KR102400179B1

KR102400179B1 - 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102400179B1
Application number: KR1020200109815A
Authority: KR
Inventors: 한태영; 이재호
Original assignee: 주식회사에이치엔비랩스
Priority date: 2020-08-31
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2022-05-25
Also published as: KR20220028612A

Abstract

본 발명은 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효 성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 항균, 항산화, 미백 및 항염증 활성에 의한 피부 손상을 예방 및 개선할 수 있다.
또한, 제형 내 우수한 방부효과, 피부 노화 예방 및 개선, 피부 주름 개선, 미백, 피부 염증 개선에 우수한 효과를 나타낼 수 있는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION ANTIMICROBOAL, ANTIOXIDATION, WHITENING OR ANTI-INFLAMMATION COMPRISING ARTEMISIA CAPILLARIS THUNBERG AND OLIVE EXTRACT}

본 발명은 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하여 항균, 항산화, 미백 및 항염증 효과를 나타내는 것으로, 방부 효과, 피부 노화 예방 및 개선, 피부 주름 개선, 미백, 피부 염증 개선이 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 가장 외부에 존재하는 기관으로 체내 수분을 보호하고 외부로부터의 침입인자를 막아 인체를 보호하는 필수적인 장벽 역할을 한다.

화장료는 일반적으로 피부를 청결하고 아름답게 하는 것이 목적이며, 이러한 목적을 수반하는 과정에서 피부를 깨끗, 촉촉하게 하고, 자외선을 차단하며, 공해 및 스트레스에 의한 체내 활성 산소 및 과산화물을 제거하여 피부의 노화를 지연하는 효과를 부여한다.

화장료를 구성하고 있는 원료들은 대부분 미생물이 이용하기에 적합한 물질들이다. 더불어 최근에는 고 기능성 화장료를 개발하기 위해 동식물로부터 얻어진 천연물들을 많이 첨가함으로써 미생물에 의한 화장료의 오염 가능성이 더욱더 높아졌다.

이에 따라 화장료에는 방부제가 첨가되고, 화장료에 사용되는 방부제는 소비자의 제품 중 그 효과를 나타내야 하며, 적합한 방부시스템이 설정되었는가 반드시 시험으로 증명되어야 한다.

화장료가 미생물에 의해 오염되었을 때, 우리에게 주는 부정적 측면은 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째는 소비자의 건강에 미치는 위험성이고, 두 번째는 상품 가치의 하락이다. 미생물에 오염된 화장료을 피부에 도포할 경우 피부의 상처나 균열을 통해 유입된 미생물이 염증이나 각종 트러블을 일으킬 수 있다. 또한 미생물의 증식으로 인한 화장료의 물리적 변화(유화의 파괴 및 변취 등)를 가져와 상품의 가치를 하락시킬 수 있다. 따라서 화장료가 미생물에 오염되지 않도록 처방에서부터 제조, 포장에 이르기까지 발생할 수 있는 다양한 오염 원인들을 파악하고 대책을 세우는 것이 필요하다.

화장료는 물, 오일, 보습제, 계면활성제, polymer, 천연물 등 미생물이 사용하기 좋은 성분들로 이루어져 있다. 화장료는 오랜 기간 동안 소비자에 의해 사용된다는 특성을 가지고 있으므로 다양한 미생물에 의한 변질을 방지하기 위한 적당한 방부제를 필요로 한다. 만약 미생물에 오염된 화장료를 사용하게 되면, 사용자에게 유해할 수 있으며, 면역력이 약한 사람에게는 병을 일으킬 수도 있다. 이와 같은 이유로 화장료는 각 제형의 특성에 따라 적합한 수준의 방부시스템이 설정되어야 한다.

피부의 노화는 크게 자연 노화와 외인성 노화로 구분할 수 있다. 외인성 노화는 주로 태양광선에 의해 영향을 받으며, 특히 자외선은 광노화(photo-aging)를 일으키는 것으로 잘 알려져 있다. 반면, 적외선은 체내에 열을 상승시켜 이로운 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

피부노화의 원인 중에 하나는 산소에서 유래되는 과산화물 음이온 라디칼(superoxide anion radical), 히드록시 라디칼 (hydroxy radical), 일중항 산소(singlet oxygen) 및 과산화수소(H₂O₂) 등의 활성산소에 의해 야기되는 자유 라디칼 반응은 지질을 포함한 세포의 주요 거대 분자를 파괴시키며, 이들은 반응성이 강하고 세포 구성물질이나 세포막과 반응하여 이상대사를 초래한다고 알려져 있다. 이 같은 비정상적인 대사나 물리, 화학적인 외부자극에 대한 노출은 산화와 항산화의 불균형을 야기해 과산화나 생체 내 방어기구의 무기력화를 일으키고 단백질의 산화 및 변성 등을 초래하며 세포의 기능을 손상시키고, 결국 탄력 감소, 주름, 기미 및 주근깨 생성 등으로 특징 지워지는 피부 노화가 가속화된다(J. Soc., Cosmet. Sci. Kor., 23, pp75-132, 1997).

특히, 자연계에 서식하는 생명체의 노화와 질병의 많은 원인 중의 하나는 산화하는 대사 과정에서 발생하는 활성 산소(active oxygen)에서 찾을 수 있는데, 이들은 건강한 조직에서는 백혈구 등이 이를 이용하여 외부에서 침입한 각종 비-자기 물질들을 비 특이적으로 제거하는데 필수적인 물질이기도 하지만 주로 불포화 지방산이 풍부한 생체막에서는 자유 라디칼 반응에 관여함으로써 지질의 과산화를 일으키는 것으로 알려져 있다.

일반 화장품, 의약품 및 식품의 원료로서 사용되는 활성산소 억제와 항산화 효과가 있는 물질이 알려져 있지만, 이는 합성품으로 장기간 인간의 피부에 적용할 경우에 안전성이 확보되지 않아 그 사용이 제한된다.

천연물은 활성산소 억제 효과가 약한 것이 대부분이지만 사람의 피부에 대해서는 안전성이 보증된다.

따라서, 활성산소 억제 효과 및 항산화 효과가 강하고 사람의 피부에 대해 서도 또 다른 효과가 있는 물질이 희망된다.

광 노화의 대표적인 조직학적 변화는 엘라스틴 섬유의 주성분인 엘라스틴의 축적이다. 정상적인 교원섬유와는 달리 광탄력소물질(solar elastotic material)은 거대분자로 구성되고 광에 의해 기능이 심각하게 손상되어 있다.

자외선에 노출된 피부세포에서 엘라스틴 유전자의 발현이 두드러지게 활성이 촉진되어 있으며, 엘라스틴 유전자의 발현은 자유 라디칼에 의해 유발된다고 한다.

엘라스타제는 엘라스틴을 분해할 수 있는 지금까지 알려진 유일한 효소이며, 이에 대한 저해는 피부 노화를 근본적으로 줄여 줄 수 있다. 콜라겐의 분해는 주요인은 광에 의해서이다.

