KR102396603B1 - Composition for improving liver function comprising citrulline as an active ingredient - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시트룰린(citrulline), 특히 L-시트룰린, 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 시트룰린, 특히 L-시트룰린, 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 간 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 간 기능 개선용 건강기능식품에 관한 것이며, 아르기닌이 포함되어 있는 복합제에서 아르기닌을 시트룰린으로 대체함으로써 아르기닌의 직접 복용에 비해 내성을 억제하고 효율성을 증대시킬 수 있다.The present invention relates to a composition for improving liver function containing citrulline, particularly L-citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient, and more particularly, to citrulline, particularly L- It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disorder or a health functional food for improving liver function containing citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient, and arginine in a combination containing arginine By replacing it with citrulline, it is possible to suppress tolerance and increase efficiency compared to direct administration of arginine.

Description

시트룰린을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물{Composition for improving liver function comprising citrulline as an active ingredient}Composition for improving liver function comprising citrulline as an active ingredient

본 발명은 시트룰린(citrulline), 특히 L-시트룰린을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 시트룰린, 특히 L-시트룰린을 유효성분으로 함유하는 간 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 간 기능 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for improving liver function containing citrulline, particularly L-citrulline, as an active ingredient, and more particularly, a pharmaceutical for preventing or treating liver disorders containing citrulline, particularly L-citrulline as an active ingredient. It relates to a health functional food for improving the composition or liver function.

종래 간 기능 개선 작용이 있는 것으로 알려진 아르기닌은 베타인 및 구연산과 함께 배합되어 간장 질환을 예방 또는 치료하기 위한 간 기능 개선용 복합제로 사용되고 있으며, 복합제 액제의 형태로도 개발되어 판매되고 있다.
Arginine, which is known to have a liver function improvement action, is used as a combination agent for improving liver function to prevent or treat liver disease by mixing with betaine and citric acid, and is also developed and sold in the form of a combination liquid formulation.

본 발명은 이들 복합제 중 유효성분인 아르기닌을 시트룰린으로 대체함으로써, 아르기닌을 직접 복용함에 따라 나타나는 부작용 및 내성 발현을 억제하고 간 기능 개선 효과가 현저히 높은, 시트룰린을 유효성분으로 함유하는 간 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 간 기능 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
The present invention prevents or treats liver disorders containing citrulline as an active ingredient, suppressing the side effects and resistance expression that occur when arginine is taken directly by replacing arginine, an active ingredient among these combination drugs, with citrulline, and having a significantly high liver function improvement effect It relates to a pharmaceutical composition for use, and a health functional food for improving liver function.

아르기닌(arginine)은 식물 등에 유리 상태로 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 아르기닌은 비필수 아미노산의 하나이나, 성장기 어린이 및 스트레스 상태, 외상, 암 등의 특이 상태일 경우에는 필수적으로 공급해주어야 하는 반필수 아미노산(semi-essential amino acid)이고, 아미노산류 강화제, 의약품, 식품 등의 성분으로 널리 이용되고 있다. 의약용으로는 간 기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제 등에 사용되고 있으며, 식품용으로는 어묵 첨가제, 건강 음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염 대체용으로 사용되고 있다. 특히 아르기닌을 섭취하였을 때 NO 생성을 증가시키고 생성된 NO가 cGMP 생성 및 혈관 확장에 도움을 주어 혈압을 낮추거나 혈행개선 및 심혈관 질환을 예방할 수 있다는 점이 동물시험 및 임상을 통해 보고된바 있다.
Arginine (arginine) is known to be contained in a free state in plants and the like. Arginine is one of the non-essential amino acids, but it is a semi-essential amino acid that must be supplied in case of special conditions such as growing children, stress, trauma, and cancer. It is widely used as a component of For medicine, it is used as a liver function promoter, brain function promoter, male infertility treatment, and general amino acid formulation. In particular, it has been reported through animal tests and clinical trials that it can increase NO production when ingested arginine and the generated NO can help cGMP production and vasodilation to lower blood pressure, improve blood circulation, and prevent cardiovascular disease.

외국의 연구결과에 의하면 심장혈관개선, 성기능 개선, 체중조절 효과 등의 생활습관병 예방을 위한 생리적 개선 효과를 나타내기 위해서는 1일 섭취량기준으로 약 5 g 정도 혹은 그 이상을 섭취해야 함이 보고된 바 있으며 일반 식사를 통해 1~2 g 섭취가 가능하며, 나머지는 건강기능식품이나 기능성음료를 통한 섭취가 권장되고 있다. 그러나 아르기닌은 장기간 섭취하였을 때 내성이 발현하는 문제가 있고, 그 밖에도 구토, 소화불량, 복통, 메스꺼움, 설사, 관절통, 부종, 발진, 홍조, 현기증, 요통, 두통, 마비, 조직 괴사, 출혈 위험, 혈압의 과도한 저하 등의 부작용이 나타날 수 있다고 알려져 있다.
According to the results of foreign studies, it has been reported that about 5 g or more of the daily intake should be consumed in order to exhibit physiological improvement effects for the prevention of lifestyle-related diseases such as cardiovascular improvement, sexual function improvement, and weight control effect. It is possible to consume 1~2 g through a regular meal, and it is recommended to consume the rest through health functional foods or functional drinks. However, arginine has a problem of developing resistance when ingested for a long time, and in addition to vomiting, indigestion, abdominal pain, nausea, diarrhea, joint pain, edema, rash, flushing, dizziness, back pain, headache, paralysis, tissue necrosis, risk of bleeding, It is known that side effects such as excessive lowering of blood pressure may occur.

시트룰린은 비필수 아미노산의 하나로, 신장에서 시트룰린은 아르기닌이라는 아미노산으로 대사되며, NO(nitric oxide)를 생성시킨다고 알려져 있다. 즉, 시트룰린은 생체 내의 단백질을 구성하는 아미노산은 아니지만, 요소 사이클의 중간체 중 하나로, 아르기닌으로부터 혈관 확장 작용을 갖는 물질로 알려진 NO와 함께 생성되고, 추가로 아스파라긴산과 축합하여 아르기닌으로 재생된다. Citrulline is one of the non-essential amino acids, and it is known that the kidneys metabolize citrulline to an amino acid called arginine and produce NO (nitric oxide). That is, citrulline is not an amino acid constituting a protein in a living body, but as one of the intermediates of the urea cycle, it is generated from arginine together with NO, which is known as a substance having a vasodilatory action, and is further condensed with aspartic acid to be regenerated into arginine.

시트룰린에는 암모니아 대사 촉진이나 혈관 확장에 의한 혈류 개선, 혈압 저하, 신경 전달, 면역력 증진, 활성 산소 소거 등의 유용한 작용이 있다는 점이 알려져 있다. 이 때문에, 상기 작용을 기대하여 시트룰린을 의약품이나 기능성 식품 등의 형태로 섭취되고 있다.Citrulline is known to have useful effects such as promoting ammonia metabolism, improving blood flow by dilating blood vessels, lowering blood pressure, neurotransmission, enhancing immunity, and scavenging free radicals. For this reason, in anticipation of the said effect|action, citrulline is ingested in the form of a pharmaceutical, a functional food, etc.

L-시트룰린 및 L-아르기닌을 배합하여 경구 섭취하는 경우 혈장 L-아르기닌의 농도가 급격히 증가하고 NO 생체이용률(bioavailability)이 증가한다는 점이 알려져 있다. L-아르기닌은 근육대사에 중요한 인자의 하나로, NO의 전구체(precursor)이며, 생성된 NO는 혈관을 이완시켜 혈류를 증가시키는 작용을 한다. (http://www.vitaminshoppe.com/p/source-naturals-l-arginine-l-citrulline-complx-120-tablets/sr-1173#.VfMQMnXosuU 참조).It is known that when L-citrulline and L-arginine are combined and taken orally, the concentration of plasma L-arginine increases rapidly and NO bioavailability increases. L-Arginine is one of the important factors for muscle metabolism, and is a precursor of NO, and the generated NO works to increase blood flow by relaxing blood vessels. (See http://www.vitaminshoppe.com/p/source-naturals-l-arginine-l-citrulline-complx-120-tablets/sr-1173#.VfMQMnXosuU).

한편 혈중 아르기닌 농도를 상승시킬 필요가 있는 피험체 및 혈류를 촉진시킬 필요가 있는 피험체에 대해서, 1회당의 섭취량이, 시트룰린 또는 그 염 및 아르기닌 또는 그 염의 총량으로서 유리의 시트룰린 및 아르기닌으로 환산해 200 mg 내지 3 g이며, 시트룰린 또는 그 염 및 아르기닌 또는 그 염의 조성비가, 유리의 시트룰린 및 아르기닌으로 환산한 중량비로 1:2 ~ 2:1이 되도록 조정된 경구제를 섭취시키는 공정을 포함하는 방법. 혈류를 촉진시킴으로써, 결림, 냉증 및 발기부전으로부터 선택되는 증상에 대해 효과를 가지는 조성물에 대한 기술이 알려진바 있다.On the other hand, for a subject who needs to raise the blood arginine concentration and a subject who needs to promote blood flow, the intake per serving is the total amount of citrulline or its salt and arginine or its salt, converted into free citrulline and arginine. A method comprising the step of ingesting an oral drug that is 200 mg to 3 g and adjusted so that the composition ratio of citrulline or a salt thereof and arginine or a salt thereof is 1:2 to 2:1 in terms of weight ratio converted to free citrulline and arginine . By promoting blood flow, there is known a technique for a composition having an effect on a symptom selected from stiffness, poor circulation and erectile dysfunction.

