 수 있다.
본원 전반에 걸쳐, 다양한 구현예는 일정 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 범위 포맷의 기재 사항은 단지 편의 및 간결성을 위한 것으로 이해되어야만 하고 본 발명의 범위에 대한 융통성의 제한으로서 해석되지 말아야 한다. 따라서, 범위의 기재사항은 상기 범위내 개별 수치적 값 뿐만 아니라 모든 가능한 서브범위를 구체적으로 기재한 것으로 고려되어야만 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재 사항은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 서브범위, 및 상기 범위내 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6의 범위 내의 개벌 숫자를 구체적으로 기재하는 거승로 고려되어야만 한다. 이것은 범위의 폭에 상관 없이 적용한다.
수치 범위가 본원에 지적될때마다, 지적된 범위 내에서 임의의 인용된 숫자 (분수 또는 정수)를 포함하는 것으로 의미된다. 문장 "사이의 범위/범위들"에, 제1은 숫자를 지적하고 제2는 숫자를 지적하고 "로부터의 범위/범위들"에서 제1은 숫자를 지적하고 제2는 숫자를 지적하고 본원에 상호교환적으로 사용되며 제1 및 제2 지적된 숫자 및 이들 사이의 모든 분수 및 정수 숫자를 포함하는 것으로 의미된다.
당업자는 용어 "배지"가 일부 구현예에서 세포 (진핵 또는 원핵 세포) 또는 임의의 다른 유형의 단일세포 또는 다세포 미생물을 성장시키기 위해 적합한 임의의 유형의 성장 배지를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "배지"는 세척 완충액, 영양 완충액, 효소 혼합물, 선택 용액 및 최종 제형 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포 또는 미생물 프로세싱을 위해 사용되는 임의의 유형의 용액을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 하나의 구현예에서, 용어 "약"은 ± 10 %를 언급한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "약"은 ± 9 %를 언급한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "약"은 ± 9 %를 언급한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "약"은 ± 8 %를 언급한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "약"은 ± 7 %를 언급한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "약"은 ± 6 %를 언급한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "약"은 ± 5 %를 언급한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "약"은 ± 4 %를 언급한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "약"은 ± 3 %를 언급한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "약"은 ± 2 %를 언급한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "약"은 ± 1 %를 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "임의로"는 일부 요소가 일부 구현예에서 제공되고 다른 구현예에서는 제공되지 않는 의미를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 특정 구현예는 상기 특성이 모순되지 않는 경우 다수의 "임의의" 특성을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 추가의 목적, 이점 및 신규한 특성은 하기의 실시예의 검토시 당업자에게 자명하고 이들은 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 추가로, 상기 본원에서 설명되고 하기 청구항에서 청구된 바와 같은 본원에 기재된 다양한 구현예 및 양상은 하기의 실시예에서 실험적으로 지지된다.
실시예
하기 실시예에 사용된 생물반응기 시스템은 도 1에 나타낸 것과 유사한 생물반응기를 포함하는, 도 14a에 도식적으로 제공된 생물반응기를 포함하였다. 천공된 장벽은 직경이 50 cm2이고 두께가 1 마이크미터인 환형 형태이었다. 상부 챔버는 원뿔 형태 및 120 cm2 상부를 가졌다. 성장 챔버 (상부 챔버)의 총 용적은 250 ml였다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "풋프린트"는 하부 천공된 장벽 표면적 및 총 챔버 면적을 언급한다.
생물반응기 용도 및 효과를 예시하기 위해 사용되는 세포는 T 림프구이지만 이것은 어떠한 방식으로든지 제한하는 것으로 고려되지 말아야한다.
