KR102392567B1 - A composition for chlamydia diagnosis and a multi-isothermal amplification primer set, and a kit with improved speed, accuracy and portability using the same and a visual diagnosis method using the diagnostic kit - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 클라미디아 진단용 조성물 및 다중 등온증폭 프라이머 세트, 그리고 이를 이용한 신속성, 정확성 및 휴대성이 향상된 키트와 진단키트를 통한 육안진단방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 조성물에 포함된 프라이머 세트를 이용하여 보다 정확도 높게 클라미디아 균을 검출하고, 신속하고 저렴하게 클라미디아 감염병을 진단할 수 있고, 랩온페이퍼 기반 진단 키트에 적용할 수 있다.The present invention relates to a composition for chlamydia diagnosis, a multi-isothermal amplification primer set, and a kit with improved speed, accuracy and portability using the same, and a visual diagnosis method using the diagnostic kit. Specifically, by using the primer set included in the composition of the present invention, it is possible to detect Chlamydia bacteria with higher accuracy, to quickly and inexpensively diagnose a chlamydia infection, and to apply it to a lab-on-paper-based diagnostic kit.
클라미디아 감염증(Chlamydia infection)은 클라미디아 트라코마티스라는 박테리아에 의해 사람에게 발생하는 흔한 성병이다. 감염이 된 사람들은 대부분 증상이 발현되지 않고, 증상이 발현되더라도 감염 후 몇 주가 걸린다. 남성에서는 비임균성 요도염, 여성에서는 자궁경부염의 형태로 나타난다.Chlamydia infection is a common sexually transmitted disease in humans caused by the bacterium Chlamydia trachomatis. Most people who become infected do not develop symptoms, and even if symptoms do develop, it may take several weeks after infection. It appears in the form of non-gonococcal urethritis in men and cervicitis in women.
이 질병은 전 세계에서 가장 흔한 성병들 가운데 하나이며, 미국에서만 100만 명 정도의 사람들이 이 질병에 감염된 것으로 짐작된다. 또한 클라미디아 감염병인 클라미디아 결막염이나 트라코마는 전 세계에서 가장 흔한 실명 원인의 하나이다. 세계 보건 기구(WHO)에 따르면 1995년에 실명 환자 중 15%로 추산하였으나, 2002년에는 단지 3.6%로 추산된 바 있다.The disease is one of the most common sexually transmitted diseases worldwide, and it is estimated that around 1 million people are infected in the United States alone. In addition, chlamydial conjunctivitis or trachoma, which are chlamydial infectious diseases, is one of the most common causes of blindness worldwide. According to the World Health Organization (WHO), in 1995 it was estimated at 15% of cases of blindness, but in 2002 it was estimated at only 3.6%.
여성의 경우 보균을 하고 있더라도 대부분의 경우 보균을 하고 있더라도 증상이 없기 때문에 정확히 알기 어렵고 실제로 약 70%는 무증상인 것으로 보고 된다. 여성과 마찬가지로 남성도 종종 증상이 전혀 없거나 있더라도 미약해서 본인이 전혀 모르고 있는 경우가 많다. 남녀 모두 치료하지 않으면 드물게 불임으로 이어질 수 있고, 클라미디아가 눈에 감염되는 경우, 영구적인 실명으로 이어질 수 있다. 클라미디아를 치료하기 위해서 에리스로마이신과 같이 일반적인 항생제를 사용할 수 있으나, 무증상인 상태에서 집단 감염이 가능하기 때문에 클라미디아의 보균 여부의 확인과 빠른 치료는 매우 중요하게 인식된다.In the case of women, even if they are carrying bacteria, in most cases, it is difficult to know exactly because there are no symptoms even if they are carrying bacteria, and in fact, about 70% of them are reported to be asymptomatic. Like women, men often have no symptoms at all or even if they do, they are so weak that they are often unaware of it. Untreated in both men and women, it can rarely lead to infertility and, if chlamydia infects the eye, can lead to permanent blindness. Common antibiotics such as erythromycin can be used to treat chlamydia, but since mass infection is possible in the asymptomatic state, confirmation of chlamydia carrier and prompt treatment are recognized as very important.
한편, 보균 여부를 확인하는 수단으로서 Real-time PCR을 이용한 진단법이 가장 빠르고 민감한 진단법으로 알려져 있으며, 일반적으로 8시간 이내에 진단이 가능하다. 현재 분자진단 방법은 PCR기술과 마이크로 채널 기술의 발전과 더불어 급속히 발전하고 있으며 Alere사의 AlereTM I 나 Roche의 Cobas Influenza 와 같이 60분 내에 검출이 가능한 제품도 상용화 되어 있다. 하지만 급속분자진단이 가능한 방법론의 경우에는 고가의 분석 장비 혹은 고가의 검사비용이 요구되며 분자진단의 전 과정을 구현하기 위해서는 여러 단계를 요구하고 있으므로 아직 현장 진단에는 한계점을 가지고 있다.On the other hand, as a means of confirming the presence of carriers, a diagnostic method using real-time PCR is known as the fastest and most sensitive diagnostic method, and can generally be diagnosed within 8 hours. Currently, molecular diagnostic methods are rapidly developing along with the development of PCR technology and microchannel technology, and products that can detect within 60 minutes, such as Alere TM I from Alere or Cobas Influenza from Roche, are also commercially available. However, in the case of a methodology capable of rapid molecular diagnosis, expensive analysis equipment or expensive examination costs are required, and several steps are required to implement the entire molecular diagnosis process, so there are still limitations to on-site diagnosis.
현재 보편화된 분자진단 법은 real-time PCR을 이용하는 것으로, 신속성 때문에 가장 보편화되어 있지만 현장진단 또는 1,2차 의료기관에서 사용하기에는 크고 고가의 장비를 요하기 때문에 쉽게 사용하는 것이 어려운 실정이다. 분자 진단을 위해서는 크게 시료의 전처리 (preparation), 핵산 증폭 반응 (reaction)과 검출 (detection)의 3단계가 요구되는데, 핵산 증폭 반응과 검출은 real-time PCR 장비에 의해 동시에 재현하는 것이 가능하지만 시료의 전처리 문제는 여전히 남아 있다.Currently, the general molecular diagnostic method uses real-time PCR, which is the most common because of its speed, but it is difficult to use easily because it requires large and expensive equipment for on-site diagnosis or use in primary and secondary medical institutions. Molecular diagnosis requires three steps: sample preparation, nucleic acid amplification reaction, and detection. Although the nucleic acid amplification reaction and detection can be reproduced simultaneously by real-time PCR equipment, the sample The problem of preprocessing still remains.
이러한 어려움을 해결하기 위해 제안된 기술이 랩온페이퍼(Lab-on-paper)이다. 랩온페이퍼 기술은 시료의 전처리, 등온증폭, 검출, 및 분석 단계를 하나의 칩 위에서 수행하도록 하는 일체형 시스템에 기반한 기술을 의미한다. 작은 페이퍼와 페이퍼에 심은 칩 구조물로 모든 반응을 자동화하여 빠르게 수행할 수 있으므로 검출 현장 등의 장소에 구애받지 않는 장점을 갖는다.A technology proposed to solve these difficulties is Lab-on-paper. Lab-on-paper technology refers to a technology based on an integrated system that performs sample pretreatment, isothermal amplification, detection, and analysis on a single chip. With small paper and a chip structure planted in the paper, all reactions can be automated and performed quickly, so it has the advantage of being independent of the detection site and other places.
본 발명은 클라미디아 감염병 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a primer set for diagnosing chlamydial infectious diseases.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 클라미디아 감염병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing chlamydia infectious disease comprising the primer set.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 클라미디아 감염병 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing chlamydial infectious diseases including the primer set.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 생물학적 시료로부터 클라미디아 감염병을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing a chlamydial infection from a biological sample using the primer set.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하는 랩온페이퍼 기반의 클라미디아 감염병 진단 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a lab-on-paper-based chlamydia infectious disease diagnostic kit using the primer set.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하는 랩온페이퍼 기반의 클라미디아 감염병 진단 시스템을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a lab-on-paper-based chlamydia infectious disease diagnosis system using the primer set.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 랩온페이퍼 기반의 클라미디아 감염병 진단 키트를 이용하는 클라미디아 감염병 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing chlamydia infectious disease using the lab-on-paper-based chlamydia infectious disease diagnosis kit.
