KR102396816B1

KR102396816B1 - 감초잎 추출발효물을 포함하는 화장품 및 화장품 첨가제 조성물

Info

Publication number: KR102396816B1
Application number: KR1020200008721A
Authority: KR
Inventors: 한갑훈; 강정란; 오동순; 김종화
Original assignee: 우석대학교 산학협력단; 농업회사법인 유한회사 케어팜
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2022-05-13
Also published as: KR20210094903A

Abstract

본 발명은 감초잎 추출발효물을 포함하는 화장품 및 화장품 첨가제 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 감초잎으로부터 물과 에탄올의 혼합용액으로 추출한 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)으로 발효하여 수득한 발효물을 포함하는 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물은 대부분 부산물로 버려지는 감초의 잎을 활용한 것으로, 이러한 감초잎의 추출발효물을 포함함으로써 인체에 안전하며, 폴리페놀, 글리시진 등의 피부에 유익한 성분을 다량 함유하고 우수한 일산화질소 생성 억제능, 항산화 활성, 항균력을 나타내어 피부트러블을 방지하거나 개선할 수 있다.

Description

감초잎 추출발효물을 포함하는 화장품 및 화장품 첨가제 조성물{Cosmetic composition and cosmetic additive composition comprising extracted-fermented Glycyrrhizia uralensis leaf}

본 발명은 감초잎 추출발효물을 포함하는 화장품 및 화장품 첨가제 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 감초잎으로부터 물과 에탄올의 혼합용액으로 추출한 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)으로 발효하여 수득한 발효물을 포함하는 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물에 관한 것이다.

식약처 조사에 따르면 청소년의 화장시기가 점점 빨라져 초등학생 17%, 중학생 64%가 화장을 시작하였고, 여중고생의 절반이상이 색조화장품을 사용하고 있다고 응답하였다. 문제는 아이들은 어른보다 피부조직이 얇아 흡수율이 높으므로 소량의 중금속이라도 위험하고, 또한 화장품 사용법을 잘 몰라 피부트러블이 발생할 수 있다는 것이다. 실제로 피부트러블로 병원을 찾는 환자의 35%가 10대인 것으로 나타났다. 또한 최근 몇 년 사이 우리나라 및 동남아 다수 국가에서 미세먼지 및 황사가 매우 심각한 단계에 있어, 청소년을 포함한 현대인들에게 접촉성 피부염, 가려움증 등 여러 형태의 피부질환을 유발하며 건강과 생활에 심각한 피해를 나타내고 있다. 이에 보다 안전하게 사용할 수 있고 상기와 같은 문제성 피부를 개선할 수 있는 제품의 개발이 필요한 실정이다.

한편, '약방에 감초'라는 말이 있듯이 예로부터 감초는 한약재에서 빠져서는 안되는 약재이다. 1983년 대한한의사협회에 따르면 한약재로 감초가 가장 많이 처방된 것으로 조사된 바 있다. 감초는 다른 약재의 독성을 완화시키고 모든 약을 조화시켜 약효가 잘 나타나게 하며 여러 가지 탁월한 효능이 많아, 동의보감 같은 후세방(後世方)은 물론, 한나라 때 저술된 '상한론(傷寒論)'과 같은 고방(古方)에서도 처방 113방 중 70방에 사용되고 있을 정도로 없어서는 안 될 중요한 약재이다. 다수의 농민들이 감초를 재배하고 있으나, 감초는 현재 정부의 생산 장려 품목이나 수매작물이 아니므로 수확물의 판로를 재배자 스스로가 개척해야하는 어려움에 노출되어 있으며, 또한 한약재로는 주로 뿌리가 사용되기 때문에 수확량의 50% 이상을 차지하는 잎이나 줄기 부위는 버려지고 있는 실정이다. 이에 감초의 활용성을 높여 농민들에게 보다 다양한 판로를 제공하고, 동시에 감초의 부산물인 잎이나 줄기를 활용한 제품을 개발하여 버려지는 부산물로 인한 문제도 해결할 필요가 있다.

