KR102400532B1 - Compositions for enhancing reprogramming and angiogenesis of induced endothelial cells - Google Patents

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Abstract

본 발명은 섬유아세포와 포스콜린(forskolin)을 포함하는 혈관내피세포 생산용 조성물, 상기 조성물을 이용하여 혈관내피세포를 생산하는 방법, 포스콜린과 섬유아세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 및 상기 약학조성물을 이용하여 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 이용하면, 생체내에서도 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 교차분화를 유도할 수 있으므로, 다양한 혈관계 질환 또는 허혈성 질환의 치료제 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a composition for producing vascular endothelial cells comprising fibroblasts and forskolin, a method for producing vascular endothelial cells using the composition, and a pharmaceutical for preventing or treating ischemic disease including forskolin and fibroblasts It relates to a method for preventing or treating an ischemic disease using the composition and the pharmaceutical composition. The composition of the present invention can induce cross-differentiation of vascular endothelial cells from fibroblasts even in vivo, and thus can be widely used in the development of therapeutic agents for various vascular diseases or ischemic diseases.

Description

유도 혈관내피세포의 직접교차 분화 효율 및 혈관 형성능 증강을 위한 조성물{Compositions for enhancing reprogramming and angiogenesis of induced endothelial cells}Compositions for enhancing reprogramming and angiogenesis of induced endothelial cells

본 발명은 유도 혈관내피세포의 직접교차 분화 효율 및 혈관 형성능 증강을 위한 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 섬유아세포와 포스콜린(forskolin)을 포함하는 혈관내피세포 생산용 조성물, 상기 조성물을 이용하여 혈관내피세포를 생산하는 방법, 포스콜린과 섬유아세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 및 상기 약학조성물을 이용하여 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for enhancing the direct cross-differentiation efficiency and angiogenesis ability of induced vascular endothelial cells, and more particularly, the present invention relates to a composition for producing vascular endothelial cells comprising fibroblasts and forskolin, the composition It relates to a method for producing vascular endothelial cells using a pharmaceutical composition for preventing or treating ischemic disease, including forskolin and fibroblasts, and a method for preventing or treating ischemic disease using the pharmaceutical composition.

허혈성 질환은 혈관이 비정상적으로 좁아지거나 손상되어 혈류가 막히는 결국 말초에 혈액이 충분히 공급되지 못하여 조직이 괴사되는 혈관계 질환이다. 허혈성 질환은 동맥 경화, 당뇨, 고혈압, 신장 질환 등 다양한 질환의 2차적인 합병증으로 유발될 수 있다. 2015년 기준으로 전세계에 약 15억 5천만명의 허혈성 질환 환자가 있으며, 약물 처치나 혈관 내 스텐트 삽입 등 부분적인 치료는 가능하나 치료 방법 및 적용 범위가 매우 제한적이다. 따라서 본 기술에서는 허혈성 질환을 근본적으로 치료하기 위한 환자 맞춤형 세포 치료제 개발을 위해 유도 혈관내피세포를 효율적으로 구축하였으며, 생체 내에서의 기능성 또한 확보하였다. An ischemic disease is a vascular disease in which blood vessels are abnormally narrowed or damaged and blood flow is blocked, eventually causing tissue necrosis due to insufficient blood supply to the periphery. Ischemic diseases can be caused as secondary complications of various diseases, such as arteriosclerosis, diabetes, high blood pressure, and kidney disease. As of 2015, there are about 1.55 billion ischemic disease patients worldwide, and partial treatment such as drug treatment or intravascular stent insertion is possible, but the treatment method and scope are very limited. Therefore, in the present technology, induced vascular endothelial cells were efficiently constructed for the development of a patient-specific cell therapy for fundamental treatment of ischemic diseases, and functionality in vivo was also secured.

직접 교차 분화 기술이란 특정 전사 인자의 과발현을 통해 하나의 성숙한 체세포로부터 다른 계통의 성숙한 체세포로 직접적으로 전환시킬 수 있는 기술이다. 사람의 체세포에 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 등을 과발현 시켜 확립한 유도 만능 줄기세포로부터 분화한 세포들이 세포 치료제로서 개발 되고 있기는 하나, 체내에서 기형종 (teratoma) 등의 종양을 생성할 수 있다는 위험성이 있어 이를 대체할 방법들이 지속적으로 연구되고 있다. 직접 교차 분화는 다능성 (pluripotency) 단계를 거치지 않고 계통 간의 직접적인 전환이 가능하므로 안전성 측면에서 유도 만능 줄기세포를 대체할 수 있는 세포 치료제로서 각광받고 있다. 현재까지 전세계적으로 신경 줄기세포, 심근세포, 간세포 등을 비롯한 다양한 계통의 세포가 직접교차 분화를 통해 확립되고 있으며 이를 임상적으로 이용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. Direct cross-differentiation technology is a technology that can directly convert one mature somatic cell to another mature somatic cell through overexpression of a specific transcription factor. Although cells differentiated from induced pluripotent stem cells established by overexpressing Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, etc. in human somatic cells, are being developed as cell therapeutics, they can generate tumors such as teratoma in the body. There is a risk that there is a risk, so alternative methods are continuously being studied. Direct cross-differentiation is attracting attention as a cell therapy that can replace induced pluripotent stem cells in terms of safety because direct cross-differentiation is possible without going through the pluripotency stage. Until now, cells of various lineages, including neural stem cells, cardiomyocytes, and hepatocytes, have been established through direct cross-differentiation around the world, and research to use them clinically is in progress.

그 중에서도 다른 계통의 체세포로부터 혈관 내피세포로의 유도는 ETV2라는 전사 인자에 의해 매개된다. ETV2는 혈액 및 내피계통 발생 단계에서 필수적인 인자로 알려져 있으며, 발생 초기 단계에 발현되었다가 발생이 진행됨에 따라 그 발현이 줄어들고 성숙한 체세포에서는 발현되지 않는다고 밝혀져 있다. Among them, the induction of vascular endothelial cells from other lineages of somatic cells is mediated by a transcription factor called ETV2. ETV2 is known to be an essential factor in blood and endothelial lineage development, and it has been found that it is expressed at an early stage of development, but its expression decreases as development progresses, and is not expressed in mature somatic cells.

cAMP는 생체 신호 전달 체계의 second messenger 중에 하나로써, adenylyl cyclase 효소에 의해 ATP가 cAMP로 전환되면서 PKA (protein kinase A) 나 EPAC (exchange proteins activated by cAMP) 등의 하위 신호전달 체계를 활성화 시키게 된다. 이렇게 활성화 된 신호들은 이화 작용을 비롯한 생체의 다양한 기전들을 조절하게 된다. 그 중에서도 EPAC는 small G protein Rap의 guanine nucleotide exchange factor로서 작용하여 Rap에 결합되어 있는 GDP를 GTP로 전환시켜 주는 역할을 하며, cAMP/PKA pathway와 독립적으로 작용한다. EPAC은 혈관 내피세포의 장벽 기능 (barrier function) 및 세포 내 골격기관의 개량 과정 (cytoskeleton reorganization) 을 조절하는 것으로 알려져 있다. cAMP/PKA pathway는 쥐 배아줄기세포 (mouse embryonic stem cells)에서 내피 계통으로의 분화를 촉진하는 것이 이미 밝혀져 있다. 하지만 직접 교차 분화를 통해 유도 혈관내피세포가 생성되는 과정이 어떠한 기전에 의해 매개되는 지는 알려진 바가 없다. cAMP is one of the second messengers of the biological signal transduction system. As ATP is converted to cAMP by adenylyl cyclase enzyme, it activates lower signaling systems such as PKA (protein kinase A) and EPAC (exchange proteins activated by cAMP). These activated signals regulate various mechanisms in the body, including catabolism. Among them, EPAC acts as a guanine nucleotide exchange factor for small G protein Rap, converting GDP bound to Rap into GTP, and works independently of the cAMP/PKA pathway. EPAC is known to regulate the barrier function of vascular endothelial cells and the reorganization process of intracellular skeletal organs (cytoskeleton reorganization). It has already been shown that the cAMP/PKA pathway promotes the differentiation of mouse embryonic stem cells into endothelial lineages. However, it is not known by what mechanism the process of induced vascular endothelial cell generation through direct cross-differentiation is mediated.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 혈관내피세포로의 교차분화를 유도할 수 있는 물질을 발굴하고자 예의 연구노력한 결과, 포스콜린(forskolin)이 섬유아세포를 교차분화시켜서 혈관내피세포를 생성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Under this background, the present inventors made intensive research efforts to discover substances capable of inducing cross-differentiation into vascular endothelial cells. As a result, it was confirmed that forskolin can cross-differentiate fibroblasts to generate vascular endothelial cells. and completed the present invention.

본 발명의 주된 목적은 섬유아세포와 포스콜린(forskolin)을 포함하는 혈관내피세포 생산용 조성물을 제공하는 것이다.The main object of the present invention is to provide a composition for producing vascular endothelial cells comprising fibroblasts and forskolin.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 혈관내피세포를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing vascular endothelial cells using the composition.