실시예에 사용되는 유동 속도는 분당 약 2-3 mm였다. 이것은 사용되는 세포에 대한 유동 속도의 대표적인 구현예이고, 여기서, 당업자는 유동 속도가 사용되는 세포에 의존하여 변화할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 실시예에서 사용되는 유동 속도는 어떠한 방식으로든지 제한하는 것으로 고려되지 말아야 한다. 예를 들어, 당업자는 간엽 줄기 세포 (MSC)와 같은 보다 큰 세포를 배양하는 경우, 상기 유동 속도는 분당 10 mm에 도달할 수 있고 마크로파아지와 같은 보다 큰 세포에 대해서도 유동 속도는 20 mm (데이터는 나타내지 않음)에 도달 할 수 있다.
실시예 1: 고밀도 세포 배양물의 성장
목적: 세포의 고밀도 배양.
방법:
세포들 (T 세포 림프구)는 ml 당 약 4백만 세포의 이들 세포에 대해 최대 공지된 세포 밀도에서 시작하여, 7일 동안 150 ml의 배지와 함께 50평방 cm 천공된 장벽 시스템 상에서 성장시켰다. 당업계에서의 지식을 기준으로, 이것은 이들 세포가 정상적으로 계대되고 이어서 ml 당 백만 세포로 유지되는 밀도이다. 상기 배지를 관류시켜 사용되는 총 배지는 증가하였지만 챔버 내 배지의 용적은 150 ml로 유지하였다.
결과:
[표 1]
일 CM2 세포(E6/ml) 총 세포 세포/cm2
상기 데이터는 본원에 기재된 생물반응기를 사용하여 상기 세포가 이들 세포에 대해 정상적으로 예상되는 밀도 (lxl06/ml)의 24-배 초과인 밀도 (세포/ml)로 성장하였음을 보여준다. 유사하게, 상기 데이터는 cm2 당 1330만으로 개시하여 50cm2의 풋프린트를 갖는 생물반응기 시스템에서 세포를 성장시켜 (10 xl06/cm2로 보고된 최대값과는 상반되게), 본원에 기재된 생물반응기의 사용은 cm2 당 73.6 xlO6 을 갖도록 유도하였음을 보여준다.
결론: 세포는 순환 시스템의 매우 작은 풋프린트 (50 cm2)를 포함하는 생물반응기를 사용하여 고밀도로 성장시킬 수 있다. 따라서, 상기 생물반응기는 변화하는 용적 및 공급 계획에서 최적 및 적응성 세포 배양을 허용하고, 최소의 쉬어 포스 (또한 실시예 2 내지 3 참조)와 함께 폐쇄된 자동화된 방식으로 세포를 활성화하고, 조작하고, 공급하고 세척하고 제형화하기 위해 허용되는 시스템을 제공하였다. 추가의 세포 항온처리기 또는 원심분리기는 각각 세포의 배양 및 수거를 위해 요구되지 않는다.
실시예 2: 세포 배양의 비교: 생물반응기 대 조직 배양 플라스크
목적: 조직 배양 플라스크에서 세포를 배양하는 것과 50 cm2 천공된 장벽을 포함하는 생물반응기에서 세포를 배양하는 것을 비교한다.
방법:
세포 (T 세포 림프구)는 하기와 같은 동일한 디쉬에서 14일 동안 배양하였다: 관류와 함께 50 cm2 천공된 장벽 생물반응기 시스템에서, 또는 배지 변화 없는 T75 플라스크에서, 또는 4일 마다 배지 교환과 함께 T75 플라스크에서.
결과:
도 14b-14c는 2개의 대표적인 배양 실험으로부터의 성장 곡선을 제공하고, 이는 세포가 배지의 대체 (부어서 제거하고 부어서 완전히 교환), 계대 또는 컨테이너 교환의 필요 없이 50 cm2 천공된 장벽을 갖는 생물반응기 시스템에서 연속적으로 성장시킬 수 있음을 보여준다. 추가로, 폐쇄된 연속 생물반응기 시스템 (황색)에서 성장된 세포는 적어도 14일 동안 계속 증식시키고, 총 세포 수 1,633,996,000개의 세포를 성취하고 이것은 배지 교환이 없는 T75 플라스크 (회색)에서 단지 약 4,3200,000 세포, 및 배지가 교환되는 T75 플라스크 (청색)에서 단지 약 300,000,000 세포와 비교되었다. 14-일 시간 프레임은 생물반응기 내 세포의 성장이 1주 후 플라스크 내 성장을 능가한다는 사실을 기반으로 사용하였다. 세포는 생물반응기에서 2주 초과 동안 배양할 수 있다 (데이터는 나타내지 않음).