본 발명자는 상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 감초의 부산물로 대부분 버려지는 잎을 활용하여 안전하게 사용할 수 있으면서 피부염증완화, 피부노화방지 등 피부에 유익한 효과를 제공할 수 있는 화장품을 개발하고자 하였다.

대한민국 등록특허 제10-1991830호

따라서 본 발명의 주된 목적은 일반적으로 한약재 등으로 많이 사용되는 감초의 뿌리 부분 대신 대부분 버려지는 부산물인 잎 부위를 활용하여 인체에 안전하면서도 유익한 기능성을 나타낼 수 있는 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 감초잎으로부터 물과 에탄올의 혼합용액으로 추출한 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)으로 발효하여 수득한 발효물을 포함하는 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 발효물은 상기 추출로 수득되는 추출액을 분말화하여 추출분말을 수득하고, 상기 추출분말을 물에 첨가하고 락토바실러스 플란타럼을 접종하고 발효하여 수득한 것임이 바람직하다.

본 발명의 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물은 대부분 부산물로 버려지는 감초의 잎을 활용한 것으로, 이러한 감초잎의 추출발효물을 포함함으로써 인체에 안전하며, 폴리페놀, 글리시진 등의 피부에 유익한 성분을 다량 함유하고 우수한 일산화질소 생성 억제능, 항산화 활성, 항균력을 나타내어 피부트러블을 방지하거나 개선할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물의 총 폴리페놀함량을 다른 균으로 발효한 발효물과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물의 처리에 따른 B16F1 세포의 생존력을 다른 균으로 발효한 발효물과 비교하여 나타낸 그래프이다. control(DW), 대조군.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물의 일산화질소 생성 억제능을 다른 균으로 발효한 발효물과 비교하여 나타낸 그래프이다. control(DW), 대조군.
도 4 내지 5는 본 발명의 일실시예에 따른 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물의 주요 파이토케이컬 분석 HPLC 결과를 감초잎 추출물, 감초뿌리 추출물 및 발효 이전과 비교하여 나타낸 그래프이다. 도 4의 (A), 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물; 도 4의 (B), 감초뿌리 80% 에탄올 진탕추출물; 도 5의 (A) 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 발효 전; 도 5의 (B) 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물(발효 후). 1, 글리시리진(glycyrrhizin); 2, 리퀴리틴(liquiritin); 3, 리퀴리티제닌(liquiritigenin).
도 6 및 7은 본 발명의 일실시예에 따른 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물의 농도별(10, 100, 250, 500㎍/㎖) 처리에 따른 RAW264.7 세포의 생존력을 감초잎 추출물, 감초뿌리 추출물 및 발효 이전과 비교하여 나타낸 그래프이다. con, 대조군; 감초 잎 발효 전, 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 발효 전; 감초 잎 발효 후, 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물; 잎, 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물; 뿌리, 감초뿌리 80% 에탄올 진탕추출물.
도 8 및 9는 본 발명의 일실시예에 따른 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물의 농도별(100, 250㎍/㎖) 일산화질소 생성 억제능을 감초잎 추출물, 감초뿌리 추출물 및 발효 이전과 비교하여 나타낸 그래프이다. CON, 대조군; LPS, LPS 처리군(1㎍/㎖); 감초 잎 발효 전, 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 발효 전; 감초 잎 발효 후, 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물; 감초 잎, 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물; 감초 뿌리, 감초뿌리 80% 에탄올 진탕추출물.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 항균력을 추출용매, 추출방식 및 감초뿌리 추출물과 비교하여 나타낸 것이다. ①, 감초 잎 80% 에탄올 초음파추출물; ②, 감초 잎 80% 에탄올 진탕추출물; ③, 감초 잎 열수 진탕추출물; ④, 감초 뿌리 80% 에탄올 초음파추출물; ⑤, 감초 뿌리 80% 에탄올 진탕추출물; ⑥, 감초 뿌리 열수 진탕추출물; ⑦, 대조군(DW).
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물의 항균력을 발효전과 비교하여 나타낸 것이다. ①, 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 발효 전; ②, 감초잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물(발효 후), ③, 대조군(DW).