본 발명의 또 다른 목적은 포스콜린과 섬유아세포를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating ischemic disease comprising forskolin and fibroblasts.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학조성물을 이용하여 허혈성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating ischemic disease using the pharmaceutical composition.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 섬유아세포 및 포스콜린(forskolin)을 포함하는 혈관내피세포 생산용 조성물을 제공한다.One embodiment of the present invention for achieving the above object provides a composition for producing vascular endothelial cells comprising fibroblasts and forskolin.

본 발명자들은 섬유아세포를 혈관내피세포로 교차분화시키는 방법을 개발한 결과, 포스콜린을 사용할 경우, 섬유아세포의 교차분화를 유도하여 혈관내피세포를 생성할 수 있음을 확인하였다.As a result of developing a method for cross-differentiation of fibroblasts into vascular endothelial cells, the present inventors confirmed that forskolin could induce cross-differentiation of fibroblasts to generate vascular endothelial cells.

따라서, 상기 포스콜린은 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 생성을 유도하는 혈관내피세포 생산용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.Therefore, the forskolin can be used as an active ingredient of a composition for producing vascular endothelial cells that induces the production of vascular endothelial cells from fibroblasts.

본 발명의 용어 "교차분화(direct reprogramming/ direct conversion/ transdifferentiation)"란, 직접교차분화라고도 호칭되며, 전혀 다른 세포형태를 가지도록 분화가 종료된 성숙한 세포간의 전환을 유도하는 기술을 의미한다. 즉, 최종적으로 분화된 세포에 유전자 또는 화합물을 도입하여 목적하는 다른 형태의 분화세포로 전환시키는 기술로 정의할 수 있다. 이러한 교차분화기술은 종래의 분화기술에서 사용되었던 전능성 단계(pluripotent state), 즉 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSCs)로 리프로그래밍하고 이를 재분화하는 단계를 경유하지 않고 목적하는 특정 세포로 직접 전환시킨다는 점에서 지금까지 사용되었던 분화기술과 구별된다.As used herein, the term “direct reprogramming/direct conversion/transdifferentiation”, also referred to as direct cross-differentiation, refers to a technique for inducing conversion between mature cells whose differentiation has been completed to have completely different cell types. That is, it can be defined as a technology for converting into a different type of differentiated cell of interest by introducing a gene or compound into the finally differentiated cell. This cross-differentiation technology is a pluripotent state used in conventional differentiation technology, that is, reprogramming into induced pluripotent stem cells (iPSCs) and re-differentiation directly into a specific target cell without going through the step. It is different from the differentiation technology used so far in that it converts it.

본 발명에 있어서, 상기 교차분화는 섬유아세포에 포스콜린을 처리하여 혈관내피세포를 생성하는 방법으로 해석될 수 있다. In the present invention, the cross-differentiation can be interpreted as a method of generating vascular endothelial cells by treating fibroblasts with forskolin.

본 발명의 용어 "섬유아세포(fibroblast)"란, 섬유세포라고도 호칭되며, 외관적으로는 편평하고 길쭉한 외형을 나타내고 불규칙한 돌기를 보이며, 세포질은 미토콘드리아, 골지체, 중심체, 소지방체 등을 포함하고, 핵은 염색성이 약한 타원형이며, 인을 함유하고, 전체적으로 교원섬유에 밀접해 존재하는 세포를 의미한다.The term "fibroblast" of the present invention is also called a fibroblast, and has a flat and elongated appearance and irregular projections in appearance, and the cytoplasm includes mitochondria, Golgi bodies, centrosomes, small fat bodies, etc., The nucleus refers to a cell that is oval in shape with weak staining, contains phosphorus, and exists in close proximity to the collagen fibers as a whole.

본 발명에 있어서, 상기 섬유아세포는 교차분화 기술에 의해 혈관내피세포의 생산에 사용되는 원료인 것으로 해석될 수 있다.In the present invention, the fibroblasts can be interpreted as a raw material used for the production of vascular endothelial cells by the cross-differentiation technique.

본 발명의 용어 "포스콜린(forskolin)"이란, 인도에 자생하는 식물의 일종인 Coleus forskohli의 근경에서 추출한 디테르펜류 화합물을 의미한다. 약리학적으로는 심근수축력의 증가나 혈압 강하 등의 심혈관작용이 있다고 알려져 있다. 이러한 포스콜린은 주로 아데닐산고리화효소의 촉매소단위를 직접 활성화하며 세포내 cAMP의 농도를 상승시키는 효과를 나타낸다고 추측되고 있다.As used herein, the term "forskolin" refers to a diterpene compound extracted from the rhizome of Coleus forskohli, a kind of plant native to India. Pharmacologically, it is known to have cardiovascular effects such as increasing myocardial contractility and lowering blood pressure. Such forskolin mainly directly activates the catalytic subunit of adenylate cyclase, and it is speculated that it has the effect of increasing the concentration of cAMP in the cell.

본 발명에 있어서, 상기 포스콜린은 섬유아세포의 교차분화를 유도하여 혈관내피세포를 생산하는 직접적인 원인물질로서 해석될 수 있다.In the present invention, the forskolin can be interpreted as a direct causative agent for producing vascular endothelial cells by inducing cross-differentiation of fibroblasts.

본 발명의 용어 "혈관내피세포(vascular endothelial cell)"란, 혈관내강이 배접하여 내막을 구성하는 한 층의 중배엽기원 세포를 의미한다. 생체내에서는, 내피세포유래 평활근 이완유도, 혈관수축작용을 하는 엔도텔린 등의 생산에 의한 혈관긴장성 조절능, 혈액응고의 조절, 혈관투과성 조절, 물질교환, 백혈구세포와의 상호작용에 의한 생체방어 등의 다양한 기능을 나타낸다고 알려져 있다.As used herein, the term "vascular endothelial cell" refers to a single layer of cells of mesoderm origin that constitute the inner membrane by lining the vascular lumen. In vivo, endothelial cell-derived smooth muscle relaxation induction, vascular tone control ability by production of endothelin, which has a vasoconstrictive action, blood coagulation regulation, vascular permeability regulation, substance exchange, and biological defense by interaction with white blood cells It is known to exhibit various functions such as

본 발명에 있어서, 상기 혈관내피세포는 섬유아세포의 교차분화에 의해 생산되는 최종 목적물질인 것으로 해석될 수 있다.In the present invention, the vascular endothelial cells can be interpreted as the final target material produced by cross-differentiation of fibroblasts.

본 발명의 다른 실시양태는 상기 조성물을 이용하여 혈관내피세포를 생산하는 방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a method for producing vascular endothelial cells using the composition.

구체적으로, 본 발명의 혈관내피세포 생산방법은 분리된 섬유아세포를 포스콜린을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.Specifically, the method for producing vascular endothelial cells of the present invention includes culturing the isolated fibroblasts in a medium containing forskolin.

본 발명에서 제공하는 혈관내피세포 생산방법에 있어서, 상기 배양하는 단계는 직접교차분화를 유도하는 과정에 해당하는 것으로 해석될 수 있다.In the method for producing vascular endothelial cells provided in the present invention, the culturing may be interpreted as corresponding to a process of inducing direct cross-differentiation.

상기 섬유아세포의 배양에 사용되는 배지로서는 당업계에서 섬유아세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 예를 들면 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 또는 Keratinocyte-SFM(Keratinocyte serum free medium)을 사용할 수 있다.As the medium used for culturing the fibroblasts, a conventional medium known to be suitable for culturing fibroblasts in the art may be used, for example, DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) or Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium). can be used

상기 섬유아세포 배지는 첨가제로 보충될 수 있다. 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.The fibroblast medium may be supplemented with additives. In general, it may contain a neutral buffer (such as phosphate and/or high concentration of bicarbonate) and protein nutrients (such as serum such as FBS, serum replacement, albumin, or essential and non-essential amino acids such as glutamine) in isotonic solution. Furthermore, lipids (fatty acids, cholesterol, HDL or LDL extracts of serum) and other components found in most stock media of this kind (such as insulin or transferrin, nucleosides or nucleotides, pyruvate, any ionized form or salt) sugar sources such as glucose, selenium, glucocorticoids such as hydrocortisone and/or reducing agents such as β-mercaptoethanol).

상기 배양시에 배지에 포함되는 포스콜린의 농도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 1 내지 50μM이 될 수 있고, 다른 예로서, 2 내지 10μM이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 5μM이 될 수 있다.The concentration of forskolin included in the culture medium during the culture is not particularly limited thereto, but as an example, may be 1 to 50 μM, as another example, may be 2 to 10 μM, and as another example, 5 μM can be

또한, 배양시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 10 내지 40일이 될 수 있고, 다른 예로서, 20 내지 30일이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 24일이 될 수 있다.In addition, the incubation time is not particularly limited thereto, but as an example, it may be 10 to 40 days, as another example, it may be 20 to 30 days, and as another example, it may be 24 days.

본 발명의 또 다른 실시양태는 포스콜린 및 섬유아세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학조성물을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating an ischemic disease comprising forskolin and fibroblasts.