광노화는 자외선에 의한 신호전달에 의해 시작되며, 이를 초기에 차단할 수 있는 항산화제나 단백질 분해효소의 발현억제효과를 지닌 레티노이드 및 단백질 저해제(inhibitor) 등에 의해 피부노화를 방지할 수 있으며 이들은 임상적으로 효과가 증명되고 있다.

피부노화 메커니즘을 살펴보면, 먼저 자외선이나 외부환경적 요인에 의해 활성산소나 자유 라디칼이 생성되며, 생성된 활성산소나, 자유 라디칼에 의해 세포막이 공격을 당하게 되어 피부는 염증(inflammation)이 일어나며, 염증화된 (inflammated) 조직은 생리학적 진행 메카니즘에 의해 단백질이나 유전자 물질 등을 파괴. 주름 등을 형성하는 피부노화가 일어난다.

이에 피부노화 메커니즘에 관여되는 단계를 모두 억제, 막아 주는 것이 피부노화를 근본적으로 방지할 수 있는 방법에 해당될 것이다.

피부에 염증을 일으키는 인자로는 물리화학적 자극, 알러젠, 자외선, 산화 스트레스, 병원균 감염 그리고 이로 인해 이차적으로 생산된 염증관련 사이토카인, 케모카인 등이 있다.

피부 염증 반응의 일반적인 경로는 외부 자극으로부터 인체를 보호하기 위한 면역반응으로 염증반응 억제를 통한 염증의 조절이 치료의 주요 타겟이 되고 있다. 피부 염증의 병변에서 염증반응의 시작과 유지에는 피부림프구 관련 항원을 발현하는 T 세포나 호산구 등의 여러 염증세포가 병변에 침윤하는 과정에서 발생하는 사이토카인이나 케모카인이 관여하며 이와 관련된 수용체가 염증세포, 각질형성세포, 섬유아세포 등 여러 세포에 발현한다고 알려져 있다, 케모카인은 사이토카인의 한 군으로 현재 약 50여종 이상이 알려졌다. 이들은 조직이 염증반응을 일으키는 동안 그 부위에 적절한 면역세포를 끌어들이는 역할을 한다. 알러젠이나 자극원에 의해 피부가 자극되면 활성화된 랑게르한스 세포가 진피쪽으로 이동하게 되고 항원 자극을 받지 않은 naive T 세포에 항원을 전달하여 T 세포가 활성화된다. 한번 항원에 노출된 적이 있는 메모리 T 세포는 혈관을 따라 순환하다 병변 부위로 이동하여 보다 빠르게 활성화되어 효과적인 면역반응이 유도된다. 이러한 기전으로 설명되어지는 대표적인 피부질환인 알레르기 접촉피부염, 건선, 아토피 피부염 등은 T 세포가 매개하는 염증성 질환이다.

한편, 활성화된 헬퍼 T 세포는 B 세포를 자극하여 면역글로불린 E의 과다 생산을 유발한다. 면역글로불린 E는 자극, 홍반, 가려움과 같은 염증반응을 일으키고 비만세포를 자극하여 또 다른 염증경로인 COX(cyclooxygenase) 신호를 활성화한다. COX-1은 조직 내에서 내재적으로 일정하게 존재하는 반면, COX-2는 염증반응으로 유도되는데 다양한 자극에 의해 단기간 내에 급격히 발현되는 것으로 알려졌다. 대표적 염증인자인 COX-2의 발현 증가가 일산화질소(nitric oxide)의 생성에도 영향을 미치는 것으로 알려졌다.

현재 염증성 피부질환 치료제로는 스테로이드 제제, 국소 면역억제제, 국소 항생제 및 항히스타민 등이 사용되고 있으나, 상피 약물제제를 장기적으로 사용하는 경우 살이 트는 팽창선조, 피부위축, 모세혈관 확장, 스테로이드성 여드름, 다모증, 자반 등의 부작용이 일어날 수 있다. 특히 스테로이드제를 광범위한 부위에 바르면 피부를 통해 약제가 전신적으로 흡수되어 소아의 경우 성장을 방해할 수 있고, 성인은 골다공증과 같은 전신적인 부작용이 발생할 수 있다.

따라서, 천연물질로부터 유래되어 부작용이 적어 인체에 안전하면서도 화장료 조성물에 방부 효과를 부여하고, 노화 예방과 미백 효과 및 염증성 피부질환 개선 효과가 우수한 조성물의 개발이 필요한 실정이다.

KR 10-2019-0012324 A

본 발명의 목적은 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효 성분으로 포함하여, 항균, 항산화, 미백 및 항염증 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하여, 다양한 미생물에 대한 항균력 제공, 피부 노화 예방 및 개선, 피부 주름 개선, 미백 효과, 피부 염증 개선에 우수한 효과를 나타낼 수 있는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물은 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효 성분으로 포함한다.

상기 조성물은 아토피 피부염 및 지루성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염증성 피부질환을 예방하는 것이다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 추출 용매를 이용하여 추출되며, 추출 후, 0.1몰 염산 에탄올 용액을 이용한 속실렛 정제와 65% 에탄올 수용액을 이용하여 정제된 것이다.

상기 조성물은 대장균(Escherichia coil), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 진균(Aspergillus brasiliensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 균을 효과적으로 제거하여 항균 및 방부 효과를 갖는 것이다.

상기 조성물은 자유 라디칼 소거능 및 MDA(Malondialdehyde) 소거능을 통해 항산화 활성을 가지는 것이다.

상기 조성물은 티로시나아제 저해능 및 멜라닌 생성 억제능을 통해 미백 효과를 나타내는 것이다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 토너는 상기 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 에멀전은 상기 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물을 유효성분으로 포함하여 제조한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 명세서에서, "예방" 이라 함은 피부를 보호하여 피부 노화 및 손상을 막거나, 억제하거나, 지연시키는 것을 말하며, "개선" 이라 함은 피부 노화 및 손상을 치유하거나, 완전히 치유하지 않아도 증상의 진전, 악화를 억제하여 손상의 진행을 멈춤 및 증상의 일부 혹은 전부를 치유의 방향으로 유도하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물은 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효 성분으로 포함한다.

인진쑥(Artemisia capillaris)은 우리나라에서 자생하는 식물로 국화과(compositae)의 다년생 초본 식물이며, 더위지기, 애탕쑥이라고도 불린다. 인진쑥은 주로 어린순이 사용되며, 항염, 항균, 항여드름, 항산화, 이뇨제, 황달 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 주요 성분으로는 폴리페놀의 일종인 클로로겐산(chlorogenic acid), 카페익산(caffeic acid)부터 정유 성분인 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid)까지 다양한 성분들이 포함되어 있다.