본 발명의 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물은 감초잎으로부터 물과 에탄올의 혼합용액으로 추출한 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)으로 발효하여 수득한 발효물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 추출원료로 사용하는 감초잎은 감초, 즉 콩과(Leguminosae)에 속하며 학명이 Glycyrrhiza uralensis Fischer인 약용식물의 잎을 의미한다. 한약재로 주로 사용되는 뿌리와는 성분함량 및 생리활성에서 상당한 차이가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 상기 감초잎은 바람직하게는 분말화하여 사용한다. 또한 바람직하게는 동결건조한 다음 분말화하여 사용한다. 또한 바람직하게는 10 ~ 100메시(mesh), 보다 바람직하게는 30 ~ 80메시, 보다 바람직하게는 40 ~ 60메시로 분말화하여 사용한다.

본 발명에서는 추출용매로 물과 에탄올의 혼합용액을 사용한다. 본 발명에 따르면 이러한 추출용매의 차이에 따라 기능성에서 상당한 차이가 발생할 수 있다. 이에 바람직하게는 50 ~ 95%(v/v)의 에탄올, 보다 바람직하게는 60 ~ 90%(v/v)의 에탄올, 보다 바람직하게는 70 ~ 90%(v/v)의 에탄올, 보다 바람직하게는 75 ~ 85%(v/v)의 에탄올을 사용한다.

본 발명에서 상기 추출을 위해 감초잎을 상기 용매에 첨가하고 정치, 진탕 또는 초음파 추출하는 방법을 사용할 수 있다. 이때 바람직하게는 감초잎을 상기 용매에 10 ~ 200g/ℓ의 농도로 첨가하고, 보다 바람직하게는 20 ~ 150g/ℓ의 농도로 첨가하고, 보다 바람직하게는 30 ~ 100g/ℓ로 첨가하고, 보다 바람직하게는 40 ~ 60g/ℓ로 첨가한다. 또한 이때 추출시간은 바람직하게는 1 ~ 100시간이고, 보다 바람직하게는 10 ~ 80시간이고, 보다 바람직하게는 20 ~ 30시간이다. 또한 이때 추출온도는 0 ~ 90℃이고, 보다 바람직하게는 20 ~ 80℃이고, 보다 바람직하게는 40 ~ 70℃이다. 진탕추출하는 경우에는 바람직하게는 50 ~ 200rpm, 보다 바람직하게는 100 ~ 150rpm으로 한다.

본 발명에서 상기 추출 이후 바람직하게는 추출액을 여과하고, 보다 바람직하게는 여과 후 감압농축하고, 보다 바람직하게는 여과, 감압농축 후 동결건조하여 사용한다.

본 발명에서는 상기와 같은 추출로 수득한 감초잎 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)으로 발효한다. 이때 발효를 위해 바람직하게는 상기 감초잎 추출물을 첨가하여 발효배지를 제조하고 여기에 상기 락토바실러스 플란타럼을 접종하는 방법을 사용한다. 이때 바람직하게는 상기 감초잎 추출물을 0.005 ~ 0.5g/100㎖의 농도가 되도록, 보다 바람직하게는 0.01 ~ 0.1g/100㎖의 농도가 되도록, 보다 바람직하게는 0.02 ~ 0.08g/100㎖의 농도가 되도록 첨가하여 발효배지를 제조한다. 또한 이때 발효배지는 바람직하게는 물을 베이스로 한다. 예를 들어, 물에 상기 감초잎 추출물을 첨가하여 발효배지를 제조한다.

본 발명에서 발효는 바람직하게는 30 ~ 40℃에서 이루어지며, 보다 바람직하게는 35 ~ 39℃에서 이루어진다. 또한 바람직하게는 1 ~ 7일, 보다 바람직하게는 2 ~ 4일간 이루어진다. 또한 바람직하게는 진탕발효이며, 이 경우 바람직하게는 100 ~ 300rpm, 보다 바람직하게는 150 ~ 200rpm으로 진탕발효한다.

본 발명에서 발효균으로 사용하는 락토바실러스 플란타럼은 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼 KCTC 3104 균주이다.