여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.The terminology used herein is for the purpose of referring to specific embodiments only, and is not intended to limit the invention. As used herein, the singular forms also include the plural forms unless the phrases clearly indicate the opposite. The meaning of "comprising," as used herein, specifies a particular characteristic, region, integer, step, operation, element and/or component, and other specific characteristic, region, integer, step, operation, element, component, and/or group. It does not exclude the existence or addition of
다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 시스템에 대하여 설명하기로 한다. 여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.Although not defined otherwise, all terms including technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by those of ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Commonly used terms defined in the dictionary are additionally interpreted as having a meaning consistent with the related technical literature and the presently disclosed content, and unless defined, are not interpreted in an ideal or very formal meaning. Hereinafter, a system according to a preferred embodiment of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. The terminology used herein is for the purpose of referring to specific embodiments only, and is not intended to limit the invention. As used herein, the singular forms also include the plural forms unless the phrases clearly indicate the opposite. The meaning of "comprising," as used herein, specifies a particular characteristic, region, integer, step, operation, element and/or component, and other specific characteristic, region, integer, step, operation, element, component, and/or group. It does not exclude the existence or addition of
이하, 본 발명을 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 구현예는 6 개의 프라이머를 포함하는 클라미디아 균(Chlamydia sp.) 감염병 진단용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 6 개의 프라이머로 구성되는 프라이머 세트는, 각각 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.One embodiment for solving the above problems provides a primer set for diagnosing Chlamydia sp. infectious diseases including six primers. The primer set composed of the six primers may be one represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 6, respectively.
상기 클라미디아 균은 구체적으로 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis)일 수 있다. 클라미디아 감염증은 성병과 안구 감염을 모두 포함하는 것일 수 있다.The Chlamydia bacteria may be specifically Chlamydia trachomatis ( C. trachomatis ). Chlamydial infections can include both sexually transmitted infections and eye infections.
용어 "프라이머"는 자유 3말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)를 가지는 짧은 폴리뉴클레오티드로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역방향 전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. The term "primer" refers to a short polynucleotide having a free 3' hydroxyl group, capable of forming a base pair with a complementary template and serving as a starting point for template strand copying. can The primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different deoxynucleoside triphospates (dNTPs) in an appropriate buffer and temperature.
상기 프라이머 세트에서 각각의 프라이머는 표적하는 유전자에 특이적으로서, 용어 "유전자에 특이적" 또는 "상보적인"은 표적 유전자에 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100% 염기쌍을 이룰 수 있는 것을 의미할 수 있다. Each primer in the primer set is specific for a gene it targets, wherein the term “gene-specific” or “complementary” means at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or 100% to the target gene. It may mean that it can form % base pairing.
상기 프라이머 세트에서 각 프라이머는 서열번호 1 내지 6의 염기서열 중 하나의 염기서열로 이루어지거나 이를 포함하는 것일 수 있고, 클라미디아 균의 유전 물질에 특이적으로 결합을 유지하는 한, 서열번호 1 내지 6으로 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 상기 프라이머는 또한, 유전자 합성의 개시점으로서 작동하는데 기본적인 성질을 변화시키지 않는 범위에서 추가의 특징을 더 포함하도록 개조될 수 있다. 따라서, 상기 프라이머는 각 정의된 서열번호의 염기서열을 포함하면서 약 1 내지 20 bp, 1 내지 15 bp, 1 내지 10 bp, 또는 1 내지 5 bp의 추가적인 염기 서열을, 상기 프라이머의 3' 말단, 5' 말단 또는 염기서열 내부에 더 포함할 수 있고, 필요한 경우 각 말단 또는 특정 염기에 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 더 포함할 수 있다. In the primer set, each primer may consist of or include one of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6, and as long as it specifically maintains binding to the genetic material of Chlamydia, SEQ ID NOs: 1 to 6 It may have 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more homology with the base sequence described as The primers can also be adapted to further include additional features to the extent that they do not change their basic properties to act as a starting point for gene synthesis. Accordingly, the primer includes an additional nucleotide sequence of about 1 to 20 bp, 1 to 15 bp, 1 to 10 bp, or 1 to 5 bp while including the nucleotide sequence of each defined SEQ ID NO: 3' end of the primer, It may be further included at the 5' end or within the nucleotide sequence, and if necessary, it may further include a label detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means at each end or specific base. can
상기 표지의 예로는, 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드일 수 있다. 상기 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 상기 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일수 있고, 상기 방사성 동위원소는 32P일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Examples of the label may be a chromogenic enzyme, a fluorescent material, a radioactive isotope, or a colloid. The chromogenic enzyme may be peroxidase, alkaline phosphatase or acid phosphatase, and the fluorescent material is thiourea (FTH), 7-acetoxycoumarin-3-yl, fluorescein-5-yl, fluorescein-6 -yl, 2',7'-dichlorofluorescin-5-yl, 2',7'-dichlorofluorescin-6-yl, dihydro tetramethylrosamine-4-yl, tetramethylrhodamine-5 -yl, tetramethylrhodamine-6-yl, 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-ethyl or 4,4- Difluoro-5,7-diphenyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-ethyl, Cy3, Cy5, poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate (FITC) , rhodamine-B-isothiocyanate (RITC), PE (Phycoerythrin) or rhodamine, and the radioactive isotope may be 32P, but is not limited thereto.
본 발명의 프라이머 세트는 등온증폭 (isothermal amplification)용으로 사용하기에 적합할 수 있다. 용어 “등온증폭(isothermal amplification)"은 하나의 온도 조건하에서 DNA를 증폭시키는 것을 의미한다. 기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 변성 (Denaturation), 어닐링 (Annealing) 및 신장 (Extension) 단계가 각각 다른 온도와 조건을 요구함에 따라 특수한 PCR 장치로 수행해야 하는 것과 달리, 등온증폭 반응은 별도의 특수한 기기가 필요하지 않은 장점을 갖는다. 일반적으로 등온 증폭 방법은 특정 온도범위 내에서 1시간 내에 목표 핵산을 10^9개까지 증폭시킬 수 있으며, 상기 온도를 유지시킬 수 있는 항온 장치만 있으면 수행할 수 있다. 또한 등온 증폭 방법은 수행 시간이 짧고 결과를 육안으로 관찰할 수 있으므로 간편하게 증폭을 확인할 수 있다.The primer set of the present invention may be suitable for use for isothermal amplification. The term “isothermal amplification” refers to amplification of DNA under a single temperature condition. Conventional polymerase chain reaction (PCR) involves denaturation, annealing, and extension steps, respectively. Unlike a special PCR device that requires different temperatures and conditions, the isothermal amplification reaction has the advantage that no special equipment is required. can be amplified up to 10^9, and can be carried out only with a constant temperature device capable of maintaining the above temperature.In addition, the isothermal amplification method has a short execution time and the result can be observed with the naked eye, so the amplification can be easily confirmed .
일 구체예에서, 상기 등온증폭은 고리매개 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification)일 수 있다. 용어 "고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)"은 외부 프라이머, 내부 프라이머, 및 반응 속도를 향상시키기 위한 추가의 루프 프라이머를 사용하여 등온에서 수행되는 증폭 방법이다. 상기 LAMP 반응에서 사용되는 프라이머 중 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 이들 내부 프라이머는 균주의 유전물질에는 포함되지 않으나 반응의 효율성을 높이기 위하여 특정 염기, 예를 들어, 일련의 티민 염기를 더 포함하도록 설계될 수 있다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LoopF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LoopB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열(고리 부위)에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다. 상기 고리매개 등온 증폭 방법은 내부 프라이머가 주형에 먼저 결합하여 신장된 후, 각 DNA 나선의 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장된다. 이때, 외부 프라이머의 신장으로 인해 가닥(strand) 변위가 발생하고, 그에 따라 먼저 합성된 가닥은 주형에서 떨어지는데, 떨어진 합성 가닥이 5' 말단에서부터 고리(loop) 구조를 형성하고, 이어서 3' 말단에도 동일한 과정으로 고리 구조가 형성되며, 이를 매개로 증폭 반응이 일어난다.In one embodiment, the isothermal amplification may be loop-mediated isothermal amplification. The term "loop-mediated isothermal amplification (LAMP)" is an amplification method performed isothermal using an outer primer, an inner primer, and an additional loop primer to enhance the reaction rate. Among the primers used in the LAMP reaction, the outer primer consists of two types of a forward outer (F3) primer and a backward outer (B3) primer, and during the non-cyclic step of the reaction, DNA double-stranded serves to release. The inner primer consists of two types: a forward inner primer (FIP) and a backward inner primer (BIP). It consists of the corresponding nucleotides. These internal primers are not included in the genetic material of the strain, but may be designed to further include a specific base, for example, a series of thymine bases in order to increase the efficiency of the reaction. The additional two types of primers consist of two types of a forward loop (LoopF) primer and a backward loop (LoopB) primer, and are attached to a nucleotide sequence (loop region) to which the inner primer does not bind to mediate the ring. Accelerates the isothermal amplification reaction. In the loop-mediated isothermal amplification method, the inner primer is first bound to the template and extended, and then the outer primer is bound to the outside of each DNA helix and extended. At this time, strand displacement occurs due to the extension of the external primer, and accordingly, the synthesized strand falls off the template, and the separated synthetic strand forms a loop structure from the 5' end, and then also at the 3' end. A ring structure is formed in the same process, and an amplification reaction takes place through this.