올리브는 올리브 나무(olea europaea)의 열매로, 이탈리아를 비롯한 지중해 유역의 요리에서 많이 쓰이며 이들의 음식문화에서 매우 중요한 역할을 한다. 생올리브는 특유의 쓴맛이 있지만 일정 기간 동안 물이나 소금물 혹은 알칼리 용액에 절이면 쓴맛이 사라지고, 고유의 풍미가 살아나며 질감도 부드러워진다. 올리브오일로 더 잘 알려져 있지만 올리브만으로도 전채 요리나 곁들임 요리가 되며, 샐러드, 파스타, 피자 등에 넣기도 한다. 전체 열량의 80~85%가 지방이지만 대부분이 몸에 좋은 불포화 지방산으로, 항산화와 항염 성분이 풍부해 세계적인 건강식품으로 인정받고 있다.

또한, 올리브에는 비타민E 와 스쿠알렌, 불포화 지방산인 올레산이 들어 있어 노화 방지에도 효과적이며, 올리브 오일은 아젤릭산이 포함되어 있어 건성피부나 각질, 모발 등에 영양을 공급해 주고, 건성피부나 아토피성 피부에 좋은 효과를 주어 피부마사지 시 혈액순환을 촉진시키며, 올리브 오일에 함유된 불포화지방산으로 인하여 피부장벽 기능이 강화되어, 외부 유해환경에 대한 피부의 방어작용을 증가시켜 준다.

아토피 피부염(atopic dermatitis)은 소양증, 피부 건조증, 습진 등을 동반하는 염증성 질환 또는 유전적, 환경적, 면역학적 원인으로 인하여 피부의 가장 바깥에 위치한 피부 보호벽인 각질층에 이상이 생겨서 발생하는 질환으로 건조한 기후에서는 더욱 심해지는 경향이 있다. 그러므로 아토피 피부염의 피부건조증을 개선을 위한 보습제의 사용과 피부장벽 기능의 회복력 증가는 아토피 피부염 치료에서 중요한 위치를 차지한다.

아토피 피부는 만성적으로 건조하므로 각종 자극에 의해 쉽게 습진이 유발되고, 소양감이 심하며, 반복적으로 재발되는 특징을 가지고 있다. 이러한 소양감과 습진은 피부 건조증에 의해 반복적으로 약화되며 적절한 관리를 하지 않으면 결국 태선화, 색소변화, 홍피증 등의 아급성, 만성병변으로 진행된다. 면역학적 이상과 동반하여 표재성 모낭염, 피틸로스포럼 모낭염, 전풍, 표재성 피부사상균증, 사마귀, 재발성 단순포진 등이 흔하다. 세균성 감염은 대개 코아귤라제 양성 포도상구균에 의하며, 주로 팔, 다리에 표재성의 소양감을 가진 모낭염 병변으로 나타나고, 심부조직의 농양 및 봉와 직염을 잘 동반하지는 않으나 심한 정도의 재발성 환상 습진병변에 동반되는 경우는 전신증상을 동반하는 재발성 봉와 직염을 일으킬 수 있다.

지루성 피부염(Seborrhoeic dermatitis)은 피지의 분비가 많은 부위(머리, 이마, 겨드랑이 등)에 발생하기 쉬운 만성염증성 피부질환으로, 홍반(붉은 반점)과 가느다란 인설(비듬)이 흔하게 나타난다. 생후 3개월 이내, 그리고 40~70세 사이에 나타나기 쉬우며, 특히 성인 남자의 3~5%에서 발생하는 매우 흔한 질환이다.

상기 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물은 건조한 인진쑥 및 올리브를 분쇄한 분쇄물을 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 탄소수 1 내지 6의 알코올과 같은 극성 용매 또는 알코올과 물의 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합 용매로 용출할 수 있으며, 보다 상세하게는 추출 용매로 물을 이용할 수 있다. 이때, 추출 온도는 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 80℃ 내지 90℃에서 추출한 추출물일 수 있다.

상기 추출 용매는 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 72시간 동안 방치될 수 있으며, 상세하게는 4 내지 6시간 동안 방치될 수 있다.

여과된 추출물을 진공 회전 농축기로 감압 농축하여 수득한 결과물일 수 있으나, 본 발명의 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물인 한, 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다.

이때 희석 용매로는 부틸렌글라이콜, 부탄다이올, 프로판다이올이 적합하다.

상기 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물은 혹돌잎(Lithophyllum okamurai) 추출물을 추가로 포함한다.

혹돌잎(Lithophyllum okamurai)은 홍조식물로 두께는 0.6mm 정도 되고, 작은 돌이나 그 밖의 물체 표면을 싸며, 혹 모양의 돌기를 내고 자란다. 온몸은 석회질로 덮여 있고 분홍색 또는 붉은색을 띤다. 원주상을 한 돌기가 가지에 해당되고, 그 끝은 둥글며 표면은 매끈하다. 한국에서는 제주와 남해안에서 채집된다.

또한, 상기와 같은 해조류에 함유되어 있는 다당류는 알긴산(Alginic Acid)과 후코이단(Fucoidan)으로, 상기 알긴산(Alginic Acid)은 식이섬유의 일종으로 세포 내 신진대사를 활발하게 하여 피부와 모발을 건강하게 하며, 피부 속 콜라겐이나 엘라스틴과 같은 탄력세포의 형성을 도운다. 피부미네랄이라 불리는 아연이 풍부하여 여드름과 뾰루지와 같은 피부트러블을 없애는데 도움이 된다.

상기 후코이단(Fucoidan)은 해조류가 파도, 햇빛으로부터 스스로를 보호하기 위하여 분비하는 물질로서 매우 탁월한 천연 보습제 역할을 하며, 최근 연구를 통해 후코이단은 세포의 활성을 도와 자외선으로부터 피부를 보호하는 효과가 확인되었다.

상기 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물에 혹돌잎 추출물을 혼합하여 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물을 제조하며, 상기 혼합 사용에 따른 상승효과에 따라 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물만 사용한 경우에 비해 우수한 항균, 항산화 및 항염증 효과를 낼 수 있다.

바람직하게 상기 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물은 인진쑥 추출물 100 중량부에 대하여, 올리브 추출물 100 중량부, 혹돌잎 추출물 40 내지 60 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 각 추출물의 상호 작용에 의한 상승효과로 임계적 의의가 있는 정도의 상승효과가 발현되며, 상기 범위를 벗어나는 경우 상승효과가 급격히 저하되거나 거의 없게 된다.

보다 바람직하게 본 발명에서는 항균, 항산화 및 항염증 효과 증진 및 기호성 향상을 위해, 검인 추출물 및 무루자(無漏子) 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

상기 검인은 가시연꽃의 종자로, 가시연꽃의 종자 성숙기에 채취하여 종자만을 꺼내어 햇볕에 말린 것을 의미한다. 상기 가시연꽃(Euryale ferox Salisb.)은 늪이나 연못에 자라는 일년초로 가시가 있으며 수염뿌리가 많이 나온다. 종자가 발아해서 나오는 잎은 작으나 점차 큰 잎이 나오며 표면에 주름이 진다. 꽃은 7 내지 8월 가시가 돋는 긴 꽃자루가 자라서 끝에 1개 달린다. 열매는 액과로 둥글며 종자는 육질 종의에 싸인다.