상술한 바와 같이, 섬유아세포는 포스콜린에 의해 혈관내피세포로 교차분화될 수 있으므로, 상기 포스콜린 및 섬유아세포를 포함하는 조성물은 혈관내피세포의 공급이 요구되는 다양한 허혈성 질환을 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다.As described above, since fibroblasts can be cross-differentiated into vascular endothelial cells by forskolin, the composition comprising the forskolin and fibroblasts is a therapeutic agent for treating various ischemic diseases requiring supply of vascular endothelial cells. can be used

본 발명의 용어 "허혈성 질환(arthropathy)"이란, 혈류의 정지(허혈)에 의해 증상을 나타내는 질환으로서, 궁극적으로 비가역적인 세포 및 조직의 손상을 동반하는 질환을 의미한다. 혈류의 정지에 의해 조직 또는 세포로 공급되는 산소의 양이 감소하게 되는데, 이로 인해 세포의 사멸이 유발되어 조직, 기관의 기능이 저하된다. 따라서, 허혈성 질환은 일반적으로 혈류의 흐름을 증가시키거나, 혈관을 재생/신생시키는 기전으로 치료하고 있다. 상기 허혈성 질환은 다양한 하위 질환을 포함하고 있으며, 구체적으로 뇌허혈, 심장허혈, 당뇨병성 혈관심장 질환, 심부전, 심근비대증, 망막허혈, 허혈성 대장염, 허혈성 급성 신부전증, 뇌졸중, 뇌외상, 신생아 저산소증, 하지혈관 허혈성 질환 또는 사지말단부 허혈성 질환 등일 수 있으며, 더욱 구체적으로 하지혈관 허혈성 질환 또는 사지말단부 허혈성 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term "ischemic disease (arthropathy)" refers to a disease that exhibits symptoms due to cessation of blood flow (ischemia), and is ultimately accompanied by irreversible damage to cells and tissues. The amount of oxygen supplied to the tissues or cells is reduced due to the cessation of blood flow, which causes cell death and deteriorates the functions of tissues and organs. Therefore, ischemic diseases are generally treated with mechanisms that increase blood flow or regenerate/new blood vessels. The ischemic disease includes various sub-diseases, specifically cerebral ischemia, cardiac ischemia, diabetic vascular heart disease, heart failure, myocardial hypertrophy, retinal ischemia, ischemic colitis, ischemic acute renal failure, stroke, brain trauma, neonatal hypoxia, lower extremity blood vessels It may be an ischemic disease or a distal extremity ischemic disease, and more specifically, may be a lower extremity vascular ischemic disease or a distal extremity ischemic disease, but is not limited thereto.

본 발명의 용어 "치료"란, 상기 약학조성물의 투여로 허혈성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term “treatment” refers to any action in which the symptoms of ischemic disease are improved or beneficial by administration of the pharmaceutical composition.

또한, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 섬유아세포의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 1㎖ 당 1.0×105개 내지 1.0×109개, 다른 예로서 1.0×106개 내지 1.0×108개, 또 다른 예로서 1.0×107개의 세포를 포함할 수 있다.In addition, the content of fibroblasts contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited thereto, but as an example, 1.0×10 5 to 1.0×10 9 per 1 ml, and as another example, 1.0×10 6 to 1.0× 10 8 cells, as another example, may contain 1.0×10 7 cells.

본 발명에 따른 섬유아세포는 동결되지 않은 채 사용되거나 차후 사용을 위해 동결될 수 있다. 동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제 (예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife) 세포 동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에 첨가될 수 있다.Fibroblasts according to the present invention can be used undisturbed or frozen for later use. If frozen, standard cryopreservatives (eg DMSO, glycerol, Epilife Cell Freezing Medium (Cascade Biologics)) can be added to the cell population prior to freezing.

본 발명의 약학조성물은, 상기 섬유아세포의 활성을 유지시키기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학조성물은, 허혈성 질환의 치료를 위한 이식용 조성물의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may further include an appropriate carrier, excipient or diluent commonly used to maintain the activity of the fibroblasts, wherein the carrier may include a non-naturally occurring carrier. can Specifically, the pharmaceutical composition may be formulated and used in the form of a composition for transplantation for the treatment of ischemic diseases. In the present invention, carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 약학 조성물을 이용한 허혈성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. Another embodiment of the present invention provides a method for preventing or treating ischemic disease using the pharmaceutical composition.

구체적으로, 본 발명에서 제공하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료방법은 (a) 분리된 섬유아세포를 포스콜린을 포함하는 배지에서 배양하여, 직접교차분화를 유도하여 혈관내피세포를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 혈관내피세포를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함한다.Specifically, the method for preventing or treating ischemic disease provided by the present invention comprises the steps of: (a) culturing the isolated fibroblasts in a medium containing forskolin to induce direct cross-differentiation to obtain vascular endothelial cells; and (b) administering the obtained vascular endothelial cells to a subject other than a human.

본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. As used herein, the term “administration” refers to the introduction of a given substance into a subject by an appropriate method.

본 발명에 있어서, 상기 투여는 허혈성 질환이 발병된 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.In the present invention, the administration may be interpreted as meaning the act of introducing the pharmaceutical composition of the present invention to an individual having an ischemic disease.

본 발명의 용어 "개체"란, 허혈성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.As used herein, the term "individual" refers to all animals, including humans, rats, mice, and livestock that have or may develop an ischemic disease. As a specific example, it may be a mammal including a human.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및 에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의 것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson), 메드셉 (Medcep), 내셔날 호스피탈 프로덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사의 주입 백을 예시할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated and administered in a unit dosage form suitable for administration in a patient's body according to a conventional method in the pharmaceutical field, and the preparation can be administered effectively by one or several administrations. including dosage. Formulations suitable for this purpose include, for parenteral administration, injections such as ampoules for injection, injections such as infusion bags, and sprays such as aerosol formulations. The injection ampoule may be prepared by mixing with an injection solution immediately before use, and physiological saline, glucose, mannitol, Ringer's solution, etc. may be used as the injection solution. In addition, the infusion bag may be made of polyvinyl chloride or polyethylene, and may be manufactured by Baxter, Becton Dickinson, Medcep, National Hospital Products, or Terumo. The company's infusion bag can be exemplified.

상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.In the pharmaceutical formulation, in addition to the active ingredient, one or more pharmaceutically acceptable conventional inert carriers, for example, preservatives, analgesics, solubilizers or stabilizers in the case of injections, and the like, in the case of formulations for topical administration It may further include a base (base), excipients, lubricants or preservatives and the like.

본 발명에 따른 포스콜린과 섬유아세포를 포함하는 약학 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 허혈성 질환 치료용 제제와 함께 또는 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 환자의 질환 부위에 직접 생착 또는 이식하거나 복강에 직접 이식 또는 주입하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 질환부위 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다. 또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접 병변에 투여하는 것 외에 일반적 방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다. The pharmaceutical composition comprising forskolin and fibroblasts according to the present invention may be administered in the form of a mixture or together with other ischemic disease treatment agents used for transplantation and other uses using administration methods commonly used in the art. Preferably, direct engraftment or transplantation to the disease site of the patient in need of treatment, or direct transplantation or injection into the abdominal cavity is possible, but is not limited thereto. In addition, the administration can be both non-surgical administration using a catheter and surgical administration methods such as injection or transplantation after incision of the diseased site, but the non-surgical administration method using a catheter is more preferable. In addition to parenteral administration according to a conventional method, for example, directly to a lesion, transplantation by intravascular injection, which is a general method, is also possible.

상기 약학 조성물에 포함되는 섬유아세포의 1일 투여량은 일 예로서 1.0×104 내지 1.0×1010 세포/kg 체중, 다른 예로서 1.0×105 내지 1.0×109 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The daily dose of fibroblasts included in the pharmaceutical composition is, for example, 1.0×10 4 to 1.0×10 10 cells/kg body weight, and as another example, 1.0×10 5 to 1.0×10 9 cells/kg body weight once Alternatively, it may be administered in several divided doses. However, it should be understood that the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of several related factors, such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, the patient's weight, age, and sex, and, therefore, the dosage It is not intended to limit the scope of the present invention in any way.

본 발명의 조성물을 이용하면, 생체내에서도 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 교차분화를 유도할 수 있으므로, 다양한 혈관계 질환 또는 허혈성 질환의 치료제 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.The composition of the present invention can induce cross-differentiation of vascular endothelial cells from fibroblasts even in vivo, and thus can be widely used in the development of therapeutic agents for various vascular diseases or ischemic diseases.