또한 L-시트룰린을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 시트룰린을 사용한 치료방법, 유효량의 L-시트룰린을 경구투여 가능한 영양보조식품으로 개체에 투여하는 방법, L-시트룰린이 만복감 및 소화불량을 치료할 수 있다는 점이 알려져 있다. In addition, a treatment method using citrulline comprising administering L-citrulline to an individual, a method of administering an effective amount of L-citrulline to an individual as a nutritional supplement that can be administered orally, L-citrulline can treat a feeling of fullness and indigestion point is known.

이밖에도 시트룰린이 골량 저하의 예방 및 치료에 효과적이라는 점, 특히 시트룰린이 대퇴골 원위부의 골량 저하를 개선하는 효과를 나타낸다는 점, 시트룰린을 함유하는, 고요산혈증의 예방 또는 개선제, 시트룰린의 항우울제, 항스트레스제, 아디포넥틴 산생 촉진제 및 콜레스테롤 저하제로서의 용도, 영양 부족 상태 치료를 위한 시트룰린의 사용에 대한 기술 등이 알려져 있다.
In addition, citrulline is effective in preventing and treating bone loss, particularly that citrulline is effective in improving bone loss in the distal part of the femur. , use as an adiponectin production promoter and cholesterol lowering agent, and techniques for the use of citrulline for the treatment of malnutrition conditions are known.

그러나 아르기닌이 포함되어 있는 복합제에서 아르기닌을 시트룰린으로 대체함으로써 아르기닌을 직접 복용하는 경우에 비해 내성을 억제하고 효율성을 증대시킬 수 있다는 점, 또한 시트룰린, 베타인 및 구연산 배합제제가 기존의 아르기닌 복합제제에 비하여 현저히 우수한 간 기능 개선 내지 간 장애 예방 또는 치료 효과를 나타낸다는 점에 대하여는 알려져 있지 아니하다.
However, by replacing arginine with citrulline in a combination drug containing arginine, tolerance can be suppressed and efficiency can be increased compared to when arginine is taken directly. Also, the combination of citrulline, betaine and citric acid is superior to the existing arginine combination formulation. It is not known about the fact that it exhibits a significantly superior liver function improvement or liver disorder prevention or treatment effect compared to that.

미국등록특허 5,767,160호 (1998. 6. 16. 등록)U.S. Patent No. 5,767,160 (registered on June 16, 1998) 한국등록특허 1,475,138호 (2014. 12. 15. 등록)Korea Patent No. 1,475,138 (Registered on December 15, 2014) 일본특허공개 2002-226370 (2002. 8. 14. 공개)Japanese Patent Laid-Open No. 2002-226370 (published on August 14, 2002) 일본특허공개 1993-246962 (1993. 9. 24. 공개)Japanese Patent Laid-Open No. 1993-246962 (published on September 24, 1993) 일본특허공개 2014-193919 (2014. 10. 9. 공개)Japanese Patent Publication No. 2014-193919 (published on October 9, 2014) 일본특허공개 2012-197283 (2012. 10. 18. 공개)Japanese Patent Publication 2012-197283 (published on October 18, 2012) 일본특허공개 2012-067062 (2012. 4. 5. 공개)Japanese Patent Laid-Open No. 2012-067062 (published on April 5, 2012) 일본특허공개 2009-261335 (2009. 11. 12. 공개)Japanese Patent Laid-Open 2009-261335 (published on November 12, 2009) 일본특허공개 2010-506887 (2010. 3. 4. 공개)Japanese Patent Laid-Open No. 2010-506887 (published on March 4, 2010) 한국등록특허 1,283,668 (2013. 7. 2. 등록)Korean Patent 1,283,668 (Registered on Jul. 2. 2013) 한국공개특허 2014-0126495 (2014. 10. 31. 공개)Korean Patent Publication No. 2014-0126495 (published on October 31, 2014) WO 2009-064004 (2009. 5. 22. 공개)WO 2009-064004 (published on May 22, 2009) WO 2008-142147 (2008. 11. 27. 공개)WO 2008-142147 (published on November 27, 2008) WO 2012-033789 (2012. 3. 15. 공개)WO 2012-033789 (published on March 15, 2012)

Masahiko Morita et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 454, Issue 1, 7 November 2014, Pages 53-57. “Oral supplementation with a combination of l-citrulline and l-arginine rapidly increases plasma l-arginine concentration and enhances NO bioavailability”Masahiko Morita et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 454, Issue 1, 7 November 2014, Pages 53-57. “Oral supplementation with a combination of l-citrulline and l-arginine rapidly increases plasma l-arginine concentration and enhances NO bioavailability” Marcel CG van de Poll et al. The American Journal of Clinical Nutrition, Volume 85, No. 1, 2007, Pages 167-172. "Interorgan amino acid exchange in humans: consequences for arginine and citrulline metabolism"Marcel C. G. van de Poll et al. The American Journal of Clinical Nutrition, Volume 85, No. 1, 2007, Pages 167-172. "Interorgan amino acid exchange in humans: consequences for arginine and citrulline metabolism" R.G. Knowles et al. Biochem J. 1990 Sep 15; 270(3): Pages 833-836. "Differential induction of brain, lung and liver nitric oxide synthase by endotoxin in the rat"R.G. Knowles et al. Biochem J. 1990 Sep 15; 270(3): Pages 833-836. "Differential induction of brain, lung and liver nitric oxide synthase by endotoxin in the rat" H. G. Windmueller, A. E. Spaeth, American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism Published 1 December 1981 Vol. 241 no. 6, "Source and fate of circulating citrulline"H. G. Windmueller, A. E. Spaeth, American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism Published 1 December 1981 Vol. 241 no. 6, "Source and fate of circulating citrulline" Barbul A, Sisto DA et al., Surgery 1981, 90(2): pages 244-251, “Arginine stimulates lymphocyte immune response in healthy human beings”Barbul A, Sisto DA et al., Surgery 1981, 90(2): pages 244-251, “Arginine stimulates lymphocyte immune response in healthy human beings” Kilbourn RG et al., The Cancer Journal From Scientific American [2000, 6 Suppl 1: S21-30], “Strategies to reduce side effects of interleukin-2: evaluation of the antihypotensive agent NG-monomethyl-L-arginine”Kilbourn RG et al., The Cancer Journal From Scientific American [2000, 6 Suppl 1: S21-30], “Strategies to reduce side effects of interleukin-2: evaluation of the antihypotensive agent NG-monomethyl-L-arginine” C. Moinard et al., British Journal of Nutrition, Volume 99, Issue 04, April 2008, pp 855-862, “Dose-ranging effects of citrulline administration on plasma amino acids and hormonal patterns in healthy subjects: the Citrudose pharmacokinetic study”C. Moinard et al., British Journal of Nutrition, Volume 99, Issue 04, April 2008, pp 855-862, “Dose-ranging effects of citrulline administration on plasma amino acids and hormonal patterns in healthy subjects: the Citrudose pharmacokinetic study” W. H. Waugh et al., J Natl Med Assoc. 2001 Oct; 93(10): 363-371., “Oral citrulline as arginine precursor may be beneficial in sickle cell disease: early phase two results”W. H. Waugh et al., J Natl Med Assoc. 2001 Oct; 93(10): 363-371., “Oral citrulline as arginine precursor may be beneficial in sickle cell disease: early phase two results” Edzard Schwedhelm et al., British Journal of Clinical Pharmacology, Volume 65, Issue 1, pages 51-59, January 2008., “Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of oral L-citrulline and L-arginine: impact on nitric oxide metabolism”Edzard Schwedhelm et al., British Journal of Clinical Pharmacology, Volume 65, Issue 1, pages 51-59, January 2008., “Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of oral L-citrulline and L-arginine: impact on nitric oxide metabolism” J. R. Bronk and R. B. Fisher, Biochem J. 1956 Sep; 64(1): 106-111, “The penetration of ornithine and citrulline into liver slices”J. R. Bronk and R. B. Fisher, Biochem J. 1956 Sep; 64(1): 106-111, “The penetration of ornithine and citrulline into liver slices”

본 발명은 종래 아르기닌 복합제가 나타내는 내성 및 낮은 생체이용률이라는 문제점이 개선 된, 시트룰린과, 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공함으로써 종래 제제에 비하여 현저히 우수한 간 기능 개선 내지 간 장애 예방 또는 치료 효과를 나타내고, 내성이 발현되지 않는 제제를 제공하고자 한다.
The present invention is a conventional formulation by providing a pharmaceutical composition or health functional food containing citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in which the problems of resistance and low bioavailability exhibited by conventional arginine complexes are improved. An object of the present invention is to provide a formulation that exhibits significantly superior liver function improvement to liver disorder prevention or treatment effect, and does not exhibit resistance.

본 발명은 또한 시트룰린, 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및 기타 간 기능 개선제, 간영양제 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 유효성분이 배합된, 간 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 간 기능 개선용 건강기능식품을 제공하고자 한다.
The present invention also relates to citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disorders or health functional food for improving liver function, in which one or more active ingredients selected from the group consisting of and other liver function improving agents, liver nutrients and vitamins are blended.

본 발명은 시트룰린(citrulline), 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 간 장애(liver disorder) 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disorder, comprising citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient.