상기 등온증폭 반응은 50 내지 75℃, 55 내지 75℃, 60 내지 72℃, 60 내지 72℃, 또는 63 내지 68℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 등온증폭방법은 10분 내지 60분, 10분 내지 40분, 20분 내지 40분, 또는 25분 내지 35분 동안 수행될 수 있다. 상기 프라이머 세트를 사용하는 경우 Ct 값은 50 이하, 40 이하, 또는 30 이하일 수 있다. The isothermal amplification reaction may be performed at 50 to 75 °C, 55 to 75 °C, 60 to 72 °C, 60 to 72 °C, or 63 to 68 °C. In addition, the isothermal amplification method may be performed for 10 minutes to 60 minutes, 10 minutes to 40 minutes, 20 minutes to 40 minutes, or 25 minutes to 35 minutes. When the primer set is used, the Ct value may be 50 or less, 40 or less, or 30 or less.
일 구체예에서, 상기 프라이머 세트는 검출 감도가 매우 높으므로, 상기 프라이머 세트를 이용하면 25 ㎕ 반응용액을 기준으로, 100 copies 이하, 50 copies 이하, 20 copies 이하, 10 copies 이하, 5 copies 이하, 또는 1 copies 이하면서, 0.1 copies 이상, 0.01 copies 이상, 또는 0.001 copies 이상의 DNA, RNA와 같은 표적 유전자가 포함된 검체에서 클라미디아 균의 검출이 가능하다. 또한, 일반적인 등온증폭반응 조건에서 빠른 시간 내에 클라미디아 균의 검출이 가능하다. 예를 들어, 클라미디아 균를 검출하기 위해 표적 유전 물질에 결합하는 6개의 프라이머(Primer) 세트(F3, B3, FIP, BIP, LF, BF)와 Isothermal Amplification buffer, dNTPs, Bst 3.0 DNA polymerase 등이 포함된 LAMP 반응 조성물, 비색분석용 Phenol red, 실시간 형광물질분석용 SYBR™ Green I(Thermo Fisher Scientific, 미국) 등의 시약을 사용하고, 상기 프라이머 세트의 각 프라이머 0.2 내지 1.6 μM을 이용하여, 63 내지 68 ℃에서 25 분 내지 35 분 동안 등온증폭 반응하여 검출 결과를 확인할 수 있다. 상기 프라이머 세트에서 각 프라이머는 구체적으로, FIP 및 BIP 프라이머의 경우 각각 1.6 μM, F3 및 B3 프라이머의 경우 각각 0.2 μM, 및 FL 및 BL 프라이머의 경우 각각 0.4 μM로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 등온증폭 반응은 등온이라는 제한된 환경에서 빠른 시간 내에 결과를 도출하여야 하므로 프라이머의 조합 및 각 성분비는 유의한 반응 결과를 얻기 위해 중요한 요소이다. In one embodiment, since the primer set has a very high detection sensitivity, when the primer set is used, 100 copies or less, 50 copies or less, 20 copies or less, 10 copies or less, 5 copies or less, based on 25 μl reaction solution, Or it is possible to detect Chlamydia bacteria in samples containing target genes such as DNA or RNA of 1 copy or less, 0.1 copies or more, 0.01 copies or more, or 0.001 copies or more. In addition, it is possible to detect Chlamydia bacteria in a short time under general isothermal amplification reaction conditions. For example, to detect Chlamydia, a set of six primers (F3, B3, FIP, BIP, LF, BF) that binds to the target genetic material, Isothermal Amplification buffer, dNTPs, Bst 3.0 DNA polymerase, etc. are included. Using reagents such as LAMP reaction composition, Phenol red for colorimetric analysis, and SYBR™ Green I (Thermo Fisher Scientific, USA) for real-time fluorescence analysis, using 0.2 to 1.6 μM of each primer in the primer set, 63 to 68 The detection result can be confirmed by performing an isothermal amplification reaction at ℃ for 25 to 35 minutes. In the primer set, it may be preferable to use, specifically, 1.6 μM each for the FIP and BIP primers, 0.2 μM each for the F3 and B3 primers, and 0.4 μM each for the FL and BL primers. Since the isothermal amplification reaction should yield results within a short time in a limited environment called isothermal, the combination of primers and each component ratio are important factors to obtain a significant reaction result.
본 발명의 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트를 포함하는 클라미디아 균 감염병 진단용 조성물 또는 키트를 포함한다.Another embodiment of the present invention includes a composition or kit for diagnosing a chlamydia infection comprising the primer set.
상기 클라미디아 균 감염병 진단용 조성물 또는 키트는 등온증폭 반응을 수행하기 위한 적절한 반응물 및 시약을 더 포함할 수 있다. 이러한 반응물 및 시약은, 예를 들어 추가의 프라이머, dNTP, 및 효소 (DNA 중합효소 또는 역방향 전사효소)등을 포함할 수 있고, 반응의 효율을 위해 염화칼륨, 황산마그네슘, 황산암모늄과 같은 무기염류나 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 반응물 및 시약은 최종 반응액 기준 10 내지 20mM Tris-HCl, 1 내지 10mM (NH4)2SO4, 10 내지 50nM KCl, 0.1 내지 2mM MgSO4, 및 0.01 내지 0.1% Tween-20, 보다 구체적으로 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50nM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20을 포함하는 pH 7 내지 9, 바람직하게는 pH 8.8의 용액일 수 있다. 상기 반응물 또는 시약은, 40 mM 내지 50 mM 수크로오스, 0.001 내지 0.01% Triton X-100, 및 0.1w/w% 내지 0.3w/w%의 글리세롤을 더 포함할 수 있다. 상기 수크로오스 대신 트레할로스를 사용할 수 있다. 수크로오스, Triton X-100, 및 글리세롤의 조합은 클라미디아 진단용 조성물 및 키트의 보관 안정성을 높여서 반응 효율을 유지하는데 도움이 된다.The composition or kit for diagnosing Chlamydia infection may further include an appropriate reactant and reagent for performing an isothermal amplification reaction. Such reactants and reagents may include, for example, additional primers, dNTPs, and enzymes (DNA polymerase or reverse transcriptase), and for the efficiency of the reaction, inorganic salts such as potassium chloride, magnesium sulfate, and ammonium sulfate or It may further include a surfactant. In one embodiment, the reactants and reagents are 10-20 mM Tris-HCl, 1-10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 10-50 nM KCl, 0.1-2 mM MgSO 4 , and 0.01-0.1% Tween- based on the final reaction solution 20, more specifically 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 50 nM KCl, 2 mM MgSO 4 , and 0.1% Tween-20 may be a solution of pH 7 to 9, preferably pH 8.8 . The reactant or reagent may further include 40 mM to 50 mM sucrose, 0.001 to 0.01% Triton X-100, and 0.1w/w% to 0.3w/w% glycerol. Trehalose may be used instead of the sucrose. The combination of sucrose, Triton X-100, and glycerol helps to maintain reaction efficiency by increasing storage stability of the chlamydia diagnostic composition and kit.
일 구체예에서, 상기 클라미디아 균 감염병 진단용 조성물 또는 키트는 검출의 편의성 및 결과분석의 명확성을 높이고 반응 결과물을 육안으로 확인하기 위해 비색분석용 물질, 형광분석용 물질 또는 검출용 표지 화합물과 같은 시약을 더 포함할 수 있다. 그러한 시약은 통상적으로 알려지거나 상업적으로 구매 가능한 것을 사용할 수 있고, 예를 들어, WarmStart®LAMP Mix가 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 시약은 반응이 효율적으로 일어나도록 하기 위해, 상기 언급한 바와 같은 Tris-HCl, (NH4)2SO4, KCl, MgSO4, 및 Tween-20을 포함하는 것일 수 있고, DNA 중합효소, 역전사효소와 같이 증폭 반응을 수행하기 위한 효소를 더 포함할 수 있다. 비색 분석의 경우 SimpliampTM Thermal Cycler/QuantStudioTM 3을 이용할 수 있고, 형광 분석의 경우 CFX96TM을 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 그 외에 상기 클라미디아 균 감염병 진단용 조성물 또는 키트의 검출 결과를 확인 하는 방법으로서 전기영동(electrophoresis), 검출용 표지 사용한 방사성 측정 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 비색분석 시 통상적인 PCR 기기(Thermocycler)를 사용할 수 있고, 형광분석 시 분석에 사용하는 형광물질의 탐지가 가능한 Real-Time PCR 기기를 사용할 수 있다.In one embodiment, the composition or kit for diagnosing chlamydial infectious disease includes a reagent such as a material for colorimetric analysis, a material for fluorescence analysis, or a labeling compound for detection in order to increase the convenience of detection and clarity of result analysis and to visually confirm the reaction result. may include more. As such reagents, commonly known or commercially available reagents may be used, for example, but not limited to, WarmStart® LAMP Mix. Such a reagent may include Tris-HCl, (NH 4 ) 2 SO 4 , KCl, MgSO 4 , and Tween-20 as mentioned above, in order for the reaction to occur efficiently, DNA polymerase, reverse transcription It may further include an enzyme for performing an amplification reaction, such as an enzyme. For colorimetric analysis, Simpliamp TM Thermal Cycler/QuantStudio TM 3 may be used, and for fluorescence analysis, CFX96 TM may be used, but is not limited thereto. In addition, as a method of confirming the detection result of the composition or kit for diagnosing the chlamydia infection, there are electrophoresis, radioactive measurement using a detection label, etc., but is not limited thereto. For colorimetric analysis, a conventional PCR device (Thermocycler) can be used, and for fluorescence analysis, a real-time PCR device capable of detecting a fluorescence material used for analysis can be used.