도 1은 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 분화를 유도하는 과정 및 결과를 나타낸다.
도 2는 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 분화를 유도하는데 관여하는 유전자를 발굴한 결과를 나타낸다.
도 3은 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 분화를 유도하는 유도제를 스크리닝한 결과를 나타낸다.
도 4는 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 분화에 미치는 forskolin의 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 forskolin이 처리된 세포에서 발현된 RNA 서열 분석결과를 나타낸다.
도 6은 Forskolin에 의한 효과를 검증한 결과를 나타낸다.
도 7은 Forskolin에 의한 효과를 검증하기 위하여, ChIP sequencing 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 8은 혈관 내피세포로의 유도 과정에서 ETV2에 의해 활성화 되는 RAP1-GTP의 발현량을 분석한 결과를 나타낸다.
도 9는 RAP1의 발현억제에 따른 분화효율의 변화를 분석한 결과를 나타낸다.
도 10a는 forskolin의 처리에 따른 유도 혈관내피세포의 수득율을 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10b는 상기 유세포 분석결과를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10c는 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포의 혈관형성능을 분석한 결과를 나타낸 현미경사진이다.
도 10d는 상기 현미경사진을 통해 확인된 혈관이 갈라지는 얻어진 branching point를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10e는 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포에서 발현되는 내피세포 특이적 마커, 동맥 관련 마커 및 혈관 발생 관련 마커의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10f는 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포에서 발현되는 섬유아세포 특이적 마커의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 생체내에서 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포의 혈관형성능을 분석하는 과정을 나타낸다.
도 12는 생체내에서 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포의 혈관형성능을 분석한 결과를 나타낸다.
도 13a는 허혈성 모델에 각 세포를 투여한 후, 시간의 경과에 따른 레이저 도플러 이미징 분석을 수행하고, 그 결과를 moorLDI 프로그램애 적용하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 13b는 상기 레이저 도플러 이미징 분석을 수행한 결과 중에서, 정상 오른쪽 다리의 혈류량 대비 왼쪽 다리의 혈류량의 비율을 시간의 경과에 따라 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13c는 상기 각 허혈성 모델로부터 허혈 조직을 적출한 후, 혈관 마커인 Isolectin B4를 면역염색한 결과를 나타내는 형광현미경사진이다.
도 13d는 상기 각 허혈성 모델로부터 적출된 허혈 조직의 유도 혈관내피세포에서 미세혈관의 비율을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.1 shows the process and results of inducing differentiation of vascular endothelial cells from fibroblasts.
2 shows the results of discovering genes involved in inducing differentiation of vascular endothelial cells from fibroblasts.
3 shows the results of screening an inducer for inducing differentiation of vascular endothelial cells from fibroblasts.
4 shows the results of confirming the effect of forskolin on the differentiation of vascular endothelial cells from fibroblasts.
5 shows the results of analysis of RNA sequences expressed in forskolin-treated cells.
6 shows the results of verifying the effect of Forskolin.
7 shows the results of ChIP sequencing analysis to verify the effect of Forskolin.
8 shows the results of analysis of the expression level of RAP1-GTP activated by ETV2 during induction into vascular endothelial cells.
9 shows the results of analyzing the change in differentiation efficiency according to the suppression of RAP1 expression.
10A is a graph showing the results of analysis of the yield of induced vascular endothelial cells according to forskolin treatment through a flow cytometer.
10B is a graph showing the results of quantitative analysis of the flow cytometry results.
10c is a micrograph showing the results of analyzing the angiogenesis performance of induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment.
10D is a graph showing the results of quantitative analysis of the obtained branching point at which the blood vessel is divided, which is confirmed through the micrograph.
10E is a graph showing the results of quantitative analysis of the expression levels of endothelial cell-specific markers, arterial-related markers, and angiogenesis-related markers expressed in induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment.
10f is a graph showing the results of quantitative analysis of the expression level of fibroblast-specific markers expressed in induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment.
11 shows a process for analyzing the angiogenesis performance of induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment in vivo.
12 shows the results of analyzing the angiogenesis performance of induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment in vivo.
13A is a photograph showing the results of analysis by applying each cell to the ischemic model, performing laser Doppler imaging analysis over time, and applying the moorLDI program to the results.
13B is a graph showing a result of analyzing a ratio of blood flow in a left leg to a blood flow in a normal right leg over time among the results of performing the laser Doppler imaging analysis.
13C is a fluorescence micrograph showing the result of immunostaining with Isolectin B4, a vascular marker, after ischemic tissue was extracted from each ischemic model.
13D is a graph showing the results of quantitative analysis of the proportion of microvessels in induced vascular endothelial cells of ischemic tissue extracted from each of the ischemic models.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1: 유도 혈관내피세포 확립 및 기전 분석을 통한 스크리닝Example 1: Screening through establishment of induced vascular endothelial cells and mechanism analysis

ETV2 단일 전사인자를 doxycycline-inducible system을 이용해 사람 섬유아세포에 과발현 시켜 유도 혈관내피세포를 제작하였다(도 1).ETV2 single transcription factor was overexpressed in human fibroblasts using the doxycycline-inducible system to prepare induced vascular endothelial cells (FIG. 1).

대략적으로, 293FT 세포에 CSII-EF-HA-ETV2-IRES-Venus 벡터, FUW-M2rtTA 벡터를 pCMV-dR8.2 dvpr과 pMD2.G의 패키징 벡터와 함께 형질주입하여 바이러스 입자를 생성하였다. 이어, 상기 293FT 세포의 배양액에서 활성화된 바이러스 입자를 수득하고, 이를 polybrene과 함께 사람 피부 섬유아세포에 감염시켰다. 24시간이 경과된 후, 새로운 배양 배지로 교체하면서, 3일간 배양하였다. 끝으로, 상기 배양된 세포에 200ng/ml의 doxycycline을 포함하는 EGM-2 배지를 가하고, 15일 동안 추가로 배양하여 유도 혈관내피세포를 제작하였다.Roughly, 293FT cells were transfected with the CSII-EF-HA-ETV2-IRES-Venus vector and the FUW-M2rtTA vector together with the packaging vectors of pCMV-dR8.2 dvpr and pMD2.G to generate viral particles. Then, activated virus particles were obtained from the culture medium of the 293FT cells, and they were infected with human skin fibroblasts together with polybrene. After 24 hours have elapsed, the culture medium was replaced with a new culture medium and cultured for 3 days. Finally, EGM-2 medium containing 200 ng/ml doxycycline was added to the cultured cells, and further cultured for 15 days to prepare induced vascular endothelial cells.

도 1은 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 분화를 유도하는 과정 및 결과를 나타낸다.1 shows the process and results of inducing differentiation of vascular endothelial cells from fibroblasts.

도 1에서 보듯이, ETV2 단일 전사인자를 이용하여 섬유아세포를 혈관내피세포로 분화시킬 수 있었고, 전체 섬유아세포 중 약 17.5%에 해당하는 세포가 혈관내피세포로 분화됨을 확인하였다.As shown in FIG. 1 , fibroblasts could be differentiated into vascular endothelial cells using the ETV2 single transcription factor, and it was confirmed that about 17.5% of the total fibroblasts were differentiated into vascular endothelial cells.

상기 분화유도 과정을 분석하기 위해서 ChIP (Chromain Immunoprecipitation) sequencing을 진행하였다(도 2).ChIP (Chromain Immunoprecipitation) sequencing was performed to analyze the differentiation induction process (FIG. 2).

도 2는 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 분화를 유도하는데 관여하는 유전자를 발굴한 결과를 나타낸다.2 shows the results of discovering genes involved in inducing differentiation of vascular endothelial cells from fibroblasts.

도 2에서 보듯이, ETV2가 enhancer 및 promoter 부위에 직접 결합하는 유전자의 집합과 ETV2가 과발현 되었을 때 발현이 증가하는 유전자들의 집합의 교집합으로 941개의 유전자를 선별하였는데, 이처럼 선별된 유전자를 대상으로 유전자 온톨로지 (Gene ontology) 분석을 수행한 결과, 이들 선별된 유전자가 signaling 조절에 관여함을 확인하였다 .As shown in FIG. 2, 941 genes were selected by the intersection of the set of genes in which ETV2 directly binds to the enhancer and promoter regions and the set of genes whose expression increases when ETV2 is overexpressed. As a result of performing (Gene ontology) analysis, it was confirmed that these selected genes are involved in signaling regulation.

상기 결과를 바탕으로 signaling을 조절할 수 있는 소분자 화합물을 배양 배지에 첨가하여 스크리닝 하였다(도 3).Based on the above results, small molecule compounds capable of regulating signaling were added to the culture medium and screened (FIG. 3).

도 3은 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 분화를 유도하는 유도제를 스크리닝한 결과를 나타낸다.3 shows the results of screening an inducer for inducing differentiation of vascular endothelial cells from fibroblasts.

도 3에서 보듯이, forskolin, rolipram 등 cAMP signaling을 활성화시키는 화합물이 직접 교차 분화 효율을 증가시키는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 3 , it was confirmed that compounds that activate cAMP signaling, such as forskolin and rolipram, directly increase cross-differentiation efficiency.

이 중에서, 가장 높은 효율을 보인 forskolin을 선정하여 실험을 진행하였으며, 다음과 같은 농도 조건에서 최대 효율을 보이는 5μM로 forskolin 처치 농도 조건을 최적화 하였다 .Among them, forskolin showing the highest efficiency was selected and the experiment was conducted, and the concentration conditions for forskolin treatment were optimized to 5 μM showing the maximum efficiency under the following concentration conditions.

실시예 2: 확립된 유도 혈관내피세포의 성상 규명Example 2: Characterization of established induced vascular endothelial cells

선정된 화합물인 forskolin을 배양 배지에 첨가하였을 때 혈관 내피세포의 주요 마커 (CD31, VE-cadherin) 를 발현하는 유도 혈관내피세포 군을 수득하였으며, 이를 유세포분석기 (Flow Cytometry)를 이용하여 확인하였다(도 4).When forskolin, the selected compound, was added to the culture medium, a group of induced endothelial cells expressing major markers of vascular endothelial cells (CD31, VE-cadherin) was obtained, which was confirmed using flow cytometry (Flow Cytometry) ( Fig. 4).

