KR102398425B1 - SIGLEC neutralizing antibody - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역 세포에서 억제 활성을 갖는 인간 Siglec에 결합하고, 이러한 Siglec의 억제 활성을 중화시키는 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 암 또는 감염성 질병의 치료를 위해 이용될 수 있다.The present invention relates to an agent that binds to human Siglec having inhibitory activity in immune cells and neutralizes the inhibitory activity of such Siglec. Such agents may be used for the treatment of cancer or infectious diseases.

Description

SIGLEC 중화 항체SIGLEC neutralizing antibody

관련 출원에 대한 교차 참조CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

본 출원은 모든 도면 및 서열 목록을 포함하여, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는, 2016년 3월 8일에 출원된 미국 가출원 제62/304,957호의 이익을 청구한다.This application claims the benefit of US Provisional Application Serial No. 62/304,957, filed March 8, 2016, which is incorporated herein by reference in its entirety, including all figures and sequence listings.

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발명의 분야field of invention

본 발명은 NK 및/또는 다른 면역 세포에서 억제 활성을 가지는 인간 Siglec 단백질에 결합하며, 이러한 Siglec의 억제 활성을 중화시키는 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 암 또는 감염성 질병의 치료를 위해 이용될 수 있다.The present invention relates to an agent that binds to human Siglec protein having inhibitory activity in NK and/or other immune cells, and neutralizes the inhibitory activity of Siglec. Such agents may be used for the treatment of cancer or infectious diseases.

NK 세포는 림프구 선조체로부터 골수에서 발달하는 단핵 세포이며, 형태적 특징 및 생물학적 특성에는 전형적으로 클러스터 결정기(CD) CD16, CD56, 및/또는 CD57의 발현; 세포 표면 상에서 알파/베타 또는 감마/델타 TCR 복합체의 부재; "자가" 주조직 적합성 복합체(MHC)/인간 백혈구 항원(HLA) 단백질을 발현하지 못하는 표적 세포에 결합하고 이를 사멸시키는 능력; 및 활성화 NK 수용체에 대한 리간드를 발현하는 종양 세포 또는 다른 질병을 갖는 세포를 사멸시키는 능력이 포함된다. NK 세포는 사전 면역화 또는 활성화가 필요 없이 몇몇 유형의 종양 세포주에 결합하고 이를 사멸시키는 이의 능력을 특징으로 한다. NK 세포는 또한 면역계에 대해 조절 효과를 발휘하는 가용성 단백질 및 사이토카인을 방출할 수 있고; 다회의 세포 분열을 거쳐 모체 세포와 유사한 생물학적 특성을 갖는 딸 세포를 생산할 수 있다. 보통, 건강한 세포는 NK 세포에 의한 용해로부터 보호된다.NK cells are mononuclear cells that develop in the bone marrow from lymphoid progenitors, and morphological characteristics and biological properties typically include expression of the cluster determinants (CDs) CD16, CD56, and/or CD57; absence of alpha/beta or gamma/delta TCR complexes on the cell surface; the ability to bind to and kill target cells that do not express the “self” major histocompatibility complex (MHC)/human leukocyte antigen (HLA) protein; and the ability to kill tumor cells or other diseased cells that express ligands for activating NK receptors. NK cells are characterized by their ability to bind and kill several types of tumor cell lines without the need for prior immunization or activation. NK cells can also release soluble proteins and cytokines that exert regulatory effects on the immune system; Through multiple cell divisions, it is possible to produce daughter cells with biological properties similar to those of the parent cells. Normally, healthy cells are protected from lysis by NK cells.

생물학적 특성에 기반하여, NK 세포의 조정에 의존하는 다양한 치료 및 백신 전략이 당분야에서 제안되었다. 그러나, NK 세포 활성은 자극 및 억제 신호가 둘 다 관여되는 복잡한 기전에 의해 조절된다. 간략하게, NK 세포의 용해 활성은 표적 세포 상에서 리간드와의 상호작용 시 양성 또는 음성 세포내 신호를 전달하는 다양한 세포 표면 수용체에 의해 조절된다. 이들 수용체를 통해 전달되는 양성 및 음성 신호 간 밸런스가 표적 세포가 NK 세포에 의해 용해(사멸)되는지 또는 용해(사멸)되는지 여부를 결정한다. NK 세포 자극 신호는 자연 세포독성 수용체(NCR), 예컨대 NKp30, NKp44, 및 NKp46뿐만 아니라 NKG2C 수용체, NKG2D 수용체, 소정 활성화 킬러 Ig-유사 수용체(KIR), 및 다른 활성화 NK 수용체(Lanier, Annual Review of Immunology 2005;23:225-74)에 의해 매개될 수 있다. NK 세포 억제 신호는 CD94/NKG2-A와 같은 수용체뿐만 아니라 주조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 I-분자를 인식하는 소정 억제 KIR에 의해 매개될 수 있다(Wagtmann et al. (1995) Immunity 5:439-449). 이들 억제 수용체는 다른 세포 상에 존재하는 MHC 클래스 I 분자(HLA 클래스 I 포함)의 다형성 결정기에 결합하며 NK 세포-매개 용해를 억제한다.Based on their biological properties, various therapeutic and vaccine strategies have been proposed in the art that rely on the modulation of NK cells. However, NK cell activity is regulated by complex mechanisms in which both stimulatory and inhibitory signals are involved. Briefly, the lytic activity of NK cells is regulated by various cell surface receptors that transmit positive or negative intracellular signals upon interaction with ligands on target cells. The balance between positive and negative signals transmitted through these receptors determines whether target cells are lysed (killed) or lysed (killed) by NK cells. NK cell stimulatory signals include natural cytotoxic receptors (NCRs), such as NKp30, NKp44, and NKp46, as well as the NKG2C receptor, NKG2D receptor, certain activating killer Ig-like receptors (KIR), and other activating NK receptors (Lanier, Annual Review of Immunology 2005;23:225-74). NK cell inhibitory signaling may be mediated by certain inhibitory KIRs that recognize major histocompatibility complex (MHC) class I-molecules as well as receptors such as CD94/NKG2-A (Wagtmann et al. (1995) Immunity 5:439). -449). These inhibitory receptors bind polymorphic determinants of MHC class I molecules (including HLA class I) present on other cells and inhibit NK cell-mediated lysis.

NK 세포의 용해 활성은 또한 siglec 폴리펩타이드에 의해 조절될 수 있다. Siglec(sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectin, 시알산-결합 면역글로불린-유사 렉틴)은 시알로글리칸에 결합하는 I-형 렉틴의 하위세트이며 세포 유형 및 분화에 의존하는 방식으로 조혈계 세포 상에서 우선적으로 발현된다. 시알산은 도처에서 발현되는 반면, 전형적으로 당단백질 및 지질의 말단 위치에서는, 하위말단 탄수화물 모이어티에 대한 결합 및 정체에 따라, 개별 Siglec 수용체에 의해 매우 특이적이고 독특한 시알로글리칸 구조만이 인식된다. Siglec은 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) α2-6 및 α2-3 결합을 함유하는 일반 포유류 시알로사이드 구조에 대해 낮은 일반적 친화도만을 갖는다.The lytic activity of NK cells can also be modulated by siglec polypeptides. Siglec (sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins) are a subset of type I lectins that bind sialoglycans and are hematopoietic cells in a cell type and differentiation-dependent manner. is preferentially expressed in While sialic acid is ubiquitously expressed, typically at terminal locations in glycoproteins and lipids, only highly specific and unique sialoglycan structures are recognized by individual Siglec receptors, subject to binding and retention to subterminal carbohydrate moieties. Siglec has only a low general affinity for common mammalian sialoside structures containing N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) α2-6 and α2-3 linkages.

Siglec은 일반적으로 2개 그룹으로 구분되며, 첫 번째 하위세트는 Siglec-1, Siglec-2, Siglec-4 및 Siglec-15로 이루어지고, Siglec의 CD33-관련 그룹에는 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-14 및 Siglec-16이 포함된다. CD33-관련 Siglec은 특히, 낮은 진화 보존도 및 여러 기전에 의해 신속히 변하는 서열을 특징으로 한다.Siglec is generally divided into two groups, the first subset consisting of Siglec-1, Siglec-2, Siglec-4 and Siglec-15, and the CD33-related group of Siglec includes Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-14 and Siglec-16. CD33-associated Siglec is characterized by, inter alia, low evolutionary conservation and rapidly changing sequences by multiple mechanisms.

Moretta 그룹(이탈리아, 제노바)에서 1999년에 최초 클로닝하여 특성규명하였으며 인간 CD33-관련 Siglec 수용체에 속하는 1형 막통과 단백질인 Siglec-7(CD328)은 시알산 결합 N-말단 V-세트 Ig 도메인, 2개의 C2-세트 Ig 도메인 및 하나의 면역-수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM) 및 하나의 ITIM-유사 모티프를 함유하는 세포질내 영역을 특징으로 한다. Siglec-7은 NK 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 호중구에서 구성적으로 발현된다. 상기 수용체의 세포외 도메인은 우선적으로 (2,8)-결합 디시알산 및 분기화 α 2,6-시알릴 잔기, 예컨대 갱글리오사이드 GD3에 의해 나타내는 것들에 결합한다.Siglec-7 (CD328), a type 1 transmembrane protein belonging to the human CD33-associated Siglec receptor, first cloned and characterized in 1999 by the Moretta group (Genova, Italy), contains a sialic acid-binding N-terminal V-set Ig domain, It is characterized by two C2-set Ig domains and an intracytoplasmic region containing one immune-receptor tyrosine based inhibition motif (ITIM) and one ITIM-like motif. Siglec-7 is constitutively expressed on NK cells, dendritic cells, monocytes and neutrophils. The extracellular domain of the receptor preferentially binds (2,8)-binding disialic acid and branching α 2,6-sialyl residues, such as those represented by the ganglioside GD3.

Siglec-9(CD329)는 2000년에 Varki 그룹에서 특성규명되었으며(예컨대, 문헌[Angata et al. J Biol Chem 2000; 275:22127-22135] 참고) 단핵구, 호중구, 수지상 세포, CD34+ 세포 및 NK 세포 상에서 발현된다. Siglec-9(뿐만 아니라 Siglec-8)는 시알산 및 설페이트를 둘 다 함유하는 시알로사이드 리간드에 대해 차별적인 특이성을 갖는 것으로 나타났으며, 설페이트의 위치가 특이성의 중요한 결정인자이다. Siglec-9는 암 세포 상에서 과발현되는 MUC16에 결합하는 것으로 나타났다. Siglec-7과 마찬가지로, Siglec 9도 시알산 결합 N-말단 V-세트 Ig 도메인, 2개의 C2-세트 Ig 도메인 및 하나의 면역-수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)와 하나의 ITIM-유사 모티프를 함유하는 세포질내 영역을 함유한다. 인간 Siglec-9의 N-말단 V-세트 Ig 도메인은 인간 Siglec-7의 N-말단 V-세트 Ig 도메인과 약 77%의 전반적인 아미노산 서열 동일성을 공유하며, 이들 두 siglec은 상이한 시알산 결합 특이성을 나타낸다.Siglec-9 (CD329) was characterized by Varki's group in 2000 (see, eg, Angata et al. J Biol Chem 2000; 275:22127-22135) monocytes, neutrophils, dendritic cells, CD34+ cells and NK cells. is expressed in Siglec-9 (as well as Siglec-8) has been shown to have differential specificity for sialoside ligands containing both sialic acid and sulfate, and the location of the sulfate is an important determinant of specificity. Siglec-9 has been shown to bind to MUC16, which is overexpressed on cancer cells. Like Siglec-7, Siglec 9 also contains a sialic acid binding N-terminal V-set Ig domain, two C2-set Ig domains and an immune-receptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) and one ITIM-like motif. contains an intracytoplasmic region that The N-terminal V-set Ig domain of human Siglec-9 shares about 77% overall amino acid sequence identity with the N-terminal V-set Ig domain of human Siglec-7, and these two siglec have different sialic acid binding specificities. indicates.

결합 검정은 Siglec-7과 유사하게, Siglec-9가 갈락토스에 대해 α2,3-글리코시드계 결합 또는 α2,6-글리코시드계 결합에서 시알산을 인식함을 보고하였다. Siglec-9 특이적 mAb를 이용하여, Zhang 등((2000) J. Biol. Chem. Vol. 275, No. 29: 22121-22126)은 Siglec-9가 단핵구, 호중구, 및 CD16+, CD56- 세포의 소수 집단에 의해 높은 또는 중간 수준으로 발현됨이 확인되었다고 보고하였다. 그러나, 약 50%의 B 세포 및 NK 세포 그리고 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 소수의 하위세트 상에서는 더 약한 발현이 관찰되었다. 저자들은 이의 높은 서열 유사성 정도에도 불구하고, Siglec-7 및 Siglec-9이 구별되는 발현 프로필을 갖는다고 결론지었다.Binding assays reported that, similar to Siglec-7, Siglec-9 recognizes sialic acid at α2,3-glycosidic bonds or α2,6-glycosidic bonds to galactose. Using Siglec-9-specific mAbs, Zhang et al. ((2000) J. Biol. Chem. Vol. 275, No. 29: 22121-22126) demonstrated that Siglec-9 was induced in monocytes, neutrophils, and CD16+, CD56- cells. It was reported that high or moderate expression was confirmed by a minority population. However, weaker expression was observed on about 50% of B cells and NK cells and a small subset of CD8+ T cells and CD4+ T cells. The authors concluded that, despite their high degree of sequence similarity, Siglec-7 and Siglec-9 have distinct expression profiles.

NK 및 다른 면역 세포 상에서 Siglec-9의 흥미로운 발현 프로필, 및 Siglec-9 중화에서의 잠재적인 치료 관심에도 불구하고, 현재까지 Siglec-9를 특이적으로 중화시키는 후보 치료제는 치료 용도를 위해 진전되거나 제안되지 않았다. 종양-연관 시알산 리간드에 의한 골수단핵구 계통 세포 상 Siglec-9의 연루는 미생물을 인식하고 직접 사멸시키는 NK 세포뿐만 아니라 호중구, 특화된 과립구에 의한 면역감독 및 종양 세포 사멸을 억제하는 것으로 보고되었다(Laubli et al. (2014) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 111(39): 14211-14216). Carlin 등((2009) Blood 113: 3333-3336)은 숙주 시알릴화 글리칸의 모방이 박테리아 병원체로 하여금 호중구 Siglec-9에 연루되어 선천성 면역 반응을 방해할 수 있도록 함을 보고하였다. Carlin 등은 항-Siglec-9 항체 191240(R&D Systems, inc.)을 Siglec-9에 대한 시알산 결합 부위로의 결합 및 시알산과의 상호작용 억제로서 설명한다. Carlin 등은 비-차단 항체(클론 E10-286, BD Biosciences inc.)와는 다르게, 클론 191240이 박테리아 세포에 대한 호중구의 활성화를 증강시킨다고 추가 보고하였다. 유사하게, 문헌[Laubli et al. (2014), 상기 문헌]은 항-Siglec-9 항체 클론 191240이 호중구에 의한 종양 세포의 사멸을 증강시키지 않은 클론 E10-286에 비해, 호중구에 의한 종양 세포의 사멸을 증강시킬 수 있음을 보고하였다.Despite the interesting expression profile of Siglec-9 on NK and other immune cells, and potential therapeutic interest in neutralizing Siglec-9, to date, candidate therapeutics that specifically neutralize Siglec-9 have been advanced or proposed for therapeutic use. It didn't happen. It has been reported that the involvement of Siglec-9 on cells of the bone marrow monocytic lineage by tumor-associated sialic acid ligands inhibits immunoregulation and tumor cell death by neutrophils, specialized granulocytes, as well as NK cells that recognize and directly kill microorganisms (Laubli et al. (2014) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 111(39): 14211-14216). Carlin et al. ((2009) Blood 113: 3333-3336) reported that mimicry of host sialylated glycans enables bacterial pathogens to implicate neutrophil Siglec-9 and interfere with the innate immune response. Carlin et al. describe the anti-Siglec-9 antibody 191240 (R&D Systems, inc.) as binding to the sialic acid binding site for Siglec-9 and inhibiting interaction with sialic acid. Carlin et al. further reported that, unlike the non-blocking antibody (clone E10-286, BD Biosciences inc.), clone 191240 enhanced the activation of neutrophils to bacterial cells. Similarly, Laubli et al. (2014), reported that the anti-Siglec-9 antibody clone 191240 can enhance the killing of tumor cells by neutrophils compared to clone E10-286, which did not enhance the killing of tumor cells by neutrophils. .

항-Siglec-7 항체는 뮤린 항-siglec-7 항체 QA79를 언급하는 유럽 특허 1238282B1(Moretta et al) 및 문헌[Vitale et al. ((1999) Proc. Nat. Acad. Sci. 96(26):15091-96)]에 기재되었을 뿐만 아니라 문헌[Falco et al. (1999) J. Exp. Med. 190:793-801]에서는 항-Siglec-7 항체 Z176을 보고한다.Anti-Siglec-7 antibody is disclosed in European Patent 1238282B1 (Moretta et al) and Vitale et al. which refers to the murine anti-siglec-7 antibody QA79. ((1999) Proc. Nat. Acad. Sci. 96(26):15091-96) as well as Falco et al. (1999) J. Exp. Med. 190:793-801 report the anti-Siglec-7 antibody Z176.

문헌[Hudak et al. (2014) Nat. Chem. Biol. 10:69-77]에서는 차단 항-Siglec-7 항체가 NK 세포에 의한 용해로부터 종양 표적 세포의 Siglec-7 매개 보호를 억제함을 보고하였다. 그러나, Siglec-9로 돌아가보면, 항-Siglec-9 항체(클론 191240이 이용됨)는 호중구에 의한 종양 세포의 사멸을 증강시키는 능력에도 불구하고(문헌[Laubli et al. (2014)] 참고), 인간 공여체로부터 정제된 NK 세포에 의한 용해로부터 종양 표적 세포의 Siglec-9 매개 보호를 억제할 수 없었다(문헌[Hudak et al (2014)] 참고). 문헌[Laubli et al. (2014)]에서 호중구에 의한 종양 세포의 사멸을 증강시키지 않으며 비-차단성으로 보고된 2가 결합 항체 클론 E10-286도 일차 NK 세포에 의한 용해로부터 종양 표적 세포의 Siglec-9 매개 보호를 억제하지 못했다(Jandus et al. (2014) J. Clin. Invest. 124(4): 1810-18020).See Hudak et al. (2014) Nat. Chem. Biol. 10:69-77] reported that blocking anti-Siglec-7 antibodies inhibit Siglec-7-mediated protection of tumor target cells from lysis by NK cells. However, returning to Siglec-9, the anti-Siglec-9 antibody (clone 191240 used), despite its ability to enhance the killing of tumor cells by neutrophils (see Laubli et al. (2014)), It was not able to inhibit Siglec-9-mediated protection of tumor target cells from lysis by NK cells purified from human donors (Hudak et al (2014)). See Laubli et al. (2014)] did not enhance the killing of tumor cells by neutrophils, and the bivalent binding antibody clone E10-286 reported as non-blocking also inhibits Siglec-9-mediated protection of tumor target cells from lysis by primary NK cells. failed (Jandus et al. (2014) J. Clin. Invest. 124(4): 1810-18020).

Siglec-7 및 Siglec-9에 대한 관심에도 불구하고, 이들 수용체를 표적화하는 치료제는 개발되지 않았다. 따라서 암과 같은 질병의 치료에서 이용하기 위한 이들 수용체를 표적화하는 제제에 대한 필요성이 존재한다.Despite interest in Siglec-7 and Siglec-9, therapeutics targeting these receptors have not been developed. Accordingly, there is a need for agents targeting these receptors for use in the treatment of diseases such as cancer.

하나의 양태에서, 본 개시는 호중구 및/또는 다른 세포에 비해 더 낮은 수준의 세포 표면 Siglec을 발현하는 인간 개체에서, 특히 NK 세포 상의, 인간 Siglet의 강력한 중화제로서 작용하고며 효과기 림프구(Siglec-7, Siglec-9)에서 억제 세포 표면 수용체로서 작용하는, 고친화도 결합제 항체를 제공한다.In one embodiment, the present disclosure provides that in a human subject expressing lower levels of cell surface Siglec compared to neutrophils and/or other cells, in particular on NK cells, it acts as a potent neutralizer of human Siglet and effector lymphocytes (Siglec-7). , Siglec-9) provide a high affinity binding agent antibody, which acts as an inhibitory cell surface receptor.

하나의 구현예에서, 본 개시는 Siglec-9의 경쟁적 및 비-경쟁적 억제제를 포함하는 Siglec(예컨대, 세포 표면에 발현되는 Siglec-9) 억제제를 제공한다. 각각의 억제제는 Siglec 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하거나 차단하지 않으면서 Siglec의 억제 활성 중화에서 특히 높은 효능을 갖는다.In one embodiment, the present disclosure provides Siglec (eg, Siglec-9 expressed on the cell surface) inhibitors, including competitive and non-competitive inhibitors of Siglec-9. Each inhibitor has a particularly high potency in neutralizing the inhibitory activity of Siglec with or without substantially blocking the interaction between Siglec and its sialic acid ligand.

하나의 구현예에서, Siglec 억제제는 인간 Siglec-9 단백질에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질, 예컨대 항체 또는 항체 단편, 또는 이를 포함하는 단백질이다. 하나의 구현예에서, Siglec 억제제는 인간 Siglec-7 및/또는 표 1의 다른 인간 Siglec에 결합하지 않고 인간 Siglec-9 단백질에 특이적으로 결합한다(mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및 mAb-F로 예시됨). 하나의 구현예에서, Siglec 억제제는 선택적으로 또한 표 1의 다른 인간 Siglec에 결합하지 않고, 인간 Siglec-9 단백질 및 인간 Siglec-7 단백질에 특이적으로 결합한다(mAb-4, mAb-5, mAb-6로 예시됨). 하나의 구현예에서, Siglec 억제제는 선택적으로 또한 표 1의 다른 인간 Siglec에 결합하지 않고, 인간 Siglec-9 단백질, 인간 Siglec-7 단백질 및 인간 Siglec-12 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편이다(mAb-1, mAb-2 및 mAb-3으로 예시됨). 하나의 구현예에서, Siglec 억제제는 인간 Siglec-9 단백질에 2가 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편이다(억제제는 각각 인간 Siglec-9 단백질에 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 도메인을 포함한다).In one embodiment, the Siglec inhibitor is a protein comprising an immunoglobulin antigen binding domain that specifically binds to human Siglec-9 protein, such as an antibody or antibody fragment, or a protein comprising the same. In one embodiment, the Siglec inhibitor specifically binds to human Siglec-9 protein without binding to human Siglec-7 and/or other human Siglec of Table 1 (mAb-A, mAb-B, mAb-C, exemplified by mAb-D, mAb-E and mAb-F). In one embodiment, the Siglec inhibitor specifically binds to human Siglec-9 protein and human Siglec-7 protein (mAb-4, mAb-5, mAb), optionally also without binding to other human Siglec of Table 1. exemplified by -6). In one embodiment, the Siglec inhibitor is an antibody or antibody fragment that specifically binds to human Siglec-9 protein, human Siglec-7 protein and human Siglec-12 protein, optionally also without binding to other human Siglec of Table 1 (exemplified by mAb-1, mAb-2 and mAb-3). In one embodiment, the Siglec inhibitor is an antibody or antibody fragment capable of bivalent binding to human Siglec-9 protein (the inhibitor comprises two antigen binding domains, each capable of binding human Siglec-9 protein).

하나의 구현예에서, 본 개시는 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키는 단리된 항체를 제공하며, 선택적으로 이 항체는 Siglec-9 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하지 않으며(mAb1, mAb2 및 mAb3으로 예시됨, 실시예 10 참고), 선택적으로 이 항체는 Siglec-9 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 차단한다(mAbA, mAbB 및 mAbC로 예시됨, 실시예 10 참고). 선택적으로, Siglec-9 폴리펩타이드는 세포, 예컨대 인간 개체로부터의 효과기 림프구, NK 세포, 예컨대, 일차 NK 세포, CD56dim NK 세포의 표면에서 발현된다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드에 추가로 결합하며 Siglec-7 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키고, 선택적으로는 추가로 이 항체는 Siglec-7 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드에 결합하지 않는다.In one embodiment, the present disclosure provides an isolated antibody that specifically binds to a human Siglec-9 polypeptide and neutralizes the inhibitory activity of the Siglec-9 polypeptide, optionally wherein the antibody comprises a Siglec-9 polypeptide and It does not substantially block the interaction between its sialic acid ligands (exemplified by mAb1, mAb2 and mAb3, see Example 10), and optionally this antibody blocks the interaction between the Siglec-9 polypeptide and its sialic acid ligand (exemplified by mAbA, mAbB and mAbC, see Example 10). Optionally, the Siglec-9 polypeptide is expressed on the surface of a cell, such as effector lymphocytes, NK cells, such as primary NK cells, CD56 dim NK cells from a human subject. In one embodiment, the antibody further binds to a human Siglec-7 polypeptide and neutralizes the inhibitory activity of the Siglec-7 polypeptide, optionally further wherein the antibody binds to the Siglec-7 polypeptide and its sialic acid ligand. It doesn't actually block interactions. In another embodiment, the antibody does not bind to a human Siglec-7 polypeptide.

하나의 양태에서, 본 발명은 특히, 인간 Siglec-9에 특이적으로 결합하며 시알산 리간드-보유 표적 세포에 대한 NK 세포(예컨대 일차 NK 세포)의 활성(예컨대 세포독성)을 증강시키는 항체의 발견으로부터 생긴다. 호중구, 이의 세포 표면에 고수준의 Siglec-9를 발현하거나 발현하도록 제조된 Siglec 전달감염체 및/또는 다른 세포에서만 세포독성을 증강시킬 수 있는 선행 기술의 항체와는 달리, 본원에 기재되는 항체는 저수준의 Siglec-9를 발현하는 세포, 예컨대 인간에서의 NK 세포(예컨대 CD56dim NK 세포)에서도 기능적이다. 이러한 Siglec-9 저-발현 NK 세포의 세포독성을 증강시키는 능력은 질병 표적 세포, 예컨대 종양 세포 및/또는 박테리아 세포에 대해 상기 세포 집단을 추가적으로 가동화할 수 있는 이점을 갖는다.In one embodiment, the present invention relates to the discovery of antibodies that specifically bind human Siglec-9 and enhance the activity (eg cytotoxicity) of NK cells (eg primary NK cells) against sialic acid ligand-bearing target cells. arises from In contrast to neutrophils, antibodies of the prior art that express high levels of Siglec-9 on their cell surface or are capable of enhancing cytotoxicity only in other cells and/or Siglec transfectants prepared to express high levels of Siglec-9, the antibodies described herein have low levels It is also functional in cells expressing Siglec-9 of, such as NK cells in humans (eg CD56 dim NK cells). This ability to enhance the cytotoxicity of Siglec-9 low-expressing NK cells has the advantage of being able to further mobilize the cell population against disease target cells, such as tumor cells and/or bacterial cells.

하나의 구현예에서, 인간 Siglec-9에 특이적으로 결합하고 Siglec-9를 발현하는 NK 세포가 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 표적 세포와 인큐베이션되는 표준 4-시간 시험관내 세포독성 검정에서 NK 세포(일차 NK 세포)의 세포독성을 증강시키고/시키거나 복원하는 항체 또는 항체 단편(또는 이러한 단편을 포함하는 단백질)이 제공된다. 하나의 구현예에서 표적 세포는 NK 세포의 첨가 전에 51Cr로 표지된 후 사멸(세포독성)이 세포로부터 배지로의 51Cr 방출과 비례하는 것으로 산정된다. 선택적으로, 검정은 본원에서의 실시예에서의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예컨대 실시예 8을 참고한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 Siglec-9를 발현하는 NK 세포의 세포독성을 적어도 Siglec-9를 발현하지 않는 NK 세포로 관찰되는 수준까지 복원시킬 수 있다(예컨대, 본원에서 실시예의 방법에 따라 결정됨).In one embodiment, in a standard 4-hour in vitro cytotoxicity assay in which NK cells that specifically bind human Siglec-9 and express Siglec-9 are incubated with target cells expressing the sialic acid ligand of Siglec-9. Antibodies or antibody fragments (or proteins comprising such fragments) that enhance and/or restore cytotoxicity of NK cells (primary NK cells) are provided. In one embodiment target cells are labeled with 51 Cr prior to addition of NK cells and then death (cytotoxicity) is calculated to be proportional to the release of 51 Cr from the cells into the medium. Optionally, the assay can be performed according to the methods in the Examples herein, see, eg, Example 8. In one embodiment, the antibody or antibody fragment is capable of restoring the cytotoxicity of NK cells expressing Siglec-9 to at least a level observed with NK cells not expressing Siglec-9 (e.g., the methods of the Examples herein determined according to).

본원에서 임의의 양태에서, NK 세포(예컨대 일차 NK 세포)는 공여체로부터 정제되고, 선택적으로 이용 전에 37℃에서 하룻밤 인큐베이션되는 신선 NK 세포로서 특정될 수 있다. 본원에서 임의의 양태에서, NK 세포 또는 일차 NK 세포는 Siglec-9를 발현하는 것으로 특정될 수 있고, 예컨대, 검정에서 이용하기 위해 세포는 유세포 측정에 의해 Siglec-9 상에서 관문화될 수 있다. 예컨대 본원에서, 실시예 8에 기재된 NK 세포를 참고한다.In any of the embodiments herein, NK cells (eg primary NK cells) can be characterized as fresh NK cells purified from a donor and optionally incubated overnight at 37° C. prior to use. In any of the aspects herein, NK cells or primary NK cells can be characterized as expressing Siglec-9, eg, for use in an assay, the cells can be cultured on Siglec-9 by flow cytometry. See, eg, the NK cells described in Example 8 herein.

또 다른 구현예에서, 인간 Siglec-9에 특이적으로 결합하며 단핵구-유래 수지상 세포(moDC)에서 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키는 항체 또는 항체 단편(또는 이러한 단편을 포함하는 단백질)이 제공된다. 하나의 구현예에서, moDC는 이의 표면에 Siglec-9의 이의 표면에 Siglec-9의 시알산 리간드를 보유한다. 하나의 구현예에서, moDC는 이의 표면에 시알산과의 시스-상호작용에 연루되는 Siglec-9 폴리펩타이드를 보유한다. 하나의 구현예에서, 항체는 moDC에서 활성화 또는 신호전달을 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 항체는 Siglec-9의 시알산 리간드를 보유하는 moDC에서 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키며, 여기서 moDC는 시알산 리간드를 제거하기 위한 뉴라미다제로의 moDC의 처리로 moDC에 대한 항체 결합에 있어서 더 낮은 EC50을 생성하는 세포이다.In another embodiment, the antibody or antibody fragment (or protein comprising such fragment) that specifically binds to human Siglec-9 and neutralizes the inhibitory activity of the Siglec-9 polypeptide in monocyte-derived dendritic cells (moDC) is provided In one embodiment, the moDC has a sialic acid ligand of Siglec-9 on its surface of Siglec-9 on its surface. In one embodiment, the moDC has on its surface a Siglec-9 polypeptide that is involved in a cis-interaction with sialic acid. In one embodiment, the antibody increases activation or signaling in moDC. In one embodiment, the antibody neutralizes the inhibitory activity of a Siglec-9 polypeptide in a moDC bearing a sialic acid ligand of Siglec-9, wherein the moDC treats the moDC with neuramidase to remove the sialic acid ligand. cells that produce lower EC 50 for antibody binding to moDC.

또 다른 양태에서, 본 발명은 특히, Siglec-7 및 Siglec-9 폴리펩타이드 둘 다에 필적하는 친화도로 결합하는 항-Siglec 항체의 발견으로부터 생긴다. 이러한 항체는 유리한 약리학적 특징을 갖는다. 본원에서 나타낸 바와 같이, NK 세포는 억제 Siglec-7 및 억제 Siglec-9 단백질을 둘 다 발현할 수 있지만, Siglec-7 및 Siglec-9는 또한 상이한 세포 집단에 걸쳐 상이한 발현 프로필을 가질 수 있다. 또한, 종양 세포가 Siglec-7에 대한 그리고 Siglec-9에 대한 천연 리간드(글리칸)를 발현할 수 있는 것으로 나타났다. 결과적으로, 하나의 Siglec은 억제하지만 다른 것은 억제하지 않는 치료제는 NK 및/또는 다른 면역 세포 집단 활성의 Siglec-매개 제한의 중화에서 최대로 효율적이 아닐 수 있다. 따라서 Siglec 7 및 9 둘 다의 억제가 유리할 수 있다. 그러나, Siglec-9는 인간 Siglec-7의 N-말단 V-세트 Ig 도메인과 단지 약 77%의 전반적인 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 또한, 이들 두 siglec은 상이한 시알산 결합 특이성을 나타내어 시알산 리간드에 의해 결합되는 영역의 구조적 차이를 제시한다.In another aspect, the present invention results from the discovery of anti-Siglec antibodies that bind, inter alia, with comparable affinity to both Siglec-7 and Siglec-9 polypeptides. Such antibodies have advantageous pharmacological properties. As shown herein, NK cells can express both inhibitory Siglec-7 and inhibitory Siglec-9 proteins, but Siglec-7 and Siglec-9 can also have different expression profiles across different cell populations. It has also been shown that tumor cells are capable of expressing natural ligands (glycans) for Siglec-7 and for Siglec-9. Consequently, therapeutics that inhibit one Siglec but not the other may not be maximally efficient at neutralizing Siglec-mediated restriction of NK and/or other immune cell population activity. Thus, inhibition of both Siglec 7 and 9 may be beneficial. However, Siglec-9 shares only about 77% overall amino acid sequence identity with the N-terminal V-set Ig domain of human Siglec-7. In addition, these two siglec exhibit different sialic acid binding specificities, suggesting a structural difference in the region bound by the sialic acid ligand.

하나의 양태에서, 본 개시는 Siglec-7 및/또는 Siglec-9의 억제 활성을 중화시키고 억제 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 필적하는 친화도로 특이적으로 결합할 수 있는 고친화도 결합제 항체를 제공한다. 예를 들어, 소정 구현예에서, Siglec-7 및 Siglec-9에 필적하는 친화도로 결합하는 항체는 각각의 Siglec 및 이의 시알산 리간드(들) 간 상호작용을 차단하는 증가된 능력을 갖는다(mAb4, mAb5 및 mAb6으로 예시됨, 실시예 6 참고). 다른 구현예에서, Siglec-9에 결합하는 항체는 Siglec-9 및 이의 시알산 리간드(들), 특히 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb 구조를 포함하는 시알산 간 상호작용을 실질적으로 차단하지 않고, Siglec-9의 억제 활성의 중화를 특징으로 할 수 있다(mAb1, mAb2 및 mAb3으로 예시됨, 실시예 9 참고).In one aspect, the present disclosure provides a modified agent capable of neutralizing the inhibitory activity of Siglec-7 and/or Siglec-9 and specifically binding with an affinity comparable to the inhibitory human Siglec-7 polypeptide and the human Siglec-9 polypeptide. A chemical binding agent antibody is provided. For example, in certain embodiments, antibodies that bind Siglec-7 and Siglec-9 with comparable affinity have an increased ability to block the interaction between each Siglec and its sialic acid ligand(s) (mAb4, exemplified by mAb5 and mAb6, see Example 6). In another embodiment, the antibody that binds to Siglec-9 does not substantially block the interaction between Siglec-9 and its sialic acid ligand(s), in particular a sialic acid comprising the structure Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb, Siglec-9 can be characterized as neutralization of the inhibitory activity of (exemplified by mAb1, mAb2 and mAb3, see Example 9).

본원에서 나타낸 바와 같이, 인간 Siglec-9는 Sia1(Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb) 및 Sia2(6'-시알릴락토스)에 둘 다 결합하는 반면, Siglec-7은 Sia2에만 결합한다. 하나의 양태에서, 이러한 Siglec 폴리펩타이드(들)과 Siglec-9 및 Siglec-7 둘 다의 시알산 리간드, 예컨대 Sia2 시알산의 상호작용을 차단할 수 있는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 시알산은 시알릴화 삼당류이다. 하나의 구현예에서, 시알산은 6'-시알릴락토스 구조를 포함한다.As shown herein, human Siglec-9 binds to both Sia1 (Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb) and Sia2 (6'-sialyllactose), whereas Siglec-7 binds only to Sia2. In one aspect, antibodies capable of blocking the interaction of such Siglec polypeptide(s) with a sialic acid ligand, such as Sia2 sialic acid, of both Siglec-9 and Siglec-7 are provided. In one embodiment, the sialic acid is a sialylated trisaccharide. In one embodiment, the sialic acid comprises a 6'-sialyllactose structure.

또 다른 양태에서, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하며 이의 억제 활성을 중화시키는 항체가 제공되며, 여기서 항체는 Sia1(Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb) 및 Sia2(6'-시알릴락토스) 둘 다와 Siglec-9 폴리펩타이드의 상호작용을 차단할 수 있다(mAb1, mAb2 및 mAb3으로 예시됨, 실시예 9 참고).In another aspect, provided is an antibody that binds to and neutralizes the inhibitory activity of a human Siglec-9 polypeptide, wherein the antibody comprises both Sia1 (Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb) and Sia2 (6'-sialyllactose) and Siglec Can block the interaction of -9 polypeptides (exemplified by mAb1, mAb2 and mAb3, see Example 9).

하나의 구현예에서, Siglec-7 및 Siglec-9에 결합할 수 있는 항체는 이의 표면에 Siglec-7 또는 Siglec-9를 발현하는 세포(예컨대, 각각의 Siglec 중 하나로 전달감염되었으나 다른 Siglec은 발현하지 않는 CHO 세포)로의 결합에 대해 유세포 측정에 의해 결정되는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드로의 결합에 대한 그 EC50으로부터 1-log 미만 만큼 상이한 인간 Siglec-7 폴리펩타이드로의 결합에 대한 EC50을 갖는다. 하나의 구현예에서, 항체는 이의 표면에 Siglec-7 또는 Siglec-9를 발현하는 세포로의 결합에 대해 유세포 측정에 의해 결정되는, 0.5 log, 0.3 log, 0.2 log 또는 0.1 log 이하만큼 상이한 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및 인간 Siglec-9 폴리펩타이드로의 결합에 대한 EC50을 갖는다. 이의 표면에 Siglec-7 또는 Siglec-9를 발현하는 세포는 필적하는 발현 수준으로 각각의 siglec을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.In one embodiment, the antibody capable of binding to Siglec-7 and Siglec-9 is a cell expressing Siglec-7 or Siglec-9 on its surface (eg, transfected with one of the respective Siglec but not expressing the other Siglec). EC 50 for binding to human Siglec-7 polypeptide differs by less than 1-log from its EC 50 for binding to human Siglec-9 polypeptide, as determined by flow cytometry for binding to non-toxic CHO cells. have In one embodiment, the antibody is a human Siglec that differs by no more than 0.5 log, 0.3 log, 0.2 log or 0.1 log as determined by flow cytometry for binding to cells expressing Siglec-7 or Siglec-9 on its surface. It has an EC 50 for binding to -7 polypeptide and human Siglec-9 polypeptide. Cells expressing Siglec-7 or Siglec-9 on their surface can be characterized as expressing the respective siglec at comparable expression levels.

하나의 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 및/또는-9에 대해 필적하는 친화도로 비-인간 영장류 Siglec에 추가로 결합한다. 하나의 구현예에서, 항체는 이의 표면에 Siglec-7 또는 Siglec-9를 발현하는 세포(예컨대, 각각의 Siglec로 전달감염된 CHO 세포)로의 결합에 대해 유세포 측정에 의해 결정되는 1-log, 0.5 log, 0.3 log, 0.2 log 또는 0.1 log 이하만큼 상이한 인간 Siglec-7 폴리펩타이드, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 비-인간 영장류 Siglec로의 결합에 대한 EC50을 갖는다.In one embodiment, the antibody further binds to non-human primate Siglec with comparable affinity to human Siglec-7 and/or-9. In one embodiment, the antibody is 1-log, 0.5 log determined by flow cytometry for binding to cells expressing Siglec-7 or Siglec-9 on its surface (eg, CHO cells transfected with each Siglec). , have an EC 50 for binding to human Siglec-7 polypeptide, human Siglec-9 polypeptide and non-human primate Siglec that differs by no more than 0.3 log, 0.2 log or 0.1 log.

하나의 구현예에서, 인간 Siglec-9의 활성을 중화시키고, 이의 표면에 Siglec-9를 발현하는 세포(예컨대, Siglec로 전달감염된 CHO 세포)로의 결합에 대해 유세포 측정에 의해 결정되는, 1-log, 0.5 log, 0.3 log, 0.2 log 또는 0.1 log 이하만큼 상이한 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 비-인간 영장류 Siglec으로의 결합에 대한 EC50을 갖는 항체가 제공된다.In one embodiment, 1-log neutralizes the activity of human Siglec-9 and determines by flow cytometry for binding to cells expressing Siglec-9 on its surface (eg, CHO cells transfected with Siglec). , antibodies having EC 50 for binding to human Siglec-9 polypeptide and non-human primate Siglec that differ by no more than 0.5 log, 0.3 log, 0.2 log or 0.1 log.

하나의 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및 인간 Siglec-9 폴리펩타이드(및 선택적으로는 추가의 비-인간 영장류 Siglec)로의 결합에 대해 10-배, 5-배, 3-배 또는 2-배 이하만큼 상이한, 예컨대 표면 플라즈몬 공명(SPR) 스크리닝에 의해(예컨대, BIAcore™ SPR 분석 장치로의 분석에 의해) 결정되는 결합 친화도에 대한 KD를 갖는다.In one embodiment, the antibody is 10-fold, 5-fold, 3-fold or have a KD for binding affinity that differs by no more than 2-fold, such as determined by surface plasmon resonance (SPR) screening (eg, by analysis with a BIAcore™ SPR assay instrument).

하나의 구현예에서, 항체는 인간 인간 Siglec-9 폴리펩타이드(및 선택적으로 추가로 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및/또는 비-인간 영장류 Siglec)로의 결합에 대해 약 1 × 10-8 M 내지 약 1 × 10-10 M, 또는 약 1 × 10-9 M 내지 약 1 × 10-11 M의 KD를 갖는다. 하나의 구현예에서, 항-Siglec-9 항체는 인간 인간 Siglec-9 폴리펩타이드로의 결합에 대해(예컨대, 1가 친화도) 약 1 × 10-8 M 내지 약 1 × 10-10 M, 또는 약 1 × 10-9 M 내지 약 1 × 10-11 M의 KD를 가지며, 여기서 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 실질적인 결합을 갖지 않는다.In one embodiment, the antibody comprises from about 1×10 −8 M to about 1 for binding to a human human Siglec-9 polypeptide (and optionally further human Siglec-7 polypeptide and/or non-human primate Siglec). x 10 -10 M, or a KD of from about 1 x 10 -9 M to about 1 x 10 -11 M. In one embodiment, the anti-Siglec-9 antibody is from about 1 x 10 -8 M to about 1 x 10 -10 M for binding (eg, monovalent affinity) to human human Siglec-9 polypeptide, or has a KD of about 1×10 −9 M to about 1×10 −11 M, wherein the antibody has no substantial binding to the human Siglec-7 polypeptide.

하나의 구현예에서, 항체는 추가로 임의의 인간 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및 Siglec-12에 실질적으로 결합하지 않는다. 하나의 구현예에서, 항체는 추가로 임의의 Siglec-14 및 Siglec-16에 실질적으로 결합하지 않는다. 하나의 구현예에서, 항체는 추가로 인간 Siglec-6에 실질적으로 결합하지 않는다. 하나의 구현예에서, 항체는 추가로 인간 Siglec-12에 실질적으로 결합하지 않는다.In one embodiment, the antibody further does not substantially bind any human Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 and Siglec-12. In one embodiment, the antibody further does not substantially bind any Siglec-14 and Siglec-16. In one embodiment, the antibody further does not substantially bind human Siglec-6. In one embodiment, the antibody further does not substantially bind human Siglec-12.

본원에서 임의의 구현예에서, 항-Siglec 항체는 세포(예컨대, NK 세포, Siglec-7 및/또는 Siglec-9를 발현하도록 제조된 세포, 예컨대, 실시예에 나타낸 바와 같이, 그 표면에 Siglec-7 및/또는 Siglec-9를 발현하도록 제조된 재조합 CHO 숙주 세포)의 표면 상에서 발현되는 폴리펩타이드로의 결합을 특징으로 할 수 있으며, 선택적으로는 추가로 항체는 유세포 측정에 의해 결정되는 고친화도로 결합한다. 예를 들어, 항체는 일차 NK 세포(예컨대, 인간 개체 또는 공여체로부터의 생물학적 샘플로부터 정제된 NK 세포), 선택적으로 CD56dim NK 세포로의 결합에 대해, 유세포 측정에 의해 결정되는, 5 ㎍/㎖ 이하, 선택적으로 1 ㎍/㎖ 이하, 0.5 ㎍/㎖ 이하, 0.2 ㎍/㎖ 이하 또는 0.1 ㎍/㎖ 이하의 EC50을 특징으로 할 수 있다. EC50은, 예를 들어, 실시예 9의 방법에 따르면, 예컨대, 4명 이상의 건강한 공여체가 평가되고, BD FACS Canto II에서 염색이 획득되고, FlowJo 소프트웨어를 이용해서 분석되고, 4-파라미터 로지스틱 피팅을 이용하여 EC50이 계산되어 결정될 수 있다.In any of the embodiments herein, the anti-Siglec antibody is administered to a cell (eg, an NK cell, a cell prepared to express Siglec-7 and/or Siglec-9, such as a Siglec- on its surface, as shown in the Examples). may be characterized by binding to a polypeptide expressed on the surface of a recombinant CHO host cell prepared to express 7 and/or Siglec-9), optionally further wherein the antibody is administered with a high affinity determined by flow cytometry. combine For example, the antibody can bind to primary NK cells (eg, NK cells purified from a biological sample from a human subject or donor), optionally CD56 dim NK cells, at 5 μg/ml, as determined by flow cytometry. and optionally can be characterized by an EC 50 of 1 μg/ml or less, 0.5 μg/ml or less, 0.2 μg/ml or less or 0.1 μg/ml or less. The EC50 is, for example, according to the method of Example 9, e.g., 4 or more healthy donors are assessed, staining is obtained in a BD FACS Canto II, analyzed using FlowJo software, and 4-parameter logistic fitting is performed. EC 50 can be calculated and determined using

또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며 면역 세포에서 이러한 Siglec(들)의 억제 활성을 중화시키고 이러한 폴리펩타이드(들)와 이의 시알산 리간드의 상호작용을 차단할 수 있는 항체 또는 항체 단편(예컨대 항원 결합 도메인 또는 이를 포함하는 단백질)이 제공된다. 하나의 구현예에서, 시알산은 시알릴화 삼당류이다. 하나의 구현예에서, 시알산은 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb 구조를 포함한다. 하나의 구현예에서, 시알산은 6'-시알릴락토스 구조를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며 인간 NK 세포 세포(예컨대 인간 일차 NK 세포; CD56dim NK 세포), 인간 단핵구, 인간 수지상 세포, 인간 대식구(특히 면역억제성 또는 M2 대식구), CD8 T 세포, 및/또는 인간 호중구에서 이러한 Siglec(들)의 억제 활성을 중화시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하며 인간 공여체로부터의 면역억제성 대식구(예컨대 M2 대식구)에서 이러한 Siglec(들)의 억제 활성을 중화시킬 수 있고, 여기서 항체 또는 항체 단편은 대식구의 면역억제성 활성 또는 능력을 감소시킨다.In another aspect, the present disclosure specifically binds to human Siglec-7 and/or Siglec-9 polypeptides and neutralizes the inhibitory activity of such Siglec(s) in immune cells, such polypeptide(s) and its sialic acid Antibodies or antibody fragments (eg, antigen binding domains or proteins comprising the same) capable of blocking the interaction of ligands are provided. In one embodiment, the sialic acid is a sialylated trisaccharide. In one embodiment, the sialic acid comprises the structure Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb. In one embodiment, the sialic acid comprises a 6'-sialyllactose structure. In one embodiment, the antibody or antibody fragment specifically binds to a human Siglec-7 and/or Siglec-9 polypeptide and comprises human NK cell cells (such as human primary NK cells; CD56 dim NK cells), human monocytes, human neutralize the inhibitory activity of these Siglec(s) in dendritic cells, human macrophages (especially immunosuppressive or M2 macrophages), CD8 T cells, and/or human neutrophils. In one embodiment, the antibody or antibody fragment specifically binds to a human Siglec-7 and/or Siglec-9 polypeptide and inhibits such Siglec(s) in immunosuppressive macrophages (eg M2 macrophages) from a human donor. The activity may be neutralized, wherein the antibody or antibody fragment reduces the immunosuppressive activity or ability of the macrophage.

논의된 바와 같이, 인간 Siglec-9는 Sia1(Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb) 및 Sia2(6'-시알릴락토스)에 둘 다 결합하는 반면, Siglec-7은 Sia2에만 결합한다. 소정 양태에서는 Siglec-9 폴리펩타이드(들)와 Siglec-7이 아니라 Siglec-9의 리간드인 시알산, 예컨대, Sia1 시알산의 상호작용을 차단할 수 있는 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 시알산은 시알릴화 삼당류이다. 하나의 구현예에서, 시알산은 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb 구조를 포함한다. 하나의 구현예에서 항체는 Siglec-7 폴리펩타이드(들)와 Siglec-9가 아니라 Siglec-7의 리간드인 시알산, 예컨대, 6'-시알릴락토스-함유 시알산의 상호작용을 실질적으로 차단하지 않는다.As discussed, human Siglec-9 binds to both Sia1 (Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb) and Sia2 (6'-sialyllactose), whereas Siglec-7 binds only to Sia2. In certain embodiments are provided antibodies capable of blocking the interaction of a Siglec-9 polypeptide(s) with a sialic acid that is a ligand of Siglec-9 but not Siglec-7, such as Sia1 sialic acid. In one embodiment, the sialic acid is a sialylated trisaccharide. In one embodiment, the sialic acid comprises the structure Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb. In one embodiment the antibody does not substantially block the interaction of the Siglec-7 polypeptide(s) with a sialic acid that is a ligand of Siglec-7 but not Siglec-9, eg, 6'-sialyllactose-containing sialic acid. does not

이러한 항체의 단편 및 유도체가 또한 제공된다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 및/또는 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항원-결합 도메인(예컨대, 단일 항원 결합 도메인, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 제조된 도메인 등)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항원-결합 도메인은 인간 Siglec-7 폴리펩타이드가 아닌 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합한다(mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및 mAb-F로 예시됨). 하나의 구현예에서, 항원-결합 도메인은 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 인간 Siglec-7 폴리펩타이드 둘 다에 결합한다(mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 및 mAb-6으로 예시됨). 하나의 구현예에서, 단백질(예컨대 항체, 다량체성 및/또는 다중특이적 단백질) 또는 이러한 항원 결합 도메인을 인코딩하는 핵산이 제공된다.Fragments and derivatives of such antibodies are also provided. In one embodiment, the antibody comprises an antigen-binding domain capable of binding a human Siglec-7 polypeptide and/or a human Siglec-9 polypeptide (e.g., a single antigen binding domain, a domain made of heavy and light chain variable domains, etc.) ) is included. In one embodiment, the antigen-binding domain binds a human Siglec-9 polypeptide that is not a human Siglec-7 polypeptide (mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E and mAb exemplified by -F). In one embodiment, the antigen-binding domain binds to both a human Siglec-9 polypeptide and a human Siglec-7 polypeptide (mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 and exemplified by mAb-6). In one embodiment, a protein (eg, an antibody, multimeric and/or multispecific protein) or nucleic acid encoding such an antigen binding domain is provided.

하나의 구현예에서, 본 개시의 중화 항-Siglec 항체는 면역 세포에서 Siglec-7 및/또는 Siglec-9에 의해 발휘되는 억제 활성을 경감시켜 Siglec-7의 시알산 리간드 및/또는 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 암 세포를 효과적으로 인식하고/하거나 제거하는 림프구의 능력을 증강시킨다. 항체(또는 항체 단편)는 암 세포가 하나의 또는 다른 유형의 리간드의 발현으로 인한 용해를 회피하는 능력을 감소시키고, 이들은 이에 따라 면역계에 의한 종양 감독을 증강시킨다. NK 구획에서, Siglec-9는 주로 CD56dim NK 세포 상에서 발현되는 반면, siglec-7은 CD56dim 및 CD56bright NK 세포 상에서 발현된다. CD56dim NK 세포(CD56dimCD16+KIR+)는 약 90%의 말초혈 및 비장 NK 세포를 나타내며, 퍼포린 및 그랜자임을 발현하고, 주요 세포독성 하위세트인 반면, CD56bright NK 세포(CD56brightCD16dim/-KIR-)는 림프절 및 편도에서 대부분의 NK 세포를 이루며, 활성화 시 주로 사이토카인 생산으로 반응한다. 하나의 구현예에서, 인간 Siglec-9에 특이적으로 결합하며, 인간 NK 세포(예컨대 인간 일차 NK 세포; CD56dim NK 세포)에서 Siglec-9에 의해 발휘되는 억제 활성을 경감시켜 NK 세포가 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 암 세포를 효과적으로 인식하고/하거나 제거하는 능력을 증강시키는 항체 또는 항체 단편이 제공된다. 하나의 구현예에서, 인간 Siglec-7 및 Siglec-9에 특이적으로 결합하며, 인간 NK 세포(예컨대 인간 일차 NK 세포; CD56dim NK 세포)에서 Siglec-7 및 Siglec-9에 의해 발휘되는 억제 활성을 경감시켜 NK 세포가 Siglec-7 및 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 암 세포를 효과적으로 인식하고/하거나 제거하는 능력을 증강시키는 항체 또는 항체 단편이 제공된다.In one embodiment, a neutralizing anti-Siglec antibody of the present disclosure reduces the inhibitory activity exerted by Siglec-7 and/or Siglec-9 in immune cells, thereby reducing the sialic acid ligand of Siglec-7 and/or Siglec-9. Enhances the ability of lymphocytes to effectively recognize and/or eliminate cancer cells expressing sialic acid ligands. Antibodies (or antibody fragments) reduce the ability of cancer cells to evade lysis due to the expression of one or another type of ligand, and they thus enhance tumor oversight by the immune system. In the NK compartment, Siglec-9 is mainly expressed on CD56 dim NK cells, whereas siglec-7 is expressed on CD56 dim and CD56 bright NK cells. CD56 dim NK cells (CD56 dim CD16 + KIR + ) represent about 90% of peripheral blood and spleen NK cells, express perforin and granzyme, and are the major cytotoxic subset, whereas CD56 bright NK cells (CD56 bright CD16 dim/- KIR - ) constitutes most NK cells in lymph nodes and amygdala, and upon activation responds mainly to cytokine production. In one embodiment, it binds specifically to human Siglec-9 and attenuates the inhibitory activity exerted by Siglec-9 in human NK cells (eg, human primary NK cells; CD56 dim NK cells) such that the NK cells are Siglec- Antibodies or antibody fragments that enhance the ability to effectively recognize and/or eliminate cancer cells expressing the sialic acid ligand of 9 are provided. In one embodiment, it specifically binds to human Siglec-7 and Siglec-9, and the inhibitory activity exerted by Siglec-7 and Siglec-9 in human NK cells (eg, human primary NK cells; CD56 dim NK cells). Antibodies or antibody fragments are provided that enhance the ability of NK cells to effectively recognize and/or eliminate cancer cells expressing the sialic acid ligands of Siglec-7 and Siglec-9.