본 발명의 일 양태에서, 보다 구체적으로 상기 시트룰린은 L-시트룰린이며, 상기 시트룰린은 개체에 투여 시 내성이 발현되지 않는다. In one embodiment of the present invention, more specifically, the citrulline is L-citrulline, and the citrulline does not develop resistance when administered to an individual.

본 발명의 일 양태에서, 시트룰린, 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및 간 기능 개선제, 간영양제 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이 배합된, 간 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다. In one aspect of the present invention, citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And at least one selected from the group consisting of liver function improving agents, liver nutrients and vitamins is provided, a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disorders is provided.

본 발명은 또한 시트룰린, 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.The present invention also relates to a health functional food for improving liver function containing citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient.

본 발명의 일 양태에서, 시트룰린, 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및 간 기능 개선제, 간영양제 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이 배합된, 간 기능 개선용 건강기능식품이 제공된다.
In one aspect of the present invention, citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And at least one selected from the group consisting of liver function improving agents, liver nutrients and vitamins is provided, health functional food for improving liver function is provided.

혈관내피세포를 사용한 실험에서 아르기닌을 장기적으로 처리하였을 때, 세포 내 아질산염/질산염(nitrite/nitrate)의 생성이 증가하지 않는 것으로 나타났으며, 이는 즉 내성이 발현됨을 의미한다. 이는 글루코우즈의 증가와 산화질소생성효소의 감소, 수퍼옥사이드의 축적을 동반하였다. In experiments using vascular endothelial cells, it was found that, when arginine was treated for a long time, intracellular nitrite/nitrate production did not increase, that is, resistance was expressed. This was accompanied by an increase in glucose, a decrease in nitric oxide synthase, and an accumulation of superoxide.

반면 시트룰린을 처리한 경우 지속적으로 아질산염/질산염의 생성이 증가하는 것으로 나타났고, 이는 내성이 발현되지 않음을 의미한다. 시트룰린 처리 시 아르기닌의 내성발현과 관련이 있을 것으로 생각되는 글루코우즈, 산화질소생성효소 및 수퍼옥사이드의 변화 역시 관찰되지 않았다. On the other hand, when citrulline was treated, the production of nitrite/nitrate was continuously increased, which means that resistance was not developed. Changes in glucose, nitric oxide synthase and superoxide, which are thought to be related to the expression of resistance to arginine, were also not observed during citrulline treatment.

또한 래트 실험에서 시트룰린의 투여 시 경구생체이용률은 ~100%로 매우 우수한 것으로 나타났다. 또한 시트룰린은 투여량의 33.7%가 아르기닌으로 변환되어 아르기닌을 투여했을 때 보다 혈중 아르기닌의 농도를 효과적으로 상승시켰다.
In addition, the oral bioavailability when administered with citrulline in a rat experiment was found to be very excellent at ~100%. In addition, 33.7% of the dose of citrulline was converted to arginine, which effectively increased the concentration of arginine in the blood than when arginine was administered.

본 발명의 발명자는 상기한 바와 같이 시트룰린이 장기간 복용 시에도 내성이 발현되지 않는 특성을 나타낸다는 점, 및 우수한 생체이용률을 나타낸다는 점을 새로이 구명하였고, 또한 베타인, 구연산과 배합하였을 때 상승효과를 나타낸다는 점을 구명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
As described above, the inventors of the present invention have newly discovered that citrulline exhibits no tolerance even when taken for a long period of time and exhibits excellent bioavailability, and also has a synergistic effect when combined with betaine and citric acid. The present invention was completed by finding that it represents a.

본 발명은 아르기닌이 포함되어 있는 복합제에서 아르기닌을 시트룰린으로 대체함으로써 아르기닌의 직접 복용에 비해 내성을 억제하고 효율성을 증대시킬 수 있다.
The present invention can suppress resistance and increase efficiency compared to direct administration of arginine by replacing arginine with citrulline in a combination drug containing arginine.

도 1은 아르기닌 및 시트룰린의 집단 약동력학 모델(population pharmacokinetics model)을 도시한 것이다.
도 2는 아르기닌 및 시트룰린을 i.v. 또는 복강내 투여하였을 때의 시간 경과에 따른 농도변화를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.1 depicts a population pharmacokinetics model of arginine and citrulline.
2 is a graph showing the results of measuring the concentration change over time when arginine and citrulline are administered iv or intraperitoneally.

본 발명은 시트룰린(citrulline), 베타인 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 간 장애(liver disorder) 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disorders, comprising citrulline, betaine and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients.

본 발명의 일 양태에서, 시트룰린은 H2NC(O)NH(CH2)3CH(NH2)CO2H의 화학식을 나타내고, IUPAC명은 2- 아미노-5-(카르바모일아미노)펜타노산 [2-Amino-5-(carbamoylamino)pentanoic acid]이며, 요소(urea) 사이클의 주요 대사체로 알려져 있다.In one embodiment of the present invention, citrulline represents the formula H 2 NC(O)NH(CH 2 ) 3 CH(NH 2 )CO 2 H, and the IUPAC name is 2-amino-5-(carbamoylamino)pentanoic acid It is [2-Amino-5-(carbamoylamino)pentanoic acid] and is known as a major metabolite of the urea cycle.

본 발명의 일 양태에서, 베타인(betaine)은 메틸기를 세 개 갖는 아미노산으로서, N,N,N-트리메틸글리신(N,N,N-trimethylglycine)이라고도 한다. 베타인은 콜린(cholin: tetramethylglycine)에서 베타인알데하이드가 되고, 다시 산화되어 메틸기의 공급원인 베타인이 되며, 메틸기를 다시 주면 다이메틸글리신(dimethylglycine)이 된다. 이것은 메틸기의 공여를 통해 메타이오닌의 합성을 촉진하는 것으로서 이 과정을 통해 간 해독 작용을 촉진하며 항암 작용 등을 수행한다고 알려져 있다. 베타인은 항지간작용과 혈압강하, 항혈당작용, 시력회복, 해독작용, 세포 복제 기능 등을 가지고 있다. 특히 췌장의 랑게르한스섬을 자극하여 인슐린 분비를 촉진하며, 알코올로 인해 손상된 지방간을 치료하는 항지간작용 외에도 카르니틴(carnitine)을 생성하여 신장을 보호하는 역할도 한다고 알려져 있다.In one aspect of the present invention, betaine is an amino acid having three methyl groups, and is also called N,N,N -trimethylglycine ( N,N ,N-trimethylglycine). Betaine becomes betainealdehyde from choline (tetramethylglycine), is oxidized again to become betaine, a source of methyl groups, and when methyl groups are given back, it becomes dimethylglycine. It promotes the synthesis of methionine through the donation of a methyl group, and it is known that through this process, it promotes liver detoxification and performs anticancer activity. Betaine has anti-hepatic action, lowering blood pressure, anti-glycemic action, vision recovery, detoxification, and cell replication. In particular, it stimulates the islet of Langerhans in the pancreas to promote insulin secretion, and is known to play a role in protecting the kidneys by producing carnitine in addition to the anti-hepatic action of treating fatty liver damaged by alcohol.

구연산(citric acid)은 산성조미료 및 산패방지제로 많이 사용되는 성분으로 무취이나 강한 산미를 갖는다. IUPAC명은 2-하이드록시프로판-1,2,3-트리카르복실산(2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid)이다.
Citric acid is a component often used as an acidic seasoning and anti-oxidation agent. It is odorless but has a strong acid taste. The IUPAC name is 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid.

본 발명의 일 양태에서, 상기 각 성분은 이의 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 적정 염의 종류 및 제조방법에 대해서는 후술하기로 한다.In one aspect of the present invention, each of the components may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt thereof. The type and preparation method of the appropriate salt will be described later.

본 발명의 일 양태에서, 상기 간 장애는 간염, 바이러스성 간염, 알코올성 간질환(alcoholic liver disease), 비-알코올성 간질환, 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis), 간섬유증, 간경변 및/또는 문맥성 고혈압, 복수, 신부전, 간성뇌증 및 급만성 간부전과 같은 간경변의 합병증으로부터 선택될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.In one aspect of the present invention, the liver disorder is hepatitis, viral hepatitis, alcoholic liver disease, non-alcoholic liver disease, non-alcoholic steatohepatitis, liver fibrosis, cirrhosis and / or complications of cirrhosis such as portal hypertension, ascites, renal failure, hepatic encephalopathy and acute chronic liver failure, but is not limited thereto.

본 발명의 일 양태에서, 상기 시트룰린은 L-시트룰린인 것을 특징으로 한다.In one aspect of the present invention, the citrulline is L-citrulline.

본 발명의 일 양태에서, 상기 시트룰린은 개체에 투여 시 내성이 발현되지 않는다. In one embodiment of the present invention, the citrulline does not develop resistance when administered to a subject.

본 발명의 일 양태에서, 시트룰린, 베타인 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염; 및 간 기능 개선제, 간영양제 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이 배합된, 간 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다. In one aspect of the present invention, citrulline, betaine and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And at least one selected from the group consisting of liver function improving agents, liver nutrients and vitamins is provided, a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disorders is provided.