본 발명에서 발효를 위해 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼 배양액을 발효배지에 첨가하는 방법으로 접종한다. 이때 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼의 농도가 1x10³ ~ 1x10¹⁰ cells/100㎖, 보다 바람직하게는 1x10⁴ ~ 1x10⁹ cells/100㎖, 보다 바람직하게는 1x10⁵ ~ 1x10⁸ cells/100㎖가 되도록 접종한다.

본 발명에서 상기 발효 이후 바람직하게는 발효액을 여과하고, 보다 바람직하게는 여과 후 동결건조하여 사용한다.

본 발명에 따르면 상기와 같은 방법에 따라 감초잎의 원활한 추출 및 발효가 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 상기와 같은 방법에 따라 제조된 감초잎 추출발효물은 총 폴리페놀함량이 우수하고, 세포독성이 낮아 인체에 안전하고, 우수한 일산화질소 생성 억제능을 나타내고, 글리시리진과 같은 파이토케미컬 함량이 우수하고, 우수한 항산화 활성을 나타내고, 우수한 항균력을 나타낼 수 있다.

특히 본 발명의 감초잎 추출발효물은 황색포도상구균 및 녹농균에 대한 항균력을 나타낼 수 있다. 이들 균은 다른 이유로도 인체에 위험할 수 있지만 화장품에 오염될 경우 눈병이나 피부 발진을 일으킬 수 있다. 따라서 본 발명의 감초잎 추출발효물을 화장품에 첨가하는 방법을 통해 상기와 같은 균의 오염을 방지함으로써 보다 안전하게 화장품을 사용할 수 있다.

본 발명에서 화장품 조성물은 세포독성 실험결과를 고려하여 상기 감초잎 추출발효물을 바람직하게는 1 ~ 100㎍/㎖의 농도로 함유한다.

본 발명의 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물은 상기 감초잎 추출발효물 이외에 화장품학적으로 허용된 담체나 첨가제를 더 포함할 수 있다. 이때 담체는 약학적으로 허용된 담체도 포함된다. 또한, 본 발명의 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물은 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 화장품 조성물의 경우 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지 크림, 팩 및 영양 에센스 등으로 제형화할 수 있다. 그리고 본 발명의 화장품 첨가제 조성물은 상기 감초잎 추출발효물 자체일 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물은 상기 감초잎 추출발효물 이외에 다른 기능성 물질을 더 포함할 수 있다. 이때 상기 기능성 물질은 식물재료의 가공물, 예를 들어 추출물 또는 발효물일 수 있다. 또한 본 발명의 화장품 조성물 및 화장품 첨가제 조성물은 식물 발효물로 상기 감초잎 추추발효물 만을 포함할 수 있고, 상기 감초잎 추출발효물 이외의 다른 식물의 추출물 또는 발효물을 포함하지 않을 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[실시예]

1. 감초 추출발효물 제조

1-1. 추출

감초전초를 세척 후 동결건조장치를 이용하여 72시간 동결건조하였다. 이후 잎과 뿌리를 분리한 다음 각각을 분쇄하고, 45메시(mesh) 망으로 걸러 분말을 수득하였다. 준비된 잎 분말 또는 뿌리 분말을 50g/ℓ로 80%(v/v) 에탄올 또는 물에 첨가하고 120rpm에서 60℃, 24시간 진탕추출 또는 초음파추출하였다. 이후 수득된 추출액을 필터로 여과하고 감압농축 및 동결건조하여 최종 추출물을 수득하였다.

1-2. 발효

상기 감초 잎 또는 뿌리 추출물을 0.05g/100㎖의 농도가 되도록 물에 첨가하여 발효배지를 준비한 다음 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)(KCTC 3104), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus)(KCTC 3171), 락토바실러스 카제이(L. casei)(KCTC 3109) 또는 락토바실러스 델부루키(L. delbrueckii)(KCTC 3635)의 배양액을 1x10⁶ cells/100㎖의 농도가 되도록 첨가하여 접종하고, 진탕배양기에서 37℃, 180 ~ 190rpm으로 3일간 진탕발효하였다. 이후 발효액을 필터(0.45㎛ 또는 0.2㎛ pore size)로 여과하고 동결건조하여 냉동보관하였다.