상기 클라미디아 균 감염병 진단용 조성물 또는 키트는 진단 결과를 정확하게 판독하기 위해서 음성대조물질 또는 양성대조물질을 더 포함할 수 있다. 음성대조물질로는 클라미디아 균과 무관한 다른 균주의 주형 RNA 또는 DNA를 이용할 수 있고, 양성대조물질로는 클라미디아 균의 감염 환자로부터 수득된 생물학적 시료 또는 클라미디아 균의 유전체 일부에 해당하는 주형 RNA 또는 DNA를 이용할 수 있다. 이들 대조 물질은 필요에 따라 하나의 튜브에서 생물학적 시료와 함께 또는 개별적으로 유전자 증폭 반응에 적용될 수 있다. The composition or kit for diagnosing Chlamydia infection may further include a negative control material or a positive control material in order to accurately read the diagnosis result. As a negative control material, template RNA or DNA of another strain unrelated to Chlamydia can be used, and as a positive control material, a biological sample obtained from a patient infected with Chlamydia or a template RNA or DNA corresponding to a part of the genome of Chlamydia. is available. These control substances can be applied to the gene amplification reaction together with the biological sample or individually in one tube as needed.
본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트 또는 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물과 생물학적 시료를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 등온증폭 반응하여 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는, 클라미디아 균 감염병을 진단하는 방법을 제공한다. 또한 상기 클라미디아 균 감염병을 진단하는 방법은 비색분석 또는 형광분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.Another embodiment of the present invention comprises the steps of: mixing the primer set or a composition comprising the primer set and a biological sample; And it provides a method for diagnosing a chlamydia infection comprising the step of amplifying the gene by performing an isothermal amplification reaction of the mixture. In addition, the method for diagnosing the chlamydial infection may further include colorimetric analysis or fluorescence analysis.
상기 생물학적 시료는 검사 대상인 개체로부터 수득된 것으로서, 비인두 또는 구인두로부터 스왑 또는 비 세척을 통해 수득된 것, 기관지 세척 또는 흡인물, 기관 간의 흡인물 및 기관지 생검, 객담, 기관지 폐포세척액 (bronchoalveolar lavage), 침, 혈액, 소변, 대변, 땀 등을 이용할 수 있다. The biological sample is obtained from the subject to be tested, obtained through swabs or nasal lavage from the nasopharynx or oropharynx, bronchial lavage or aspirate, intertracheal aspirate and bronchial biopsy, sputum, bronchoalveolar lavage , saliva, blood, urine, feces, sweat, etc. can be used.
상기 생물학적 시료는 증폭 반응의 효율을 높이기 위해 전처리를 가할 수 있다. 전처리는 물로 10배, 50배, 100배, 200배, 또는 400배 희석하는 것일 수 있고, protenase K를 처리 후 열처리하는 것일 수 있고, 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법과 같은 통상적으로 알려진 것을 이용하거나 상업적으로 판매하는 키트를 이용해 생물학적 시료로부터 유전자를 추출하거나 일정 수준으로 정제하는 것일 수 있다. 상기 전처리는 50mM Tris-HCl (pH8.0),150mM NaCl, 5mM EDTA, 및 1% NP-40를 포함하는 lysis buffer, Brij-35 0.1% ~ 0.5w/w%, Tris-HCl 10mM ~ 300mM (pH7.0 ~ 8.0), 및 CaCl2 1mM ~ 10mM, 구체적으로 Brij-35 0.3w/w%, Tris-HCl 100 mM(pH7.5), 및 CaCl2 5mM을 포함하는 용액으로 검체 시료를 처리하는 것을 의미할 수 있고, 구체적으로 상기 용액으로 처리한 후 통상적인 방법으로 정제하여 시료로부터 유전자만 수득하는 것을 의미할 수 있다. 상기 전처리 용액의 조합은 검체로부터 유전자가 쉽게 추출되도록 하고, 본 발명의 프라이머 세트의 등온증폭 반응 효율을 증진시킬 수 있다. The biological sample may be pre-treated to increase the efficiency of the amplification reaction. Pretreatment may be a 10-fold, 50-fold, 100-fold, 200-fold, or 400-fold dilution with water, and may be a heat treatment after treatment with protenase K, anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, Genes may be extracted or purified to a certain level from a biological sample using commonly known methods such as liquid chromatography, continuous extraction, centrifugation, or gel electrophoresis, or using commercially available kits. The pretreatment is 50mM Tris-HCl (pH8.0), 150mM NaCl, 5mM EDTA, and lysis buffer containing 1% NP-40, Brij-35 0.1% ~ 0.5w / w%, Tris-HCl 10mM ~ 300mM ( pH7.0 to 8.0), and CaCl 2 1 mM to 10 mM, specifically Brij-35 0.3w/w%, Tris-HCl 100 mM (pH7.5), and CaCl 2 5 mM It may mean that, specifically, it may mean that only the gene is obtained from the sample by treatment with the solution and then purification by a conventional method. The combination of the pretreatment solution allows the gene to be easily extracted from the sample and can enhance the isothermal amplification reaction efficiency of the primer set of the present invention.
상기 클라미디아 균 감염병 진단 방법은 증폭된 유전자를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 SYBR Green I과 같은 형광 물질이나 형광표지자를 이용한 형광 측정, 페놀 레드와 같은 지시약의 색상 변화, 탁색도, 침전물 생성, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The method for diagnosing chlamydia infectious disease includes detecting the amplified gene. The detection of the amplification product can be performed by fluorescence measurement using a fluorescent substance such as SYBR Green I or a fluorescent marker, color change of an indicator such as phenol red, turbidity, precipitate generation, DNA laddering, capillary electrophoresis, DNA chip, gel electrophoresis, It may be performed through radiometric measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto.
본 발명의 키트는 각 반응 시약을 담은 용기나 시험에 사용하기 위한 도구 및 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서 등을 추가로 포함할 수 있다.The kit of the present invention may further include a container containing each reaction reagent, a tool for use in a test, and a user's guide describing optimal conditions for performing the reaction.
본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트를 포함하는 랩온페이퍼 기반의 클라미디아 감염병 진단 키트를 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a lab-on-paper-based chlamydia infectious disease diagnostic kit comprising the primer set.
또한 본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 프라이머 세트를 포함하는 랩온페이퍼 기반의 클라미디아 감염병 진단 시스템을 제공한다.Also, another embodiment of the present invention provides a lab-on-paper-based chlamydia infectious disease diagnosis system including the primer set.
또한 본 발명의 또 다른 구체예는, 상기 랩온페이퍼 기반의 클라미디아 감염병 진단 키트를 이용하는 클라미디아 감염병 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.In addition, another embodiment of the present invention provides a method for providing information for diagnosing chlamydia infectious disease using the lab-on-paper-based chlamydia infectious disease diagnosis kit.