하나의 구현예에서, 본 개시의 항체는 Siglec-7 및 Siglec-9 둘 다에 결합할 수 있으며 림프구(예컨대, NK 세포, CD8+ T 세포) 세포독성의 Siglec-7 및 Siglec-9-매개 억제를 둘 다 중화시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 항체는 표적 세포(예컨대, Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드를 발현하는 세포, 종양 세포)의 존재 하에 림프구 활성화를 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 항체는 Siglec-9를 발현하는 NK 세포가 인간 공여체로부터 정제되며 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 표적 세포와 인큐베이션되는 표준 시험관내 세포독성 검정에서 평가되는, NK 세포의 세포독성을 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 세포독성의 증가된 활성화 또는 억제의 중화는 세포독성/세포독성 가능성 마커, 예컨대 CD107 및/또는 CD137 발현(가동화)의 증가에 의해 평가된다. 하나의 구현예에서, 세포독성의 증가된 활성화 또는 억제 중화는 51Cr 방출 검정에서 51Cr 방출의 증가에 의해 평가된다. Siglec-7은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. Siglec-9는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, Siglec-9는 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함한다.In one embodiment, an antibody of the present disclosure is capable of binding to both Siglec-7 and Siglec-9 and inhibits Siglec-7 and Siglec-9-mediated inhibition of lymphocyte (eg, NK cell, CD8+ T cell) cytotoxicity. Both can be neutralized. In one embodiment, the antibody increases lymphocyte activation in the presence of a target cell (eg, a cell expressing a ligand of Siglec-7 and/or a ligand of Siglec-9, a tumor cell). In one embodiment, the antibody comprises NK cells, wherein the NK cells expressing Siglec-9 are purified from a human donor and incubated with target cells expressing the sialic acid ligand of Siglec-9, as assessed in a standard in vitro cytotoxicity assay. increases cytotoxicity. In one embodiment, neutralization of increased activation or inhibition of cytotoxicity is assessed by an increase in cytotoxicity/cytotoxic potential markers such as CD107 and/or CD137 expression (mobilization). In one embodiment, increased activation or inhibition of neutralization of cytotoxicity is assessed by an increase in 51 Cr release in a 51 Cr release assay. Siglec-7 may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Siglec-9 may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO:2. In another embodiment, Siglec-9 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160.

하나의 구현예에서, 본 개시의 항체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드(위치 100에 라이신을 보유하며, 집단의 약 49%를 나타냄) 및 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2의 잔기 100에 해당하는 위치에 글루탐산을 보유하며), 집단의 약 36%를 나타냄) 둘 다에 결합할 수 있다. 임의의 구현예에서 본 개시의 항체 또는 항체 단편은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드를 발현하는(또는 그 세포가 이를 발현하는) 개체에서뿐만 아니라 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드를 발현하는(또는 그 세포가 이를 발현하는) 개체에서 Siglec-9의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 것으로 특정될 수 있다.In one embodiment, the antibody of the present disclosure comprises a Siglec-9 polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (having a lysine at position 100, representing about 49% of the population) and SEQ ID NO: 160 Siglec-9 polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 having glutamic acid at the position corresponding to residue 100, representing about 36% of the population). In any embodiment the antibody or antibody fragment of the present disclosure is administered in an individual expressing (or in a cell expressing it) a Siglec-9 polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as well as of SEQ ID NO: 160 It can be characterized as capable of neutralizing the inhibitory activity of Siglec-9 in an individual expressing (or having a cell expressing it) a Siglec-9 polypeptide comprising an amino acid sequence.

하나의 구현예에서, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하며 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드 둘 다의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항체 또는 항체 단편(또는 이러한 단편을 포함하는 단백질)이 제공된다. 하나의 구현예에서, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하며 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드를 발현하는 NK 세포에서 및 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드를 발현하는 NK 세포에서 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항체 또는 항체 단편(또는 이러한 단편을 포함하는 단백질)이 제공된다. 하나의 구현예에서, 항체는 특정 Siglec-9를 발현하는 NK 세포가 인간 공여체로부터 정제되어 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 표적 세포와 인큐베이션되는 표준 시험관내 세포독성 검정에서 평가되는 NK 세포의 세포독성을 증가시킨다.In one embodiment, both a Siglec-9 polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a Siglec-9 polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160 that binds to a human Siglec-9 polypeptide Antibodies or antibody fragments (or proteins comprising such fragments) capable of neutralizing the inhibitory activity of In one embodiment, in a NK cell that binds to a human Siglec-9 polypeptide and expresses a Siglec-9 polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a Siglec comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160 Antibodies or antibody fragments (or proteins comprising such fragments) capable of neutralizing the inhibitory activity of a Siglec-9 polypeptide in NK cells expressing the -9 polypeptide are provided. In one embodiment, the antibody comprises NK cells expressing a specific Siglec-9 purified from a human donor and incubated with target cells expressing the sialic acid ligand of Siglec-9. NK cells assessed in a standard in vitro cytotoxicity assay. increases cytotoxicity.

본원에서 임의의 구현예의 하나의 양태에서, 항체는 2가 방식으로 Siglec의 세포외 도메인 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 4량체(예컨대, 전장, F(ab)'2 단편) 항체 또는 항체 단편이다. 예를 들어, 2가 방식으로 Siglec에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 각각 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합할 수 있는, 또는 각각 Siglec-7 및 Siglec-9 폴리펩타이드 둘 다에 존재하는 에피토프에 결합할 수 있는, 2개의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 임의의 구현예의 또 다른 양태에서, 항체는 1가 방식으로 Siglec에 결합하며 각각의 Siglec, 예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9에서 작용제 활성이 없다. 하나의 구현예에서, 1가 방식으로 Siglec에 결합하는 항체는 Fab 단편이다. 본원에서 임의의 구현예에서, 1가 방식 또는 2가 방식으로 Siglec에 결합하는 항체는 Siglec9에서 작용제 활성이 없다. 치료적 이용을 위해, 항체는 바람직하게는 비-고갈 항체이다. 선택적으로 항체는 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 의해 결합될 수 있지만 그 Fc 도메인을 통한 인간 FcγR (예컨대, CD16; 선택적으로 하나 이상의 또는 각각의 인간 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64 폴리펩타이드)에 대한 결합이 실질적으로 부재하는 Fc 도메인을 포함한다. 선택적으로 항체는 하나 이상의, 또는 각각의 인간 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64 폴리펩타이드에 대한 항체의 결합 친화도를 감소시키는 아미노산 개질(예컨대 하나 이상의 치환)을 포함하는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형의 Fc 도메인을 포함한다.In one aspect of any of the embodiments herein, the antibody is a tetrameric (eg, full-length, F(ab)'2 fragment) antibody or antibody fragment that binds to an epitope present on the extracellular domain of Siglec in a bivalent manner. . For example, an antibody or antibody fragment that binds to Siglec in a bivalent manner may each bind a Siglec-9 polypeptide, or may bind an epitope present on both Siglec-7 and Siglec-9 polypeptides, respectively. may comprise two antigen binding domains. In another aspect of any of the embodiments herein, the antibody binds to Siglec in a monovalent manner and lacks agonist activity at each Siglec, such as Siglec-7 and/or Siglec-9. In one embodiment, the antibody that binds to Siglec in a monovalent manner is a Fab fragment. In any of the embodiments herein, the antibody that binds to Siglec in a monovalent or bivalent mode has no agonist activity at Siglec9. For therapeutic use, the antibody is preferably a non-depleting antibody. Alternatively, the antibody may be bound by a human neonatal Fc receptor (FcRn) but via its Fc domain a human FcγR (eg CD16; optionally one or more or each of human CD16A, CD16B, CD32A, CD32B and/or CD64 polypeptides) ), which is substantially free of binding to an Fc domain. Optionally the antibody is a human IgG1, IgG2, comprising an amino acid modification (such as one or more substitutions) that reduces the binding affinity of the antibody to one or more, or each of human CD16A, CD16B, CD32A, CD32B and/or CD64 polypeptides; It contains an Fc domain of the IgG3 or IgG4 isotype.

하나의 구현예에서, 항체는 Siglec-9에, 선택적으로는 추가로 Siglec-7에 결합하는 하나 이상의(예컨대, 2개의) 항원 결합 도메인을 포함한다. 하나의 특정한 구현예에서, 항체는 2개의 동일한 항원 결합 도메인(선택적으로, 2개의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 페어)을 포함하며 Siglec-9, 선택적으로는 추가로 Siglec-7에 결합하고 그 억제 활성을 중화시키며, 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 의해 결합될 수 있는 Fc 도메인을 포함하고, 인간 FcγR (예컨대, CD16; 선택적으로 하나 이상의, 또는 각각의 인간 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64 폴리펩타이드)에 대한 결합이 실질적으로 부재하는 4량체, 선택적으로 전장, 항체이다.In one embodiment, the antibody comprises one or more (eg, two) antigen binding domains that bind to Siglec-9, optionally further to Siglec-7. In one specific embodiment, the antibody comprises two identical antigen binding domains (optionally two heavy and light chain variable region pairs) and binds to Siglec-9, optionally further Siglec-7, and exhibits its inhibitory activity. a human FcγR (eg CD16; optionally one or more, or each of human CD16A, CD16B, CD32A, CD32B and/or CD64 poly a tetrameric, optionally full-length, antibody substantially free of binding to peptides).

본원에서 임의의 구현예에서, 인간 림프구 상에서 Siglec에 대한 결합 시, 모노클로날 항체는 표적 세포가 림프구, 예컨대 인간 개체로부터의 효과기 림프구, NK 또는 CD8+ T 세포, 예컨대 CD56dim NK 세포와 접촉하는 경우, 표적 세포 표면 상에 Siglec의 시알산 리간드를 보유하는 표적 인간 세포의 용해를 증강시키거나 재구성하는 능력을 갖고/갖거나 림프구 활성화(예컨대, 림프구 상에서 CD107 및/또는 CD137 발현의 증가에 의해 결정됨)를 증가시키는 능력을 갖는다. 하나의 구현예에서, 제1 하위세트의 림프구에 의해 발현되는 제1 Siglec(예컨대 CD56dim NK 세포 상에서 발현되는 Siglec-9)을 중화시키며 제2 하위세트의 림프구에 의해 발현되는 제2 Siglec(예컨대 CD56bright NK 세포 상에서 발현되는 Siglec-7)을 중화시키는 항체가 제공된다. 제1 및 제2 하위세트의 인간 림프구(예컨대, NK 세포, CD8+ T 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식구, 면역억제성 또는 M2 대식구)는 예를 들어 상이한 세포 표면 마커 또는 상이한 기능적 특성, 또는 상이한 표적 세포를 용해시키거나 인식하는(예컨대, 이에 의해 활성화되는) 능력을 특징으로 할 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체는 이의 시알로사이드 리간드(예컨대, 종양 세포 상에 존재하는 리간드)에 대한 Siglec의 결합을 감소시킨다(차단한다).In any of the embodiments herein, upon binding to Siglec on human lymphocytes, the monoclonal antibody is administered when the target cell is in contact with a lymphocyte, such as an effector lymphocyte from a human subject, NK or CD8+ T cells, such as CD56 dim NK cells. , has the ability to enhance or reconstitute the lysis of target human cells bearing the sialic acid ligand of Siglec on the target cell surface and/or lymphocyte activation (eg, as determined by increased CD107 and/or CD137 expression on lymphocytes) has the ability to increase In one embodiment, a second Siglec (eg, Siglec-9 expressed on CD56 dim NK cells) expressed by a first subset of lymphocytes and neutralizes a first Siglec expressed by a first subset of lymphocytes (eg, a second Siglec expressed by a second subset of lymphocytes) Antibodies that neutralize Siglec-7) expressed on CD56 bright NK cells are provided. The first and second subsets of human lymphocytes (eg, NK cells, CD8+ T cells, monocytes, dendritic cells, macrophages, immunosuppressive or M2 macrophages) may, for example, have different cell surface markers or different functional properties, or different targets. may be characterized by the ability to lyse or recognize (eg, activated by) cells. In one embodiment, the antibody reduces (blocks) binding of Siglec to its sialoside ligand (eg, a ligand present on tumor cells).

본원에서 임의의 구현예에서, Siglec의 시알로사이드 또는 시알산 리간드는 천연 리간드로, 예컨대, 시알산 리간드(시알산을 포함하는 리간드)는 항체가 결합하는 Siglec 폴리펩타이드에 결합하는 것으로 알려져 있다. 9-탄소 산성 단당류 패밀리인 시알산은 전형적으로 N-글리칸, O-글리칸 및 당지질의 종결 분기인 것으로 확인된다. Siglec은 2-위치로부터의 산 시알릭 결합, 시알산의 배열 및 이의 제시 방식과 같은 시알산 분자의 여러 양태를 인식하는 것으로 여겨진다. 본원에서 임의의 구현예에서, Siglec의 리간드는 주로 5-N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) 유도체를 포함하며, 다른 시알산 유도체, 예컨대 5-N-글리콜릴뉴라민산(Neu5Gc) 유도체를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, Siglec-9 및/또는 Siglec-7의 리간드는 당단백질(예컨대, 뮤신) 또는 당지질 상에 존재하는 시알산이다. 하나의 구현예에서, Siglec-7의 리간드는 b-계열 갱글리오사이드, 예컨대, GD2, GD3 및 GT1b 상에 제시되는 α2,8-결합 디시알산을 포함한다. 하나의 구현예에서, Siglec-7의 리간드는 내부 분기화 알파2,6-결합 디시알릭 갱글리오사이드, 예컨대, DSGb5를 포함한다. 하나의 구현예에서, Siglec-9의 리간드는 뮤신, 예컨대, MUC1 상에 존재하는 리간드이거나 이를 포함한다. 하나의 구현예에서, Siglec-9의 리간드는 시알산 및 설페이트를 둘 다 함유하는 시알로글리칸 리간드이다.In any of the embodiments herein, the sialoside or sialic acid ligand of Siglec is a natural ligand, eg, a sialic acid ligand (a ligand comprising sialic acid) is known to bind to a Siglec polypeptide to which the antibody binds. Sialic acids, a family of 9-carbon acidic monosaccharides, are typically identified as terminal branches of N-glycans, O-glycans and glycolipids. Siglec is believed to recognize several aspects of the sialic acid molecule, such as the acid sialic bond from the 2-position, the arrangement of the sialic acid and its mode of presentation. In any of the embodiments herein, the ligands of Siglec primarily include 5-N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) derivatives, and may include other sialic acid derivatives, such as 5-N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) derivatives. can In one embodiment, the ligand of Siglec-9 and/or Siglec-7 is a sialic acid present on a glycoprotein (eg, mucin) or glycolipid. In one embodiment, the ligand of Siglec-7 comprises a b-family ganglioside, such as an α2,8-linked disialic acid presented on GD2, GD3 and GT1b. In one embodiment, the ligand of Siglec-7 comprises an internally branching alpha2,6-linked disialic ganglioside, such as DSGb5. In one embodiment, the ligand of Siglec-9 is or comprises a ligand present on a mucin, such as MUC1. In one embodiment, the ligand of Siglec-9 is a sialoglycan ligand containing both sialic acid and sulfate.

하나의 양태에서, 항체는 제1 및 제2 인간 CD33-관련 Siglec으로서 세포외 도메인 상에 존재하는 공통 결정기에 결합한다. 본원에서 임의의 구현예의 하나의 양태에서, 항체는 Siglec-7이 아니라 Siglec-9에 존재하는 결정기에 결합한다. 본원에서 임의의 구현예의 하나의 양태에서, 항체는 Siglec-7 및 Siglec-9 상에 존재하는 공통 결정기에 결합한다. 선택적으로, 항체에 의해 결합되는 결정기는 하나 이상의 다른 Siglec, 예컨대, 하나 이상의(모든) Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및 Siglec-12 상에는 존재하지 않는다.In one embodiment, the antibody binds to a common determinant present on the extracellular domain as a first and a second human CD33-associated Siglec. In one aspect of any of the embodiments herein, the antibody binds a determinant present on Siglec-9 but not on Siglec-7. In one aspect of any of the embodiments herein, the antibody binds to a common determinant present on Siglec-7 and Siglec-9. Optionally, the determinant to be bound by the antibody is on one or more other Siglec, such as one or more (all) Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 and Siglec-12. does not exist.

본원에서 임의의 구현예에서, 항체는 Siglec의 세포외 도메인에 결합한다. 본원에서의 소정 구현예에서, 특히 항체가 Siglec 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 차단하는 경우, 항체는 적어도 부분적으로 Siglec의 시알산 결합 도메인 내에 또는 근처에 결합할 수 있다. 본원에서 다른 구현예에서, 특히 항체가 Siglec 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 차단하지 않는 경우, 항체는 Siglec의 시알산 결합 도메인 밖에 결합할 수 있다.In any of the embodiments herein, the antibody binds to the extracellular domain of Siglec. In certain embodiments herein, the antibody is capable of binding at least partially within or near the sialic acid binding domain of Siglec, particularly when the antibody blocks the interaction between Siglec and its sialic acid ligand. In other embodiments herein, the antibody may bind outside the sialic acid binding domain of Siglec, particularly if the antibody does not block the interaction between Siglec and its sialic acid ligand.

본원에서 임의의 구현예에서, 인간 림프구(예컨대, 일차 NK 세포) 상의 Siglec에 대한 결합 시, 모노클로날 항체는 표적 세포가 림프구와 접촉하게 되는 경우, 표적 세포 표면 상에 Siglec의 시알산 리간드를 보유하는 표적 인간 세포의 용해를 재구성하는 능력을 갖는다.In any of the embodiments herein, upon binding to Siglec on human lymphocytes (eg, primary NK cells), the monoclonal antibody releases the sialic acid ligand of Siglec on the surface of the target cell when the target cell comes into contact with the lymphocyte. It has the ability to reconstitute lysis of target human cells that retain it.

본원에서 임의의 구현예에서, 항체는 Siglec 폴리펩타이드(예컨대, 인간 Siglec-7 및/또는 인간 Siglec-9)로의 결합에 대해 10-8 M 미만, 바람직하게는 10-9 M 미만의 KD를 갖는다(예컨대 본원에서 실시예에 개시된 방법에 따라 결정되는, 1가 결합에 대해). Siglec-7 및 Siglec-9 결합 부위가 풍부하게 발현되는 저친화도 시알산과의 시스 상호작용으로 인해 세포 표면에서 일반적으로 차단되는 것으로 여겨지는 한, 시스와 경쟁하는 리간드보다 높은 친화도를 발현하는 항체로 트랜스 상호작용이 일어날 수 있다. 하나의 구현예에서, 중화 항-Siglec 항체는 시알로사이드 리간드의 Siglec(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9)으로의 결합을 변위시킬 수 있다.In any of the embodiments herein, the antibody has a KD for binding to a Siglec polypeptide (eg, human Siglec-7 and/or human Siglec-9) of less than 10 -8 M, preferably less than 10 -9 M (eg for monovalent bonds, as determined according to the methods disclosed in the Examples herein). Antibodies expressing higher affinity than ligands that compete with cis, so long as the Siglec-7 and Siglec-9 binding sites are generally thought to be blocked at the cell surface due to their cis interaction with the abundantly expressed low-affinity sialic acid trans interactions may occur. In one embodiment, the neutralizing anti-Siglec antibody is capable of displacing binding of a sialoside ligand to Siglec (eg, Siglec-7 and/or Siglec-9).

본 발명은 또한 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편, 또는 이의 유도체를 제공하며, 이는 임의의 상기 특성을 단독으로 또는 임의의 적합한 조합으로 갖는다.The present invention also provides a human or humanized antibody or antibody fragment, or derivative thereof, having any of the above properties, alone or in any suitable combination.

하나의 양태에서 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및/또는 mAb-F에 의해 결합된 Siglec-9 상의 에피토프로의 결합에 대해 경쟁하는(예컨대, Siglec-9 폴리펩타이드 상의 에피토프로의 결합에 대해 임의의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 모노클로날 항체가 제공된다.In one embodiment competes for binding to an epitope on Siglec-9 bound by mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E and/or mAb-F (eg, Siglec- 9 competing with an antibody having the heavy and light chain CDRs or variable regions of any mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E or mAb-F for binding to an epitope on the polypeptide) Monoclonal antibodies are provided.

하나의 양태에서 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 및/또는 mAb-6에 의해 결합된 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 상의 에피토프로의 결합에 대해 경쟁하는(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드 상의 에피토프로의 결합에 대해 임의의 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 및/또는 mAb-6의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 갖는 항체와 경쟁하는) 모노클로날 항체가 제공된다.Compete for binding to an epitope on Siglec-7 and/or Siglec-9 bound by mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 and/or mAb-6 in one embodiment (e.g., of any mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 and/or mAb-6 for binding to an epitope on the Siglec-7 and/or Siglec-9 polypeptide. monoclonal antibodies (competing with antibodies having heavy and light chain CDRs or variable regions) are provided.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 잔기 N82, P83, A84, R85, A86 및/또는 V87에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 하나의 양태에서, 항-Siglec-7 항체는 잔기 N81, D100, H102 및/또는 T103에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 하나의 양태에서, 항-Siglec-7 항체는 잔기 W88, E89, E90, R92에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 1의 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-7 폴리펩타이드, 예컨대, 하나 이상의(또는 모든) 돌연변이체 M6, M8, M15 또는 M16에 대한 결합을 소실하지 않는다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody has reduced binding to a Siglec-7 polypeptide having a mutation at residues N82, P83, A84, R85, A86 and/or V87 (such as the mutations shown in Table 3). In one embodiment, the anti-Siglec-7 antibody has reduced binding to a Siglec-7 polypeptide having mutations at residues N81, D100, H102 and/or T103 (such as the mutations shown in Table 3). In one embodiment, the anti-Siglec-7 antibody has reduced binding to a Siglec-7 polypeptide having a mutation at residues W88, E89, E90, R92 (eg, the mutations shown in Table 3). Residue positions for mutations are referenced to the Siglec-7 polypeptide of SEQ ID NO: 1. Optionally, the antibody does not lose binding to one or more other mutant Siglec-7 polypeptides of Table 3, such as one or more (or all) mutants M6, M8, M15 or M16.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 잔기 N78, P79, A80, R81, A82 및/또는 V83에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 하나의 양태에서, 항-Siglec-9 항체는 잔기 N77, D96, H98 및/또는 T99에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 하나의 양태에서, 항-Siglec-9 항체는 잔기 W84, E85, E86 및/또는 R88에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드, 예컨대, 하나 이상의(또는 모든) 돌연변이체 M6, M8, M15 또는 M16에 대한 결합을 소실하지 않는다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody has reduced binding to a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues N78, P79, A80, R81, A82 and/or V83 (such as the mutations shown in Table 3). In one embodiment, the anti-Siglec-9 antibody has reduced binding to a Siglec-9 polypeptide having mutations at residues N77, D96, H98 and/or T99 (such as the mutations shown in Table 3). In one embodiment, the anti-Siglec-9 antibody has reduced binding to a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues W84, E85, E86 and/or R88 (eg, the mutations shown in Table 3). Residue positions for mutations are referenced to the Siglec-9 polypeptide of SEQ ID NO:2. Optionally, the antibody does not lose binding to one or more other mutant Siglec-9 polypeptides of Table 3, such as one or more (or all) mutants M6, M8, M15 or M16.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 잔기 S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 및/또는 G54에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드, 예컨대, 돌연변이체 9, 10 및/또는 11, 또는 하나 이상의(또는 모든) 돌연변이체 M7 또는 M8에 대한 결합을 소실하지 않는다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody has reduced binding to a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 and/or G54 (such as the mutations shown in Table 3). has Residue positions for mutations are referenced to the Siglec-9 polypeptide of SEQ ID NO:2. Optionally, the antibody does not lose binding to one or more other mutant Siglec-9 polypeptides of Table 3, such as mutants 9, 10 and/or 11, or one or more (or all) mutants M7 or M8 .

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 잔기 P55, H58, E122, G124, S125 및/또는 K127에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드, 예컨대, 돌연변이체 9, 10 및/또는 11에 대한 결합을 소실하지 않는다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody has reduced binding to a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues P55, H58, E122, G124, S125 and/or K127 (such as the mutations shown in Table 3). Residue positions for mutations are referenced to the Siglec-9 polypeptide of SEQ ID NO:2. Optionally, the antibody does not lose binding to one or more other mutant Siglec-9 polypeptides of Table 3, such as mutants 9, 10 and/or 11.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 잔기 K131 및/또는 H132에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드, 예컨대, 돌연변이체 9, 10 및/또는 11, 또는 하나 이상의(또는 모든) 돌연변이체 M8 또는 M15에 대한 결합을 소실하지 않는다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody has reduced binding to a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues K131 and/or H132 (eg, the mutations shown in Table 3). Residue positions for mutations are referenced to the Siglec-9 polypeptide of SEQ ID NO:2. Optionally, the antibody does not lose binding to one or more other mutant Siglec-9 polypeptides of Table 3, such as mutants 9, 10 and/or 11, or one or more (or all) mutants M8 or M15 .

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 잔기 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및/또는 D71에서 돌연변이(예컨대 표 3에 나타낸 돌연변이)를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 갖는다. 돌연변이에 대한 잔기 위치는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드에 대해 참조된다. 선택적으로, 항체는 표 3의 하나 이상의 다른 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드, 예컨대, 돌연변이체 9, 10 및/또는 11, 또는 하나 이상의(또는 모든) 돌연변이체 M6, M15 또는 M16에 대한 결합을 소실하지 않는다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody has reduced binding to a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues R63, A66, N67, T68, D69, Q70 and/or D71 (such as the mutations shown in Table 3). . Residue positions for mutations are referenced to the Siglec-9 polypeptide of SEQ ID NO:2. Optionally, the antibody loses binding to one or more other mutant Siglec-9 polypeptides of Table 3, such as mutants 9, 10 and/or 11, or one or more (or all) mutants M6, M15 or M16. I never do that.

하나의 구현예에서, 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 또는 이와 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 이와 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드로의 결합에 대해 경쟁하는 항원-결합 화합물이 제공된다:In one embodiment, it binds to and/or binds to an epitope comprising or identical to the heavy and light chain CDR1, CDR2 and CDR3 of an antibody selected from the group consisting of and/or with Siglec-7 and/or Siglec-9 polypeptides. Antigen-binding compounds are provided that compete for binding of:

(a) (i) SEQ ID NO: 3의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 4의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;(a) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 3 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 4 monoclonal antibody;

(b) (i) SEQ ID NO: 5의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 6의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체; (b) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 5 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 6 monoclonal antibody;

(c) (i) SEQ ID NO: 7의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 8의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;(c) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 7 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 8 monoclonal antibody;

(d) (i) SEQ ID NO: 9의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 10의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;(d) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 9 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 10 monoclonal antibody;

(e) (i) SEQ ID NO: 11의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 12의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체; 및(e) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 11 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 12 monoclonal antibody; and

(f) (i) SEQ ID NO: 13의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 14의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체.(f) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 13 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 14 monoclonal antibody.

(g) (i) SEQ ID NO: 15의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 16의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;(g) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 15 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 16 monoclonal antibody;

(h) (i) SEQ ID NO: 17의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 18의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;(h) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 17 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 18 monoclonal antibody;

(i) (i) SEQ ID NO: 19의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 20의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;(i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 19 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 20 monoclonal antibody;

(j) (i) SEQ ID NO: 21의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 22의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체;(j) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 21 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 22 monoclonal antibody;

(k) (i) SEQ ID NO: 23의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 24의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체; 및 (k) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 23 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 24 monoclonal antibody; and

(l) (i) SEQ ID NO: 25의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 26의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체. (l) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 25 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 26 monoclonal antibody.

본 발명의 임의의 구현예의 하나의 양태에서, Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 항체 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및 mAb-F로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 갖는 중쇄; 및 항체 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및 mAb-F로 구성되는 군으로부터 선택되는 각 항체의 경쇄의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 갖는 경쇄를 가질 수 있다.In one aspect of any embodiment of the invention, the antibody that binds to the Siglec-9 polypeptide is from the group consisting of antibodies mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E and mAb-F a heavy chain having 1, 2 or 3 CDRs of a heavy chain of an antibody selected from; and a light chain having one, two or three CDRs of a light chain of each antibody selected from the group consisting of antibodies mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E and mAb-F; can have

하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 SYWMH(SEQ ID NO: 75)를 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 EINPSNGHTNYNEKFES(SEQ ID NO: 78)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 GVESYDFDDALDY(SEQ ID NO: 80)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 RASQDINNYLN(SEQ ID NO: 83)을 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 YTSRLHS(SEQ ID NO: 57)를 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 QQGNTLPFT(SEQ ID NO: 86)를 포함하는 경쇄 CDR3; 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.In one aspect, there is provided an antigen binding domain or antibody that binds to a human Siglec-9 polypeptide comprising: a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence SYWMH (SEQ ID NO: 75); a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence EINPSNGHTNYNEKFES (SEQ ID NO: 78); a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence GVESYDFDDALDY (SEQ ID NO: 80); a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence RASQDINNYLN (SEQ ID NO: 83); a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence YTSRLHS (SEQ ID NO: 57); a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence QQGNTLPFT (SEQ ID NO: 86); and human heavy and light chain framework sequences.

하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 SYWMH(SEQ ID NO: 75)를 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 EINPSNGHTNYNEKFKT(SEQ ID NO: 90)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 GVETYDFDDAMDY(SEQ ID NO: 92)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 RASQDINNYLN(SEQ ID NO: 83)을 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 FTSRLHS(SEQ ID NO: 95)를 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 QQGDTFPFT(SEQ ID NO: 96)를 포함하는 경쇄 CDR3; 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.In one aspect, there is provided an antigen binding domain or antibody that binds to a human Siglec-9 polypeptide comprising: a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence SYWMH (SEQ ID NO: 75); a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence EINPSNGHTNYNEKFKT (SEQ ID NO: 90); a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence GVETYDFDDAMDY (SEQ ID NO: 92); a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence RASQDINNYLN (SEQ ID NO: 83); amino acid sequence FTSRLHS (SEQ ID NO: 95) light chain CDR2 comprising; a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence QQGDTFPFT (SEQ ID NO: 96); and human heavy and light chain framework sequences.

하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 NYEMN(SEQ ID NO: 98)을 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 WINTYTGESTYADDFK(SEQ ID NO: 101)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 DDYGRSYGFAY(SEQ ID NO: 103)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 RASESVDSYGNSFMH(SEQ ID NO: 106)를 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 LASKLES(SEQ ID NO: 109)를 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 HQNNEDPPWT(SEQ ID NO: 110)를 포함하는 경쇄 CDR3; 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.In one aspect, there is provided an antigen binding domain or antibody that binds to a human Siglec-9 polypeptide comprising: a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence NYEMN (SEQ ID NO: 98); a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence WINTYTGESTYADDFK (SEQ ID NO: 101); a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence DDYGRSYGFAY (SEQ ID NO: 103); a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 106); a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence LASKLES (SEQ ID NO: 109); a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence HQNNEDPPWT (SEQ ID NO: 110); and human heavy and light chain framework sequences.

하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 DYSMH(SEQ ID NO: 112)를 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 WIITETGEPTYADDFRG(SEQ ID NO: 115)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 DFDGY(SEQ ID NO: 117)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 RASENIYSYLA(SEQ ID NO: 119)를 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 NAKTLTE(SEQ ID NO: 122)를 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 QHHYGFPWT(SEQ ID NO: 123)를 포함하는 경쇄 CDR3; 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.In one aspect, there is provided an antigen binding domain or antibody that binds to a human Siglec-9 polypeptide comprising: a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence DYSMH (SEQ ID NO: 112); a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence WIITETGEPTYADDFRG (SEQ ID NO: 115); a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence DFDGY (SEQ ID NO: 117); a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence RASENIYSYLA (SEQ ID NO: 119); a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence NAKTLTE (SEQ ID NO: 122); a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence QHHYGFPWT (SEQ ID NO: 123); and human heavy and light chain framework sequences.

하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 TFGMH(SEQ ID NO: 125)를 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 YISSGSNAIYYADTVKG(SEQ ID NO: 128)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 PGYGAWFAY(SEQ ID NO: 130)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 RASSSVSSAYLH(SEQ ID NO: 133)를 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 STSNLAS(SEQ ID NO: 136)을 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 QQYSAYPYT(SEQ ID NO: 137)를 포함하는 경쇄 CDR3; 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.In one aspect, there is provided an antigen binding domain or antibody that binds to a human Siglec-9 polypeptide comprising: a heavy chain CDR1 comprising the amino acid sequence TFGMH (SEQ ID NO: 125); a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence YISSGSNAIYYADTVKG (SEQ ID NO: 128); a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence PGYGAWFAY (SEQ ID NO: 130); a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence RASSSVSSAYLH (SEQ ID NO: 133); a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence STSNLAS (SEQ ID NO: 136); a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence QQYSAYPYT (SEQ ID NO: 137); and human heavy and light chain framework sequences.

하나의 양태에서, 다음을 포함하는, 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 항체가 제공된다: 아미노산 서열 DYSMH(SEQ ID NO: 112)를 포함하는 중쇄 CDR1; 아미노산 서열 VISTYNGNTNYNQKFKG(SEQ ID NO: 139)를 포함하는 중쇄 CDR2; 아미노산 서열 RGYYGSSSWFGY(SEQ ID NO: 141)를 포함하는 중쇄 CDR3; 아미노산 서열 KASQNVGTDVA(SEQ ID NO: 144)를 포함하는 경쇄 CDR1; 아미노산 서열 SASYRYS(SEQ ID NO: 147)를 포함하는 경쇄 CDR2; 아미노산 서열 QQYNSFPYT(SEQ ID NO: 148)를 포함하는 경쇄 CDR3 및 인간 중쇄 및 경쇄 프레임워크 서열.In one aspect, there is provided an antigen binding domain or antibody that binds to a human Siglec-9 polypeptide comprising: the amino acid sequence DYSMH (SEQ ID NO: 112); heavy chain CDR1 comprising; a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence VISTYNGNTNYNQKFKG (SEQ ID NO: 139); a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence RGYYGSSSWFGY (SEQ ID NO: 141); a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence KASQNVGTDVA (SEQ ID NO: 144); a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence SASYRYS (SEQ ID NO: 147); light chain CDR3 and human heavy and light chain framework sequences comprising the amino acid sequence QQYNSFPYT (SEQ ID NO: 148).

본 발명의 임의의 구현예의 하나의 양태에서, Siglec-7 및 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항체는 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 및 mAb-6으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체의 각각의 중쇄 및/또는 경쇄의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄를 가질 수 있다.In one aspect of any embodiment of the invention, the antibodies that bind Siglec-7 and Siglec-9 polypeptides are antibodies mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 and mAb-6 may have heavy and/or light chains having 1, 2 or 3 CDRs of each heavy and/or light chain of an antibody selected from the group consisting of

본 발명의 임의의 구현예의 하나의 양태에서, Siglec으로의 결합은 세포성 Siglec인 것으로 특정될 수 있으며, 여기서 Siglec은 세포에 표면에서, 예를 들어 천연 또는 개질된 세포성 Siglec, 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 Siglec, NK 세포, CD8 T 세포 등에 의해 발현되는 Siglec으로 발현된다.In one aspect of any embodiment of the invention, binding to a Siglec may be characterized as being a cellular Siglec, wherein the Siglec is at the surface of a cell, eg, a native or modified cellular Siglec, to a recombinant host cell. Siglec expressed by Siglec, NK cells, CD8 T cells, etc. are expressed as Siglec.

본 발명은 또한 임의의 상기 특성을 갖는 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 세포, 및 이러한 세포를 항-Siglec 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 인간 항-Siglec 항체의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 단백질, 핵산, 벡터, 및/또는 세포 및 전형적으로 조성물의 제형화, 전달, 안정성, 또는 다른 특징을 촉진하는 활성 성분 또는 비활성 성분일 수 있는 하나 이상의 추가 성분(예컨대, 다양한 담체)을 포함하는, 조성물, 예컨대 약제학적으로 허용 가능한 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 Siglec-매개 생물학적 활성의 조정에서, 예를 들어 이에 관련된 질병, 특히 암 및 감염성 질병의 치료에서, 이러한 항체, 핵산, 벡터, 세포, 유기체, 및/또는 조성물의 다양하고 새롭고 유용한 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to nucleic acids encoding human or humanized antibodies or antibody fragments having any of the above characteristics, vectors comprising such nucleic acids, cells comprising such vectors, and preparing such cells under conditions suitable for expression of anti-Siglec antibodies. It provides a method for producing a human anti-Siglec antibody comprising the step of culturing. The present invention also relates to such proteins, nucleic acids, vectors, and/or cells and typically one or more additional ingredients (eg, various carriers) which may be active or inactive ingredients that facilitate the formulation, delivery, stability, or other characteristics of the composition. ), such as pharmaceutically acceptable compositions and kits. The present invention further relates to a variety of new and useful of such antibodies, nucleic acids, vectors, cells, organisms, and/or compositions in the modulation of Siglec-mediated biological activity, for example in the treatment of diseases related thereto, in particular cancer and infectious diseases. It relates to methods of manufacture and use.

또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, Siglec-9의 억제 활성을 중화시키는 항체의 생산 방법이 제공된다:In another aspect, there is provided a method of producing an antibody that neutralizes the inhibitory activity of Siglec-9, comprising:

(a) Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 복수의 항체를 제공하는 단계,(a) providing a plurality of antibodies that bind to the Siglec-9 polypeptide;

(b) 선택적으로 일차 인간 NK 세포, 예컨대 CD56dim NK 세포에서 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키는 항체(예컨대, 단계 (a)의 것들)를 선택하는 단계, 및(b) optionally selecting an antibody (such as those of step (a)) that neutralizes the inhibitory activity of the Siglec-9 polypeptide in primary human NK cells, such as CD56 dim NK cells, and

(c) Siglec-9 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하지 않는 항체(예컨대, 단계 (b)의 것들)를 선택하는 단계. 하나의 구현예에서, Siglec-9 폴리펩타이드는 세포, 예컨대, CHO 세포, 림프구, NK 세포의 표면에서 발현된다.(c) selecting antibodies (eg, those of step (b)) that do not substantially block the interaction between the Siglec-9 polypeptide and its sialic acid ligand. In one embodiment, the Siglec-9 polypeptide is expressed on the surface of a cell, such as a CHO cell, a lymphocyte, a NK cell.

또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, Siglec-9의 억제 활성을 중화시키는 항체의 생산 방법이 제공된다:In another aspect, there is provided a method of producing an antibody that neutralizes the inhibitory activity of Siglec-9, comprising:

(a) Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 복수의 항체를 제공하는 단계,(a) providing a plurality of antibodies that bind to the Siglec-9 polypeptide;

(b) 선택적으로 일차 인간 NK 세포, 예컨대 CD56dim NK 세포에서 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키는 항체(예컨대, 단계 (a)의 것들)를 선택하는 단계, 및(b) optionally selecting an antibody (such as those of step (a)) that neutralizes the inhibitory activity of the Siglec-9 polypeptide in primary human NK cells, such as CD56 dim NK cells, and

(c) Siglec-9 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하는 항체(예컨대, 단계 (b)의 것들)를 선택하는 단계, 선택적으로 Siglec-9의 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb a 6'-시알릴락토스 시알산 리간드를 둘 다 차단하는 항체를 선택하는 단계.(c) selecting an antibody (such as those of step (b)) that substantially blocks the interaction between the Siglec-9 polypeptide and its sialic acid ligand, optionally Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb a 6 of Siglec-9 '- Selecting an antibody that blocks both sialyllactose sialic acid ligands.

또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, Siglec-7의 억제 활성을 중화시키는 항체의 생산 방법이 제공된다:In another aspect, there is provided a method of producing an antibody that neutralizes the inhibitory activity of Siglec-7, comprising:

(a) Siglec-7 폴리펩타이드에 결합하는 복수의 항체를 제공하는 단계,(a) providing a plurality of antibodies that bind to the Siglec-7 polypeptide;

(b) Siglec-7 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키는 항체(예컨대, 단계 (a)의 것들)를 선택하는 단계, 및(b) selecting an antibody (such as those of step (a)) that neutralizes the inhibitory activity of the Siglec-7 polypeptide, and

(c) Siglec-7 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 실질적으로 차단하지 않는 항체(예컨대, 단계 (b)의 것들)를 선택하는 단계. 하나의 구현예에서, Siglec-7 폴리펩타이드는 세포, 예컨대, CHO 세포, 림프구, NK 세포의 표면에서 발현된다.(c) selecting antibodies (eg, those of step (b)) that do not substantially block the interaction between the Siglec-7 polypeptide and its sialic acid ligand. In one embodiment, the Siglec-7 polypeptide is expressed on the surface of a cell, such as a CHO cell, a lymphocyte, a NK cell.

임의의 상기 방법에서의 단계 (b) 및 (c)는 임의의 요망되는 순서로 수행될 수 있음이 이해될 것이다.It will be understood that steps (b) and (c) in any of the above methods may be performed in any desired order.

또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, Siglec-9 및 Siglec-7의 억제 활성을 중화시키는 항체의 생산 방법이 제공된다:In another aspect, there is provided a method of producing an antibody that neutralizes the inhibitory activity of Siglec-9 and Siglec-7, comprising:

(a) Siglec-9 및 Siglec-7 폴리펩타이드에 결합하는 복수의 항체를 제공하는 단계,(a) providing a plurality of antibodies that bind to Siglec-9 and Siglec-7 polypeptides;

(b) 선택적으로 일차 인간 NK 세포, 예컨대 CD56bright 및 CD56dim NK 세포에서 Siglec-9 폴리펩타이드 및 Siglec-7 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시키는 항체(예컨대, 단계 (a)의 것들)를 선택하는 단계.(b) selectively selecting antibodies (such as those of step (a)) that neutralize the inhibitory activity of the Siglec-9 polypeptide and the Siglec-7 polypeptide in primary human NK cells, such as CD56 bright and CD56 dim NK cells step.

하나의 구현예에서, Siglec의 억제 활성을 중화시키는 항체의 선택은 일차 NK 세포(예컨대 인간 공여체로부터; 예를 들어 실시예 10의 방법에 따라, 수득되는 정제 NK 세포)를 강화시키는 항체를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. In one embodiment, selection of an antibody that neutralizes the inhibitory activity of Siglec comprises selecting an antibody that enhances primary NK cells (eg, purified NK cells obtained from a human donor; eg, according to the method of Example 10). may include steps.

하나의 구현예에서, 항체가 임의의 두 상이한 Siglec 유전자 산물의 억제 활성을 중화시키는지 여부의 결정은 Siglec(들)을 발현하는 림프구가 표적 세포(예컨대 Siglec(들)의 리간드를 발현하는 것)와 접촉되는 경우, 항체가 세포독성 마커의 증가(예컨대, CD107 및/또는 CD137의 발현 증가)를 야기하는지 여부를 평가하는 단계를 포함한다. 세포독성 마커의 증가(예컨대, CD107 및/또는 CD137의 발현 증가)는 항체가 Siglec 유전자 산물(들)의 억제 활성을 중화시킬 수 있음을 시사한다.In one embodiment, the determination of whether the antibody neutralizes the inhibitory activity of any two different Siglec gene products is that lymphocytes expressing Siglec(s) are target cells (eg, expressing ligands of Siglec(s)). and assessing whether the antibody causes an increase in cytotoxic markers (eg, increased expression of CD107 and/or CD137) when contacted with An increase in cytotoxic markers (eg, increased expression of CD107 and/or CD137) suggests that the antibody may neutralize the inhibitory activity of the Siglec gene product(s).

본 발명은 또한 Siglec-7 및/또는 Siglec-9-발현 림프구, 선택적으로 NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 활성을 조정하기 위한 시험관내 방법을 제공하며, 방법은 이의 표면에 Siglec-7 및/또는 Siglec-9를 발현하는 림프구(예컨대 일차 NK 세포)를 Siglec-7 및 Siglec-9의 억제 활성을 중화시키는 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.The present invention also provides an in vitro method for modulating the activity of Siglec-7 and/or Siglec-9-expressing lymphocytes, optionally NK cells and/or CD8+ T cells, the method comprising: or contacting the lymphocytes expressing Siglec-9 (such as primary NK cells) with an antibody that neutralizes the inhibitory activity of Siglec-7 and Siglec-9.

본 발명은 또한 림프구(예컨대, NK 세포, CD8+ T 세포) 활성의 활성 강화 및/또는 조정을 필요로 하는 대상체에서 림프구(예컨대, NK 세포, CD8+ T 세포) 활성의 활성 강화 및/또는 조정 방법, 예를 들어 CD56dim NK 세포(주요 세포독성 하위세트) 및 선택적으로 추가로 CD56bright NK 세포(림프절 및 편도에서 대부분의 NK 세포로, 활성화 시 주로 사이토카인 생산으로 반응함)의 조정에 의한 NK 세포 활성의 강화 방법을 제공하며, 방법은 대상체에 유효량의 임의의 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 대상체는 암을 앓는 환자이다. 예를 들어, 환자는 혈액암, 예컨대 급성 골수구 백혈병, 만성 골수구 백혈병, 다발성 골수종, 또는 비-호지킨 림프종을 앓을 수 있다. 대안적으로, 환자는 고형 종양, 예컨대, 결장직장암, 신장암, 난소암, 폐암, 유방암 또는 악성 흑색종을 앓을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 감염성 질병을 앓는 환자이다.The present invention also provides a method for enhancing and/or modulating the activity of lymphocyte (eg, NK cells, CD8+ T cells) activity in a subject in need thereof, For example, NK cells by modulation of CD56 dim NK cells (a major cytotoxic subset) and optionally further CD56 bright NK cells (most NK cells in lymph nodes and amygdala, which upon activation respond primarily to cytokine production) A method of enhancing activity is provided, the method comprising administering to a subject an effective amount of any of the above compositions. In one embodiment, the subject is a patient suffering from cancer. For example, the patient may have a blood cancer, such as acute myelocytic leukemia, chronic myelocytic leukemia, multiple myeloma, or non-Hodgkin's lymphoma. Alternatively, the patient may have a solid tumor such as colorectal cancer, kidney cancer, ovarian cancer, lung cancer, breast cancer or malignant melanoma. In another embodiment, the subject is a patient suffering from an infectious disease.

이들 양태는 본원에서 제공되는 본 발명의 기재에서 보다 자세히 기재되며, 추가 양태, 특징, 및 이점은 이로부터 명백할 것이다.These aspects are set forth in greater detail in the description of the invention provided herein, and further aspects, features, and advantages will be apparent therefrom.

도 1은 항-Siglec 항체의 NK 세포로의 결합을 나타낸다. Siglec MFI:형광 세기의 평균. 유의미한 분율(약 44%)의 NK 세포가 Siglec-7 및 Siglec-9를 둘 다 발현하여, 큰 비율의 NK 세포가, 예를 들어 종양 세포 상에 존재하는 글리칸 리간드의 함수로서, 각각의(또는 둘 다의) 이들 수용체에 의해 저해될 수 있음을 제시한다.
도 2는, 예를 들어, Siglec-9 또는 시아노몰구스 Siglec이 아닌 Siglet-7에 결합하는 항체(오른쪽 패널), 각각의 Siglec-7, Siglec-9 및 시아노몰구스 Siglec에 결합하는 항체(중간 패널), 및 Siglec-7 또는 시아노몰구스 Siglec이 아닌 Siglet-9에 결합하는 항체(왼쪽 패널)의 유세포 측정으로부터의 대표 결과를 나타낸다.
도 3은 이의 각각의 EC50 값이 수반되는, 항체 mAbA, mAbC 및 mAbD의 moDC(왼쪽 패널) 및 뉴라미다제-처리 moDC(오른쪽 패널)로의 유세포 측정 결합에 의한 적정을 나타낸다. EC50은 뉴라미니다제 처리 후 크게 증강되어(10배), moDC 상에서 발현되는 Siglec-9가 뉴라미니다제 처리 전에 이의 시알산 리간드와의 시스 상호작용에 연루되었음을 제시하였다. 그러나, 정체기 수준은 변경되지 않아, 항체가 세포 표면 상의 모든 Siglec-9(결합 및 비결합) 입체형태에 결합할 수 있고 monoDC뿐만 아니라 다른 세포 유형(예컨대, 단핵구 및 대식구 M1 및 M2)에서 시스-상호작용 및 신호전달을 억제함을 제시한다.
도 4는 Siglec-7 및 Siglec-9 교차 반응성 항체 중에서(도 4b) 및 Siglec-9 단일특이적(비-Siglec-7 결합) 항체 중에서(도 4a) YTS Siglec-9* 세포독성 증가의 용량 의존적 유도를 나타낸다.
도 5는 일차 NK 세포(공여체로부터 정제된 신선 NK 세포로서) 및 HT29 결장직장암 세포를 이용하여, 전통적인 51Cr 방출 검정에서, 2명의 상이한 인간 공여체(공여체 D1(왼쪽 패널) 및 D2(오른쪽 패널))에서 항체 mAbA, mAbC, mAbD, mAbE, 및 mAbF에 의해 매개되는 일차 NK 세포 세포독성의 증가를 나타낸다.
도 6은 HT29 종양 세포의 존재 하에 1명의 인간 공여체에서 몇몇 항-Siglec-9 및 항 Siglec-7/9 항체 mAbA, mAbB, mAbF, mAb6 및 mAb4에 의해 매개되는 CD137을 발현하는 Siglec-9-양성 NK 세포%의 증가를 나타낸다. 항-Siglec-9 항체는 Siglec-9-발현 일차 인간 NK 세포의 세포독성을 동일한 공여체로부터의 Siglec-9-음성 일차 인간 NK 세포에서 관찰되는 수준까지 완전 복원하였다.
도 7은 항체 mAbA 및 mAb1이 Siglec-9-음성 CD137+ NK 세포(%)(오른쪽 패널)가 아닌 Siglec-9-양성 CD137+ NK 세포(%)(중간 패널)의 증가를 유도함을 나타낸다. 항체의 부재 하에 CD137을 발현하는 NK%를 왼쪽 패널에 나타낸다.
도 8은 항체의 존재 하에 Siglec-9-Fc 단백질의 Ramos 세포로의 결합을 나타낸다(상부 패널). 항-Siglec/9 mAb mAbA, mAbB, mAbC, 및 mAbD는 각각 Siglec-9-Fc 단백질의 Ramos 세포로의 결합을 억제한 반면, mAbE는 부분적 억제를 나타내었고, mAbF는 결합을 억제하지 않았다. 항체의 존재 하에 Siglec-9-Fc 단백질의 K562 세포로의 결합을 하부 패널에 나타낸다. 항-Siglec/9 mAb mAbA, mAbB, mAbC 및 mAbD는 각각 Siglec-9-Fc 단백질의 Ramos 세포로의 결합을 억제한 반면, mAbE 및 mAbF는 둘 다 부분적 억제를 나타내었다.
도 9 및 10은 ELISA 검정을 이용하여 항 Siglec-7/9 항체에 의한 Siglec-7 및 Siglec-9 및 시알릴화 리간드 간 상호작용의 차단 평가를 나타낸다. 도 9는 mAb 1, mAb2, mAb4, mAb5 및 mAb6이 Sia2와의 Siglec-7 상호작용을 차단하였으나, mAb3은 차단하지 않았음을 나타낸다. 도 10은 모든 mAb가 Sia2와 Siglec-9 상호작용을 차단하는 반면, mAb1, mAb2 및 mAb3은 Sia1과 Siglec-9 상호작용을 억제하는 능력을 낮게 나타내었고 이에 따라 Sia1 상호작용을 실질적으로 차단하지 않았음을 나타낸다.
도 11 내지 도 14는 인간 Siglec-9 단백질을 나타낸다. 도 11은 Siglec-9 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인의 구조를 나타내며, Siglec-9 돌연변이체 M9, M10 및 M11에서 치환된 잔기를 짙은 색조로 나타낸다. 도 12는 Siglec-9 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인의 구조를 나타내며, Siglec-9 돌연변이체 M6 및 M7에서 치환된 잔기를 짙은 색조로 나타낸다. 도 13은 Siglec-9 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인의 구조를 나타내며, Siglec-9 돌연변이체 M16에서 치환된 잔기를 짙은 색조로 나타낸다. 도 14는 Siglec-9 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인의 구조를 나타내며, Siglec-9 돌연변이체 M8에서 치환된 잔기를 짙은 색조로 나타낸다. 각각의 도 11 내지 14에서, 시알산 리간드 결합 부위를 밝은 색조로 나타낸다.1 shows the binding of anti-Siglec antibodies to NK cells. Siglec MFI: Average of fluorescence intensity. A significant fraction (about 44%) of NK cells expressed both Siglec-7 and Siglec-9, so that a large proportion of NK cells, e.g., as a function of glycan ligands present on tumor cells, each ( or both) may be inhibited by these receptors.
Figure 2 shows, for example, an antibody that binds Siglet-7 but not Siglec-9 or cyanomolgus Siglec (right panel), an antibody that binds Siglec-7, Siglec-9 and cyanomolgus Siglec, respectively (middle) panel), and representative results from flow cytometry of antibodies that bind to Siglec-7 or Siglet-9 but not cyanomolgus Siglec (left panel).
3 shows titration by flow cytometric binding of antibodies mAbA, mAbC and mAbD to moDC (left panel) and neuramidase-treated moDC (right panel) accompanied by their respective EC 50 values. EC 50 was significantly enhanced (10-fold) after neuraminidase treatment, suggesting that Siglec-9 expressed on moDC was implicated in its cis interaction with its sialic acid ligand prior to neuraminidase treatment. However, stationary phase levels are not altered, so that the antibody can bind all Siglec-9 (bound and unbound) conformations on the cell surface and cis- in monoDC as well as other cell types (e.g., monocytes and macrophages M1 and M2). It is suggested to inhibit interaction and signaling.
FIG. 4 is a dose-dependent increase in YTS Siglec-9* cytotoxicity in Siglec-7 and Siglec-9 cross-reactive antibodies ( FIG. 4B ) and in Siglec-9 monospecific (non-Siglec-7 binding) antibodies ( FIG. 4A ). indicates induction.
Figure 5 shows two different human donors (donor D1 (left panel) and D2 (right panel) in a classical 51 Cr release assay, using primary NK cells (as fresh NK cells purified from donors) and HT29 colorectal cancer cells. ) shows an increase in primary NK cell cytotoxicity mediated by antibodies mAbA, mAbC, mAbD, mAbE, and mAbF.
Figure 6 Siglec-9-positive expressing CD137 mediated by several anti-Siglec-9 and anti-Siglec-7/9 antibodies mAbA, mAbB, mAbF, mAb6 and mAb4 in one human donor in the presence of HT29 tumor cells. Shows an increase in % NK cells. The anti-Siglec-9 antibody fully restored the cytotoxicity of Siglec-9-expressing primary human NK cells to the level observed in Siglec-9-negative primary human NK cells from the same donor.
7 shows that antibodies mAbA and mAb1 induce an increase in Siglec-9-positive CD137+ NK cells (%) (middle panel) but not Siglec-9-negative CD137+ NK cells (%) (right panel). The % of NK expressing CD137 in the absence of antibody is shown in the left panel.
Figure 8 shows the binding of Siglec-9-Fc protein to Ramos cells in the presence of antibody (top panel). The anti-Siglec/9 mAbs mAbA, mAbB, mAbC, and mAbD inhibited binding of Siglec-9-Fc protein to Ramos cells, respectively, whereas mAbE showed partial inhibition and mAbF did not inhibit binding. Binding of Siglec-9-Fc protein to K562 cells in the presence of antibody is shown in the lower panel. The anti-Siglec/9 mAbs mAbA, mAbB, mAbC and mAbD respectively inhibited the binding of Siglec-9-Fc protein to Ramos cells, whereas both mAbE and mAbF showed partial inhibition.
9 and 10 show evaluation of blocking of interactions between Siglec-7 and Siglec-9 and sialylated ligands by anti-Siglec-7/9 antibodies using an ELISA assay. 9 shows that mAb 1, mAb2, mAb4, mAb5 and mAb6 blocked Siglec-7 interaction with Sia2, but not mAb3. Figure 10 shows that all mAbs block Sia2 and Siglec-9 interaction, whereas mAb1, mAb2 and mAb3 showed low ability to inhibit Sia1 and Siglec-9 interaction and thus did not substantially block Sia1 interaction. indicates the sound
11 to 14 show the human Siglec-9 protein. 11 shows the structure of the Siglec-9 N-terminal V-set Ig-like domain, with substituted residues in dark shades in Siglec-9 mutants M9, M10 and M11. Figure 12 shows the structure of the Siglec-9 N-terminal V-set Ig-like domain, with substituted residues in dark tones in Siglec-9 mutants M6 and M7. Figure 13 shows the structure of the Siglec-9 N-terminal V-set Ig-like domain, with the residues substituted in Siglec-9 mutant M16 shown in dark shades. Figure 14 shows the structure of the Siglec-9 N-terminal V-set Ig-like domain, showing the substituted residues in Siglec-9 mutant M8 in dark tones. In each of Figures 11 to 14, the sialic acid ligand binding site is shown in light color.