2. 실험

2-1. 발효액의 생균수 측정

발효 1, 2, 3일이 되는 시점에 발효액 시료(감초 잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효액)를 3개씩 준비한 다음 현미경 계수법으로 생균수를 측정하였다.

이의 결과, 표 1에서와 같이 발효기간이 경과할수록 생균수가 증가한 것으로 나타났으며, 이는 발효균주의 생장이 원활하게 이루어져 정상적으로 발효가 이루어졌다는 것을 의미한다.

시료	희석	측정수(반복)			평균	편차	환산(cells/ml)
시료	희석	1	2	3	평균	편차	환산(cells/ml)
발효1일	1.E-01	6.4	7.2	6.4	6.667	0.462	2.E+07
발효2일	1.E-01	13.4	13.2	13	13.200	0.200	3.E+07
발효3일	1.E-02	6.6	5.8	6	6.133	0.416	2.E+08

2-2. 총 폴리페놀 함량 분석

총 폴리페놀 함량(total polyphenol contents)은 Na Hyun Lee et al.(2015). 의 방법을 따라 측정하였다. 시료용액(감초 잎 80% 에탄올 진탕추출물의 발효물 현탁액(DDW)(0.5g/L)) 및 갈릭산 표준(gallic acid standard)(0, 20, 40, 60, 80, 100㎎/L) 100㎕에 2% Na₂CO₃ 용액 2㎖을 가하고 충분히 교반한 다음 3분 방치한 후 50% Folin & Ciocalteu's phenol reagents 100㎕를 가하여 볼텍싱(vortexing)한 후 암실에서 30분간 반응 시키고 750nm에서 blank를 대조로 하여 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 총 폴리페놀 함량은 갈릭산을 표준물질로 하여 구한 건량선으로부터 계산하였다.

이의 결과, 도 1에서와 같이 락토바실러스 플란타럼으로 발효한 시료가 발효전 시료 및 다른 발효균주로 발효한 시료에 비해 우수한 것으로 나타났다. 이때 락토바실러스 플란타럼으로 발효한 시료의 총 폴리페놀 함량은 300.94±0.01mgGAE/g였다.

2-3. 발효균주 차이에 따른 발효물의 안전성 평가

MTT 방법을 사용하여 B16F1 세포를 대상으로 세포 생존력을 측정하였다. 감초 잎 80% 에탄올 진탕추출물의 발효전 및 각 발효균주로 발효한 발효물을 B16F1 세포에 각각 10㎎/㎖의 농도로 처리하고 세포 생존력을 측정하였다.

이의 결과, 도 2에서와 같이 락토바실러스 플란타럼으로 발효한 시료가 발효전 시료 및 다른 발효균주로 발효한 시료에 비해 세포 생존력이 높은 것으로 나타났다. 이는 락토바실러스 플란타럼으로 발효한 시료가 다른 시료들에 비해 세포독성으로부터 안전하다는 것을 의미한다. 이때 락토바실러스 플란타럼으로 발효한 시료 처리군의 세포 생존력은 99%로 나타났다.

2-4. 발효균주 차이에 따른 발효물의 일산화질소 생성 억제능 평가

실험에 사용한 RAW 264.7(TIB-71; ATCC, USA) 대식세포는 ATCC(American type cell collection, USA)로부터 구입하였으며, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Gibco, USA) 배지에 10% FBS(Fetal Bovine Serum; Gibco, USA)와 1%의 Penicillin(100U/㎖)/Streptocycin(100㎍/㎖)을 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂조건 하에서 배양하였다.

RAW 264.7 세포를 5×10⁵cells/well의 농도로 6-well plate에 분주한 다음 24시간 배양 후 배지를 제거하였다. 여기에 새로운 DMEM(10% FBS, 1% Penicillin(100U/㎖)/Streptocycin(100㎍/㎖))배지 및 시료(감초 잎 80% 에탄올 진탕추출물의 발효물)를 1시간 동안 전처리한 뒤 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 시료 처리 24시간 후에 세포배양 상등액 50㎕와 Griess 시약(1% sulfanilamide + 0.1% α-naphthylamide in 2.5% phosphoric acid) 50㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA 리더를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NaNO₂로 표준곡선을 작성하여 세포배양 상등액에 함유되어 있는 일산화질소(nitric oxide, NO)의 값을 계산하였다.