결론:
본원에 기재된 생물반응기 시스템에서 세포의 배양은 심지어 배지가 교환된 플라스크에서의 세포 배양 보다 더 효과적이다.
실시예 3: 생물반응기 내에서 성장한 세포의 프로세싱
목적: 세포 (또는 미생물)의 프로세싱은 세포의 세척, 배지의 대체 및 세포의 농축을 포함한다. 이들 단계는 정상적으로 반복적인 원심분리 및 세포의 펠렛화에 의해 선행 기술 분야에서 성취된다. 배지 대체를 위해 당업계에 공지된 2개의 추가의 기술이 있고, 이들은 TFF (접선 방향 힘 여과) 원심분리 및 역류 원심분리이다. 본 실시에의 목적은 회수된 세포의 생존능을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기로부터의 세포 회수를 조사하는 것이다.
방법:
사용된 생물반응기 시스템에서 (도 15a에 입증된), 세포를 세척하고 성장 배지를 대체하기 위해, 세척 완충액은 생물반응기 용기의 바닥 (하부 챔버 (1550)로부터 하류 (1510)로 관류시키고, 여기서, 세척 완충액은 제1 천공된 장벽 (1512)을 통해 상부 챔버 (1540)로 유동하고 가장 높은 밸브 (1530)로부터 추출하였다. 상기 관류 유동은 성장 배지가 세척 용액에 의해 대체될때까지 배지를 희석시켰다. 일부 구현예에서, 밸브 (1530)는 (액체 변화 동안에) 세포가 생물반응기를 이탈하지 못하도록 구성되는, 천공된 장벽 또는 필터 (나타내지 않음)를 포함할 수 있다.
이 시점에서, 최종 제형 배지는 세척 완충액을 대체하면서, 시스템을 통해 관류될 수 있다. 추가로, 일부 구현예에서, 성장 배지의 일부는 세포가 위치하는 수준 때까지 상부 챔버로부터 인출 제거 (임의로 세포가 생물반응기를 이탈하지 못하도록 구성된 제2 스크리닝 천공된 장벽 (도 15a 1502)을 통해)될 수 있고 이로써 최종 제형화 배지가 관류되기 전에 용적을 감소시키고 세포를 농축시킨다 (도 15a). 도 15a에서 입증된 바와 같이, 역위된 절두원추 형태를 갖는 제공된 생물반응기는 세포 (또는 미생물) 성장 매쓰가 세척 용액의 상향 유동 (중력 방향에 반대로) 및 압력 평형 (매쓰 중력 대 상향 액체 유동)으로 인해 보다 큰 표면으로 부유하고 상승하도록 한다. 추가로, 일정한 용적-유동으로 인해, 세척 용액의 보다 느린 유동은 역위된 절두원추 형태의 상부 및 보다 큰 면적에서 세포 (또는 미생물) 매쓰 (3)를 통과하고, 이는 세포 매쓰의 농축에 일조하고 세척 용액 유동에 의해 적용된 전단력을 감소시킨다.