정의Justice

명세서에서 이용되는 단수는 하나 이상을 의미할 수 있다. 단어 "포함하는"과 함께 이용되는 경우, 청구범위(들)에서 이용되는 단수는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 본원에서 이용되는 "또 다른"은 적어도 제2의 또는 그 이상을 의미할 수 있다.The singular used in the specification may mean one or more. When used in conjunction with the word “comprising,” the singular as used in the claim(s) may mean one or more than one. As used herein, “another” may mean at least a second or more.

"포함하는"이 이용되는 경우, 이는 선택적으로 "로 본질적으로 구성되는" 또는 "로 구성되는"에 의해 대체될 수 있다.Where “comprising” is used, it may optionally be replaced by “consisting essentially of” or “consisting of”.

인간 Siglec-7(Genbank 접근 번호 NP_055200.1에 나타내며, 그 전체 개시는 본원에 참조로 포함됨)은 CD33-관련 Siglec 패밀리의 구성원이다(Angata and Varki, Glycobiology 10 (4), 431-438 (2000)). 인간 Siglec-7은 다음 아미노산 서열을 갖는, 467개 아미노산을 포함한다:Human Siglec-7 (represented in Genbank Accession No. NP_055200.1, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference) is a member of the CD33-related Siglec family (Angata and Varki, Glycobiology 10 (4), 431-438 (2000)) ). Human Siglec-7 contains 467 amino acids, with the amino acid sequence:

Figure 112018096971757-pct00001
Figure 112018096971757-pct00001

인간 Siglec-9(Genbank 접근 번호 NP055256.1에 나타내며, 그 전체 개시는 본원에 참조로 포함됨)는 CD33-관련 Siglec 패밀리의 구성원이다(Angata and Varki, J. Biol. Chem. 275 (29), 22127-22135 (2000)). 인간 Siglec-9는 다음 아미노산 서열을 갖는 463개 아미노산을 포함한다:Human Siglec-9 (shown in Genbank Accession No. NP055256.1, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference) is a member of the CD33-related Siglec family (Angata and Varki, J. Biol. Chem. 275 (29), 22127). -22135 (2000)). Human Siglec-9 contains 463 amino acids with the following amino acid sequence:

Figure 112018096971757-pct00002
Figure 112018096971757-pct00002

본 발명의 맥락에서, "NK 세포 세포독성의 Siglec-매개 억제를 중화시킨다", ""T 세포 세포독성의 Siglec-매개 억제를 중화시킨다" 또는 "Siglec의 억제 활성을 중화시킨다""는 Siglec(예컨대, Siglec-7, Siglec-9)이 세포내 공정에 부정적으로 영향을 미치는 그 능력이 억제되어 사이토카인 방출 및 세포독성 반응과 같은 림프구 반응을 야기하는 공정을 나타낸다. 이는 예를 들어 표준 NK-세포 또는 T-세포 기반 세포독성 검정에서 측정될 수 있으며, 여기서 치료 화합물이 Siglec 양성 림프구에 의한 시알산 리간드 양성 세포의 사멸을 자극하는 능력이 측정된다. 하나의 구현예에서, 항체 조제물은 Siglec-제한 림프구의 세포독성에서 적어도 10% 강화, 선택적으로 림프구 세포독성에서 적어도 40% 또는 50% 강화, 또는 선택적으로 NK 세포독성에서 적어도 70% 강화를 야기하며, 기재된 세포독성 검정을 참조한다. 하나의 구현예에서, 항체 조제물은 Siglec-제한 림프구에 의한 사이토카인 방출에서 적어도 10% 강화, 선택적으로 사이토카인 방출에서 적어도 40% 또는 50% 강화, 또는 선택적으로 사이토카인 방출에서 적어도 70% 강화를 야기하며, 기재된 세포독성 검정을 참조한다. 하나의 구현예에서, 항체 조제물은 Siglec-제한 림프구에 의한 세포독성 마커(예컨대, CD107 및/또는 CD137)의 세포 표면 발현에서 적어도 10% 강화, 선택적으로 적어도 40% 또는 50% 강화, 또는 선택적으로 세포독성 마커(예컨대, CD107 및/또는 CD137)의 세포 표면 발현에서 적어도 70% 강화를 야기한다.In the context of the present invention, "neutralizes Siglec-mediated inhibition of NK cell cytotoxicity", ""neutralizes Siglec-mediated inhibition of T cell cytotoxicity" or "neutralizes the inhibitory activity of Siglec" means Siglec ( For example, Siglec-7, Siglec-9) represent processes in which their ability to negatively affect intracellular processes is inhibited, resulting in lymphocyte responses such as cytokine release and cytotoxic responses. This can be measured, for example, in a standard NK-cell or T-cell based cytotoxicity assay, wherein the ability of a therapeutic compound to stimulate the killing of sialic acid ligand positive cells by Siglec positive lymphocytes is measured. In one embodiment, the antibody preparation results in at least a 10% potentiation in the cytotoxicity of Siglec-restricted lymphocytes, optionally at least a 40% or 50% potentiation in lymphocyte cytotoxicity, or optionally at least a 70% potentiation in NK cytotoxicity. and see the described cytotoxicity assay. In one embodiment, the antibody preparation is at least 10% potentiating in cytokine release by Siglec-restricted lymphocytes, optionally at least 40% or 50% potentiating in cytokine release, or optionally at least 70% potentiating in cytokine release. , see the described cytotoxicity assay. In one embodiment, the antibody preparation is at least 10% potentiated, optionally at least 40% or 50% potentiated, or selective in cell surface expression of a cytotoxic marker (eg, CD107 and/or CD137) by Siglec-restricted lymphocytes. resulting in at least 70% enhancement in cell surface expression of cytotoxic markers (eg, CD107 and/or CD137).

항-Siglec 항체가 Siglec 분자의 시알산 리간드로의 결합을 "차단"하는 능력은 항체가 가용성 또는 세포-표면 연관된 Siglec 및 시알산 분자를 이용하는 검정에서 Siglec 분자의 시알산 분자로의 결합을 용량-의존적 방식으로 검출 가능하게 감소시킬 수 있음을 의미하며, 여기서 Siglec 분자는 항체의 부재 하에 시알산 분자에 검출 가능하게 결합한다.The ability of an anti-Siglec antibody to "block" the binding of a Siglec molecule to a sialic acid ligand is determined by the ability of the antibody to dose- detectably reduced in a dependent manner, wherein the Siglec molecule detectably binds to the sialic acid molecule in the absence of the antibody.

본 전체 명세서 내에서 "암의 치료" 등이 항-Siglec 결합 제제(예로 항체)에 대해 언급되는 경우, 이는 본 출원이 출원되는 국가에서의 특허 허여에 허용 가능한 요지 대상에 따라, (a) 암의 치료 방법으로서, 암의 치료를 허용하는 용량(치료 유효량)으로, 바람직하게는 본원에 명시된 용량(양)으로, 이러한 치료를 필요로 하는 개체, 포유류, 특히 인간에게 항-Siglec 결합 제제(바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한 담체 물질 중)를(적어도 1회 치료를 위해) 투여하는 단계를 포함하는, 방법; (b) 암의 치료를 위한 항-Siglec 결합 제제의 용도 또는 상기 치료에서(특히 인간에서)의 이용을 위한 항-Siglec 결합 제제; (c) 암의 치료를 위한 약학 조제물의 제조를 위한 항-Siglec 결합 제제의 용도, 항-Siglec 결합 제제를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 암의 치료를 위한 약학 조제물의 제조를 위한 항-Siglec 결합 제제의 이용 방법, 또는 암의 치료에 적절한 항-Siglec 결합 제제의 유효 용량을 포함하는 약학 조제물; 또는 (d) a), b) 및 c)의 임의의 조합을 의미한다.Where "treatment of cancer" or the like is referred to in reference to an anti-Siglec binding agent (eg an antibody) throughout this specification, it is subject to subject matter permissible for granting a patent in the country in which this application is filed: (a) cancer As a method of treatment, an anti-Siglec binding agent (preferably an anti-Siglec binding agent (preferably a human) in need of such treatment at a dose (therapeutically effective amount) acceptable for the treatment of cancer, preferably at a dose (amount) specified herein. preferably in a pharmaceutically acceptable carrier material (for at least one treatment); (b) use of an anti-Siglec binding agent for the treatment of cancer or an anti-Siglec binding agent for use in said treatment (especially in humans); (c) use of an anti-Siglec binding agent for the manufacture of a pharmaceutical formulation for the treatment of cancer, the preparation of a pharmaceutical formulation for the treatment of cancer comprising admixing the anti-Siglec binding agent with a pharmaceutically acceptable carrier a method of using an anti-Siglec binding agent for, or a pharmaceutical formulation comprising an effective dose of an anti-Siglec binding agent suitable for the treatment of cancer; or (d) any combination of a), b) and c).

본원에서 이용되는 용어 "항원 결합 도메인"은 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 3차원 구조를 포함하는 도메인을 나타낸다. 따라서, 하나의 구현예에서, 상기 도메인은 항체 사슬의 고가변 영역, 선택적으로 VH 및/또는 VL 도메인, 선택적으로 적어도 VH 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 결합 도메인은 항체 사슬의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 결합 도메인은 비-면역글로불린 스캐폴드로부터의 폴리펩타이드 도메인을 포함할 수 있다.As used herein, the term “antigen binding domain” refers to a domain comprising a three-dimensional structure capable of immunospecifically binding to an epitope. Thus, in one embodiment, said domain may comprise a hypervariable region of an antibody chain, optionally a VH and/or VL domain, optionally at least a VH domain. In another embodiment, the binding domain may comprise at least one complementarity determining region (CDR) of an antibody chain. In another embodiment, the binding domain may comprise a polypeptide domain from a non-immunoglobulin scaffold.

본원에서 상호 교환적으로 이용되는 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"에는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일쇄가 포함된다. 전형적인 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개 도메인 CH1, CH2, 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다. 예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드쇄로 이루어지며, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단은 일차적으로 항원 인식에 관여하는 약 100개 내지 110개 이상 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 이들 경쇄 및 중쇄를 각각 나타낸다. 상이한 면역글로불린 클래스에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 "알파", "델타", "엡실론", "감마" 및 "뮤"로 명명된다. 이들 중 몇몇은 서브클래스 또는 이소형, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등으로 추가 구분된다. 상이한 면역글로불린 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 배치는 잘 알려져 있다. IgG는 이들이 생리적 상황에서 가장 일반적인 항체이므로, 그리고 이들이 실험실 환경에서 가장 쉽게 제조되므로, 본원에서 채용되는 예시적인 항체 클래스이다. 선택적으로 항체는 모노클로날 항체이다. 항체의 구체예에는 인간화, 키메라, 인간, 또는 달리-인간-적합 항체가 있다. "항체"에는 또한 본원에 기재되는 임의의 항체의 임의의 단편 또는 유도체가 포함된다.The terms “antibody” or “immunoglobulin,” as used interchangeably herein, include whole antibodies and any antigen-binding fragments or single chains thereof. A typical antibody comprises at least two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds. Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (V H ) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region consists of three domains CH1, CH2, and CH3. Each light chain consists of a light chain variable region (V L ) and a light chain constant region. The light chain constant region consists of one domain, CL. Exemplary immunoglobulin (antibody) structural units include tetramers. Each tetramer consists of two identical pairs of polypeptide chains, each pair having one "light" (about 25 kDa) and one "heavy" chain (about 50-70 kDa). The N-terminus of each chain defines a variable region of about 100 to 110 or more amino acids that is primarily involved in antigen recognition. The terms variable light chain (V L ) and variable heavy chain (V H ) refer to these light and heavy chains, respectively. The heavy chain constant domains corresponding to the different immunoglobulin classes are named "alpha", "delta", "epsilon", "gamma" and "mu", respectively. Some of these are further divided into subclasses or isotypes, such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, and the like. The subunit structures and three-dimensional configurations of different immunoglobulin classes are well known. IgG is an exemplary antibody class employed herein as they are the most common antibodies in a physiological context, and because they are most readily prepared in a laboratory setting. Optionally, the antibody is a monoclonal antibody. Embodiments of the antibody are humanized, chimeric, human, or otherwise-human-compatible antibodies. "Antibody" also includes any fragment or derivative of any antibody described herein.

"교차 반응성" 항-Siglec 항체는 특이성 및/또는 친화도를 가지고 하나를 초과하는 Siglec 분자에 결합하는 항체이다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 Siglec-7 및 Siglec-9와 교차 반응성일 수 있다.A “cross-reactive” anti-Siglec antibody is an antibody that binds to more than one Siglec molecule with specificity and/or affinity. For example, the monoclonal antibody may be cross-reactive with Siglec-7 and Siglec-9.

용어 "~에 특이적으로 결합한다"란 항체가 단백질의 재조합 형태, 여부에서의 에피토프, 또는 단리된 표적 세포의 표면 상에 존재하는 원상태 단백질을 이용하여 평가되는 바와 같이, 경쟁적 결합 검정에서 결합 파트너, 예로 Siglec-7, Siglec-9에 바람직하게 결합할 수 있음을 의미한다. 특이적 결합을 결정하기 위한 경쟁적 결합 검정 및 다른 방법은 아래에 추가 기재되며 당분야에 널리 공지되어 있다.The term "specifically binds to" refers to a binding partner in a competitive binding assay, as assessed using a recombinant form of the protein, an epitope on whether or not, or a native protein present on the surface of an isolated target cell. , for example, means that it can preferably bind to Siglec-7 or Siglec-9. Competitive binding assays and other methods for determining specific binding are further described below and are well known in the art.

항체가 특정한 모노클로날 항체"와 경쟁한다"고 언급되는 경우, 이는 항체가 재조합 Siglec 분자 또는 표면 발현 Siglec 분자를 이용하는 결합 검정에서 모노클로날 항체와 경쟁함을 의미한다. 예를 들어, 평가 항체가 결합 검정에서 Siglec 폴리펩타이드 또는 Siglec-발현 세포에 대한 참조 항체의 결합을 감소시키는 경우, 항체는 참조 항체와 각각 "경쟁한다"고 언급된다.When it is stated that an antibody “competes” with a particular monoclonal antibody, it is meant that the antibody competes with the monoclonal antibody in a binding assay using either a recombinant Siglec molecule or a surface-expressed Siglec molecule. For example, an antibody is said to "compete" with the reference antibody, respectively, if the evaluation antibody reduces binding of the reference antibody to a Siglec polypeptide or Siglec-expressing cell in a binding assay.

본원에서 이용되는 용어 "친화도"란, 에피토프에 대한 항체의 결합 강도를 의미한다. 항체의 친화도는 [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag]로 정의되는 해리 상수 Kd에 의해 주어지며, 여기서 [Ab-Ag]는 항체-항원 복합체의 몰 농도이고, [Ab]는 미결합 항체의 몰 농도이고, [Ag]는 미결합 항원의 몰 농도이다. 친화도 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. mAb의 친화도 결정 방법은 문헌[Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993) 및 Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601(1983)]에서 확인될 수 있고, 상기 참고문헌은 전체가 본원에 참조로 포함된다. mAb의 친화도를 결정하기 위해 당분야에 널리 공지된 하나의 표준 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 스크리닝의 이용이다(예컨대 BIAcore™ SPR 분석 장치를 이용하는 분석에 의해).As used herein, the term “affinity” refers to the binding strength of an antibody to an epitope. The affinity of an antibody is given by the dissociation constant Kd, defined as [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag], where [Ab-Ag] is the molar concentration of the antibody-antigen complex, and [Ab] is the is the molar concentration of bound antibody, and [Ag] is the molar concentration of unbound antigen. The affinity constant K a is defined as 1/Kd. Methods for determining the affinity of mAbs are described in Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene. Publishing Assoc. and Wiley Interscience, NY, (1992, 1993) and Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), which reference is incorporated herein by reference in its entirety. One standard method well known in the art for determining the affinity of a mAb is the use of surface plasmon resonance (SPR) screening (eg, by assay using a BIAcore™ SPR assay device).

본원의 맥락 내에서, "결정기"는 폴리펩타이드 상의 상호작용 또는 결합 부위를 지칭한다.Within the context of this application, "determinant" refers to an interaction or binding site on a polypeptide.

용어 "에피토프"란 항원성 결정기를 나타내며, 항체가 결합하는 항원 상 지역 또는 영역이다. 단백질 에피토프는 결합에 직접 관여되는 아미노산 잔기뿐만 아니라 특정한 항원 결합 항체 또는 펩타이드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기, 즉 항체의 "풋프린트(footprint)" 내의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이는, 예로 항체 또는 수용체와 조합될 수 있는 복잡한 항원 분자 상의 가장 간단한 형태 또는 가장 작은 구조 영역이다. 에피토프는 선형 또는 입체형태/구조적일 수 있다. 용어 "선형 에피토프"는 아미노산의 선형 서열(일차 서열) 상에서 인접하는 아미노산 잔기로 이루어진 에피토프로서 정의된다. 용어 "입체형태 또는 구조적 에피토프"는 전혀 인접하지 않고 아미노산 잔기로 이루어진 에피토프로서 정의되며, 이에 따라 분자의 폴딩에 의해 서로 인접하게 되는 아미노산의 선형 서열의 분리된 부분(이차, 삼차 및/또는 사차 구조)을 나타낸다. 입체형태 에피토프는 3-차원 구조에 의존한다. 따라서 용어 '입체형태'란 종종 '구조적'과 상호교환적으로 이용된다.The term “epitope” refers to an antigenic determinant and is a region or region on an antigen to which an antibody binds. A protein epitope may include amino acid residues directly involved in binding as well as amino acid residues that are effectively blocked by a particular antigen-binding antibody or peptide, ie, amino acid residues within the “footprint” of the antibody. It is, for example, the simplest form or smallest structural region on a complex antigenic molecule that can be combined with an antibody or receptor. Epitopes may be linear or conformational/structural. The term “linear epitope” is defined as an epitope consisting of contiguous amino acid residues on a linear sequence of amino acids (the primary sequence). The term "conformational or conformational epitope" is defined as an epitope consisting of amino acid residues that are not contiguous at all, and thus separate portions of a linear sequence of amino acids (secondary, tertiary and/or quaternary structure) that are made contiguous to one another by the folding of the molecule. ) is indicated. Conformational epitopes depend on a three-dimensional structure. Thus, the term 'conformity' is often used interchangeably with 'structural'.

Siglec-발현 세포(예컨대, Siglec-7 또는 Siglec-9 발현 림프구)에 대한 용어 "고갈시키다" 또는 "고갈시키는"은 샘플 또는 대상체에 존재하는 이러한 Siglec-발현 세포의 수에 부정적으로 영향을 미치기 위한, 사멸, 제거, 용해 또는 이러한 사멸, 제거 또는 용해의 유도를 일으키는 공정, 방법, 또는 화합물을 의미한다. 공정, 방법, 또는 화합물에 대한 "비-고갈"은 공정, 방법, 또는 화합물이 고갈시키지 않음을 의미한다.The term "deplete" or "depleting" with respect to Siglec-expressing cells (eg, Siglec-7 or Siglec-9 expressing lymphocytes) is intended to negatively affect the number of such Siglec-expressing cells present in a sample or subject. , means a process, method, or compound that causes death, elimination, dissolution or induction of such death, removal or dissolution. “Non-depleting” for a process, method, or compound means that the process, method, or compound is not depleted.

용어 "제제"란 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 표시하기 위해 본원에서 이용된다. 용어 "치료제"는 생물학적 활성을 갖는 제제를 나타낸다. The term “agent” is used herein to denote a chemical compound, mixture of chemical compounds, biological macromolecule, or extract prepared from a biological material. The term “therapeutic agent” refers to an agent having biological activity.

본원에서의 목적을 위해, "인간화" 또는 "인간" 항체는 하나 이상의 인간 면역글로불린의 불변 및 가변 프레임워크 영역이 동물 면역글로불린의 결합 영역, 예컨대, CDR과 융합되는 항체를 나타낸다. 이러한 항체는 결합 영역이 유래되는 비-인간 항체의 결합 특이성을 유지하지만, 비-인간 항체에 대한 면역 반응을 회피하도록 설계된다. 이러한 항체는 항원성 유발접종에 반응하여 특이적 인간 항체를 생산하도록 "조작된" 트랜스제닉 마우스 또는 다른 동물로부터 수득될 수 있다(예로, 그 전체 교시가 본원에 참조로 포함되는, 문헌[Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579] 참고). 완전 인간 항체는 모두 당분야에 널리 공지되어 있는, 유전적 또는 염색체 전달감염 방법뿐만 아니라 파지 디스플레이 기술에 의해서도 구축될 수 있다(예로, 문헌[McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553] 참고). 인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다(예로, 이들의 전문이 참조로 포함되는, 미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참고).For the purposes herein, a “humanized” or “human” antibody refers to an antibody in which the constant and variable framework regions of one or more human immunoglobulins are fused to the binding regions, such as CDRs, of an animal immunoglobulin. Such antibodies retain the binding specificity of the non-human antibody from which the binding region is derived, but are designed to evade an immune response to the non-human antibody. Such antibodies can be obtained from transgenic mice or other animals that have been "engineered" to produce specific human antibodies in response to antigenic challenge (eg, Green et al., the entire teachings of which are incorporated herein by reference). (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579). Fully human antibodies can be constructed by phage display techniques as well as genetic or chromosomal transfection methods, all well known in the art (see, e.g., McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Reference). Human antibodies can also be produced by in vitro activated B cells (see, eg, US Pat. Nos. 5,567,610 and 5,229,275, incorporated by reference in their entirety).

"키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이하거나 변형된 클래스, 효과기 기능 및/또는 종의 불변 영역 또는 키메라 항체에 대해 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예로 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역, 또는 이들의 일부가 변형되거나, 대체되거나, 교환된; 또는 (b) 가변 영역 또는 이들의 일부가 상이하거나 변형된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변형되거나, 대체되거나, 교환된 항체 분자이다.A “chimeric antibody” refers to (a) a constant region of a different or modified class, effector function and/or species of antigen binding site (variable region) or an entirely different molecule, e.g., an enzyme, a toxin, which confer new properties on the chimeric antibody; the constant region, or a portion thereof, has been modified, replaced, or exchanged to be linked to a hormone, growth factor, drug, etc.; or (b) an antibody molecule in which the variable region or a portion thereof has been modified, replaced, or exchanged with a variable region having different or altered antigenic specificity.

본원에서 이용되는 경우, 용어 "고가변 영역"은 항원 결합에 관여되는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 고가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예컨대, 경쇄 가변 도메인에서의 잔기 24~34(L1), 50~56(L2) 및 89~97(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서의 31~35(H1), 50~65(H2) 및 95~102(H3); Kabat et al. 1991) 및/또는 "고가변 루프"로부터의 아미노산 잔기(예컨대, 경쇄 가변 도메인에서의 잔기 26~32(L1), 50~52(L2) 및 91~96(L3) 및 중쇄 가변 도메인에서의 26~32(H1), 53~55(H2) 및 96~101(H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917), 또는 항원 결합에 관여되는 필수 아미노산을 결정하기 위한 유사 시스템으로부터의 잔기를 포함한다. 전형적으로, 상기 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., 상기 문헌]에 기재된 방법에 의해 수행된다. 본원에서 "Kabat 위치", "Kabat에서의 가변 도메인 잔기 넘버링" 및 "Kabat에 따른"과 같은 어구는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 상기 넘버링 시스템을 나타낸다. Kabat 넘버링 시스템을 이용하여, 펩타이드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 그 안으로의 삽입에 대응하는 더 적거나 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인에는 CDR H2의 잔기 52 뒤의 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤의 삽입된 잔기(예컨대, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)가 포함될 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" Kabat 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.As used herein, the term “hypervariable region” refers to the amino acid residues of an antibody that are involved in antigen binding. The hypervariable region generally comprises amino acid residues from a “complementarity determining region” or “CDR” (eg, residues 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89-97 (L3) in the light chain variable domain and heavy chain 31-35 (H1), 50-65 (H2) and 95-102 (H3) in the variable domains; Kabat et al. 1991) and/or amino acid residues from "hypervariable loops" (eg, in the light chain variable domain). residues 26-32 (L1), 50-52 (L2) and 91-96 (L3) of and 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) in the heavy chain variable domain of Chothia; and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917), or similar systems for determining essential amino acids involved in antigen binding. Typically, the numbering of amino acid residues in these regions is performed by the method described in Kabat et al., supra. Phrases such as "Kabat position", "variable domain residue numbering in Kabat" and "according to Kabat" herein refer to the above numbering system for either a heavy chain variable domain or a light chain variable domain. Using the Kabat numbering system, the actual linear amino acid sequence of a peptide may contain fewer or additional amino acids corresponding to shortenings or insertions into the FRs or CDRs of the variable domains. For example, a heavy chain variable domain has a single amino acid insertion after residue 52 of CDR H2 (residue 52a according to Kabat) and an inserted residue after heavy chain FR residue 82 (eg residues 82a, 82b, and 82c according to Kabat, etc.) may be included. The Kabat numbering of residues can be determined for a given antibody by alignment with a "standard" Kabat numbered sequence in the region of homology of the antibody sequence.

본원에서 이용되는 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기란 CDR로 정의되는 영역을 배제하는 항체 가변 도메인의 영역을 의미한다. 각각의 항체 가변 도메인 프레임워크는 CDR에 의해 구분되는 인접 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 추가 세분될 수 있다.As used herein, “framework” or “FR” residues refer to regions of an antibody variable domain that exclude regions defined as CDRs. Each antibody variable domain framework can be further subdivided into contiguous regions (FR1, FR2, FR3 and FR4) separated by CDRs.

용어 "Fc 도메인", "Fc 부분" 및 "Fc 영역"은 항체 중쇄의 C-말단 단편, 예로 인간 γ(감마) 중쇄의 아미노산(aa) 약 230 내지 aa 약 450 또는 다른 유형의 항체 중쇄(예로, 인간 항체에 있어서 α, δ, ε 및 μ), 또는 이들의 천연 발생 동종이형에서의 그 대응부 서열을 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 면역글로불린에 대해 일반적으로 허용되는 Kabat 아미노산 넘버링이 본 개시를 통해 이용된다(문헌[Kabat et al.(1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD] 참고).The terms "Fc domain", "Fc portion" and "Fc region" refer to a C-terminal fragment of an antibody heavy chain, e.g., amino acids (aa) from about 230 to aa about 450 of a human γ (gamma) heavy chain or other types of antibody heavy chains (e.g., , α, δ, ε and μ) for human antibodies, or their corresponding sequences in their naturally occurring allotypes. Unless otherwise specified, the generally accepted Kabat amino acid numbering for immunoglobulins is used throughout this disclosure (Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service). , National Institute of Health, Bethesda, MD]).

용어 "단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 순수한"은 그 원상태 상태에서 확인되는 바와 같이 이들에 보통 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 나타낸다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기법, 예컨대 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 결정된다. 조제물에 존재하는 주요 종인 단백질은 실질적으로 정제된다.The terms “isolated,” “purified,” or “biologically pure,” denote a material that is substantially or essentially free of components ordinarily attendant thereto as identified in its native state. Purity and homogeneity are typically determined using analytical chemistry techniques such as polyacrylamide gel electrophoresis or high performance liquid chromatography. The main species present in the preparation, the protein, is substantially purified.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 본원에서 상호 교환적으로 이용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 천연 발생 아미노산의 인공적 화학 모사체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.The terms “polypeptide,” “peptide,” and “protein” are used interchangeably herein to refer to a polymer of amino acid residues. The term applies to naturally occurring amino acid polymers and non-naturally occurring amino acid polymers, as well as amino acid polymers in which one or more amino acid residues are artificial chemical mimetics of the corresponding naturally occurring amino acid.

용어 "재조합"은, 예로 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대해 이용되는 경우, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 원상태 핵산 또는 단백질의 변형에 의해 개질되었음을, 또는 세포가 이렇게 개질된 세포로부터 유래됨을 시사한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 원상태(비재조합) 형태 내에서 확인되지 않는 유전자를 발현하거나 다르게 비정상적으로 발현되거나 하향 발현되거나 전혀 발현되지 않는 원상태 유전자를 발현한다.The term "recombinant", eg, when used in reference to a cell, or a nucleic acid, protein, or vector, has been modified by the introduction of a heterologous nucleic acid or protein or modification of the native nucleic acid or protein, or cell is derived from these modified cells. Thus, for example, a recombinant cell expresses a gene that is not identified within the native (non-recombinant) form of the cell or expresses a native gene that is otherwise aberrantly expressed, down-expressed, or not expressed at all.

본원에서의 맥락 내에서, 폴리펩타이드 또는 에피토프에 "결합하는" 항체라는 용어는 상기 결정기에 특이성 및/또는 친화도를 가지고 결합하는 항체를 지칭한다.Within the context of the present application, the term antibody "binding" to a polypeptide or epitope refers to an antibody that binds with specificity and/or affinity to said determinant.

용어 "동일성" 또는 "동일한"은 2개 이상의 폴리펩타이드의 서열 간 관계에서 이용되는 경우, 2개 이상의 아미노산 잔기 스트링 간 매치 수에 의해 결정되는, 폴리펩타이드 간 서열 관련성 정도를 나타낸다. "동일성"은 특정한 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 해결되는 갭 정렬(존재하는 경우)을 갖는 더 작은 2개 이상의 서열 간 동일한 매치 백분율을 측정한다. 관련 폴리펩타이드의 동일성은 공지된 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 이러한 방법에는, 비제한적으로 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)]에 기재된 것들이 포함된다.The term "identity" or "identical", when used in the relationship between the sequences of two or more polypeptides, refers to the degree of sequence relatedness between polypeptides as determined by the number of matches between strings of two or more amino acid residues. "Identity" measures the percentage of identical matches between two or more sequences that have a gap alignment (if any) resolved by a particular mathematical model or computer program (ie, an "algorithm"). The identity of related polypeptides can be easily calculated by known methods. Such methods include, but are not limited to, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devreux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

동일성 결정 방법은 평가되는 서열 간에 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성 결정 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 설명된다. 두 서열 간 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법에는 GAP을 포함하는 GCG 프로그램 패키지(Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387(1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410(1990))가 포함된다. BLASTX 프로그램은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 및 다른 출처(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 상기 문헌)에서 공개적으로 이용 가능하다. 널리 공지된 Smith Waterman 알고리즘도 동일성을 결정하기 위해 이용될 수 있다.Methods for determining identity are designed to provide the greatest match between the sequences being evaluated. A method for determining identity is described in a publicly available computer program. Computer program methods for determining the identity between two sequences include the GCG program package including GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis. ), BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). The BLASTX program is publicly available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). The well-known Smith Waterman algorithm can also be used to determine identity.

항체의 생산production of antibodies

질병(예컨대 암, 감염성 질병)의 치료를 위해 유용한 항-Siglec 제제는 인간 Siglec-9 단백질의 세포외 부분에 결합하며(그리고 선택적으로 추가 Siglec-12 결합을 포함하거나 포함하지 않고, 인간 Siglec-7 단백질에 추가 결합하며) Siglec 양성 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 인간 Siglec의 억제 활성을 감소시킨다. 하나의 구현예에서 제제는 시알산 분자가 호중구, 수지상 세포, 대식구, M2 대식구, NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포에서 Siglec에 의한 억제성 신호전달을 야기하는 능력을 억제한다.Anti-Siglec agents useful for the treatment of diseases (eg, cancer, infectious diseases) bind to the extracellular portion of the human Siglec-9 protein (and optionally with or without additional Siglec-12 binding, and include human Siglec-7 It further binds to protein) and reduces the inhibitory activity of human Siglec expressed on the surface of Siglec-positive immune cells. In one embodiment the agent inhibits the ability of the sialic acid molecule to cause inhibitory signaling by Siglec in neutrophils, dendritic cells, macrophages, M2 macrophages, NK cells and/or CD8+ T cells.

하나의 구현예에서, 본원에 기재되는 항-Siglec 제제는 Siglec의 리간드를 보유하는 표적 세포(예컨대 암 세포)에 대한 인간에서의 또는 인간 공여체로부터의 NK 세포 및/또는 호중구의 세포독성을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. NK 세포 및 호중구는 미생물 및 암 세포를 인식하고 직접 사멸시키는 특화된 과립구이다. 종양 세포의 표면에서 발현하는 시알산은 종양 세포에 대한 NK 세포의 세포독성을 감소시키는 것으로 나타난다. 항체는 NK 세포 세포독성을 증강시키기 위해, 예를 들어 세포독성 수준을 그 표면에서 특정 Siglec을 발현하지 않는 NK 세포 또는 호중구에서 실질적으로 관찰되는 수준까지 복원하기 위해 이용될 수 있다.In one embodiment, an anti-Siglec agent described herein increases the cytotoxicity of NK cells and/or neutrophils in a human or from a human donor to target cells (eg, cancer cells) bearing a ligand of Siglec. can be used for NK cells and neutrophils are specialized granulocytes that recognize and directly kill microorganisms and cancer cells. Sialic acid expressed on the surface of tumor cells has been shown to reduce the cytotoxicity of NK cells to tumor cells. Antibodies can be used to enhance NK cell cytotoxicity, eg, to restore the level of cytotoxicity to a level substantially observed in NK cells or neutrophils that do not express a particular Siglec on their surface.

시알산은 또한 수지상 세포 상에서 고발현되며, TLR 자극에 대한 반응성을 포함하여, 몇몇 DC 기능을 조정하는 것으로 기재되었다. 시알산 합성의 차단은 TLR 자극에 대한 moDC의 활성화 역치 및 몇몇 미생물 TLR 리간드에 대한 Siglec-E 고갈 증강된 수지상 세포 반응을 저하시킨다. Siglec-9는 마우스에서 Siglec-E의 가장 가까운 인간 오르소로그 구성원이며, 항-Siglec-9 항체의 차단은 수지상 세포 활성화를 증강시키고 DC-T 상호작용을 조정할 수 있다. 시알산으로의 항원 변형은 항원-특이적 조절 T(Treg) 세포의 생성을 조절하고 수지상 세포를 통한 효과기 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 형성을 방지한다. 수지상 세포의 식균능도 a2,6-시알산 결핍에 의해 개선될 수 있다.Sialic acid is also highly expressed on dendritic cells and has been described to modulate several DC functions, including responsiveness to TLR stimulation. Blockade of sialic acid synthesis lowers the activation threshold of moDCs to TLR stimulation and Siglec-E depletion enhanced dendritic cell responses to several microbial TLR ligands. Siglec-9 is the closest human ortholog member of Siglec-E in mice, and blockade of anti-Siglec-9 antibodies can enhance dendritic cell activation and modulate DC-T interactions. Antigen modification with sialic acid regulates the generation of antigen-specific regulatory T (Treg) cells and prevents the formation of effector CD4+ and CD8+ T cells via dendritic cells. The phagocytosis of dendritic cells can also be improved by a2,6-sialic acid deficiency.

Siglec-7 및 Siglec-9는 둘 다 유형 M1 및 M2 대식구에서 발현되며, Siglec-9의 녹다운은 다양한 표면 발현 마커(예컨대 CCR7 및 CD200R)를 조정하는 것으로 기재되어, Siglec-9에 의한 대식구 기능의 조정을 제시한다. 실제로, 다양한 Siglec-9 돌연변이체(ITIM 도메인에서의 돌연변이)가 대식구 세포주에서 전달감염되었으며 Siglec-9가 항-염증성 사이토카인 IL-10의 생산을 증강시킴을 실증하였다. Siglec-9와 가용성 리간드의 결합은 또한 체크포인트 리간드 PD-L1의 증가된 발현을 가지며, 대식구가 종양-연관 대식구-유사 표현형을 나타내도록 유도할 수 있다.Siglec-7 and Siglec-9 are both expressed on type M1 and M2 macrophages, and knockdown of Siglec-9 has been described to modulate various surface expression markers (such as CCR7 and CD200R), thus reducing the level of macrophage function by Siglec-9. suggest an adjustment. Indeed, various Siglec-9 mutants (mutations in the ITIM domain) have been transfected in macrophage cell lines and demonstrated that Siglec-9 enhances the production of the anti-inflammatory cytokine IL-10. Binding of Siglec-9 to a soluble ligand also has increased expression of the checkpoint ligand PD-L1 and can induce macrophages to exhibit a tumor-associated macrophage-like phenotype.

하나의 구현예에서 제제는 시알산 분자와 Siglec으로의 결합에서 경쟁한다, 즉, 제제는 Siglec 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 차단한다.In one embodiment the agent competes for binding of the sialic acid molecule to Siglec, ie, the agent blocks the interaction between Siglec and its sialic acid ligand.

본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 전장 항체, 항체 단편, 및 합성 또는 반-합성 항체-유래 분자로부터 선택되는 항체이다.In one embodiment of the invention, the agent is an antibody selected from full-length antibodies, antibody fragments, and synthetic or semi-synthetic antibody-derived molecules.

본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 완전 인간 항체, 인간화 항체, 및 키메라 항체로부터 선택되는 항체이다.In one embodiment of the invention, the agent is an antibody selected from fully human antibodies, humanized antibodies, and chimeric antibodies.

본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM 항체로부터 선택되는 항체의 단편이다.In one embodiment of the invention, the agent is a fragment of an antibody selected from IgA, IgD, IgG, IgE and IgM antibodies.

본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되는 불변 도메인을 포함하는 항체의 단편이다.In one embodiment of the invention, the agent is a fragment of an antibody comprising constant domains selected from IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.

본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 중쇄 Ig(라마 또는 낙타 Ig), VHH 단편, 단일 도메인 FV, 및 단일쇄 항체 단편으로부터 선택되는 항체 단편이다.In one embodiment of the present invention, the agent comprises a Fab fragment, Fab' fragment, Fab'-SH fragment, F(ab)2 fragment, F(ab')2 fragment, Fv fragment, heavy chain Ig (llama or camel Ig), an antibody fragment selected from a V HH fragment, a single domain FV, and a single chain antibody fragment.

본 발명의 하나의 양태에서, 제제는 scFV, dsFV, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 카파 바디, IgNAR; 및 다중특이적 항체로부터 선택되는 합성 또는 반합성 항체-유래 분자이다.In one embodiment of the present invention, the agent comprises scFV, dsFV, minibody, diabody, triabody, kappa body, IgNAR; and a synthetic or semi-synthetic antibody-derived molecule selected from a multispecific antibody.

따라서 본 발명은 Siglec에 결합하는 항체 및 항원 결합 도메인(및 이를 포함하는 폴리펩타이드)에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 추가 인간 Siglec, 예컨대, Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및/또는 Siglec-12에 비해 적어도 100-배 더 낮은 결합 친화도(예컨대, KD)로 Siglec-7 및/또는 Siglec-9에 결합한다. 하나의 양태에서, 항체 또는 항원 결합 도메인은 Siglec-7이 아닌 Siglec-9에 결합한다; 하나의 구현예에서, 항체는 인간 Siglec-7 폴리펩타이드에 비해 적어도 100-배 더 낮은 결합 친화도(예컨대, KD)로 인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합한다. 또 다른 양태에서, 항체는 서로 1-log 초과가 상이하지 않은 결합 친화도(예컨대, KD)로 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 인간 Siglec-7 폴리펩타이드에 모두 결합하며, 여기서 상기 Siglec-7 및 Siglec-9에 대한 결합 친화도는 추가 인간 Siglec, 예컨대, Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및/또는 Siglec-12에 비해 적어도 100-배 더 낮다. 친화도는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명에 의해, 재조합 Siglec 폴리펩타이드로의 결합에 대해 결정될 수 있다.Accordingly, the present invention relates to antibodies and antigen binding domains (and polypeptides comprising the same) that bind to Siglec. In one embodiment, the antibody or antigen binding domain is at least 100 compared to an additional human Siglec, such as Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 and/or Siglec-12. Binds to Siglec-7 and/or Siglec-9 with -fold lower binding affinity (eg KD). In one embodiment, the antibody or antigen binding domain binds Siglec-9 but not Siglec-7; In one embodiment, the antibody binds to a human Siglec-9 polypeptide with at least a 100-fold lower binding affinity (eg, KD) compared to a human Siglec-7 polypeptide. In another embodiment, the antibody binds to both a human Siglec-9 polypeptide and a human Siglec-7 polypeptide with a binding affinity (eg, KD) that does not differ by more than 1-log from each other, wherein the Siglec-7 and Siglec Binding affinity for -9 is at least 100-fold greater than that of an additional human Siglec, such as Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 and/or Siglec-12. low. Affinity can be determined for binding to a recombinant Siglec polypeptide, for example, by surface plasmon resonance.

본 발명의 하나의 양태에서, 항체는 정제되거나 적어도 부분적으로 정제된 형태이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항체는 본질적으로 단리된 형태이다.In one embodiment of the invention, the antibody is in purified or at least partially purified form. In one embodiment of the invention, the antibody is in essentially isolated form.

항체는 당분야에 공지된 다양한 기법에 의해 생산될 수 있다. 전형적으로, 이들은 Siglec 폴리펩타이드, 바람직하게는 인간 Siglec 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 이용한 비-인간 동물, 바람직하게는 마우스의 면역화에 의해 생산된다. Siglec 폴리펩타이드는 인간 Siglec-9 및/또는 Siglec-7 폴리펩타이드의 전장 서열, 또는 이의 단편 또는 유도체, 전형적으로 면역원성 단편, 즉, Siglec 폴리펩타이드를 발현하는 세포 표면 상에 노출된 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 포함할 수 있다. 이러한 단편은 전형적으로 성숙 폴리펩타이드 서열의 적어도 약 7개 연속 아미노산, 더욱 바람직하게는 이의 적어도 약 10개 연속 아미노산을 함유한다. 단편은 전형적으로 수용체의 세포외 도메인으로부터 본질적으로 유래된다. 하나의 구현예에서, 면역원은 지질막에, 전형적으로 세포 표면에서, 야생형 인간 Siglec 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역원은 온전한 세포, 특히 온전한 인간 세포, 선택적으로 처리되거나 용해된 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 재조합 Siglec 폴리펩타이드이다.Antibodies can be produced by a variety of techniques known in the art. Typically, they are produced by immunization of a non-human animal, preferably a mouse, with an immunogen comprising a Siglec polypeptide, preferably a human Siglec polypeptide. A Siglec polypeptide comprises the full-length sequence of a human Siglec-9 and/or Siglec-7 polypeptide, or a fragment or derivative thereof, typically an immunogenic fragment, i.e. an epitope exposed on the surface of a cell expressing the Siglec polypeptide. It may include a portion of a polypeptide. Such fragments typically contain at least about 7 contiguous amino acids of the mature polypeptide sequence, more preferably at least about 10 contiguous amino acids thereof. Fragments are typically derived essentially from the extracellular domain of the receptor. In one embodiment, the immunogen comprises a wild-type human Siglec polypeptide in a lipid membrane, typically at the cell surface. In certain embodiments, the immunogen comprises intact cells, particularly intact human cells, optionally treated or lysed cells. In another embodiment, the polypeptide is a recombinant Siglec polypeptide.

항원으로 비-인간 포유류를 면역화하는 단계는 마우스에서 항체의 생산을 자극하기 위해 당분야에 널리 공지된 임의의 방식으로 수행될 수 있다(예를 들어, 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되는 문헌[E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)] 참고). 면역원은 선택적으로 아주반트, 예컨대 완전 또는 불완전 프로인트 아주반트를 함유하며, 완충액 중에 현탁되거나 용해된다. 면역원의 양, 완충액 유형 및 아주반트의 양을 결정하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다. 이들 파라미터는 상이한 면역원에 있어서 상이할 수 있지만, 쉽게 규명된다.The step of immunizing a non-human mammal with an antigen can be performed in any manner well known in the art for stimulating the production of antibodies in mice (see, e.g., literature, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference). [E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)]). The immunogen optionally contains an adjuvant, such as complete or incomplete Freund's adjuvant, and is suspended or dissolved in a buffer. Methods for determining the amount of immunogen, type of buffer and amount of adjuvant are well known to those skilled in the art and are not limited in any way. These parameters may be different for different immunogens, but are easily characterized.

유사하게, 항체의 생산을 자극하기 충분한 면역화 위치 및 빈도도 당분야에 널리 공지되어 있다. 전형적인 면역화 프로토콜에서, 비-인간 동물은 1일차에 그리고 약 1주 후 다시 항원이 복강내 주사된다. 여기에 약 20일차에, 선택적으로 아주반트, 예컨대 불완전 프로인트 아주반트를 함유하는 항원의 리콜 주사가 뒤따른다. 리콜 주사는 정맥내 수행되며, 연속 며칠 동안 반복될 수 있다. 여기에 약 40일차에, 전형적으로 아주반트를 함유하지 않고, 정맥내 또는 복강내 부스터 주사가 뒤따른다. 상기 프로토콜은 약 40일 후 항원-특이적 항체-생산 B 세포의 생산을 일으킨다. 면역화에서 이용된 항원에 대한 항체를 발현하는 B 세포의 생산을 일으키는 한, 다른 프로토콜도 이용될 수 있다.Similarly, sites and frequencies of immunization sufficient to stimulate production of antibodies are well known in the art. In a typical immunization protocol, non-human animals are injected intraperitoneally with antigen again on day 1 and about 1 week later. This is followed by a recall injection of antigen, optionally containing an adjuvant, such as incomplete Freund's adjuvant, on about day 20. Recall injections are performed intravenously and may be repeated for several consecutive days. This is followed by an intravenous or intraperitoneal booster injection, typically without adjuvant, at about day 40. The protocol results in the production of antigen-specific antibody-producing B cells after about 40 days. Other protocols may be used as long as they result in the production of B cells expressing antibodies to the antigen used in the immunization.

대안적 구현예에서, 비-면역화된 비-인간 포유류로부터의 림프구가 단리되고, 시험관내 성장된 후 세포 배양에서 면역원에 노출된다. 이어서 림프구가 수확되고 후술되는 융합 단계가 수행된다.In an alternative embodiment, lymphocytes from a non-immunized non-human mammal are isolated, grown in vitro, and then exposed to the immunogen in cell culture. Lymphocytes are then harvested and a fusion step described below is performed.

모노클로날 항체에 있어서, 다음 단계는 항체-생산 하이브리도마를 형성하기 위한 면역화된 비-인간 포유류로부터의 비장세포의 단리 및 이들 비장세포와 불멸화된 세포의 후속 융합이다. 비-인간 포유류로부터 비장세포의 단리는 당분야에 널리 공지되어 있으며, 전형적으로 단일 세포 현탁액을 생산하기 위해 마취된 비-인간 포유류로부터의 비장 제거, 이의 소편으로의 절단 및 세포 여과장치의 나일론 메쉬를 통해 비장낭으로부터 적절한 완충액으로의 비장세포 압착이 관여된다. 세포는 세척되어, 원심분리되고, 임의의 적혈구를 용해시키는 완충액 중에 재현탁된다. 용액이 다시 원심분리되고 펠렛 내의 잔여 림프구가 신선 완충액 중 최종 재현탁된다.For monoclonal antibodies, the next step is to form antibody-producing hybridomas. Isolation of splenocytes from immunized non-human mammals and subsequent fusion of these splenocytes with immortalized cells. Isolation of splenocytes from non-human mammals is well known in the art and typically involves removal of a spleen from a non-human mammal anesthetized to produce a single cell suspension, cleavage thereof into pieces, and a nylon mesh of cell filters. Involves compression of splenocytes from the splenic sac into an appropriate buffer through the Cells are washed, centrifuged, and resuspended in a buffer that lyses any red blood cells. The solution is centrifuged again and the remaining lymphocytes in the pellet are finally resuspended in fresh buffer.

일단 단리되어 단일 세포 현탁액에 존재하는 경우, 림프구는 불멸 세포주에 융합될 수 있다. 이는 전형적으로 마우스 골수종 세포주이지만, 하이브리도마의 생성에 유용한 여러 다른 불멸 세포주가 당분야에 공지되어 있다. 뮤린 골수종 세포주에는 비제한적으로 Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego, U. S. A.)로부터 이용 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래되는 것들, American Type Culture Collection(Rockville, Maryland U. S. A.)으로부터 이용 가능한 X63 Ag8653 및 SP-2 세포가 포함된다. 융합은 폴리에틸렌 글리콜 등을 이용해서 실시된다. 이어서 생성 하이브리도마는 미융합, 모체 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 선택 배지에서 성장시킨다. 예를 들어, 모체 골수종 세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 부재하는 경우, 하이브리도마에 대한 배양 배지에는 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)이 포함될 것이며, 이 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.Once isolated and present in a single cell suspension, the lymphocytes can be fused to an immortal cell line. This is typically a mouse myeloma cell line, but several other immortal cell lines useful for the generation of hybridomas are known in the art. Murine myeloma cell lines include, but are not limited to, those derived from MOPC-21 and MPC-11 mouse tumors available from the Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, U.S.A.), and X63 Ag8653 available from the American Type Culture Collection (Rockville, Maryland U.S.A.). and SP-2 cells. The fusion is performed using polyethylene glycol or the like. The resulting hybridomas are then grown in a selective medium containing one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused, parental myeloma cells. For example, if the maternal myeloma cells lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT or HPRT), the culture medium for the hybridomas will include hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium). and this substance prevents the growth of HGPRT-deficient cells.

하이브리도마는 전형적으로 대식구의 영양세포층 상에서 성장시킨다. 대식구는 바람직하게는 비장세포를 단리하기 위해 이용되는 비-인간 포유류의 한배로부터 유래되며 전형적으로 하이브리도마의 플레이트-접종 수 일 전에 불완전 프로인트 아주반트 등으로 초회감작된다. 융합 방법은 문헌[Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]에 기재되어 있으며, 그 개시는 본원에 참조로 포함된다.Hybridomas are typically grown on feeder cell layers of macrophages. The macrophages are preferably derived from a litter of non-human mammals used to isolate splenocytes and are typically primed with incomplete Freund's adjuvant or the like several days prior to plate-inoculation of the hybridomas. Fusion methods are described in Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice," pp. 59-103 (Academic Press, 1986), the disclosure of which is incorporated herein by reference.

세포는 콜로니 형성 및 항체 생산을 위해 충분한 시간 동안 선택 배지에서 성장시킨다. 이는 보통 약 7일 내지 약 14일이다.Cells are grown in selective medium for a time sufficient for colony formation and antibody production. This is usually about 7 to about 14 days.

이어서 하이브리도마 콜로니는 Siglec 폴리펩타이드 유전자 산물에 특이적으로 결합하는 항체의 생산에 대해 검정된다. 검정은 전형적으로 비색계측 ELISA-유형 검정이지만, 하이브리도마를 성장시키는 웰에 적응될 수 있는 임의의 검정이 채택될 수 있다. 다른 검정에는 방사선면역검정 또는 형광 활성화 세포 정렬이 포함된다. 요망되는 항체 생산에 대해 양성인 웰이 하나 이상의 별도의 콜로니가 존재하는지를 결정하기 위해 검사된다. 하나를 초과하는 콜로니가 존재하는 경우, 하나의 세포만 요망되는 항체를 생산하는 콜로니를 생성함을 보장하기 위해 세포가 재클로닝되고 성장시킬 수 있다. 전형적으로, 항체는 또한 Siglec 폴리펩타이드, 예컨대, Siglec-발현 세포에 결합하는 능력에 대해 평가될 것이다.The hybridoma colonies are then assayed for production of antibodies that specifically bind to the Siglec polypeptide gene product. The assay is typically a colorimetric ELISA-type assay, although any assay that can be adapted to the wells in which the hybridomas are grown may be employed. Other assays include radioimmunoassays or fluorescence activated cell sorting. Wells positive for the desired antibody production are tested to determine if one or more separate colonies are present. If more than one colony is present, the cells can be recloned and grown to ensure that only one cell produces a colony producing the desired antibody. Typically, the antibody will also be assessed for its ability to bind to a Siglec polypeptide, such as a Siglec-expressing cell.

모노클로날 항체를 생산하는 것으로 확인되는 하이브리도마는 적절한 배지, 예컨대 DMEM 또는 RPMI-1640에서 더 다량으로 성장시킬 수 있다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 생체내에서 동물 내의 복수 종양으로서 성장시킬 수 있다.Hybridomas found to produce monoclonal antibodies can be grown in larger quantities in an appropriate medium, such as DMEM or RPMI-1640. Alternatively, hybridoma cells can be grown in vivo as ascites tumors in animals.

요망되는 모노클로날 항체를 생산하기 충분한 성장 후, 모노클로날 항체를 함유하는 성장 배지(또는 복수액)는 세포로부터 분리되며 거기에 존재하는 모노클로날 항체가 정제된다. 정제는 전형적으로 겔 전기영동, 투석, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스를 이용하는 크로마토그래피, 또는 고체 지지체, 예컨대 아가로스 또는 세파로스 비드에 연결된 항-마우스 Ig에 의해 달성된다(모두, 예를 들어, 문헌[Antibody Purification Handbook, Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition AC]에 기재되며, 그 개시는 본원에 참조로 포함된다). 결합된 항체는 전형적으로 항체-함유 분획의 즉각적인 중화를 포함하는 저 pH 완충액(pH 3.0 이하의 글리신 또는 아세테이트 완충액)을 이용함으로써 단백질 A/단백질 G 컬럼으로부터 용출된다. 이들 분획은 필요에 따라 풀링되고, 투석되고, 농축된다.After sufficient growth to produce the desired monoclonal antibody, the growth medium (or ascites fluid) containing the monoclonal antibody is isolated from the cells and the monoclonal antibody present therein is purified. Purification is typically accomplished by gel electrophoresis, dialysis, chromatography using Protein A or Protein G-Sepharose, or anti-mouse Ig linked to a solid support such as agarose or Sepharose beads (all, e.g. , Antibody Purification Handbook, Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition AC, the disclosure of which is incorporated herein by reference). Bound antibody is typically eluted from the Protein A/Protein G column by using a low pH buffer (glycine or acetate buffer at pH 3.0 or less) which involves immediate neutralization of the antibody-containing fraction. These fractions are pooled, dialyzed and concentrated as needed.

하나의 모노클로날 항체만 검출되고 생산됨을 확실히 하기 위해 하나의 뚜렷한 콜로니를 갖는 양성 웰이 전형적으로 재-클로닝되고 재-검정된다.Positive wells with one distinct colony are typically re-cloned and re-assayed to ensure that only one monoclonal antibody is detected and produced.