상기 추가 배합되는 성분은, 아르기닌, 타우린, 카르니틴, 베타글루칸, 밀크시슬, 우르소데옥시콜산, 니코틴산아미드, 비타민B6, 및 비타민B2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
The additionally formulated component may be at least one selected from the group consisting of arginine, taurine, carnitine, beta-glucan, milk thistle, ursodeoxycholic acid, nicotinic acid amide, vitamin B6, and vitamin B2, but is not limited thereto.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 시트룰린, 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 간 장애의 예방 또는 치료를 위하여 다른 약물 또는 성분과 조합/배합되어 투여될 수 있다. 따라서 본 발명은 시트룰린, 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 기타 간 기능 개선제, 간영양제 또는 비타민과의 배합치료를 포함하는, 간 장애 환자의 치료방법을 또한 포함한다.
More specifically, citrulline, betaine, and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, according to the present invention may be administered in combination/incorporation with other drugs or components for the prevention or treatment of liver disorders. Accordingly, the present invention also includes a method for treating a patient with liver disorders, comprising combination therapy with citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and other liver function improving agents, liver nutrients or vitamins.

보다 구체적으로 본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 사용될 수 있다. 산 부가염은 통상의 방법, 예컨대 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있으며 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예컨대 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.More specifically, in one embodiment according to the present invention, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid may be used as the salt. Acid addition salts can be prepared by conventional methods, such as by dissolving the compound in an aqueous solution of an excess of acid, and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile, in equal molar amounts of the compound and It is not limited to heating an acid or alcohol in water (eg glycol monomethyl ether) and then evaporating the mixture to dryness, or suction filtration of the precipitated salt.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산,글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.In one embodiment according to the present invention, an organic acid and an inorganic acid may be used as the free acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, etc. may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, Acetic acid, trifluoroacetic acid, citric acid, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid ( glycollic acid), gluconic acid, galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanillic acid, hydroiodic acid, etc. can be used, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염을 적당한 은염(예컨대, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.In one embodiment according to the present invention, a pharmaceutically acceptable metal salt may be prepared using a base. The alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving the compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate. In this case, it is pharmaceutically suitable to prepare a sodium, potassium or calcium salt as the metal salt, and the corresponding silver salt can be obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).

본 발명에 따른 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 시트룰린, 베타인 또는 구연산의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함할 수 있으며, 예컨대 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
In one embodiment according to the present invention, the pharmaceutically acceptable salts of citrulline, betaine or citric acid according to the present invention may include salts of acidic or basic groups that may be present in the compounds, unless otherwise indicated. and, for example, pharmaceutically acceptable salts include sodium, calcium and potassium salts of a hydroxyl group, and other pharmaceutically acceptable salts of an amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulfate, phosphate, hydrogen phosphate, and dihydrogen phosphate. , acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts. can be manufactured through

보다 구체적으로 상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.More specifically, the pharmaceutical composition is composed of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories and injections. It may have any one formulation selected from the group.

상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 경구, 직장, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 비내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. The administration route of the composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. The composition of the present invention may be administered orally, rectally, intravenously, intramuscularly, intraperitoneally, subcutaneously, or intranasally, but is not limited thereto. In addition, the composition may be administered by any device capable of transporting the active agent to a target cell.

본 발명의 일 실시양태에서, 경구 투여를 위한 약학적 제제는 예를 들어 당의정, 정제, 환제, 산제, 과립제 또는 캅셀제와 같은 투여량 단위 형태 및 앰플로 존재할 수 있다. 이들은 그 자체로 공지된 방법, 예를 들어 통상적인 혼합, 입상화, 당제 조제, 용해 또는 동결건조 방법에 의해 제조된다. 예를 들어, 경구 투여를 위한 제약학적 제제는 활성 성분을 고체 담체와 혼합하고, 혼합물을 입상화하고, 필요하다면 적절한 첨가제를 첨가한 후에, 혼합물 또는 과립을 정제 또는 당의정의 형태로 제형화 함으로써 제조될 수 있다. In one embodiment of the present invention, pharmaceutical preparations for oral administration may be presented in dosage unit form such as, for example, dragees, tablets, pills, powders, granules or capsules, and in ampoules. They are prepared by methods known per se, for example by customary mixing, granulation, confection, dissolution or lyophilization methods. For example, pharmaceutical preparations for oral administration are prepared by mixing the active ingredient with a solid carrier, granulating the mixture, adding appropriate additives if necessary, and then formulating the mixture or granules into the form of tablets or dragees. can be

적절한 담체로는 특히 충진제, 예컨대 당, 예를 들어 락토스, 사카로스, 만니톨 또는 소르비톨, 셀룰로즈 제제 및/또는 인산칼슘, 예를 들어 인산삼칼슘 또는 인산수소칼슘, 및 결합제, 예컨대 예를 들어 옥수수, 밀, 쌀 또는 감자 전분을 사용한 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 및 필요한 경우 붕해제, 예컨대 상기 언급된 전분, 카르복시메틸 전분, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨이다.Suitable carriers include, inter alia, fillers such as sugars such as lactose, saccharose, mannitol or sorbitol, cellulose preparations and/or calcium phosphates such as tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate, and binders such as corn, Starch paste using wheat, rice or potato starch, gelatin, tragacanth, methylcellulose and/or polyvinylpyrrolidone, and if necessary disintegrants such as the above-mentioned starch, carboxymethyl starch, crosslinked polyvinylpyrrolidone money, agar or alginic acid or a salt thereof, such as sodium alginate.

첨가제로는 특히 유동-조절제 및 윤활제, 예를 들어 규산, 탈크, 스테아르산 또는 그의 염, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 칼슘, 및/또는 폴리에틸렌글리콜이다. 위액에 저항성일 수 있는 적절한 코팅을 당의정 코어에 제공하고, 특히 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물 중에 임의로 아라비아고무, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄을 함유하는 농축된 당 용액, 또는 락커 용액이 사용되거나, 또는 위액에 저항성인 코팅을 형성하기 위하여, 아세틸셀룰로스 프탈레이트 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트와 같은 적절한 셀룰로스 제제의 용액이 사용될 수 있다. Additives are in particular flow-regulating agents and lubricants, for example silicic acid, talc, stearic acid or salts thereof, such as magnesium or calcium stearate, and/or polyethyleneglycol. Concentrated sugar solution, which provides the dragee core with a suitable coating which may be resistant to gastric juices, in particular, optionally containing gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol and/or titanium dioxide in a suitable organic solvent or solvent mixture; Alternatively, a lacquer solution may be used, or a solution of a suitable cellulosic agent such as acetylcellulose phthalate or hydroxypropylmethylcellulose phthalate may be used to form a coating resistant to gastric juices.

다른 경구 투여 가능한 약학적 제제로는 캅셀제가 있으며, 젤라틴으로 만들어진 건식-충진 캅셀, 및 젤라틴 및 가소제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 만들어진 연질의 밀봉된 캅셀제이다. 건식-충진 캅셀은 입자의 형태, 예를 들어 충진제, 예컨대 락토스, 결합제, 예컨대 전분, 및/또는 활택제, 예컨대 탈크 또는 스테아르산마그네슘, 및 적절하다면 안정화제와의 혼합물의 형태로 활성 성분을 함유할 수도 있다. 연질 캅셀에서, 활성 성분을 적절한 액체, 예컨대 지방 오일, 파라핀 오일 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁시키고, 여기에 안정화제를 첨가할 수도 있다.Other orally administrable pharmaceutical preparations include capsules, dry-filled capsules made of gelatin, and soft, sealed capsules made of gelatin and a plasticizer such as glycerol or sorbitol. Dry-filled capsules contain the active ingredient in the form of particles, for example in mixture with fillers such as lactose, binders such as starches, and/or glidants such as talc or magnesium stearate, and if appropriate stabilizers You may. In soft capsules, the active ingredient is dissolved or suspended in a suitable liquid, such as fatty oil, paraffin oil or liquid polyethylene glycol, to which a stabilizing agent may also be added.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비경구 제제는 여러 방식, 예컨대 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 비내, 피내, 피하, 바람직하게는 정맥 내 방식으로 효과적인 주사액일 수 있다. 이러한 액체는 바람직하게는, 활성 성분을 단독으로 또는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 함유하는 동결 건조된 제제로부터 사용 전에 제조될 수 있는 등장성 수용액 또는 현탁액이다. 약학적 제제는 살균될 수 있고/있거나 보존제, 안정화제, 습윤제 및/또는 유화제, 용해제, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충액과 같은 첨가제를 함유할 수 있다. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Parenteral preparations may be injections effective in several ways, such as intravenous, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intradermal, subcutaneous, preferably intravenous. Such liquids are preferably isotonic aqueous solutions or suspensions which may be prepared prior to use from lyophilized preparations containing the active ingredient alone or in association with a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical preparations may be sterilized and/or contain additives such as preservatives, stabilizers, wetting and/or emulsifying agents, solubilizing agents, salts for adjusting the osmotic pressure and/or buffers.

구체적으로 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.Specifically, non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.

본 발명의 일 양태에서, 시트룰린은 0.1 mg/kg/일 내지 1000 mg/kg/일의 양, 구체적으로 1 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일의 양, 보다 구체적으로 10 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일의 양이 75 kg의 온혈 동물에 투여됨으로써 간 장애 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
In one embodiment of the present invention, citrulline is administered in an amount of 0.1 mg/kg/day to 1000 mg/kg/day, specifically in an amount of 1 mg/kg/day to 500 mg/kg/day, more specifically in an amount of 10 mg/kg An amount of /day to 100 mg/kg/day may be administered to a warm-blooded animal weighing 75 kg, thereby exhibiting an effect of preventing or treating liver disorders.