상기 무루자는 소철(Cycas revoluta Thunb.)의 익은 종자 말린 것을 의미한다. 상기 소철은 공원이나 정원에 조경수로 식재하는 상록성 떨기나무 또는 작은큰키나무로 높이 1 내지 4m, 지름 20 내지 30cm이다. 줄기 껍질은 잎자국으로 둘러싸여 자란다. 잎은 줄기 끝에 모여 달리고 1회 깃꼴겹잎이며 작은잎은 선형이며 길이 8 내지 20cm, 폭 5 내지 8cm, 가장자리가 밋밋하며 약간 뒤로 말려 있다. 꽃은 6 내지 8월에 암수딴그루에 핀다. 수꽃차례는 줄기 끝에 곧게 서고 원기둥 모양이며 길이 50 내지 60cm, 폭 10 내지 13cm, 많은 비늘조각으로 되며 비늘조각 안에 수술대가 없는 꽃밥이 붙어 있다. 암꽃차례는 원줄기 끝에 둥글게 모여 달리며, 자루에 2 내지 8개의 배주가 어긋나서 붙고 위쪽에 황갈색 털이 빽빽하게 나 있다. 열매는 구과이며, 10월에 익는데 씨는 길이 4cm쯤이고, 붉은색이다. 우리나라 남부지방, 제주도 등에서 식재하며, 일본, 중국, 타이완 등 자생지에서는 해안가에 분포한다. 관상용으로 식재하고, 열매를 식용, 약용한다.

상기 검인 추출물 및 무루자 추출물을 추가로 포함할 경우, 복합 추출물로 구성함에 따라, 인진쑥 추출물, 올리브 추출물 및 혹돌잎 추출물만을 혼합으로 사용하는 경우에 비해, 항산화 및 항염증 효과를 동등 또는 상승시키고, 더 나이가 기호성 높은 조성물로 제공을 가능하게 한다.

바람직하게 본 발명의 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물은 인진쑥 추출물 100 중량부에 대하여, 올리브 추출물 100 중량부, 혹돌잎 추출물 40 내지 60 중량부, 검인 추출물 10 내지 20 중량부 및 무루자 추출물 10 내지 20 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 세포독성이 낮아 상대적으로 높은 농도에서 안정적으로 사용할 수 있는 장점이 있으며, 쑥 및 해조류 특유의 이취로 인한 떨어지는 기호도를 상승시킬 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌증, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 제형 또는 연고로 제조될 수 있다.

또한, 필요에 따라 기능적 물질, 예컨대 미백제, 보습제, 항염증제, 항균제, 비타민, 자외선 차단제, 항생제, 여드름 방지제, 향수, 염료가 포함될 수도 있으며, 이들은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 양으로 본 발명에 따른 화장용 조성물에 포함될 수 있다.

상기 피부학적으로 허용된 담체는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제, 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 방부제, 저급 알코올 등이 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 그 종류와 농도는 다양하고, 당업자가 본 발명의 범위 내에서 변경할 수 있는 부분을 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물로부터 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다.

상기 화장품은 본 발명의 추출물 이외에도 피부학적으로 허용된 매질 또는 기제를 함유함으로써 당업계에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트 또는 미용액 등이 있다. 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클 렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

본 발명의 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물에 의하면 항산화, 미백 및 항염증 활성을 통해, 피부 노화, 피부 주름, 미백 효과 및 피부 염증을 예방 및 개선할 수 있으며, 항균활성을 통해 화장품 또는 그에 포함되는 원료에 우수한 방부력을 제시해 줄 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 조성물을 농도별로 처리했을 때 DPPH 자유 라디칼 소거능에 대한 실험 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 조성물을 농도별로 처리했을 때 MDA(Malondialdehyde) 소거능에 대한 실험 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 조성물을 농도별로 처리했을 때 티로시나아제 소거능에 대한 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 조성물을 농도별로 처리했을 때 멜라닌 생성량에 대한 실험 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 조성물의 일산화질소 및 프로스타글란딘의 소거능에 대한 실험 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 조성물을 농도별로 처리했을 때 염증성 사이토카인의 양을 비교한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 조성물을 농도별로 처리했을 때 인터루킨-6의 양을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예 1: 추출물의 제조]

1. 인진쑥 추출물의 제조

인진쑥을 세척하고 건조한 뒤 이를 분쇄하였다. 상기 분쇄물을 물에 혼합하고 이를 6시간 동안 80 내지 90℃를 유지하고, 이를 냉각시킨 뒤 와트만 여과지로 여과한 후 그 여액을 70℃에서 감압농축 하여 1차 인진쑥 추출물 파우더를 수득 하였다. 이 인진쑥 추출물 파우더를 속실렛 장치에 넣고 0.1몰 염산 에탄올 수용액으로 환류 시켜 얻은 1차 정제 인진쑥 추출물 파우더를 다시 50℃로 가온 된 65% 에탄올 수용액에 넣어 용해 후 불순물은 와트만 여과지로 여과하였다. 여액은 10℃ 이하로 냉각하여 재결정된 물질을 60℃도에 진공건조 하여 최종적인 인진쑥 추출물(AE)을 제조하였다.

2. 올리브 추출물의 제조

상기 인진쑥 추출물(AE)과 동일한 방법으로 올리브 추출물(OE)을 제조하였다.

3. 인진쑥 추출물과 올리브 추출물의 혼합물 제조

상기 제조된 인진쑥 추출물(AE) 및 올리브 추출물(OE)을 인진쑥 추출물(AE), 올리브 추출물(OE) 및 프로판다이올(Propanediol) 0.9/0.1/9의 비율로 혼합하여 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물(MX1)을 제조하였다.

[실험예 1: 조성물의 항균력에 의한 미생물의 생육 억제 효과 실험]

인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물(MX1)에 대한 항균력을 측정하기 위해, 화장품 업계에서 주로 평가하는 세균 3종과 진균 2종을 표 1과 같이 선정하였으며, 여드름, 무좀, 비듬을 유발하는 균주를 표 2와 같이, 그리고 피부상 재균 뿐만 아니라 비뇨기과 및 성 관련 질환 원인 균주를 표 3과 같이 선정하여 시험을 진행하였다.

	균주명	strain number
세균	Escherichia coil	ATCC 8739
	Staphylococcus aureus	ATCC 6538
	Pseudomonas aeruginosa	ATCC 9027
진균	Candida albicans	ATCC 10231
진균	Aspergillus brasillensis	ATCC 16404

균주명	strain number
Propionibacterium acnes	ATCC 6919
Malassezia furfur	ATCC 14521
Trichophyton mentagrophytes	ATCC 9533

균주명	strain number
Gardnerella vaginalis	ATCC 14019
Neisseria gonorrhoeae	ATCC 19424
Chlamydia trachomatis	ATCC VR-885
Ureaplasma urealyticum	ATCC 27618
Ureaplasma parvum	ATCC 27815
Mycoplasma genitalium	ATCC 33530
Mycoplasma hominis	ATCC 23114
Trichomonas vaginalis	ATCC 30001
Treponema phagedenis	ATCC 27807
Mycobacterium smegmatis	ATCC 19420

선정된 균주를 이용하여 항균력을 측정하기 위해, MIC test를 진행하였다.