항체는 또한 예를 들어 문헌[(Ward et al. Nature, 341 (1989) p. 544, 그 전체 개시는 본원에 참조로 포함됨)]에 개시된 바와 같은, 면역글로불린의 조합 라이브러리의 선택에 의해 생산될 수 있다.Antibodies can also be produced by selection of combinatorial libraries of immunoglobulins, as disclosed, for example, in Ward et al. Nature, 341 (1989) p. 544, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. can

항체는 Siglec 폴리펩타이드에 대한 최대 결합을 달성하기 위해 요구되는 농도에 대해 Siglec 상에서 적정될 수 있다. Siglec 폴리펩타이드(또는 이를 발현하는 세포)로의 결합에 대한 "EC50"은 Siglec 폴리펩타이드(또는 이를 발현하는 세포)로의 결합에 대해 그 최대 반응 또는 효과의 50%를 생성하는 항-Siglec 항체의 효율적 농도를 나타낸다.Antibodies can be titrated on Siglec to the concentration required to achieve maximal binding to the Siglec polypeptide. The "EC50" for binding to a Siglec polypeptide (or a cell expressing it) is the effective concentration of an anti-Siglec antibody that produces 50% of its maximal response or effect on binding to a Siglec polypeptide (or a cell expressing it) indicates

일단 Siglec에 결합할 수 있는/있거나 다른 요망되는 특성을 가질 수 있는 항체가 확인되면, 이들은 또한 전형적으로, 다른 Siglec 폴리펩타이드 및/또는 미관련 폴리펩타이드를 포함하는 다른 폴리펩타이드에 결합하는 이의 능력에 대해, 본원에 기재되는 것들을 포함하는 표준 방법을 이용하여 평가될 것이다. 이상적으로, 항체는 Siglec, 예컨대, 인간 Siglec-7 및/또는 인간 Siglec-9에만 상당한 친화도를 가지고 결합하며, 미관련 폴리펩타이드, 특히 CD33-관련 Siglec 이외의 폴리펩타이드, 또는 요망되는 Siglec 이외의 Siglec(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9)에 유의미한 수준으로 결합하지 않는다. 그러나, Siglec에 대한 친화도가 다른 Siglec 및/또는 다른, 미관련 폴리펩타이드)에 대한 것보다 실질적으로 더 큰(예컨대, 5x, 10x, 50x, 100x, 500x, 1000x, 10,000x 이상인) 한, 항체는 본 발명의 방법에서 이용하기 적합함이 이해될 것이다.Once antibodies that may bind to Siglec and/or may have other desired properties are identified, they will also typically depend on their ability to bind other Siglec polypeptides and/or other polypeptides, including unrelated polypeptides. will be assessed using standard methods, including those described herein. Ideally, the antibody binds with significant affinity only to a Siglec, such as human Siglec-7 and/or human Siglec-9, and an unrelated polypeptide, in particular a CD33-associated non-Siglec polypeptide, or the desired non-Siglec It does not bind to a significant level to Siglec (eg, Siglec-7 and/or Siglec-9). However, as long as the affinity for Siglec is substantially greater (eg, at least 5x, 10x, 50x, 100x, 500x, 1000x, 10,000x) than for other Siglec and/or other, unrelated polypeptides), the antibody It will be understood that is suitable for use in the method of the present invention.

항-Siglec 항체는 이들이 인간 Fcγ 수용체에 대한 특이적 결합이 감소되거나 실질적으로 없도록 비-고갈 항체로 제조될 수 있다. 이러한 항체는 Fcγ 수용체에 결합하지 않거나 이에 대해 낮은 결합 친화도를 갖는 것으로 알려져 있는 다양한 중쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 하나의 이러한 예는 인간 IgG4 불변 영역이다. 대안적으로 불변 영역, 예컨대 Fab 또는 F(ab')2 단편을 포함하지 않는 IgG4 항체 단편이 Fc 수용체 결합을 회피하기 위해 이용될 수 있다. Fc 수용체 결합은, 예를 들어 BIACORE 검정에서 Fc 수용체 단백질에 대한 항체의 결합 평가를 포함하는 당분야에 공지된 방법에 따라 평가될 수 있다. 또한, Fc 부분이 Fc 수용체에 대한 결합을 최소화하거나 제거하도록 개질된 임의의 항체 이소형이 이용될 수 있다(예로, 그 개시가 본원에 참조로 포함되는 WO03101485 참고). 검정, 예컨대 Fc 수용체 결합을 평가하기 위한 세포 기반 검정은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 예로, WO03101485에 기재되어 있다.Anti-Siglec antibodies can be prepared as non-depleting antibodies such that they have reduced or substantially reduced specific binding to human Fcγ receptors. Such antibodies may comprise constant regions of various heavy chains that are known to not bind to, or have low binding affinity for, Fcγ receptors. One such example is the human IgG4 constant region. Alternatively, an IgG4 antibody fragment that does not contain a constant region, such as a Fab or F(ab')2 fragment, may be used to circumvent Fc receptor binding. Fc receptor binding can be assessed according to methods known in the art, including, for example, assessing the binding of an antibody to an Fc receptor protein in a BIACORE assay. In addition, any antibody isotype in which the Fc portion has been modified to minimize or eliminate binding to Fc receptors may be used (see, eg, WO03101485, the disclosure of which is incorporated herein by reference). Assays, such as cell-based assays for assessing Fc receptor binding, are well known in the art and are described, eg, in WO03101485.

Siglec 폴리펩타이드 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 항체를 인코딩하는 DNA는 하이브리도마로부터 단리되어 적절한 숙주 내로의 전달감염을 위해 적절한 발현 벡터 내에 배치된다. 이어서 숙주는 항체, 또는 이의 변이체, 예컨대 그 모노클로날 항체의 인간화 버전, 항체의 활성 단편, 항체의 항원 인식부를 포함하는 키메라 항체, 또는 검출 가능한 모이어티를 포함하는 버전의 재조합 생산을 위해 이용된다.DNA encoding an antibody that binds to an epitope present on the Siglec polypeptide is isolated from the hybridoma and placed in an appropriate expression vector for transfection into an appropriate host. The host is then used for recombinant production of the antibody, or variant thereof, such as a humanized version of a monoclonal antibody thereof, an active fragment of the antibody, a chimeric antibody comprising an antigen recognition portion of the antibody, or a version comprising a detectable moiety. .

모노클로날 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적 절차를 이용하여(예컨대, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 이용하여) 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 배치될 수 있고, 이어서 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득하기 위해, 다른 경우 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 대장균 세포, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 전달감염된다. 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같이, 이러한 DNA 서열은 임의의 다수의 목적을 위해, 예컨대, 항체의 인간화를 위해, 단편 또는 유도체의 생산을 위해, 또는 예컨대 항체의 결합 특이성을 최적화하기 위해 항원 결합 부위에서 항체의 서열을 변경하기 위해 변경될 수 있다. 항체를 인코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현은 당분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); 및 Pluckthun, Immunol. 130, p. 151 (1992)] 참고).DNA encoding a monoclonal antibody can be readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., using oligonucleotide probes capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of murine antibodies). . Once isolated, the DNA can be placed into an expression vector, and then host cells that otherwise do not produce immunoglobulin proteins, such as E. coli cells, simian COS cells, to obtain synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells. , Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, or myeloma cells. As described elsewhere herein, such DNA sequences can be used as antigen binding sites for any of a number of purposes, such as for humanization of antibodies, for production of fragments or derivatives, or for optimizing the binding specificity of antibodies. may be altered to alter the sequence of the antibody in Recombinant expression in bacteria of DNA encoding an antibody is well known in the art (see, e.g., Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); and Pluckthun, Immunol. 130, p. 151 (1992)).

본 발명의 맥락 내에서, "공통 결정기"는 인간 억제 Siglec 수용체, 특히 CD33-관련 Siglec의 몇몇 유전자 산물에 의해 공유되는 결정기 또는 에피토프를 명명한다. 항체는 적어도 Siglec-7 및 Siglec-9에 의해 공유되는 공통 결정기에 결합할 수 있다. 하나의 구현예에서, 공통 결정기는 선택적으로 하나 이상의, 또는 모든 CD33-관련 Siglec, 특히 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및 Siglec-12 상에 부재할 수 있다. 하나의 구현예에서 공통 결정기는 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및 Siglec-12 상에 부재한다. Within the context of the present invention, "common determinant" designates a determinant or epitope shared by several gene products of the human inhibitory Siglec receptor, in particular the CD33-associated Siglec. The antibody is capable of binding at least a common determinant shared by Siglec-7 and Siglec-9. In one embodiment, the common determinant is optionally on one or more, or all CD33-related Siglec, in particular Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 and Siglec-12. may be absent in In one embodiment a common crystal group is absent on Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 and Siglec-12.

Siglec 폴리펩타이드(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9, 특히 모노클로날 항체 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F와 실질적으로 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체(Siglec-9 특이적) 또는 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과 실질적으로 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항체(Siglec-7/9 특이적)의 확인은 항체 경쟁이 평가될 수 있는 임의의 하나의 다양한 면역학적 스크리닝 검정을 이용해서 쉽게 결정될 수 있다. 여러 이러한 검정이 일상적으로 실시되며 당분야에 널리 공지되어 있다(예컨대, 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 제5,660,827호 참고). 본원에 기재되는 항체가 결합하는 에피토프의 실제 결정이 어떠한 방식으로든 본원에 기재되는 모노클로날 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 확인하기 위해 요구되지 않음이 이해될 것이다.Substantially or essentially with a Siglec polypeptide (eg, Siglec-7 and/or Siglec-9, in particular the monoclonal antibodies mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E or mAb-F one or more antibodies that bind to the same epitope (Siglec-9 specific) or that bind substantially or essentially the same epitope as mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6; Identification of one or more antibodies (Siglec-7/9 specific) can be readily determined using any one of a variety of immunological screening assays in which antibody competition can be assessed.Many of these assays are routinely practiced and known in the art. It is well known (see, e.g., U.S. Patent No. 5,660,827, which is incorporated herein by reference).The actual determination of the epitope to which the antibody described herein binds is in any way identical or substantially identical to the monoclonal antibody described herein. It will be understood that this is not required to identify antibodies that bind to the same epitope.

예를 들어, 검사될 평가 항체가 상이한 원천 동물로부터 수득되거나, 심지어 상이한 Ig 이소형을 갖는 경우, 대조군(예를 들어, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F 또는 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6) 및 평가 항체가 혼합되고(또는 사전-흡착되고), Siglec 폴리펩타이드 함유 샘플에 적용되는 단순한 경쟁 검정이 채택될 수 있다. 웨스턴 블로팅에 기반하는 프로토콜 및 BIACORE 분석의 이용이 이러한 경쟁 연구에서 이용하기 적합하다.Controls (e.g., mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, for example, if the test antibody to be tested is obtained from an animal of different origin, or even has a different Ig isotype. or mAb-F or mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6) and the evaluation antibody are mixed (or pre-adsorbed) and applied to a sample containing Siglec polypeptide A simple competition test with Protocols based on Western blotting and the use of BIACORE assays are suitable for use in this competition study.

소정 구현예에서, Siglec 항원 샘플로의 적용 전 시기 동안 대조군 항체(예를 들어, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F 또는 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6)를 가변량의 평가 항체(예컨대, 약 1:10 또는 약 1:100)와 사전 혼합한다. 다른 구현예에서, 대조군 및 가변량의 평가 항체는 Siglec 항원 샘플로의 노출 동안 단순 혼합될 수 있다. 결합된 항체를 자유 항체와(예컨대, 미결합 항체를 제거하기 위한 분리 또는 세척 기법을 이용함으로써) 그리고 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6을 평가 항체와(예컨대, 종-특이적 또는 이소형-특이적 이차 항체를 이용함으로써 또는 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6을 검출 가능한 표지로 특이적으로 표지함으로써) 구별할 수 있는 한, 평가 항체가 결합에 대해 경쟁하고/하거나 Siglec 상에서 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과 공통 결합 부위를 인식함을 시사하는, 평가 항체가 항원에 대한 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6의 결합을 감소시키는지를 결정할 수 있다. 경쟁적으로 무관한 항체의 부재 하에 (표지된) 대조군 항체의 결합은 대조군 고-값으로 작용할 수 있다. 대조군 저-값은 표지된(mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6) 항체를 정확히 동일한 유형(mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6)의 미표지 항체와 인큐베이션함으로써 수득될 수 있고, 여기서 경쟁이 일어나 표지된 항체의 결합을 감소시킬 것이다. 평가 검정에서, 평가 항체의 존재 하에 표지된 항체 반응성의 유의미한 감소는 Siglec 상에서 실질적으로 동일한 영역을 인식하고, 표지된 (mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6) 항체와 "교차-반응하는" 또는 이와 경쟁하는 평가 항체임을 시사한다. 약 1:10 내지 약 1:100의 임의의 비의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6:평가 항체로 Siglec 항원으로의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6의 결합을 적어도 약 50%, 예컨대 적어도 약 60%, 또는 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 또는 90%(예컨대, 약 65% 내지 100%)만큼 감소시키는 임의의 평가 항체는 각각의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과 경쟁하는 항체인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 이러한 평가 항체는 Siglec 항원으로의 각각의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6의 결합을 적어도 약 90%(예컨대, 약 95%)만큼 감소시킬 것이다.In certain embodiments, a control antibody (e.g., mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E or mAb-F or mAb-1, mAb during the period prior to application to the Siglec antigen sample -2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6) is premixed with a variable amount of the assay antibody (eg, about 1:10 or about 1:100). In another embodiment, the control and variable amounts of the assay antibody can be simply mixed during exposure to the Siglec antigen sample. Combined antibody with free antibody (eg, by using separation or washing techniques to remove unbound antibody) and mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6 with an evaluation antibody (eg, by using a species-specific or isotype-specific secondary antibody or mAb-A; Specific detectable label for mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6 to the extent that the evaluation antibody competes for binding and/or on Siglec mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, Assessing antibodies to antigens mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-, suggesting that they recognize a common binding site with mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6 D, whether it reduces binding of mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6. Binding of a (labeled) control antibody in the absence of a competitively irrelevant antibody can serve as a control high-value. Control low-values are labeled (mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb- 5 or mAb-6) antibodies of the exact same type (mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb- 4, incubation with an unlabeled antibody of mAb-5 or mAb-6), where competition will occur to reduce binding of the labeled antibody. In the evaluation assay, a significant decrease in labeled antibody reactivity in the presence of the evaluation antibody recognizes substantially identical regions on Siglec, and the labeled (mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6) antibody "cross-reacting" with or competing with an evaluation antibody. mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, in any ratio from about 1:10 to about 1:100; mAb-4, mAb-5 or mAb-6: mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2 to Siglec antigen as evaluation antibody , binding of mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6 by at least about 50%, such as at least about 60%, or more preferably at least about 80% or 90% (eg, between about 65% and 100%). %) of any evaluated antibody, each of mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb- 4, considered to be an antibody that competes with mAb-5 or mAb-6. Preferably, such evaluation antibody comprises each of mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, will reduce binding of mAb-4, mAb-5 or mAb-6 by at least about 90% (eg, about 95%).

경쟁은 또한, 예를 들어, 유세포 측정 평가에 의해 평가될 수 있다. 이러한 평가에서, 하나 이상의 주어진 Siglec 폴리펩타이드(들)를 보유하는 세포는 먼저, 예를 들어, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과, 이어서 형광단 또는 바이오틴으로 표지된 평가 항체와 인큐베이션될 수 있다. 항체는 포화량의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과의 사전 인큐베이션 시 수득되는 결합이 각각의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과의 사전 인큐베이션 없이 항체에 의해 수득되는 결합(형광의 평균으로 측정됨)의 약 80%, 바람직하게는 약 50%, 약 40% 이하(예컨대, 약 30%, 20% 또는 10%)인 경우, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과 경쟁하는 것으로 언급된다. 대안적으로, 항체는 포화량의 평가 항체와 사전 인큐베이션된 세포 상에서 각각의 표지된 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6 항체(형광단 또는 바이오틴에 의해)로 수득되는 결합이 평가 항체와의 사전 인큐베이션 없이 수득된 결합의 약 80%, 바람직하게는 약 50%, 약 40% 이하(예컨대, 약 30%, 20% 또는 10%)인 경우, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6과 경쟁하는 것으로 언급된다.Competition can also be assessed, for example, by flow cytometric evaluation. In this evaluation, cells carrying one or more given Siglec polypeptide(s) are first treated, for example, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb- 1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6 followed by incubation with an evaluation antibody labeled with a fluorophore or biotin. Antibody is a saturating amount of mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb Binding obtained upon pre-incubation with -6 is each mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb -4, about 80%, preferably about 50%, about 40% or less of the binding (measured as the mean of fluorescence) obtained by the antibody without prior incubation with mAb-5 or mAb-6 (eg about 30 %, 20% or 10%), mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4 , to compete with mAb-5 or mAb-6. Alternatively, the antibody is administered on cells pre-incubated with a saturating amount of the assay antibody, respectively, labeled mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb -2, the binding obtained with the mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6 antibody (by fluorophore or biotin) is about 80% of the binding obtained without prior incubation with the assay antibody, preferably mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb- 1, referred to as competing with mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6.

평가 항체가 사전-흡착되고 Siglec 항원이 고정되는 표면으로 포화 농도로 적용되는 단순 경쟁 검정이 또한 채택될 수 있다. 단순 경쟁 검정에서의 표면은 바람직하게는 BIACORE 칩(또는 표면 플라즈몬 공명 분석에 적합한 다른 매체)이다. 이어서 대조군 항체(예컨대, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6)가 Siglec-포화 농도로 표면과 접촉되고 Siglec 및 대조군 항체의 표면 결합이 측정된다. 대조군 항체의 상기 결합은 평가 항체의 부재 하에 Siglec-함유 표면으로의 대조군 항체의 결합과 비교된다. 평가 검정에서, 평가 항체의 존재 하에 대조군 항체에 의한 Siglec-함유 표면 결합에서의 유의미한 감소는 평가 항체가 결합에 대해 경쟁하며 이에 따라 평가 항체가 대조군 항체와 "교차-반응"하도록 Siglec 상에서 대조군 항체와 동일한 영역을 인식할 수 있음을 시사한다. Siglec 항원으로의 대조군(such as mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6) 항체의 결합을 적어도 약 30% 이상, 바람직하게는 약 40%만큼 감소시키는 임의의 평가 항체는 대조군(예컨대, 각각의 mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6)으로서 Siglec으로의 결합에 대해 경쟁하는 항체인 것으로 간주될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 평가 항체는 Siglec 항원으로의 대조군 항체(예컨대, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 또는 mAb-6)의 결합을 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 60%, 적어도 약 70% 이상)만큼 감소시킬 것이다. 대조군 및 평가 항체의 순서가 역전될 수 있음이 이해될 것이다: 즉, 대조군 항체가 먼저 표면에 결합될 수 있고 평가 항체가 이후 경쟁 검정에서 표면과 접촉된다. 바람직하게는, 제2 항체(항체가 교차-반응한다고 가정하면)에 대해 나타난 결합에서의 감소가 더 큰 크기일 것으로 예상될 것이므로, Siglec 항원에 대해 더 높은 친화도를 갖는 항체가 표면에 먼저 결합된다. 이러한 검정의 추가예는, 예컨대, 문헌[Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41]에서 제공되며, 그 개시가 본원에 참조로 포함된다.A simple competition assay in which the evaluation antibody is pre-adsorbed and applied at a saturating concentration to the surface to which the Siglec antigen is immobilized can also be employed. The surface in the simple competition assay is preferably a BIACORE chip (or other suitable medium for surface plasmon resonance analysis). Then a control antibody (eg, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6) is contacted with the surface at a Siglec-saturating concentration and surface binding of Siglec and control antibody is measured. This binding of the control antibody is compared to the binding of the control antibody to the Siglec-containing surface in the absence of the evaluation antibody. In the evaluation assay, a significant decrease in binding to the Siglec-containing surface by the control antibody in the presence of the evaluation antibody is associated with the control antibody on Siglec such that the evaluation antibody competes for binding and thus the evaluation antibody "cross-reacts" with the control antibody. This suggests that the same area can be recognized. Control with Siglec antigen (such as mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb- 5 or mAb-6) any evaluative antibody that reduces binding of the antibody by at least about 30% or more, preferably about 40%, is a control (eg, each of mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb- D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6) can be considered to be antibodies that compete for binding to Siglec. . Preferably, such evaluation antibody is a control antibody to a Siglec antigen (eg mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E, mAb-F, mAb-1, mAb-2, mAb -3, mAb-4, mAb-5 or mAb-6) by at least about 50% (eg, at least about 60%, at least about 70% or more). It will be appreciated that the order of the control and evaluation antibodies may be reversed: that is, the control antibody may first be bound to the surface and the evaluation antibody then contacted with the surface in a competition assay. Preferably, the antibody with higher affinity for the Siglec antigen is first to the surface, since the decrease in binding seen to the second antibody (assuming the antibody cross-reacts) would be expected to be of a greater magnitude. are combined Further examples of such assays are described, eg, in Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, the disclosure of which is incorporated herein by reference.

항체가 에피토프 영역 내에 결합하는지 여부의 결정은 당업자에게 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 맵핑/특성규명 방법의 일례로서, 항-Siglec 항체에 대한 에피토프 영역은 Siglec 단백질에서 노출된 아민/카복실의 화학적 변경을 이용하는 에피토프 "풋-프린팅"에 의해 결정될 수 있다. 이러한 풋-프린팅 기법의 하나의 구체예는 HXMS(질량 분광측정에 의해 검출되는 수소-중수소 교환)의 이용이며, 여기서 수용체 및 리간드 단백질 아미드 양성자의 수소/중수소 교환, 결합, 및 역 교환이 일어나며, 단백질 결합에 참여하는 골격 아미드기는 역 교환으로부터 보호되고, 이에 따라 중수소화된 채 유지될 것이다. 관련 영역은 이 지점에서 펩타이드 단백분해, 신속 마이크로보어 고성능 액체 크로마토그래피 분리, 및/또는 전기분무 이온화 질량 분광측정에 의해 확인될 수 있다. 예컨대, 문헌[Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) Engen, J. R. and Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A]을 참고한다. 적합한 에피토프 확인 기법의 또 다른 예에는 핵 자기 공명 에피토프 맵핑(NMR)이며, 여기서 전형적으로 자유 항원 및 항원 결합 펩타이드, 예컨대 항체와 복합체를 이룬 항원의 2차원 NMR 스펙트럼에서의 신호 위치가 비교된다. 항원은 전형적으로 항원에 대응하는 신호만 NMR-스펙트럼에서 나타나고 항원 결합 펩타이드로부터의 신호는 나타나지 않도록 15N으로 선택적으로 동위원소 표지된다. 항원 결합 펩타이드와의 상호작용에 관여되는 아미노산으로부터 유래되는 항원 신호는 전형적으로 자유 항원의 스펙트럼에 비해 복합체의 스펙트럼에서 위치를 이동할 것이며, 결합에 관여되는 아미노산은 그러한 방식으로 확인될 수 있다. 예컨대, 문헌[Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); 및 Saito and Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24]을 참고한다.The determination of whether an antibody binds within an epitope region can be performed in a manner known to those skilled in the art. As an example of such a mapping/characterization method, the epitope region for an anti-Siglec antibody can be determined by epitope "foot-printing" using chemical alterations of the exposed amine/carboxyl in the Siglec protein. One embodiment of such a foot-printing technique is the use of HXMS (hydrogen-deuterium exchange detected by mass spectrometry), where hydrogen/deuterium exchange, binding, and reverse exchange of receptor and ligand protein amide protons occur, The backbone amide groups that participate in protein binding are protected from reverse exchange and will therefore remain deuterated. Relevant regions can be identified at this point by peptide proteolysis, rapid microbore high performance liquid chromatography separation, and/or electrospray ionization mass spectrometry. See, eg, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) Engen, J. R. and Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A]. Another example of a suitable epitope identification technique is nuclear magnetic resonance epitope mapping (NMR), where signal positions in two-dimensional NMR spectra of antigens typically complexed with free antigen and antigen binding peptides, such as antibodies, are compared. Antigens are typically selectively isotopically labeled with 15N such that only the signal corresponding to the antigen appears in the NMR-spectrum and no signal from the antigen binding peptide is seen. An antigen signal derived from an amino acid involved in an interaction with an antigen binding peptide will typically shift positions in the spectrum of the complex relative to that of the free antigen, and the amino acid involved in binding can be identified in that way. See, eg, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); and Saito and Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24].

에피토프 맵핑/특성규명은 또한 질량 분광측정 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예컨대, 문헌[Downard, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35 (4): 493-503 및 Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9): 1792-1801]을 참고한다. 프로테아제 소화 기법도 에피토프 맵핑 및 확인의 맥락에서 유용할 수 있다. 항원 결정기-관련 영역/서열은 프로테아제 소화에 의해, 예컨대 트립신을 Siglec에 대해 약 1:50 비로 이용하여 또는 pH 7~8에서 o/n 소화에 의해, 이어서 펩타이드 확인을 위한 질량 분광측정(MS) 분석에 의해 결정될 수 있다. 항-Siglec 결합제에 의한 트립신 절단으로부터 보호되는 펩타이드는 이후 트립신 소화를 거친 샘플 및 항체와 인큐베이션된 후, 예컨대 트립신에 의한 소화를 거친 샘플의 비교에 의해(이에 따라 결합제의 풋프린트를 드러내어) 확인될 수 있다. 다른 효소, 예컨대 키모트립신, 펩신 등이 또한 또는 대안적으로 유사한 에피토프 특성규명 방법에서 이용될 수 있다. 또한, 효소 소화는 잠재적 항원 결정기 서열이 표면 노출되지 않은 Siglec 폴리펩타이드 영역 내에 있는지 여부, 그리고 이에 따라 면역원성/항원성 측면에서 가장 무관할 수 있음을 분석하기 위한 빠른 방법을 제공할 수 있다.Epitope mapping/characterization can also be performed using mass spectrometric methods. See, eg, Downard, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35 (4): 493-503 and Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9): 1792-1801]. Protease digestion techniques may also be useful in the context of epitope mapping and identification. Epitope-associated regions/sequences can be identified by protease digestion, such as by o/n digestion at pH 7-8 using trypsin in a ratio of about 1:50 to Siglec, followed by mass spectrometry (MS) for peptide identification. It can be determined by analysis. Peptides that are protected from trypsin cleavage by the anti-Siglec binding agent can then be identified (thus revealing the footprint of the binding agent) by comparison of a sample that has undergone trypsin digestion and a sample that has been incubated with the antibody, e.g., digested with trypsin. can Other enzymes such as chymotrypsin, pepsin, and the like may also or alternatively be used in similar epitope characterization methods. In addition, enzymatic digestion can provide a rapid method to analyze whether potential epitope sequences are within unsurface-exposed Siglec polypeptide regions, and thus may be most irrelevant in terms of immunogenicity/antigenicity.

부위-지정 돌연변이화는 결합 에피토프의 규명에 유용한 또 다른 기법이다. 예를 들어, "알라닌-스캐닝"에서, 단백질 절편 내의 각각의 잔기가 알라닌 잔기로 대체되고, 결합 친화도에 대한 결과가 측정된다. 돌연변이가 결합 친화도의 상당한 감소를 야기하는 경우, 이는 결합에 관여될 가능성이 크다. 구조 에피토프에 특이적인 모노클로날 항체(즉, 폴딩되지 않은 단백질에 결합하지 않는 항체)는 알라닌-대체가 단백질의 전반적 폴딩에 영향을 미치지 않음을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 예컨대, 문헌[Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386; 및 Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6]을 참고한다.Site-directed mutagenesis is another technique useful for characterization of binding epitopes. For example, in "alanine-scanning", each residue in a protein fragment is replaced with an alanine residue, and the result for binding affinity is determined. If the mutation results in a significant decrease in binding affinity, it is most likely involved in binding. A monoclonal antibody specific for a structural epitope (ie, an antibody that does not bind to an unfolded protein) can be used to confirm that alanine-replacement does not affect the overall folding of the protein. See, eg, Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386; and Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6].

전자 현미경이 또한 에피토프 "풋-프린팅"을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Wang et al., Nature 1992; 355:275-278]에서는 원상태 동부 모자이크 바이러스의 캡시드 표면 상에서 Fab-단편의 물리적 풋프린트를 결정하기 위해 냉동전자 현미경, 3차원 이미지 재구성, 및 X-선 결정측정의 통합 적용을 이용하였다. Electron microscopy can also be used for epitope “foot-printing”. See, eg, Wang et al., Nature 1992; 355:275-278] used an integrated application of cryoelectron microscopy, three-dimensional image reconstruction, and X-ray crystallography to determine the physical footprint of Fab-fragments on the capsid surface of native eastern mosaic virus.

에피토프 평가를 위한 다른 형태의 "표지-비함유" 검정에는 표면 플라즈몬 공명(SPR, BIACORE) 및 반사계측 간섭 분광측정(RifS)이 포함된다. 예컨대, 문헌[F

Figure 112018096971757-pct00003
gerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14; Nice et al., J. Chroma-togr. 1993; 646:159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kr
Figure 112018096971757-pct00004
ger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944]를 참고한다.Other forms of “label-free” assays for epitope evaluation include surface plasmon resonance (SPR, BIACORE) and reflectometric interference spectroscopy (RifS). For example, [F
Figure 112018096971757-pct00003
gerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14; Nice et al., J. Chroma-togr. 1993; 646:159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kr
Figure 112018096971757-pct00004
ger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944].

본 발명의 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 본원에 기재되는 하나 이상의 예시적인 경쟁 검정에서 확인될 수 있음이 또한 주지되어야 한다.It should also be noted that antibodies that bind to the same or substantially the same epitope as an antibody of the invention may be identified in one or more exemplary competition assays described herein.

교차-차단 검정은 또한 평가 항체가 인간 Siglec(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9)에 대한 천연 또는 비-천연 시알산 리간드의 결합에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항-Siglec 항체 조제물이 시알산과의 Siglec-7 상호작용을 감소시키거나 차단하는지 여부를 결정하기 위해, 다음 평가가 수행될 수 있다: 용량-범위의 항-인간 Siglec-9 Fab가 고정된 용량의 인간 Siglec-Fc(예컨대, Siglec-7 Fc 및/또는 Siglec-9 Fc)와 실온에서 30분 공동-인큐베이션된 후, 1 h 동안 시알산 리간드 발현 세포주 상에 첨가된다. 세포를 염색 완충액 중에서 2회 세척 후, 염색 완충액 중 희석된 PE-커플링된 염소 항-마우스 IgG Fc 단편 2차 항체가 세포에 첨가되고, 플레이트는 4℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션된다. 세포는 2회 세척되고 HTFC 플레이트 판독기가 장착된 Accury C6 유세포 측정기 상에서 분석된다. 평가 항체의 부재 하에, Siglec-Fc는 세포에 결합한다. 시알산으로의 Siglec-결합을 차단하는 Siglec-Fc(예컨대, Siglec-7 Fc 및/또는 Siglec-9 Fc)와 사전-인큐베이션된 항체 조제물의 존재 하에, 세포로의 Siglec-Fc의 결합은 감소된다. 그러나, 시알산 리간드-발현 표적 세포에 대한 NK 세포 용해 활성의 재구성은 Siglec-시알산 리간드 상호작용의 차단을 평가할 필요 없이 직접 평가될 수 있음이 이해될 것이다.Cross-blocking assays can also be used to assess whether an evaluation antibody affects binding of a natural or non-native sialic acid ligand to human Siglec (eg, Siglec-7 and/or Siglec-9). For example, to determine whether a humanized anti-Siglec antibody preparation reduces or blocks Siglec-7 interaction with sialic acid, the following assessment can be performed: Dose-range anti-human Siglec-9 Fabs are co-incubated with a fixed dose of human Siglec-Fc (eg, Siglec-7 Fc and/or Siglec-9 Fc) for 30 min at room temperature and then added onto the sialic acid ligand expressing cell line for 1 h. After washing the cells twice in staining buffer, PE-coupled goat anti-mouse IgG Fc fragment secondary antibody diluted in staining buffer is added to the cells and the plate is incubated at 4° C. for an additional 30 minutes. Cells are washed twice and analyzed on an Accury C6 flow cytometer equipped with an HTFC plate reader. In the absence of the assay antibody, Siglec-Fc binds to cells. In the presence of an antibody preparation pre-incubated with Siglec-Fc (eg, Siglec-7 Fc and/or Siglec-9 Fc) that blocks Siglec-binding to sialic acid, binding of Siglec-Fc to cells is reduced. . However, it will be appreciated that reconstitution of NK cell lytic activity on sialic acid ligand-expressing target cells can be assessed directly without the need to assess blockade of Siglec-sialic acid ligand interaction.

선택적으로, 본 개시의 항체는 임의의 하나 이상의 항체 E10-286(BD Biosciences Corp.), 유럽 특허 1238282B1에 개시된 QA79(Moretta et al., Universita degli Studi di Genova), 또는 문헌[Falco et al. (1999) J. Exp. Med. 190:793-801]에서 언급된 Z176, 또는 예컨대, 전체적으로 또는 부분적으로 항원 결합 영역 또는 중쇄 및/또는 경쇄 CDR을 포함하는, 상기 항체의 유도체가 아닌 항체로 특정될 수 있다. 선택적으로, 본 개시의 항체는 2015년 9월 9일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/EP2015/070550(Innate Pharma)에 개시된 임의의 하나 이상의 항체 3A11, 1H9 및 2B4가 아닌 항체로 특정될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 언급된 항체는, 항체의 성질에 따라, 본 개시의 항체의 특징을 갖도록 변경될 수 있다.Optionally, the antibody of the present disclosure comprises any one or more of antibodies E10-286 (BD Biosciences Corp.), QA79 disclosed in European Patent 1238282B1 (Moretta et al., Universita degli Studi di Genova), or Falco et al. (1999) J. Exp. Med. 190:793-801, or an antibody that is not a derivative of said antibody comprising, for example, in whole or in part an antigen binding region or heavy and/or light chain CDRs. Optionally, an antibody of the present disclosure may be characterized as an antibody other than any one or more of antibodies 3A11, 1H9 and 2B4 disclosed in PCT Application No. PCT/EP2015/070550 (Innate Pharma), filed September 9, 2015. In another embodiment, the above-mentioned antibody can be modified to have the characteristics of the antibody of the present disclosure, depending on the nature of the antibody.

인간 Siglec-9의 세포외 도메인, 예컨대, N-말단 V-세트 도메인 또는 Ig-유사 C2-유형 도메인 1 또는 2에 결합하는 항체, 예를 들어 본원에서 실시예에 나타내는 에피토프에 결합하는 항체가 본원에서 제공된다.Antibodies that bind to an extracellular domain of human Siglec-9, such as an N-terminal V-set domain or an Ig-like C2-type domain 1 or 2, eg, antibodies that bind to an epitope shown in the Examples herein are disclosed herein. is provided in

하나의 양태에서, 항체는 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 하나의 구현예에서, 항체는 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F에 의해 결합되는 에피토프와 적어도 부분적으로 중첩되거나 그 안에, 적어도 하나의 잔기를 포함하는 Siglec-9 및/또는 Siglec-7의 에피토프에 결합한다. 항체에 의해 결합되는 잔기는 Siglec-9 및/또는 Siglec-7 폴리펩타이드의 표면, 예컨대 세포 표면 상에서 발현되는 Siglec-9 또는 Siglec-7 폴리펩타이드에 존재하는 것으로 특정될 수 있다. 항체에 의해 결합된 Siglec-9 및/또는 Siglec-7 상의 아미노산 잔기는, 예를 들어 표 3에 기재된 잔기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment, the antibody is an antibody mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb- Binds to substantially the same epitope as E or mAb-F. In one embodiment, the antibody is an antibody mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb -E or binds to an epitope of Siglec-9 and/or Siglec-7 comprising at least one residue therein at least partially overlapping with the epitope bound by mAb-F. Residues bound by the antibody can be characterized as being present on the surface of a Siglec-9 and/or Siglec-7 polypeptide, such as a Siglec-9 or Siglec-7 polypeptide expressed on a cell surface. The amino acid residues on Siglec-9 and/or Siglec-7 bound by the antibody may be selected, for example, from the group consisting of those listed in Table 3.

Siglec-9 돌연변이체로 전달감염된 세포에 대한 항-Siglec 항체의 결합이 측정되어 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 2)에 결합하는 항-Siglec 항체의 능력과 비교될 수 있다. Siglec-7에 추가적으로 결합하는 항체에 있어서, 항-Siglec 항체의 결합은 추가적으로 또는 대안적으로 Siglec-7 돌연변이체(예컨대 표 3)로 전달감염된 세포를 이용하여 수행되고 야생형 Siglec-7 폴리펩타이드(예컨대, SEQ ID NO: 1)에 결합하는 항-Siglec 항체의 능력과 비교될 수 있다. 항-Siglec 항체 및 돌연변이체 Siglec-9 및/또는 Siglec-7 폴리펩타이드(예컨대, 표 3의 돌연변이체 Siglec-9 또는 Siglec-7) 간 결합의 감소는 결합 친화도 감소(예컨대, 공지된 방법, 예컨대 특정 돌연변이체를 발현하는 세포의 FACS 평가에 의해 또는 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 결합의 Biacore™(SPR) 평가에 의해 측정됨) 및/또는 항-Siglec 항체의 총 결합능 감소(예컨대, 항-Siglec 항체 농도 대 폴리펩타이드 농도의 그래프에서 Bmax 감소로 입증됨)가 있음을 의미한다. 결합의 유의미한 감소는 돌연변이된 잔기가 항-Siglec 항체로의 결합에 직접 관여되거나 항-Siglec 항체가 Siglec-9에 결합되는 경우 결합 단백질에 매우 인접해 있음을 시사한다.Binding of the anti-Siglec antibody to cells transfected with the Siglec-9 mutant can be measured and compared to the ability of the anti-Siglec antibody to bind to a wild-type Siglec-9 polypeptide (eg, SEQ ID NO: 2). For antibodies that additionally bind to Siglec-7, binding of the anti-Siglec antibody is additionally or alternatively performed using cells transfected with a Siglec-7 mutant (eg Table 3) and a wild-type Siglec-7 polypeptide (eg, , the ability of the anti-Siglec antibody to bind to SEQ ID NO: 1). Reduction of binding between an anti-Siglec antibody and a mutant Siglec-9 and/or Siglec-7 polypeptide (eg, a mutant Siglec-9 or Siglec-7 in Table 3) results in a decrease in binding affinity (eg, known methods; reduced total binding capacity of the anti-Siglec antibody (e.g., as measured by FACS evaluation of cells expressing a particular mutant or by Biacore™ (SPR) evaluation of binding to the mutant polypeptide) and/or evidenced by a decrease in Bmax in the graph of antibody concentration versus polypeptide concentration). A significant decrease in binding suggests that the mutated residue is directly involved in binding to the anti-Siglec antibody or is very contiguous to the binding protein when the anti-Siglec antibody is bound to Siglec-9.

일부 구현예에서, 결합의 유의미한 감소는 항-Siglec 항체 및 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드 간 결합 친화도 및/또는 결합능이 항체 및 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드 간 결합에 비해 40% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과만큼 감소됨을 의미한다. 소정 구현예에서, 결합은 검출 한계 미만으로 감소된다. 일부 구현예에서, 결합의 유의미한 감소는 돌연변이체 Siglec-9 폴리펩타이드에 대한 항-Siglec 항체의 결합이 항-Siglec 항체 및 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드 간 관찰되는 결합의 50% 미만(예컨대, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% 또는 10% 미만)인 경우 입증된다.In some embodiments, a significant decrease in binding indicates that the binding affinity and/or binding capacity between the anti-Siglec antibody and the mutant Siglec-9 polypeptide is greater than 40%, greater than 50% compared to binding between the antibody and the wild-type Siglec-9 polypeptide. , greater than 55%, greater than 60%, greater than 65%, greater than 70%, greater than 75%, greater than 80%, greater than 85%, greater than 90%, or greater than 95%. In certain embodiments, binding is reduced below the limit of detection. In some embodiments, a significant decrease in binding indicates that binding of the anti-Siglec antibody to the mutant Siglec-9 polypeptide is less than 50% (e.g., 45%) of the binding observed between the anti-Siglec antibody and the wild-type Siglec-9 polypeptide. , less than 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% or 10%).

일부 구현예에서, 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F에 의해 결합된 아미노산 잔기를 포함하는 절편 내 잔기가 상이한 아미노산으로 치환되는 돌연변이체 Siglec-9 및/또는 Siglec-7 폴리펩타이드에 대해 유의미하게 더 낮은 결합을 나타내는 항-Siglec 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 돌연변이체는 야생형 Siglec 폴리펩타이드(예컨대 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드)에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 M6, M8, M9, M10, M11, M15 및 M16으로부터 선택되는 돌연변이체이다. 하나의 구현예에서, 돌연변이체는 야생형 Siglec-7 폴리펩타이드(예컨대 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드)에 대한 결합에 비해, 표 3의 돌연변이체 M6, M8, M9, M10, M11, M15 및 M16으로부터 선택되는 돌연변이체이다.In some embodiments, it comprises an amino acid residue bound by an antibody mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E or mAb-F Anti-Siglec antibodies are provided that exhibit significantly lower binding to mutant Siglec-9 and/or Siglec-7 polypeptides in which residues in the fragment are substituted with different amino acids. In one embodiment, the mutant comprises the mutants M6, M8, M9, M10, M11, M15 and It is a mutant selected from M16. In one embodiment, the mutant is compared to binding to a wild-type Siglec-7 polypeptide (eg, the polypeptide of SEQ ID NO: 1), the mutants M6, M8, M9, M10, M11, M15 and M16 of Table 3 It is a mutant selected from.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 N78, P79, A80, R81, A82 및/또는 V83(SEQ ID NO: 2 참조)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody comprises 1, 2, 3, 4 of the residues selected from the group consisting of N78, P79, A80, R81, A82 and/or V83 (see SEQ ID NO: 2). Binds to an epitope on human Siglec-9, including canine, five or six.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 N77, D96, H98 및/또는 T99(SEQ ID NO: 2 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody comprises 1, 2, 3 or 4 of the residues selected from the group consisting of N77, D96, H98 and/or T99 (see SEQ ID NO: 2). Binds to an epitope on human Siglec-9.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 W84, E85, E86 및/또는 R88(SEQ ID NO: 2 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody comprises 1, 2, 3 or 4 of the residues selected from the group consisting of W84, E85, E86 and/or R88 (see SEQ ID NO: 2). Binds to an epitope on human Siglec-9.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 및/또는 G54(SEQ ID NO: 2 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody comprises one, two of the residues selected from the group consisting of S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 and/or G54 (see SEQ ID NO: 2); Binds to an epitope on human Siglec-9 comprising 3, 4, 5, 6, 7 or 8.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 잔기 K131 및/또는 H132(SEQ ID NO: 2 참조) 중 1개 또는 2개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody binds to an epitope on human Siglec-9 comprising one or two of residues K131 and/or H132 (see SEQ ID NO: 2).

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및/또는 D71(SEQ ID NO: 2 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody comprises one, two, three of the residues selected from the group consisting of R63, A66, N67, T68, D69, Q70 and/or D71 (see SEQ ID NO: 2). , 4, 5, 6 or 7, binds to an epitope on human Siglec-9.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 P55, H58, E122, G124, S125 및/또는 K127(SEQ ID NO: 2 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함하는 인간 Siglec-9 상의 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody comprises 1, 2, 3, 4 of the residues selected from the group consisting of P55, H58, E122, G124, S125 and/or K127 (see SEQ ID NO: 2). Binds to an epitope on human Siglec-9, including canine, five or six.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 N82, P83, A84, R85, A86 및/또는 V87(SEQ ID NO: 1 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함하는 인간 Siglec-7 상의 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody comprises 1, 2, 3, 4 of the residues selected from the group consisting of N82, P83, A84, R85, A86 and/or V87 (see SEQ ID NO: 1). Binds to an epitope on human Siglec-7, including canine, five or six.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 N81, D100, H102 및/또는 T103(SEQ ID NO: 1 참조)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 인간 Siglec-7 상의 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody comprises 1, 2, 3 or 4 of the residues selected from the group consisting of N81, D100, H102 and/or T103 (see SEQ ID NO: 1). Binds to an epitope on human Siglec-7.

하나의 양태에서, 항-Siglec 항체는 W88, E89, E90, R92(SEQ ID NO: 1 참조)로 구성되는 군으로부터 선택되는 잔기 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함하는 인간 Siglec-7 상의 에피토프에 결합한다.In one embodiment, the anti-Siglec antibody is a human Siglec comprising 1, 2, 3 or 4 of the residues selected from the group consisting of W88, E89, E90, R92 (see SEQ ID NO: 1). Binds to an epitope on -7.

일단 Siglec에 대해 요망되는 결합을 갖는 항원-결합 화합물이 수득되면, 이는 Siglec(예컨대, Siglec-7 및/또는 Siglec-9)을 억제하는 그 능력에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 항-Siglec 항체가 시알산 리간드(예컨대 세포 상에 존재하는)에 의해 유도되는 Siglec 활성화를 감소시키거나 차단하는 경우, 이는 Siglec-제한 림프구의 세포독성을 증강시킬 수 있다. 이는 그 예가 후술되는, 전형적인 세포독성 검정에 의해 평가될 수 있다.Once an antigen-binding compound with desired binding to Siglec is obtained, it can be evaluated for its ability to inhibit Siglec (eg, Siglec-7 and/or Siglec-9). For example, if an anti-Siglec antibody reduces or blocks Siglec activation induced by a sialic acid ligand (eg, present on a cell), it may enhance the cytotoxicity of Siglec-restricted lymphocytes. This can be assessed by a typical cytotoxicity assay, examples of which are described below.

항체가 Siglec-매개 신호전달을 감소시키는 능력은, 예컨대, Siglec-7 또는 Siglec-9를 발현하는 NK 세포, 및 각각의 Siglec의 시알산 리간드를 발현하는 표적 세포를 이용하여 표준 4시간 시험관내 세포독성 검정에서 평가될 수 있다. 이러한 NK 세포는 Siglec-7 또는 Siglec-9가 시알산 리간드를 인식하여 림프구-매개 세포용해를 방지하는 억제성 신호전달의 개시 및 전파를 야기하므로, 시알산 리간드를 발현하는 표적을 효율적으로 사멸시키지 않는다. 이러한 검정은 본원에서 실시예, 예컨대 실시예 8에서의 방법에 따라, 이용 전에 37℃에서 하룻밤 인큐베이션된, 공여체로부터 정제된 신선 NK 세포로서 일차 NK 세포를 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 시험관내 세포독성 검정은, 예를 들어 문헌[Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)]에 기재된 바와 같이, 당분야에 널리 공지된 표준 방법에 의해 수행될 수 있다. 표적 세포는 NK 세포의 첨가 전에 51Cr로 표지된 후, 사멸의 결과로서 세포로부터 배지로의 51Cr의 방출에 비례하는 것으로 사멸이 산정된다. Siglec-7 및/또는 Siglec-9의 시알산 리간드로의 결합을 방지하는 항체의 첨가는 Siglec을 통한 억제성 신호전달의 개시 및 전파를 방지한다. 따라서, 이러한 제제의 첨가는 표적 세포의 림프구-매개 사멸을 증가시킨다. 이에 따라 상기 단계는, 예컨대 리간드 결합의 차단에 의한 Siglec-7 또는 Siglec-9-유도 음성 신호전달을 방지하는 제제를 확인시켜준다. 특정 51Cr-방출 세포독성 검정에서, Siglec-7 또는 Siglec-9-발현 NK 효과기-세포는 시알산 리간드-음성 표적 세포(예컨대, 시알리다제로 처리된 세포)를 사멸시킬 수 있지만, 시알산 리간드-발현 대조군 세포는 덜 사멸시킨다. 따라서, NK 효과기 세포는 특정 Siglec을 통한 시알산-유도 억제성 신호전달로 인해 시알산 리간드 양성 세포를 덜 효율적으로 사멸시킨다. NK 세포가 이러한 51Cr-방출 세포독성 검정에서 차단 항-Siglec 항체와 사전-인큐베이션되는 경우, 시알산 리간드-발현 세포는 항체-농도-의존적 방식으로 더 효율적으로 사멸된다. 검정은 각각의 Siglec, 예컨대, Siglec-7 및 Siglec-9에 대해 별도로 수행될 수 있다.The ability of an antibody to reduce Siglec-mediated signaling is demonstrated using, for example, NK cells expressing Siglec-7 or Siglec-9, and target cells expressing the sialic acid ligand of each Siglec, in standard 4 hour in vitro cells. can be evaluated in a toxicity assay. These NK cells do not efficiently kill targets expressing sialic acid ligands, as Siglec-7 or Siglec-9 recognizes sialic acid ligands and causes initiation and propagation of inhibitory signaling that prevents lymphocyte-mediated cytolysis. does not Such assays can be performed using primary NK cells as purified fresh NK cells from donors, incubated overnight at 37° C. prior to use, according to the methods in Examples herein, such as Example 8. Such in vitro cytotoxicity assays are described, for example, in Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, NY, (1992, 1993), by standard methods well known in the art. Target cells are labeled with 51 Cr prior to addition of NK cells, and then death is assessed as proportional to the release of 51 Cr from the cells into the medium as a result of death. Addition of antibodies that prevent binding of Siglec-7 and/or Siglec-9 to the sialic acid ligand prevents the initiation and propagation of inhibitory signaling through Siglec. Thus, the addition of such agents increases lymphocyte-mediated killing of target cells. This step thus identifies agents that prevent Siglec-7 or Siglec-9-induced negative signaling, for example by blocking ligand binding. In certain 51 Cr-releasing cytotoxicity assays, Siglec-7 or Siglec-9-expressing NK effector-cells can kill sialic acid ligand-negative target cells (eg, cells treated with sialidase), whereas sialic acid ligand -expression control cells are less killed. Thus, NK effector cells kill sialic acid ligand positive cells less efficiently due to sialic acid-induced inhibitory signaling through specific Siglec. When NK cells are pre-incubated with blocking anti-Siglec antibodies in this 51 Cr-releasing cytotoxicity assay, sialic acid ligand-expressing cells are killed more efficiently in an antibody-concentration-dependent manner. Assays can be performed separately for each Siglec, such as Siglec-7 and Siglec-9.

항체의 억제 활성(즉, 세포독성 증강력)은 또한 임의의 여러 다른 방식으로, 예컨대, 그 개시가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136]에 기재된 바와 같은 세포내 자유 칼슘에 대한 그 효과에 의해 또는 NK 세포 세포독성 활성화 마커, 예컨대 탈과립 마커 CD107 또는 CD137 발현 상의 효과에 의해 평가될 수 있다. NK, T, 또는 NKT 세포 활성은 또한, 임의의 세포 기반 세포독성 검정을 이용하여, 예컨대, 표적 세포, 예컨대 P815, K562 세포, 또는 각각의 전체 개시가 본원에 참조로 포함되는, 문헌[Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998;188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001;8:1131-1135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999;190:1505-1516]에 개시되는 적절한 종양 세포를 사멸시키도록 NK 세포를 자극하는 항체의 능력을 평가하기 위해 임의의 다른 파라미터를 측정하여 평가될 수 있다.The inhibitory activity (ie, cytotoxicity enhancing power) of an antibody may also be determined in any of several other ways, eg, as described in Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136 or by NK cell cytotoxic activation markers such as the degranulation markers CD107 or CD137 expression by their effect on intracellular free calcium as described in It can be evaluated by the effect of the phase. NK, T, or NKT cell activity can also be measured using any cell-based cytotoxicity assay, e.g., by target cells, such as P815, K562 cells, or the entire initiation of each of which is incorporated herein by reference, Sivori et al. al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998;188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001;8:1131-1135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999;190:1505-1516] can be assessed by measuring any other parameter to assess the ability of an antibody to stimulate NK cells to kill appropriate tumor cells.

하나의 구현예에서, 항체 조제물은 Siglec-제한 림프구 세포독성의 적어도 10% 강화, 바람직하게는 NK 세포독성의 적어도 40% 또는 50% 강화, 또는 보다 바람직하게는 NK 세포독성의 적어도 70% 강화를 야기한다.In one embodiment, the antibody preparation has at least 10% potentiation of Siglec-restricted lymphocyte cytotoxicity, preferably at least 40% or 50% potentiation of NK cytotoxicity, or more preferably at least 70% potentiation of NK cytotoxicity. causes

세포독성 림프구의 활성은 또한 사이토카인-방출 검정을 이용하여 설명될 수 있고, 여기서 NK 세포는 NK 세포의 사이토카인 생산(예를 들어 IFN-y 및 TNF-α 생산)을 자극하기 위해 항체와 인큐베이션된다. 예시적인 프로토콜에서, PBMC로부터의 IFN-y 생산은 세포 표면 및 세포질내 염색 및 배양에서 4일 후 유세포 측정에 의한 분석에 의해 평가된다. 간략하게, 브레펠딘(Brefeldin) A(Sigma Aldrich)는 배양의 마지막 4시간 동안 5 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가된다. 이어서 세포는 투과화(IntraPrep™; Beckman Coulter) 및 PE-항-IFN-y 또는 PE-IgG1(Pharmingen)로의 염색 전에 항-CD3 및 항-CD56 mAb와 인큐베이션된다. 폴리클로날 활성화 NK 세포로부터의 GM-CSF 및 IFN-y 생산은 ELISA(GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-y: OptElA set, Pharmingen)를 이용하여 상청액에서 측정된다.The activity of cytotoxic lymphocytes can also be elucidated using a cytokine-release assay, wherein the NK cells are incubated with an antibody to stimulate cytokine production (eg, IFN-y and TNF-α production) of the NK cells. do. In an exemplary protocol, IFN-y production from PBMCs is assessed by cell surface and intracytoplasmic staining and analysis by flow cytometry after 4 days in culture. Briefly, Brefeldin A (Sigma Aldrich) is added to a final concentration of 5 μg/ml during the last 4 hours of incubation. Cells are then incubated with anti-CD3 and anti-CD56 mAbs prior to permeabilization (IntraPrep™; Beckman Coulter) and staining with PE-anti-IFN-y or PE-IgG1 (Pharmingen). GM-CSF and IFN-y production from polyclonal activated NK cells was measured in the supernatant using ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-y: OptElA set, Pharmingen).

항체 단편 및 유도체(달리 언급되거나 문맥 상 명확히 금지되지 않는 한, 본 출원에서 이용되는 용어 "항체" 또는 "항체들"에 의해 포괄됨)는 당분야에 공지된 기법에 의해 생산될 수 있다. "단편"은 온전한 항체의 일부, 일반적으로 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 비제한적으로 (1) 단일쇄 Fv 분자 (2) 연관된 중쇄 모이어티를 포함하지 않고, 단 하나의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 또는 경쇄 가변 도메인의 3개 CDR을 함유하는 이의 단편 및 (3) 연관된 경쇄 모이어티를 포함하지 않고, 단 하나의 중쇄 가변 도메인을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 또는 중쇄 가변 도메인의 3개 CDR을 함유하는 이의 단편을 포함하는, 인접한 아미노산 잔기의 하나의 비단속 서열로 구성되는 일차 구조를 갖는 폴리펩타이드인 임의의 항체 단편(본원에서 "단일쇄 항체 단편" 또는 "단일쇄 폴리펩타이드"로 언급됨); 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 항체가 포함된다. 특히, 나노바디, 도메인 항체, 단일 도메인 항체 또는 "dAb"가 포함된다.Antibody fragments and derivatives (unless otherwise stated or clearly prohibited by context, encompassed by the term "antibody" or "antibodies" as used herein) can be produced by techniques known in the art. A “fragment” comprises a portion of an intact antibody, usually an antigen binding site or variable region. Examples of antibody fragments include Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, and Fv fragments; diabody; (1) a single chain Fv molecule (2) a single chain polypeptide containing only one light chain variable domain without an associated heavy chain moiety, or a fragment thereof containing three CDRs of a light chain variable domain and (3) one ratio of contiguous amino acid residues, including a single chain polypeptide containing only one heavy chain variable domain, or a fragment thereof containing the three CDRs of a heavy chain variable domain, without an associated light chain moiety any antibody fragment (referred herein as "single chain antibody fragment" or "single chain polypeptide") that is a polypeptide having a primary structure consisting of intermittent sequences; and multispecific (eg, bispecific) antibodies formed from antibody fragments. In particular, Nanobodies, domain antibodies, single domain antibodies or “dAbs” are included.