이의 결과, 도 3에서와 같이 발효전 시료에 비해 발효한 시료가 일산화질소 생성 억제능이 좀 더 높은 것으로 나타났다.

2-5. 파이토케미컬 정량 평가

감초 추출물 및 발효물에 대한 비교 평가를 위하여 HPLC를 이용한 주성분의 정량분석을 실시하였다.

HPLC 분석 아웃라인

분석대상	Glycyrrhizic acid, liquiritin, liquiritigenin
HPLC	Agilent 1200 series
Detector	DAD (Diode Array Detector) at 254 and 276 nm
Calibration curve	Calibration range : 10 ~ 50 ㎍/mL (no weight)

해당 시험으로 사용한 농도의 표기는 모두 free base로서 기재하였다. 대한민국약전에 등재되어 있는 감초의 지표성분을 바탕으로 글리시리진(glycyrrhizic acid, glycyrrhizin), 리퀴리틴(liquiritin), 리퀴리티제닌(liquiritigenin)을 분석대상 파이토케미컬로 선정하여 각 추출물 및 발효물 중의 함량을 평가하고 비교하였다.

주요 성분에 대한 HPLC 정량 평가용 희석액(diluent)으로 50%(v/v) 메탄올(aqueous methanol)을 조제하여 사용하였다.

분석한 감초 추출물 및 발효물 시료는 다음 표 3과 같다.

시료 ID	시료 정보
GLY-L1	발효 전 감초 잎 추출물
GLY-L2	발효 후 감초 잎 추출물
GLY-L3	감초 잎 추출물
GLY-R1	감초 뿌리 추출물

* GLY : Glycyrrhiza, L: leaves, R: root

상기 발효 전 감초 잎 추출물은 감초 잎 80% 에탄올 진탕추출물을 멸균한 뒤 0.05g/100㎖의 농도로 배지를 제조하고 멸균 및 필터로 여과한 후 동결건조한 것이고, 상기 발효 후 감초 잎 추출물은 감초 잎 80% 에탄올 진탕추출물의 락토바실러스 플란타럼 발효물이고, 상기 감초 잎 추출물은 감초 잎 80% 에탄올 진탕추출물이고, 상기 감초 뿌리 추출물은 감초 뿌리 80% 에탄올 진탕추출물이다.

HPLC 정량평가 전처리를 위해 각 분말 시료를 일정량(20 ~ 40㎎) 취하여 메탄올 1㎖로 초음파 추출하고, 상등액 중 일정량을 취하여 50%(v/v) 메탄올을 이용 희석한 후 원심분리하고, 상등액을 검액으로 하여 HPLC에 15㎕를 주입하였다.

HPLC 조건은 다음과 같다.

HPLC: Agilent 1200 series with DAD(Diode Array Detector)

검출기: UV 254 및 276nm

컬럼: Shseido CapCell PAK MGII C18(4.6×150mm, 3μm pore size)

컬럼온도: 35℃

이동상: 구배 용출로서 0.1% 포름산(aqueous)/아세토니트릴(A/B, v/v): 0분-25% B, 4분-25% B, 8분-30% B, 12분-35% B, 16분-45% B, 19분-45% B, 22분-70% B, 27분-70% B, 28분-40% B, 30분-25% B

흐름률: 0.6㎖/분

주입량: 15㎕

표준물질에 대한 피크(peak) 면적비와 조제 농도를 이용하고, 가중 최소자승법에 따르는 검량선의 회귀식을 이용해 농도를 산출하였다. 검량선의 작성 및 농도의 산출에는 Agilent Chemstation(Agilent 1200 series)을 이용하였다.

조제농도의 단위: ㎍/㎖

검량선의 회귀식: y = ax + b

(y: 피크 면적비, x: 조제농도, a: 기울기, b: y절편)

농도(㎎/g) = C × V × W^-1 × f

C = 수득된 결과(㎍/㎖)

V = 추출볼륨(㎖)

W = 시료중량(g)

f = 희석인자

측정치는 ㎍/㎖ 또는 ㎎/g으로서(free base로서 환산) 표시, 소수점 이하 2자리수로 표시하고, 피크 면적치는 유효숫자 4자리수로 기재하였다.