도 4는 섬유아세포로부터 혈관내피세포의 분화에 미치는 forskolin의 효과를 확인한 결과를 나타낸다.4 shows the results of confirming the effect of forskolin on the differentiation of vascular endothelial cells from fibroblasts.

도 4에서 보듯이, 14일 동안 유도한 후, 전환 효율은 forskolin을 처치한 군이 약 42.8%로 대조군(vehicle인 DMSO 처치)에 비해 약 2배 높은 효율을 나타냄을 확인하였고, 세포면역염색법(immunocytochemistry)를 통해 forskolin 첨가 시 첨가하지 않았을 때에 비해 CD31, VE-Cadherin 발현이 증가한 것을 확인하였다. As shown in FIG. 4 , after induction for 14 days, the conversion efficiency of the forskolin-treated group was about 42.8%, which was confirmed to be about 2 times higher than that of the control (vehicle, DMSO treatment), and cell immunostaining ( Through immunocytochemistry), it was confirmed that the expression of CD31 and VE-Cadherin increased when forskolin was added compared to when not added.

또한, 세포의 기능성을 검증하기 위해 혈관 내피세포의 전구 단계 마커인 VEGFR2를 발현하는 VEGFR2 양성 세포군을 유도 3일 째에 분류하였다. 그 이후 4일 간의 유도를 거친 후 96 well plate에 분주 된 3D matrigel에 접종하고, 24시간 동안 배양한 후 생체 외 혈관 형성능을 평가하였다. ETV2가 발현되는 세포에서는 녹색 형광을 띠게 되는데, 이에 따라 형성된 혈관에서도 녹색 형광을 관찰하였다. 평가 시 혈관이 갈라지는 branching point를 정량화 그래프로 나타내었다. 그 결과, vehicle을 처치한 세포보다 forskolin을 처치한 세포에서 혈관 형성능이 향상됨을 확인하였다.In addition, in order to verify the functionality of the cells, a VEGFR2-positive cell group expressing VEGFR2, a progenitor marker of vascular endothelial cells, was sorted on the 3rd day of induction. After 4 days of induction, the 3D matrigel was inoculated into a 96-well plate, and cultured for 24 hours to evaluate angiogenesis in vitro. Cells expressing ETV2 exhibit green fluorescence, and thus green fluorescence was observed in blood vessels formed as a result. The branching point at which the blood vessel splits during evaluation is shown as a quantification graph. As a result, it was confirmed that the angiogenesis capacity was improved in the cells treated with forskolin than in the cells treated with the vehicle.

아울러, forskolin이 처리된 세포에서 발현된 RNA 서열을 분석하였다(도 5). 이때, High-throughput sequencing은 NextSeq 500 (Illuina)를 이용해 진행되었으며 UCSC hg19 genome build와 대조하여 분석하였다. 히트맵은 Cluster 3.0과 Treeview를 이용해 도식화 하였다. Gene ontology 분석은 vehicle과 forskolin 그룹 간 발현이 2배 이상 차이나는 유전자를 모아 진행되었으며, PANTHER 프로그램을 이용하여 분석하였다. GSEA 분석은 GSEA v3.0 프로그램을 이용하였다. In addition, RNA sequences expressed in forskolin-treated cells were analyzed (FIG. 5). At this time, high-throughput sequencing was performed using NextSeq 500 (Illuina) and analyzed against UCSC hg19 genome build. The heat map was schematized using Cluster 3.0 and Treeview. Gene ontology analysis was carried out by collecting genes whose expression differed more than twice between the vehicle and forskolin groups, and was analyzed using the PANTHER program. GSEA analysis was performed using the GSEA v3.0 program.

도 5는 forskolin이 처리된 세포에서 발현된 RNA 서열 분석결과를 나타낸다. 5 shows the results of analysis of RNA sequences expressed in forskolin-treated cells.

도 5에서 보듯이, 혈관 발생과 관련된 유전자 군에서 forskolin을 처치한 유도 혈관내피세포와 사람 제대 정맥 혈관 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)가 가깝게 clustering 되는 것을 확인하였다 As shown in FIG. 5, it was confirmed that forskolin-treated induced vascular endothelial cells and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were closely clustered in the gene group related to angiogenesis.

따라서, 상술한 도 4 및 5의 결과를 종합하면, vehicle을 처치했을 때보다 forskolin을 처치한 유도 혈관내피세포가, 천연의 혈관내피세포와 더욱 유사한 성상을 나타냄을 알 수 있었다.Therefore, combining the above-described results of FIGS. 4 and 5, it was found that the induced vascular endothelial cells treated with forskolin showed more similar properties to those of natural endothelial cells than when treated with vehicle.

실시예 3: Forskolin 처치에 의한 직접 교차 분화 기전 파악Example 3: Identification of direct cross-differentiation mechanism by Forskolin treatment

Forskolin에 의한 효과를 검증하기 위해 cAMP signaling 하위의 EPAC과 PKA pathway의 특이적인 활성제와 억제제를 직접 교차 분화 과정 중에 처치하였다(도 6). 이때, 상기 활성제로는 EPAC 특이적 활성제인 100μM의 8-4-Chlorophenylthio-cAMP(8-CPT-cAMP)와 PKA과 EPAC를 모두 활성화 시키는 25μM의 8-bromo-cAMP(8-Br-cAMP)를 사용하였고, 상기 활성제는 10일 동안 처리하였다.To verify the effect of Forskolin, specific activators and inhibitors of the EPAC and PKA pathways under cAMP signaling were directly treated during the cross-differentiation process (FIG. 6). At this time, as the activator, 100 μM of 8-4-Chlorophenylthio-cAMP (8-CPT-cAMP), which is an EPAC-specific activator, and 25 μM of 8-bromo-cAMP (8-Br-cAMP), which activates both PKA and EPAC, were used. and the active agent was treated for 10 days.

도 6은 Forskolin에 의한 효과를 검증한 결과를 나타낸다. 6 shows the results of verifying the effect of Forskolin.

도 6에서 보듯이, 상기 활성제인 8-CPT-cAMP와 8-Br-cAMP를 처리하였을 때, 모두 대조군(vehicle; Veh)에 비해 CD31과 VE-cadherin을 동시에 발현하는 유도 혈관 내피세포의 비율이 증가됨을 확인하였다. As shown in FIG. 6 , when the activators 8-CPT-cAMP and 8-Br-cAMP were treated, the ratio of induced vascular endothelial cells simultaneously expressing CD31 and VE-cadherin was higher than that of the control group (vehicle; Veh). was confirmed to be increased.

또한, EPAC 특이적 억제제인 ESI-09와 PKA 특이적 억제제인 KT5720을 처치했을 경우 직접 교차 분화 효율이 감소하였으며, forskolin을 처치했을 때의 높은 효율을 억제제들이 상쇄시킴을 확인하였다.In addition, it was confirmed that the direct cross-differentiation efficiency was decreased when the EPAC-specific inhibitor ESI-09 and the PKA-specific inhibitor KT5720 were treated, and the inhibitors offset the high efficiency when forskolin was treated.

따라서, ETV2 과발현에 의해 사람의 섬유아세포로부터 혈관 내피세포를 유도하는 과정에서 cAMP signaling이 중요한 인자임을 알 수 있었다.Therefore, it was found that cAMP signaling is an important factor in the process of inducing vascular endothelial cells from human fibroblasts by ETV2 overexpression.

한편, cAMP의 하위 기전인 PKA, EPAC과 ETV2 와의 상관 관계를 찾기 위해 ChIP sequencing 분석을 진행하였다(도 7). Meanwhile, ChIP sequencing analysis was performed to find the correlation between PKA and EPAC, which are sub-mechanisms of cAMP, and ETV2 (FIG. 7).

대략적으로, ETV2가 도입된 섬유아세포를 doxycycline이 포함되지 않은 배지 (CTL-Dox)와 포함된 배지 (+Dox)를 이용하여 배양한 후, 혈관 내피세포로의 유도 과정에서 ETV2와 forskolin 의 상관 관계를 규명하고자 하였다. Roughly, the correlation between ETV2 and forskolin during induction into vascular endothelial cells after culturing ETV2-introduced fibroblasts using doxycycline-free medium (CTL-Dox) and medium containing doxycycline (+Dox) was intended to elucidate.

도 7은 Forskolin에 의한 효과를 검증하기 위하여, ChIP sequencing 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 7 shows the results of ChIP sequencing analysis to verify the effect of Forskolin.

도 7에서 보듯이, ChIP sequencing을 통해 ETV2가 EPAC1을 코딩하고 있는 RAPGEF3 유전자의 프로모터에 직접적으로 결합하는 것을 ETV2가 발현하지 않는 대조군 (CTL-Dox)에 비해 상승된 피크를 통해 확인할 수 있었다(도 7의 좌측). As shown in FIG. 7 , it was confirmed through ChIP sequencing that ETV2 directly binds to the promoter of the RAPGEF3 gene encoding EPAC1 through an elevated peak compared to the control group (CTL-Dox) in which ETV2 is not expressed (Fig. 7, left).