소정 구현예에서, 항체 생산 하이브리도마의 DNA는, 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 동종성 비-인간 서열 대신 치환함으로써(예컨대, Morrison et al., PNAS pp. 6851 (1984)), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 연결함으로써 발현 벡터 내로의 삽입 전에 변경될 수 있다. 이러한 방식으로, 원래 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다. 전형적으로, 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드가 항체의 불변 도메인에 대해 치환된다.In certain embodiments, the DNA of the antibody-producing hybridoma is obtained by substituting, for example, coding sequences for human heavy and light chain constant domains in place of homologous non-human sequences (eg, Morrison et al., PNAS pp. 6851). (1984)), or by covalently linking all or part of a coding sequence for a non-immunoglobulin polypeptide to an immunoglobulin coding sequence prior to insertion into an expression vector. In this way, "chimeric" or "hybrid" antibodies are prepared that have the binding specificity of the original antibody. Typically, such non-immunoglobulin polypeptides are substituted for the constant domains of antibodies.

선택적으로 항체는 인간화 항체이다. 항체의 "인간화" 형태는 뮤린 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 특이적인 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 부분에 있어서, 인간화 항체는 수신체의 상보성-결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원래 항체의 요망되는 특이성, 친화도, 및 능력을 유지하면서 원래 항체(공여체 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린(수신체 항체)이다.Optionally, the antibody is a humanized antibody. A "humanized" form of an antibody is a specific chimeric immunoglobulin, immunoglobulin chain or fragment thereof (such as Fv, Fab, Fab', F(ab')2, or other antigen-binding subsequence). For the most part, humanized antibodies have residues from the complementarity-determining regions (CDRs) of the recipient to residues from the CDRs of the original antibody (donor antibody) while retaining the desired specificity, affinity, and ability of the original antibody. It is a human immunoglobulin (recipient antibody) that is replaced by

일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 대체될 수 있다. 또한, 인간화 항체는 수신체 항체 또는 들여오는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 확인되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변경은 항체 성능을 추가 정련하고 최적화하도록 제조된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 원래 항체의 영역에 대응하며 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열의 영역이다. 인간화 항체는 최적으로는 또한, 전형적으로 인간 면역글로불린의 영역인, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가 상세사항에 대해서는, 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되는, 문헌[Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al, Nature, 332, pp. 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992); Verhoeyen et Science, 239, pp. 1534]; 및 U.S. 특허 제4,816,567호를 참고한다. 항체의 인간화 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다.In some cases, Fv framework residues of a human immunoglobulin may be replaced by corresponding non-human residues. In addition, humanized antibodies may contain residues that are not identified in the recipient antibody or in the importing CDR or framework sequences. These modifications are made to further refine and optimize antibody performance. In general, a humanized antibody will comprise substantially all of at least one, and typically two, variable domains, wherein all or substantially all of the CDR regions correspond to those of the original antibody and all or substantially all of the FR regions It is a region of the human immunoglobulin consensus sequence. A humanized antibody optimally will also comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin. For further details, see Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al, Nature, 332, pp. 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992); Verhoeyen et Science, 239, pp. 1534]; and U.S. See Patent No. 4,816,567. Methods for humanizing antibodies are well known in the art.

인간화 항체의 제조에서 이용될, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "최적-피팅" 방법에 따르면, 항체의 가변 도메인의 서열이 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서 마우스 서열과 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크(FR)로서 승인된다(Sims et al., J. Immunol. 151, pp. 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. 196, 1987, pp. 901). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터의 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 몇몇 상이한 인간화 항체에 대해 이용될 수 있다(Carter et al., PNAS 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151, p. 2623 (1993)).The selection of the human variable domains of both heavy and light chains to be used in the preparation of humanized antibodies is very important to reduce antigenicity. According to the so-called "best-fit" method, the sequences of the variable domains of an antibody are screened against the entire library of known human variable-domain sequences. The human sequence closest to the mouse sequence is then accepted as the human framework (FR) for humanized antibodies (Sims et al., J. Immunol. 151, pp. 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. 196). , 1987, pp. 901). Another method uses a specific framework from the consensus sequence of all human antibodies of a specific subgroup of light or heavy chains. The same framework can be used for several different humanized antibodies (Carter et al., PNAS 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151, p. 2623 (1993)).

추가로 항체가 Siglec 수용체 및 다른 바람직한 생물학적 특성에 대해 고친화도를 보유하며 인간화되는 것이 중요하다. 상기 목표를 달성하기 위해, 하나의 방법에 따르면, 인간화 항체는 모체 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모체 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용 가능하며, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다. 이러한 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할 분석, 즉 그 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 상기 방식으로, FR 잔기가 요망되는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대해 증가된 친화도가 달성되도록 공통 및 들여온 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접 그리고 가장 실질적으로 관여된다.It is further important that the antibody be humanized with high affinity for the Siglec receptor and other desirable biological properties. To achieve this goal, according to one method, humanized antibodies are prepared by a process of analysis of the parental sequences and various conceptual humanized products using three-dimensional models of the parental and humanized sequences. Three-dimensional immunoglobulin models are generally available and familiar to those skilled in the art. Computer programs are available that illustrate and display possible three-dimensional structures of selected candidate immunoglobulin sequences. Inspection of such displays allows analysis of the possible role of residues in the function of the candidate immunoglobulin sequence, ie, the analysis of residues that affect the ability of the candidate immunoglobulin to bind its antigen. In this way, FR residues can be selected and combined from consensus and imported sequences to achieve a desired antibody characteristic, such as increased affinity for the target antigen(s). In general, CDR residues are directly and most substantially involved in their effect on antigen binding.

"인간화" 모노클로날 항체를 제조하는 또 다른 방법은 면역화를 위해 이용되는 마우스로서 XenoMouse(Abgenix, Fremont, CA)를 이용하는 것이다. XenoMouse는 그 면역글로불린 유전자가 기능적 인간 면역글로불린 유전자에 의해 대체된 뮤린 숙주이다. 따라서, 상기 마우스에 의해 또는 상기 마우스의 B 세포로부터 제조된 하이브리도마에서 생산되는 항체는 이미 인간화 항체이다. XenoMouse는 미국 특허 제6,162,963호에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.Another method of making "humanized" monoclonal antibodies is to use the XenoMouse (Abgenix, Fremont, CA) as the mouse used for immunization. XenoMouse is a murine host in which the immunoglobulin gene has been replaced by a functional human immunoglobulin gene. Thus, an antibody produced by the mouse or in a hybridoma prepared from B cells of the mouse is already a humanized antibody. XenoMouse is described in US Pat. No. 6,162,963, which is incorporated herein by reference in its entirety.

인간 항체는 또한 다양한 다른 기법에 따라, 예컨대, 면역화를 위해, 인간 항체 레퍼토리를 발현하도록 조작된 다른 트랜스제닉 동물을 이용함으로써(Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), 또는 파지 디스플레이 방법을 이용하는 인간 항체 레퍼토리의 선택에 의해 생산될 수 있다. 이러한 기법은 당업자에게 공지되어 있으며 본 출원에서 개시되는 모노클로날 항체에서 시작하여 구현될 수 있다.Human antibodies can also be produced according to a variety of other techniques, such as for immunization, by using other transgenic animals engineered to express human antibody repertoires (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), or by phage display methods. can be produced by selection of the human antibody repertoire to use. Such techniques are known to those skilled in the art and can be implemented starting with the monoclonal antibodies disclosed herein.

하나의 구현예에서, 항-Siglec 항체는 인간 Fcγ 수용체, 예컨대, 임의의 하나 이상의 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및/또는 CD64)에 실질적인 특이적 결합을 갖지 않도록 제조될 수 있다. 이러한 항체는 Fcγ 수용체로의 결합이 없거나 낮은 것으로 알려진 다양한 중쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 불변 영역을 포함하지 않는(또는 그 일부를 포함하는) 항체 단편, 예컨대 F(ab')2 단편이 Fc 수용체 결합을 배제하기 위해 이용될 수 있다. Fc 수용체 결합은, 예를 들어 BIACORE 검정에서 Fc 수용체 단백질에 대한 항체의 결합 평가를 포함하는, 당분야에 공지된 방법에 따라 평가될 수 있다. 또한, 일반적으로 Fc 부분이 Fc 수용체에 대한 결합을 최소화하거나 제거하도록 변경된(예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 아미노산 치환의 도입에 의해) 임의의 항체 IgG 이소형이 이용될 수 있다(예컨대, 그 개시가 본원에 참조로 포함되는, WO 03/101485 참고). 검정, 예컨대 Fc 수용체 결합을 평가하기 위한 세포 기반 검정은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대, WO 03/101485에 기재되어 있다.In one embodiment, an anti-Siglec antibody can be prepared that does not have substantial specific binding to a human Fcγ receptor, such as any one or more of CD16A, CD16B, CD32A, CD32B and/or CD64. Such antibodies may comprise constant regions of various heavy chains known to have little or no binding to Fcγ receptors. Alternatively, antibody fragments that do not contain (or contain a portion of) a constant region, such as F(ab')2 fragments, can be used to rule out Fc receptor binding. Fc receptor binding can be assessed according to methods known in the art, including, for example, assessing the binding of an antibody to an Fc receptor protein in a BIACORE assay. Also, in general, any antibody IgG isotype in which the Fc portion is altered to minimize or eliminate binding to the Fc receptor (eg, by introduction of 1, 2, 3, 4, 5 or more amino acid substitutions) (see eg WO 03/101485, the disclosure of which is incorporated herein by reference). Assays, such as cell-based assays for assessing Fc receptor binding, are well known in the art and are described, eg, in WO 03/101485.

하나의 구현예에서, 항체는 효과기 세포와 최소 상호작용을 갖는 "Fc 무증상(silent)" 항체를 생성하는 Fc 영역에서의 하나 이상의 특정 돌연변이를 포함할 수 있다. 무증상화 효과기 기능은 항체의 Fc 영역에서 돌연변이에 의해 수득될 수 있고 당분야에 기재되어 있다: N297A 돌연변이, LALA 돌연변이(Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); 및 D265A(Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69), 또한 그 개시가 본원에 참조로 포함되는 Heusser 등의 WO2012/065950을 참고한다. 하나의 구현예에서, 항체는 힌지 영역에 1개, 2개, 3개 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 IgG1 또는 IgG2이며 잔기 233~236, 선택적으로 233~238(EU 넘버링)에 1개, 2개 또는 3개의 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 IgG4이며 잔기 327, 330 및/또는 331(EU 넘버링)에 1개, 2개 또는 3개의 치환을 포함한다. 무증상 Fc lgG1 항체의 예는 lgG1 Fc 아미노산 서열에 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 LALA 돌연변이체이다. Fc 무증상 돌연변이의 또 다른 예는 예를 들어 DAPA(D265A, P329A) 돌연변이(US 6,737,056)와 같이 lgG1 항체에서 이용되는, 잔기 D265에서의, 또는 D265 및 P329에서의 돌연변이이다. 또 다른 무증상 lgG1 항체는 잔기 N297에 돌연변이(예컨대 N297A, N297S 돌연변이)를 포함하며, 이는 비글리코실화/비-글리코실화 항체를 생성한다. 다른 무증상 돌연변이에는 잔기 L234 및 G237에서의 치환(L234A/G237A); 잔기 S228, L235 및 R409에서의 치환(S228P/L235E/R409K,T,M,L); 잔기 H268, V309, A330 및 A331에서의 치환(H268Q/V309L/A330S/A331S); 잔기 C220, C226, C229 및 P238에서의 치환(C220S/C226S/C229S/P238S); 잔기 C226, C229, E233, L234 및 L235에서의 치환(C226S/C229S/E233P/L234V/L235A; 잔기 K322, L235 및 L235에서의 치환(K322A/L234A/L235A); 잔기 L234, L235 및 P331에서의 치환(L234F/L235E/P331S); 잔기 234, 235 및 297에서의 치환; 잔기 E318, K320 및 K322에서의 치환(L235E/E318A/K320A/K322A); 잔기에서의 치환(V234A, G237A, P238S); 잔기 243 및 264에서의 치환; 잔기 297 및 299에서의 치환; EU 넘버링 시스템에 의해 정의되는 잔기 233, 234, 235, 237, 및 238이 PAAAP, PAAAS 및 SAAAS로부터 선택되는 서열을 포함하도록 하는 치환(WO2011/066501 참고)이 포함된다.In one embodiment, the antibody may comprise one or more specific mutations in the Fc region resulting in an “Fc silent” antibody with minimal interaction with effector cells. Asymptomatic effector function can be obtained by mutation in the Fc region of an antibody and has been described in the art: N297A mutation, LALA mutation (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6): 685-691); and D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69), also see Heusser et al. WO2012/065950, the disclosure of which is incorporated herein by reference. In one embodiment, the antibody comprises 1, 2, 3 or more amino acid substitutions in the hinge region. In one embodiment, the antibody is IgG1 or IgG2 and comprises 1, 2 or 3 substitutions at residues 233-236, optionally 233-238 (EU numbering). In one embodiment, the antibody is IgG4 and comprises 1, 2 or 3 substitutions at residues 327, 330 and/or 331 (EU numbering). An example of an asymptomatic Fc lgG1 antibody is a LALA mutant comprising L234A and L235A mutations in the lgG1 Fc amino acid sequence. Another example of Fc asymptomatic mutations are mutations at residues D265, or at D265 and P329, used in lgG1 antibodies, such as, for example, the DAPA(D265A, P329A) mutation (US Pat. No. 6,737,056). Another asymptomatic lgG1 antibody contains a mutation at residue N297 (eg N297A, N297S mutation), which results in an aglycosylated/non-glycosylated antibody. Other asymptomatic mutations include substitutions at residues L234 and G237 (L234A/G237A); substitutions at residues S228, L235 and R409 (S228P/L235E/R409K,T,M,L); substitutions at residues H268, V309, A330 and A331 (H268Q/V309L/A330S/A331S); substitutions at residues C220, C226, C229 and P238 (C220S/C226S/C229S/P238S); Substitutions at residues C226, C229, E233, L234 and L235 (C226S/C229S/E233P/L234V/L235A; substitutions at residues K322, L235 and L235 (K322A/L234A/L235A); substitutions at residues L234, L235 and P331 (L234F/L235E/P331S); substitution at residues 234, 235 and 297; substitution at residues E318, K320 and K322 (L235E/E318A/K320A/K322A); substitution at residue (V234A, G237A, P238S); residue substitutions at 243 and 264; substitutions at residues 297 and 299; substitutions such that residues 233, 234, 235, 237, and 238 as defined by the EU numbering system comprise a sequence selected from PAAAP, PAAAS and SAAAS (WO2011) See also /066501).

하나의 구현예에서, 항체는 본 개시의 항체의 개선된 안정성을 생성하는 Fc 영역 내 하나 이상의 특정 돌연변이를 포함할 수 있고, 예컨대 여러 방향족 아미노산 잔기를 포함하고/하거나 높은 소수성을 가질 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 인간 lgG1 기원의 Fc 도메인을 포함할 수 있고, Kabat 잔기(들) 234, 235, 237, 330 및/또는 331에 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 Fc 도메인의 일례는 Kabat 잔기 L234, L235 및 P331에 치환을 포함한다(예컨대, L234A/L235E/P331S 또는 (L234F/L235E/P331S). 이러한 Fc 도메인의 또 다른 예는 Kabat 잔기 L234, L235, G237 및 P331에 치환을 포함한다(예컨대, L234A/L235E/G237A/P331S). 이러한 Fc 도메인의 또 다른 예는 Kabat 잔기 L234, L235, G237, A330 및 P331에 치환을 포함한다(예컨대, L234A/L235E/G237A/A330S/P331S). 하나의 구현예에서, 항체는 L234X1 치환, L235X2 치환, 및 P331X3 치환을 포함하는, 선택적으로 인간 IgG1 이소형의, Fc 도메인을 포함하며, 여기서 X1은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X2는 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X3은 프롤린 이외의 임의의 아미노산 잔기이고; 선택적으로 X1은 알라닌 또는 페닐알라닌 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X2는 글루탐산 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X3은 세린 또는 이의 보존적 치환이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 L234X1 치환, L235X2 치환, G237X4 치환 및 P331X4 치환을 포함하는, 선택적으로 인간 IgG1 이소형의, Fc 도메인을 포함하며, 여기서 X1은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X2는 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X3은 글리신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X4는 프롤린 이외의 임의의 아미노산 잔기이고; 선택적으로 X1은 알라닌 또는 페닐알라닌 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X2는 글루탐산 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로, X3은 알라닌 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X4는 세린 또는 이의 보존적 치환이다. 또 다른 구현예에서, 항체는 L234X1 치환, L235X2 치환, G237X4 치환, G330X4 치환, 및 P331X5 치환을 포함하는, 선택적으로 인간 IgG1 이소형의, Fc 도메인을 포함하며, 여기서 X1은 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X2는 류신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X3은 글리신 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, X4는 알라닌 이외의 임의의 아미노산 잔기이고, 및 X5는 프롤린 이외의 임의의 아미노산 잔기이고; 선택적으로 X1은 알라닌 또는 페닐알라닌 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X2는 글루탐산 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로, X3은 알라닌 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로, X4는 세린 또는 이의 보존적 치환이고; 선택적으로 X5는 세린 또는 이의 보존적 치환이다. 본원에서 이용되는 약칭 명명에서, 포맷은 야생형 잔기: 폴리펩타이드에서의 위치: 돌연변이체 잔기이며, 여기서 잔기 위치는 Kabat에 따른 EU 넘버링에 따라 나타낸다.In one embodiment, the antibody may comprise one or more specific mutations in the Fc region that result in improved stability of the antibodies of the present disclosure, such as comprise several aromatic amino acid residues and/or may have high hydrophobicity. For example, such an antibody may comprise an Fc domain from human lgG1 and may comprise a mutation at Kabat residue(s) 234, 235, 237, 330 and/or 331. One example of such an Fc domain comprises substitutions at Kabat residues L234, L235 and P331 (eg L234A/L235E/P331S or (L234F/L235E/P331S). Another example of such an Fc domain is Kabat residues L234, L235, G237 and a substitution at P331 (e.g., L234A/L235E/G237A/P331S) Another example of such an Fc domain comprises a substitution at Kabat residues L234, L235, G237, A330 and P331 (e.g., L234A/L235E/ G237A/A330S/P331S) In one embodiment, the antibody comprises an Fc domain, optionally of a human IgG1 isotype, comprising a L234X 1 substitution, a L235X 2 substitution, and a P331X 3 substitution, wherein X 1 is leucine. any amino acid residue other than, X 2 is any amino acid residue other than leucine, X 3 is any amino acid residue other than proline; optionally X 1 is alanine or phenylalanine or a conservative substitution thereof; optionally X 2 is glutamic acid or a conservative substitution thereof; optionally X 3 is serine or a conservative substitution thereof In another embodiment, the antibody comprises L234X 1 substitution, L235X 2 substitution, G237X 4 substitution and P331X 4 substitution, optionally of a human IgG1 isotype, comprising an Fc domain, wherein X 1 is any amino acid residue other than leucine, X 2 is any amino acid residue other than leucine, X 3 is any amino acid residue other than glycine , X 4 is any amino acid residue other than proline; optionally, X 1 is alanine or phenylalanine or a conservative substitution thereof; optionally X 2 is glutamic acid or a conservative substitution thereof; optionally, X 3 is alanine or a conservative substitution thereof; conservative substitution; optionally X 4 is serine or a conservative substitution thereof In another embodiment, the antibody comprises a L234X 1 substitution, a L235X 2 substitution, a G237X 4 substitution, an Fc domain, optionally of a human IgG1 isotype, comprising a G330X 4 substitution, and a P331X 5 substitution, wherein X 1 is any amino acid residue other than leucine and X 2 is any amino acid residue other than leucine , X 3 is any amino acid residue other than glycine, X 4 is any amino acid residue other than alanine, and X 5 is any amino acid residue other than proline; optionally X 1 is alanine or phenylalanine or a conservative substitution thereof; optionally X 2 is glutamic acid or a conservative substitution thereof; optionally, X 3 is alanine or a conservative substitution thereof; optionally, X 4 is serine or a conservative substitution thereof; optionally X 5 is serine or a conservative substitution thereof. In the abbreviated nomenclature used herein, the format is wild-type residue: position in polypeptide: mutant residue, wherein residue positions are indicated according to EU numbering according to Kabat.

하나의 구현예에서, 항체는 아래의 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일하지만 Kabat 위치 234, 235 및 331(밑줄침)의 아미노산 잔기를 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:In one embodiment, the antibody is a heavy chain comprising the amino acid sequence below, or an amino acid sequence that is at least 90%, 95% or 99% identical thereto but retaining the amino acid residues at Kabat positions 234, 235 and 331 (underlined). Contains constant regions:

Figure 112018096971757-pct00005
Figure 112018096971757-pct00005

하나의 구현예에서, 항체는 아래의 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일하지만 Kabat 위치 234, 235 및 331(밑줄침)의 아미노산 잔기를 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:In one embodiment, the antibody is a heavy chain comprising the amino acid sequence below, or an amino acid sequence that is at least 90%, 95% or 99% identical thereto but retaining the amino acid residues at Kabat positions 234, 235 and 331 (underlined). Contains constant regions:

Figure 112018096971757-pct00006
Figure 112018096971757-pct00006

하나의 구현예에서, 항체는 아래의 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일하지만 Kabat 위치 234, 235, 237, 330 및 331(밑줄침)의 아미노산 잔기를 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:In one embodiment, the antibody has the following amino acid sequence, or an amino acid sequence that is at least 90%, 95% or 99% identical thereto but retains the amino acid residues at Kabat positions 234, 235, 237, 330 and 331 (underlined) a heavy chain constant region comprising:

Figure 112018096971757-pct00007
Figure 112018096971757-pct00007

하나의 구현예에서, 항체는 아래의 아미노산 서열, 또는 그와 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일하지만 Kabat 위치 234, 235, 237 및 331(밑줄침)의 아미노산 잔기를 보유하는 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다:In one embodiment, the antibody comprises the amino acid sequence below, or a sequence that is at least 90%, 95% or 99% identical thereto but retaining the amino acid residues at Kabat positions 234, 235, 237 and 331 (underlined) heavy chain constant region comprising:

Figure 112018096971757-pct00008
Figure 112018096971757-pct00008

Fc 무증상 항체는 ADCC 활성을 생성하지 않거나 적게 생성하여, Fc 무증상 항체가 50% 미만의 특이적 세포 용해인 ADCC 활성을 나타낸다. 바람직하게는 항체에는 실질적으로 ADCC 활성이 부재하며, 예컨대, Fc 무증상 항체는 5% 미만 또는 1% 미만인 ADCC 활성(특이적 세포 용해)을 나타낸다. Fc 무증상 항체는 또한 세포(예컨대 NK 세포, T 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식구)의 표면에서 Siglec-9 및/또는 Siglec-7의 FcγR-매개 가교의 부재를 일으킬 수 있다.The Fc asymptomatic antibody produces little or no ADCC activity, so that the asymptomatic Fc antibody exhibits ADCC activity of less than 50% specific cell lysis. Preferably the antibody is substantially free of ADCC activity, eg, an Fc asymptomatic antibody exhibits less than 5% or less than 1% ADCC activity (specific cell lysis). Fc asymptomatic antibodies may also result in the absence of FcγR-mediated crosslinking of Siglec-9 and/or Siglec-7 on the surface of cells (eg NK cells, T cells, monocytes, dendritic cells, macrophages).

하나의 구현예에서, 항체는 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, 330, 331 및 409로 구성되는 군으로부터 선택되는 임의의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 잔기에서 중쇄 불변 영역에 치환을 갖는다(중쇄 불변 영역에서 잔기의 넘버링은 Kabat에 따른 EU 넘버링을 따른다). 하나의 구현예에서, 항체는 잔기 234, 235 및 322에 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 잔기 234, 235 및 331에 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 잔기 234, 235, 237 및 331에 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, 항체는 잔기 234, 235, 237, 330 및 331에 치환을 포함한다. 하나의 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 서브타입의 도메인이다. 아미노산 잔기는 Kabat에 따른 EU 넘버링을 따라 나타낸다.In one embodiment, the antibody is 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, having substitutions in the heavy chain constant region at any 1, 2, 3, 4, 5 or more residues selected from the group consisting of 330, 331 and 409 (the numbering of residues in the heavy chain constant region is according to Kabat EU numbering follows). In one embodiment, the antibody comprises substitutions at residues 234, 235 and 322. In one embodiment, the antibody comprises substitutions at residues 234, 235 and 331. In one embodiment, the antibody comprises substitutions at residues 234, 235, 237 and 331. In one embodiment, the antibody comprises substitutions at residues 234, 235, 237, 330 and 331. In one embodiment, the Fc domain is a domain of a human IgG1 subtype. Amino acid residues are indicated according to EU numbering according to Kabat.

항체 CDR 서열Antibody CDR sequences

항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 및 mAb-F의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 표 B에 나타낸다. 특정 구현예에서, 모노클로날 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F와 본질적으로 동일한 에피토프 또는 결정기에 결합하는 항체가 제공되며; 선택적으로 항체는 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 고가변 영역을 포함한다. 본원에서 임의의 구현예에서, 항체 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F는 아미노산 서열 및/또는 이를 인코딩하는 핵산 서열을 특징으로 할 수 있다. 하나의 구현예에서, 모노클로날 항체는 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 VH 및/또는 VL, 또는 Fab 또는 F(ab')2 부분을 포함한다. 또한 mAb1의 중쇄 가변 영역을 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다. 하나의 구현예에 따르면, 모노클로날 항체는 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 중쇄 가변 영역의 3개 CDR을 포함한다. 또한 각각의 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 가변 경쇄 가변 영역, 또는 각각의 mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E 또는 mAb-F의 경쇄 가변 영역의 1개, 2개 또는 3개 CDR을 추가로 포함하는 모노클로날 항체가 제공된다. 선택적으로 임의의 하나 이상의 상기 경쇄 또는 중쇄 CDR은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 아미노산 변경(예컨대, 치환, 삽입 또는 결실)을 함유할 수 있다. 선택적으로, 항체 mAb1의 항원 결합 영역의 일부 또는 전부를 포함하는 임의의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역이 선택적으로 인간 불변 영역, 선택적으로 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형에 융합되고, 선택적으로는 추가로 효과기 기능(인간 Fcγ 수용체에 대한 결합)을 감소시키기 위한 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG 유형의 면역글로불린 불변 영역에 융합하는 항체가 제공된다.Heavy chains of antibodies mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E and mAb-F And the amino acid sequence of the light chain variable region is shown in Table B. In certain embodiments, monoclonal antibodies mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb Antibodies that bind to essentially the same epitope or determinant as -E or mAb-F are provided; Optionally the antibody is an antibody mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E or mAb -F contains the hypervariable region. In any of the embodiments herein, the antibody mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb -E or mAb-F may be characterized by an amino acid sequence and/or a nucleic acid sequence encoding it. In one embodiment, the monoclonal antibody is mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D , VH and/or VL of mAb-E or mAb-F, or Fab or F(ab′) 2 moieties. Also provided are monoclonal antibodies comprising the heavy chain variable region of mAbl. According to one embodiment, the monoclonal antibody is mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb- D, comprising the three CDRs of the heavy chain variable region of mAb-E or mAb-F. Also each of mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb-E or mAb-F the variable light chain variable region of, or each of mAb-1, mAb-2, mAb-3, mAb-4, mAb-5, mAb-6, mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D, mAb Monoclonal antibodies further comprising one, two or three CDRs of the light chain variable region of -E or mAb-F are provided. Optionally any one or more of said light or heavy chain CDRs may contain 1, 2, 3, 4, 5 or more amino acid alterations (eg, substitutions, insertions or deletions). Optionally, any light and/or heavy chain variable region comprising part or all of the antigen binding region of antibody mAbl is optionally fused to a human constant region, optionally a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype, optionally is further fused to an immunoglobulin constant region of the human IgG type comprising an amino acid substitution to reduce effector function (binding to human Fcγ receptor). Antibodies are provided.

또 다른 양태에서, 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 HCDR1 영역; 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 HCDR2 영역; 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 HCDR3 영역; 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 LCDR1 영역; 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 LCDR2 영역; 표 A-1에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb1의 LCDR3 영역을 포함하는 항체가 제공된다.In another embodiment, it comprises the amino acid sequence shown in Table A-1, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally one or more of these the HCDR1 region of mAbl, in which amino acids may be substituted by different amino acids; an amino acid sequence shown in Table A-1, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR2 region of mAbl which may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-1, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid HCDR3 region of mAbl which may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-1, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR1 region of mAb1 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-1, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR2 region of mAb1 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-1, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are deleted or different Antibodies comprising the LCDR3 region of mAbl which may be substituted by amino acids are provided.

[표 A-1][Table A-1]

Figure 112018096971757-pct00009
Figure 112018096971757-pct00009

또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 HCDR1 영역; 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 HCDR2 영역; 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 HCDR3 영역; 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 LCDR1 영역; 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 LCDR2 영역; 표 A-3에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb3의 LCDR3 영역을 포함한다.In another aspect, the invention provides an antibody, wherein the antibody comprises the amino acid sequence shown in Table A-3, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof the HCDR1 region of mAb3, optionally wherein one or more of these amino acids may be substituted by different amino acids; an amino acid sequence shown in Table A-3, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR2 region of mAb3 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-3, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR3 region of mAb3 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-3, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR1 region of mAb3 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-3, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR2 region of mAb3 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-3, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are deleted or different and the LCDR3 region of mAb3 which may be substituted by an amino acid.

[표 A-3][Table A-3]

Figure 112018096971757-pct00010
Figure 112018096971757-pct00010

또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 HCDR1 영역; 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 HCDR2 영역; 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 HCDR3 영역; 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 LCDR1 영역; 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 LCDR2 영역; 표 A-4에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb4의 LCDR3 영역을 포함한다.In another aspect, the invention provides an antibody, wherein the antibody comprises the amino acid sequence shown in Table A-4, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof the HCDR1 region of mAb4, optionally wherein one or more of these amino acids may be substituted by different amino acids; an amino acid sequence shown in Table A-4, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the HCDR2 region of mAb4 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-4, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the HCDR3 region of mAb4 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-4, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the LCDR1 region of mAb4 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-4, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the LCDR2 region of mAb4 that may be substituted by; the amino acid sequence shown in Table A-4, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are deleted or different and the LCDR3 region of mAb4 which may be substituted by an amino acid.

[표 A-4][Table A-4]

Figure 112018096971757-pct00011
Figure 112018096971757-pct00011

또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 HCDR1 영역; 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 HCDR2 영역; 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 HCDR3 영역; 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 LCDR1 영역; 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 LCDR2 영역; 표 A-5에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAb5의 LCDR3 영역을 포함한다.In another aspect, the invention provides an antibody, wherein the antibody comprises the amino acid sequence shown in Table A-5, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof the HCDR1 region of mAb5, wherein optionally one or more of these amino acids may be substituted by different amino acids; an amino acid sequence shown in Table A-5, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR2 region of mAb5 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-5, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR3 region of mAb5 that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-5, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR1 region of mAb5, which may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-5, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR2 region of mAb5 that may be substituted by; comprising the amino acid sequence shown in Table A-5, or the sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are deleted or different and the LCDR3 region of mAb5 which may be substituted by an amino acid.

[표 A-5][Table A-5]

Figure 112018096971757-pct00012
Figure 112018096971757-pct00012

또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 HCDR1 영역; 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 HCDR2 영역; 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 HCDR3 영역; 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 LCDR1 영역; 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 LCDR2 영역; 표 A-7에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbA의 LCDR3 영역을 포함한다.In another aspect, the invention provides an antibody, wherein the antibody comprises an amino acid sequence shown in Table A-7, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof an HCDR1 region of a mAbA, wherein optionally one or more of these amino acids may be substituted by different amino acids; an amino acid sequence shown in Tables A-7, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR2 region of mAbA that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-7, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR3 region of mAbA that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-7, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR1 region of mAbA that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-7, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR2 region of mAbA that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-7, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are deleted or different and the LCDR3 region of mAbA, which may be substituted by an amino acid.

[표 A-7][Table A-7]

Figure 112018096971757-pct00013
Figure 112018096971757-pct00013

또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbB의 HCDR1 영역; 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbB의 HCDR2 영역; 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbB의 HCDR3 영역; 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbB의 LCDR1 영역; 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbB의 LCDR2 영역; 표 A-8에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbB의 LCDR3 영역을 포함한다.In another aspect, the invention provides an antibody, wherein the antibody comprises an amino acid sequence shown in Table A-8, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof the HCDR1 region of a mAbB comprising the sequence of, optionally one or more of these amino acids may be substituted by different amino acids; an amino acid sequence shown in Table A-8, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR2 region of mAbB that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-8, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR3 region of mAbB that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-8, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR1 region of mAbB that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-8, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR2 region of mAbB that may be substituted by; the amino acid sequence shown in Table A-8, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are deleted or different and the LCDR3 region of mAbB which may be substituted by an amino acid.

[표 A-8][Table A-8]

Figure 112018096971757-pct00014
Figure 112018096971757-pct00014

또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 HCDR1 영역; 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 HCDR2 영역; 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 HCDR3 영역; 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 LCDR1 영역; 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 LCDR2 영역; 표 A-9에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbC의 LCDR3 영역을 포함한다.In another aspect, the invention provides an antibody, wherein the antibody comprises an amino acid sequence shown in Table A-9, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof an HCDR1 region of a mAbC, wherein optionally one or more of these amino acids may be substituted by different amino acids; an amino acid sequence shown in Table A-9, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR2 region of mAbC that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-9, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR3 region of mAbC that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-9, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR1 region of mAbC that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-9, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR2 region of mAbC that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Table A-9, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are deleted or different and the LCDR3 region of mAbC which may be substituted by an amino acid.

[표 A-9][Table A-9]

Figure 112018096971757-pct00015
Figure 112018096971757-pct00015

또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 HCDR1 영역; 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 HCDR2 영역; 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 HCDR3 영역; 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 LCDR1 영역; 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 LCDR2 영역; 표 A-10에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbD의 LCDR3 영역을 포함한다.In another aspect, the invention provides an antibody, wherein the antibody comprises an amino acid sequence shown in Table A-10, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof an HCDR1 region of a mAbD, wherein optionally one or more of these amino acids may be substituted by different amino acids; an amino acid sequence shown in Tables A-10, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the HCDR2 region of a mAbD that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-10, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the HCDR3 region of a mAbD that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-10, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the LCDR1 region of a mAbD that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-10, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids are linked to a different amino acid LCDR2 region of mAbD that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-10, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are deleted or different and the LCDR3 region of mAbD which may be substituted by an amino acid.

[표 A-10][Table A-10]

Figure 112018096971757-pct00016
Figure 112018096971757-pct00016

또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 HCDR1 영역; 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 HCDR2 영역; 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 HCDR3 영역; 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 LCDR1 영역; 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 LCDR2 영역; 표 A-11에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbE의 LCDR3 영역을 포함한다.In another aspect, the invention provides an antibody, wherein the antibody comprises an amino acid sequence shown in Tables A-11, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof an HCDR1 region of a mAbE, wherein optionally one or more of these amino acids may be substituted by different amino acids; an amino acid sequence shown in Tables A-11, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the HCDR2 region of mAbE that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-11, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the HCDR3 region of mAbE that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-11, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the LCDR1 region of mAbE that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-11, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids are linked to a different amino acid the LCDR2 region of mAbE that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-11, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are deleted or different and the LCDR3 region of mAbE, which may be substituted by an amino acid.

[표 A-11][Table A-11]

Figure 112018096971757-pct00017
Figure 112018096971757-pct00017

또 다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제공하며, 여기서 항체는 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 HCDR1 영역; 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 HCDR2 영역; 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 HCDR3 영역; 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 LCDR1 영역; 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 LCDR2 영역; 표 A-12에 나타낸 아미노산 서열, 또는 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열을 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 이들 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산에 의해 치환될 수 있는 mAbF의 LCDR3 영역을 포함한다.In another aspect, the invention provides an antibody, wherein the antibody comprises an amino acid sequence shown in Tables A-12, or at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof an HCDR1 region of a mAbF, wherein optionally one or more of these amino acids may be substituted by different amino acids; an amino acid sequence shown in Tables A-12, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR2 region of mAbF that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-12, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the HCDR3 region of mAbF that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-12, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR1 region of mAbF that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-12, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally wherein one or more of these amino acids is linked to a different amino acid the LCDR2 region of mAbF that may be substituted by; an amino acid sequence shown in Tables A-12, or a sequence of at least 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids thereof, optionally in which one or more of these amino acids are deleted or different and the LCDR3 region of mAbF, which may be substituted by an amino acid.

[표 A-12][Table A-12]

Figure 112018096971757-pct00018
Figure 112018096971757-pct00018

본원에서 임의의 구현예의 또 다른 양태에서, 임의의 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 LCDR1, LCDR2, LCDR3 서열은 선택적으로 모두(또는 각각, 독립적으로) Kabat 넘버링 시스템의 것들(각각의 CDR에 대해 표 A-1 내지 A-12에 나타냄), Chotia 넘버링 시스템의 것들(각각의 CDR에 대해 표 A-1 내지 A-12에 나타냄), IMGT 넘버링 시스템의 것들(각각의 CDR에 대해 표 A-1 내지 A-12에 나타냄), 또는 임의의 다른 적합한 넘버링 시스템의 것들로 특정될 수 있다.In another aspect of any of the embodiments herein, any HCDR1, HCDR2, HCDR3 and LCDR1, LCDR2, LCDR3 sequences are optionally all (or each, independently) those of the Kabat numbering system (Table A- for each CDR 1 to A-12), those from the Chotia numbering system (shown in Tables A-1 to A-12 for each CDR), those from the IMGT numbering system (Tables A-1 to A- for each CDR) 12), or any other suitable numbering system.

본원에서 임의의 구현예의 또 다른 양태에서, mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, mAbF, mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 또는 mAb6의 중쇄 및 경쇄의 임의의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 이의 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 인접한 아미노산의 서열, 및/또는 대응하는 SEQ ID NO에 기재된 특정 CDR 또는 CDR 세트와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.In another aspect of any of the embodiments herein, any CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy and light chains of mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, mAbF, mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 or mAb6 are at least 4 thereof a sequence of 5, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 contiguous amino acids, and/or at least 50%, 60%, 70% of a specific CDR or set of CDRs set forth in the corresponding SEQ ID NO; It can be characterized as having an amino acid sequence that shares 80%, 85%, 90% or 95% sequence identity.

본 발명의 임의의 항체, 예컨대, mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, mAbF, mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 또는 mAb6에서, 특정된 가변 영역 및 CDR 서열은 서열 변경, 예컨대, 치환(1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 서열 변경)을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3은 1개, 2개, 3개 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 치환된 잔기는 인간 기원의 서열에 존재하는 잔기이다. 하나의 구현예에서 치환은 보존적 변경이다. 보존적 서열 변경은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의미하게 영향을 미치거나 이를 변형하지 않는 아미노산 변경을 나타낸다. 이러한 보존적 변경에는 아미노산 치환, 부가 및 결실이 포함된다. 변경은 당분야에 공지된 표준 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이화 및 PCR-매개 돌연변이화에 의해 본 발명의 항체 내로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것들이다. 특정된 가변 영역 및 CDR 서열은 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 치환이 수행되는 경우, 바람직한 치환은 보존적 변경일 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리가 당분야에 정의되었다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 미하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 무극성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분기화 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변형된 항체는 본원에 기재되는 검정을 이용하여 보유된 기능(즉, 본원에 나타낸 특성)에 대해 평가될 수 있다.In any of the antibodies of the invention, e.g., mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, mAbF, mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 or mAb6, the specified variable region and CDR sequences are sequence alterations, such as substitutions (1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more sequence changes). In one embodiment, the CDR1, CDR2 and/or CDR3 of the heavy and light chains comprise 1, 2, 3 or more amino acid substitutions, wherein the substituted residues are residues present in a sequence of human origin. In one embodiment the substitution is a conservative alteration. Conservative sequence alterations refer to amino acid alterations that do not significantly affect or modify the binding characteristics of the antibody containing the amino acid sequence. Such conservative alterations include amino acid substitutions, additions and deletions. Alterations can be introduced into the antibodies of the invention by standard techniques known in the art, such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis. Conservative amino acid substitutions are typically those in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a side chain with similar physicochemical properties. The specified variable region and CDR sequences may contain 1, 2, 3, 4 or more amino acid insertions, deletions or substitutions. Where substitutions are made, preferred substitutions will be conservative alterations. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids with uncharged polar side chains (eg , glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan), amino acids with nonpolar side chains (such as alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine), amino acids with beta-branched side chains (such as threonine, valine, isoleucine) and Amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) are included. Thus, one or more amino acid residues within the CDR regions of an antibody of the invention can be replaced with other amino acid residues of the same side chain family and the modified antibody retains the function (i.e., the properties shown herein) using the assays described herein. can be evaluated for

IMGT, Kabat 및 Chothia 정의 시스템에 따른 CDR의 서열을 표 A-1 내지 A-12에 요약한다. 본 발명에 따른 항체의 가변 영역의 서열을 아래의 표 B에 기재한다. 본원에서 임의의 구현예에서, VL 또는 VH 서열은 신호 펩타이드 또는 이의 임의의 부분을 추가로 포함하거나 이것이 없도록 특정되거나 넘버링될 수 있다.The sequences of the CDRs according to the IMGT, Kabat and Chothia definition systems are summarized in Tables A-1 to A-12. The sequence of the variable region of the antibody according to the present invention is shown in Table B below. In any of the embodiments herein, the VL or VH sequence may be specified or numbered to further comprise or not further comprise a signal peptide or any portion thereof.

하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 이의 결합 및/또는 기능적 특성을 보유하는 항체 단편이다.In one embodiment, an antibody of the invention is an antibody fragment that retains its binding and/or functional properties.

[표 B][Table B]

Figure 112018096971757-pct00019
Figure 112018096971757-pct00019

항체 제형물antibody formulation

항-Siglec 항체는 1 mg/㎖ 내지 500 mg/㎖의 농도로 포함하는 약학 제형물에 포함될 수 있고, 여기서 상기 제형물은 2.0 내지 10.0의 pH를 갖는다. 제형물은 완충 시스템, 보존제(들), 등장화제(들), 킬레이트화제(들), 안정화제 및 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 약학 제형물은 수성 제형물, 즉 물을 포함하는 제형물이다. 이러한 제형물은 전형적으로 용액 또는 현탁액이다. 추가 구현예에서, 약학 제형물은 수용액이다. 용어 "수성 제형물"은 적어도 50%w/w 물을 포함하는 제형물로 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수용액"은 적어도 50%w/w 물을 포함하는 용액으로 정의되며, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50%w/w 물을 포함하는 현탁액으로 정의된다.The anti-Siglec antibody may be included in a pharmaceutical formulation comprising a concentration of 1 mg/ml to 500 mg/ml, wherein the formulation has a pH of 2.0 to 10.0. The formulation may further comprise a buffering system, preservative(s), isotonic agent(s), chelating agent(s), stabilizing agent and surfactant. In one embodiment, the pharmaceutical formulation is an aqueous formulation, ie a formulation comprising water. Such formulations are typically solutions or suspensions. In a further embodiment, the pharmaceutical formulation is an aqueous solution. The term "aqueous formulation" is defined as a formulation comprising at least 50% w/w water. Likewise, the term "aqueous solution" is defined as a solution comprising at least 50% w/w water, and the term "aqueous suspension" is defined as a suspension comprising at least 50% w/w water.

또 다른 구현예에서, 약학 제형물은 냉동 건조 제형물이며, 이용 전에 의사 또는 환자가 용매 및/또는 희석제를 여기에 첨가한다.In another embodiment, the pharmaceutical formulation is a freeze-dried formulation, to which a physician or patient adds a solvent and/or diluent prior to use.

또 다른 구현예에서, 약학 제형물은 임의의 사전 용해 없이 바로 이용할 수 있는 건조 제형물(예컨대, 냉동-건조되거나 분무-건조됨)이다.In another embodiment, the pharmaceutical formulation is a ready-to-use dry formulation (eg freeze-dried or spray-dried) without any prior dissolution.

추가 양태에서, 약학 제형물은 이러한 항체의 수용액 및 완충액을 포함하며, 여기서 항체는 1 mg/㎖ 이상의 농도로 존재하며, 상기 제형물은 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 갖는다.In a further embodiment, the pharmaceutical formulation comprises an aqueous solution of such antibody and a buffer, wherein the antibody is present at a concentration of at least 1 mg/ml, and wherein the formulation has a pH of from about 2.0 to about 10.0.

또 다른 구현예에서, 제형물의 pH는 약 2.0 내지 약 10.0, 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.5, 약 5.0 내지 약 8.0 및 약 5.5 내지 약 7.5로 구성된 목록으로부터 선택된 범위이다.In another embodiment, the pH of the formulation is in a range selected from the list consisting of about 2.0 to about 10.0, about 3.0 to about 9.0, about 4.0 to about 8.5, about 5.0 to about 8.0, and about 5.5 to about 7.5.

추가 구현예에서, 완충액은 아세트산 나트륨, 탄산 나트륨, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 라이신, 아르기닌, 인산 2수소 나트륨, 인산 수소 2나트륨, 인산 나트륨 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄, 바이신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 특정한 완충액 중 각각의 하나는 본 발명의 대안적 구현예를 구성한다.In a further embodiment, the buffer is sodium acetate, sodium carbonate, citrate, glycylglycine, histidine, glycine, lysine, arginine, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium phosphate and tris(hydroxymethyl)-aminomethane , bicine, tricine, malic acid, succinate, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, aspartic acid or mixtures thereof. Each one of these specific buffers constitutes an alternative embodiment of the present invention.

추가 구현예에서, 제형물은 약제학적으로 허용 가능한 보존제를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 제형물은 등장화제를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 제형물은 또한 킬레이트화제를 포함한다. 본 발명의 추가 구현예에서, 제형물은 안정화제를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 제형물은 계면활성제를 추가로 포함한다. 편의성을 위해, 문헌[Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995]을 참조한다.In a further embodiment, the formulation further comprises a pharmaceutically acceptable preservative. In a further embodiment, the formulation further comprises an isotonic agent. In a further embodiment, the formulation also comprises a chelating agent. In a further embodiment of the invention, the formulation further comprises a stabilizing agent. In a further embodiment, the formulation further comprises a surfactant. For convenience, see Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 19th edition, 1995.

다른 성분이 본 발명의 펩타이드 약학 제형물에 존재할 수 있음이 가능하다. 이러한 추가 성분에는 수화제, 유화제, 항산화제, 증량제, 등장성 개질제, 킬레이트화제, 금속 이온, 유성 비히클, 단백질(예로, 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쯔비터이온(예로, 아미노산, 예컨대 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 라이신 및 히스티딘)이 포함될 수 있다. 이러한 추가 성분은, 당연히 본 발명의 약학 제형물의 전반적 안정성에 부정적 영향을 미치지 않아야 한다.It is possible that other ingredients may be present in the peptide pharmaceutical formulations of the present invention. Such additional ingredients include wetting agents, emulsifying agents, antioxidants, bulking agents, tonicity modifiers, chelating agents, metal ions, oily vehicles, proteins (eg human serum albumin, gelatin or proteins) and zwitterions (eg amino acids such as betaine). , taurine, arginine, glycine, lysine and histidine). These additional ingredients, of course, should not adversely affect the overall stability of the pharmaceutical formulation of the present invention.

본 발명에 따른 항체를 함유하는 약학 조성물은 여러 부위에서, 예를 들어 국소 부위, 예를 들어 피부 및 점막 부위에서, 흡수를 우회하는 부위, 예를 들어 동맥 내, 정맥 내, 심장 내 투여에서 및 흡수가 관여되는 부위, 예를 들어 피부 내, 피부 하, 근육 내 또는 복부 내 투여에서 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여는 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 몇몇 투여 경로, 예를 들어, 피하, 근육내, 복강내, 정맥내, 혀, 설하, 볼, 입안, 경구, 위 및 장내, 비강, 폐, 예를 들어 세기관지 및 폐포 또는 이들의 조합을 통해, 표피, 피부, 경피, 질, 직장, 눈, 예를 들어 결막을 통해, 요관 및 비경구를 통할 수 있다.Pharmaceutical compositions containing the antibody according to the invention can be administered at several sites, for example at local sites, e.g. at skin and mucosal sites, at sites bypassing absorption, e.g. intra-arterial, intravenous, intracardiac administration and It can be administered to a patient in need of such treatment at sites involved in absorption, for example intradermal, subcutaneous, intramuscular or intraabdominal administration. Administration of the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered to a patient in need of such treatment by several routes of administration, for example, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, lingual, sublingual, buccal, buccal, oral, gastric and intestinal, Via the nasal, pulmonary, eg, bronchioles and alveoli or combinations thereof, epidermal, dermal, transdermal, vaginal, rectal, ocular, eg, via the conjunctiva, ureter, and parenteral.

적합한 항체 제형물은 또한 이미 개발된 다른 치료적 모노클로날 항체와의 경험을 조사하여 결정될 수 있다. 몇몇 모노클로날 항체는 임상적 상황에서 효율적인 것으로 나타났으며, 예컨대 리툭산(Rituxan)(리툭시맙(Rituximab), 허셉틴(Herceptin)(트라스투주맙(Trastuzumab)) 졸레어(Xolair)(오말리주맙(Omalizumab)), 벡사르(Bexxar)(토시투모맙(Tositumomab)), 캄파스(Campath)(알렘투주맙(Alemtuzumab)), 제바린(Zevalin), 온코림(Oncolym) 및 유사한 제형물이 본 발명의 항체와 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 9.0 mg/㎖ 염화 나트륨, 7.35 mg/㎖ 2수화 시트르산 나트륨, 0.7 mg/㎖ 폴리소르베이트 80 및 주이용 멸균수 중, IV 투여를 위해 제형화된 100 mg(10 mL) 또는 500 mg(50 mL) 단회-이용 바이알에서 10 mg/㎖ 농도로 공급될 수 있다. pH는 6.5로 조정된다. 또 다른 구현예에서, 항체는 약 20 mM Na-시트레이트, 약 150 mM NaCl, pH 약 6.0을 포함하는 제형물로 공급된다.Suitable antibody formulations can also be determined by examining experience with other therapeutic monoclonal antibodies that have already been developed. Several monoclonal antibodies have been shown to be effective in clinical settings, such as Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) Xolair (Omalizumab (Rituximab) Omalizumab)), Bexxar (Tositumomab), Campath (Alemtuzumab), Zevalin, Oncolym and similar formulations of the present invention For example, monoclonal antibody in 9.0 mg/ml sodium chloride, 7.35 mg/ml dihydrate sodium citrate, 0.7 mg/ml polysorbate 80 and sterile water for injection, IV 100 mg (10 mL) or 500 mg (50 mL) single-use vial formulated for administration can be supplied at 10 mg/mL concentration.The pH is adjusted to 6.5.In another embodiment, the antibody is about 20 mM Na-citrate, about 150 mM NaCl, pH about 6.0 Supplied as a formulation.

종양의 진단 및 치료Diagnosis and treatment of tumors

본원에 기재되는 항-Siglec 항체를 이용하는 개체, 특히 인간 환자의 치료 방법이 또한 제공된다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 인간 환자에 대한 투여를 위한 약학 조성물의 제조에서 본원에 기재되는 항체의 용도를 제공한다. 전형적으로, 환자는 암 또는 감염성 질병, 예컨대, 박테리아 또는 바이러스 질병을 앓거나, 이러한 위험에 처해 있다.Also provided are methods of treating a subject, particularly a human patient, using the anti-Siglec antibodies described herein. In one embodiment, the invention provides the use of an antibody described herein in the manufacture of a pharmaceutical composition for administration to a human patient. Typically, the patient suffers from, or is at risk of, cancer or an infectious disease, such as a bacterial or viral disease.

예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명은 Siglec-7 및/또는 Siglec-9-제한 면역 세포, 예컨대, 림프구의 활성 강화를 필요로 하는 환자에서 Siglec-7 및/또는 Siglec-9-제한 면역 세포, 예컨대, 림프구의 활성 강화 방법으로서, 상기 환자에 대한 중화 항-Siglec-7 및/또는 항-Siglec-9 항체의 투여 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 항체는, 예를 들어 인간 또는 인간화 항-Siglec-7 및/또는 Siglec-9 항체일 수 있으며, 이 항체는 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 수용체의 시알산-매개 활성화를 감소시키거나 예방한다. 하나의 구현예에서, 방법은 증가된 림프구(예컨대, NK 및/또는 CD8+ T 세포) 활성이 유익한 질병을 갖는 환자에서 이러한 림프구의 활성 증가에 대한 것이며, 이는 NK 또는 CD8+ T 세포에 의한 용해에 취약한 세포가 관여되거나, 이에 의해 영향받거나, 야기되고, 또는 불충분한 NK 또는 CD8+ T 세포 활성, 예컨대 암 또는 감염성 질병에 의해 야기하거나 이를 특징으로 한다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 본 발명은 Siglec-7 및/또는 Siglec-9-제한 면역 세포, 예를 들어 NK 세포(예컨대 CD56bright 세포), T 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식구(예컨대, 면역억제성 또는 M2 대식구)의 활성(예컨대 세포 활성화, 항-종양 면역성 또는 활성, 사이토카인 생산, 증식)의 증강을 필요로 하는 환자에서 Siglec-7 및/또는 Siglec-9-제한 면역 세포, 예를 들어 NK 세포(예컨대 CD56bright 세포), T 세포, 단핵구, 수지상 세포, 대식구(예컨대, 면역억제성 또는 M2 대식구)의 활성(예컨대 세포 활성화, 항-종양 면역성 또는 활성, 사이토카인 생산, 증식)의 증강 방법으로서, 상기 환자에게 본 개시의 중화 항-Siglec-7 및/또는 항-Siglec-9 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.For example, in one embodiment, the present invention provides Siglec-7 and/or Siglec-9-restricted immunity in a patient in need of enhancing the activity of Siglec-7 and/or Siglec-9-restricted immune cells, such as lymphocytes. Provided is a method for enhancing the activity of cells, such as lymphocytes, comprising administering to said patient a neutralizing anti-Siglec-7 and/or anti-Siglec-9 antibody. The antibody can be, for example, a human or humanized anti-Siglec-7 and/or Siglec-9 antibody, wherein the antibody reduces or prevents sialic acid-mediated activation of the Siglec-7 and/or Siglec-9 receptor. . In one embodiment, the method is for increasing the activity of lymphocytes (eg, NK and/or CD8+ T cells) in a patient having a disease in which the activity is beneficial, which is susceptible to lysis by NK or CD8+ T cells. The cells are involved, affected by, caused, or caused by or characterized by insufficient NK or CD8+ T cell activity, such as cancer or an infectious disease. For example, in one embodiment, the present invention relates to Siglec-7 and/or Siglec-9-restricted immune cells, such as NK cells (eg CD56 bright cells), T cells, monocytes, dendritic cells, macrophages (eg, Siglec-7 and/or Siglec-9-restricted immune cells in patients in need of enhancement of immunosuppressive or M2 macrophage) activity (eg cell activation, anti-tumor immunity or activity, cytokine production, proliferation), e.g. For example NK cells (eg CD56 bright cells), T cells, monocytes, dendritic cells, macrophages (eg immunosuppressive or M2 macrophages) activity (eg cell activation, anti-tumor immunity or activity, cytokine production, proliferation) Provided is a method comprising administering to said patient a neutralizing anti-Siglec-7 and/or anti-Siglec-9 antibody of the present disclosure.