이의 결과, 표 4에서와 같이, 감초 잎 추출물의 글리시리진 및 리퀴리틴의 함량이 감초 뿌리 추출물에 비해 낮기는 하지만, 감초 잎 추출물을 락토바실러스 플란타럼으로 발효함에 따라 글리시리진의 함량이 증가하는 것으로 나타났다.

	함량(㎍/㎎)
	글리시리진(1)	리퀴리틴(2)	리퀴리티제닌(3)
GLY-L1	1.09	0.91	0.52
GLY-L2	1.20	0.84	0.53
GLY-L3	0.81	0.70	0.36
GLY-R1	17.70	3.83	0.18

2-6. 항산화 활성 평가

항산화 활성을 평가하기 위해 상기 표 3의 시료를 대상으로 DPPH, ABTS 및 SOD 분석을 수행하였다.

각 시료에 DMSO 1㎖을 첨가하여 100㎎/㎖의 농도로 추출한 뒤 연속희석하여 1㎎/㎖의 농도로 검액을 제조하였다.

DPPH 라디칼 소거능(radical scavenging activity) 분석은 96 well plate에 검액 20㎕, 0.5mM DPPH 용액 80㎕를 순서대로 넣고 30분간 상온방치 후 ELISA 517nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였다. 이후 다음 계산식 1을 사용하여 DPPH 라디칼 소거능을 계산하였다.

[계산식 1]

ABTS 라디칼 소거능 분석은 각 검액 10㎕를 well에 넣고 ABTS+ 용액 90㎕를 넣은 뒤 37℃에서 30분간 항온처리(암조건에서)한 다음 ELISA로 734nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였다. 이후 다음 계산식 2를 사용하여 ABTS 라디칼 소거능을 계산하였다.

[계산식 2]

SOD 라디칼 소거능 분석은 각 검액 20㎕를 well에 넣고 WST 용액 200㎕를 첨가한 다음 blank2와 blank3의 well에 희석완충액을 각각 20㎕ 씩 넣어준 뒤 blank1과 검액 well에 enzyme working solution을 각각 20㎕ 씩 첨가하고, 37℃에서 20분간 항온처리한 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였다. Blank1의 흡광도값이 0.7≤blank1≤1.0이 나오는 반응시간을 확인하고자 kinetic mode로 흡광도 값을 측정하였다. 이후 다음 계산식 3을 사용하여 SOD 라디칼 소거능을 계산하였다.

[계산식 3]

이의 결과, 표 5에서와 같이, 감초 잎 추출물의 항산화 활성이 감초 뿌리 추출물에 비해 매우 우수한 것으로 나타났다. 그리고 발효전과 후를 비교하였을 때 DPPH는 감소한 반면 ABTS는 증가하는 것으로 나타났다.

시료 ID	라디칼 소거능(%)
시료 ID	DPPH	ABTS	SOD
PC	92.55±0.12	99.71±0.65	-
GLY-L1	54.44±2.93	49.99±5.18	85.53±0.56
GLY-L2	48.98±2.32	51.24±4.79	82.45±1.97
GLY-L3	70.60±4.49	57.09±5.67	97.98±1.84
GLY-R1	6.10±0.63	9.86±0.95	37.26±2.70

* PC: 양성대조군(positive control)

* 3반복 분석에 따른 평균±표준편차로 표현

2-7. 발효물의 농도별 안전성 평가

MTT([3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide], Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA) 방법을 사용하여 RAW 264.7 세포를 대상으로 상기 표 3 시료의 농도별 처리에 따른 세포 생존력을 측정하였다. 세포를 5×10³cells/well의 농도로 96-well plate에 분주하고 24시간 배양한 후 배지를 제거하였다. 여기에 새로운 DMEM(10% FBS, 1% Penicillin(100U/㎖)/Streptocycin(100㎍/㎖)) 100㎕ 및 농도별로 희석한 시료를 각각 첨가하여 24시간 배양한 다음 MTT 용액(5㎎/㎖) 10㎕를 각 well에 첨가하고 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배지를 제거하고 100㎕/well의 DMSO(dimethylsulfoxide; Sigma Chemical Co., St. Louis MO, USA)를 넣어 세포 내에 생성된 포마잔(formazan)을 15분간 교반하여 용출한 후, ELISA 리더를 이용하여 590nm에서 흡광도를 측정하였다.