본 발명의 일 양태에서, 시트룰린은 1주일에 1회 내지 7회, 1일 1회 내지 수회의 투여간격으로 투여될 수 있으며, 장기간 복용하여도 내성 발현이 되지 않는다.In one embodiment of the present invention, citrulline may be administered at intervals of 1 to 7 times a week, or 1 to several times a day, and resistance does not develop even when taken for a long period of time.

본 발명에서 사용하기 위한 시트룰린의 투여량 및 투여간격은 다양한 요인, 예컨대 활성 성분의 유효성 및 작용 지속시간, 투여방식, 온혈 동물의 성별, 연령, 체중 및 기타 질환의 중경도 등의 개별 조건에 따라 달라질 수 있다. 특정 투여경로 및 투여량은 투여 받을 개체의 특징, 즉 연령, 체중, 질환상태, 몸의 컨디션 등의 조건에 따라 담당 의사/수의사에 의해 선택될 수 있다.
The dosage and administration interval of citrulline for use in the present invention depends on various factors, such as the effectiveness and duration of action of the active ingredient, administration mode, and individual conditions such as the sex, age, weight and severity of other diseases of warm-blooded animals. may vary. A specific administration route and dosage may be selected by the attending physician/veterinarian according to the characteristics of the subject to be administered, ie, age, weight, disease state, physical condition, and the like.

본 발명에서 유효성분으로 함유하는은 간 장애의 예방, 치료 또는 개선의 효과를 가져오는 용량 범위로 함유하는 것을 의미하고, 중증도 및 제형에 따라 용량범위는 변할 수 있으며, 적용횟수도 적용 대상의 연령, 체중 및 체질에 따라 변할 수 있다. In the present invention, containing as an active ingredient means containing in a dosage range that brings the effect of preventing, treating or improving liver disorders, the dosage range may vary depending on the severity and dosage form, and the number of times of application is also the age of the subject. , may vary depending on body weight and constitution.

본 발명에서 치료는 본 발명의 약학 조성물을 간 장애를 갖는 개체에 적용한 결과로서 간 장애의 완치는 물론 간 장애에 따른 증세의 부분적 완치, 호전 및 경감을 포함한다.In the present invention, treatment includes partial cure, alleviation and alleviation of liver disorders as a result of applying the pharmaceutical composition of the present invention to a subject having liver disorders.

본 발명에서 예방은 본 발명의 약학 조성물을 간 장애를 갖는 개체에 적용하여 제 증세 내지 현상을 억제 또는 차단함으로써, 간 장애에 따른 증세가 사전에 발생되지 않도록 하는 것을 의미한다.Prevention in the present invention means that by applying the pharmaceutical composition of the present invention to an individual having a liver disorder to suppress or block the symptoms or phenomena, so that the symptoms according to the liver disorder do not occur in advance.

또한 본 발명에 있어서, 개선이란 증상의 경감, 예방 또는 치료를 포함하는 의미이다.In addition, in the present invention, improvement is meant to include alleviation, prevention or treatment of symptoms.

또한 본 발명에 있어서, 유효성분이란 단독으로 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체(carrier)와 함께 활성을 나타내는 성분을 의미한다.In addition, in the present invention, the active ingredient means a component that exhibits activity alone or together with a carrier (carrier) that has no activity by itself.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여되는데, 본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 개선에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, the term "pharmaceutically effective amount" refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or improvement. The effective dose level depends on the subject type and severity, age, sex, drug activity, drug sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs, and other medical fields. It may be determined according to known factors.

본 발명에서 용어, "개체"란 간 장애가 이미 발병되었거나, 발병될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고 본 발명에 따른 시트룰린을 포함하는 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 개선할 수 있다.
As used herein, the term "individual" refers to all animals, including humans, that have already or may develop liver disorders, and can effectively prevent and improve the disease by administering the composition containing citrulline according to the present invention to the subject. can

본 발명은 또한 시트룰린, 베타인 및 구연산을 유효성분으로 함유하는 간 기능 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.The present invention also relates to a health functional food for improving liver function containing citrulline, betaine and citric acid as active ingredients.

본 발명의 일 양태에서, 상기 시트룰린은 L-시트룰린인 것을 특징으로 한다.In one aspect of the present invention, the citrulline is L-citrulline.

본 발명의 일 양태에서, 상기 시트룰린은 개체에 투여 시 내성이 발현되지 않는다. In one embodiment of the present invention, the citrulline does not develop resistance when administered to a subject.

본 발명의 일 양태에서, 시트룰린, 베타인 및 구연산; 및 간 기능 개선제, 간영양제 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상이 배합된, 간 기능 개선용 건강기능식품이 제공된다. In one aspect of the present invention, citrulline, betaine and citric acid; And at least one selected from the group consisting of liver function improving agents, liver nutrients and vitamins is provided, health functional food for improving liver function is provided.

상기 추가 배합되는 성분은, 아르기닌, 타우린, 카르니틴, 베타글루칸, 밀크시슬, 우르소데옥시콜산, 니코틴산아미드, 비타민B6, 및 비타민B2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
The additionally formulated component may be at least one selected from the group consisting of arginine, taurine, carnitine, beta-glucan, milk thistle, ursodeoxycholic acid, nicotinic acid amide, vitamin B6, and vitamin B2, but is not limited thereto.

본 발명의 건강기능식품은, 시트룰린을 포함하되, 적절한 식품보조첨가제가 포함될 수 있다.The health functional food of the present invention includes citrulline, but may contain an appropriate food supplement additive.

본 발명에서 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
In the present invention, the term "food supplement additive" refers to a component that can be supplementally added to food, and is added to manufacture health functional food of each formulation, and those skilled in the art can appropriately select and use it.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 간 기능 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.The food composition of the present invention may include a health functional food. As used herein, the term "health functional food" refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills using raw materials or ingredients useful for the human body. Here, the term "functionality" refers to obtaining useful effects for health purposes, such as regulating nutrients or physiological effects on the structure and function of the human body. The health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and during the manufacture, it can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art. In addition, unlike general drugs, it has the advantage that there are no side effects that may occur when taking the drug for a long time by using food as a raw material, and it is excellent in portability. is possible

본 발명의 시트룰린이 첨가되는 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the type of food to which citrulline of the present invention is added. Examples of foods to which the above substances can be added include drinks, meat, sausage, bread, biscuits, rice cakes, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, There are beverages, alcoholic beverages, vitamin complexes, dairy products, and dairy products, and includes all health functional foods in the ordinary sense.

본 발명의 시트룰린은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 시트룰린의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.The citrulline of the present invention may be added to food as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. The mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of its use (for prevention or improvement). In general, the amount of citrulline in the health functional food may be added in an amount of 0.01 to 90 parts by weight based on the total weight of the food. However, in the case of long-term intake for health and hygiene or health control, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.

본 발명에 따른 건강식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 10 g이다.When the health food composition according to the present invention is a beverage composition, other ingredients are not particularly limited except for containing the compound as an essential ingredient in the indicated ratio, and various flavoring agents or natural carbohydrates are added as an additional ingredient like a conventional beverage. may contain. Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As flavoring agents other than those described above, natural flavoring agents (taumatin, stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. The proportion of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 10 g per 100 compositions of the present invention.

또한, 본 발명에 따른 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. In addition, the health food composition according to the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic and natural flavoring agents, coloring agents and thickeners (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, Alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like may be contained. In addition, it may contain natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice beverages and vegetable beverages.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 시트룰린 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
These components may be used independently or in combination. The proportion of these additives is not limited, but is generally selected from 0.01 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of citrulline of the present invention.

이하 본 발명을 실험예를 통해 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이고, 본 발명의 권리범위가 이로 한정되는 것을 의도하지 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through experimental examples. However, the following experimental examples are provided to help the understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not intended to be limited thereto.

< 실험준비 >< Experiment preparation >

HUVEC은 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하였다. 배양 시약은 Invitrogen(Carlsbad, CA)에서, 기타 시약은 Laboratory Product Sales (Rochester, NY) 및 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다. LC-MS의 내부표준(internal standard)으로, 13C6-ARG[as ARG:HCl(U-13C6, 98%)], D4-CIT[as L-Citrulline(4,4,5,5-D4, 96.5%)],및 D7-ADMA[as ADMA:HCl:H2O(2,3,3,4,4,5,5-D7, 98%)]를 Cambridge Isotope Laboratories, Inc (Andover, MA)에서 구입하였다. 인간 eNOS 면역분석 키트를 R & D systems (Minneapolis, MN)에서 구입하였다. o-톨루이딘 방법을 활용하는 Quantichrom D-Glucose 분석 키트를 Bioassay Systems (Hayward, CA)에서 구입하였다. 모든 실험에는 탈이온수(de-ionized water, 18 MΩ)를 사용하였다.
HUVECs were purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, VA). Culture reagents were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA), and other reagents were purchased from Laboratory Product Sales (Rochester, NY) and Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). As an internal standard of LC-MS, 13 C 6 -ARG [as ARG:HCl (U- 13 C 6 , 98%)], D 4 -CIT [as L-Citrulline (4,4,5, 5-D 4 , 96.5%)], and D 7 -ADMA [as ADMA:HCl:H 2 O(2,3,3,4,4,5,5-D 7 , 98%)] from Cambridge Isotope Laboratories , Inc (Andover, MA). Human eNOS immunoassay kits were purchased from R&D systems (Minneapolis, Minn.). o A Quantichrom D-Glucose assay kit utilizing the -toluidine method was purchased from Bioassay Systems (Hayward, CA). In all experiments, de-ionized water (18 MΩ) was used.