상기 프로모터 부위를 각각 primer로 합성하여 (P1, P2) ChIP-qPCR를 진행하였다. ChIP Assay kit를 이용하여 각 세포에서 ETV2 (단백질)과 DNA 사이의 결합을 통해 ETV2가 결합된 DNA 만을 침전, 추출해 냈으며 이를 quantitative PCR을 이용하여 분석하였다. negative control에 비해 ETV2가 발현하고 있는 +Dox 세포 군에서 RAPGEF3의 P1, P2 부위에 ETV2가 유의적으로 결합되어 있는 것을 확인하였다(도 7의 중앙).Each of the promoter regions was synthesized with a primer (P1, P2), and ChIP-qPCR was performed. Using the ChIP Assay kit, only ETV2-bound DNA was precipitated and extracted from each cell through the binding between ETV2 (protein) and DNA, and this was analyzed using quantitative PCR. It was confirmed that ETV2 was significantly bound to the P1 and P2 regions of RAPGEF3 in the +Dox cell group expressing ETV2 compared to the negative control (center of FIG. 7 ).

실제로 doxycycline을 처치하여 ETV2를 발현 시켰을 때 RAPGEF3의 발현이 증가하는지 확인하기 위해 CTL-Dox (ETV2를 발현하지 않는 대조군 세포) 및 3일 동안 doxycycline을 처치한 세포 군 (+Dox, day3), 7일 동안 doxycycline을 처치한 세포 군 (+Dox, day7)에서 RAPGEF3의 mRNA 발현을 비교하였다. 그 결과 doxycycline을 처치한 세포 군에서 유의적으로 RAPGEF3 발현이 증가해 있었다(도 7의 우측).In fact, to check whether the expression of RAPGEF3 increases when ETV2 is expressed by treatment with doxycycline, CTL-Dox (control cells that do not express ETV2) and doxycycline-treated cell group for 3 days (+Dox, day3), 7 days mRNA expression of RAPGEF3 was compared in the doxycycline-treated cell group (+Dox, day 7). As a result, RAPGEF3 expression was significantly increased in the cell group treated with doxycycline (right side of FIG. 7).

상기 도 7의 결과를 종합하면, 혈관 내피세포로의 직접 교차 분화과정에서 ETV2가 RAPGEF3의 프로모터 부위에 직접적으로 결합함으로써 RAPGEF3의 발현을 조절한다는 점을 알 수 있었다.7, it was found that ETV2 regulates the expression of RAPGEF3 by directly binding to the promoter region of RAPGEF3 in the process of direct cross-differentiation into vascular endothelial cells.

또한, RAPGEF3의 전사 및 번역을 통해 생성되는 단백질인 EPAC1은 하위 분자인 RAP1과 결합하고 있는 GDP를 GTP로 치환하여 RAP1을 활성화시킬 수 있다. ETV2가 실제로 RAPGEF3의 프로모터 조절을 통해 EPAC1 하위 기전을 조절할 수 있는지 확인하기 위해 세포를 24시간 동안 starvation 시킨 후 forskolin 자극에 의해 유도되는 EPAC1과 EPAC1의 하위 분자인 RAP1의 활성화 형태인 RAP1-GTP의 발현량을 확인하였다(도 8). In addition, EPAC1, a protein produced through transcription and translation of RAPGEF3, can activate RAP1 by substituting GTP for GDP binding to RAP1, a sub-molecule. To check whether ETV2 can actually regulate the sub-mechanism of EPAC1 through RAPGEF3 promoter regulation, cells were starvated for 24 hours and then forskolin stimulation induced expression of EPAC1 and RAP1-GTP, an activated form of RAP1, a sub-molecule of EPAC1. The amount was confirmed (FIG. 8).

도 8은 혈관 내피세포로의 유도 과정에서 ETV2에 의해 활성화 되는 RAP1-GTP의 발현량을 분석한 결과를 나타낸다.8 shows the results of analysis of the expression level of RAP1-GTP activated by ETV2 during induction into vascular endothelial cells.

도 8에서 보듯이, doxycycline을 처치하여 ETV2가 발현하고 있는 세포군에서만 EPAC1이 발현되었고, 이에 따라, RAP1의 활성화 형태인 RAP1-GTP 발현이 10μM의 Forskolin을 60분 동안 처치한 세포군에서 증가됨을 확인하였다(도 8의 좌측). As shown in FIG. 8 , EPAC1 was expressed only in the ETV2 expression cell group by treatment with doxycycline. Accordingly, it was confirmed that the expression of RAP1-GTP, an activated form of RAP1, was increased in the cell group treated with 10 μM Forskolin for 60 minutes. (left side of FIG. 8).

또한, ETV2 발현과 함께 EPAC을 조절할 수 있는 화합물과 같이 처리했을 때 RAP1-GTP의 발현이 함께 조절되는 지 확인하기 위해 EPAC 특이적 활성제인 8-CPT-cAMP (100mM) 와 특이적 억제제인 ESI-09 (2.5mM)를 사용하였다. 그 결과, 대조군 (veh)에 비해 8-CTP-cAMP 및 forskolin을 처리했을 때 RAP1-GTP 발현이 증가하며, forskolin에 EPAC 억제제인 ESI-09를 처리했을 때 RAP1-GTP 발현이 감소하는 것으로 보아 forskolin에 의한 효과가 상쇄됨을 확인하였다(도 8의 우측).In addition, in order to check whether the expression of RAP1-GTP is regulated together when treated with a compound that can modulate EPAC along with ETV2 expression, 8-CPT-cAMP (100 mM), an EPAC-specific activator, and ESI-, a specific inhibitor 09 (2.5 mM) was used. As a result, compared to the control group (veh), RAP1-GTP expression increased when treated with 8-CTP-cAMP and forskolin, and RAP1-GTP expression decreased when forskolin was treated with ESI-09, an EPAC inhibitor. It was confirmed that the effect is canceled (right side of FIG. 8).

상기 도 8의 결과로부터, 직접 교차 분화 과정에서 ETV2에 의해 EPAC1의 발현이 조절되며, 활성화 된 EPAC은 하위의 RAP1-GTP의 발현을 조절함을 알 수 있었다.8, it was found that the expression of EPAC1 is regulated by ETV2 in the direct cross-differentiation process, and the activated EPAC regulates the expression of subordinate RAP1-GTP.

끝으로, EPAC의 하위 물질인 RAP1이 혈관 내피세포의 직접 교차 분화 과정에서 중요한 인자인지 확인하기 위해 short hairpin RNA 도입을 통해 RAP1의 발현을 억제하였다(도 9).Finally, to confirm that RAP1, a sub-material of EPAC, is an important factor in the process of direct cross-differentiation of vascular endothelial cells, the expression of RAP1 was suppressed by introduction of short hairpin RNA (FIG. 9).

도 9는 RAP1의 발현억제에 따른 분화효율의 변화를 분석한 결과를 나타낸다.9 shows the results of analyzing the change in differentiation efficiency according to the suppression of RAP1 expression.

도 9의 좌측 그래프에서 보듯이, ETV2가 도입된 피부 섬유아세포에 RAP1의 isoform인 RAP1A, RAP1B의 short hairpin RNA를 도입함으로써 각각의 발현을 억제시키고, vehicle과 forskolin 처치 군으로 각각 나누어 유도 10일 후에 유도 혈관내피세포 내 RAP1 mRNA 발현이 감소된 것을 확인하였다.As shown in the graph on the left of FIG. 9 , each expression was inhibited by introducing short hairpin RNAs of RAP1A and RAP1B, which are isoforms of RAP1, into skin fibroblasts into which ETV2 was introduced, and divided into vehicle and forskolin treatment groups, respectively, after 10 days of induction. It was confirmed that RAP1 mRNA expression in induced vascular endothelial cells was reduced.

또한, 동일한 방법으로 유도 10일 후 유세포 분석을 통해 각 군에서의 직접교차분화 효율을 비교하였다. 도 9의 중앙 그래프에서 보듯이, 대조군 (shCTL)에 비해 shRAP1A, shRAP1B 군에서 분화 효율이 감소하였으며, vehicle과 forskolin을 처치한 세포 군에서 모두 분화효율이 감소됨을 확인하였다.In addition, the direct cross-differentiation efficiency in each group was compared through flow cytometry 10 days after induction in the same way. As shown in the central graph of FIG. 9 , the differentiation efficiency was decreased in the shRAP1A and shRAP1B groups compared to the control group (shCTL), and it was confirmed that the differentiation efficiency was decreased in both the vehicle and forskolin-treated cell groups.

아울러, 도 9의 우측 그래프에서 보듯이, quantitative PCR을 통해 혈관 내피세포 특이적인 마커 (PECAM1, VE-cadherin, VWF, VEGFR2) 발현을 확인하였을 때, shRAP1A 및 shRAP1B 군에서 대조군 (shCTL)에 비해 현저하게 혈관 내피세포 마커 발현이 감소함을 vehicle, forskolin 군에서 모두 확인하였다.In addition, as shown in the graph on the right of FIG. 9, when the expression of vascular endothelial cell-specific markers (PECAM1, VE-cadherin, VWF, VEGFR2) was confirmed through quantitative PCR, the shRAP1A and shRAP1B groups were significantly more pronounced than the control group (shCTL). It was confirmed that the expression of vascular endothelial cell markers decreased in both the vehicle and forskolin groups.