또 다른 구현예에서, 세척 용액의 보다 큰 용적은 세포 수준 위에 위치된 추가의 장벽을 갖는 (도 15a를 참조하는 경우) 생물반응기를 사용하고, 상기 생물반응기를 역위시킴에 의해 (도 15b에 나타낸 바와 같이) 성장 배지와 교환될 수 있다. 생물반응기 용기는 상부 챔버 (또는 지금 하부 챔버 (1540)인 것)가 (1502) 아래 및 (1512) 위 둘다에서 천공된 장벽 및 세포 매쓰를 갖도록 전환된 것으로 구성된다. 이것은 실제로 보다 많은 배지 또는 세척 용액이 제2 장벽 (도 15b에서 장벽 (2))의 보다 큰 표면적으로 인해 하류로 관류되도록 한다. 당업자는 광범위한 표면적 상에 보다 많은 용적이 동일한 속도 (유동 속도)를 유도함으로써 세포가 제2 장벽 (도 15b에서 장벽 (2)) 근처에 체류하고 세포 매쓰의 보다 큰 용적이 세척될 수 있음을 인지할 것이다.
도 15c 및 15d는 이들의 광범위한 베이스에 대해 동일한 직경을 갖는 2개의 절두 원추 부분으로 구성된 용기를 포함하는 생물반응기 (1590)를 입증하지만, 그러나 이들의 보다 좁은 베이스는 상이한 직경을 포함할 수 있다. 2개의 부분은 이들의 보다 광범위한 (유사한) 베이스에서 함께 동축으로 연결된 다른 부분의 상부 상에 하나에 위치한다. 용기는 2개의 천공된 장벽에 의해 3개의 챔버로 나누어진다: 제1 천공된 장벽 (1505) 및 제2 (스크리닝) 천공된 장벽 (1506) (이들은 일부 구현예에 따라 생물반응기의 용기의 벽에 밀봉적으로 배치됨). 도 15c는 세포 성장 단계 동안에 생물반응기를 입증하고, 여기서, 제1 하부 챔버 (1591) (이의 바닥으로서 최고 좁은 베이스를 갖는)는 제1 천공된 장벽 (1505)을 통해 상류로 유동하는 성장 배지와 함께 제2 중앙 챔버 (1592) (이는 2개의 천공된 장벽에 의해 생성되었다)로 도입되도록 구성되고; 상기 중앙 챔버는 세포와 함께 (여기에 나타내지 않음)에 도입되고 세포를 수용하도록 구성된다. 나타낸 바와 같이, 제2 중앙 챔버 (1592)는 가장 크고/가장 넓은 횡단 표면 (1595)을 갖고, 따라서 가능 느린 배지의 유동 속도를 갖는 면적을 포함한다. 일부 구현예에 따라, 목적은 성장 단계 동안에 가장 크고/가장 넓은 면적을 통과하지 못하도록 하는 것이고; 이것은 예를 들어, 배지의 유동 속도를 제어함에 의해 성취될 수 있다. 가장 넓은 면적 위에, 제2 천공된 장벽 (1506)이 보여지고, 이는 상부 제3 챔버 (1593)의 바닥으로서 작용하고, 이는 세척 배지 (여기서, 나타내지 않음)와 함께 도입되도록 구성된다.
도 15d는 세척 단계 동안에 이의 전환되거나 역위된 위치에서 생물반응기 (1590)를 입증한다. 세척 단계 동안에, 세척 배지는 제3 챔버 (1593) (나타내지 않음)을 통해 하류로 도입되고 이어서 중앙 챔버 (1592)에서 수용된 세포 매쓰를 통해 아래로 도입됨에 이어서 제3 챔버 (1593)를 통해 인출 제거된다. 제2 천공된 장벽 (1506)은 세포가 통과되지 못하도록 구성되고; 따라서, 세척된 세포는 제2 중앙 챔버에 보유된다.
일부 구현예에 따라, 도 15c 및 15d에 입증된 것과 같은 생물반응기 구성 (용기의 하나의 베이스는 다른 것보다 넓다)은 2 단계로 세포를 성장시키기 위해 사용될 수 있다. 제1 단계에서, 성장은 도 15c에서 입증된 바와 같이 보다 작은 베이스가 아래로 향하는 곳에서 개시할 수 있고, 매우 낮은 양의 세포가 보다 높은 표면적으로 성장하도록 한다. 세포 매쓰가 성장하는 경우의 제2 단계에서, 세포가 또 다른 생물반응기의 보다 큰 챔버로 이동하는 것 대신, 생물반응기 (1590)는 도 15d에 나타낸 바와 같이 지금 보다 광범위한 베이스가 아래로 향하도록 전환되거나 역위될 수 있도록 하여, 세포 매쓰가 보다 큰 표면적이 되게하고 배지의 유동 속도가 저하되도록 한다.