상기 프라이머 세트를 랩온페이퍼 칩(lab-on-paper chip) 기술을 적용하면, 별도의 핵산을 정제하지 않아도 반응패드까지 이동하면서 핵산 물질이 정제되어 곧바로 증폭 반응에 적용될 수 있고, 1회의 시료를 적용하여 다수의 표적 핵산을 동시에 검출하고 관련 질병을 진단할 수 있다. 이를 실현하기 위해, 상기 랩온페이퍼 기반의 클라미디아 감염병 진단 키트 및 시스템은 시료패드(120), 버퍼패드(121), 제1연결패드(131), 개시자패드(132), 반응패드(140), 가열패드(141), 차단패드(142), 제2연결패드(150), 검출패드(160), 흡수패드(170) 및 하우징 구조물(110)을 구성요소로 포함한다.If a lab-on-paper chip technology is applied to the primer set, the nucleic acid material is purified while moving to the reaction pad without further purification of the nucleic acid and can be directly applied to the amplification reaction, and a single sample is applied. Thus, it is possible to simultaneously detect multiple target nucleic acids and diagnose related diseases. In order to realize this, the lab-on-paper-based chlamydia infectious disease diagnostic kit and system include a
구체적으로, 생물학적 시료를 수용하는 시료패드; 상기 시료패드와 분리되어 배치되고, 재수화(rehydration) 완충액을 수용하는 버퍼패드; 상기 시료패드의 상부에 배치되고, 시료패드와 반응패드를 연결하는 제1연결패드; 상기 버퍼패드의 상부에 배치되고, 버퍼패드와 반응패드를 연결하는 개시자 (opener) 패드; 상기 제1연결패드 및 개시자 패드의 하부에 배치되고, 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 본 발명의 일 구체예에 따른 클라미디아 균에 특이적인 프라이머 세트와 등온증폭반응 (LAMP)을 위한 시약을 포함하고, 등온증폭반응이 일어나는 반응패드; 상기 반응패드의 상부에 배치되고, 상기 등온증폭반응물을 운반하는 제2연결패드; 상기 제2연결패드의 하부에 배치되고, 상기 등온증폭반응물로부터 증폭된 표적 핵산을 획득하는 검출패드; 및 상기 검출패드의 측방에 배치되고, 잔류하는 시료를 흡수하는 흡수패드를 포함하고, 상기 시료패드, 개시자 패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부에 배치된 가열패드를 포함하는 클라미디아 균 감염증 진단용 구조물을 제공한다. Specifically, a sample pad for receiving a biological sample; a buffer pad disposed separately from the sample pad and accommodating a rehydration buffer; a first connection pad disposed on the sample pad and connecting the sample pad and the reaction pad; an initiator pad disposed on the buffer pad and connecting the buffer pad and the reaction pad; A primer set specific for Chlamydia according to an embodiment of the present invention, which is disposed under the first connection pad and the initiator pad, capable of specifically binding to a target nucleic acid, and a reagent for an isothermal amplification reaction (LAMP) Including, a reaction pad in which the isothermal amplification reaction occurs; a second connection pad disposed on the reaction pad and carrying the isothermal amplification reactant; a detection pad disposed under the second connection pad and configured to obtain a target nucleic acid amplified from the isothermal amplification reaction product; and an absorption pad disposed on the side of the detection pad and absorbing the remaining sample, and a heating pad disposed under the sample pad, the initiator pad, the reaction pad, and the second connection pad. A diagnostic construct is provided.
다른 구체예에서, 상기 클라미디아 균 감염증 진단용 구조물이 비색 진단법에 기반하는 경우, 상기 구조물은 생물학적 시료를 수용하는 시료패드; 상기 시료패드와 분리되어 배치되고, 재수화(rehydration) 완충액을 수용하는 버퍼패드; 상기 시료패드의 상부에 배치되고, 시료패드와 반응패드를 연결하는 제1연결패드; 상기 버퍼패드의 상부에 배치되고, 버퍼패드와 반응패드를 연결하는 개시자 (opener) 패드; 상기 제1연결패드 및 개시자패드의 하부에 배치되고, 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머와 등온증폭반응 (LAMP)을 위한 시약을 포함하고, 등온증폭반응이 일어나는 반응패드; 상기 반응패드 상부에 배치되고, 반응온도 유지 및 시료의 증발을 차단하는 차단패드; 상기 반응패드의 상부에 배치되고, 금 나노입자가 고정되어 있는 제2연결패드; 상기 제2연결패드의 하부에 배치되고, 상기 금 나노입자와 결합된 등온증폭반응물로부터 증폭된 표적 핵산을 획득하는 검출패드; 및 상기 검출패드의 측방에 배치되고, 잔류하는 시료를 흡수하는 흡수패드를 포함하고, 상기 시료패드, 개시자패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부에 배치된 가열패드를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 금 나노입자는 표면에 스트렙타비딘(streptavidin)을 포함할 수 있다.In another embodiment, when the structure for diagnosing Chlamydia infection is based on a colorimetric diagnostic method, the structure may include a sample pad for accommodating a biological sample; a buffer pad disposed separately from the sample pad and accommodating a rehydration buffer; a first connection pad disposed on the sample pad and connecting the sample pad and the reaction pad; an initiator pad disposed on the buffer pad and connecting the buffer pad and the reaction pad; a reaction pad disposed under the first connection pad and the initiator pad, comprising a primer capable of specifically binding to a target nucleic acid, and a reagent for an isothermal amplification reaction (LAMP), in which an isothermal amplification reaction occurs; a blocking pad disposed on the reaction pad and configured to maintain a reaction temperature and block evaporation of the sample; a second connection pad disposed on the reaction pad and having gold nanoparticles fixed thereon; a detection pad disposed under the second connection pad and configured to obtain a target nucleic acid amplified from the isothermal amplification reaction product bound to the gold nanoparticles; and an absorption pad disposed on a side of the detection pad to absorb a residual sample, and a heating pad disposed under the sample pad, the initiator pad, the reaction pad, and the second connection pad. In this case, the gold nanoparticles may include streptavidin on the surface.
클라미디아 균 감염증 진단용 시스템은 상기 구조물; 상기 검출패드의 상부에 배치되고, 상기 검출패드로부터 형광 이미지를 획득하고, 형광 세기를 측정하는 인식부; 및 상기 인식부로부터 측정된 형광 세기 값을 이용하여 유의성 값을 도출하고, 상기 유의성 값으로 부터, 질병, 바이러스 또는 균 감염 여부를 출력하는 출력부를 더 포함할 수 있다. 상기 시스템에 적용하려는 경우 클라미디아 균에 특이적인 프라이머 세트에서 6 개의 정방향 및 역방향 프라이머들 중 어느 하나가 형광 표지자로 표시된 것일 수 있다.A system for diagnosing a chlamydial infection includes the structure; a recognition unit disposed on the detection pad, acquiring a fluorescence image from the detection pad, and measuring fluorescence intensity; and an output unit for deriving a significance value using the fluorescence intensity value measured from the recognition unit, and outputting whether or not a disease, virus, or fungal infection is present from the significance value. In case of application to the system, any one of the six forward and reverse primers in the primer set specific for Chlamydia may be labeled with a fluorescent marker.
일 구체예에서, 상기 시료패드 및 제1연결패드와 버퍼패드 및 개시자패드; 반응패드; 제2연결패드; 검출패드; 및 흡수패드는 순차적으로 적어도 일부분 접촉되어 측방으로 배치된 것일 수 있다.In one embodiment, the sample pad, the first connection pad, the buffer pad and the initiator pad; reaction pad; a second connection pad; detection pad; And the absorbent pad may be arranged laterally in contact with at least a portion in sequence.
일 구체예에서, 상기 시료패드, 제1연결패드, 버퍼패드, 개시자패드, 반응패드, 제2연결패드, 검출패드, 및 흡수패드는 하우징 구조물로 둘러 싸인 것일 수 있다.In one embodiment, the sample pad, the first connection pad, the buffer pad, the initiator pad, the reaction pad, the second connection pad, the detection pad, and the absorption pad may be surrounded by a housing structure.
일 구체예에서, 상기 반응패드는 상부에 차단패드가 배치된 것일 수 있다.In one embodiment, the reaction pad may have a blocking pad disposed thereon.
일 구체예에서, 상기 검출패드는 복수 개의 구분된 웰을 포함하는 것일 수 있다.In one embodiment, the detection pad may include a plurality of divided wells.
일 구체예에서, 상기 시료패드에 적용된 시료는 흡수패드까지 측방으로 이동하는 것일 수 있다.In one embodiment, the sample applied to the sample pad may move laterally to the absorbent pad.
일 양상은, 상기 클라미디아 균 감염증 진단용 키트 또는 시스템의 시료패드에 생물학적 시료를 적용하고, 등온증폭반응하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 상기 증폭된 표적 핵산으로부터 형광 이미지를 획득하고, 형광 세기를 측정하는 단계; 상기 측정된 각 표적 핵산의 형광 세기 값을 이용하여 유의성 값을 결정하는 단계;및 상기 각 표적 핵산의 유의성 값으로부터 클라미디아 균 감염 여부를 출력하는, 클라미디아 균 감염증 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.In one aspect, applying a biological sample to the sample pad of the kit or system for diagnosing Chlamydia infection, amplifying the target nucleic acid by isothermal amplification; obtaining a fluorescence image from the amplified target nucleic acid and measuring fluorescence intensity; Determining a significance value using the measured fluorescence intensity value of each target nucleic acid; And outputting whether or not Chlamydia infection from the significance value of each target nucleic acid, provides an information providing method for diagnosing Chlamydia infection.
이하 각 구성요소에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, each component will be described in detail.