하나의 구현예에서, 본 개시의 항체는 ST3GAL6 및/또는 ST3GAL1 효소의 발현(또는, 예컨대, 고수준의 ST3GAL6 및/또는 ST3GAL1 효소 활성), 선택적으로 ST3GAL6 효소의 과발현(예컨대, 건강한 조직에서, 건강한 개체에서의 발현 대비)을 특징으로 하는 종양의 치료에서 이용된다.In one embodiment, an antibody of the present disclosure comprises expression of ST3GAL6 and/or ST3GAL1 enzyme (eg, high levels of ST3GAL6 and/or ST3GAL1 enzyme activity), optionally overexpression of ST3GAL6 enzyme (eg, in healthy tissue, healthy subject). is used in the treatment of tumors characterized by the expression in

보다 구체적으로, 본원에서의 방법 및 조성물은 다양한 암 및 다른 증식성 질병의 치료를 위해 이용된다. 이들 방법은 림프구 상 억제 수용체의 차단을 통해 면역 반응을 증강시켜 작동하므로, 이들은 매우 광범위한 암에 적용 가능하다. 하나의 구현예에서, 본 개시의 항-Siglec 항체로 치료받는 인간 환자는 간암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암(예컨대 HNSCC), 유방암, 폐암, 비-소세포 폐암(NSCLC), 제거 내성 전립선암(CRPC), 흑색종, 자궁암, 결장암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 정소암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 비-호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계의 암, 갑상샘암, 부갑상샘암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 소아기 고형 종양, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 요관암, 신우 암종, 중추 신경계(CNS) 종양, 일차 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척추 축 종양, 뇌 줄기 교종, 뇌하수체 샘종, 카포시 육종, 표피모양 암, 편평상피세포암, 석면증에 의해 유도된 것을 포함하는 환경 유도된 암, 혈액 종양, 예를 들어, 다발성 골수종, B-세포 림프종, 호지킨 림프종/일차 종격 B-세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 급성 골수구 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 소포 림프종, 광범위 큰 B-세포 림프종, 버키트 림프종, 면역모구 큰 세포 림프종, 전구체 B-림프모구 림프종, 맨틀 세포 림프종, 급성 림프모구 백혈병, 균상 식육종, 무형성 큰 세포 림프종, T-세포 림프종, 및 전구체 T-림프모구 림프종, 및 상기 암의 임의의 조합을 갖는다. 본 발명은 또한 전이암의 치료에 적용 가능하다. 환자는 치료 이전, 동안 또는 이후 하나 이상의 상술되는 임상 속성에 대해 평가되거나 선택될 수 있다.More specifically, the methods and compositions herein are used for the treatment of a variety of cancers and other proliferative diseases. Since these methods work by enhancing the immune response through blockade of inhibitory receptors on lymphocytes, they are applicable to a very wide range of cancers. In one embodiment, the human patient treated with an anti-Siglec antibody of the present disclosure is liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer (such as HNSCC), breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer (NSCLC), removal resistant prostate Cancer (CRPC), melanoma, uterine cancer, colon cancer, rectal cancer, cancer of the anal area, stomach cancer, testicular cancer, uterine cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, non-Hodgkin's lymphoma, esophageal cancer , small intestine cancer, cancer of the endocrine system, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, childhood solid tumor, lymphocyte lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) Tumor, primary CNS lymphoma, tumor angiogenesis, spinal axis tumor, brain stem glioma, pituitary adenoma, Kaposi's sarcoma, epidermal cancer, squamous cell carcinoma, environmental induced cancer including those induced by asbestos, hematological tumors, For example, multiple myeloma, B-cell lymphoma, Hodgkin's lymphoma/primary mediastinal B-cell lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, acute myeloid lymphoma, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, follicular lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, immunoblastic large cell lymphoma, precursor B-lymphoblastic lymphoma, mantle cell lymphoma, acute lymphoblastic leukemia, mycosis fungoides, aplastic large cell lymphoma, T-cell lymphoma, and precursor T-lymphoblastic lymphoma, and any combination of the above cancers. The present invention is also applicable to the treatment of metastatic cancer. A patient may be assessed or selected for one or more of the specified clinical attributes prior to, during or after treatment.

항-Siglec 항체 기반 치료는 또한 바람직하게는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 곰팡이 또는 진균에 의한 감염에 의해 야기되는 임의의 감염을 포함하는, 감염성 질병을 치료하거나 예방하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 바이러스 감염성 유기체에는 비제한적으로 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 독감, 바리셀라, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 1형(HSV-1), 단순 헤르페스 2형(HSV-2), 우역, 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 융합 바이러스, 유두종 바이러스, 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 에키노바이러스, 아르보바이러스, 헌타바이러스, 콕사키 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 소아마비 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 1형 또는 2형(HIV-1, HIV-2)이 포함된다. 박테리아는 비제한적으로 다음을 포함하는, 또 다른 바람직한 감염성 유기체 클래스를 구성한다: 스타필로코커스(Staphylococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus), 예컨대 S. 피오게네스(pyogenes); 엔테로코커스(Enterococci); 바실러스(Bacillus), 예컨대 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 및 락토바실러스(Lactobacillus); 리스테리아(Listeria); 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae); 가드네렐라, 예컨대 G. 바지날리스(vaginalis); 노카디아(Nocardia); 스트렙토마이세스(Streptomyces); 써모액티노마이세스 불가리스(Thermoactinomyces vulgaris); 트레포네르나(Treponerna); 캄필로박터(Camplyobacter), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 P. 애루기노사(aeruginosa); 레지오넬라(Legionella); 나이세리아(Neisseria), 예컨대 N. 고노로애(gonorrhoeae) 및 N. 메닌지티데스(meningitides); 플라보박테리움, 예컨대 F. 메닌고셉티쿰(meningosepticum) 및 F. 오도라턴(odoraturn); 브루셀라(Brucella); 보르데텔라(Bordetella), 예컨대 B. 퍼투시스(pertussis) 및 B. 브론키셉티카(bronchiseptica); 에스체리키아(Escherichia), 예컨대 E. 콜라이(coli), 클렙시엘라(Klebsiella); 엔테로박터(Enterobacter), 세라티아(Serratia), 예컨대 S. 마르센스(marcescens) 및 S. 리퀘파시엔스(liquefaciens); 에드워드시엘라(Edwardsiella); 프로테우스(Proteus), 예컨대 P. 미라빌리스(mirabilis) 및 P. 불가리스(vulgaris); 스트렙토바실러스(Streptobacillus); 리케차세애(Rickettsiaceae), 예컨대 R. 피케츠피(fickettsfi), 클라미디아(Chlamydia), 예컨대 C. 시타치(psittaci) 및 C. 트라코나티스(trachornatis); 미코박테리움(Mycobacterium), 예컨대 M. 투베르쿨로시스(tuberculosis), M. 인트라셀룰라레(intracellulare), M. 폴루이턴(folluiturn), M. 라프래(laprae), M. 애비움(avium), M. 보비스(bovis), M. 아프리카넘(africanum), M. 칸사시이(kansasii), M. 인트라셀룰라레(intracellulare), 및 M. 레프래누리움(lepraernurium); 및 노카디아(Nocardia). 원생동물에는 비제한적으로 레이슈마니아(leishmania), 콕지디오아(kokzidioa), 및 트립파노소마(trypanosoma)가 포함될 수 있다. 기생충에는 비제한적으로 클라미디아(chlamydia) 및 리케차(rickettsia)가 포함된다.Anti-Siglec antibody based therapies may also be used to treat or prevent infectious diseases, including any infection, preferably caused by infection by a virus, bacteria, protozoa, fungus or fungus. Such virally infectious organisms include, but are not limited to, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, flu, varicella, adenovirus, herpes simplex type 1 (HSV-1), herpes simplex type 2 (HSV-2), ox, Rhinovirus, echovirus, rotavirus, respiratory syncytial virus, papillomavirus, papillomavirus, cytomegalovirus, echinovirus, arbovirus, huntavirus, coxsackie virus, mumps virus, measles virus, rubella virus, poliovirus and human Immunodeficiency virus types 1 or 2 (HIV-1, HIV-2) are included. Bacteria constitute another preferred class of infectious organisms including, but not limited to: Staphylococcus; Streptococcus, such as S. pyogenes ; Enterococci; Bacillus, such as Bacillus anthracis , and Lactobacillus; Listeria; Corynebacterium diphtheriae ; Gardnerella, such as G. vaginalis ; Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris ; Treponerna; Camplyobacter, Pseudomonas, such as P. aeruginosa ; Legionella; Neisseria, such as N. gonorrhoeae and N. meningitides ; Flavobacterium, such as F. meningosepticum and F. odoraturn ; Brucella; Bordetella, such as B. pertussis and B. bronchiseptica ; Escherichia, such as E. coli , Klebsiella; Enterobacter, Serratia, such as S. marcescens and S. liquefaciens ; Edwardsiella; Proteus, such as P. mirabilis and P. vulgaris ; Streptobacillus (Streptobacillus); Rickettsiaceae, such as R. pickettsfi , Chlamydia, such as C. psittaci and C. trachornatis ; Mycobacterium, such as M. tuberculosis , M. intracellulare, M. folluiturn, M. laprae, M. avium ), M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracellulare, and M. lepraernurium ; and Nocardia. Protozoa may include, but are not limited to, leishmania, kokzidioa, and trypanosoma. Parasites include, but are not limited to, chlamydia and rickettsia.

항체 조성물은 개체에 의해 발현되는 대립유전자에서 Siglec-9(SEQ ID NO: 2 참조)의 위치 100 또는 Siglec-7(SEQ ID NO: 1 참조)의 위치 104에 존재하는 잔기와 무관하게 개체를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 위치 100에 라이신을 보유하는 Siglec-9(예컨대 SEQ ID NO: 2)는 집단의 약 49%를 나타내는 반면) 위치 100에 글루탐산을 보유하는 Siglec-9(예컨대 SEQ ID NO: 160)는 집단의 약 36%를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 항체 조성물은 Siglec-9(SEQ ID NO: 2 참조)의 위치 100에 라이신을 갖는 개체 및 Siglec-9의 위치 100에 글루탐산을 갖는 개체를 치료하기 위해 이용된다. 하나의 구현예에서, 그 세포(예컨대 NK 세포, 호중구 등)가 Siglec-9(SEQ ID NO: 2 참조)의 위치 100에 라이신을 발현하는 개체 및 그 세포가 Siglec-9의 위치 100에 글루탐산을 발현하는 개체를 치료하기 위해 동일한 투여 요법이 이용된다. 하나의 구현예에서, 투여 요법은 개체에서 발현되는 특정 MICA 대립유전자와 무관하게, 동일한 투여 방식, 동일한 투여량 및 동일한 투여 빈도를 포함한다.The antibody composition treats the subject irrespective of the residue present at position 100 of Siglec-9 (see SEQ ID NO: 2) or position 104 of Siglec-7 (see SEQ ID NO: 1) in the allele expressed by the subject. can be used to Siglec-9 having a lysine at position 100 (eg SEQ ID NO: 2) represents about 49% of the population, whereas Siglec-9 having a glutamic acid at position 100 (eg SEQ ID NO: 160) represents about 49% of the population. represents 36%. In one embodiment, the antibody composition is used to treat a subject having a lysine at position 100 of Siglec-9 (see SEQ ID NO: 2) and a subject having a glutamic acid at position 100 of Siglec-9. In one embodiment, an individual wherein the cell (eg, NK cell, neutrophil, etc.) expresses a lysine at position 100 of Siglec-9 (see SEQ ID NO: 2) and the cell expresses a glutamic acid at position 100 of Siglec-9 The same dosing regimen is used to treat the expressing subject. In one embodiment, the dosing regimen comprises the same mode of administration, the same dosage and the same frequency of administration, irrespective of the particular MICA allele expressed in the subject.

항체 조성물은 단독치료법 또는 보통 항체가 투여되는 특정 치료 목적을 위해 이용되는 제제를 포함하는 하나 이상의 다른 치료제와의 조합 치료로서 이용될 수 있다. 추가적인 치료제는 보통 전형적으로 치료받는 특정 질병 또는 병태에 대한 단독치료법에서 그 제제에 대해 이용되는 양 및 치료 요법으로 투여될 것이다. 이러한 치료제에는 비제한적으로 항암제 및 화학치료제가 포함된다. Antibody compositions can be used as monotherapy or as combination therapy with one or more other therapeutic agents, including agents used for the particular therapeutic purpose for which the antibody is usually administered. The additional therapeutic agent will usually be administered in the amount and treatment regimen typically employed for that agent in monotherapy for the particular disease or condition being treated. Such therapeutic agents include, but are not limited to, anti-cancer agents and chemotherapeutic agents.

하나의 구현예에서, 항-Siglec-9 및/또는 항-Siglec-7 중화 항체는 인간 CD16에 대한 결합이 부재하지만 CD16-발현 효과기 세포(예컨대 NK 또는 효과기 T 세포)의 활성을 강화한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 제2 또는 추가적인 제2 치료제는, 예컨대 NK 세포에 의해 발현되는 CD16을 통해 결합되는 세포에 대해 ADCC를 유도할 수 있는 항체 또는 다른 Fc 도메인-함유 단백질이다. 전형적으로, 이러한 항체 또는 다른 단백질은 관심 항원, 예컨대 종양 세포 상에 존재하는 항원(종양 항원)에 결합하는 도메인, 및 Fc 도메인 또는 이의 일부를 포함할 것이며, 항원 결합 도메인을 통해 항원으로 및 Fc 도메인을 통해 Fcγ 수용체(예컨대 CD16)로의 결합을 나타낼 것이다. 하나의 구현예에서, 그 ADCC 활성은 적어도 부분적으로 CD16에 의해 매개될 것이다. 하나의 구현예에서, 추가적인 치료제는 원상태 또는 변경된 인간 Fc 도메인, 예를 들어 인간 IgG1 또는 IgG3 항체로부터의 Fc 도메인을 갖는 항체이다. 용어 "항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 당분야에서 널리 이해되는 용어이며, Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비-특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 나타낸다. ADCC를 매개하는 비-특이적 세포독성 세포에는 자연 살해(NK) 세포, 대식구, 단핵구, 호중구, 및 호산구가 포함된다. 용어 "ADCC-유도 항체"는 당업자에게 공지된 검정(들)에 의해 측정되는 ADCC를 실증하는 항체를 나타낸다. 이러한 활성은 전형적으로 Fc 영역의 다양한 FcR과의 결합을 특징으로 한다. 임의의 특정 기전에 의해 제한되지 않고, 당업자는 항체가 ADCC를 실증하는 능력이, 예를 들어, 그 서브클래스(예컨대 lgG1 또는 lgG3)에 의해, Fc 영역 내로 도입된 돌연변이에 의해, 또는 항체의 Fc 영역내 탄수화물 패턴에 대한 변경에 의해서일 수 있음을 인식할 것이다. ADCC를 유도하는 항체의 예에는 리툭시맙(림프종, CLL의 치료를 위해, 트라스투주맙(유방암의 치료를 위해), 알렘투주맙(만성 림프구 백혈병의 치료를 위해) 및 세툭시맙(결장직장암, 두부 및 경부 편평상피세포 암종의 치료를 위해)이 포함된다. ADCC-증강 항체의 예에는 비제한적으로 GA-101(저푸코실화 항-CD20), 마게툭시맙(Fc 증강 항-HER2), 메폴리주맙, MEDI-551(Fc 조작 항-CD19), 오비누투주맙(당-조작/저푸코실화 항-CD20), 오카라투주맙(Fc 조작 항-CD20), XmAb®5574/MOR208(Fc 조작 항-CD19)이 포함된다.In one embodiment, the anti-Siglec-9 and/or anti-Siglec-7 neutralizing antibody lacks binding to human CD16 but potentiates the activity of CD16-expressing effector cells (eg NK or effector T cells). Thus, in one embodiment, the second or additional second therapeutic agent is an antibody or other Fc domain-containing protein capable of inducing ADCC against cells bound, eg, via CD16 expressed by NK cells. Typically, such an antibody or other protein will comprise a domain that binds an antigen of interest, such as an antigen present on a tumor cell (tumor antigen), and an Fc domain, or a portion thereof, to the antigen via the antigen binding domain and to the Fc domain. binding to Fcγ receptors (eg CD16). In one embodiment, its ADCC activity will be mediated at least in part by CD16. In one embodiment, the additional therapeutic agent is an antibody having a native or altered human Fc domain, eg, an Fc domain from a human IgG1 or IgG3 antibody. The term “antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity” or “ADCC” is a term well understood in the art, wherein non-specific cytotoxic cells expressing Fc receptors (FcRs) recognize bound antibodies on target cells and A cell-mediated response is then shown that results in lysis of the target cell. Non-specific cytotoxic cells that mediate ADCC include natural killer (NK) cells, macrophages, monocytes, neutrophils, and eosinophils. The term “ADCC-inducing antibody” refers to an antibody that demonstrates ADCC as measured by assay(s) known to those skilled in the art. Such activity is typically characterized by the binding of the Fc region to various FcRs. Without being limited by any particular mechanism, one of ordinary skill in the art would appreciate that the ability of an antibody to demonstrate ADCC is determined, for example, by its subclass (eg, lgG1 or lgG3), by mutations introduced into the Fc region, or the Fc of the antibody. It will be appreciated that this may be due to alterations to the carbohydrate pattern within the region. Examples of antibodies that induce ADCC include rituximab (for the treatment of lymphoma, CLL, trastuzumab (for the treatment of breast cancer), alemtuzumab (for the treatment of chronic lymphocytic leukemia) and cetuximab (for the treatment of colorectal cancer). , for the treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck) Examples of ADCC-enhancing antibodies include, but are not limited to, GA-101 (low fucosylated anti-CD20), magetuximab (Fc enhancing anti-HER2). , mepolizumab, MEDI-551 (Fc engineered anti-CD19), obinutuzumab (sugar-engineered/hypofucosylated anti-CD20), okaratuzumab (Fc engineered anti-CD20), XmAb ® 5574/MOR208 (Fc engineered anti-CD19).

하나의 구현예에서, 항-Siglec-9 및/또는 항-Siglec-7 중화 항체는 특히 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 제제로의 치료에 대해 불량한 반응체인(또는 감수성이 아닌) 개체에서, 예컨대 PD-1 및 PD-L1 간 상호작용을 억제하는, 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 제제의 효능을 강화한다. 항-Siglec-9 및/또는 항-Siglec-7 중화 항체는 PD-1-발현 효과기 세포(예컨대 NK 또는 효과기 T 세포, 예컨대 Siglec-9 발현 NK 세포)의 활성을 강화하기 유용할 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 제2 또는 추가적인 제2 치료제는 인간 PD-1의 억제 활성을 중화시키는 항체 또는 다른 제제이다.In one embodiment, the anti-Siglec-9 and/or anti-Siglec-7 neutralizing antibody is particularly effective in individuals who are poor responders (or not susceptible) to treatment with agents that neutralize the inhibitory activity of human PD-1. enhance the efficacy of agents that neutralize the inhibitory activity of human PD-1, such as inhibiting the interaction between PD-1 and PD-L1. Anti-Siglec-9 and/or anti-Siglec-7 neutralizing antibodies may be useful for enhancing the activity of PD-1-expressing effector cells (eg, NK or effector T cells, such as Siglec-9 expressing NK cells). Thus, in one embodiment, the second or additional second therapeutic agent is an antibody or other agent that neutralizes the inhibitory activity of human PD-1.

Programmed Death 1(PD-1)(또한 "Programmed Cell Death 1"로 나타냄)은 수용체의 CD28 패밀리의 억제 구성원이다. 전체 인간 PD-1 서열은 GenBank 접근 번호 U64863 하에 확인될 수 있다. PD-1의 억제 활성의 억제 또는 중화에는 PD-L1-유도 PD-1 신호전달을 방지하는 폴리펩타이드 제제(예컨대, 항체, Fc 도메인에 융합된 폴리펩타이드, 면역어드헤신 등)의 이용이 관여될 수 있다. 시판되거나 임상 평가 중인, PD-1/PD-L1 경로를 차단하는 적어도 6개 제제가 현재 존재한다. 한 제제는 BMS-936558(니볼루맙(Nivolumab)/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; 예전 MDX-1106)이다. 니볼루맙(상표명 Opdivo®)은 PD-1 및 CD80 둘 다에 대한 PD-L1 리간드의 결합을 억제하는 FDA-승인받은 완전 인간 IgG4 항-PD-L1 mAb이며 그 개시가 본원에 참조로 포함되는, WO 2006/121168에서 항체 5C4로 기재된다. 흑색종 환자에 있어서, 가장 유의미한 OR은 3 ㎎/㎏의 용량에서 관찰된 반면, 다른 암 유형에 있어서는 10 ㎎/㎏이었다. 니볼루맙은 일반적으로 암 진행 전까지 3주마다 10 ㎎/㎏으로 투여된다. 용어 "인간 PD-1의 억제 활성을 감소시킨다", "PD-1을 중화시킨다" 또는 "인간 PD-1의 억제 활성을 중화시킨다"는 PD-1이 PD-1과 하나 이상의 그 결합 파트너, 예컨대 PD-L1 또는 PD-L2와의 상호작용으로 생성되는 그 신호 전달능에서 억제되는 공정을 나타낸다. PD-1의 억제 활성을 중화시키는 제제는 PD-1과 하나 이상의 그 결합 파트너, 예컨대 PD-L1, PD-L2와의 상호작용으로 생성되는 신호 전달을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 폐지하거나, 방해한다. 이에 의해 이러한 제제는 T-세포 효과기 기능, 예컨대 증식, 사이토카인 생산 및/또는 세포독성을 증강시키기 위해, T 림프구 상에 발현되는 세포 표면 단백질에 의해 또는 이를 통해 매개되는 부정적 공동-자극 신호를 감소시킬 수 있다.Programmed Death 1 (PD-1) (also referred to as "Programmed Cell Death 1") is an inhibitory member of the CD28 family of receptors. The full human PD-1 sequence can be identified under GenBank Accession No. U64863. Inhibition or neutralization of the inhibitory activity of PD-1 may involve the use of a polypeptide agent (eg, an antibody, a polypeptide fused to an Fc domain, an immunoadhesin, etc.) that prevents PD-L1-induced PD-1 signaling. can There are currently at least six agents that block the PD-1/PD-L1 pathway, either on the market or in clinical evaluation. One agent is BMS-936558 (Nivolumab/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; formerly MDX-1106). Nivolumab (trade name Opdivo®) is an FDA-approved fully human IgG4 anti-PD-L1 mAb that inhibits binding of PD-L1 ligand to both PD-1 and CD80, the disclosure of which is incorporated herein by reference; It is described as antibody 5C4 in WO 2006/121168. For melanoma patients, the most significant OR was observed at a dose of 3 mg/kg, while for other cancer types it was 10 mg/kg. Nivolumab is usually administered at 10 mg/kg every 3 weeks until cancer progression. The term "reduces the inhibitory activity of human PD-1", "neutralizes PD-1" or "neutralizes the inhibitory activity of human PD-1" means that PD-1 comprises PD-1 and one or more binding partners thereof; For example, it represents a process that is inhibited in its signal transduction ability resulting from an interaction with PD-L1 or PD-L2. Agents that neutralize the inhibitory activity of PD-1 may reduce, block, inhibit, abrogate, or reduce signal transduction resulting from the interaction of PD-1 with one or more of its binding partners, such as PD-L1, PD-L2, or , interfere with These agents thereby reduce negative co-stimulatory signals mediated by or through cell surface proteins expressed on T lymphocytes to enhance T-cell effector functions, such as proliferation, cytokine production and/or cytotoxicity. can do it

람브롤리주맙 또는 펨브롤리주맙(상표명 Keytruda®)으로도 나타내는 MK-3475(인간 IgG4 항-PD1 mAb, Merck)는 흑색종의 치료를 위해 FDA에 의해 승인받았으며, 다른 암에서 평가되고 있다. 펨브롤리주맙은 질병 진행 전까지 2주 또는 3주마다 2 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏으로 평가되었다. 인간화 항체 h409의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA 구축물. 모두 미국 타입 배양 수집 특허 기탁처(American Type Culture Collection Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA)에 기탁되었다. h409A-l 1의 중쇄를 인코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드는 2008년 6월 9일에 기탁되었고 081469_SPD-H로 확인되었으며, h409Al 1의 경쇄를 인코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드는 2008년 6월 9일에 기탁되었고 0801470_SPD-L-l 1로 확인되었다. Merck 3745 또는 SCH-900475로도 알려져 있는 MK-3475도 WO2009/114335에 기재되어 있다.MK-3475 (human IgG4 anti-PD1 mAb, Merck), also referred to as lambrolizumab or pembrolizumab (trade name Keytruda®), has been approved by the FDA for the treatment of melanoma and is being evaluated in other cancers. Pembrolizumab was assessed at 2 mg/kg or 10 mg/kg every 2 or 3 weeks until disease progression. DNA constructs encoding the variable regions of the heavy and light chains of humanized antibody h409. All were deposited with the American Type Culture Collection Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA. The plasmid containing the DNA encoding the heavy chain of h409A-1 1 was deposited on June 9, 2008 and identified as 081469_SPD-H, the plasmid containing the DNA encoding the light chain of h409A-1 1 was deposited on June 9, 2008 has been deposited and identified as 0801470_SPD-L-1 1. MK-3475, also known as Merck 3745 or SCH-900475, is also described in WO2009/114335.

MPDL3280A/RG7446(항-PD-L1, Roche/Genentech)은 FcγR 결합 및 결과적인 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 최소화함으로써 유효성 및 안전성을 최적화하도록 설계된 조작된 Fc 도메인을 함유하는 인간 항-PD-L1 mAb이다. 1 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 15 ㎎/㎏, 및 25 ㎎/㎏ 이상 용량의 MPDL3280A를 최대 1년 동안 3주마다 투여하였다. 3상 시험에서, MPDL3280A 1200 mg을 NSCLC에서 3주마다 정맥내 주입에 의해 투여한다.MPDL3280A/RG7446 (anti-PD-L1, Roche/Genentech) is a human anti-containing engineered Fc domain designed to optimize efficacy and safety by minimizing FcγR binding and consequent antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). PD-L1 mAb. Doses of 1 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, and 25 mg/kg or more of MPDL3280A were administered every 3 weeks for up to 1 year. In a phase 3 trial, 1200 mg of MPDL3280A is administered by intravenous infusion every 3 weeks in NSCLC.

AMP-224(Amplimmune 및 GSK)는 Fc 도메인에 융합된 PD-L2 세포외 도메인을 포함하는 면역어드헤신이다. PD-1을 중화시키는 제제의 다른 예에는 PD-L2에 결합하고(항-PD-L2 항체) PD-1 및 PD-L2 간 상호작용을 차단하는 항체가 포함될 수 있다.AMP-224 (Amplimmune and GSK) is an immunoadhesin comprising a PD-L2 extracellular domain fused to an Fc domain. Other examples of agents that neutralize PD-1 may include antibodies that bind to PD-L2 (anti-PD-L2 antibodies) and block the interaction between PD-1 and PD-L2.

피들리주맙(Pidlizumab, CT-011; CureTech)(인간화 IgG1 항-PD1 mAb, CureTech/Teva), 피들리주맙(CT-011; CureTech)(예컨대, WO2009/101611 참고)은 또 다른 예이다; 제제를 30명의 리툭시맙-감수성 재발 FL을 갖는 환자에서 평가하였고 CT-011의 최초 주입 2주 후부터 시작하여, 4주 동안 매주 375 ㎎/㎡으로 투여되는 리툭시맙과의 조합으로 4회 주입 동안 4주마다 3 ㎎/㎏의 정맥내 CT-011로 치료하였다.Pidlizumab (CT-011; CureTech) (humanized IgG1 anti-PD1 mAb, CureTech/Teva), Fidlizumab (CT-011; CureTech) (see, eg, WO2009/101611) are another example; The formulation was evaluated in 30 patients with rituximab-sensitive relapsed FL and starting 2 weeks after the first injection of CT-011, 4 infusions in combination with rituximab administered at 375 mg/m 2 weekly for 4 weeks. was treated with intravenous CT-011 at 3 mg/kg every 4 weeks during

추가의 공지된 PD-1 항체 및 다른 PD-1 억제제에는 AMP-224(GSK에 라이센싱된 B7-DC/IgG1 융합 단백질), WO 2012/145493에 기재된 AMP-514, WO2011/066389 및 US2013/034559에 기재된 항체 MEDI-4736(AstraZeneca/Medimmune에 의해 개발된 항-PD-L1), WO2010/077634에 기재된 항체 YW243.55.S70(항-PD-L1), WO2007/005874에 기재된 Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된 항-PD-L1 항체로, BMS-936559로도 알려져 있는 MDX-1105, 및 WO2006/121168, WO2009/014708, WO2009/114335 및 WO2013/019906에 기재된 항체 및 억제제가 포함되며, 그 개시가 본원에 참조로 포함된다. 항-PD1 항체의 추가 예는, 예를 들어 각각 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 및/또는 SEQ ID NO: 8의 경쇄 가변 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 각각 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 항체 중쇄 가변 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는 항체가 WO2015/085847(Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.)에 개시되어 있으며, 여기서 SEQ ID NO 언급은 WO2015/085847에 따른 넘버링이며, 그 개시가 본원에 참조로 포함된다. PD-1 또는 PD-L1로의 결합에 대해 임의의 이러한 항체와 경쟁하는 항체가 또한 이용될 수 있다.Additional known PD-1 antibodies and other PD-1 inhibitors include AMP-224 (a B7-DC/IgG1 fusion protein licensed to GSK), AMP-514 described in WO 2012/145493, WO2011/066389 and US2013/034559 Antibody MEDI-4736 as described (anti-PD-L1 developed by AstraZeneca/Medimmune), antibody YW243.55.S70 described in WO2010/077634 (anti-PD-L1), by Bristol-Myers Squibb described in WO2007/005874 Anti-PD-L1 antibodies developed include MDX-1105, also known as BMS-936559, and the antibodies and inhibitors described in WO2006/121168, WO2009/014708, WO2009/114335 and WO2013/019906, the disclosure of which is herein incorporated by reference. Further examples of anti-PD1 antibodies include, for example, the light chain variable domains CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and/or SEQ ID NO: 8, respectively, and SEQ ID NO: 3, respectively, Antibodies having antibody heavy chain variable domains CDR1, CDR2 and CDR3 of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 are disclosed in WO2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.), wherein reference to SEQ ID NO: numbering according to 085847, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Antibodies that compete with any such antibody for binding to PD-1 or PD-L1 may also be used.

예시적인 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙이다(예컨대, 그 개시가 본원에 참조로 포함되는 WO 2009/114335 참고). 항-PD-1 항체는 ATCC에 081469_SPD-H로 기탁된 DNA에 의해 인코딩되는 중쇄 가변 영역 및 ATCC에 0801470_SPD-L-l 1로 기탁된 DNA에 의해 인코딩되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, WO 2008/156712의 항체 h409Al 1일 수 있다. 다른 구현예에서, 항체는 펨브롤리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역을 포함한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 항체는 ATCC에 081469_SPD-H로 기탁된 DNA에 의해 인코딩되는 펨브롤리주맙의 VH의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인, 및 ATCC에 0801470_SPD-L-l 1로 기탁된 DNA에 의해 인코딩되는 펨브롤리주맙의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.An exemplary anti-PD-1 antibody is pembrolizumab (see, eg, WO 2009/114335, the disclosure of which is incorporated herein by reference). The anti-PD-1 antibody is disclosed in WO 2008/156712, comprising a heavy chain variable region encoded by the DNA deposited with the ATCC as 081469_SPD-H and a light chain variable region encoded by the DNA deposited with the ATCC as 0801470_SPD-L-1 1 antibody h409Al 1 . In another embodiment, the antibody comprises the heavy and light chain CDRs or variable regions of pembrolizumab. Thus, in one embodiment, the antibody is obtained by the CDR1, CDR2, and CDR3 domains of the VH of pembrolizumab encoded by the DNA deposited with the ATCC as 081469_SPD-H, and the DNA deposited with the ATCC as 0801470_SPD-L-1 1 and the CDR1, CDR2 and CDR3 domains of the VL of pembrolizumab that are encoded.

일부 구현예에서, PD-1 중화 제제는 PD-L1의 PD-1로의 결합을 억제하는 항-PD-L1 mAb이다. 일부 구현예에서, PD-1 중화 제제는 PD-1의 PD-L1로의 결합을 억제하는 항-PD1 mAb이다. 일부 구현예에서, PD-1 중화 제제는 면역어드헤신(예컨대, 불변 영역(예컨대, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PD-L1 또는 PD-L2의 세포외 부분 또는 PD-1 결합부를 포함하는 면역어드헤신)이다.In some embodiments, the PD-1 neutralizing agent is an anti-PD-L1 mAb that inhibits binding of PD-L1 to PD-1. In some embodiments, the PD-1 neutralizing agent is an anti-PD1 mAb that inhibits binding of PD-1 to PD-L1. In some embodiments, the PD-1 neutralizing agent comprises an extracellular portion or PD-1 binding portion of PD-L1 or PD-L2 fused to an immunoadhesin (eg, a constant region (eg, an Fc region of an immunoglobulin sequence)) immune adhesin).

치료 방법에서, 항-Siglec 항체 및 제2 치료제는 별도로, 함께 또는 순차적으로, 또는 칵테일 중에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 화합물은 제2 치료제의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 항-Siglec 항체는 제2 치료제의 투여 전 대략 0일 내지 30일에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, Siglec-결합 화합물은 제2 치료제의 투여 전 약 30분 내지 약 2주, 약 30분 내지 약 1주, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 1일, 또는 약 1일 내지 5일에 투여된다. 일부 구현예에서, 항-Siglec 항체는 치료제의 투여와 동시적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 항-Siglec 항체는 제2 치료제의 투여 후 투여된다. 예를 들어, 항-Siglec 항체는 제2 치료제의 투여 후 대략 0일 내지 30일에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-Siglec 항체는 제2 치료제의 투여 후 약 30분 내지 약 2주, 약 30분 내지 약 1주, 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 1일, 또는 약 1일 내지 약 5일에 투여된다.In the method of treatment, the anti-Siglec antibody and the second therapeutic agent may be administered separately, together or sequentially, or in a cocktail. In some embodiments, the antigen-binding compound is administered prior to administration of the second therapeutic agent. For example, the anti-Siglec antibody may be administered approximately 0 to 30 days prior to administration of the second therapeutic agent. In some embodiments, the Siglec-binding compound is administered from about 30 minutes to about 2 weeks, from about 30 minutes to about 1 week, from about 1 hour to about 2 hours, from about 2 hours to about 4 hours, about 4 prior to administration of the second therapeutic agent. from about 6 hours to about 6 hours, from about 6 hours to about 8 hours, from about 8 hours to 1 day, or from about 1 to 5 days. In some embodiments, the anti-Siglec antibody is administered concurrently with the administration of the therapeutic agent. In some embodiments, the anti-Siglec antibody is administered following administration of the second therapeutic agent. For example, the anti-Siglec antibody may be administered approximately 0 to 30 days after administration of the second therapeutic agent. In some embodiments, the anti-Siglec antibody is administered from about 30 minutes to about 2 weeks, from about 30 minutes to about 1 week, from about 1 hour to about 2 hours, from about 2 hours to about 4 hours, about 4 hours after administration of the second therapeutic agent. from about 6 hours to about 6 hours, from about 6 hours to about 8 hours, from about 8 hours to 1 day, or from about 1 day to about 5 days.

다른 양태에서, Siglec-7+ 및/또는 Siglec-9+ NK 세포 및/또는 T 세포, 예컨대, CD8 T 세포, CD56bright NK 세포, CD56dim NK 세포의 확인 방법이 제공된다. NK 세포 및/또는 T 세포 상의 Siglec-7 및/또는 Siglec-9의 공동-발현 평가는 진단 또는 예후 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 개체로부터(예컨대, 혈액 샘플로부터, 암 환자로부터 수득된 암 또는 암-인접 조직으로부터) 수득되고 Siglec-7 및/또는 Siglec-9+ NK 및/또는 T 세포의 존재에 대해 분석될 수 있다. 이러한 세포 상에서 Siglec-9의 발현은, 예를 들어, NK 및/또는 T 세포, 예를 들어 Siglec-9 폴리펩타이드에 의해 억제되는 종양 침윤 NK 및/또는 T 세포를 갖는 개체를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 세포 상에서 Siglec-7 및 Siglec-9 둘 다의 발현은, 예를 들어, NK 및/또는 T 세포, 예를 들어 Siglec-7 및 Siglec-9 폴리펩타이드 둘 다에 의해 억제되는 종양 침윤 NK 및/또는 T 세포를 갖는 개체를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 방법은, 예를 들어, Siglec-7 및/또는 Siglec-9를 중화시키는 제제로의 치료로의 반응에 대한 예후로 유용할 수 있다. 이러한 세포 상에서 Siglec-9(및 선택적으로 추가의 Siglec-7)의 발현은 본 개시의 항체로의 치료에 적합한 개체를 시사할 수 있다.In another aspect, a method of identifying Siglec-7+ and/or Siglec-9+ NK cells and/or T cells, such as CD8 T cells, CD56 bright NK cells, CD56 dim NK cells, is provided. Assessing the co-expression of Siglec-7 and/or Siglec-9 on NK cells and/or T cells can be used in diagnostic or prognostic methods. For example, a biological sample may be obtained from a subject (eg, from a blood sample, from cancer or cancer-proximal tissue obtained from a cancer patient) and tested in the presence of Siglec-7 and/or Siglec-9+ NK and/or T cells. can be analyzed for Expression of Siglec-9 on such cells can be used, for example, to identify individuals with NK and/or T cells, eg, tumor infiltrating NK and/or T cells that are inhibited by a Siglec-9 polypeptide. can Expression of both Siglec-7 and Siglec-9 on these cells can be inhibited, for example, by NK and/or T cells, such as tumor infiltrating NK and/or by both Siglec-7 and Siglec-9 polypeptides. or to identify individuals with T cells. The method may be useful, for example, as a prognosis for response to treatment with an agent that neutralizes Siglec-7 and/or Siglec-9. Expression of Siglec-9 (and optionally additional Siglec-7) on such cells may indicate an individual suitable for treatment with an antibody of the present disclosure.

소정의 선택적 양태에서, 환자는 Siglec-7 및/또는 Siglec-9에 대한 천연 리간드의 종양 샘플(예컨대, 종양 조직 및/또는 종양 인접 조직)의 존재를 평가함으로써 항-Siglec-7 및/또는 항-Siglec-9 항체로의 치료에 대해 확인될 수 있다. 본원에서 임의의 치료 용도 또는 암 치료 또는 예방 방법의 하나의 구현예에서, 개체에서 암의 치료 또는 예방은 다음 단계를 포함한다:In certain optional embodiments, the patient is administered anti-Siglec-7 and/or anti-Siglec-7 and/or anti-Siglec-7 by assessing the presence of a tumor sample (eg, tumor tissue and/or adjacent tumor tissue) of a native ligand for Siglec-7 and/or Siglec-9. - can be identified for treatment with a Siglec-9 antibody. In one embodiment of any of the therapeutic uses or methods of treating or preventing cancer herein, treating or preventing cancer in an individual comprises the steps of:

a) 암을 갖는 개체 내에서 악성 세포(예컨대, 종양 세포)가 Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드를 발현하는지 여부를 결정하는 단계, 및 a) determining whether a malignant cell (eg, a tumor cell) expresses a ligand of Siglec-7 and/or a ligand of Siglec-9 in the subject having cancer, and

b) Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드가 악성 세포(예컨대, 종양 세포)에 의해(예컨대, 그 표면 상에) 유의미하게 발현된다는 결정 시, 개체에 각각의 항-Siglec-7 및/또는 항-Siglec-9 항체, 예컨대, 본 개시의 임의의 양태에 따른 항체를 투여하는 단계.b) upon determining that the ligand of Siglec-7 and/or the ligand of Siglec-9 is significantly expressed by (eg, on the surface of) a malignant cell (eg, a tumor cell), the individual is given each anti-Siglec-7 and/or administering an anti-Siglec-9 antibody, such as an antibody according to any aspect of the present disclosure.

하나의 구현예에서, 생물학적 샘플(예컨대, 종양 세포, 종양 조직 및/또는 종양 인접 조직을 포함하는 샘플)이 Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드를 우세하게 발현한다는 결정은 개체가 각각 Siglec-7 및/또는 Siglec-9 폴리펩타이드를 억제하는 항체로 치료받을 수 있고/있거나 이로부터 이익을 얻을 수 있는 암을 가짐을 시사한다.In one embodiment, the determination that the biological sample (eg, a sample comprising tumor cells, tumor tissue, and/or tissue adjacent to the tumor) predominantly expresses a ligand of Siglec-7 and/or a ligand of Siglec-9 is determined by the individual suggest having a cancer that could be treated with and/or would benefit from an antibody that inhibits Siglec-7 and/or Siglec-9 polypeptides, respectively.

하나의 구현예에서, Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드의 유의미한 발현은 상기 리간드(들)가 주어진 개체로부터 채취된 상당수의 종양 세포에서 발현됨을 의미한다. 정확한 백분율 값에 의해 구애받지 않고, 일부 예에서 리간드는 환자로부터(샘플 중) 채취된 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 이상의 종양 세포 상에 존재하는 경우, "유의미하게 발현되는" 것으로 언급될 수 있다.In one embodiment, significant expression of a ligand of Siglec-7 and/or a ligand of Siglec-9 means that the ligand(s) is expressed in a significant number of tumor cells harvested from a given subject. Without being bound by the exact percentage value, in some instances the ligand is present on at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or more of the tumor cells taken from the patient (in the sample); Significantly expressed".

임의의 방법의 하나의 구현예에서, 암을 갖는 개체 내의 악성 세포(예컨대, 종양 세포)가 Siglec-7 및/또는 Siglec-9의 리간드를 발현하는지 여부의 결정은 생물학적 샘플 중 악성 세포 상에서 Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드의 발현 수준을 결정하는 단계 및 그 수준을 참조 수준(예컨대, 값, 약하거나 강한 세포 표면 염색 등)과 비교하는 단계를 포함한다. 참조 수준은, 예를 들어, 건강한 개체, 항-Siglec 항체로의 치료로부터 임상적 이익을 유도하지 않는/낮게 유도하는 개체, 또는 항-Siglec 항체로의 치료로부터 실질적인 임상적 이익을 유도하는 개체에 대응할 수 있다. 생물학적 샘플이 증가된 수준(예컨대, 높은 값, 강한 표면 염색, 항-Siglec 항체로의 치료로부터 실질적인 임상적 이익을 유도하는 개체의 수준에 대응하는 수준, 항-Siglec 항체로의 치료로부터 임상적 이익을 유도하지 않는/낮게 유도하는 개체에 대응하는 수준보다 높은 수준 등)으로 Siglec-7의 리간드 및/또는 Siglec-9의 리간드를 발현한다는 결정은 개체가 항-Siglec 항체로 치료받을 수 있는 암을 가짐을 시사한다.In one embodiment of any of the methods, the determination of whether a malignant cell (eg, a tumor cell) in an individual having cancer expresses a ligand of Siglec-7 and/or Siglec-9 is a Siglec- on the malignant cell in the biological sample. determining the expression level of the ligand of 7 and/or the ligand of Siglec-9 and comparing the level with a reference level (eg, value, weak or strong cell surface staining, etc.). A reference level may be, for example, in a healthy individual, an individual that induces no/lower clinical benefit from treatment with an anti-Siglec antibody, or an individual who derives substantial clinical benefit from treatment with an anti-Siglec antibody. can respond The biological sample has increased levels (e.g., high values, strong surface staining, levels corresponding to levels in the subject that elicit substantial clinical benefit from treatment with anti-Siglec antibody, clinical benefit from treatment with anti-Siglec antibody) Determining that the individual expresses a ligand of Siglec-7 and/or a ligand of Siglec-9 at a level that is higher than that corresponding to a subject that does not/lower inducing suggests having

실시예Example

실시예 1: Siglec-7 및 Siglec-9를 공동 발현하는 인간 NK 세포 하위세트Example 1: Human NK Cell Subsets Co-expressing Siglec-7 and Siglec-9

CD33-관련 Siglec 중, Siglec-7(CD328) 및 Siglec-9(CD329)는 암 세포에 의해 과발현되는 글리칸을 포함하는 시알산에 대한 결합 특성을 공유하며, 이들이 발현되는 면역 세포에서 억제 수용체로 기능하는 것으로 여겨진다. 림프구 상에서 Siglec의 발현을 조사하기 위해, Siglec-7 및 Siglec-9의 분포를 인간 NK 세포 상에서 연구하였다. Among the CD33-associated Siglec, Siglec-7 (CD328) and Siglec-9 (CD329) share binding properties to sialic acids, including glycans, which are overexpressed by cancer cells and act as inhibitory receptors in the immune cells in which they are expressed. is believed to be functioning. To examine the expression of Siglec on lymphocytes, the distribution of Siglec-7 and Siglec-9 was studied on human NK cells.

NK 세포 상의 Siglec-7 및 Siglec-9 발현을 인간 공여체로부터 정제된 신선 NK 세포 상에서 유세포 측정에 의해 결정하였다. NK 집단을 CD3- CD56+ 세포(항 CD3 Pacific blue - BD Pharmingen #558124; 항 CD56-PE-Vio770 - Milteny #130 100 676)로서 결정하였다. 항-Siglec-7 항체(클론 194211 - IgG1 APC - R&D Systems #FAB11381A), 항-Siglec-9 항체(클론 191240 - IgG2A PE - R&D Systems #FAB1139P) 및 이소형 대조군 IgG1 APC 및 IgG2A APC를 이용하였다. NK 세포를 30분 동안 50 ㎕의 염색 Ab 혼합물과 인큐베이션하고, 염색 완충액으로 2회 세척하고, 형광을 Canto II(HTS)로 드러내었다.Siglec-7 and Siglec-9 expression on NK cells was determined by flow cytometry on fresh NK cells purified from human donors. The NK population was determined as CD3-CD56+ cells (anti CD3 Pacific blue - BD Pharmingen #558124; anti CD56-PE-Vio770 - Milteny #130 100 676). Anti-Siglec-7 antibody (clone 194211 - IgGl APC - R&D Systems #FAB11381A), anti-Siglec-9 antibody (clone 191240 - IgG2A PE - R&D Systems #FAB1139P) and isotype controls IgGl APC and IgG2A APC were used. NK cells were incubated with 50 μl of the staining Ab mixture for 30 minutes, washed twice with staining buffer, and fluorescence revealed with Canto II (HTS).

결과를 도 1에 나타낸다. 대표 결과를 나타낸다. MFI:형광 세기의 평균. 상당한 분율(약 44%)의 NK 세포가 Siglec-7 및 Siglec-9를 둘 다 발현하여, 큰 비율의 NK 세포가, 예를 들어 종양 세포 상에 존재하는 글리칸 리간드의 함수로서, 각각의(또는 둘 모두의) 이러한 수용체에 의해 억제될 수 있음을 제시하였다.The results are shown in FIG. 1 . Representative results are shown. MFI: Average of fluorescence intensity. A significant fraction (about 44%) of NK cells express both Siglec-7 and Siglec-9, so that a large proportion of NK cells, for example, as a function of glycan ligands present on tumor cells, each ( or both) by these receptors.

실시예 2: 항-Siglec 항체의 생성Example 2: Generation of Anti-Siglec Antibodies

항-인간 Siglec-7 및 Siglec-9 항체를 수득하기 위해, Balb/c 마우스를 인간 Siglec-7 Fc 및 인간 Siglec-9 Fc 세포외 도메인 재조합 단백질로 면역화하였다. 2개의 상이한 면역화를 수행하였다.To obtain anti-human Siglec-7 and Siglec-9 antibodies, Balb/c mice were immunized with human Siglec-7 Fc and human Siglec-9 Fc extracellular domain recombinant proteins. Two different immunizations were performed.

Siglec-7 Fc 및 Siglec-9 Fc 단백질로의 제1 면역화에서, 마우스는 30 ㎍의 각각의 단백질 및 완전 프로인트 아주반트의 에멀젼의 2회 주사를 복강내 수여받았다. 이어서, 마우스는 7.5 ㎍의 각각의 단백질로의 추가접종을 정맥내 수여받았다. 2개의 상이한 융합(융합 1 및 2)을 수행하였다. 면역 비장 세포를 X63.Ag8.653 불멸화 B 세포로의 추가접종 3일 후 융합시키고, 조사된 비장 세포의 존재 하에 배양하였다. 하이브리도마를 반-고체 메틸셀룰로스-함유 배지에 플레이트-접종하고 자라는 클론을 clonepix 2 장치(Molecular Devices)를 이용하여 픽킹하였다.In the first immunization with Siglec-7 Fc and Siglec-9 Fc proteins, mice received 2 injections of 30 μg of each protein and an emulsion of complete Freund's adjuvant intraperitoneally. Mice were then given an intravenous boost with 7.5 μg of each protein. Two different fusions (fusions 1 and 2) were performed. Immune splenocytes were fused 3 days after boosting with X63.Ag8.653 immortalized B cells and cultured in the presence of irradiated splenocytes. Hybridomas were plate-inoculated into semi-solid methylcellulose-containing medium and growing clones were picked using a clonepix 2 apparatus (Molecular Devices).

제2 면역화를 다시 Siglec-7 Fc 및 Siglec-9 Fc 단백질로 수행하였다. 마우스는 30 ㎍의 각각의 단백질 및 완전 프로인트 아주반트 에멀젼의 3회 주사를 복강내 수여받았다. 이어서, 마우스는 5 ㎍의 각각의 단백질로의 추가접종을 정맥내 수여받았다. 3개의 상이한 융합(융합 3, 4 및 5)을 수행하였다. 면역 비장 세포를 X63.Ag8.653 불멸화 B 세포로의 추가접종 3일 후 융합시키고, 조사된 비장 세포의 존재 하에 배양하였다. 하이브리도마를 P96 배지에 플레이트-접종하였다. 상기 면역화(및 이후 실시예)에서 이용된 Siglec-7 Fc 및 Siglec-9 Fc 단백질을 CHO 세포에서 생산하였다. Siglec-7 Fc 단백질은 다음 아미노산 서열을 가졌다:A second immunization was again performed with Siglec-7 Fc and Siglec-9 Fc proteins. Mice received 3 injections of 30 μg of each protein and complete Freund's adjuvant emulsion intraperitoneally. Mice were then given an intravenous boost with 5 μg of each protein. Three different fusions (fusions 3, 4 and 5) were performed. Immune splenocytes were fused 3 days after boosting with X63.Ag8.653 immortalized B cells and cultured in the presence of irradiated splenocytes. Hybridomas were plate-inoculated into P96 medium. used in the above immunizations (and later in the Examples) Siglec-7 Fc and Siglec-9 Fc proteins were produced in CHO cells. Siglec-7 Fc protein had the following amino acid sequence:

Figure 112018096971757-pct00020
Figure 112018096971757-pct00020

Siglec-9 Fc 단백질은 다음 아미노산 서열을 가졌다:The Siglec-9 Fc protein had the following amino acid sequence:

Figure 112018096971757-pct00021
Figure 112018096971757-pct00021

일차 스크리닝: 두 면역화의 성장 클론의 상청액(SN)을 모체 및 huSiglec-7, huSiglec-9 및 cynoSiglec-발현 CHO 세포주를 이용하여 유세포 측정에 의해 일차 스크리닝에서 평가하였다. HuSiglec-7, - 및 cynoSiglec-발현 CHO를 각각 0.5 μM 및 0.05 μM CFSE로 염색하였다. 유세포 측정 스크리닝을 위해, 모든 세포를 균일하게 혼합하고, 상청액 중 반응 항체의 존재를 alexa fluor 647로 표지된 염소 항-마우스 폴리클로날 항체(pAb)로 드러내었다.Primary Screening: Supernatants (SN) of growth clones of both immunizations were evaluated in primary screening by flow cytometry using parental and huSiglec-7, huSiglec-9 and cynoSiglec-expressing CHO cell lines. HuSiglec-7, - and cynoSiglec-expressing CHO were stained with 0.5 μM and 0.05 μM CFSE, respectively. For flow cytometric screening, all cells were mixed homogeneously and the presence of reactive antibody in the supernatant was revealed with alexa fluor 647 labeled goat anti-mouse polyclonal antibody (pAb).

결과: 각각 융합 1, 2 및 3/4/5에서 인간 Siglec-7 및/또는 인간 Siglec-9 및/또는 Siglec-cyno에 결합하는 20개, 19개 및 80개 초과 항체를 각각의 융합에서 선택하였다. 3개의 상이한 융합으로부터 상이한 교차 반응성 항-Siglec-7, Siglec-9 및 Siglec-Cyno 항체 및 항-Siglec-9 항체(Siglec-7에 결합하지 않음)를 클로닝하여 N-연관 글리코실화가 없고 Fcγ 수용체에 대한 결합이 감소된 중쇄 N297Q(Kabat EU 넘버링) 돌연변이를 갖는 키메라 인간 IgG1 항체로 생산하였다.Results: selected from each fusion 20, 19 and more than 80 antibodies that bind human Siglec-7 and/or human Siglec-9 and/or Siglec-cyno in fusions 1, 2 and 3/4/5, respectively did Different cross-reactive anti-Siglec-7, Siglec-9 and Siglec-Cyno antibodies and anti-Siglec-9 antibodies (which do not bind to Siglec-7) from three different fusions were cloned with no N-linked glycosylation and no Fcγ receptors. was produced as a chimeric human IgG1 antibody with a heavy chain N297Q (Kabat EU numbering) mutation with reduced binding to .

도 2는 예를 들어 Siglec-7에 결합하지만 Siglec-9 또는 시아노몰구스 Siglec에 결합하지 않는 항체(오른쪽 패널), 각각의 Siglec-7, Siglec-9 및 시아노몰구스 Siglec에 결합하는 항체(가운데 패널), 및 Siglec-9에 결합하지만 Siglec-7 또는 시아노몰구스 Siglec에 결합하지 않는 항체(왼쪽 패널)의 유세포 측정의 대표 결과를 나타낸다.2 shows, for example, an antibody that binds to Siglec-7 but not Siglec-9 or cyanomolgus Siglec (right panel), an antibody that binds Siglec-7, Siglec-9 and cyanomolgus Siglec, respectively (middle). Panels), and representative results of flow cytometry of antibodies that bind to Siglec-9 but not to Siglec-7 or cyanomolgus Siglec (left panel) are shown.