하류 세척/수거 프로세스는 단일 천공된 장벽을 갖는 생물반응기의 구현예에서 시험하였고, 여기서, 3개의 상이한 표면 속도는 천공된 장벽 근처에서 조사하였다: 3.6 mm/min, 1.8 mm/min, 및 1.2 mm/min. 깊은 튜브와 함께 배지의 제거 후 (도 15a) 성장 배지 내 15 ml의 세포를 유지하였다. 사용되는 총 세척 용적은 600 ml였고, 여기서, 세포를 포함하는 액체의 최종 용적은 다시 15 ml로 감소하였다. 배지 대체는 40 사이클 동안 수행하였다 (40(40) x 15 ml 세척 = 600 ml 총 세척 용적). 대체될 수 있는 배지의 용적에는 제한이 없다.
결과:
액체 용액의 교환 동안에 유동 속도의 효과를 조사하기 위해, 하류 세척/수거에 사용되는 액체 용적은 유지시켰지만 액체가 유동하는 속도는 상이하였다. 따라서, 보다 짧은 기간에서의 교환은 보다 높은 유동의 결과이고 보다 긴 기간에서의 교환은 보다 낮은 유동 속도의 결과이다.
3.6 mm/min에서 배지 교환 30분 후, 회수된 세포의 60.3%는 87.8%의 생존능을 갖는다. 1.8 mm/min에서 배지 교환의 60분 후, 91% 생존능을 갖는 100%의 세포가 회수되었다. 1.2 mm/min에서 배지 교환의 90분 후, 92.1% 생존능을 갖는 100 %의 세포가 회수되었다.
결론:
배지 대체는 5용적의 희석물을 대체하는, TFF와 같은 당업계에 공지된 다른 방법과 유사하였다. 유의적으로, 세포를 세척하고 수거하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용하는 것은 사용되는 낮은 유동 속도가 훨씬 적은 전단력과 함께 함께 1,000 내지 10,000배 낮았기 때문에 연속 유동 원심분리 (분당 1-2 리터)의 높은 유동 속도 및 전단력을 회피한다.
본원에 기재된 생물반응기 및 이의 시스템의 특정 특성은 본원에서 도해되고 기재되었고, 많은 변형, 치환, 변화 및 등가물은 현재 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 첨부된 청구항은 본원에 기재된 생물반응기 및 이의 시스템의 진정한 취지 내에 속하는 모든 상기 변형 및 변화를 커버하는 것으로 의도되는 것으로 이해되어야 한다.