시료패드sample pad
시료패드(120)는 핵산 물질이 함유된 시료를 수용한다. 상기 시료는 인체로부터 분리된 것으로서 혈액, 혈청, 혈장, 침, 땀, 소변, 세포배양액, 조직현탁액 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 시료는 세포 용해 완충액(lysis buffer)과 혼합된 것일 수 있고, 필요에 따라 상기 세포 용해 완충액과 혼합 후, 원심분리, 여과, 침전 등 통상적으로 알려진 방법으로 추가 정제될 수 있다. 바람직하게는 상기 시료는 세포 용해 완충액과 혼합된 후 핵산 검출용 구조물 외에서 상기 시료패드에 적용하기 위해 정제하는 단계를 포함하지 않는다. The
상기 세포 용해용 완충액(Lysis buffer)은 Tris(트리스(히드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl)aminomethane))를 5 mM 내지 80 mM, 5mM 내지 50mM, 또는 10mM 내지 50 mM로 포함하는 것일 수 있다. Tris는 구체적으로 Tris-HCl일 수 있고, 세포 용해용 완충액에서 완충제로서 급격한 pH 변동을 줄일 수 있다. The cell lysis buffer (Lysis buffer) may be one containing Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethane) in an amount of 5 mM to 80 mM, 5 mM to 50 mM, or 10 mM to 50 mM . Tris may specifically be Tris-HCl, and as a buffer in a buffer for cell lysis, it is possible to reduce abrupt pH fluctuations.
상기 세포 용해용 완충액은 pH 8.0 내지 9.0일 수 있다. pH가 8.0 미만인 경우, 핵산 물질의 안정성이 감소되거나 이동 속도가 감소될 수 있다.The cell lysis buffer may have a pH of 8.0 to 9.0. If the pH is less than 8.0, the stability of the nucleic acid material may be reduced or the transfer rate may be reduced.
상기 세포 용해용 완충액은 염화칼륨(KCl)을 5 mM 내지 50 mM, 5mM 내지 40mM, 또는 10mM 내지 20 mM로 포함하는 것일 수 있다. 50 mM을 초과하는 고농도의 염화칼륨은 세포 용해에 도움이 되지만, 용출된 핵산 물질의 수용해도를 감소시켜 부가 완충액을 다량 가해야 하거나 반응패드까지 이동하는데 걸리는 시간을 증가시킬 수 있다. 반면 염화칼륨이 5 mM 미만인 경우 세포가 제대로 용해되지 않을 수 있다. The cell lysis buffer may contain potassium chloride (KCl) in an amount of 5 mM to 50 mM, 5 mM to 40 mM, or 10 mM to 20 mM. A high concentration of potassium chloride exceeding 50 mM is helpful for cell lysis, but may reduce the aqueous solubility of the eluted nucleic acid material, so that a large amount of addition buffer must be added or the time taken to move to the reaction pad may increase. On the other hand, if potassium chloride is less than 5 mM, cells may not be lysed properly.
상기 세포 용해용 완충액은 황산마그네슘(MgSO4)을 1 mM 내지 30 mM, 1mM 내지 20mM, 또는 2mM 내지 16 mM 로 포함하는 것일 수 있다. 황산마그네슘을 적정량 포함하는 경우 핵산 물질의 안정성과 이동 속도가 증가하는 것으로 확인되었고, 점도에 영향을 미치지 않기 때문에 유체의 흐름을 방해하지 않아 페이퍼 칩 분석용으로 시료를 전처리하는데 유리하다. The cell lysis buffer may contain magnesium sulfate (MgSO 4 ) in an amount of 1 mM to 30 mM, 1 mM to 20 mM, or 2 mM to 16 mM. When magnesium sulfate is included in an appropriate amount, it has been confirmed that the stability and movement speed of the nucleic acid material increase, and since it does not affect the viscosity, it does not interfere with the flow of the fluid, which is advantageous for pre-treatment of samples for paper chip analysis.
상기 세포 용해용 완충액은 황산암모늄((NH4)2SO4)을 5 mM 내지 50 mM, 5mM 내지 40mM, 또는 10mM 내지 20 mM로 포함하는 것일 수 있다. 50 mM을 초과하는 고농도의 황산암모늄은 세포 용해물을 침전시킬 수 있고, 황산암모늄이 5mM 미만인 경우 pH가 불안정해질 수 있다.The cell lysis buffer may contain ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) in an amount of 5 mM to 50 mM, 5 mM to 40 mM, or 10 mM to 20 mM. A high concentration of ammonium sulfate exceeding 50 mM may precipitate cell lysates, and pH may become unstable when ammonium sulfate is less than 5 mM.
상기 세포 용해용 완충액은 단백질분해효소를 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, 또는 0.03 mg/ml 내지 0.07 mg/ml을 포함하는 것일 수 있다. 단백질분해효소는 고분자 단백질을 분해하여 핵산이 이동 경로인 기판이나 페이퍼의 기공을 고분자 단백질이 차단하지 않도록 하고, RNase 및 DNase 활성을 억제하여 핵산 물질의 안정성을 증가시킨다. 상기 단백질분해효소는 프로테이나아제 K(proteinase K)일 수 있다. The cell lysis buffer may be one containing a protease from 0.01 mg/ml to 0.1 mg/ml, or from 0.03 mg/ml to 0.07 mg/ml. The protease decomposes the high molecular protein so that the high molecular protein does not block the pores of the substrate or paper through which the nucleic acid moves, and increases the stability of the nucleic acid material by inhibiting the RNase and DNase activity. The protease may be proteinase K (proteinase K).
상기 계면활성제는 TritonX-100 또는 Tween20 (폴리소르베이트20)일 수 있고, 세포 용해용 완충액 중량을 기준으로 0.01w/w% 내지 0.2w/w%, 바람직하게는 0.05w/w% 내지 0.1w/w%로 포함될 수 있다.The surfactant may be TritonX-100 or Tween20 (polysorbate 20), 0.01w/w% to 0.2w/w%, preferably 0.05w/w% to 0.1w based on the weight of the buffer for cell lysis It can be included as /w%.
상기 세포 용해용 완충액은 시료의 부피 대비 1:1로 사용되는 것일 수 있다.The cell lysis buffer may be used in a 1:1 ratio to the volume of the sample.
상기 세포 용해용 완충액은 글리세롤을 포함하지 않는 것일 수 있다. 글리세롤은 단백질의 침전을 막기 위해 첨가되기도 하나, 글리세롤은 점도를 증가시켜 세포 용해물의 유동성을 감소시키고, 핵산 물질의 이동에 방해가 될 수 있다.The cell lysis buffer may not contain glycerol. Glycerol is sometimes added to prevent protein precipitation, but glycerol increases viscosity to decrease fluidity of cell lysates, and may interfere with the movement of nucleic acid substances.
상기 세포 용해용 완충액은 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다. 환원제는 디티오트레이톨(DTT), 머캅토에탄올 등으로서 단백질을 변성시키고 세포 용해물의 수용해도를 높이는데 도움이 되지만, 페이퍼 칩에 흘러 들어가는 용액 내 존재하는 경우 형광 발광 또는 검출 반응에 방해가 될 수 있다. The cell lysis buffer may not contain a reducing agent. Reducing agents, such as dithiothreitol (DTT) and mercaptoethanol, help to denaturate proteins and increase the aqueous solubility of cell lysates, but when present in the solution flowing into the paper chip, they do not interfere with fluorescence or detection reaction. can be
상기 시료패드의 하부에 배치되고 상기 시료패드를 가열하기 위한 가열패드(141)를 포함한다. 세포 용해용 완충액에 의한 시료의 용해를 효율적으로 하기 위해 가열패드를 60 내지 80℃의 온도에서 1 분 내지 5분 간, 바람직하게는 5 분 간 가열 처리해줌으로써 시료패드에서 바이러스, 균주 또는 세포 등의 포함하는 시료의 용해를 촉진한다.and a
상기 세포 용해용 조성물을 적용하면 폴리설폰 막 (예를 들어, Vivid GF) 또는 니트로셀룰로오스 막으로 이루어진 시료패드(120)에서 세포의 용해를 촉진하고, 핵산을 보다 쉽게 검출할 수 있도록 한다. 상기 폴리설폰 막 및 니트로셀룰로오스 막은 2개 이상이 적층된 구조를 이루는 것일 수 있다. 상기 폴리설폰 막은 비 대칭적인 것일 수 있고, 폴리설폰 막 및 니트로셀룰로오스 막은 0.5 ㎛ 내지 1 ㎛의 기공을 갖는 다공성 재질인 것일 수 있다. 상기 기공은 다소 큰 편인 것이 유리한데, 생물학적 시료는 점도를 갖는 것이 많고, 특히 시료에 세포 용해용 조성물을 처리하게 되면 핵산 물질과 단백질이 세포 밖으로 용출되면서 점도가 현저히 올라갈 수 있다. 따라서 시료패드의 기공 사이즈는 시료를 신속하게 흡수하기에 적절한 크기를 갖는 것이 바람직하다.When the composition for cell lysis is applied, cell lysis is promoted in the
상기 세포 용해용 완충액을 이용함으로써 측방 유동식 (lateral flow)으로 핵산을 보다 쉽게 검출할 수 있다. 용어 “측방 유동식”이란 중력을 이용하지 않고, 수평 방향으로 모세관 현상이나 확산 현상에 의해 시료를 적용한 지점으로부터 목표 지점까지 흐르도록 하는 방식을 의미한다. 세포 용해물에는 핵산 물질을 분해할 수 있는 가수분해 효소들이 다량 함유되어 있으므로, 이동 경로에 오래 머무는 경우 핵산 물질의 수득량이 감소할 수 있다. 따라서 측방 유동식 핵산 검출용 구조물에 적용하려면, 흐름도가 우수해야 하고, 시료가 이동하는 동안 세포 용해물이 침전되어 이동 경로를 차단하지 않아야 한다. 또한, 핵산 물질과 염을 형성하여 침전이나 이동속도를 저하시키지 않아야 한다. 본 발명의 세포 용해용 완충액의 조성은 글리세롤 또는 환원제를 포함하지 않아도 세포 용해물이나 핵산 물질이 침전되지 않고, 높은 수율로 핵산 물질을 반응 패드까지 측방으로 이동시킬 수 있다.By using the cell lysis buffer, nucleic acids can be more easily detected in a lateral flow manner. The term “lateral flow type” refers to a method in which a sample flows from an applied point to a target point by capillary or diffusion in the horizontal direction without using gravity. Since the cell lysate contains a large amount of hydrolytic enzymes capable of degrading the nucleic acid material, the yield of the nucleic acid material may decrease if it stays in the migration path for a long time. Therefore, in order to be applied to a lateral flow nucleic acid detection construct, the flow chart should be excellent and the cell lysate should not be precipitated to block the migration path while the sample is moving. In addition, it should not form a salt with a nucleic acid material to decrease precipitation or movement speed. The composition of the cell lysis buffer of the present invention does not include glycerol or a reducing agent, but does not precipitate cell lysate or nucleic acid material, and can move nucleic acid material laterally to the reaction pad in a high yield.