MIC는 minimal inhibitory concentration의 약자로서 세균의 발육을 억제할 수 있는 최소한의 항균제 농도를 의미한다.

시험을 위해 세균은 2×10⁷ CFU/mL, 진균은 2×10⁶ CFU/mL로 준비한다. Microtube에 시험하고자 하는 시료를 세균용, 진균용 따로 담아 세균용은 NB(nutrient broth)로 진균용은 PDB(potato dextrose broth)를 담아 확실히 섞어준다. 96 웰 플레이트의 맨 위 칸에 준비한 시료를 0.1 mL씩 넣어준다 (세균용과 진균용을 구분하여 넣어준다).

상기에서 준비한 균주를 96 웰 플레이트 전체에 0.1 mL씩 채운 후 맨 위칸부터 1/2씩 희석해준다. 이 때 아래칸은 시료와 희석하지 않고 균액만 두어 blank로 사용한다. 모든 과정이 끝나면 96 웰 플레이트를 37℃에서 배양한다. 결과 평가는 다음과 같다. 세균 3종의 확인은 18 ~ 24시간, C. albicans의 경우 32 ~ 56시간, A. brasillensis의 경우 36 ~ 72시간 후에 꺼내어 육안으로 혼탁도 여부를 측정하여 균의 성장 여부를 확인한다. 이 때, 최소저해농도는 혼탁도가 사라지는 시점의 농도로 설정하여 표기한다.

결과는 하기 표 4 내지 표 6과 같다. 표 4에 따르면, 본 조성물은 시험 균주 5종에 대해 0.5% ~ 1%의 농도에서 최소저해농도를 보임으로써, 균의 종류와 관계없이 균일한 항균력을 나타내는 것을 확인하였다.

No.	Sample	E.coli	S.aureus	P.aeruginosa	C.albicans	A.brasillensis
1	1,2-HD	1.0	2.0	1.0	1.0	1.0
2	MX1	0.5	1.0	1.0	1.0	1.0

(단위: %)

No.	Sample	P.acnes	M.furfur	T.Mentagrophytes
1	1,2-HD	2.0	2.0	2.0
2	MX1	1.0	1.0	1.0

(단위: %)

No.	Strain	MIC value
1	Gardnerella vaginalis	1.0
2	Neisseria gonorrhoeae	0.5
3	Chlamydia trachomatis	1.0
4	Ureaplasma urealyticum	1.0
5	Ureaplasma parvum	1.0
6	Mycoplasma genitalium	10.0
7	Mycoplasma hominis	1.0
8	Trichomonas vaginalis	0.5
9	Treponema phagedenis	1.0
10	Mycobacterium smegmatis	0.5

(단위: %)

상기 표 5에 따르면, 본 조성물은 여드름, 무좀, 비듬을 유발하는 각각의 균주에 대해 1%의 농도에서 최소저해농도를 보였으며, 표 6에 따르면, 본 조성물은 비뇨기과 및 성 관련 질환 원인균주 각각에 대해서도 0.5% ~ 1.0%의 최소저해농도를 보임으로써, 피부상재균 뿐 아니라 다양한 병원성 균주에 대해서도 균일한 농도에서 항균력을 발휘하는 것을 확인하였다.

상기 결과들은 화장품 업계에서 방부제로 가장 널리 쓰이는 1,2-hexanediol과 비교하여 평가하였으며, 대부분의 시험 균주들에 대해 1,2-hexanediol의 절반 정도 농도에서 동일한 수준의 항균력이 확인되었다.

따라서, 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물은 넓은 범위에서 우수한 항균력을 발휘함을 알 수 있다.

[실험예 2: 조성물을 포함하는 화장품 제형의 방부력 효과 시험]

인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물(MX1)을 포함하는 기본 제형 2종에 대한 방부력을 측정하기 위해, 화장품 업계에서 평가하는 세균 3종과 진균 2종을 상기 표 1과 같이 선정하여 방부력 시험을 진행하였다. 방부력 시험을 진행하기 위해 제조한 기본 제형 2가지는 하기 제형 예 1 및 제형 예 2와 같다.

제형 예 1. 토너

상기 토너를 하기 표 7의 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.

	원료	함량(%)
A	Disodium EDTA	0.02
	Cirtic acid	0.03
	Sodium citrate	0.10
	Glycerin	2.00
	Water	To 100
B	PEG-60 Hydrogenated Casor Oil	0.10
	Perfume	0.02
	1,3-Butylene Glycol	2.00
C	MX1	1.00

제형 예 2. 에멀전

상기 에멀전을 하기 표 8의 조성 성분 및 조성비에 따라 통상적인 방법으로 제조하였다.

	원료	함량(%)
A	Ammonium Acryloyldimethyltaurate/VP Copolymer	1.50
A	Caprylic/Capric Triglycerides	10.00
B	Cetearyl Olivate/Sorbitan Olivate	5.00
B	Water	To 100
C	MX1	1.00

선정된 균주를 이용하여 방부력 시험을 진행하기 위해, 시험할 균주를 세균은 2×10⁸ CFU/mL, 진균은 2×10⁷ CFU/mL로 준비한다. 방부력을 평가하기 위한 시료를 정확하게 20.0g씩 멸균된 용기에 나누어 담는다. 이 때, 시료별로 시험 대상균의 수만큼 준비한다. 상기에서 준비한 접종 균을 20.0g씩 나누어 담은 용기에 0.2 mL씩 각각 접종한 후 접종 균액이 시료에 균일하게 분포할 수 있도록 잘 섞는다. 접종 후 25℃에서 4주 동안 배양하며, 매 1주 간격으로 시료 중 1g을 회수하여 희석액 9 mL에 혼합 후 단계 별 희석하여 생균수를 측정한다. 각 균 회수 시점 별 균감소는 아래 식에 따라 계산한다.

감소율: D₀-D_X/D₀Х100(%)

Log reduction: Log(D₀)-Log(D_X)

D₀: 접종균수 (CFU/g)

D_X: X주차에서 회수된 균수 (CFU/g)

판정 기준은 다음과 같다.

[판정 기준]

세균: 1주차에 99.9% 이상 감소 (Log reduction 3.0 이상), 이후 시험기간 동안 증식 없음

진균: 1주차에 90% 이상 감소 (Log reduction 1.0 이상), 이후 시험기간 동안 증식 없음

결과는 하기 표 9 및 표 10과 같다.