Claims (33)
- 세포 또는 미생물을 그 안에 성장시키기 위한 생물반응기로서, 상기 생물반응기는:
- 그 안에 공간을 둘러싸는 밀폐된 용기;
- 그 안에 다수의 공극을 갖는 제1 장벽으로서, 상기 제1 장벽은 공간이 제1 하부 챔버와 제2 상부 챔버로 분할되도록 구성된 공간 내 밀폐적으로 배치되며, 여기서, 상기 제2 챔버는 그 안에 성장하는 세포 또는 미생물을 수용하도록 구성되어 있고 상기 공극의 직경이 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버 사이에서 그리고 그 반대에서만 유체 유동이 가능하도록 구성되고, 여기서 상기 제1 장벽이 상기 용기에서 성장된 세포들 또는 미생물이 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버 사이를 통과하도록 하지 않고, 상기 다수의 공극은 100 마이크로미터 미만의 크기를 가지고, 여기서, 상기 밀폐된 용기가 제1 방향으로 배치될 때, 적어도 상기 제2 챔버가 상기 제2 챔버의 바닥에서 상부까지 증가하는 횡단면 면적을 포함하고, 상기 밀폐된 용기가 제1 방향으로 배치될 때, 상기 증가하는 횡단면 면적은 상기 제2 챔버 내에 배치된 유체에서 유체 속도 구배를 제공하도록 구성되어 상기 유체의 속도가 상기 제1 장벽으로부터 유체의 상부 표면으로의 방향으로 감소되도록 하는, 제1 장벽,
- 상기 유체를 상기 제1 챔버로 도입하기 위한 하나 이상의 유체 유입구 포트; 및
- 상기 유체를 상기 제2 챔버로부터 유출하도록 하기 위한 하나 이상의 유출구 포트를 포함하고; 여기서 유체 유동은 상류 유동을 포함하고,
상기 밀폐된 용기는 상기 제1 방향에 대해 역위된 제2 방향으로 배치되도록 구성되는, 생물반응기. - 청구항 1에 있어서, 상기 생물반응기가 그 안에 다수의 공극을 갖는 정렬 장벽을 추가로 포함하고; 상기 정렬 장벽이 상기 제1 챔버 아래 제1 챔버의 공간 내에 밀봉적으로 배치되고; 상기 정렬 장벽이 상기 유체 유동을 정렬하고, 상기 유체 유동의 속도를 제어하며, 버블 통과를 방지하도록 구성되는, 생물반응기.
- 청구항 2항에 있어서, 상기 정렬 장벽의 공극이 원뿔 형태를 포함하는, 생물반응기.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물반응기가 그 안에 다수의 공극을 갖는 추가의 스크리닝 장벽을 추가로 포함하고; 상기 스크리닝 장벽이 상기 제2 챔버의 상부 섹션에서 상기 제2 챔버의 공간 내에 배치되어 상기 성장하는 세포 또는 미생물이 상기 제1 장벽과 상기 스크리닝 장벽 사이에 수용되고; 상기 스크리닝 장벽이 세포 통과를 방지하도록 구성되는, 생물반응기.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 횡단면의 형태가 원형, 타원형, 다각형 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 생물반응기.
- 청구항 1에 있어서, 하기 중 적어도 하나가 딱 들어맞는 생물반응기:
- 상기 하나 이상의 유체 유출구가 상기 제2 챔버의 높이를 따라 상이한 위치에서 개방하는 다수의 유체 유출구 포트를 포함한다;
- 상기 제1 장벽이 상기 용기의 벽에 접하여 배치된다;
- 상기 생물반응기 용기는 적어도 2개 부분으로 구성된다;
- 상기 용기의 형태가 원뿔 형태, 절두원추 형태, 테이퍼링 형태, 원통형 형태, 다각형 프리즘 형태, 타원 횡단면을 갖는 테이퍼링 형태, 다각형 횡단면을 갖는 테이퍼링 형태, 원통형 부분 및 테이퍼링 부분을 갖는 형태 및 원뿔형 또는 테이퍼 부분 및 반구형 부분을 갖는 형태 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다;
- 적어도 상기 하나 이상의 유체 유출구 포트의 적어도 하나가 펌프에 유동적으로 연결되도록 구성되고, 상기 펌프가 제2 챔버로부터 유체를 수용하도록 구성되고, 임의로, 여기서, 상기 펌프가 추가로 유체를 상기 유체 유입구 포트 중 적어도 하나를 통해 상기 제1 챔버로 다시 재순환시키도록 구성된다;