따라서, RAP1이 ETV2에 의한 혈관 내피세포의 직접 교차 분화 과정에서 중요한 역할을 수행함을 알 수 있었다. Therefore, it was confirmed that RAP1 plays an important role in the direct cross-differentiation of vascular endothelial cells by ETV2.

실시예 4: 유도 혈관 내피세포의 장기간 배양 후의 성상 검증 Example 4: Verification of properties after long-term culture of induced vascular endothelial cells

실시예 4-1: forskolin의 유도 혈관내피세포 생성능 분석Example 4-1: Analysis of forskolin-induced vascular endothelial cell production

유도 혈관 내피세포의 장기간 배양을 위해 doxycycline 유도 3일 째 VEGFR2 양성 세포군을 분리해 낸 후, doxycycline을 제외한 배양 배지에서 세포를 유지하면서 14일 동안 증식시켰다. 이어, 다시 doxycycline과 vehicle (대조군) 및 forskolin (실험군)을 각각 포함한 배양 배지를 넣어줌으로써 혈관 내피세포로 재분화를 유도하고, 장기간 배양에 따른 혈관 내피세포의 성상이 유지되는지의 여부를 검증하였다(도 10a 및 10b). For long-term culture of induced vascular endothelial cells, a VEGFR2-positive cell group was isolated on the 3rd day of doxycycline induction, and the cells were grown for 14 days while maintaining the cells in a culture medium except for doxycycline. Then, re-differentiation into vascular endothelial cells was induced by adding a culture medium containing doxycycline, vehicle (control group), and forskolin (experimental group), respectively, and it was verified whether the properties of vascular endothelial cells were maintained after long-term culture (Fig. 10a and 10b).

도 10a는 forskolin의 처리에 따른 유도 혈관내피세포의 수득율을 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타내고, 도 10b는 상기 유세포 분석결과를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다. FIG. 10a shows the results of analyzing the yield of induced vascular endothelial cells according to forskolin treatment through a flow cytometer, and FIG. 10b is a graph showing the results of quantitative analysis of the flow cytometry results.

도 10a 및 10b에서 보듯이, 35일 째 43%, 42일 째 55.5%로 vehicle을 처치한 세포군에 비해 forskolin을 처치했을 때 약 2배 이상의 높은 효율을 나타냄을 확인하였다.As shown in FIGS. 10a and 10b, it was confirmed that when forskolin was treated, the efficiency was about twice as high as 43% on day 35 and 55.5% on day 42, compared to the cell group treated with vehicle.

실시예 4-2: forskolin의 유도에 의해 생성된 혈관내피세포의 분화능 분석Example 4-2: Analysis of differentiation capacity of vascular endothelial cells generated by induction of forskolin

장기간 배양된 유도 혈관내피세포의 기능성을 확인하기 위해 유도 24일 째 96 well plate 안에 분주된 3D matrigel 안에서 24시간 동안 배양한 후, 생체 외 혈관형성능을 분석하였다(도 10c 및 10d). To confirm the functionality of long-term cultured induced vascular endothelial cells, on the 24th day of induction, they were cultured for 24 hours in 3D matrigel dispensed in a 96 well plate, and then the angiogenesis performance in vitro was analyzed ( FIGS. 10c and 10d ).

도 10c는 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포의 혈관형성능을 분석한 결과를 나타낸 현미경사진이고, 도 10d는 상기 현미경사진을 통해 확인된 혈관이 갈라지는 얻어진 branching point를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.10C is a micrograph showing the results of analyzing the angiogenesis performance of induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment, and FIG. It is a graph.

도 10c 및 10d에서 보듯이, ETV2 발현에 따라 녹색 형광을 띠는 혈관이 확인되었는데, forskolin을 처리하지 않고 생성된 유도 혈관내피세포에 비하여 장기간 배양한 후에도 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포가 상대적으로 우수한 혈관형성능을 나타냄을 확인하였다.As shown in FIGS. 10c and 10d , blood vessels exhibiting green fluorescence were identified according to ETV2 expression. Compared to induced vascular endothelial cells generated without forskolin treatment, induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment even after long-term culture. It was confirmed that showed relatively good angiogenesis performance.

실시예 4-3: forskolin의 유도에 의해 생성된 혈관내피세포의 마커 분석Example 4-3: Marker analysis of vascular endothelial cells generated by induction of forskolin

유도 혈관내피세포를 대상으로 내피세포 특이적 마커 (CD31, VE-cadherin, VWF, VEGFR2); 동맥 관련 마커 (NOTCH4, HEY1); 및 혈관 발생 관련 마커 (SOX18, FOXO1, TSPAN12, EDN1)의 발현을 mRNA 수준에서 분석하였다(도 10e). Endothelial cell-specific markers for induced vascular endothelial cells (CD31, VE-cadherin, VWF, VEGFR2); arterial-associated markers (NOTCH4, HEY1); And the expression of angiogenesis-related markers (SOX18, FOXO1, TSPAN12, EDN1) was analyzed at the mRNA level (FIG. 10e).

도 10e는 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포에서 발현되는 내피세포 특이적 마커, 동맥 관련 마커 및 혈관 발생 관련 마커의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.10E is a graph showing the results of quantitative analysis of the expression levels of endothelial cell-specific markers, arterial-related markers, and angiogenesis-related markers expressed in induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment.

도 10e에서 보듯이, forskolin을 처리하지 않은 대조군(Veh+Dox)에 비해 forskolin을 처리한 실험군(Fsk+Dox)에서는 장기간 배양 후에도 내피세포 특이적 마커, 동맥 관련 마커 및 혈관 발생 관련 마커가 상대적으로 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.As shown in FIG. 10e, in the experimental group (Fsk+Dox) treated with forskolin compared to the control group (Veh+Dox) not treated with forskolin, endothelial cell-specific markers, arterial-related markers, and angiogenesis-related markers were relatively high even after long-term culture. It was confirmed that it was expressed at a high level.

또한, forskolin의 처리에 의해 교차분화된 혈관내피세포에서 섬유아세포 특이적 마커(FSP1 및 THY1)의 발현을 mRNA 수준에서 분석하였다(도 10f). In addition, the expression of fibroblast-specific markers (FSP1 and THY1) in cross-differentiated vascular endothelial cells by treatment with forskolin was analyzed at the mRNA level (FIG. 10f).

도 10f는 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포에서 발현되는 섬유아세포 특이적 마커의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.10f is a graph showing the results of quantitative analysis of the expression level of fibroblast-specific markers expressed in induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment.

도 10f에서 보듯이, 직접교차분화를 수행하기 이전의 모세포 (CTL-Dox) 에서는 섬유아세포 특이적 마커(FSP1 및 THY1)가 높은 수준으로 발현되었으나, 이에 forskolin을 처리하면, 상기 섬유아세포 특이적 마커의 발현수준이 급격히 감소되었고, 이러한 감소수준은 배양시간에 비례함을 확인하였다.As shown in FIG. 10f , fibroblast-specific markers (FSP1 and THY1) were expressed at high levels in the parental cells (CTL-Dox) prior to direct cross-differentiation, but when treated with forskolin, the fibroblast-specific markers The expression level of was rapidly decreased, and it was confirmed that this decrease level was proportional to the incubation time.

상기 결과를 종합하면, forskolin을 처리할 경우, 장기 배양을 통해 높은 효율로 다량의 세포를 확보하고, 장기간 배양한 후에도 그 성상을 유지할 수 있음을 확인하였다. Summarizing the above results, it was confirmed that when forskolin was treated, a large amount of cells were secured with high efficiency through long-term culture, and their properties could be maintained even after long-term culture.

이는 세포치료제의 대량 생산을 위한 전략으로 유용함을 알 수 있었다.This was found to be useful as a strategy for mass production of cell therapy products.

실시예 5: 유도 혈관내피세포의 생체 스캐폴드 내에서의 혈관형성능 검증Example 5: Verification of angiogenesis performance of induced vascular endothelial cells in a living scaffold

랫트의 간을 이용한 탈세포 지지체에 사람 유도 혈관내피세포를 재세포화 하여 ex vivo 상황에서의 혈관형성능을 검증하였다(도 11).Human induced vascular endothelial cells were recellularized on decellularized scaffolds using rat liver to verify angiogenesis in ex vivo conditions (FIG. 11).

도 11은 생체내에서 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포의 혈관형성능을 분석하는 과정을 나타낸다. 11 shows a process for analyzing the angiogenesis performance of induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment in vivo.

도 11에서 보듯이, 유도 혈관내피세포 중 VEGFR2 양성 세포군을 분류한 후 간 탈세포 지지체에 주입하였으며, bioreactor 내 지지체 배양 단계를 Phase 1과 Phase 2로 분리하였다. 상기 Phase 1 에서는 doxycycline을 처치하지 않은 상태로 약 7일 동안 세포가 지지체에 안정적으로 생착되도록 하였고. Phase 2 에서는 doxycycline과 forskolin을 배지에 처치하여 혈관 내강에 부착된 유도 혈관내피세포를 성숙시키며 혈관 구조를 형성하도록 하였다 11, after sorting the VEGFR2-positive cell group among the induced vascular endothelial cells, they were injected into the liver decellularization scaffold, and the scaffold culture step in the bioreactor was separated into Phase 1 and Phase 2. In the Phase 1, cells were stably engrafted on the scaffold for about 7 days without doxycycline treatment. In Phase 2, doxycycline and forskolin were treated in the medium to mature the induced vascular endothelial cells attached to the lumen of blood vessels and form vascular structures.