이의 결과, 도 6 및 7에서와 같이 모든 추출물 및 발효물이 전체적으로 농도의존적인 세포독성을 나타냈으며, 감초 잎 추출물이 감초 뿌리 추출물에 비해 안전성이 낮으나, 발효를 통해 개선되는 것으로 나타났다. 또한 감초 잎 추출발효물의 경우 100㎍/㎖까지 세포독성 없이 안전하게 사용할 수 있는 것으로 나타났다.

2-8. 발효물의 농도별 일산화질소 생성 억제능 평가

상기 2-4의 방법에 따르되, 상기 표 3 시료의 농도별 처리에 따른 일산화질소 생성 억제능을 비교하였다.

이의 결과, 도 8 및 9에서와 같이 모든 추출물 및 발효물이 전체적으로 농도의존적인 일산화질소 생성 억제능을 나타냈다.

2-9. 항균력 평가

감초 잎 또는 뿌리 추출물 및 발효물의 항균력을 평가하였다.

균주로는 호기성 그람양성균인 Staphylococcus aureus(KCTC3881), 호기성 그람음성균인 Escherichia coli(KCTC1039) 및 Pseudomonas aeruginosa(KCTC1637), 진균류로 캔디다증을 일으키는 Candia albicans(KCTC7965) 및 Aspergillus niger(KCTC 6910)를 생물자원센터(KCTC)에서 분양받아 사용하였다.

-80℃에 보관되어 있던 각 균주를 꺼내어 녹이고, S. aureus와 P. aeruginosa는 TSA(Trypicsoy agar)에, E. coli는 LB(Luria-Bertani media)에, C. albicans는 YEPD에, A. niger는 PDA에 접종하여 30℃에서 18 ~ 48시간 동안 배양하였으며 실험하는 동안 균주의 활성이 떨어지지 않도록 7일에 한번 간격으로 계대배양하면서 사용하였다.

균주	기탁번호	배지
Escherichia coli	KCTC 1039	LB
Staphylococcus aureus	KCTC 3881	TSA
Pseudomonas aeruginosa	KCTC 1637	TSA
Candida albicans	KCTC 7965	YEPD
Aspergillus niger	KCTC 6910	PDA

항균력은 준비된 시료를 페이퍼-디스크 방법으로 측정하였으며, 실험 방법은 다음과 같다.

먼저, 계대배양을 통해 활성이 좋은 각 균주의 단일 콜로니를 취하여 고체배지 전체에 균일하게 획선 도말한다. 멸균된 페이퍼-디스크를 도말된 플레이트 위에 올리고 40 ~ 60㎕씩의 각 시료를 주입한다. 각 균주의 최적조건에서 배양한다. 배양 후 클리어존을 확인하고 측정한다.

이의 결과, 도 10에서와 같이 감초 잎 및 뿌리 모두 80% 에탄올 추출물에서 S. aureus 및 P. aeruginosa에 대한 항균활성을 나타낸 반면, 열수추출물에서는 항균활성을 나타내지 않았다. 또한, 도 11에서와 같이 감초 잎 80% 에탄올 진탕추출물의 발효전과 후 모두에서 S. aureus 및 P. aeruginosa에 대한 항균활성을 나타냈다.

Claims

감초잎으로부터 물과 에탄올의 혼합용액으로 추출하여 수득되는 추출액을 분말화하여 추출분말을 수득하고, 상기 추출분말을 물에 첨가하고 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 접종하고 발효하여 수득한 발효물을 포함하는 화장품 조성물.
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감초잎으로부터 물과 에탄올의 혼합용액으로 추출하여 수득되는 추출액을 분말화하여 추출분말을 수득하고, 상기 추출분말을 물에 첨가하고 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 접종하고 발효하여 수득한 발효물을 포함하는 화장품 첨가제 조성물.
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