< < in vitroin vitro 실험 > Experiment >

HUVEC을 최종농도 100 μM ARG 및 5 mM 글루코우즈를 함유하고, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 20% 말혈청(horse serum)이 첨가된 modified F-12K 배지에서 배양하였다. 세포를 37℃의 온도, 5% CO2, 가습 챔버(humidified chamber)에 두었으며, 모든 실험에는 6 내지 16계대 (평균 계대수= 9 ± 3)된 세포를 사용하였다.HUVECs were cultured in modified F-12K medium containing 20% horse serum containing 100 μM ARG and 5 mM glucose final concentration, 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin. . The cells were placed at a temperature of 37° C., 5% CO 2 , and a humidified chamber, and cells aged 6 to 16 passages (average number of passages = 9 ± 3) were used in all experiments.

급성(acute) 실험을 위해, 100 μM의 ARG 및 5 mM 글루코우즈를 함유하는 modified F-12K 배지에서 배양된 HUVEC을 6-웰 디쉬(well area는 9.6 cm2)에서 컨플루언시하게 성장시키고, Locke's 완충액(154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 3.6 mM NaHCO3, 2.3 mM CaCl2, 5.6 mM D-glucose, 5 mM HEPES, pH 7.4)에서 2시간 동안 배양하고/거나, 100 μM ARG 또는 500 μM CIT와 배합하여 배양하였다. 만성 노출(chronic exposure)의 경우 추가로 100 μM ARG 또는 500 μM CIT와 함께 매일 리프레쉬되는 배지에서 연속적으로 7일 동안 배양된 세포를 배양하고, 2시간 동안 100 μM ARG 또는 500 μM CIT로 순차적으로 챌린지하는 방법을 사용하였다.For acute experiments, HUVECs cultured in modified F-12K medium containing 100 μM ARG and 5 mM glucose were grown to confluency in 6-well dishes (well area is 9.6 cm 2 ) and , in Locke's buffer (154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 3.6 mM NaHCO 3 , 2.3 mM CaCl 2 , 5.6 mM D-glucose, 5 mM HEPES, pH 7.4) for 2 h and/or 100 μM ARG or 500 μM It was cultured in combination with CIT. For chronic exposure, incubate the cultured cells for 7 consecutive days in medium refreshed daily with an additional 100 μM ARG or 500 μM CIT and challenge sequentially with 100 μM ARG or 500 μM CIT for 2 hours method was used.

ARG 또는 CIT 챌린지 후, 처치된 세포를 1 mL PBS로 2회 세척하고, 동량의 F-12K 배지(0.5 mL)를 가하기 전에 트립신 EDTA(0.5 mL)로 3분 미만 동안 배양하였다. 세포를 원심분리하고(300 x g, 5분), 1mL의 PBS로 2회 세척하고, 0.5 mL 라이시스 완충액(R&D system)을 사용하여 용해시켰다. 용해된 혼합물을 원심분리하고(13000 x g, 5분), 상등액(대략 150-300 μL)을 수득하여, Lowry 방법으로 단백질 농도를 분석하는 데 사용하였고, 표준품으로는 우혈청 알부민을 사용하였다. 세포 용해물은 프로토콜에 따라 eNOS 발현 및 글루코우즈 축적을 테스트하는데 사용되었다.
After ARG or CIT challenge, the treated cells were washed twice with 1 mL PBS and incubated for less than 3 minutes with trypsin EDTA (0.5 mL) before adding an equal amount of F-12K medium (0.5 mL). Cells were centrifuged (300 x g, 5 min), washed twice with 1 mL of PBS, and lysed using 0.5 mL lysis buffer (R&D system). The lysed mixture was centrifuged (13000 x g, 5 min), and a supernatant (approximately 150-300 μL) was obtained, which was used to analyze the protein concentration by the Lowry method, and bovine serum albumin was used as a standard. Cell lysates were used to test eNOS expression and glucose accumulation according to the protocol.

< < in vivoin vivo 실험 > Experiment >

225-250 g의 수컷 Sprague-Dawley 래트를 실험에 사용하였다. 래트를 수술 또는 약물요법이 시작되기 전 2주 동안 실험실에 익숙해질 수 있도록 하였다. 모든 동물 실험 프로토콜은 <University animal care and use committee>에 의해 허락되었다.Male Sprague-Dawley rats weighing 225-250 g were used in the experiment. Rats were allowed to acclimatize to the laboratory for 2 weeks before surgery or drug therapy was initiated. All animal testing protocols were approved by the <University animal care and use committee>.

in vivo 실험에서는, 3일 동안 래트에서 ARG versus CIT 보충 요법 후, ARG, CIT, ADMA, SDMA 및 글루코우즈의 혈장 농도, 무기 아질산염 및 질산염의 혈장 및 뇨중 농도가 비교되었다. 동물이 접근할 수 있게 되기 전에 마시는 물에는 1.25 % ARG 또는 1.25 % CIT가 주입되었고, pH 7.2-7.4로 조정되었다. 2일째에, 래트를 대사 케이지로 옮기고, 뇨 샘플을 희생시키기 20시간 전에 채취하였다. 실험 마지막에 래트에 케타민(90 mg/kg) 및 자일라진(9 mg/kg)을 복강내 투여하여 마취시키고, 흉대동맥(thoracic aorta)에서 혈액을 채취하여 원심분리 후 혈장을 수득하였다.In an in vivo experiment, plasma concentrations of ARG, CIT, ADMA, SDMA and glucose, and plasma and urine concentrations of inorganic nitrites and nitrates were compared in rats after ARG versus CIT supplementation for 3 days. Before animals became accessible, drinking water was infused with either 1.25% ARG or 1.25% CIT and adjusted to pH 7.2-7.4. On day 2, rats were transferred to metabolic cages and urine samples were taken 20 hours prior to sacrifice. At the end of the experiment, rats were anesthetized by intraperitoneal administration of ketamine (90 mg/kg) and xylazine (9 mg/kg), and blood was collected from the thoracic aorta and centrifuged to obtain plasma.

약동력학 스터디를 위해, 래트에 20 mg/kg Zoletil 50® (tiletamine HCl 125 mg/5 mL + zolazepam HCl 125 mg/5 mL)을 복강내 주사하여 마취시키고, 폴리에틸렌(PE) 튜빙(0.58 mm i.d., 0.96 mm o.d., Natsume, Tokyo, Japan)을 우측 목정맥(jugular vein)에 꽂았다. 24시간 후, 생리학적 상태를 측정하고, 동물 모델이 안정적인 것으로 보이는 경우 실험을 수행하였다. 래트를 ARG 또는 CIT 투여 전 24시간 동안 절식시켰다. ARG 및 CIT는 노멀 생리식염수에 용해시키고, 음경 정맥 주사를 통해 150 mg/kg (n=3, each) 용량을 주사하였고, 경구 영양공급을 통해 500 mg/kg (n=4 for ARG and n=5 for CIT) 용량을 투여하였다. 정맥 혈액 샘플을 약물 투여 전 및 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 및 24시간 째에 채혈하였다. 혈장 샘플을 4℃에서 10분간 원심분리(5000 x g)하여 수득하고, 분석하기 전까지 -20℃에 저장하였다.
For pharmacokinetic studies, rats were anesthetized by intraperitoneal injection of 20 mg/kg Zoletil 50 ® (tiletamine HCl 125 mg/5 mL + zolazepam HCl 125 mg/5 mL) and polyethylene (PE) tubing (0.58 mm id, 0.96 mm od, Natsume, Tokyo, Japan) was inserted into the right jugular vein. After 24 hours, the physiological status was measured and the experiment was performed if the animal model appeared to be stable. Rats were fasted for 24 hours prior to ARG or CIT administration. ARG and CIT were dissolved in normal saline, 150 mg/kg (n=3, each) dose was injected through penile intravenous injection, and 500 mg/kg (n=4 for ARG and n= 5 for CIT) was administered. Venous blood samples were drawn prior to drug administration and at 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 and 24 hours. Plasma samples were obtained by centrifugation (5000×g) at 4°C for 10 minutes and stored at -20°C until analysis.

< 무기 아질산염(inorganic nitrite) 및 총 아질산염/질산염(total nitrite/nitrate) >< Inorganic nitrite and total nitrite/nitrate >

세포 용해물, 래트 혈장, 뇨 샘플 또는 프레쉬하게 준비된 아질산염 표준품을 100 μL 부피로 우선 2중-탈이온수에 넣었다. 샘플을 빛으로부터 보호하고, 10 μL의 프레쉬하게 준비된 디아미노나프탈렌(DAN, 0.05 mg/mL in 1 M HCl)을 가하고 즉시 믹싱하였다. 10분간 실온에서 배양하고, 반응을 5 μL의 2.8 M NaOH로 종료시켰다. 형광강도를 플레이트 리더로 측정(excitation at 360 nm and emission read at 420 nm)하였고, 100%로 강도 조정을 하였다.Cell lysates, rat plasma, urine samples or freshly prepared nitrite standards were first placed in double-deionized water in a volume of 100 μL. The sample was protected from light, 10 μL of freshly prepared diaminonaphthalene (DAN, 0.05 mg/mL in 1 M HCl) was added and mixed immediately. Incubate for 10 min at room temperature, and the reaction was terminated with 5 μL of 2.8 M NaOH. The fluorescence intensity was measured with a plate reader (excitation at 360 nm and emission read at 420 nm), and the intensity was adjusted to 100%.