	0 d	7 d	14 d	21 d	28 d
Bacteria	2.36 x 10⁶	99.99%	99.99%	99.99%	99.99%
Yeast	1.50 x 10⁵	99.99%	99.99%	99.99%	99.99%
Fungi	1.93 x 10⁵	99.98%	99.99%	99.99%	99.99%

	0 d	7 d	14 d	21 d	28 d
Bacteria	2.36 x 10⁶	99.99%	99.99%	99.99%	99.99%
Yeast	1.50 x 10⁵	99.99%	99.99%	99.99%	99.99%
Fungi	1.93 x 10⁵	99.99%	99.99%	99.99%	99.99%

상기 표 9 및 표 10에 따르면, 본 조성물을 포함하는 토너와 에멀전은 시험균주 5종에 대해 1주차 통과 기준에 부합하는 감소율을 보였으며, 이후 4주차까지 증식이 없는 것을 확인함으로써 제형의 형태나 균의 종류와 관계없이 고른 방부력을 나타내는 것을 알 수 있다.

[실험예 3: 조성물의 항산화 효과 시험]

인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물(MX1)의 항산화능을 확인하기 위해 자유 라디칼 소거능 평가 및 MDA(Malondialdehyde) 생성 감소능 평가를 하였다.

1. DPPH 자유 라디칼 소거능 평가

10 mg DPPH를 100 mL 메탄올(MeOH)에 용해시켜 100 ㎍/mL가 되도록 하였다. 본 조성물은 200 mg을 10 mL의 MeOH에 용해시킴으로써 제조한 후 단계적으로 희석하여 준비하였으며, 양성대조군으로써 자유 라디칼 소거능이 뛰어나다고 잘 알려진 Ascorbic acid를 설정하였다.

1 mL의 DPPH를 각각의 용액에 첨가하고 용액을 어둡게 유지하고 정확한 30분 동안 정치시켰다. 각 용액의 UV 흡수는 517 nm에서 기록하였다. 반응을 37 ℃에서 30 분간 진행시키고 517 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 흡광도를 모니터링 하였다. % 라디칼 소거 활성(% RSA)은 DMSO 함유 대조군과 비교하여 결정하였다. 라디칼 소거 활성(%)으로서의 DPPH에 의한 자유 라디칼의 소거는 다음과 같이 계산하였으며, 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다.

% RSA = (대조 흡광도 - 흡광도) X 100 / 대조 흡광도

도 1에 따르면, 조성물을 0.05% 부터 2%까지 사용하는 경우, 즉 함량이 증가될수록 DPPH 자유 라디칼 소거능이 향상되는 것을 확인하였다.

상기 실험 결과를 통해, 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물(MX1)의 경우, DPPH 라디칼 소거능이 우수하여 항산화에 의한 노화 억제 작용이 우수하다고 할 수 있다.

2. MDA(Malondialdehyde) 소거능 평가

MDA는 리놀레인산의 최종 산물로, 지질과산화 수준과 비례하여 발생한다. 불포화지방산은 생체내에서 효소반응에 의해 일정방향으로 산화되어서 물과 탄산가스가 된다. 한편, 비효소적자동산화의 경우에는 불포화지방산의 이중결합에 분자상의 산소가 직접 결합한 물질이 생긴다. 이것을 과산화지질이라고 일컫는다. 이 물질은 분자의 일부에 쌍이 아닌 전자가 생긴 상태(자유 라디칼)이므로 불안정하고 반응성이 매우 높다. 따라서 생체 내에서 생긴 과산화지질은 생체막계에 상해를 주고, 효소, 단백, 호르몬, 비타민 등을 실활 혹은 변성시켜 세포의 기능저하나 괴사를 야기하는 부작용을 가지고 있다. 임상적으로는 노화, 동맥경화증, 혈전증, 당뇨병, 피부질환, 호흡기질환, 간질환 등과의 관련성에 관해서 보고되어 있다. 염증 반응에 의해 활성산소가 생기면 지질 과산화(lipid peroxidation)가 진행되어 MAA protein이 분비되어 cytokine과 면역 반응을 악화시킨다고 알려져 있다.

상기 조성물을 정제수로 단계별로 희석하여 준비한 후, 4 mL의 시료와 1 mL의 13% 리놀레인산을 중탕교반기를 이용하여 섞어주었다. 이후 2.5 mL의 thiobarbituric acid(TBA) 용액을 넣은 후 10분 동안 반응시킨 후, 25℃에서 5000g로 10분 동안 원심분리 하여 상등액을 분리하고, 이를 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.

MDA 농도는 하기 식에 의해 계산하였으며, 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

MDA contents (%) = 100 [(A_c - A_s)/A_c]

A_c : 대조군 흡광도

A_s : 시료군 흡광도

도 2에 따르면, 상기 조성물을 0.01% 부터 2%까지 사용하는 경우, 즉 함량이 증가될수록 MDA 생성 저해능이 높아지는 것을 확인하였다.

따라서 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물(MX1)은 체내에서 발생한 자유 라디칼에 의한 지질과산화를 감소시켜 세포를 보호해 줌으로써, 항산화에 의한 노화 억제 작용이 우수하다고 할 수 있다.

[실험예 4: 조성물의 미백 효과 시험]

인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물(MX1)의 미백 효과를 확인하기 위해 티로시나아제 저해능 및 멜라닌 생성 억제능 평가를 하였다.

1. 티로시나아제 생성 억제

티로시나아제는 멜라닌 생합성에 관여하는 효소로써, 본 실험에서는 기질인 티로신과 티로시나아제의 작용에 의해 생성되는 DOPA quinone의 최대 흡수파장인 490 nm을 이용하여 티로시나아제의 활성 저해능을 평가하였다. 실험에 사용된 Mushroom tyrosinase와 L-tyrosine은 미국 시그마알드리치사로부터 상업적으로 구매하여 측정하였다.

실험에 앞서 양성대조군인 Kojic acid와 상기 조성물은 0.05M sodium phosphate buffer(pH 6.5)를 이용하여 적절한 농도로 희석하여 준비하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 0.1 M Sodium phosphate buffer(pH 6.5) 220 ㎕, 시료 20 ㎕, 2,000 U/mL mushroom tyroinase 20 ㎕를 넣은 후, 37℃에서 5분간 전배양을 하였다.

이후 1.5 mM L-tyrosine을 40 ㎕씩 넣고, 37℃에서 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

티로시나아제의 저해율은 하기 식에 의해 계산하였으며, 그 결과를 하기 도 3에 나타내었다.

Tyrosinase inhibition (%) = {1- (standard / 시료의 흡광도 ÷ blank 흡광도)} × 100

도 3에 따르면, 상기 조성물을 0.01% 부터 2%까지 사용하는 경우, 즉 함량이 증가될수록 티로시나아제 활성 저해능이 높아지는 것을 확인하였다. 또한 양성대조군인 Kojic acid 100 ㎍/mL과 비교하였을 때, 상기 조성물 1%의 농도에서 티로시나아제 활성 저해율이 비슷한 수준인 것으로 확인되었다.