- 상기 유체가 성장 배지, 세척 용액, 영양 용액, 수거 용액, 수확 용액, 저장 용액 및 이들의 임의의 조합물 중 임의의 하나를 포함한다;
- 상기 제1 챔버의 공극들 각각의 직경은 0.1 내지 40 마이크로미터 사이에서 선택된다; 그리고
- 이들의 임의의 조합물. - 청구항 1에 있어서, 상기 제1 장벽이 고정된 이동 가능하지 않은 장벽이고, 상기 장벽이 편평한 장벽, 상기 생물반응기의 종축으로 특정 각도로 기울어진 편평한 장벽, 상기 용기의 상부와 대면하는 오목한 상부 표면을 갖는 오목한 장벽, 테이퍼링 장벽 및 원뿔형 장벽에서 선택되는, 생물반응기.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물반응기가 상기 생물반응기로부터 세포를 수확하도록 구성된 상기 제1 장벽의 상부 표면에 인접하게 배치된 적어도 하나의 수확 포트를 추가로 포함하는, 생물반응기.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물반응기가 상기 세포 또는 미생물을 지지하기 위해 제2 챔버내에 배치된 지지 매트릭스를 추가로 포함하는, 생물반응기.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물반응기가 작동적으로 커플링되어 있고
상기 용기 내 유체의 하나 이상의 화학적 및/또는 물리적 성질을 감지하도록 구성된 하나 이상의 센서를 포함하는 적어도 하나의 센서 유닛;
하나 이상의 유체 유출구 포트 및 유체 유입구 포트 내 유체의 유동을 제어하도록 구성된 다수의 제어 가능하게 개방될 수 있고 폐쇄될 수 있는 밸브;
유체 저장소로부터 새로운 액체 유체의 펌프의 유입구 포트로의 유동을 제어하도록 구성된 제어 가능하게 개방 가능하고 폐쇄 가능한 밸브;
상기 용기 내 유체를 가열하도록 구성된 가열기 유닛;
상기 용기 내 유체를 냉각하도록 구성된 냉각 유닛; 및
산소 공급원으로부터의 산소를 포함하는 가스의 상기 용기내 배치된 가스 분산 헤드로의 유동을 제어하도록 구성된 가스 밸브 중 적어도 하나를 제어하도록 구성된 제어기를 추가로 포함하는, 생물반응기. - 생물반응기에서 세포 또는 미생물을 성장시키기 위한 방법으로서, 상기 생물반응기는;
- 그 안에 공간을 둘러싸는 밀폐된 용기;
- 그 안에 다수의 공극을 갖는 제1 장벽으로서, 상기 제1 장벽은 공간이 제1 하부 챔버와 제2 상부 챔버로 분할되도록 구성된 공간 내 밀폐적으로 배치되며, 여기서, 상기 제2 챔버는 그 안에 성장하는 세포 또는 미생물을 수용하도록 구성되어 있고 상기 공극의 직경이 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버 사이에서 그리고 그 반대에서만 유체 유동이 가능하도록 구성되고, 여기서 상기 제1 장벽이 상기 용기에서 성장된 세포들 또는 미생물이 상기 제1 챔버와 상기 제2 챔버 사이를 통과하도록 하지 않고, 상기 다수의 공극은 100 마이크로미터 미만의 크기를 가지고, 여기서, 상기 밀폐된 용기가 제1 방향으로 배치될 때, 적어도 상기 제2 챔버가 상기 제2 챔버의 바닥에서 상부까지 증가하는 횡단면 면적을 포함하고, 상기 밀폐된 용기가 제1 방향으로 배치될 때, 상기 증가하는 횡단면 면적은 상기 제2 챔버 내에 배치된 유체에서 유체 속도 구배를 제공하도록 구성되어 상기 유체의 속도가 상기 제1 장벽으로부터 유체의 상부 표면으로의 방향으로 감소되도록 하는, 제1 장벽,
- 상기 유체를 상기 제1 챔버로 도입하기 위한 하나 이상의 유체 유입구 포트; 및
- 상기 유체를 상기 제2 챔버로부터 유출하도록 하기 위한 하나 이상의 유출구 포트를 포함하고; 여기서 유체 유동은 상류 유동을 포함하고;
상기 밀폐된 용기는 상기 제1 방향에 대해 역위된 제2 방향으로 배치되도록 구성되고,
상기 방법은;
- 상기 밀폐된 용기를 상기 제1 방향으로 배치하는 단계;
- 세포 또는 미생물을 상기 생물반응기의 상기 제2 챔버로 도입하는 단계;
- 상기 세포 또는 미생물에 상기 유체를 관류시키고, 상기 관류는 상기 생물반응기 내 상기 유체의 유동 수준 및/또는 유동 속도를 제어함을 포함하는 단계;