총 아질산염/질산염을 측정하기 위하여, 질산염을 Aspergillus niger 로부터의 질산염 환원제(reductase)의 작용에 의해 아질산염으로 변환되도록 하였다. 즉, 샘플을 40 μM NADH 및 14 mU 효소와 함께 50 μL의 20 mM Tris, pH 7.6 조건에서 배양하고, 10 μL의 DAN과 30분간 실온에서 배양하였다. 반응은 30분 후 20 μL의 NaOH로 종료시켰다. 샘플 중 아질산염 함량은 NADH를 함유하는 효소 블랭크값을 우선 뺌으로써 계산되었다. 그 값을 총 단백질 농도를 사용하여 노멀라이즈하고, Lowry 방법에 따라 계산하였다.
To determine total nitrite/nitrate, nitrate was converted to nitrite by the action of a nitrate reductase from Aspergillus niger . That is, samples were incubated with 40 μM NADH and 14 mU enzyme in 50 μL of 20 mM Tris, pH 7.6, and incubated with 10 μL of DAN at room temperature for 30 minutes. The reaction was terminated with 20 μL of NaOH after 30 min. The nitrite content in the sample was calculated by first subtracting the blank of the enzyme containing NADH. The values were normalized using the total protein concentration and calculated according to the Lowry method.

< 수퍼옥사이드 측정 >< Superoxide Measurement >

O2·- 생성은 DHE(dihydroethidium) 형광을 사용하여 측정하였다. 배양 마지막에 세포 또는 래트 대동맥 링(aortic rings)을 세척하고, Lockes 완충액(최종 DHE 농도가 10 nM) 중에서 20분간 배양하였다. 그 후 이를 아세토니트릴(0.2 mL/well)에서 하비스트하고, 소니케이션시킨 후(10s), 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다(13,000 x g). 상등액을 공기로 말리고, PBS를 부은 후, 형광강도(in arbitrary units, AU)를 마이크로-플레이트 리더를 사용하여 2회 측정하였다(excitation 및 emission wavelength는 각각 490 nm 및 570 nm)
O 2 − production was measured using dihydroethidium (DHE) fluorescence. At the end of incubation, cells or rat aortic rings were washed and incubated in Lockes buffer (final DHE concentration of 10 nM) for 20 minutes. It was then harvested in acetonitrile (0.2 mL/well), sonicated (10 s), and centrifuged at 4° C. for 5 minutes (13,000×g). After drying the supernatant with air and pouring PBS, fluorescence intensity (in arbitrary units, AU) was measured twice using a micro-plate reader (excitation and emission wavelengths were 490 nm and 570 nm, respectively)

< LC-MS/MS 분석 >< LC-MS/MS analysis >

ARG, CIT, ADMA 및 SDMA 농도를 LC-MS/MS 분석으로 측정하였다. 즉, 혈장 샘플을 물로 10배 희석하고, 20 μL의 희석된 샘플을 내부표준 standards (20 μL의 1 μM 13C6-ARG 및 20 μL의 1 μM D4-CIT 및 20 μL의 250 nM D7ADMA)과 혼합하고, 0.5% 아세트산 및 0.025% 트리플루오로아세트산을 함유하는 120 μL의 아세토니트릴을 첨가하여 단백질을 제거하였다. 20분간 원심분리후(10,000 x g) 상등액을 수집하여 분석에 사용하였다.
ARG, CIT, ADMA and SDMA concentrations were determined by LC-MS/MS analysis. That is, the plasma sample was diluted 10-fold with water, and 20 μL of the diluted sample was mixed with internal standard standards (20 μL of 1 μM 13 C 6 -ARG and 20 μL of 1 μM D 4 -CIT and 20 μL of 250 nM D 7 ). ADMA) and added 120 μL of acetonitrile containing 0.5% acetic acid and 0.025% trifluoroacetic acid to remove protein. After centrifugation for 20 minutes (10,000 x g), the supernatant was collected and used for analysis.

< 통계분석 >< Statistical Analysis >

ARG, CIT, 및 CIT로부터 형성된 ARG의 모든 혈장 농도 프로파일은 S-ADAPT 소프트웨어로 집단 약동력학 모델링을 함으로써 동시에 분석되었다. 실험결과는 달리 언급이 없는 한 평균값 ± 표준편차(n = 6 replicates)를 나타낸다. 그룹 간 통계학적 비교는 ANOVA를 사용하여 수행되었고, Fishers 및 Tukeys post-hoc test procedure가 사용되었다. 통계학적 유의성은 p<0.05일 때로 하였다.
All plasma concentration profiles of ARG, CIT, and ARG formed from CIT were analyzed simultaneously by population pharmacokinetic modeling with S-ADAPT software. Experimental results represent mean ± standard deviation (n = 6 replicates) unless otherwise stated. Statistical comparisons between groups were performed using ANOVA, and the Fishers and Tukeys post-hoc test procedure was used. Statistical significance was determined when p<0.05.

상기 실험한 결과를 정리하면 다음과 같다:
The results of the above experiments are summarized as follows:

< 실험 결과 >< Experiment Result >

실험에 CIT (500 μM) 농도 노출이 선택된 이유는 더 낮은 농도에서는 100 μM ARG와 비교하였을 때 충분한 NO 생성이 나타나지 않았기 때문이었다. The CIT (500 μM) concentration exposure was chosen for the experiment because the lower concentration did not result in sufficient NO production when compared to 100 μM ARG.

표1을 보면, Locke's 완충액 중에서 2시간 동안 100 μM ARG 또는 500 μM CIT에 급성 노출되었을 때 HUVEC의 다른 반응이 나타나있다. 두 처치군 모두에서 대조군과 비교해 보았을 때 아질산염/질산염 축적 정도가 유사하게 증가하는 것으로 나타난 반면, acute ARG 노출군에서만 O2 및 세포내 글루코우즈의 증가가 나타났다. eNOS 활성은 ARG 또는 CIT 급성 노출군에서 모두 거의 변화가 없었다.
Table 1 shows the different responses of HUVECs upon acute exposure to 100 μM ARG or 500 μM CIT in Locke's buffer for 2 hours. In both treatment groups, the degree of nitrite/nitrate accumulation was similarly increased when compared to the control group, whereas only in the acute ARG exposure group, O2 and an increase in intracellular glucose. eNOS activity was almost unchanged in either ARG or CIT acute exposure groups.

100 μM ARG에 7일간 연속적으로 노출시킨 후, HUVEC 세포는 100 μM ARG로 2시간 동안 챌린지하였을 때 아질산염/질산염 축적이 감소하는 것으로 나타났다. After 7 consecutive days of exposure to 100 μM ARG, HUVEC cells showed reduced nitrite/nitrate accumulation when challenged with 100 μM ARG for 2 h.

부수적으로, 상기 세포들은 증가된 O2·- 및 세포내 글루코우즈 축적을 보였다. 반대로 500 μM CIT에 7일간 노출된 세포들은 CIT의 챌린지 용량을 2시간 동안 주었을 때 반응하는 것으로 나타났다. 500 μM CIT를 7일간 연속적으로 노출시킨 후 관찰된 O2·- 및 세포내 글루코우즈 레벨은 대조군 레벨과 유사하였다. 다양한 CIT 처리군에서 eNOS 단백질 발현에 있어서 차이가 없었다.
Concomitantly, the cells showed increased O 2 − and intracellular glucose accumulation. Conversely, cells exposed to 500 μM CIT for 7 days responded to the challenge dose of CIT for 2 hours. O 2 · - observed after continuous exposure to 500 μM CIT for 7 days and intracellular glucose levels were similar to control levels. There was no difference in eNOS protein expression in the various CIT treatment groups.

Figure 112015090090244-pat00001
Figure 112015090090244-pat00001

(Cellular response in HUVEC after acute or chronic treatment with CIT and ARG. * p < 0.05 versus control, ^p < 0.05, CIT versus ARG in acute groups, #p < 0.05, CIT versus ARG in chronic groups)
(Cellular response in HUVEC after acute or chronic treatment with CIT and ARG. * p < 0.05 versus control, ^p < 0.05, CIT versus ARG in acute groups, #p < 0.05, CIT versus ARG in chronic groups)

하기 표2는 ARG, CIT, ADMA, SDMA 및 글루코우즈의 혈장 농도, 무기 아질산염 및 질산염의 혈장 및 뇨중 농도를 나타낸 것으로서, 3일간 1.25% ARG vs. CIT를 마시는 물에 주입하였을 때 수득된 결과이다. Table 2 below shows the plasma concentrations of ARG, CIT, ADMA, SDMA and glucose, and the plasma and urine concentrations of inorganic nitrite and nitrate, 1.25% ARG vs. Results obtained when CIT was injected into drinking water.

그 결과 CIT 투여군에서는 유사한 몰 농도(ARG에 대한 CIT의 몰용량비는 0.994임)를 주었음에도 불구하고, 현저히 높은 혈장 ARG 및 CIT를 보였다(각각 평균 1.72 및 5.38배). 혈장 ADMA 및 SDMA 농도는 ARG versus CIT dosing 사이에 차이가 없었다. As a result, the CIT-administered group showed significantly higher plasma ARG and CIT (average 1.72 and 5.38 times, respectively) despite giving a similar molar concentration (the molar dose ratio of CIT to ARG was 0.994). Plasma ADMA and SDMA concentrations did not differ between ARG versus CIT dosing.