따라서 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물(MX1)은 티로시나아제 저해능을 통해 멜라닌 생성을 저해하여 피부 미백에 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.

2. B16F10 멜라닌 형성 세포에 의한 멜라닌 생성 억제

B16F10 멜라닌 형성 세포는 마우스에서 유래한 세포주이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다. 본 시험예에 사용된 B16F10 멜라닌 형성 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양 받아 사용하였다.

B16F10 멜라닌 형성 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶ cells/mL 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 35℃ 배양기에서 상기 조성물을 0.01% 부터 0.1%까지 각각 첨가하여 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)로 떼어내고, 세포 수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan)의 방법을 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS(phosphate buffer saline)로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 mL를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해하고, 마이크로플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. 비교 실험을 위해 멜라닌 생성 억제 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 알부틴을 양성 대조군으로 사용하였다.

B16F10 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 하기식에 의해 계산하였으며, 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.

멜라닌 생성 저해율(%) = {(A-B)/A} X 100

도 4에 따르면, 조성물을 0.01% 부터 0.1%까지 사용하는 경우, 즉 함량이 증가될수록 멜라닌 생성 저해능이 높아지는 것을 확인하였다.

[실험예 5: 조성물의 항산화 및 항염증 효과 시험]

인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물(MX1)의 피부 염증 억제 및 개선 효과를 확인하기 위해 항염 효과 평가를 하였다.

1. LPS(Lipopolysaccharide) 유도 Nitric oxide 및 PGE₂ 생성 억제능

상기 조성물의 항염 활성 효과를 확인해보기 위해 대식세포를 이용하여 일산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E₂(PGE₂)의 생성에 대한 효과를 알아보았다.

대식세포는 외부로부터 침입한 세균이나 곰팡이를 탐식하기 위해 세포막에서 활성산소를 내뿜어서 이물질을 용해시킨다. 그러나, 대식세포의 활성이 지속적으로 증가하여 이러한 반응이 빈번해지고 활성산소의 분비량이 많아지면 활성산소가 세포 밖까지 유출되어 다른 혈관벽이나 조직을 공격하여 병에 걸리게 된다. 또한 프로스타글란딘 E₂ 또한 대식세포의 활성에 의해 발생되는 염증성 인자이며, 혈관확장, 기관지확장, 위산억제, 염증, 발열 등의 증상을 일으킨다. 이러한 대식세포의 특징을 이용하여 어떠한 물질의 항염 효능을 측정할 수 있다. 실험에 사용된 세포는 RAW264.7(Mouse macrophage)이며, 37℃, 5%의 CO₂, 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50 ㎍/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 세포를 96 웰 플레이트에 1×10⁵ cells/well의 농도로 넣어준 후, 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포의 배지를 제거하고 시료를 처리한 새 배지로 교환한 후 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 30분 동안 전배양 하였다. 30분간 배양 후 LPS를 1 ㎍/mL이 되도록 처리하여 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 상층액을 100 ㎕씩 취하여 새 96 웰 플레이트에 옮긴 후, griess reagent A와 B를 1:1로 혼합한 후 100 ㎕씩 분주한다. Griess reagent를 처리한 즉시 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 대식세포의 NO 생성율(%)은 하기식에 의해 계산하였으며, 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.

NO 생성량(%) = 시료첨가구의 흡광도/대조구의 흡광도 × 100

PGE₂의 생성 또한 상기의 방법과 유사하게 진행하였다. 배양 후 상층액을 100 ㎕씩 취하여 새 96 웰 플레이트에 옮긴 후, 실험자의 성향 및 실험 환경을 고려하여 배양배지를 사용하여 10 ~ 20배 희석하였다. Anti-Mouse IgG plate의 NSB 웰에 배양배지를 100 ㎕ 넣고 Standard와 sample(희석한 상층액)을 각 웰에 100 ㎕씩 넣은 후, blank 웰을 제외한 모든 웰에 blue PGE₂-AP conjugate를 50 ㎕씩 넣었다. NSB 웰에 배양배지를 50 ㎕를 넣고, blank와 NSB 웰을 제외한 모든 웰에 yellow PGE₂ antibody를 50 ㎕씩 넣고, 상온(22~25℃) 조건에서 orbital shaker를 사용하여 500 rpm으로 2시간 동안 shaking하였다. 2시간 후 플레이트의 내용물을 버린 후 400 ㎕의 washing buffer로 3번 세척한 후 각 웰에 200 ㎕의 substrate solution을 넣고, 상온 (22~25℃)에서 45분간 배양하였다. 배양 후 각 웰에 50 ㎕의 stop solution을 넣고, 즉시 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대식세포의 PGE₂ 생성율(%)은 하기식에 의해 계산하였으며, 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.

Standard curve = 자연로그를 이용, y=A*ln(x) + B의 방정식을 얻는다.

% bound = [(시료의 흡광도-NSB 흡광도)/(Blank 흡광도-NSB 흡광도)]*100

위의 두 식을 이용하여, PGE₂ 생성량 = 희석배수*(e(%bound-B))/A

도 5에서 보는 바와 같이, 상기 조성물을 0.01% 부터 0.1%까지 사용하는 경우, 즉 함량이 증가될수록 NO 및 PGE₂ 생성이 감소되는 것을 확인하였다.

따라서 상기 조성물은 항원 등의 외부자극에 의해 발생되는 발열, 부종, 홍반 등의 염증 반응에 대해 우수한 항염 효과가 있음을 알 수 있다.

2. 자외선 조사에 의해 유도된 염증성 사이토카인 억제능

상기 조성물의 항염 활성 효과를 확인해보기 위해 초기 염증성 분자 중 하나인 TNF-α, COX-2, IL-1b 생성에 대한 효과를 알아보았다. TNF-α와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 형성은 포스포리파제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글란딘(prostaglandin)으로 바뀌는 과정 및 일산화질소(NO) 형성 과정으로 이어지게 된다. 실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Skin Keratinocytes cell line)이며 37℃, 5%의 CO₂, 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50 ㎍/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 후 1시간 동안 UV를 조사하여 세포에 스트레스를 주었다. 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사한 세포를 사용하였다.

RNA 분석을 위해 세포 내의 total RNA를 세포 배양으로부터 Trizol reagent(Invitrogen, USA)를 사용하여 추출하였다. RNA의 순도와 무결성은 A260nm/A280nm비율 측정을 통해 확인하였고, RNA 수율은 260nm에서 흡광도로 측정하였다.

cDNA합성은 3 ㎍의 total RNA를 Oligo dT 15(500 ng/㎕) primer, dNTP (10 mM), RTase inhibitor(40 U/㎕), Powerscript Ⅱ RTase(Clontech, USA)를 첨가하여 25℃에서 10분간 primer annealing, 42℃에서 60분간 cDNA를 합성하고 95℃에서 5분간 RTase denaturation 시켰다. PCR은 cDNA로부터 TNF-α, COX-2, IL-1b의 GAPDH를 증폭하기 위하여 cDNA 3 ㎕, 10X taq polymerase buffer 5 ㎕, 10 mM dNTP 2 ㎕, 10 pmol primer 각각 2 ㎕, taq polymerase 0.5 ㎕를 혼합하고 증류수를 더하여 50 ㎕로 조정한 후 증폭시켰다. 프라이어 서열은 표 11에 나타내었다.