Siglec 서열Siglec sequence 명칭designation NCBI 참조 서열 NCBI Reference Sequence 서열(AA)sequence (AA) 인간 Siglec-7Human Siglec-7 NM_014385.3 ; NP_055200.1NM_014385.3 ; NP_055200.1 QKSNRKDYSLTMQSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCFQNLTCSVPWACEQGTPPMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQPQHHGTSLTCQVTLPGAGVTTNRTIQLNVSYPPQNLTVTVFQGEGTASTALGNSSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTWRSLTLYPSQPSNPLVLELQVHLGDEGEFTCRAQNSLGSQHVSLNLSLQQEYTGKMRPVSGVLLGAVGGAGATALVFLSFCVIFIVVRSCRKKSARPAADVGDIGMKDANTIRGSASQGNLTESWADDNPRHHGLAAHSSGEEREIQYAPLSFHKGEPQDLSGQEATNNEYSEIKIPK(SEQ ID NO: 150)QKSNRKDYSLTMQSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCFQNLTCSVPWACEQGTPPMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQPQHHGTSLTCQVTLPGAGVTTNRTIQLNVSYPPQNLTVTVFQGEGTASTALGNSSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTWRSLTLYPSQPSNPLVLELQVHLGDEGEFTCRAQNSLGSQHVSLNLSLQQEYTGKMRPVSGVLLGAVGGAGATALVFLSFCVIFIVVRSCRKKSARPAADVGDIGMKDANTIRGSASQGNLTESWADDNPRHHGLAAHSSGEEREIQYAPLSFHKGEPQDLSGQEATNNEYSEIKIPK(SEQ ID NO: 150) 인간 Siglec-9Human Siglec-9 NM_014441.2 ;NP_055256.1NM_014441.2 ;NP_055256.1 QTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR(SEQ ID NO: 151)QTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR(SEQ ID NO: 151) 인간 Siglec-3Human Siglec-3 NM_001772.3; NP_001763.3 NM_001772.3; NP_001763.3 DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISGDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWL SAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYV PQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNF HGMNPSKDTSTEYSEVRTQ(SEQ ID NO: 152)DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISGDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWL SAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYV PQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNF HGMNPSKDTSTEYSEVRTQ(SEQ ID NO: 152) 인간 Siglec-5Human Siglec-5 NM_003830.3NM_003830.3 EKPVYELQVQKSVTVQEGLCVLVPCSFSYPWRSWYSSPPLYVYWFRDGEIPYYAEVVATNNPDRRVKPETQGRFRLLGDVQKKNCSLSIGDARMEDTGSYFFRVERGRDVKYSYQQNKLNLEVTALIEKPDIHFLEPLESGRPTRLSCSLPGSCEAGPPLTFSWTGNALSPLDPETTRSSELTLTPRPEDHGTNLTCQMKRQGAQVTTERTVQLNVSYA PQTITIFRNGIALEILQNTSYLPVLEGQALRLLCDAPSNPPAHLSWFQGSPALNATPISNTGILELRRVRSAEEGGFTCRAQHPLGFLQIFLNLSVYSLPQLLGPSCSWEAEGLHCRCSFRARPAPSLCWRLEEKPLEGNSSQGSFKVNSSSAGPWANSSLILHGGLSSDLKVSCKAWNIYGSQSGSVLLLQGRSNLGTGVVPAALGGAGVMALLCICLCLIFFLIVKARRKQAAGRPEKMDDEDPIMGTITSGSRKKPWPDSPGDQASPPGDAPPLEEQKELHYASLSFSEMKSREPKDQEAPSTTEYSEIKTSK(SEQ ID NO: 153)EKPVYELQVQKSVTVQEGLCVLVPCSFSYPWRSWYSSPPLYVYWFRDGEIPYYAEVVATNNPDRRVKPETQGRFRLLGDVQKKNCSLSIGDARMEDTGSYFFRVERGRDVKYSYQQNKLNLEVTALIEKPDIHFLEPLESGRPTRLSCSLPGSCEAGPPLTFSWTGNALSPLDPETTRSSELTLTPRPEDHGTNLTCQMKRQGAQVTTERTVQLNVSYA PQTITIFRNGIALEILQNTSYLPVLEGQALRLLCDAPSNPPAHLSWFQGSPALNATPISNTGILELRRVRSAEEGGFTCRAQHPLGFLQIFLNLSVYSLPQLLGPSCSWEAEGLHCRCSFRARPAPSLCWRLEEKPLEGNSSQGSFKVNSSSAGPWANSSLILHGGLSSDLKVSCKAWNIYGSQSGSVLLLQGRSNLGTGVVPAALGGAGVMALLCICLCLIFFLIVKARRKQAAGRPEKMDDEDPIMGTITSGSRKKPWPDSPGDQASPPGDAPPLEEQKELHYASLSFSEMKSREPKDQEAPSTTEYSEIKTSK(SEQ ID NO: 153) 인간 Siglec-6Human Siglec-6 NM_198845.4NM_198845.4 QERRFQLEGPESLTVQEGLCVLVPCRLPTTLPASYYGYGYWFLEGADVPVATNDPDEEVQEETRGRFHLLWDPRRKNCSLSIRDARRRDNAAYFFRLKSKWMKYGYTSSKLSVRVMALTHRPNISIPGTLESGHPSNLTCSVPWVCEQGTPPIFSWMSAAPTSLGPRTTQSSVLTITPRPQDHSTNLTCQVTFPGAGVTMERTIQLNVSSFKILQNTSSLPVLEGQALRLLCDADGNPPAHLSWFQGFPALNATPISNTGVLELPQVGSAEEGDFTCRAQHPLGSLQISLSLFVHWKPEGRAGGVLGAVWGASITTLVFLCVCFIFRVKTRRKKAAQPVQNTDDVNPVMVSGSRGHQHQFQTGIVSDHPAEAGPISEDEQELHYAVLHFHKVQPQEPKVTDTEYSEIKIHK(SEQ ID NO: 154)QERRFQLEGPESLTVQEGLCVLVPCRLPTTLPASYYGYGYWFLEGADVPVATNDPDEEVQEETRGRFHLLWDPRRKNCSLSIRDARRRDNAAYFFRLKSKWMKYGYTSSKLSVRVMALTHRPNISIPGTLESGHPSNLTCSVPWVCEQGTPPIFSWMSAAPTSLGPRTTQSSVLTITPRPQDHSTNLTCQVTFPGAGVTMERTIQLNVSSFKILQNTSSLPVLEGQALRLLCDADGNPPAHLSWFQGFPALNATPISNTGVLELPQVGSAEEGDFTCRAQHPLGSLQISLSLFVHWKPEGRAGGVLGAVWGASITTLVFLCVCFIFRVKTRRKKAAQPVQNTDDVNPVMVSGSRGHQHQFQTGIVSDHPAEAGPISEDEQELHYAVLHFHKVQPQEPKVTDTEYSEIKIHK(SEQ ID NO: 154) 인간 Siglec-8Human Siglec-8 NM_014442.2NM_014442.2 MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRKKSARPAAGVGDTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGELHYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNPSSKEVRG
(SEQ ID NO: 155)MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRKKSARPAAGVGDTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGELHYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNPSSKEVRG
(SEQ ID NO: 155) 인간 Siglec-10Human Siglec-10 NM_033130.4NM_033130.4 MDGRFWIRVQESVMVPEGLCISVPCSFSYPRQDWTGSTPAYGYWFKAVTETTKGAPVATNHQSREVEMSTRGRFQLTGDPAKGNCSLVIRDAQMQDESQYFFRVERGSYVRYNFMNDGFFLKVTALTQKPDVYIPETLEPGQPVTVICVFNWAFEECPPPSFSWTGAALSSQGTKPTTSHFSVLSFTPRPQDHNTDLTCHVDFSRKGVSVQRTVRLRVAYAPRDLVISISRDNTPALEPQPQGNVPYLEAQKGQFLRLLCAADSQPPATLSWVLQNRVLSSSHPWGPRPLGLELPGVKAGDSGRYTCRAENRLGSQQRALDLSVQYPPENLRVMVSQANRTVLENLGNGTSLPVLEGQSLCLVCVTHSSPPARLSWTQRGQVLSPSQPSDPGVLELPRVQVEHEGEFTCHARHPLGSQHVSLSLSVHYSPKLLGPSCSWEAEGLHCSCSSQASPAPSLRWWLGEELLEGNSSQDSFEVTPSSAGPWANSSLSLHGGLSSGLRLRCEAWNVHGAQSGSILQLPDKKGLISTAFSNGAFLGIGITALLFLCLALIIMKILPKRRTQTETPRPRFSRHSTILDYINVVPTAGPLAQKRNQKATPNSPRTPLPPGAPSPESKKNQKKQYQLPSFPEPKSSTQAPESQESQEELHYATLNFPGVRPRPEARMPKGTQADYAEVKFQ(SEQ ID NO: 156)MDGRFWIRVQESVMVPEGLCISVPCSFSYPRQDWTGSTPAYGYWFKAVTETTKGAPVATNHQSREVEMSTRGRFQLTGDPAKGNCSLVIRDAQMQDESQYFFRVERGSYVRYNFMNDGFFLKVTALTQKPDVYIPETLEPGQPVTVICVFNWAFEECPPPSFSWTGAALSSQGTKPTTSHFSVLSFTPRPQDHNTDLTCHVDFSRKGVSVQRTVRLRVAYAPRDLVISISRDNTPALEPQPQGNVPYLEAQKGQFLRLLCAADSQPPATLSWVLQNRVLSSSHPWGPRPLGLELPGVKAGDSGRYTCRAENRLGSQQRALDLSVQYPPENLRVMVSQANRTVLENLGNGTSLPVLEGQSLCLVCVTHSSPPARLSWTQRGQVLSPSQPSDPGVLELPRVQVEHEGEFTCHARHPLGSQHVSLSLSVHYSPKLLGPSCSWEAEGLHCSCSSQASPAPSLRWWLGEELLEGNSSQDSFEVTPSSAGPWANSSLSLHGGLSSGLRLRCEAWNVHGAQSGSILQLPDKKGLISTAFSNGAFLGIGITALLFLCLALIIMKILPKRRTQTETPRPRFSRHSTILDYINVVPTAGPLAQKRNQKATPNSPRTPLPPGAPSPESKKNQKKQYQLPSFPEPKSSTQAPESQESQEELHYATLNFPGVRPRPEARMPKGTQADYAEVKFQ(SEQ ID NO: 156) 인간 Siglec-11Human Siglec-11 NM_052884.2NM_052884.2 NKDPSYSLQVQRQVPVPEGLCVIVSCNLSYPRDGWDESTAAYGYWFKGRTSPKTGAPVATNNQSREVEMSTRDRFQLTGDPGKGSCSLVIRDAQREDEAWYFFRVERGSRVRHSFLSNAFFLKVTALTKKPDVYIPETLEPGQPVTVICVFNWAFKKCPAPSFSWTGAALSPRRTRPSTSHFSVLSFTPSPQDHDTDLTCHVDFSRKGVSAQRTVRLRVAYAPKDLIISISHDNTSALELQGNVIYLEVQKGQFLRLLCAADSQPPATLSWVLQDRVLSSSHPWGPRTLGLELRGVRAGDSGRYTCRAENRLGSQQQALDLSVQYPPENLRVMVSQANRTVLENLGNGTSLPVLEGQSLRLVCVTHSSPPARLSWTRWGQTVGPSQPSDPGVLELPPIQMEHEGEFTCHAQHPLGSQHVSLSLSVHYPPQLLGPSCSWEAEGLHCSCSSQASPAPSLRWWLGEELLEGNSSQGSFEVTPSSAGPWANSSLSLHGGLSSGLRLRCKAWNVHGAQSGSVFQLLPGKLEHGGGLGLGAALGAGVAALLAFCSCLVVFRVKICRKEARKRAAAEQDVPSTLGPISQGHQHECSAGSSQDHPPPGAATYTPGKGEEQELHYASLSFQGLRLWEPADQEAPSTTEYSEIKIHTGQPLRGPGFGLQLEREMSGMVPK(SEQ ID NO: 157)NKDPSYSLQVQRQVPVPEGLCVIVSCNLSYPRDGWDESTAAYGYWFKGRTSPKTGAPVATNNQSREVEMSTRDRFQLTGDPGKGSCSLVIRDAQREDEAWYFFRVERGSRVRHSFLSNAFFLKVTALTKKPDVYIPETLEPGQPVTVICVFNWAFKKCPAPSFSWTGAALSPRRTRPSTSHFSVLSFTPSPQDHDTDLTCHVDFSRKGVSAQRTVRLRVAYAPKDLIISISHDNTSALELQGNVIYLEVQKGQFLRLLCAADSQPPATLSWVLQDRVLSSSHPWGPRTLGLELRGVRAGDSGRYTCRAENRLGSQQQALDLSVQYPPENLRVMVSQANRTVLENLGNGTSLPVLEGQSLRLVCVTHSSPPARLSWTRWGQTVGPSQPSDPGVLELPPIQMEHEGEFTCHAQHPLGSQHVSLSLSVHYPPQLLGPSCSWEAEGLHCSCSSQASPAPSLRWWLGEELLEGNSSQGSFEVTPSSAGPWANSSLSLHGGLSSGLRLRCKAWNVHGAQSGSVFQLLPGKLEHGGGLGLGAALGAGVAALLAFCSCLVVFRVKICRKEARKRAAAEQDVPSTLGPISQGHQHECSAGSSQDHPPPGAATYTPGKGEEQELHYASLSFQGLRLWEPADQEAPSTTEYSEIKIHTGQPLRGPGFGLQLEREMSGMVPK(SEQ ID NO: 157) 인간 Siglec-12Human Siglec-12 NM_053003.3NM_053003.3 KEQKDYLLTMQKSVTVQEGLCVSVLCSFSYPQNGWTASDPVHGYWFRAGDHVSRNIPVATNNPARAVQEETRDRFHLLGDPQNKDCTLSIRDTRESDAGTYVFCVERGNMKWNYKYDQLSVNVTASQDLLSRYRLEVPESVTVQEGLCVSVPCSVLYPHYNWTASSPVYGSWFKEGADIPWDIPVATNTPSGKVQEDTHGRFLLLGDPQTNNCSLSIRDARKGDSGKYYFQVERGSRKWNYIYDKLSVHVTALTHMPTFSIPGTLESGHPRNLTCSVPWACEQGTPPTITWMGASVSSLDPTITRSSMLSLIPQPQDHGTSLTCQVTLPGAGVTMTRAVRLNISYPPQNLTMTVFQGDGTASTTLRNGSALSVLEGQSLHLVCAVDSNPPARLSWTWGSLTLSPSQSSNLGVLELPRVHVKDEGEFTCRAQNPLGSQHISLSLSLQNEYTGKMRPISGVTLGAFGGAGATALVFLYFCIIFVVVRSCRKKSARPAVGVGDTGMEDANAVRGSASQGPLIESPADDSPPHHAPPALATPSPEEGEIQYASLSFHKARPQYPQEQEAIGYEYSEINIPK(SEQ ID NO: 158)KEQKDYLLTMQKSVTVQEGLCVSVLCSFSYPQNGWTASDPVHGYWFRAGDHVSRNIPVATNNPARAVQEETRDRFHLLGDPQNKDCTLSIRDTRESDAGTYVFCVERGNMKWNYKYDQLSVNVTASQDLLSRYRLEVPESVTVQEGLCVSVPCSVLYPHYNWTASSPVYGSWFKEGADIPWDIPVATNTPSGKVQEDTHGRFLLLGDPQTNNCSLSIRDARKGDSGKYYFQVERGSRKWNYIYDKLSVHVTALTHMPTFSIPGTLESGHPRNLTCSVPWACEQGTPPTITWMGASVSSLDPTITRSSMLSLIPQPQDHGTSLTCQVTLPGAGVTMTRAVRLNISYPPQNLTMTVFQGDGTASTTLRNGSALSVLEGQSLHLVCAVDSNPPARLSWTWGSLTLSPSQSSNLGVLELPRVHVKDEGEFTCRAQNPLGSQHISLSLSLQNEYTGKMRPISGVTLGAFGGAGATALVFLYFCIIFVVVRSCRKKSARPAVGVGDTGMEDANAVRGSASQGPLIESPADDSPPHHAPPALATPSPEEGEIQYASLSFHKARPQYPQEQEAIGYEYSEINIPK(SEQ ID NO: 158) 시아노몰구스 SiglecCyanomolgus Siglec XM_005590087.1XM_005590087.1 QRNNQKNYPLTMQESVTVQQGLCVHVLCSFSYPWYGWISSDPVHGYWFRAGAHTDRDAPVATNNPARAVREDTRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARSSDAGTYFFRVETGKTKWNYKYAPLSVHVTALTHRPNILIPGTLESGCPRNLTCSVPWACEQGTAPMISWMGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTIHLNVSYPPQNLTMTVFQGNDTVSIVLGNGSSVSVPEGPSLRLVCAVDSNPPARLSLSWGGLTLCPSQPSNPGVLELPRVHLRDEEEFTCRAQNLLGSQQVSLNVSLQSKATSGLTQGAVGAGATALVFLSFCVIFVVVP(SEQ ID NO: 159)QRNNQKNYPLTMQESVTVQQGLCVHVLCSFSYPWYGWISSDPVHGYWFRAGAHTDRDAPVATNNPARAVREDTRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARSSDAGTYFFRVETGKTKWNYKYAPLSVHVTALTHRPNILIPGTLESGCPRNLTCSVPWACEQGTAPMISWMGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTIHLNVSYPPQNLTMTVFQGNDTVSIVLGNGSSVSVPEGPSLRLVCAVDSNPPARLSLSWGGLTLCPSQPSNPGVLELPRVHLRDEEEFTCRAQNLLGSQQVSLNVSLQSKATSGLTQGAVGAGATALVFLSFCVIFVVVP(SEQ ID NO: 159) 인간 Siglec-9 K100E/A315E 대립유전자Human Siglec-9 K100E/A315E Allele QTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTENCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDEAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR(SEQ ID NO: 160)QTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTENCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDEAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR(SEQ ID NO: 160) 인간 Siglec-9 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인 Human Siglec-9 N-terminal V-set Ig-like domain MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGKPIPNPLLGLDSTQTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTAATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR(SEQ ID NO: 161)MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGKPIPNPLLGLDSTQTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTAATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR(SEQ ID NO: 161) 인간 Siglec-9 Ig-유사 C2-유형 도메인 1Human Siglec-9 Ig-like C2-type domain 1 MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGKPIPNPLLGLDSTLTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR(SEQ ID NO: 162)MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGKPIPNPLLGLDSTLTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR(SEQ ID NO: 162) 인간 Siglec-9 Ig-유사 C2-유형 도메인 2Human Siglec-9 Ig-like C2-type domain 2 MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGKPIPNPLLGLDSTSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR(SEQ ID NO: 163)MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGKPIPNPLLGLDSTSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR(SEQ ID NO: 163)

실시예 3: CD33-관련 Siglec에 대한 결합Example 3: Binding to CD33-Associated Siglec

Siglec-7 및 Siglec-9에 대한 서열 유사성을 공유하는 CD33-관련 Siglec은 일반적으로 Siglec-1, Siglec-2, Siglec-4 및 Siglec-15로 이루어지는 제1 하위세트 및 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-14 및 Siglec-16이 포함되는 CD33-관련 Siglec 그룹의 2개 그룹으로 구분된다. 다른 CD33-관련 Siglec은 상이한 생물학적 기능을 가지고/가지거나 종양 감독에 관여되는 것으로 여겨지지 않으므로, 다른 CD33-관련 Siglec에 결합하지 않는 교차 반응성 Siglec-7/9 항체를 수득할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 항체를 추가 스크리닝하였다.The CD33-associated Siglec, which share sequence similarity to Siglec-7 and Siglec-9, generally consists of a first subset consisting of Siglec-1, Siglec-2, Siglec-4 and Siglec-15 and Siglec-3, Siglec-5 , divided into two groups, the CD33-related Siglec group, which includes Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-9, Siglec-10, Siglec-11, Siglec-12, Siglec-14 and Siglec-16. do. To evaluate whether it is possible to obtain cross-reactive Siglec-7/9 antibodies that do not bind to other CD33-associated Siglec as different CD33-associated Siglec have different biological functions and/or are not believed to be involved in tumor supervision. Antibodies were further screened for

Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 및 Siglec-12를 발현하는 세포를 생성하고 교차 반응성 Siglec-7/9 항체의 대표 하위세트를 세포로의 결합에 대해 유세포 측정에 의해 평가하였다. 본원에서 이용된 상이한 Siglec에 대한 아미노산 서열 및 Genbank 참조는 상기, 표 1에 나타낸다.Cells expressing Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 and Siglec-12 were generated and a representative subset of the cross-reactive Siglec-7/9 antibodies was transfected into the cells. Binding was assessed by flow cytometry. Amino acid sequences and Genbank references for the different Siglec used herein are shown in Table 1, above.

간략하게, HuSiglec-발현 CHO 세포주(하나의 Siglec을 발현하는 세포주)를 이용하였다. 유세포 측정 스크리닝을 위해, 항체를 각각의 HuSig-lec-발현 CHO 세포주(CHO HuSiglec-3 세포주, CHO HuSiglec-5 세포주, CHO HuSiglec-6 세포주, CHO HuSiglec-8 세포주, CHO HuSiglec-10 세포주, CHO HuSiglec-11 세포주, CHO HuSiglec-12 세포주)와 1시간 인큐베이션하고, 염색 완충액 중 2회 세척하고, PE로 표지된 염소 항-마우스 폴리클로날 항체(pAb)로 드러내고, 염색 완충액으로 2회 세척하고, HTFC 유세포 측정기 상에서 염색을 획득하여 FlowJo 소프트웨어를 이용해서 분석하였다.Briefly, a HuSiglec-expressing CHO cell line (a cell line expressing one Siglec) was used. For flow cytometric screening, antibodies were transfected with each HuSig-lec-expressing CHO cell line (CHO HuSiglec-3 cell line, CHO HuSiglec-5 cell line, CHO HuSiglec-6 cell line, CHO HuSiglec-8 cell line, CHO HuSiglec-10 cell line, CHO HuSiglec cell line -11 cell line, CHO HuSiglec-12 cell line) for 1 hour, washed twice in staining buffer, exposed with PE-labeled goat anti-mouse polyclonal antibody (pAb), washed twice with staining buffer, Staining was acquired on a HTFC flow cytometer and analyzed using FlowJo software.

결과는 항-Siglec-9 항체 mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE 및 mAbF 중 어느 것도 임의의 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-10, Siglec-11 또는 Siglec-12에 결합하지 않음을 나타내었다.Results showed that none of the anti-Siglec-9 antibodies mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE and mAbF were any Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-7, Siglec-8, Siglec-10, Siglec- 11 or Siglec-12.

결과는 일부 교차 반응성 Siglec-7/9 항체가 Siglec-7 및 Siglec-9에 부가하여 Siglec-12 또는 Siglec-6에 또한 결합할 수 있음을 나타내었다. mAb1, mAb2 및 mAb3은 Siglec-7 및 Siglec-9에 부가하여 Siglec-12에 결합한 반면, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6은 Siglec-12에 결합하지 않았다. 예시적인 항체 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 또는 mAb6 중 어느 것도 임의의 Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, 또는 Siglec-11에 결합하지 않았다.The results indicated that some cross-reactive Siglec-7/9 antibodies could also bind Siglec-12 or Siglec-6 in addition to Siglec-7 and Siglec-9. mAb1, mAb2 and mAb3 bound to Siglec-12 in addition to Siglec-7 and Siglec-9, whereas mAb3, mAb4, mAb5 and mAb6 did not bind to Siglec-12. None of the exemplary antibodies mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 or mAb6 bound to any Siglec-3, Siglec-5, Siglec-6, Siglec-8, Siglec-10, or Siglec-11.

실시예 4: Siglec으로의 결합에 대한 항체의 적정Example 4: Titration of Antibodies for Binding to Siglec

인간 Siglec-7, 인간 Siglec-9 및 시아노몰구스 Siglec-9 상의 항체 결합을 인간 Siglec-7 및 인간 Siglec-9 및 시아노몰구스 Siglec-9로 전달감염된 CHO 세포 상에서 유세포 측정에 의한 적정 실험에 의해 평가하였다. 세포를 일차 항체 20 ㎍/㎖ 및 1:5 희석 시리즈를 함유하는 염색 완충액(SB) 중 1 h 인큐베이션하였다. 이들을 SB로 3회 세척한 후, 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(Fc) PE(Beckman Coulter #IM05510)와 30분 인큐베이션하고, SB로 2회 세척하였다. HTFC Intellicyt 유세포 측정기로 염색을 드러내었다. Antibody binding on human Siglec-7, human Siglec-9 and cyanomolgus Siglec-9 was determined by titration experiments by flow cytometry on CHO cells transfected with human Siglec-7 and human Siglec-9 and cyanomolgus Siglec-9. evaluated. Cells were incubated for 1 h in staining buffer (SB) containing 20 μg/ml of primary antibody and a 1:5 dilution series. They were washed three times with SB, then incubated with goat F(ab') 2 anti-human IgG(Fc) PE (Beckman Coulter #IM05510) for 30 minutes, and washed twice with SB. Staining was revealed with an HTFC Intellicyt flow cytometer.

2개의 면역화에서의 5개 융합으로부터 아래 나타낸 6개 항체가 세포에 의해 발현된 인간 Siglec-7 및 인간 Siglec-9, 그리고 추가로 시아노몰구스 Siglec에 필적하는 결합 친화도를 갖는 것으로 확인되었다. 각각의 항체에 있어서 결합에 대한 EC50 값(㎍/㎖)을 아래에 나타낸다.From five fusions in two immunizations, six antibodies shown below were identified with binding affinities comparable to human Siglec-7 and human Siglec-9 expressed by the cells, and further to cyanomolgus Siglec. The EC 50 values for binding (μg/ml) for each antibody are shown below.

Figure 112018096971757-pct00022
Figure 112018096971757-pct00022

실시예 5: 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 Siglec-9 결합 친화도Example 5: Siglec-9 binding affinity by surface plasmon resonance (SPR)

Biacore™ T100 일반 절차 및 시약Biacore™ T100 General Procedures and Reagents

SPR 측정을 25℃에서 Biacore™ T200 장치(Biacore™ GE Healthcare) 상에서 수행하였다. 전체 Biacore™ 실험에서, HBS-EP+(Biacore™ GE Healthcare) 및 NaOH 10 mM이 각각 진행 완충액 및 재생 완충액으로 작용하였다. 센소그램을 Biacore™ T200 평가 소프트웨어로 분석하였다. 인간 siglec-9 및 siglec-7 다량체 단백질을 Innate Pharma에서 클로닝하고, 생산하고, 정제하였다.SPR measurements were performed on a Biacore™ T200 instrument (Biacore™ GE Healthcare) at 25°C. In the entire Biacore™ experiment, HBS-EP+ (Biacore™ GE Healthcare) and 10 mM NaOH served as running buffer and regeneration buffer, respectively. The sensorgrams were analyzed with the Biacore™ T200 evaluation software. Human siglec-9 and siglec-7 multimeric proteins were cloned, produced and purified at Innate Pharma.

단백질-A의 면역화Protein-A Immunization

단백질을 센서 칩 CM5 상의 덱스트란층 내 카복실기에 공유 고정하였다. 칩 표면을 EDC/NHS(N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필) 카보디아미드 하이드로클로라이드 및 N-하이드록시숙신이미드(Biacore™, GE Healthcare)로 활성화하였다. 적절한 고정화 수준(즉 600 RU 내지 2000 RU)에 도달할 때까지 단백질을 커플링 완충액(10 mM 아세테이트, pH 4.2 & 5.0) 중 10 ㎍/㎖까지 희석하였다. 잔여 활성화기의 탈활성화를 100 mM 에탄올아민 pH 8(Biacore™, GE Healthcare)을 이용하여 수행하였다.The protein was covalently immobilized to the carboxyl group in the dextran layer on the sensor chip CM5. The chip surface was activated with EDC/NHS (N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiamide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide (Biacore™, GE Healthcare). Appropriate immobilization levels (i.e., Proteins were diluted to 10 μg/ml in coupling buffer (10 mM acetate, pH 4.2 & 5.0) until reaching 600 RU to 2000 RU. Deactivation of residual activators was performed with 100 mM ethanolamine pH 8 (Biacore). ™, GE Healthcare).

친화도 연구Affinity Study

친화도 연구를 제조업체(Biacore™ GE Healthcare kinetic wizard)에서 권장되는 표준 동역학 프로토콜에 따라 수행하였다. 600 nM 내지 0.975 nM 범위의 항-Siglec-9 및 항-Siglec-7/9 항체 Fab 단편의 연속 희석물을 고정화된 Siglec-9 Fc 및 Siglec-7 Fc 단백질 상에 순차적으로 주사하고, 재생 전 10분 동안 해리하게 두었다. 전체 센소그램 세트를 1:1 동역학 결합 모델을 이용하여 피팅하였다. 1가 친화도 및 동역학 연합 및 해리 속도 상수를 아래의 표 2에서 아래에 나타낸다.Affinity studies were performed according to the standard kinetic protocol recommended by the manufacturer (Biacore™ GE Healthcare kinetic wizard). Serial dilutions of anti-Siglec-9 and anti-Siglec-7/9 antibody Fab fragments ranging from 600 nM to 0.975 nM were sequentially injected onto the immobilized Siglec-9 Fc and Siglec-7 Fc proteins, 10 prior to regeneration. left to dissociate for a minute. The entire set of sensorgrams was fitted using a 1:1 kinetic binding model. Monovalent affinity and kinetic association and dissociation rate constants are shown below in Table 2 below.

Siglec-9 Fc 단백질 상의 Fab 결합Fab binding on Siglec-9 Fc protein FABFAB KD(nM)(1:1 결합)KD (nM) (1:1 binding) Koff(10-3) 1/SKoff (10-3) 1/S Fab.A(mAbA의 Fab)Fab.A (Fab of mAbA) 0.040.04 0.0250.025 Fab.B(mAbB의 Fab)Fab.B (Fab of mAbB) 0.370.37 0.310.31 Fab.C(mAbC의 Fab)Fab.C (Fab of mAbC) 0.550.55 0.430.43 Fab.D(mAbD의 Fab)Fab.D (Fab of mAbD) 4.124.12 0.110.11 Fab.E(mAbE의 Fab)Fab.E (Fab of mAbE) 1One 1.91.9 Fab.F(mAbF의 Fab)Fab.F (Fab of mAbF) 1One 0.460.46 Fab1(mAb1의 Fab)Fab1 (Fab of mAb1) 0.40.4 0.160.16 Fab2(mAb2의 Fab)Fab2 (Fab of mAb2) 0.80.8 0.170.17 Siglec-7 Fc 단백질 상의 Fab 결합Fab binding on Siglec-7 Fc protein FabFab KD(nM)(1:1 결합)KD (nM) (1:1 binding) Koff(10-3) 1/SKoff (10-3) 1/S Fab1Fab1 0.060.06 0.040.04 Fab2Fab2 0.070.07 0.040.04

실시예 6: 단핵구-유래 수지상 세포의 적정Example 6: Titration of monocyte-derived dendritic cells

단핵구-유래 수지상 세포(moDC)의 생성: Generation of monocyte-derived dendritic cells (moDCs):

단핵구-유래 수지상 세포를 말초혈 단핵 세포로부터 생성하였다. PBMC를 건강한 공여체로부터 수득된, 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 단핵구를 키트 단핵구 단리 키트 II(Miltenyi Biotec)를 이용하여 정제하고 10% 불활성화 FBS(GIBCO), 글루타민(GIBCO), MEM NEAA(GIBCO), 나트륨 피루베이트(GIBCO), IL-4(20 ng/㎖)(Peprotech) 및 GM-CSF(400 ng/㎖)(Miltenyi Biotec)가 보충된 RPMI 배지(GIBCO) 중 총 6일 동안 moDC에서 분화시켰다. 세포를 37℃에서 가습 CO2 인큐베이터에서 배양하고, 사이토카인을 4일차에 재생시켰다.Monocyte-derived dendritic cells were generated from peripheral blood mononuclear cells. PBMCs were isolated from soft white blood cells obtained from healthy donors. Monocytes were purified using kit Monocyte Isolation Kit II (Miltenyi Biotec) and 10% inactivated FBS (GIBCO), glutamine (GIBCO), MEM NEAA (GIBCO), sodium pyruvate (GIBCO), IL-4 (20 ng/ ml) (Peprotech) and GM-CSF (400 ng/ml) (Miltenyi Biotec) supplemented with RPMI medium (GIBCO) for a total of 6 days in moDC differentiation. Cells were cultured in a humidified CO2 incubator at 37°C, and cytokines were regenerated on day 4.

moDC를 25 mU 뉴라미니다제(Roche Diagnostics)로 2시간 동안 탈시알릴화하였다. 뉴라미니다제 처리 전 및 후에 탈시알릴화를 제어하였다: moDC 세포를 마우스 Siglec-7 Fc(IPH) 및 마우스 Siglec-9 Fc 재조합 단백질(IPH) 10 ㎍/㎖로 염색 완충액(SB) 중 1 h 인큐베이션하고, SB로 2회 세척하고, 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG(Fc) PE(Jackson ImmunoResearch)와 30분 인큐베이션하고, SB로 2회 세척하고, Canto II(HTS)로 형광을 드러내었다.moDCs were desialylated with 25 mU neuraminidase (Roche Diagnostics) for 2 h. Desialylation was controlled before and after neuraminidase treatment: moDC cells were treated with mouse Siglec-7 Fc (IPH) and mouse Siglec-9 Fc recombinant protein (IPH) at 10 µg/ml for 1 h in staining buffer (SB). Incubated, washed twice with SB, incubated for 30 min with goat F(ab')2 anti-mouse IgG(Fc) PE (Jackson ImmunoResearch), washed twice with SB, and fluoresced with Canto II (HTS) revealed

적정Adequate

moDC 및 뉴라미니다제 처리 moDC 상의 결합을 유세포 측정에 의해 적정 실험에서 평가하였다. 세포를 일차 항체 10 ㎍/㎖ 및 1:10의 희석 시리즈를 함유하는 염색 완충액(SB) 중 1 h 인큐베이션하였다. 이들을 SB로 2회 세척한 후, 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(Fc) PE(Jackson Immunoresearch)와 30분 인큐베이션하고, SB로 2회 세척하였다. HTFC Intellicyt 유세포 측정기로 형광을 드러내었다.Binding on moDC and neuraminidase treated moDC was assessed in titration experiments by flow cytometry. Cells were incubated for 1 h in staining buffer (SB) containing 10 μg/ml of primary antibody and a dilution series of 1:10. They were washed twice with SB, then incubated with goat F(ab') 2 anti-human IgG(Fc) PE (Jackson Immunoresearch) for 30 minutes, and washed twice with SB. Fluorescence was revealed with an HTFC Intellicyt flow cytometer.

결과result

EC50은 뉴라미니다제 처리 후 크게 증강되어(10배), moDC 상에서 발현되는 Siglec-9가 뉴라미니다제 처리 전 이의 시알산 리간드와 시스 상호작용에 관여됨을 시사하였다. 그러나, 정체기 상 수준은 변경되지 않아, 고친화도 항체가 세포 표면 상의 모든 Siglec-9(결합 및 미결합) 입체형태에 결합할 수 있고 모노DC뿐만 아니라 다른 세포 유형(예컨대, NK 세포, CD8 T 세포, 단핵구 및 대식구 M1 및 M2)에서 시스-상호작용 및 신호전달을 억제함을 제시한다. 이들 각각의 EC50 값이 수반되는, moDC(왼쪽 패널) 및 뉴라미다제-처리 moDC(오른쪽 패널)에서의 대표 항체 mAbA, mAbC 및 mAbD에 대한 결과를 도 3에 나타낸다.EC 50 was significantly enhanced (10-fold) after neuraminidase treatment, suggesting that Siglec-9 expressed on moDC is involved in cis interaction with its sialic acid ligand before neuraminidase treatment. However, the level of the stationary phase is not altered, so that the high affinity antibody can bind all Siglec-9 (bound and unbound) conformations on the cell surface and monoDC as well as other cell types (e.g., NK cells, CD8 T cells) , show inhibition of cis-interactions and signaling in monocytes and macrophages M1 and M2). Results for representative antibodies mAbA, mAbC and mAbD in moDC (left panel) and neuramidase-treated moDC (right panel), accompanied by their respective EC 50 values, are shown in FIG. 3 .

실시예 7: NK 세포에서 Siglec 활성을 중화시키는 항체의 능력 평가Example 7: Assessment of the ability of antibodies to neutralize Siglec activity in NK cells

제1 및 제2 면역화에서 평가된 항-Siglec-7/9 항체를 일차 NK 세포(이용 전에 37℃에서 하룻밤 인큐베이션된, 인간 공여체로부터 정제된 신선 NK 세포)를 이용하여 NK 세포 활성화 검정에서 Siglec 활성의 차단에 대해 평가하였다. 24시간에 CD137 발현의 증가는 NK 세포를 포함하는 몇몇 림프구의 활성화와 연관된다(Kohrt et al. (2011) Blood 117(8):2423-2432). NK 세포 활성화에 대한 항-Siglec-7/9 항체 및 표적 세포의 탈시알릴화의 효과를 유세포 측정에 의해 NK 세포 상에서 CD137 발현의 분석에 의해 결정하였다. 각각의 항-Siglec-7/9 mAb mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6은 24시간차에 CD137 발현의 증가를 유도하였다.Siglec activity in NK cell activation assays using anti-Siglec-7/9 antibodies evaluated in the first and second immunizations using primary NK cells (fresh NK cells purified from human donors, incubated overnight at 37° C. prior to use) was evaluated for blocking. An increase in CD137 expression at 24 h is associated with activation of several lymphocytes, including NK cells (Kohrt et al. (2011) Blood 117(8):2423-2432). The effect of anti-Siglec-7/9 antibody and desialylation of target cells on NK cell activation was determined by analysis of CD137 expression on NK cells by flow cytometry. Each of the anti-Siglec-7/9 mAbs mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 and mAb6 induced an increase in CD137 expression at 24 h.

이어서 항-Siglec-7/9 항체의 효과를 효과기로서 YTS Siglec-9* 효과기 세포주(인간 Siglec-9로 전달감염된 인간 NK 세포주 YTS) 및 표적으로서 Ramos 세포주를 이용하여 세포독성 검정(Cr51)에 의해 연구하였다. 상기 평가는 51Cr-로딩된 표적 세포의 용해를 직접 정량하여 YTS Siglec-9* 세포주의 세포독성을 측정한다. 간략하게, 표적 세포를 먼저 방사활성 51Cr 동위원소로 표지한 후 효과기 세포와 37℃에서 4 h 동안 공동-인큐베이션한다. 상기 시간 동안, YTS 세포에 감수성인 표적 세포가 용해되어 51Cr을 배지 내로 방출한다. 회수된 상청액 중 51Cr을 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 측정한다. 수득된 결과는 NK 세포에 의한 표적 세포의 용해 백분율 평가를 허용한다. 검정을 E:T 비 5/1로, 완전 RPMI 중, 200 ㎕ 최종/웰로 96 U 웰 플레이트에서 수행하였다. 항-Siglec-7/9 항체 및 이소형 대조군을 10 ㎍/㎖ 및 1:10의 희석 시리즈로 첨가하였다.The effect of the anti-Siglec-7/9 antibody was then evaluated in a cytotoxicity assay (Cr 51 ) using the YTS Siglec-9* effector cell line (human NK cell line YTS transfected with human Siglec-9) as effectors and the Ramos cell line as targets. researched by This assessment measures the cytotoxicity of the YTS Siglec-9* cell line by directly quantifying the lysis of 51 Cr-loaded target cells. Briefly, target cells are first labeled with a radioactive 51 Cr isotope and then co-incubated with effector cells at 37° C. for 4 h. During this time, target cells sensitive to YTS cells are lysed and release 51 Cr into the medium. 51 Cr in the recovered supernatant is determined by liquid scintillation counting. The results obtained allow assessment of the percent lysis of target cells by NK cells. Assays were performed in 96 U well plates with 200 μl final/well in complete RPMI, with an E:T ratio of 5/1. Anti-Siglec-7/9 antibody and isotype control were added in a dilution series of 10 μg/ml and 1:10.

각각의 항-Siglec-7/9 mAbs mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6은 용량 의존적 방식으로 YTS Siglec-9* 세포독성의 증가를 유도하였다. 대조군으로, 상기 효과는 야생형 YTS 세포주(Siglec-9 발현 없음) 상에서는 관찰되지 않았다. 유사하게, 각각의 항-Siglec-9 mAbs mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE 및 mAbF는 용량 의존적 방식으로 YTS Siglec-9* 세포독성의 증가를 유도한다. 도 4는 Siglec-7 및 Siglec-9 교차 반응성 항체(도 4b) 중 및 Siglec-9 단일특이적(비-Siglec-7 결합) 항체(도 4a) 중 YTS Siglec-9* 세포독성 증가의 용량 의존적 유도를 나타낸다.Each of the anti-Siglec-7/9 mAbs mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 and mAb6 induced an increase in YTS Siglec-9* cytotoxicity in a dose dependent manner. As a control, this effect was not observed on the wild-type YTS cell line (no expression of Siglec-9). Similarly, each of the anti-Siglec-9 mAbs mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE and mAbF induces an increase in YTS Siglec-9* cytotoxicity in a dose dependent manner. FIG. 4 is a dose-dependent increase in YTS Siglec-9* cytotoxicity in Siglec-7 and Siglec-9 cross-reactive antibodies ( FIG. 4B ) and in Siglec-9 monospecific (non-Siglec-7 binding) antibodies ( FIG. 4A ). indicates induction.

실시예 8: 일차 인간 NK 세포(낮은 Siglec-9 발현)에서 Siglec-9 중화의 상세 연구Example 8: Detailed Study of Siglec-9 Neutralization in Primary Human NK Cells (Low Siglec-9 Expression)

본 발명자들은 NK 세포에서 Siglec-9를 중화시키지 못하는 선행 항체의 무능력이, 예를 들어, 이의 표면에 훨씬 더 높은 수준의 Siglec-9, 및 상이한 NK 세포 하위세트에서 발현되는 Siglec-7을 발현하는 호중구 및 다른 세포에 비해, 일차 NK 세포에서의 Siglec-9 발현차에 관련될 수 있다는 가능성을 고려하였다. NK 세포에서 Siglec-9를 중화시키는 항체가 수득될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 유세포 측정에 의해 Siglec-9 상에서 관문화된 여러 인간 공여체로부터 일차 NK 세포에서 항체를 연구하고 선택하였다. 전통적 51Cr 방출 검정에서 종양 세포 용해를 평가함으로써 세포독성에 의해, 그리고 NK 세포 상의 CD137 표면 발현을 평가함으로써 활성화 검정에 의해 항-Siglec-9 항체의 효과를 연구하였다. 각각의 경우, 일차 NK 세포(공여체로부터 정제된 신선 NK 세포)를 효과기 세포로 이용하고 HT29 결장직장암 세포주를 표적으로 이용하였다.We show that the inability of prior antibodies to neutralize Siglec-9 on NK cells can be attributed, for example, to significantly higher levels of Siglec-9 on its surface, and Siglec-7, which is expressed in different NK cell subsets. Compared to neutrophils and other cells, the possibility that Siglec-9 expression in primary NK cells may be involved was considered. To investigate whether antibodies that neutralize Siglec-9 in NK cells could be obtained, we studied and selected antibodies in primary NK cells from several human donors that were cultured on Siglec-9 by flow cytometry. The effect of anti-Siglec-9 antibody was studied by cytotoxicity by assessing tumor cell lysis in a traditional 51 Cr release assay and by activation assay by assessing CD137 surface expression on NK cells. In each case, primary NK cells (fresh NK cells purified from donors) were used as effector cells and the HT29 colorectal cancer cell line was used as a target.

파트 1: 세포독성 검정: 2명의 인간 공여체에서 정제된 NK 대 HT29 종양 세포Part 1: Cytotoxicity Assay: Purified NK vs. HT29 Tumor Cells from 2 Human Donors

세포독성 검정으로 51Cr-로딩된 표적 세포의 용해를 직접 정량하여 NK 세포 상에서 세포독성을 측정하였다. 간략하게, 표적 세포를 먼저 방사활성 51Cr 동위원소로 표지한 후 효과기 세포와 37℃에서 4 h 동안 공동-인큐베이션하였다. 이 시간 동안, NK 세포에 감수성인 표적 세포가 용해되어 배지 내로 51Cr을 방출하였다. 회수된 상청액 중 51Cr을 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 측정하였다. 수득된 결과는 NK 세포에 의한 표적 세포의 용해 백분율 평가를 허용한다. 검정을 E:T 비 8/1로, 완전 RPMI 중 200 ㎕ 최종/웰로 96 U 웰 플레이트에서 수행하였다. 항-Siglec-9 항체 및 이소형 대조군을 10 ㎍/㎖로 첨가하였다.Cytotoxicity was measured on NK cells by directly quantifying the lysis of 51 Cr-loaded target cells in a cytotoxicity assay. Briefly, target cells were first labeled with a radioactive 51 Cr isotope and then co-incubated with effector cells at 37°C for 4 h. During this time, target cells sensitive to NK cells were lysed and released 51 Cr into the medium. 51 Cr in the recovered supernatant was determined by liquid scintillation counting. The results obtained allow assessment of the percent lysis of target cells by NK cells. Assays were performed in 96 U well plates with an E:T ratio of 8/1, 200 μl final/well in complete RPMI. Anti-Siglec-9 antibody and isotype control were added at 10 μg/ml.

각각의 항-Siglec9 항체 mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, 및 mAbF 및 항-Siglec7/9 항체 mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 및 mAb6은 NK 세포 세포독성의 증가를 유도하였다. 도 5는 2명의 상이한 인간 공여체(공여체 D1(왼쪽 패널) 및 D2(오른쪽 패널))에서 항체 mAbA, mAbC, mAbD, mAbE, 및 mAbF에 의해 매개되는 일차 NK 세포 세포독성의 증가를 나타내는 대표도이다.Each of the anti-Siglec9 antibodies mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, and mAbF and the anti-Siglec7/9 antibodies mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 and mAb6 induced an increase in NK cell cytotoxicity. 5 is a representative diagram showing the increase in primary NK cell cytotoxicity mediated by antibodies mAbA, mAbC, mAbD, mAbE, and mAbF in two different human donors (donor D1 (left panel) and D2 (right panel)). .

파트 2: 활성화 검정(CD137): 단일 인간 공여체에서 정제된 NK 대 HT29, mAb 비교Part 2: Activation Assay (CD137): Comparison of Purified NK vs. HT29, mAb from a Single Human Donor

NK 세포 활성화에 대한 항-Siglec-7/9 및 항-Siglec-9 항체의 효과를 유세포 측정에 의해 Siglec-9 양성 NK 세포 상의 CD137 발현 분석에 의해 결정하였다. 효과기 세포는 일차 NK 세포(이용 전 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한, 공여체로부터 정제된 신선 NK 세포)였고 표적 세포(HT29 세포주)를 비 1:1로 혼합하였다. CD137 검정을 완전 RPMI 중, 200 ㎕ 최종/웰로 96 U 웰 플레이트에서 수행하였다. 항체를 효과기 세포와 37℃에서 30분 사전-인큐베이션한 후 표적 세포를 37℃에서 하룻밤 공동-인큐베이션하였다. 다음 단계는 500 g에서 3분 회전; 염색 완충액(SB)으로 2회 세척; 염색 Ab 혼합물(항 CD3 Pacific blue - BD Pharmingen; 항-CD56-PE-Vio770(Miltenyi); 항-CD137-APC(Miltenyi), 항 Siglec-9 K8-PE(Biolegend) 50 ㎕ 첨가; 4℃에서 30분 인큐베이션; SB로 2회 세척하고; SB로 펠렛을 재현탁하고; Canto II(HTS)으로 형광을 드러내었다.The effect of anti-Siglec-7/9 and anti-Siglec-9 antibodies on NK cell activation was determined by analysis of CD137 expression on Siglec-9 positive NK cells by flow cytometry. Effector cells were primary NK cells (fresh NK cells purified from donors, incubated overnight at 37° C. prior to use) and target cells (HT29 cell line) were mixed in a 1:1 ratio. The CD137 assay was performed in 96 U well plates at 200 μl final/well in complete RPMI. Antibodies were pre-incubated with effector cells at 37°C for 30 minutes followed by co-incubation of target cells at 37°C overnight. The next step was 3 min rotation at 500 g; Wash twice with staining buffer (SB); Staining Ab mixture (anti-CD3 Pacific blue - BD Pharmingen; anti-CD56-PE-Vio770 (Miltenyi); anti-CD137-APC (Miltenyi), 50 μl of anti-Siglec-9 K8-PE (Biolegend) added; 30 at 4°C) min incubation; wash twice with SB; resuspend the pellet in SB; fluorescence with Canto II (HTS).

음성 대조군은 NK 세포 대 HT29 단독 및 이소형 대조군의 존재 하였다. 도 6은 1명의 인간 공여체에서 몇몇 항-Siglec-9 및 항 Siglec-7/9 항체 mAbA, mAbB, mAbF, mAb6 및 mAb4에 의해 매개되는 CD137을 발현하는 Siglec-9-양성 NK 세포%의 증가를 나타내는 대표도이다. 대조군으로서, CD137을 발현하는 Siglec-9-음성 NK 세포%는 이들 항체에 의해 영향받지 않았다. 도면에서 알 수 있듯이, 항-Siglec-9 항체는 Siglec-9-발현 일차 인간 NK 세포의 세포독성을 동일한 공여체로부터 Siglec-9-음성 일차 인간 NK 세포에서 관찰되는 수준까지 완전 복원하였다.Negative controls were the presence of NK cells versus HT29 alone and isotype controls. 6 shows the increase in % of Siglec-9-positive NK cells expressing CD137 mediated by several anti-Siglec-9 and anti-Siglec-7/9 antibodies mAbA, mAbB, mAbF, mAb6 and mAb4 in one human donor. It is a representative diagram representing As a control, % of Siglec-9-negative NK cells expressing CD137 were not affected by these antibodies. As can be seen, the anti-Siglec-9 antibody completely restored the cytotoxicity of Siglec-9-expressing primary human NK cells to the level observed in Siglec-9-negative primary human NK cells from the same donor.

파트 3: 활성화 검정(CD137): 6명의 인간 공여체에서 정제된 NK 대 HT29, mAbA 및 mAb1Part 3: Activation Assay (CD137): Purified NK vs. HT29, mAbA and mAb1 from 6 Human Donors

하나의 항 Siglec-9(mAb.A) 및 하나의 항 Siglec-7/9(mAb1)를 이용하여 6명의 공여체로 실험을 재현하였다. 항체의 부재 하에("배지" 상황), CD137 발현 NK%는 공여체 사이에서 6% 내지 27%로 변하였다((도 7, 왼쪽 패널) 참고). 데이터를 각 실험으로부터의 대조군 배지 값 대비 상대 변화로 정상화하였다: ((X - X배지))/X배지)(%). 도 7에 나타낸 바와 같이, mAbA 및 mAb1은 Siglec-9+ CD137+ NK%의 증가를 유도하였고(도 7, 중간 패널), Siglec-9- CD137+ NK%의 증가는 유도하지 않았다(도 7, 오른쪽 패널).Experiments were reproduced with 6 donors using one anti-Siglec-9 (mAb.A) and one anti-Siglec-7/9 (mAb1). In the absence of antibody (“medium” situation), % CD137 expressing NK varied between 6% and 27% between donors ( see FIG. 7 , left panel). Data were normalized to relative change relative to control medium values from each experiment: ((X - X medium ))/X medium )(%). As shown in Fig. 7, mAbA and mAb1 induced an increase in Siglec-9+ CD137+ NK% (Fig. 7, middle panel), but not an increase in Siglec-9-CD137+ NK% (Fig. 7, right panel). ).

실시예 9: 일차 NK 세포 상의 적정Example 9: Titration on Primary NK Cells

신선 정제 인간 NK 세포 상의 항체 결합을 유세포 측정에 의한 적정 실험에 의해 평가하였다. 세포를 일차 항체 10 ㎍/㎖ 및 1:10의 희석 시리즈 함유 염색 완충액(SB) 중 1 h 인큐베이션하였다. 이를 SB로 3회 세척한 후, 염소 F(ab')2 항-인간 IgG(Fc) PE(Jackson ImmunoResearch)와 30분 인큐베이션하였다. 염색을 BD FACS Canto II 상에서 획득하고 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. EC50 값을 아아래의 표에 ㎍/㎖로 나타낸다(4-파라미터 로지스틱 피팅을 이용하여 계산함).Antibody binding on freshly purified human NK cells was assessed by flow cytometry titration experiments. Cells were incubated for 1 h in staining buffer (SB) containing 10 μg/ml of primary antibody and a dilution series of 1:10. After washing 3 times with SB, it was incubated with goat F(ab') 2 anti-human IgG(Fc) PE (Jackson ImmunoResearch) for 30 minutes. Staining was acquired on a BD FACS Canto II and analyzed using FlowJo software. EC 50 values are presented in μg/ml in the table below (calculated using 4-parameter logistic fitting).

Figure 112018096971757-pct00023
Figure 112018096971757-pct00023

실시예 10: 시알산 리간드로의 Siglec 결합 차단Example 10: Siglec Binding Blocking to Sialic Acid Ligand

파트 A: 유세포 측정에 의한 시알산 발현 종양 세포로의 Siglec-9 결합의 차단Part A: Blocking of Siglec-9 Binding to Sialic Acid Expressing Tumor Cells by Flow Cytometry

항-인간 Siglec-9 Fab의 용량-범위를 고정 용량의 인간 Siglec-9 Fc 융합 재조합 단백질과 실온에서 30분 공동-인큐베이션한 후, 1시간 동안 다양한 시알산 발현 세포주 K562 E6(인간 HLA-E로 전달감염된 K562 세포주) 및 Ramos 상에 첨가하였다. 세포를 염색 완충액 중 2회 세척 후, 염색 완충액 중 희석된 PE-커플링된 염소 항-마우스 IgG Fc 단편 이차 항체(Jackson Immunoresearch)를 세포에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고 HTFC 플레이트 판독기가 장착된 Accury C6 유세포 측정기 상에서 분석하였다. 형광 평균 대 Fab 및 Siglec-9 Fc 융합 재조합 단백질의 비를 그래프 상에 도시하였다.The dose-range of anti-human Siglec-9 Fab was co-incubated with a fixed dose of human Siglec-9 Fc fusion recombinant protein for 30 min at room temperature followed by 1 h in various sialic acid expressing cell lines K562 E6 (with human HLA-E). transfected K562 cell line) and Ramos. After washing the cells twice in staining buffer, PE-coupled goat anti-mouse IgG Fc fragment secondary antibody (Jackson Immunoresearch) diluted in staining buffer was added to the cells and the plate was incubated at 4°C for an additional 30 minutes. . Cells were washed twice and analyzed on an Accury C6 flow cytometer equipped with an HTFC plate reader. The fluorescence mean versus the ratio of the Fab and Siglec-9 Fc fusion recombinant proteins are plotted on the graph.