ADMA에 대한 혈장 ARG의 비는 ARG 그룹보다 (ARG/ADMA = 286 ± 72, p<0.05) CIT 그룹에서 더 높게 나타났다 (ARG/ADMA = 436 ± 151).
The ratio of plasma ARG to ADMA was higher in the CIT group (ARG/ADMA = 286 ± 72, p<0.05) than in the ARG group (ARG/ADMA = 436 ± 151).

Figure 112015090090244-pat00002
Figure 112015090090244-pat00002

(Comparison of various ARG biomarkers after 3 days of ARG or CIT oral supplementation in rats. Data are presented as the mean SD. *, p<0.05 and ***, p<0.001 versus ARG)
(Comparison of various ARG biomarkers after 3 days of ARG or CIT oral supplementation in rats. Data are presented as the mean SD. *, p<0.05 and ***, p<0.001 versus ARG)

상기 표2는 또한 혈장 및 뇨중 아질산염 및 질산염 농도가 ARG 및 CIT 투여 후 현저히 증가한다는 점을 보여준다. 흥미롭게도, CIT 투여로 인하여 ARG 투여 후 결과에 비해 혈장 및 뇨중 아질산염/질산염 레벨이 더 높은 것으로 나타났다. 혈장 글루코우즈 레벨은 CIT 투여와 비교하여 ARG를 경구 투여한 3일 후 현저히 증가하였다.Table 2 above also shows that nitrite and nitrate concentrations in plasma and urine are significantly increased after ARG and CIT administration. Interestingly, CIT administration resulted in higher plasma and urine nitrite/nitrate levels compared to results after ARG administration. Plasma glucose levels were significantly increased after 3 days of oral administration of ARG compared to CIT administration.

대동맥 eNOS 단백질 발현은 ARG 또는 CIT 투여 후 현저히 변화되지는 않았다. 흉대동맥에서 eNOS 단백질은 대조군(n=8)에서 0.41 ± 0.13 μg/mg 단백질이었고, ARG 군(n=15) 에서 0.48 ± 0.21 μg/mg이었으며, CIT군(n=8)에서 0.45 ± 0.19 μg/mg이었다.
Aortic eNOS protein expression was not significantly changed after ARG or CIT administration. In the thoracic aorta, eNOS protein was 0.41 ± 0.13 μg/mg protein in the control group (n=8), 0.48 ± 0.21 μg/mg in the ARG group (n=15), and 0.45 ± 0.19 μg in the CIT group (n=8). /mg.

최종 집단 약동력학 모델은 ARG의 경우 one disposition compartment이고, CIT의 경우 two disposition compartment이었으며, 경구 흡수는 일차 프로세스를 따랐다. ARG 및 CIT의 내생적 합성은 0차 프로세스를 따랐다. The final population pharmacokinetic model was one disposition compartment for ARG and two disposition compartments for CIT, and oral absorption followed a primary process. The endogenous synthesis of ARG and CIT followed a zero-order process.

측정된 경구 생체이용률은 ARG의 경우 18.8%, CIT의 경우 100%였고, 33.7%의 CIT는 ARG로 대사되었다. 따라서 ARG 농도는 CIT 투여로 인해 현저히 증가하였다. The measured oral bioavailability was 18.8% for ARG and 100% for CIT, and 33.7% of CIT was metabolized to ARG. Therefore, ARG concentration was significantly increased by CIT administration.

총 클리어런스는 ARG의 경우 0.112 L/h, CIT의 경우 0.157 L/h였고, steady-state에서 distribution 부피는 ARG의 경우 72.5 mL, CIT의 경우 442 mL였다. 농도에 대해 피팅된 상관계수는 ARG의 경우 0.93 (0.86), CIT의 경우 0.95 (0.86)였고, 여기에서 전술한 수치는 개별값, 괄호안 수치는 집단값을 나타낸다.
The total clearance was 0.112 L/h for ARG and 0.157 L/h for CIT, and the distribution volume at steady-state was 72.5 mL for ARG and 442 mL for CIT. Correlation coefficients fit for concentration were 0.93 (0.86) for ARG and 0.95 (0.86) for CIT, where the above-mentioned values represent individual values and the values in parentheses represent group values.

상기한 바와 같이, 혈관내피세포를 사용한 실험에서 아르기닌을 장기적으로 처리하였을 때, 세포 내 아질산염/질산염(nitrite/nitrate)의 생성이 증가하지 않는 것으로 나타났으며, 이는 즉 내성이 발현됨을 의미한다. 이는 글루코우즈의 증가와 산화질소생성효소의 감소, 수퍼옥사이드의 축적을 동반하였다. As described above, when arginine was treated for a long time in an experiment using vascular endothelial cells, it was found that the production of intracellular nitrite / nitrate (nitrite / nitrate) does not increase, that is, resistance is expressed. This was accompanied by an increase in glucose, a decrease in nitric oxide synthase, and an accumulation of superoxide.

반면 시트룰린을 처리한 경우 지속적으로 아질산염/질산염의 생성이 증가하는 것으로 나타났고, 이는 내성이 발현되지 않음을 의미한다. 시트룰린 처리 시 아르기닌의 내성발현과 관련이 있을 것으로 생각되는 글루코우즈, 산화질소생성효소 및 수퍼옥사이드의 변화 역시 관찰되지 않았다. On the other hand, when citrulline was treated, the production of nitrite/nitrate was continuously increased, which means that resistance was not developed. Changes in glucose, nitric oxide synthase and superoxide, which are thought to be related to the expression of resistance to arginine, were also not observed during citrulline treatment.

또한 래트 실험에서 시트룰린의 투여 시 경구생체이용률은 ~100%로 매우 우수한 것으로 나타났다. 또한 시트룰린은 투여량의 33.7%가 아르기닌으로 변환되어 아르기닌을 투여했을 때 보다 혈중 아르기닌의 농도를 효과적으로 상승시켰다.
In addition, the oral bioavailability when administered with citrulline in a rat experiment was found to be very excellent at ~100%. In addition, 33.7% of the dose of citrulline was converted to arginine, which effectively increased the concentration of arginine in the blood than when arginine was administered.

본 발명의 발명자는 상기한 바와 같이 시트룰린, 베타인 및 구연산의 세 가지 성분이 배합된 형태로 복용하는 경우, 장기간 복용 시에도 내성이 발현되지 않는 특성을 나타낸다는 점, 및 우수한 생체이용률을 나타낸다는 점을 새로이 구명하였으며, 특히 본 발명에 따른 시트룰린은 아르기닌을 대체하여 간 장애 예방 또는 치료 목적의 약학적 조성물, 또는 간 기능 개선용 건강식품조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.The inventors of the present invention, as described above, when the three components of citrulline, betaine and citric acid are taken in a blended form, resistance does not develop even when taken for a long period of time, and excellent bioavailability. In particular, the citrulline according to the present invention can be usefully used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for the purpose of preventing or treating liver disorders by replacing arginine, or as an active ingredient in a health food composition for improving liver function.

Claims (5)

시트룰린(citrulline), 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 아르기닌 내성 간 장애(liver disorder) 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 아르기닌 내성 간 장애는 간염, 바이러스성 간염, 알코올성 간질환(alcoholic liver disease), 비-알코올성 간질환, 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis), 간섬유증, 간경변 및 문맥성 고혈압, 복수, 신부전, 간성뇌증 및 급만성 간부전과 같은 간경변의 합병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아르기닌 내성 간 장애인 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing or treating arginine-resistant liver disorder, comprising citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient,
The arginine-resistant liver disorder is hepatitis, viral hepatitis, alcoholic liver disease, non-alcoholic liver disease, non-alcoholic steatohepatitis, liver fibrosis, cirrhosis and portal hypertension, ascites, A pharmaceutical composition for an arginine-resistant liver disorder selected from the group consisting of complications of liver cirrhosis, such as renal failure, hepatic encephalopathy, and acute and chronic liver failure.
 제1항에 있어서,
상기 시트룰린은 L-시트룰린인 것을 특징으로 하는, 아르기닌 내성 간 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The method of claim 1,
The citrulline is a pharmaceutical composition for preventing or treating arginine-resistant liver disorder, characterized in that L-citrulline.
 삭제delete 삭제delete 시트룰린, 베타인 및 구연산, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 아르기닌 내성 간 장애 개선용 건강기능식품으로서,
상기 아르기닌 내성 간 장애는 간염, 바이러스성 간염, 알코올성 간질환(alcoholic liver disease), 비-알코올성 간질환, 비-알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis), 간섬유증, 간경변 및 문맥성 고혈압, 복수, 신부전, 간성뇌증 및 급만성 간부전과 같은 간경변의 합병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아르기닌 내성 간 장애인 건강기능식품.As a health functional food for improving arginine-resistant liver disorder containing citrulline, betaine and citric acid, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient,
The arginine-resistant liver disorder is hepatitis, viral hepatitis, alcoholic liver disease, non-alcoholic liver disease, non-alcoholic steatohepatitis, liver fibrosis, cirrhosis and portal hypertension, ascites, A health functional food for an arginine-resistant liver disorder selected from the group consisting of complications of liver cirrhosis such as renal failure, hepatic encephalopathy and acute and chronic liver failure.
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