PCR에 의하여 생성된 산물은 1% 아가로우스 겔(agarose gel)에서 전기 영동하여 image analyzer(UGEN, U:Genius)로 확인하였으며 각 밴드의 밀도는 밀도계측프로그램(Gene Tools from Syngene)을 이용하여 측정하였다.

Gene	Primer
GAPDH	F: 5'- AAC GAA TTT GGT CGA ACA GC-3'
GAPDH	R: 5'- TGA GGA GGG ATT CAG TG-3'
IL-1b	F: 5' - GTC TCT GAA TCA GAA ATC CTT CTA TC - 3'
IL-1b	R: 5' - CAT GTC AAA TTT CAC TGC TTC ATC C - 3'
TNF-a	F: 5' - CAA AGT AGA CCT GCC CAG AC - 3'
TNF-a	R: 5' - GAC CTC TCT CTA ATC AGC CC - 3'
COX-2	F: 5' - GTC CCT GAG CAT CTA CGG TTT G - 3'
COX-2	R: 5' - CCC ATT CAG GAT GCT CCT GTT - 3'

도 6에서 보는 바와 같이, 상기 조성물을 0.01% 부터 0.1%까지 사용하는 경우, 즉 함량이 증가될수록 염증성 사이토카인 발현의 억제가 월등하게 나타나는 양상을 보여, 높은 항염 효과를 가지는 것으로 나타났다.

따라서 상기 조성물은 다양한 외부자극(자외선, 항원 등)에 의해 발생되는 피부자극을 감소시킴으로써, 발열, 부종, 홍반 등의 염증 반응에 대해 우수한 항염 효과가 있음을 알 수 있다.

3. 자외선 조사에 의해 유도된 인터루킨-6 억제능

상기 조성물의 항염 활성 효과를 확인해보기 위해 염증성 분자 중 하나인 인터루킨-6(IL-6) 생성에 대한 효과를 알아보았다. 인터루킨-6는 발열 및 급성 염증반응을 매개하는 단백질이며, 아토피, 건선 등 각종 피부질환을 일으키는 원인으로 알려져 있다. 실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Skin Keratinocytes cell line)이며 37℃, 5%의 CO₂, 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50 ㎍/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 세포를 96 웰 플레이트에 1×10⁵ cells/well의 농도로 넣어준 후, 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포의 배지를 제거하고 시료를 처리한 새 배지로 교환한 후 37℃, 5%의 CO₂ 배양기에서 30분 동안 전배양 하였다. 배양 후 1시간 동안 UV를 조사하여 세포에 스트레스를 주었다. 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사한 세포를 사용하였다. 배양 후 상층액을 100 ㎕씩 취하여 새 96 웰 플레이트에 옮긴 후, Thermo Fisher사의 IL-6 Human ELISA Kit를 이용하여 실험을 수행하였다.

도 7에서 보는 바와 같이, 상기 조성물을 0.01% 부터 0.1%까지 사용하는 경우, 즉 함량이 증가될수록 인터루킨-6 발현의 억제가 월등하게 나타나는 양상을 보여, 높은 항염 효과를 가지는 것으로 나타났다.

따라서 상기 조성물은 다양한 외부자극(자외선, 항원 등)에 의해 발생되는 피부자극을 감소시킴으로써, 발열, 부종, 홍반 등의 일반적인 염증 반응뿐 아니라 아토피와 같은 급성 염증 반응에 대해서도 우수한 항염 효과가 있음을 알 수 있다.

[제조예 2: 복합 추출물의 제조]

1. 복합 추출물의 제조

상기 제조예 1에서 제조된 인진쑥 추출물(AE)과 동일한 방법으로 혹돌잎 추출물(LE), 검인 추출물(FE) 및 무루자 추출물(GE)을 제조하였다.

2. 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물

상기 제조예 1에서 제조된 인진쑥 추출물(AE) 및 올리브 추출물(OE)을 유효성분으로 포함하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물(MX1)과 동일한 방법으로 인진쑥 추출물(AE), 올리브 추출물(OE), 혹돌잎 추출물(LE), 검인 추출물(FE) 및 무루자 추출물(GE)을 하기 표 12과 같은 함량 범위로 혼합하여 항균, 항산화 미백 및 항염증용 화장료 조성물을 제조하였다.

	MC1	MC2	MC3	MC4	MC5	MC6
AE	100	100	100	100	100	100
OE	100	100	100	100	100	100
LE	-	30	40	50	60	70
FE	-	-	5	10	20	30
GE	-	-	5	10	20	30

(단위: 중량부)

[실험예 6: 복합 추출물의 항균, 항산화, 미백 및 항염증 효과 시험]

상시 실험예 1 내지 5에서 실시한 MX1의 실험과 동일한 실험을 진행한 후, 상기 제조예 2에 의하는 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 조성물(MC1 내지 MC6)의 효과 시험을 진행하였다.

그 결과의 상대적인 비교를 위해, 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 혼합한 MC1의 효과를 지수 5로 두고, 복합 추출물 MC2 내지 MC6을 지수로 비교 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

지수가 높을수록 그 효과가 우수함을 의미한다.

	MC1	MC2	MC3	MC4	MC5	MC6
항균 활성	5	6	7	8	9	7
항산화 활성	5	5	6	7	8	6
항염증 효과	5	6	6	7	7	6

(단위: 지수)

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 혼합한 MC1 및 복합 추출물 MC2 내지 MC6에서 MC1과 동등 또는 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 복합 추출물(MC3 내지 MC6)의 경우 낮은 세포독성으로 안정성이 증가되면서 우수한 항균, 항산화, 미백 및 항염증 효과를 나타냈다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

인진쑥 추출물 및 올리브 추출물을 유효성분으로 포함하며,
혹돌잎 추출물, 검인 추출물 및 무루자 추출물을 더 포함하는
항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 아토피 피부염 및 지루성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염증성 피부질환을 예방하는 것인
항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 추출 용매를 이용하여 추출되며,
추출 후, 0.1몰 염산 에탄올 용액을 이용한 속실렛 정제와 65% 에탄올 수용액을 이용하여 정제된 것인
항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 대장균(Escherichia coil), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 진균(Aspergillus brasiliensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 균을 효과적으로 제거하여 항균 및 방부 효과를 갖는 것인
항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 자유 라디칼 소거능 및 MDA(Malondialdehyde) 소거능을 통해 항산화 활성을 가지는 것인
항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 티로시나아제 저해능 및 멜라닌 생성 억제능을 통해 미백 효과를 나타내는 것인
항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물을 포함하는
토너.
제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항균, 항산화, 미백 및 항염증용 화장료 조성물을 포함하는
에멀전.