결과를 도 8에 나타낸다. 상부 패널에, 항체의 존재 하에 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 나타낸다. 항-Siglec/9 mAb mAbA, mAbB, mAbC, 및 mAbD는 각각 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 억제한 반면, mAbE는 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 억제하는 부분적 능력을 나타내었고, mAbF는 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 유의미하게 억제하지 않았다. 도 8, 하부 패널에, 항체의 존재 하에 K562 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 나타낸다. 항-Siglec/9 mAb mAbA, mAbB, mAbC 및 mAbD는 각각 Ramos 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질 결합을 억제한 반면, mAbE 및 mAbF는 둘 다 K562 세포로의 Siglec-9-Fc 단백질의 결합을 억제하는 부분적 능력을 상당히 더 높은 항체 농도에서만 나타내었다. 결론적으로, 항체 mAbA, mAbB, mAbC, 및 mAbD는 종양 세포 상에서 그 시알산 리간드에 대한 Siglec-9의 결합을 완전 차단하는 반면, 항체 mAbE 차단은 시알산 발현 세포주에 의존하며 mAbF는 결합을 차단하지 않는다.The results are shown in FIG. 8 . In the upper panel, the binding of Siglec-9-Fc protein to Ramos cells in the presence of antibody is shown. The anti-Siglec/9 mAbs mAbA, mAbB, mAbC, and mAbD inhibited Siglec-9-Fc protein binding to Ramos cells, respectively, whereas mAbE inhibited Siglec-9-Fc protein binding to Ramos cells. showed partial ability, and mAbF did not significantly inhibit the binding of Siglec-9-Fc protein to Ramos cells. Figure 8, lower panel, shows binding of Siglec-9-Fc protein to K562 cells in the presence of antibody. Anti-Siglec/9 mAbs mAbA, mAbB, mAbC and mAbD inhibited Siglec-9-Fc protein binding to Ramos cells, respectively, whereas mAbE and mAbF both inhibited Siglec-9-Fc protein binding to K562 cells. A partial ability to inhibit was shown only at significantly higher antibody concentrations. In conclusion, antibodies mAbA, mAbB, mAbC, and mAbD completely block binding of Siglec-9 to its sialic acid ligand on tumor cells, whereas antibody mAbE blockade is dependent on sialic acid expressing cell lines and mAbF does not block binding. does not

파트 B: ELISA 검정에 의한 시알릴화 리간드로의 Siglec-7 및 Siglec-9 결합의 차단Part B: Blocking of Siglec-7 and Siglec-9 Binding to Sialylation Ligands by ELISA Assay

시알산은 형성된 글리코실화 단백질 및 지질 상의 9-탄소 카복실화 단당류이다. 시알릴트랜스퍼라제(이의 생합성을 촉매함) 및 뉴라미니다제로도 명명되는 시알리다제(이의 절단을 촉매함)를 포함하는 몇몇 효소가 포유류 시스템에서 이의 발생을 조절한다. 암에서, 변형된 시알산 프로필은 종양 성장, 전이의 증강 및 면역 감독의 회피에서 우세한 역할을 담당하여, 암 세포 생존을 야기한다(Bork et al., J Pharm Sci. 2009 Oct;98(10):3499-508). 시알릴화를 조절하는 변형된 효소 프로필과 함께 증가된 시알릴화가 몇몇 암에서 보고되었다. ST3GAL6 효소는 다발성 골수종 세포주 및 환자에서 과발현되며, 시험관 내에서 다발성 골수종 세포의 표면 상 α-2,3-연관 시알산의 발현과 연관된다. 생체 내에서, ST3GAL6 녹다운은 감소된 종양 부담 및 연장된 생존과 더불어, 다발성 골수종 세포의 감소된 귀소 및 골수 틈새로의 그래프팅과 연관된다(Glavey et al., Blood. 2014 Sep 11;124(11):1765-76). 교종에서의 높은 ST3GAL1 효소 발현은 더 높은 종양 등급의 중간엽 분자 분류와 연관된다(Chong et al., Natl Cancer Inst. 2015 Nov 7;108(2). 비정상적인 프로모터 메틸화는 암에서 몇몇 시알릴 트랜스퍼라제 발현의 조정에서 역할을 담당한다(Vojta et al., Biochim Biophys Acta. 2016 Jan 12). 방광암에서, 비정상적인 ST6GAL1 프로모터 메틸화는 ST6Gal1 발현 손실을 유도한다(Antony et al., BMC Cancer. 2014 Dec 2;14:901). Sialic acid is a 9-carbon carboxylated monosaccharide on the formed glycosylated proteins and lipids. Several enzymes regulate their development in mammalian systems, including sialyltransferase (which catalyzes its biosynthesis) and sialidase (which catalyzes its cleavage), also termed neuraminidase. In cancer, the altered sialic acid profile plays a predominant role in tumor growth, enhancement of metastasis and evasion of immune oversight, leading to cancer cell survival (Bork et al., J Pharm Sci. 2009 Oct; 98(10)). :3499-508). Increased sialylation with altered enzyme profiles regulating sialylation has been reported in several cancers. The ST3GAL6 enzyme is overexpressed in multiple myeloma cell lines and patients, and is associated with the expression of α-2,3-linked sialic acids on the surface of multiple myeloma cells in vitro. In vivo, ST3GAL6 knockdown is associated with reduced homing of multiple myeloma cells and grafting into the bone marrow niche, along with reduced tumor burden and prolonged survival (Glavey et al., Blood. 2014 Sep 11;124(11). ):1765-76). High ST3GAL1 enzyme expression in gliomas is associated with higher tumor grade mesenchymal molecular classification (Chong et al., Natl Cancer Inst. 2015 Nov 7;108(2). Abnormal promoter methylation is associated with several sialyl transferases in cancer. plays a role in the regulation of expression (Vojta et al., Biochim Biophys Acta. 2016 Jan 12) In bladder cancer, aberrant ST6GAL1 promoter methylation leads to loss of ST6Gal1 expression (Antony et al., BMC Cancer. 2014 Dec 2; 14:901).

Siglec-7 및 Siglec-9는 다양한 시알산 결합에 결합한다. 칩 상에 인쇄된 시알로사이드 라이브러리로 몇몇 Siglec 및 하나의 선택적 Siglec-7 리간드에 공통적인 시알로사이드 리간드를 확인하였다(Rillahan et al., ACS Chem Biol. 2013 Jul 19;8(7):1417-22). Siglec-7 및 Siglec-9에 의한 시알로사이드의 가능한 차별적 인식의 관점에서, 면역 세포 상의 Siglec-7 및 Siglec-9 둘 다의 표적화는 다양한 시알릴 트랜스퍼라제 및 시알산이 주어지는 몇몇 암 유형의 표적화를 허용할 수 있다.Siglec-7 and Siglec-9 bind to various sialic acid bonds. A sialoside library printed on a chip identified sialoside ligands common to several Siglec and one selective Siglec-7 ligand (Rillahan et al., ACS Chem Biol. 2013 Jul 19;8(7):1417). -22). In view of the possible differential recognition of sialosides by Siglec-7 and Siglec-9, targeting of both Siglec-7 and Siglec-9 on immune cells suggests targeting of several cancer types given various sialyl transferases and sialic acid. can allow

항 Siglec-7/9 항체에 의한 Siglec-7 및 Siglec-9 그리고 시알릴화 리간드 간 상호작용의 차단을 ELISA 검정에서 평가하였다. Siglec 단백질은 Siglec-7 인간 Fc 및 Siglec-9 인간 Fc 재조합 단백질이었고, 리간드는 시알릴화 삼당류를 함유하는 바이오틴화 중합체였다("Sia1"로 나타내는 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb-PAA-바이오틴 Glycotech # 01-077 및 6'-시알릴락토스-PAA-바이오틴 Glycotech # 01-039("Sia2"로 나타냄). 간략하게, 단백질 A를 4℃에서 하룻밤 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 3회 세척 및 포화 후, Siglec-7 Fc 및 Siglec-9 Fc를 1H30 동안 RT에서 0.8 ㎍/웰로 첨가하였다. 3회 세척 후, mAb를 20 ㎍/㎖로 및 1:5의 희석 시리즈로 첨가하였다. 3회 세척 후, 바이오틴화 시알릴화 중합체를 실온에서 3시간 동안 첨가하였다. 3회 세척 후, 스트렙타비딘-퍼옥시다제(Beckman)를 1:1000으로 첨가하였다. 마지막으로, Siglec-7 및 Siglec-9 단백질 상의 바이오틴화 중합체의 결합을 암소 내 RT에서 TMB(Interchim)의 첨가에 의해 드러내었고, 반응을 H2SO4의 첨가에 의해 중단시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.Blocking of the interaction between Siglec-7 and Siglec-9 and sialylated ligands by anti-Siglec-7/9 antibodies was evaluated in an ELISA assay. The Siglec protein was a Siglec-7 human Fc and Siglec-9 human Fc recombinant protein, and the ligand was a biotinylated polymer containing sialylated trisaccharide (Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb-PAA-biotin Glycotech #01- denoted "Sia1") 077 and 6'-Sialyllactose-PAA-Biotin Glycotech #01-039 (referred to as "Sia2") Briefly, Protein A was coated onto ELISA plates overnight at 4° C. After 3 washes and saturation, Siglec -7 Fc and Siglec-9 Fc were added at 0.8 μg/well at RT during 1H30.After 3 washes, mAb was added at 20 μg/ml and in a dilution series of 1:5.After 3 washes, biotinylation The sialylated polymer is added at room temperature for 3 hours.After 3 washes, streptavidin-peroxidase (Beckman) is added 1:1000. Finally, the biotinylated polymer on Siglec-7 and Siglec-9 proteins. was revealed by the addition of TMB (Interchim) at RT in the dark and the reaction was stopped by the addition of H2SO4 Absorbance was read at 450 nm.

결과를 도 9 및 10에 나타낸다. mAb1, mAb2, mAb4, mAb5 및 mAb6은 Sia2와 Siglec-7의 상호작용을 차단하였으나, mAb3은 이를 차단하지 않았다(도 9). 모든 mAb가 Sia2와의 Siglec-9 상호작용을 차단하였으나(도 10), mAb1, mAb2 및 mAb3은 Sia1과 Siglec-9의 상호작용을 억제하는 능력을 적게 나타내었고(도 10), 이에 따라 Sia1 상호작용을 실질적으로 차단하지 않았다. mAb5 및 mAb6은 Sia1과 Siglec-9의 상호작용을 차단하였고, mAb4는 Sia1과 Siglec-9의 상호작용을 차단하는 중간 정도의 능력을 가졌다. Siglec-9 상의 차단 효과는 시알산 유형에 의존한다. 전반적으로, 가장 완전한 억제는 항-Siglec-9 항체 mAbA, mAbB, mAbC 및 mAbD로 관찰되었고 이는 시알산과 Siglec-9 상호작용의 실질적으로 완전 억제를 달성하였다.The results are shown in FIGS. 9 and 10 . mAb1, mAb2, mAb4, mAb5 and mAb6 blocked the interaction of Sia2 with Siglec-7, but mAb3 did not ( FIG. 9 ). All mAbs blocked the Siglec-9 interaction with Sia2 ( FIG. 10 ), but mAb1, mAb2 and mAb3 showed little ability to inhibit the interaction of Sia1 with Siglec-9 ( FIG. 10 ), and thus the Sia1 interaction has not been substantially blocked. mAb5 and mAb6 blocked the interaction of Sia1 with Siglec-9, and mAb4 had an intermediate ability to block the interaction of Sia1 with Siglec-9. The blocking effect on Siglec-9 is dependent on the sialic acid type. Overall, the most complete inhibition was observed with the anti-Siglec-9 antibodies mAbA, mAbB, mAbC and mAbD, which achieved substantially complete inhibition of the Siglec-9 interaction with sialic acid.

실시예 11: 점 돌연변이를 이용한 항-Siglec 항체의 에피토프Example 11: Epitope of anti-Siglec antibody using point mutation

항-Siglec-9 항체의 에피토프를 정의하기 위해, 본 발명자들은 먼저 HEK293T 세포에서 태그 V5와 함께 각각의 단일 Siglec-9 도메인(V-세트 Ig-유사 도메인, Ig-유사 C2-유형 도메인 1, 및 Ig-유사 C2-유형 도메인 2)을 발현하고 각각의 단백질에 대한 항체의 결합을 평가하여 본 발명의 항체의 결합 도메인을 확인하였다.To define the epitope of the anti-Siglec-9 antibody, we first analyzed each single Siglec-9 domain (V-set Ig-like domain, Ig-like C2-type domain 1, and The binding domain of the antibody of the present invention was identified by expressing an Ig-like C2-type domain 2) and evaluating the binding of the antibody to each protein.

이어서 본 발명자들은 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인의 표면에 걸친 분자 표면에 노출된 아미노산의 치환에 의해 정의된 Siglec-9 돌연변이체를 설계하였다. Siglec-9의 구조는 아직 풀리지 않았으나, 이용 가능한 Siglec 구조 중, Siglec-7이 가장 가까운 구성원이다(Siglec-9 아미노산 서열과 80% 초과 동일성을 가짐). 결과적으로, 본 발명자들은 Siglec-9 돌연변이체를 설계하기 위해 Siglec-7 구조를 이용하였다. SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드의 원상태 Siglec-9 펩타이드 리더를 치환 리더 서열 및 V5 태그(표 1에서 Siglec-9 도메인 단백질 V-세트 Ig-유사 도메인, Ig-유사 C2-유형 도메인 1, 및 Ig-유사 C2-유형 도메인 2에 나타냄), 이어서 표 1의 Siglec-9 아미노산 서열로 대체하였고, 여기에 표 3에 기재된 아미노산 치환을 포함시켰다. 단백질을 HEK293T 세포주에서 발현시켰다.We then designed a Siglec-9 mutant defined by the substitution of amino acids exposed on the molecular surface across the surface of the N-terminal V-set Ig-like domain. The structure of Siglec-9 has not yet been resolved, but among the available Siglec structures, Siglec-7 is the closest member (having greater than 80% identity to the Siglec-9 amino acid sequence). Consequently, we used the Siglec-7 structure to design a Siglec-9 mutant. The native Siglec-9 peptide leader of the polypeptide of SEQ ID NO: 2 was replaced with a substitution leader sequence and a V5 tag (Siglec-9 domain protein V-set Ig-like domain, Ig-like C2-type domain 1, and Ig in Table 1) -Like C2-type domain 2), then replaced with the Siglec-9 amino acid sequence in Table 1, which includes the amino acid substitutions listed in Table 3. The protein was expressed in the HEK293T cell line.

모든 도면(도 11 내지 14)은 상기 문헌[Alphey et al (2003)]에 기재된, SIGLEC-7 구조 107V의 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인에 대응한다. 도면은 말단 시알산 당 상에서 카복실기와의 상호작용에 대해 모든 Siglec에서 보존되는 주요 잔기인 아르기닌 124, 및 Siglec-7 및 Siglec-9 간에 보존된 주변 잔기 W132, K131, K135 및 N133을 포함하며 또한 시알산 결합에 대해 필수적인 것으로 기재되는 리간드 결합 영역을 밝은 색조로 나타낸다. W132는 시알산의 글리세롤 모이어티와 소수성 상호작용을 제공한다. 표 3에서 표적화된 아미노산 돌연변이는 Siglec-7 및 Siglec-9 둘 다에 존재하는 잔기이며, Siglec-7에 대해 SEQ ID NO: 1 또는 Siglec-9에 대해 SEQ ID NO: 2의 넘버링을 이용하여 나타낸다(야생형 Siglec-9에서의 잔기/잔기의 위치/돌연변이체에서의 잔기).All figures ( FIGS. 11-14 ) correspond to the N-terminal V-set Ig-like domain of SIGLEC-7 structure 107V, described in Alphey et al (2003), supra. The figure includes arginine 124, a major residue conserved in all Siglec for interaction with carboxyl groups on the terminal sialic acid sugar, and peripheral residues W132, K131, K135 and N133 conserved between Siglec-7 and Siglec-9, also containing sialic acid Ligand binding regions described as essential for acid binding are shown in light shades. W132 provides a hydrophobic interaction with the glycerol moiety of sialic acid. The amino acid mutations targeted in Table 3 are residues present in both Siglec-7 and Siglec-9 and are shown using the numbering of SEQ ID NO: 1 for Siglec-7 or SEQ ID NO: 2 for Siglec-9. (residues/positions of residues in wild-type Siglec-9/residues in mutants).

Ref.Ref. SEQ ID NO: 1의 Siglec-7에 대해 나타내는 돌연변이Mutations shown for Siglec-7 of SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 2의 Siglec-9에 대해 나타내는 돌연변이Mutations shown for Siglec-9 of SEQ ID NO: 2
M1M1 Q19A-T20A-S21N-K22AQ19A-T20A-S21N-K22A Q18A-T19A-S20N-K21AQ18A-T19A-S20N-K21A M2M2 L27T-T29A-S47A-S49A-K104NL27T-T29A-S47A-S49A-K104N L22T-T24A-S42A-S44A-K100NL22T-T24A-S42A-S44A-K100N M3M3 Q31E-S33K-T35VQ31E-S33K-T35V Q26E-S28K-T30VQ26E-S28K-T30V M5M5 H43L-P45A-H96F-L98S-N105D-T107A-S109AH43L-P45A-H96F-L98S-N105D-T107A-S109A H38L-P40A-H92F-L94S-N101D-T103A-S105AH38L-P40A-H92F-L94S-N101D-T103A-S105A M6M6 S52L-H53T-G54D-W55S-I56A-Y57A-P58A-G59SS52L-H53T-G54D-W55S-I56A-Y57A-P58A-G59S S47L-H48T-G49D-W50S-I51A-Y52A-P53A-G54SS47L-H48T-G49D-W50S-I51A-Y52A-P53A-G54S M7M7 P60S-H62A-E126A-G128S-S129K-K131AP60S-H62A-E126A-G128S-S129K-K131A P55S-H58A-E122A-G124S-S125K-K127AP55S-H58A-E122A-G124S-S125K-K127A M8M8 R67A-A70T-N71A-T72R-D73R-Q74K-D75AR67A-A70T-N71A-T72R-D73R-Q74K-D75A R63A-A66T-N67A-T68R-D69R-Q70K-D71AR63A-A66T-N67A-T68R-D69R-Q70K-D71A M9M9 N82A-P83S-A84S-R85S-A86K-V87SN82A-P83S-A84S-R85S-A86K-V87S N78A-P79S-A80S-R81S-A82K-V83SN78A-P79S-A80S-R81S-A82K-V83S M10M10 N81A-D100A-H102W-T103RN81A-D100A-H102W-T103R N77A-D96A-H98W-T99RN77A-D96A-H98W-T99R M11M11 W88V-E89K-E90A-R92AW88V-E89K-E90A-R92A W84V-E85K-E86A-R88AW84V-E85K-E86A-R88A M12M12 D93A-R94A-R111S-D112A-R114AD93A-R94A-R111S-D112A-R114A D89A-R90A-R107S-D108A-R110AD89A-R90A-R107S-D108A-R110A M13M13 E38A-R115A-S116K-N142V-T144A-A118SE38A-R115A-S116K-N142V-T144A-A118S E33A-R111A-S112K-N138V-T140A-A114SE33A-R111A-S112K-N138V-T140A-A114S M14M14 R124A-W132Y-N133AR124A-W132Y-N133A R120A-W128Y-N129AR120A-W128Y-N129A M15M15 H137D-R138A-R120S-S32RH137D-R138A-R120S-S32R H133D-R134A-R116S-S27RH133D-R134A-R116S-S27R M16M16 K135M-H136WK135M-H136W K131M-H132WK131M-H132W

돌연변이체의 생성generation of mutants

Siglec-9 돌연변이체를 PCR에 의해 생성하였다. 증폭된 서열을 아가로스 겔 상에서 수행하고 Macherey Nagel PCR Clean-Up 겔 추출 키트를 이용하여 정제하였다. 이어서 각각의 돌연변이체에 대해 생성된 정제 PCR 산물을 ClonTech InFusion™ 시스템으로 발현 벡터 내로 결찰하였다. 돌연변이된 서열을 함유하는 벡터를 Miniprep으로 제조하고 서열분석하였다. 서열분석 후, 돌연변이된 서열을 함유하는 벡터를 Promega PureYield™ 플라스미드 Midiprep 시스템을 이용하여 Midiprep™으로 제조하였다. HEK293T 세포를 DMEM 배지(Invitrogen) 중에 성장시키고, Invitrogen의 Lipofectamine™ 2000을 이용하여 벡터로 전달감염시키고 트랜스유전자 발현에 대한 평가 전 24시간 또는 48시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다.Siglec-9 mutants were generated by PCR. The amplified sequence was run on an agarose gel and purified using the Macherey Nagel PCR Clean-Up Gel Extraction Kit. The resulting purified PCR products for each mutant were then ligated into expression vectors with the ClonTech InFusion™ system. Vectors containing the mutated sequences were prepared and sequenced with Miniprep. After sequencing, vectors containing the mutated sequences were prepared with Midiprep™ using the Promega PureYield™ plasmid Midiprep system. HEK293T cells were grown in DMEM medium (Invitrogen), transfected with vectors using Invitrogen's Lipofectamine™ 2000 and incubated at 37° C. in a CO 2 incubator for 24 or 48 hours prior to evaluation for transgene expression.

HEK293T 전달감염된 세포로의 항-Siglec-9 결합의 유세포 측정 분석Flow cytometric analysis of anti-Siglec-9 binding to HEK293T transfected cells

항체 mAb4, mAb5 및 mAb6은 Ig-유사 C2-유형 도메인 1에 결합한 반면 mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE mAbF, mAb1, mAb2 및 mAb3은 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인에 결합하였다. V-세트 Ig-유사 도메인 결합 항체를 유세포 측정에 의해 각각의 돌연변이체 1 내지 16으로의 이의 결합에 대해 평가하였다. 제1 실험을 수행하여 하나의 농도에서 하나 또는 몇몇 돌연변이체에 대해 이의 결합을 소실하는 항체를 결정하였다. 결합의 손실을 확인하기 위해, 그 결합이 Siglec-9 돌연변이에 의해 영향받는 것으로 보이는 항체 상에서 항체의 적정을 수행하였다. 결과를 아래의 표 4에 나타낸다.Antibodies mAb4, mAb5 and mAb6 bound Ig-like C2-type domain 1 whereas mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE mAbF, mAb1, mAb2 and mAb3 bound N-terminal V-set Ig-like domains. V-set Ig-like domain binding antibodies were evaluated for their binding to each of mutants 1-16 by flow cytometry. A first experiment was performed to determine antibodies that lost their binding to one or several mutants at one concentration. To confirm the loss of binding, titration of the antibody was performed on the antibody whose binding appeared to be affected by the Siglec-9 mutation. The results are shown in Table 4 below.

항체는 집단에서 가변하는 잔기 K100(SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 참조) 또는 K104(SEQ ID NO: 1의 Siglec-7 참조)에서의 치환을 포함하는 돌연변이체 M2에 대한 결합을 손실하지 않았다; 이에 따라, 항체는 표 1에 나타낸 Siglec-9 대립유전자(SEQ ID NO: 160)에 결합할 것이다.The antibody did not lose binding to mutant M2 comprising a substitution at residues K100 (see Siglec-9 of SEQ ID NO: 2) or K104 (see Siglec-7 of SEQ ID NO: 1) that varied in the population. ; Accordingly, the antibody will bind to the Siglec-9 allele shown in Table 1 (SEQ ID NO: 160).

항-Siglec-7 및 항-Siglec-9 특이적 항체 mAb1, mAb2 및 mAb3, 및 Siglec-9 특이적 항체 mAbE 및 mAbF는 모두 Siglec-9의 돌연변이체 M9, M10 및 M11에 대한 결합을 손실하였으나, 모든 다른 돌연변이체에 대해서는 그렇지 않았다. 돌연변이체 9는 잔기 N78, P79, A80, R81, A82 및 V83(Siglec-9 참조)에 아미노산 치환을 함유하여, 돌연변이체의 하나 이상의, 또는 모든 잔기가 이들 항체의 코어 에피토프에 중요함을 시사한다. 돌연변이체 10은 잔기 N77, D96, H98 및 T99에 아미노산 치환을 함유하여, 돌연변이체의 하나 이상의, 또는 모든 잔기가 이들 항체의 코어 에피토프에 중요함을 시사한다. 돌연변이체 11은 잔기 W84, E85, E86 및 R88에 아미노산 치환을 함유하여, 돌연변이체의 하나 이상의, 또는 모든 잔기가 이들 항체의 코어 에피토프에 중요함을 시사한다. 도 11에 나타낸 바와 같이, M9, M10 및 M11에서 치환된 잔기는 시알산 결합 부위를 함유하는 면(밝은 색조)에서 벗어난 N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인의 면(어두운 색조) 상에서 확인된다. 특히, 항체는 Siglec의 시알릭 리간드 특이성을 정의하는 C-C' 루프 도메인에 돌연변이를 갖는 M8(예컨대, 문헌[Alphey et al., 2003 J. Biol. Chem. 278(5):3372-3377] 참고), 또는 부분적으로 리간드 결합 영역을 커버하는 M16의 M15로의 결합을 소실하지 않았다. 따라서 항체는 시알산 접촉 영역 또는 결합 부위, 또는 C-C' 루프로 결합하지 않고, Siglec-9의 차단에서 높은 효능을 달성한다.The anti-Siglec-7 and anti-Siglec-9 specific antibodies mAb1, mAb2 and mAb3, and the Siglec-9 specific antibodies mAbE and mAbF all lost binding of Siglec-9 to mutants M9, M10 and M11, This was not the case for all other mutants. Mutant 9 is a residue It contains amino acid substitutions at N78, P79, A80, R81, A82 and V83 (see Siglec-9), suggesting that one or more, or all, residues of the mutant are important for the core epitope of these antibodies. Mutant 10 contains amino acid substitutions at residues N77, D96, H98 and T99, suggesting that one or more, or all, residues of the mutant are important for the core epitopes of these antibodies. Mutant 11 contains amino acid substitutions at residues W84, E85, E86 and R88, suggesting that one or more, or all, residues of the mutant are important for the core epitope of these antibodies. As shown in Figure 11 , substituted residues in M9, M10 and M11 are identified on the face of the N-terminal V-set Ig-like domain (dark tint) off the face containing the sialic acid binding site (light tint). . In particular, the antibody is M8 with a mutation in the CC' loop domain defining the sialic ligand specificity of Siglec (see, e.g., Alphey et al., 2003 J. Biol. Chem. 278(5):3372-3377). , or the binding of M16 to M15 partially covering the ligand binding region was not lost. The antibody thus achieves high efficacy in blocking Siglec-9 without binding to the sialic acid contact region or binding site, or the CC' loop.

항-Siglec-9 특이적 항체 mAbD는 돌연변이체 M6으로의 결합을 소실하였으나, 임의의 다른 돌연변이체에 대해서는 그렇지 않았다. 돌연변이체 6은 잔기 S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 및 G54(Siglec-9 참조)에 아미노산 치환을 함유하여, 돌연변이체의 하나 이상의, 또는 모든 잔기가 항체의 코어 에피토프에 중요함을 시사한다. 도 12에 나타낸 바와 같이, M6(진한 색조)에서 치환된 잔기는 시알산 결합 부위를 함유하지만, 리간드 결합 부위 외부에 있는(밝은 색조) N-말단 V-세트 Ig-유사 도메인면의 상부에서 확인된다. mAbD는 M7로의 결합을 소실하지 않았으나, 상기 돌연변이체 M7에 대한 결합의 부분적 감소를 나타내었다; M7은 리간드 결합 영역(밝은 색조) 내로 부분적으로 중첩될 수 있는 잔기를 함유한다. M7에는 잔기 P55, H58, E122, G124, S125 및 K127(Siglec-9 참조)에 아미노산 치환이 포함되었다. 따라서, M7의 잔기는 항체의 코어 에피토프에 중요하지 않다. 항체는 C-C' 루프 도메인에 돌연변이를 갖는 M8 또는 부분적으로 리간드 결합 영역을 커버하는 M16의 M15에 대한 결합을 소실하지 않았다. 따라서 항체는 시알산 접촉 영역 또는 결합 부위, 또는 C-C' 루프에 결합하지 않고 Siglec-9의 차단에서 높은 효능을 달성한다.The anti-Siglec-9 specific antibody mAbD lost binding to mutant M6, but not to any of the other mutants. Mutant 6 contains amino acid substitutions at residues S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 and G54 (see Siglec-9), such that one or more, or all, residues of the mutant are important for the core epitope of the antibody suggests As shown in Figure 12 , residues substituted at M6 (dark tint) contain the sialic acid binding site, but are outside the ligand binding site (light tint) and are identified on top of the face of the N-terminal V-set Ig-like domain. do. mAbD did not abolish binding to M7, but showed a partial decrease in binding to the mutant M7; M7 contains residues that may partially overlap into the ligand binding region (light tint). M7 contained amino acid substitutions at residues P55, H58, E122, G124, S125 and K127 (see Siglec-9). Thus, the residues of M7 are not critical to the core epitope of the antibody. The antibody did not lose binding to M15 of M8 with a mutation in the CC' loop domain or M16 partially covering the ligand binding region. The antibody thus achieves high efficacy in blocking Siglec-9 without binding to the sialic acid contact region or binding site, or the CC' loop.

항-Siglec-9 특이적 항체 mAbA 및 mAbB는 둘 다 Siglec-9의 돌연변이체 M16에 대한 결합을 소실하였으나, 임의의 다른 돌연변이체에 대해서는 그렇지 않았다. 돌연변이체 16은 잔기 K131 및 H136(Siglec-9 참조)에 아미노산 치환을 함유하여, 돌연변이체의 하나 이상의, 또는 모든 잔기가 이러한 항체의 코어 에피토프에 중요함을 시사한다. 흥미롭게도, M16은 Siglec-9의 시알산 리간드 접촉 부위의 근위 또는 내에 있고(도 13 참고), 항체는 M8(C-C' 루프 도메인 돌연변이체, 또는 M15에 대한 결합을 소실하지 않았다. 따라서 항체는 C-C' 루프에 결합하지 않고, Siglec-9 차단에서, 그리고 또한 시알산 접촉 영역 내에서 높은 효능을 달성한다.The anti-Siglec-9 specific antibodies mAbA and mAbB both lost binding of Siglec-9 to mutant M16, but not to any of the other mutants. Mutant 16 contains amino acid substitutions at residues K131 and H136 (see Siglec-9), suggesting that one or more, or all, residues of the mutant are important for the core epitope of this antibody. Interestingly, M16 is proximal or within the sialic acid ligand contact site of Siglec-9 (see Figure 13 ), and the antibody did not lose binding to M8 (CC' loop domain mutant, or M15. Thus, the antibody was ' Without binding to the loop, high efficacy is achieved in Siglec-9 blocking, and also within the sialic acid contact region.

다른 한 편, 항체 mAbC는 Siglec-9의 돌연변이체 M8(즉, C-C' 루프 내)로의 결합을 소실하였으나, M15 또는 M16으로의, 또는 M6, M7 또는 M8로의, 또는 M9, M10 또는 M11로의(또는 임의의 다른 돌연변이체로의) 결합을 소실하지 않았고, M15 및 M16으로의 결합은 부분적으로 감소하였다. M8에서 돌연변이된 잔기를 도 14에 나타낸다. 돌연변이체 8은 잔기 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및 D71(Siglec-9 참조)에 아미노산 치환을 함유하여, 돌연변이체의 하나 이상의, 또는 모든 잔기가 이들 항체의 코어 에피토프에 중요함을 시사한다. 따라서, 항체는 Siglec의 시알산 특이성을 정의하는 C-C' 루프 도메인 내 잔기에 결합한다.On the other hand, antibody mAbC lost binding of Siglec-9 to mutant M8 (i.e. in the CC' loop), but to M15 or M16, or to M6, M7 or M8, or to M9, M10 or M11 ( or to any other mutants), and binding to M15 and M16 was partially reduced. The mutated residues in M8 are shown in FIG. 14 . Mutant 8 contains amino acid substitutions at residues R63, A66, N67, T68, D69, Q70 and D71 (see Siglec-9), indicating that one or more, or all, residues of the mutant are important for the core epitope of these antibodies. suggest Thus, the antibody binds to residues in the CC' loop domain that define the sialic acid specificity of Siglec.

돌연변이체 →Mutant → M1M1 M2M2 M3M3 M5M5 M6M6 M7M7 M8M8 M9M9 M10M10 M11M11 M14M14 M15M15 M16M16 항체antibody mAb1mAb1 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- -- -- ++ ++ ++ mAb2mAb2 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- -- -- ++ ++ ++ mAb3mAb3 ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- -- -- ++ ++ ++ mAb.AmAb.A ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- mAb.BmAb.B ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- mAb.CmAb.C ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- ++ ++ ++ ++ +/-+/- +/-+/- mAb.DmAb.D ++ ++ ++ ++ -- +/-+/- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ mAb.EmAb.E ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- -- -- ++ ++ ++ mAb.FmAb.F ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- -- -- ++ ++ ++

본원에서 인용된 공보, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 이들의 전문이 참조로, 그리고 각각의 참고문헌이 참조로 포함됨을 개별적이고 구체적으로 나타내고, 본원에서 다른 곳에서 수행된 특정 문헌에 대한 임의의 별도로 제공된 포함과 무관하게, 본원에 그 전문(법에서 허용되는 최대 정도까지)을 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 포함된다.All references, including publications, patent applications, and patents, cited herein are by reference in their entirety, and each reference individually and specifically indicates that each reference is incorporated by reference in its entirety, and to the specific publications made elsewhere herein. Irrespective of any separately provided incorporation for, it is incorporated herein to the same extent as if presented herein in its entirety (to the maximum extent permitted by law).

본 발명의 기재의 맥락에서 부정관사("a" 및 "an") 및 정관사("the") 및 유사한 지시 대상 용어의 이용은 본원에서 달리 나타내거나 문맥 상 명확히 금기되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포괄하는 것으로 간주되어야 한다.The use of the indefinite articles ("a" and "an") and the definite article ("the") and similar referent terms in the context of the present description refer to the singular and the plural unless otherwise indicated herein or otherwise clearly prohibited by context. All should be considered inclusive.

달리 언급되지 않는 한, 본원에서 제공되는 모든 정확한 값은 대응하는 근사값을 대표한다(예로, 특정한 인자 또는 측정에 대해 제공되는 모든 정확한 예시 값은 적절한 경우, "약"에 의해 수식되는, 대응하는 근사 측정을 또한 제공하는 것으로 간주될 수 있다). "약"이 수치와 연계되어 이용되는 경우, 이는 명시된 수치의 ±10%에 대응하는 값을 포함하는 것으로 명시될 수 있다.Unless otherwise stated, all exact values provided herein are representative of the corresponding approximations (eg, all example exact values provided for a particular factor or measurement are, where appropriate, a corresponding approximation, modified by "about" as appropriate). may also be considered to provide a measure). When "about" is used in connection with a numerical value, it may be specified to include a value corresponding to ±10% of the specified numerical value.

요소 또는 요소들에 대해 "포함하는", "갖는", "포함되는" 또는 "함유하는"과 같은 용어를 이용하는 본 발명의 임의의 양태 또는 구현예의 본원에서의 기재는 달리 언급되거나 문맥 상 명확히 금기되지 않는 한, 특정 요소 또는 요소들"로 구성되는", "로 본질적으로 구성되는" 또는 "을 실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 양태 또는 구현예에 대한 뒷받침을 제공하려는 것이다(예로, 특정 요소를 포함하는 것으로 본원에 기재된 조성물은 달리 나타내거나 문맥 상 명확히 금기되지 않는 한, 해당 요소로 구성되는 조성물을 또한 기재하는 것으로 이해되어야 한다). Remarks herein of any aspect or embodiment of the invention using terms such as “comprising”, “having”, “comprising” or “comprising” of an element or elements are otherwise stated or expressly contraindicated in context. Unless otherwise stated, it is intended to provide support for a similar aspect or embodiment of the invention "consisting of," "consisting essentially of," or "substantially comprising" the particular element or elements (e.g., the particular element). Compositions described herein as comprising should be understood to also describe compositions comprising those elements, unless otherwise indicated or clearly contradicted by context).

본원에서 제공된 임의의 모든 예 또는 예시적 언어(예로, "예컨대")의 이용은 단순히 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위에 제한을 부과하지 않는다. 명세서에서의 어떤 말도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 시사하는 것으로 간주되어서는 안 된다.The use of any and all examples or illustrative language (eg, “such as”) provided herein is merely to better exemplify the invention and does not impose a limitation on the scope of the invention, unless otherwise claimed. No word in the specification should be construed as suggesting that any non-claimed element is essential to the practice of the invention.

SEQUENCE LISTING <110> INNATE PHARMA <120> SIGLEC NEUTRALIZING ANTIBODIES <130> IP20183498FR <150> 62/304,957 <151> 2016-03-08 <160> 169 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 467 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Arg Glu Arg Val 1 5 10 15 Glu Gly Gln Lys Ser Asn Arg Lys Asp Tyr Ser Leu Thr Met Gln Ser 20 25 30 Ser Val Thr Val Gln Glu Gly Met Cys Val His Val Arg Cys Ser Phe 35 40 45 Ser Tyr Pro Val Asp Ser Gln Thr Asp Ser Asp Pro Val His Gly Tyr 50 55 60 Trp Phe Arg Ala Gly Asn Asp Ile Ser Trp Lys Ala Pro Val Ala Thr 65 70 75 80 Asn Asn Pro Ala Trp Ala Val Gln Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His 85 90 95 Leu Leu Gly Asp Pro Gln Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp 100 105 110 Ala Arg Met Ser Asp Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly 115 120 125 Asn Ile Lys Trp Asn Tyr Lys Tyr Asp Gln Leu Ser Val Asn Val Thr 130 135 140 Ala Leu Thr His Arg Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser 145 150 155 160 Gly Cys Phe Gln Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln 165 170 175 Gly Thr Pro Pro Met Ile Ser Trp Met Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu 180 185 190 His Pro Ser Thr Thr Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro 195 200 205 Gln His His Gly Thr Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Leu Pro Gly Ala 210 215 220 Gly Val Thr Thr Asn Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro 225 230 235 240 Gln Asn Leu Thr Val Thr Val Phe Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ser Thr 245 250 255 Ala Leu Gly Asn Ser Ser Ser Leu Ser Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu 260 265 270 Arg Leu Val Cys Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Trp 275 280 285 Thr Trp Arg Ser Leu Thr Leu Tyr Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Leu 290 295 300 Val Leu Glu Leu Gln Val His Leu Gly Asp Glu Gly Glu Phe Thr Cys 305 310 315 320 Arg Ala Gln Asn Ser Leu Gly Ser Gln His Val Ser Leu Asn Leu Ser 325 330 335 Leu Gln Gln Glu Tyr Thr Gly Lys Met Arg Pro Val Ser Gly Val Leu 340 345 350 Leu Gly Ala Val Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu Ser 355 360 365 Phe Cys Val Ile Phe Ile Val Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser Ala 370 375 380 Arg Pro Ala Ala Asp Val Gly Asp Ile Gly Met Lys Asp Ala Asn Thr 385 390 395 400 Ile Arg Gly Ser Ala Ser Gln Gly Asn Leu Thr Glu Ser Trp Ala Asp 405 410 415 Asp Asn Pro Arg His His Gly Leu Ala Ala His Ser Ser Gly Glu Glu 420 425 430 Arg Glu Ile Gln Tyr Ala Pro Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Pro Gln 435 440 445 Asp Leu Ser Gly Gln Glu Ala Thr Asn Asn Glu Tyr Ser Glu Ile Lys 450 455 460 Ile Pro Lys 465 <210> 2 <211> 463 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Arg Glu Arg Ala Glu 1 5 10 15 Gly Gln Thr Ser Lys Leu Leu Thr Met Gln Ser Ser Val Thr Val Gln 20 25 30 Glu Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ser His 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Pro Val Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu 50 55 60 Gly Ala Asn Thr Asp Gln Asp Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn Pro Ala 65 70 75 80 Arg Ala Val Trp Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu Gly Asp 85 90 95 Pro His Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg Arg Ser 100 105 110 Asp Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Ser Ile Lys Trp 115 120 125 Asn Tyr Lys His His Arg Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Leu Thr His 130 135 140 Arg Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly Cys Pro Gln 145 150 155 160 Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro 165 170 175 Met Ile Ser Trp Ile Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu Asp Pro Ser Thr 180 185 190 Thr Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp His Gly 195 200 205 Thr Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Thr Thr 210 215 220 Asn Lys Thr Val His Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro Gln Asn Leu Thr 225 230 235 240 Met Thr Val Phe Gln Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Val Leu Gly Asn 245 250 255 Gly Ser Ser Leu Ser Leu Pro Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu Val Cys 260 265 270 Ala Val Asp Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Leu Ser 275 280 285 Trp Arg Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Gly Val 290 295 300 Leu Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg Asp Ala Ala Glu Phe Thr Cys 305 310 315 320 Arg Ala Gln Asn Pro Leu Gly Ser Gln Gln Val Tyr Leu Asn Val Ser 325 330 335 Leu Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val Thr Gln Gly Val Val Gly Gly 340 345 350 Ala Gly Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu Ser Phe Cys Val Ile Phe Val 355 360 365 Val Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser Ala Arg Pro Ala Ala Gly Val 370 375 380 Gly Asp Thr Gly Ile Glu Asp Ala Asn Ala Val Arg Gly Ser Ala Ser 385 390 395 400 Gln Gly Pro Leu Thr Glu Pro Trp Ala Glu Asp Ser Pro Pro Asp Gln 405 410 415 Pro Pro Pro Ala Ser Ala Arg Ser Ser Val Gly Glu Gly Glu Leu Gln 420 425 430 Tyr Ala Ser Leu Ser Phe Gln Met Val Lys Pro Trp Asp Ser Arg Gly 435 440 445 Gln Glu Ala Thr Asp Thr Glu Tyr Ser Glu Ile Lys Ile His Arg 450 455 460 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Thr Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Asn Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Phe Asn Ser Val Thr Thr Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Thr Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Asn Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Phe Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Thr Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Thr Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Gly Tyr Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Asn Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Phe Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Arg Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala His Ile Gly Ser Gly Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ile Phe Thr Thr Gly Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Gln 65 70 75 80 Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Ala Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Ser Leu Phe Ala Tyr Trp Gly His Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Glu Phe Met Ser Thr Ser Leu 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musculus <400> 9 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala His Ile Gly Ser Gly Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ile Phe Thr Thr Gly Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Gln 65 70 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musculus <400> 21 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ile Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Phe Asp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Arg Gly Lys Ser Pro Gln Phe Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Thr Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr 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musculus <400> 54 Ala Arg Leu Ile Phe Thr Thr Gly Phe Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 57 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 58 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Gln Gln Gly Asn Ala Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60 Gly Asn Ala Leu Pro Trp 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Asp Tyr Asn Met Asn 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 62 Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr Asn 1 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 64 Asn Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 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Glu 180 185 190 Asp Ala Asn Ala Val Arg Gly Ser Ala Ser Gln Gly Pro Leu Thr Glu 195 200 205 Pro Trp Ala Glu Asp Ser Pro Pro Asp Gln Pro Pro Pro Ala Ser Ala 210 215 220 Arg Ser Ser Val Gly Glu Gly Glu Leu Gln Tyr Ala Ser Leu Ser Phe 225 230 235 240 Gln Met Val Lys Pro Trp Asp Ser Arg Gly Gln Glu Ala Thr Asp Thr 245 250 255 Glu Tyr Ser Glu Ile Lys Ile His Arg 260 265 <210> 163 <211> 246 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 163 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser 20 25 30 Thr Ser Thr Val Leu Gly Asn Gly Ser Ser Leu Ser Leu Pro Glu Gly 35 40 45 Gln Ser Leu Arg Leu Val Cys Ala Val Asp Ala Val Asp Ser Asn Pro 50 55 60 Pro Ala Arg Leu Ser Leu Ser Trp Arg Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser 65 70 75 80 Gln Pro Ser Asn Pro Gly Val Leu Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg 85 90 95 Asp Ala Ala Glu Phe Thr Cys Arg Ala Gln Asn Pro Leu Gly Ser Gln 100 105 110 Gln Val Tyr Leu Asn Val Ser Leu Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val 115 120 125 Thr Gln Gly Val Val Gly Gly Ala Gly Ala Thr Ala Leu Val Phe Leu 130 135 140 Ser Phe Cys Val Ile Phe Val Val Val Arg Ser Cys Arg Lys Lys Ser 145 150 155 160 Ala Arg Pro Ala Ala Gly Val Gly Asp Thr Gly Ile Glu Asp Ala Asn 165 170 175 Ala Val Arg Gly Ser Ala Ser Gln Gly Pro Leu Thr Glu Pro Trp Ala 180 185 190 Glu Asp Ser Pro Pro Asp Gln Pro Pro Ala Ser Ala Arg Ser Ser 195 200 205 Val Gly Glu Gly Glu Leu Gln Tyr Ala Ser Leu Ser Phe Gln Met Val 210 215 220 Lys Pro Trp Asp Ser Arg Gly Gln Glu Ala Thr Asp Thr Glu Tyr Ser 225 230 235 240 Glu Ile Lys Ile His Arg 245 <210> 164 <211> 575 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 164 Gln Lys Ser Asn Arg Lys Asp Tyr Ser Leu Thr Met Gln Ser Ser Val 1 5 10 15 Thr Val Gln Glu Gly Met Cys Val His Val Arg Cys Ser Phe Ser Tyr 20 25 30 Pro Val Asp Ser Gln Thr Asp Ser Asp Pro Val His Gly Tyr Trp Phe 35 40 45 Arg Ala Gly Asn Asp Ile Ser Trp Lys Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn 50 55 60 Pro Ala Trp Ala Val Gln Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu 65 70 75 80 Gly Asp Pro Gln Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg 85 90 95 Met Ser Asp Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Asn Ile 100 105 110 Lys Trp Asn Tyr Lys Tyr Asp Gln Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Leu 115 120 125 Thr His Arg Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly Cys 130 135 140 Phe Gln Asn Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr 145 150 155 160 Pro Pro Met Ile Ser Trp Met Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu His Pro 165 170 175 Ser Thr Thr Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln His 180 185 190 His Gly Thr Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Leu Pro Gly Ala Gly Val 195 200 205 Thr Thr Asn Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro Gln Asn 210 215 220 Leu Thr Val Thr Val Phe Gin Gly Glu Gly Thr Ala Ser Thr Ala Leu 225 230 235 240 Gly Asn Ser Ser Ser Leu Ser Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu 245 250 255 Val Cys Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Trp Thr Trp 260 265 270 Arg Ser Leu Thr Leu Tyr Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Leu Val Leu 275 280 285 Glu Leu Gln Val His Leu Gly Asp Glu Gly Glu Phe Thr Cys Arg Ala 290 295 300 Gln Asn Ser Leu Gly Ser Gln His Val Ser Leu Asn Leu Ser Leu Gln 305 310 315 320 Gln Glu Tyr Thr Gly Lys Met Arg Pro Val Ser Gly Val Leu Leu Gly 325 330 335 Ala Val Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 340 345 350 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 355 360 365 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 370 375 380 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 385 390 395 400 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 405 410 415 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 420 425 430 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 435 440 445 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 450 455 460 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 465 470 475 480 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 485 490 495 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 500 505 510 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 515 520 525 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 530 535 540 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 545 550 555 560 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 565 570 575 <210> 165 <211> 567 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 165 Gln Thr Ser Lys Leu Leu Thr Met Gln Ser Ser Val Thr Val Gln Glu 1 5 10 15 Gly Leu Cys Val His Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Ser His Gly 20 25 30 Trp Ile Tyr Pro Gly Pro Val Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly 35 40 45 Ala Asn Thr Asp Gln Asp Ala Pro Val Ala Thr Asn Asn Pro Ala Arg 50 55 60 Ala Val Trp Glu Glu Thr Arg Asp Arg Phe His Leu Leu Gly Asp Pro 65 70 75 80 His Thr Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile Arg Asp Ala Arg Arg Ser Asp 85 90 95 Ala Gly Arg Tyr Phe Phe Arg Met Glu Lys Gly Ser Ile Lys Trp Asn 100 105 110 Tyr Lys His His Arg Leu Ser Val Asn Val Thr Ala Leu Thr His Arg 115 120 125 Pro Asn Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Ser Gly Cys Pro Gln Asn 130 135 140 Leu Thr Cys Ser Val Pro Trp Ala Cys Glu Gin Gly Thr Pro Pro Met 145 150 155 160 Ile Ser Trp Ile Gly Thr Ser Val Ser Pro Leu Asp Pro Ser Thr Thr 165 170 175 Arg Ser Ser Val Leu Thr Leu Ile Pro Gln Pro Gln Asp His Gly Thr 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Gln Val Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Thr Thr Asn 195 200 205 Lys Thr Val His Leu Asn Val Ser Tyr Pro Pro Gln Asn Leu Thr Met 210 215 220 Thr Val Phe Gln Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Val Leu Gly Asn Gly 225 230 235 240 Ser Ser Leu Ser Leu Pro Glu Gly Gln Ser Leu Arg Leu Val Cys Ala 245 250 255 Val Asp Ala Val Asp Ser Asn Pro Pro Ala Arg Leu Ser Leu Ser Trp 260 265 270 Arg Gly Leu Thr Leu Cys Pro Ser Gln Pro Ser Asn Pro Gly Val Leu 275 280 285 Glu Leu Pro Trp Val His Leu Arg Asp Ala Ala Glu Phe Thr Cys Arg 290 295 300 Ala Gln Asn Pro Leu Gly Ser Gln Gln Val Tyr Leu Asn Val Ser Leu 305 310 315 320 Gln Ser Lys Ala Thr Ser Gly Val Thr Gln Gly Gly Gly Gly Ser Ser 325 330 335 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 340 345 350 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Lys Pro Lys 355 360 365 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 370 375 380 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 385 390 395 400 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 405 410 415 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 420 425 430 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 435 440 445 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 450 455 460 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 465 470 475 480 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 485 490 495 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 500 505 510 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 515 520 525 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 530 535 540 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 545 550 555 560 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 565 <210> 166 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 166 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 167 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 167 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 168 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 168 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 169 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 169 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims (51)

인간 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하고 인간 NK 세포에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 단리된 항체로,
상기 항체가:
(a) (i) SEQ ID NO: 15의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 16의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
(b) (i) SEQ ID NO: 17의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 18의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
(c) (i) SEQ ID NO: 19의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 20의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
(d) (i) SEQ ID NO: 21의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 (ii) SEQ ID NO: 22의 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체,
로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체.An isolated antibody capable of binding to a human Siglec-9 polypeptide and neutralizing the inhibitory activity of a Siglec-9 polypeptide expressed by human NK cells, comprising:
The antibody titer:
(a) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 15 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 16 antibodies to;
(b) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 17 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 18 antibodies to;
(c) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 19 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 20 antibodies to;
(d) (i) a heavy chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 21 and (ii) a light chain comprising CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable region of SEQ ID NO: 22 antibody,
An antibody selected from the group consisting of. 제1항에 있어서, 항체는, Siglec-9를 발현하는 NK 세포가 인간 공여체로부터 정제되고 Siglec-9의 시알산 리간드를 발현하는 표적 세포와 인큐베이션되는, 표준 4시간 시험관내 51Cr 방출 세포독성 검정에서 NK 세포의 세포독성을 증강시키고/시키거나 복원하는 항체.The antibody of claim 1 , wherein the antibody is administered in a standard 4 hour in vitro 51 Cr release cytotoxicity assay, wherein NK cells expressing Siglec-9 are purified from a human donor and incubated with target cells expressing the sialic acid ligand of Siglec-9. Antibodies that enhance and/or restore the cytotoxicity of NK cells in 제1항에 있어서, 항체가 그 표면에 시알산과의 시스-상호작용에 관여되는 Siglec-9 폴리펩타이드를 보유하는 인간 moDC에 의해 발현되는 Siglec-9 폴리펩타이드의 억제 활성을 중화시킬 수 있는 항체.The antibody according to claim 1, wherein the antibody is capable of neutralizing the inhibitory activity of a Siglec-9 polypeptide expressed by human moDC having on its surface a Siglec-9 polypeptide involved in cis-interaction with sialic acid. 제1항에 있어서, 항체에 CD16 인간 Fcγ 수용체에 결합하는 능력이 결여된 항체.The antibody of claim 1 , wherein the antibody lacks the ability to bind to the CD16 human Fcγ receptor. 제4항에 있어서, 항체에 인간 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B 및 CD64에 결합하는 능력이 결여된 항체.5. The antibody of claim 4, wherein the antibody lacks the ability to bind human CD16A, CD16B, CD32A, CD32B and CD64. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 이의 시알산 리간드 간 상호작용을 차단하는 항체.6. The antibody of any one of claims 1-5, wherein the antibody blocks the interaction between the human Siglec-9 polypeptide and its sialic acid ligand. 제6항에 있어서, 항체가 (a) 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb 간 상호작용을 차단하고, (b) 인간 Siglec-9 폴리펩타이드 및 6'-시알릴락토스 간 상호작용을 차단하는 항체.7. The method of claim 6, wherein the antibody (a) blocks the interaction between the human Siglec-9 polypeptide and Neu5Aca2-3Galb1-4GlcNAcb, and (b) inhibits the interaction between the human Siglec-9 polypeptide and 6'-sialyllactose blocking antibodies. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드 및 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 Siglec-9 폴리펩타이드에 결합하는 항체.6. The antibody according to any one of claims 1 to 5, wherein the antibody is directed to a Siglec-9 polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a Siglec-9 polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 160. binding antibody. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포가 표적 세포 표면 상에 Siglec의 리간드를 보유하는 표적 인간 세포와 접촉되는 경우, 항체가 인간 공여체로부터 정제된 Siglec-발현 NK 세포에서 세포독성 및/또는 세포독성과 연관된 마커의 증가를 야기하는 항체.6 . The cell according to claim 1 , wherein the antibody is purified from a human donor when the NK cells are contacted with a target human cell bearing a ligand of Siglec on the target cell surface. Antibodies that result in an increase in markers associated with toxicity and/or cytotoxicity. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드로의 결합에 비해 다음에 대해 감소된 결합을 특징으로 하며, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조하여 나타내어 지는 항체:
- 잔기 N78, P79, A80, R81, A82 및/또는 V83에 돌연변이; 잔기 N77, D96, H98 및/또는 T99에 돌연변이 및/또는 잔기 W84, E85, E86 및/또는 R88에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드;
- 잔기 S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 및/또는 G54에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드;
- 잔기 P55, H58, E122, G124, S125 및/또는 K127에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드
- 잔기 K131 및/또는 H132에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드; 및/또는
- 잔기 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및/또는 D71에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드.6. The antibody according to any one of claims 1 to 5, wherein the antibody is characterized by reduced binding relative to binding to the wild-type Siglec-9 polypeptide of SEQ ID NO: 2, wherein the amino acid residue is SEQ ID NO: : Antibody represented with reference to the Siglec-9 polypeptide of 2:
- a mutation at residues N78, P79, A80, R81, A82 and/or V83; a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues N77, D96, H98 and/or T99 and/or a mutation at residues W84, E85, E86 and/or R88;
- a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 and/or G54;
- a Siglec-9 polypeptide having mutations at residues P55, H58, E122, G124, S125 and/or K127
- a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues K131 and/or H132; and/or
- a Siglec-9 polypeptide having a mutation in residues R63, A66, N67, T68, D69, Q70 and/or D71. 제6항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 2의 야생형 Siglec-9 폴리펩타이드로의 결합에 비해 다음에 대해 감소된 결합을 특징으로 하며, 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 2의 Siglec-9 폴리펩타이드를 참조하여 나타내어 지는 항체:
- 잔기 N78, P79, A80, R81, A82 및/또는 V83에 돌연변이; 잔기 N77, D96, H98 및/또는 T99에 돌연변이 및/또는 잔기 W84, E85, E86 및/또는 R88에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드;
- 잔기 S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 및/또는 G54에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드;
- 잔기 P55, H58, E122, G124, S125 및/또는 K127에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드
- 잔기 K131 및/또는 H132에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드; 및/또는
- 잔기 R63, A66, N67, T68, D69, Q70 및/또는 D71에 돌연변이를 갖는 Siglec-9 폴리펩타이드.7. The method of claim 6, wherein the antibody is characterized by reduced binding relative to binding to the wild-type Siglec-9 polypeptide of SEQ ID NO: 2, wherein the amino acid residues are the Siglec-9 polypeptide of SEQ ID NO: 2 Antibodies represented by reference to:
- a mutation at residues N78, P79, A80, R81, A82 and/or V83; a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues N77, D96, H98 and/or T99 and/or a mutation at residues W84, E85, E86 and/or R88;
- a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues S47, H48, G49, W50, I51, Y52, P53 and/or G54;
- a Siglec-9 polypeptide having mutations at residues P55, H58, E122, G124, S125 and/or K127
- a Siglec-9 polypeptide having a mutation at residues K131 and/or H132; and/or
- a Siglec-9 polypeptide having a mutation in residues R63, A66, N67, T68, D69, Q70 and/or D71. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 Fc 도메인 및 Fcγ 수용체 간 결합을 감소시키도록 변경된 Fc 도메인을 갖는 항체로, 상기 변경이 잔기 233 내지 236(EU 넘버링)에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는, 항체.6. The antibody according to any one of claims 1 to 5, wherein the antibody has an Fc domain altered to reduce binding between the Fc domain and an Fcγ receptor, said alteration being 1 at residues 233 to 236 (EU numbering); An antibody comprising two or three amino acid substitutions. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인 항체.6. The antibody according to any one of claims 1 to 5, wherein said antibody is an antibody fragment. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 핵산.A nucleic acid encoding the heavy and/or light chain of the antibody of any one of claims 1-5. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 재조합 숙주 세포.6. A hybridoma or recombinant host cell that produces the antibody of any one of claims 1-5. 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 암의 치료에 사용하기 위한 약학 조성물로서, 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 약학 조성물.A pharmaceutical composition for use in the treatment of cancer in a patient in need thereof, comprising an effective amount of the antibody of any one of claims 1 to 5. 제16항에 있어서, 상기 암이 ST3GAL1 및/또는 ST3GAL6 효소의 발현을 특징으로 하는 암인 약학 조성물.The pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the cancer is a cancer characterized by the expression of ST3GAL1 and/or ST3GAL6 enzymes. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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