- 상기 세포 또는 미생물을 목적하는 농도까지 성장시키는 단계; 및
- 상기 생물반응기로부터 상기 세포 또는 미생물을 수확하는 단계를 포함하는, 방법. - 청구항 13에 있어서, 상기 관류 단계가 상기 제1 장벽을 통해 상기 유체를 재순환시키는 단계이거나;
상기 유체를 산소화시키는 단계이거나;
상기 유체를 상기 제1 챔버를 통해 상기 제2 챔버내로 상기 제1 장벽을 통해 관류시키는 단계; 또는
이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는, 방법. - 청구항 14에 있어서, 상기 재순환시키는 단계가
- 새로운 유체의 양을 상기 생물반응기에 첨가하는 단계; 및
- 상기 생물반응기로부터 상기 유체의 양을 인출하는 단계 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 방법. - 청구항 13에 있어서,
- 상기 방법은 상기 제2 챔버 내 상기 유체의 수준을 증가시키는 단계를 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 상기 세포 또는 미생물을 세척하는 하나 이상의 단계를 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 상기 제2 챔버 내 상기 유체의 용적을 감소시킴에 의해 상기 세포를 농축시키는 단계를 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 세포 매쓰 상에 적용되는 중력과 상류 유체 유동의 선택된 속도 간의 균형으로 인해, 상기 제2 챔버 내 특정 영역에서 부유 위치에서 세포 매쓰를 유지하는 단계를 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 상기 세포를 추가의 상이한 세포와 함께 동시 배양하는 단계를 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 상기 제2 챔버의 헤드스페이스에서 산소와 CO2를 포함하는 가스 물질의 농도를 제어하는 단계를 추가로 포함하거나; 상기 방법은 유체의 용해된 산소 수준과 pH 수준 중 적어도 하나를, 관류 및 조종하는 단계 중 적어도 하나를 통해 제어하는 단계를 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 사이토킨을 상기 배양 배지에 첨가하거나 상기 세포를 사이토킨을 부착하는 사이토킨 분비 세포와 함께 동시 배양하는 단계를 추가로 포함하거나;
- 상기 방법은 상기 장벽을 항체로 코팅하는 단계를 추가로 포함하거나; 또는
- 이의 임의의 조합을 포함하는, 방법. - 청구항 13에 있어서, 상기 세포가 접착성 세포이고 상기 방법이, 상기 세포가 상기 제2 챔버내에 배치된 하나 이상의 표면에 부착되도록 하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 하나 이상의 표면이 상기 제1 장벽의 상부 표면, 상기 제2 챔버의 벽의 표면, 상기 제2 챔버 내에 배치된 세포 지지 매트릭의 표면 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 청구항 16에 있어서,
- 상기 세포는 T-세포이고 추가의 상이한 세포는 사이토킨 분비 세포이거나;
- 상기 세포는 T-세포이고 추가의 상이한 세포는 항원 제시 세포이거나;
- 상기 세포는 배아 줄기 세포이고 추가의 상이한 세포는 피더 세포인, 방법. - 청구항 13에 있어서,
상기 방법은:
- 상기 세포를 성장시키는 단계 후, 그리고 상기 세포를 수확하는 단계 이전에 상기 밀폐된 용기를 상기 제2 방향으로 역위하는 단계; 및
- 상기 밀폐된 용기를 역위하는 단계 후, 그리고 상기 세포를 수확하는 단계 이전에 상기 세포를 세척하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 세포를 도입하고, 관류시키고, 제어하고, 성장시키고, 세척하고, 수확하는 단계가 연속적이고 상기 제2 챔버에서 또는 이로부터 수행되는, 방법. - 삭제
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