제1연결패드first connection pad
제1연결패드(131)는 시료패드와 일부분 접촉하여 시료패드의 상부에 배치되고, 시료패드에 비해 상대적으로 폭이 좁은 구조물로 시료패드와 반응패드를 연결한다.The
제1연결패드는 셀룰로오스 막으로 이루어진 재질로서, 0.005 ㎛ 내지 0.015 ㎛의 기공을 갖는 것일 수 있다.The first connection pad is a material made of a cellulose film, and may have pores of 0.005 μm to 0.015 μm.
버퍼패드buffer pad
버퍼패드(121)는 재수화 완충액을 적가하는 패드로서, 구조물에 수압을 가하는 역할을 한다. 버퍼패드는 단백질과 같은 세포 용해 잔해물의 반응패드로의 이동을 최소화하고 반응 완료 후 수압을 가하여 등온증폭반응물 만의 검출패드로의 이동을 유도하기 위해 시료패드와 분리되어 배치될 수 있다.The
버퍼패드에 적용되는 재수화 완충액은 부가 완충액으로서, 예를 들어 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl, 20 mM 내지 70 mM 염화칼륨, 0.5 mM 내지 5 mM 황산마그네슘, 1 mM 내지 30 mM 황산암모늄, 및 0.01w/w% 내지 0.2 w/w% Tween® 20 내지 TritonX-100을 포함하고 산도가 pH 8.0 내지 9.0인 등온완충액 또는 인산 완충액 (50mM Na2HPO4, pH 7.2)일 수 있다. 상기 등온완충액은 보다 구체적으로 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 및 0.1% Tween® 20을 포함하고, 산도는 pH 8.8일 수 있다. 상기 부가 완충액은 단백질분해효소, 글리세롤, 또는 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다.The rehydration buffer applied to the buffer pad is an addition buffer, for example, 5 mM to 80 mM Tris-HCl, 20 mM to 70 mM potassium chloride, 0.5 mM to 5 mM magnesium sulfate, 1 mM to 30 mM ammonium sulfate, and 0.01 It may be an isothermal buffer or phosphate buffer (50 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2) containing w/w% to 0.2 w/w% Tween® 20 to TritonX-100 and having an acidity of pH 8.0 to 9.0. The isothermal buffer may more specifically include 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 50 mM KCl, 2 mM MgSO 4 , and 0.1% Tween® 20, and the acidity may be pH 8.8. The addition buffer may not contain a protease, glycerol, or a reducing agent.
상기 버퍼패드는 재수화 완충액을 충분히 수령할 수 있도록 0.5 ㎛ 내지 1 ㎛의 기공을 갖는 다공성 재질로서, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물일 수 있다.The buffer pad is a porous material having pores of 0.5 μm to 1 μm to sufficiently receive the rehydration buffer, and includes cotton, wool, paper, nitrocellulose, cellulose acetate, glass fiber, polysulfone, polyacrylic, polynitrile, polypiperazine, polyamide, polyethersulfone, polyvinylidenefluoride, polyethyleneimine, polydimethylsiloxane or mixtures thereof.
개시자 (opener) 패드initiator pad
개시자 패드(132)는 버퍼패드와 일부분 접촉하여 버퍼패드의 상부에 배치되고, 버퍼패드에 비해 상대적으로 폭이 좁은 구조물로 버퍼패드와 반응패드를 연결한다.The
개시자 패드는 셀룰로오스 막으로 이루어진 재질로서, 0.005 ㎛ 내지 0.015 ㎛의 기공을 갖는 것일 수 있다. 개시자 패드에서 버퍼패드 또는 반응패드와 접촉하는 부분은 저융점 아가로오스 또는 왁스로 코팅된 것일 수 있다. 상기 코팅은 버퍼패드로의 역흐름을 차단하여 측방 유동성을 가속화시킬 수 있다.The initiator pad is a material made of a cellulose film, and may have pores of 0.005 μm to 0.015 μm. A portion of the initiator pad in contact with the buffer pad or the reaction pad may be coated with low melting point agarose or wax. The coating can accelerate lateral flow by blocking back flow to the buffer pad.
상기 개시자 패드 하부에는 가열을 위한 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 등온증폭이 끝나는 시점에 개시자 패드를 가열하면서 버퍼패드에 부가 완충액을 가하면, 개시자 패드의 저융점 아가로오스 또는 왁스가 녹으면서 반응패드로 수압이 발생하여 등온증폭된 결과물이 검출 패드로 쉽게 이동하도록 한다. 상기 가열은 60 내지 80℃로 수행되는 것일 수 있다.A
반응패드reaction pad
반응패드는 랩온페이퍼에서 페이퍼 칩에 해당하는 구성요소로서, 증폭반응을 위한 dNTP, DNA 중합효소, 역전사 효소, 형광 표지자, 등온증폭반응 버퍼 등을 포함한 등온증폭반응 시약이 고정되어 있다. 따라서 시료패드에 적용되는 부가 완충액에 의해 반응패드에 핵산 물질을 포함하는 용액이 스며들어 적셔지고, 상기 등온증폭반응 시약과 시료의 접촉물이 반응패드로 이동하여 반응패드 하부에서 가열패드에 의해 온도를 60 내지 70℃로 가열하면 등온증폭반응 또는 역전사 등온증폭반응이 일어난다.The reaction pad is a component corresponding to the paper chip in the lab-on-paper, and isothermal amplification reagent including dNTP, DNA polymerase, reverse transcriptase, fluorescent marker, isothermal amplification reaction buffer, etc. for the amplification reaction is fixed. Therefore, the solution containing the nucleic acid material is soaked into the reaction pad by the addition buffer applied to the sample pad, and the contact material between the isothermal amplification reagent and the sample moves to the reaction pad and is heated by the heating pad under the reaction pad. When heated to 60 to 70 ℃ isothermal amplification reaction or reverse transcription isothermal amplification reaction occurs.
상기 등온증폭반응 시약은 구체적으로 dNTP, 등온증폭버퍼, 및 역전사/DNA/RNA 중합효소 등을 포함할 수 있고, 이들은 반응패드 내에 혼합 후 건조하거나, 파우더 타입으로 반응패드 표면에 도포하여 예를 들어, 약 40℃ 오븐에서 약 30분 간 가열하여 고정시킨 것일 수 있다.The isothermal amplification reaction reagent may specifically include dNTP, isothermal amplification buffer, and reverse transcription / DNA / RNA polymerase, etc., which are mixed in the reaction pad and dried, or applied to the surface of the reaction pad in a powder type, for example , may be fixed by heating in an oven at about 40 ° C for about 30 minutes.