상기 Phase 1 배양이 끝난 지지체와 Phase 2까지 배양이 끝난 지지체를 대상으로, Picrosirius red를 이용한 조직 염색(적색: 콜라젠 염색, 녹색: 세포의 세포질 염색)을 수행하였다(도 12).Tissue staining (red: collagen staining, green: cell cytoplasmic staining) using Picrosirius red was performed on the scaffolds that had been cultured up to Phase 1 and the scaffolds that had been cultured up to Phase 2 (FIG. 12).

도 12는 생체내에서 forskolin의 처리에 의해 생성된 유도 혈관내피세포의 혈관형성능을 분석한 결과를 나타낸다.12 shows the results of analyzing the angiogenesis performance of induced vascular endothelial cells generated by forskolin treatment in vivo.

도 12에서 보듯이, Phase 1 배양이 끝난 지지체는 정확한 혈관 구조를 형성하지 못한 반면에 Phase 2까지 배양이 끝난 지지체는 혈관 내강에 부착된 혈관 내피세포들의 분포를 확인할 수 있었다(도 12의 좌측). As shown in FIG. 12 , the scaffold after culturing in Phase 1 did not form an accurate vascular structure, whereas in the scaffold after culturing up to Phase 2, the distribution of vascular endothelial cells attached to the lumen of the vessel could be confirmed (left side of FIG. 12). .

또한, 지지체 내 혈관에서 혈관 관련된 마커들이 발현하는 지 확인하기 위해 면역염색을 진행했을 때, 혈관 마커인 lectin과 혈관 내피세포 마커인 VE-cadherin과 Claudin-5 가 Phase 2의 혈관 구조에서 발현함을 확인하였다(도 12의 우측). In addition, when immunostaining was performed to confirm the expression of blood vessel-related markers in the blood vessels in the scaffold, it was found that the vascular marker lectin and the vascular endothelial cell markers VE-cadherin and Claudin-5 were expressed in the vascular structure of Phase 2 It was confirmed (right side of FIG. 12).

따라서, 조직 공학적 측면에서 유도 혈관내피세포의 사용이 가능할 것으로 분석되었다.Therefore, it was analyzed that the use of induced vascular endothelial cells would be possible in terms of tissue engineering.

실시예 6: 유도 혈관내피세포의 생체 내 혈관형성능 검증Example 6: Verification of in vivo angiogenesis performance of induced vascular endothelial cells

면역이 결핍된 마우스(nude mouse)의 왼쪽 뒷다리의 대퇴동맥(femoral artery)을 결찰한 후 절개하여 재생이 가능한 허혈성 모델을 확립하였다. 절개 후 혈관의 진행방향에 따라 가쪽으로(laterally) 하기 각 세포 군을 근육내 주사하고, 주사후 14일 동안 혈로의 재생정도를 평가함으로써, 허혈증상의 치료수준을 비교하였다(도 13a 내지 13d). The ischemic model capable of regeneration was established by ligating and dissecting the femoral artery of the left hind leg of an immune-deficient mouse (nude mouse). After incision, each of the following cell groups was intramuscularly injected laterally according to the direction of blood vessel progression, and the level of ischemic treatment was compared by evaluating the degree of regeneration of blood channels for 14 days after injection ( FIGS. 13a to 13d ).

1. CTL -Dox: ETV2가 발현되지 않는 fibroblast (음성대조군)1. CTL-Dox: fibroblast in which ETV2 is not expressed (negative control)

2. Veh +Dox: Vehicle을 처치한 유도 혈관내피세포2. Veh +Dox: Induced vascular endothelial cells treated with Vehicle

3. Fsk +Dox: Forskolin을 처치한 유도 혈관내피세포3. Fsk +Dox: Forskolin-treated induced vascular endothelial cells

4. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC, 양성대조군)4. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC, positive control)

도 13a는 허혈성 모델에 각 세포를 투여한 후, 시간의 경과에 따른 레이저 도플러 이미징 분석을 수행하고, 그 결과를 moorLDI 프로그램애 적용하여 분석한 결과를 나타내는 사진이다.13A is a photograph showing the results of analysis by applying each cell to the ischemic model, performing laser Doppler imaging analysis over time, and applying the moorLDI program to the results.

도 13a에서 보듯이, 혈류가 정상적으로 흐르는 부위는 붉은색으로 나타나는 반면, 혈류가 흐르지 않는 다리는 푸른색을 띠게 되는데, 모든 허혈성 모델에서 시간의 경과에 따라 혈류의 흐름이 개선됨을 확인하였다.As shown in FIG. 13A , the area through which blood flow normally flows appears in red, whereas the leg in which blood does not flow appears in blue.

도 13b는 상기 레이저 도플러 이미징 분석을 수행한 결과 중에서, 정상 오른쪽 다리의 혈류량 대비 왼쪽 다리의 혈류량의 비율을 시간의 경과에 따라 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.13B is a graph showing a result of analyzing a ratio of blood flow in a left leg to a blood flow in a normal right leg over time among the results of the laser Doppler imaging analysis.

도 13b에서 보듯이, Fsk +Dox 실험군의 경우, 4일 후부터 빠르게 혈류가 증가한 것을 확인하였으며, 수술 14일 후에도 다른 세포군을 주입한 다리에 비해 가장 높은 혈류 회복율을 나타냄을 확인하였다.As shown in FIG. 13b , in the case of the Fsk + Dox experimental group, it was confirmed that blood flow increased rapidly after 4 days, and it was confirmed that even after 14 days of surgery, it exhibited the highest blood flow recovery rate compared to the leg injected with other cell groups.

도 13c는 상기 각 허혈성 모델로부터 허혈 조직을 적출한 후, 혈관 마커인 Isolectin B4를 면역염색한 결과를 나타내는 형광현미경사진이고, 도 13d는 상기 각 허혈성 모델로부터 적출된 허혈 조직의 유도 혈관내피세포에서 미세혈관의 비율을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.13C is a fluorescence micrograph showing the results of immunostaining with Isolectin B4, a vascular marker, after ischemic tissue was extracted from each of the ischemic models, and FIG. It is a graph showing the result of quantitative analysis of the ratio of microvessels.

도 13c 및 13d에서 보듯이, Fsk +Dox 실험군의 경우, 다른 실험군에 비하여 상대적으로 유도 혈관내피세포에서 미세혈관의 비율이 증가됨을 확인하였다.As shown in FIGS. 13c and 13d , in the case of the Fsk + Dox experimental group, it was confirmed that the ratio of microvessels in the induced vascular endothelial cells was relatively increased compared to that of the other experimental groups.

상기 도 13a 내지 13d의 결과로부터, forskolin을 처치한 세포 군에서 혈관 형성능이 향상됨을 알 수 있었다.From the results of FIGS. 13A to 13D, it was found that the angiogenic ability was improved in the forskolin-treated cell group.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing the technical spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention, rather than the above detailed description, all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims to be described later and their equivalents.

Claims (7)

삭제delete 섬유아세포와 포스콜린(forskolin)을 포함하는 혈관내피세포 생산용 조성물로,
상기 포스콜린은 섬유아세포의 교차분화를 유도하여 혈관내피세포를 생성하는 것인, 조성물.
A composition for producing vascular endothelial cells comprising fibroblasts and forskolin,
Wherein the forskolin induces cross-differentiation of fibroblasts to generate vascular endothelial cells.
 분리된 섬유아세포를 포스콜린을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 혈관내피세포 생산방법.
A method for producing vascular endothelial cells, comprising culturing the isolated fibroblasts in a medium containing forskolin.
 제3항에 있어서,
상기 배양하는 단계는 직접교차분화를 유도하는 것인, 혈관내피세포 생산방법.
4. The method of claim 3,
The culturing step is to induce direct cross-differentiation, vascular endothelial cell production method.
 포스콜린 및 섬유아세포를 포함하는 허혈성 질환 치료용 약학조성물.
A pharmaceutical composition for the treatment of ischemic diseases comprising forskolin and fibroblasts.
 제5항에 있어서,
상기 약학조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학조성물.
6. The method of claim 5,
The pharmaceutical composition will further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
 (a) 분리된 섬유아세포를 포스콜린을 포함하는 배지에서 배양하여, 직접교차분화를 유도하여 혈관내피세포를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 수득한 혈관내피세포를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료방법.
(a) culturing the isolated fibroblasts in a medium containing forskolin to induce direct cross-differentiation to obtain vascular endothelial cells; and
(b) a method for preventing or treating an ischemic disease comprising administering the obtained vascular endothelial cells to a subject other than a human.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CIRC RES. 2019 JANUARY 04; VOL. 124(1), P. 29-31. [DOI:10.1161/CIRCRESAHA.118.314195]*

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