반응패드(140)는 제1연결패드 및 개시자 패드와 일부분 접촉하여, 제1연결패드와 개시자 패드의 하부 및 측방으로 배치될 수 있다. 등온증폭반응이 일어날 수 있는 온도로 가열하기 위해 상기 반응패드(140) 하부에는 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 상기 가열패드는 가열을 위한 열선 또는 열판을 포함할 수 있다. 반응패드에서 반응 온도 및 시간은 프라이머 세트의 증폭 효율에 따라 조절될 수 있다.The
상기 반응패드는 등온증폭반응의 효율을 증가시키기 위해 반응패드 상부에 차단패드(142)가 배치되어 차단 역할을 할 수 있다. 일련의 배치된 패드를 라미네이트 처리된 차단패드에 의해 등온증폭반응 온도를 유지하고, 시약의 증발을 차단하여 반응의 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 차단 패드는 비공성의 막 또는 외부 공기로부터 반응패드를 차단할 수 있는 구조물일 수 있다.In the reaction pad, a
상기 반응패드에는 복수 개의 웰이 존재하고, 각 웰에는 등온증폭반응을 위한 프라이머 세트로서 반응 패드에 웰이 존재함으로써 등온증폭반응이 보다 집중적으로 일어날 수 있다. 상기 웰은 구체적으로 바닥에 히드로겔 층이 형성되어 있고, 상기 프라이머 세트가 히드로겔 층에 고정된 형태일 수 있다. 특정 표적 핵산의 집중적인 증폭을 위해, 각 웰에는 서로 다른 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트가 고정될 수 있다.A plurality of wells exist in the reaction pad, and wells exist in the reaction pad as a primer set for the isothermal amplification reaction in each well, so that the isothermal amplification reaction can occur more intensively. Specifically, the well may have a hydrogel layer formed at the bottom, and the primer set may be fixed to the hydrogel layer. For intensive amplification of a specific target nucleic acid, a set of primers specifically binding to different target nucleic acids may be immobilized in each well.
상기 프라이머를 함유하는 히드로겔 층은 예를 들어 하기와 같은 방법으로 형성될 수 있다. 히드로겔 용액 총 부피를 기준으로 UV-광가교성 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA, Sigma-Aldrich, MW700) 20% v/v, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, Sigma-Aldrich, MW600) 40% v/v 및 광개시제 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 (Sigma-Aldrich) 5% v/v 및 버퍼(PBS 완충액, pH7.5) 35%를 혼합하고, 여기에 프라이머 세트를 혼합하여 하이드로겔 용액을 제조한다. 상기 폴리(에틸렌 글리콜)은 히드로겔 미세입자의 공극율을 증가시키기 위하여 포함되는 것이 바람직하다. 그런 다음, 상기 히드로겔 용액을 반응 패드의 각 웰 내부 표면에 도포하고, 1분간 UV 노출(360 nm wavelength, 35 mJ/cm2)하여 히드로겔 코팅층을 형성한다. 히드로겔 층은 공극을 가지므로 히드로겔 층 내 프라이머에 결합하여 공극 내에서 집중적으로 증폭반응이 일어날 수 있다.The hydrogel layer containing the primer may be formed, for example, by the following method. UV-photocrosslinkable poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA, Sigma-Aldrich, MW700) 20% v/v, poly(ethylene glycol) (PEG, Sigma-Aldrich, MW600) 40 by total volume of hydrogel solution % v/v and photoinitiator 2-hydroxy-2-methylpropiophenone (Sigma-Aldrich) 5% v/v and buffer (PBS buffer, pH7.5) 35%, mixed with a primer set Prepare a hydrogel solution. The poly(ethylene glycol) is preferably included in order to increase the porosity of the hydrogel microparticles. Then, the hydrogel solution is applied to the inner surface of each well of the reaction pad, and UV exposure (360 nm wavelength, 35 mJ/cm 2 ) for 1 minute to form a hydrogel coating layer. Since the hydrogel layer has pores, it binds to the primers in the hydrogel layer and the amplification reaction can occur intensively within the pores.
상기 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머들 중 어느 하나는 Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, BHQ, Iowa Black RQ, 및 IRDye로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 검출자로 표지된 것일 수 있다. 상기 검출자는 형광 표지자로 역할할 수 있고, 표적 핵산을 독립적으로 검출하기 위해, 표적 핵산 마다 다르게 표지 될 수 있다. Any one of the forward and reverse primers in the primer set is Cy3, Cy5, TAMRA, TEX, TYE, HEX, FAM, TET, JOE, MAX, ROX, VIC, Cy3.5, Texas Red, Cy5.5, TYE, It may be labeled with one or more detectors selected from the group consisting of BHQ, Iowa Black RQ, and IRDye. The detector may serve as a fluorescent marker, and in order to independently detect the target nucleic acid, it may be labeled differently for each target nucleic acid.
상기 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머 중 나머지 어느 하나는 비오틴이 결합된 것일 수 있다. 상기 진단용 구조물이 형광분석법에 기반한 경우, 비오틴은 검출부 표면에 고정된 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합할 수 있으므로, 최종적으로 검출 패드에서 스트렙타비딘과 결합하고 포획되면 형광 검출 결과를 가시화한다. 비오틴은 증폭된 표적 핵산에서 형광 표지자와 서로 반대 위치에 존재하도록 설계될 수 있고, 예를 들어, 정방향 프라이머의 5' 말단에 형광 표지자를 결합시킨 경우, 역방향 프라이머의 5' 말단에 비오틴을 결합시킬 수 있다.In the primer set, any one of the forward and reverse primers may be biotin-bound. When the diagnostic construct is based on fluorescence analysis, biotin can bind to streptavidin immobilized on the surface of the detection unit, and thus finally binds to streptavidin on the detection pad and captures, then the fluorescence detection result is visualized. Biotin may be designed to exist at positions opposite to the fluorescent marker in the amplified target nucleic acid. For example, when the fluorescent marker is bound to the 5' end of the forward primer, biotin may be bound to the 5' end of the reverse primer. can
상기 진단용 구조물이 비색진단법에 기반한 경우, 상기 프라이머 세트에서 정방향 및 역방향 프라이머 중 나머지 어느 하나에 결합된 비오틴이 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합할 수 있으므로, 증폭된 표적 핵산에 결합된 형태로 존재하여 제2연결패드를 통과하면서, 금 입자의 표면에 스트렙타비딘과 결합하고 검출패드에서 포획되면 검출 결과가 가시화되도록 한다. When the diagnostic construct is based on colorimetric diagnostics, biotin bound to the other of the forward and reverse primers in the primer set can bind to streptavidin, so it exists in a form bound to the amplified target nucleic acid. As it passes through the second connection pad, it binds to streptavidin on the surface of the gold particle and is captured by the detection pad, so that the detection result is visualized.
상기 반응패드는 시료 및 부가완충액의 흐름은 자유롭도록 하면서 핵산이 머물면서 충분히 등온증폭반응할 수 있도록, 0.001㎛ 내지 0.005㎛, 바람직하게는, 0.005㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다. The reaction pad may have a pore size of 0.001 μm to 0.005 μm, preferably 0.005 μm, so that the nucleic acid can sufficiently react while allowing the flow of the sample and the addition buffer to be free.
상기 반응패드는 셀룰로오스아세테이트 막의 재질로 이루어진 것으로서, 시료 및 부가완충액의 흐름은 자유롭도록 하면서 핵산이 머물면서 충분히 등온증폭반응할 수 있도록, 0.001㎛ 내지 0.005㎛, 바람직하게는, 0.005㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.The reaction pad is made of a material of a cellulose acetate membrane, and has a pore size of 0.001 μm to 0.005 μm, preferably, 0.005 μm so that the nucleic acid can sufficiently react while allowing the flow of the sample and the addition buffer to be free. may have
상기 반응패드는 40 mM 내지 50 mM 수크로오스, 0.001 내지 0.01% Triton X-100, 및 0.1w/w% 내지 0.3w/w%의 글리세롤을 포함할 수 있다. 상기 수크로오스 대신 트레할로스를 사용할 수 있다. 이는 수분 또는 산소에 등온증폭반응 시약 및 프라이머세트 등이 노출되었을 때, 이들의 보관 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기 보관 안정성이란 25℃ 내지 30℃에서 분해물이나 부산물 없이 3 주 이상 보관할 수 있는 것을 의미할 수 있다.The reaction pad may contain 40 mM to 50 mM sucrose, 0.001 to 0.01% Triton X-100, and 0.1w/w% to 0.3w/w% glycerol. Instead of the sucrose, trehalose may be used. This can increase the storage stability of the isothermal amplification reagent and primer set when exposed to moisture or oxygen. The storage stability may mean that it can be stored for 3 weeks or more without decomposition or by-products at 25°C to 30°C.
제2연결패드second connection pad
제2연결패드(150)는 반응패드와 일부분 접촉하여 검출패드의 상부 및 측방으로 배치될 수 있다. 제2연결패드(150)는 반응패드에서 증폭된 핵산을 검출패드로 이동시킨다. 제2연결패드는 증폭된 핵산이 쉽게 검출패드로 이동할 수 있도록, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물인 다공성 재질로서, 0.01㎛ 내지 0.05㎛, 바람직하게는, 0.05㎛의 기공 사이즈를 갖는 다공성 재질일 수 있다.The
상기 진단용 구조물이 비색진단법에 기반한 경우, 제2연결패드(150)는 반응패드와 일부분 접촉하여 반응패드의 상부 및 측방으로 배치될 수 있다. 제2연결패드(150)는 금 나노입자를 포함하고, 상기 금 나노입자는 반응패드에서 증폭된 핵산과 결합하여 검출패드로 이동된다. 금 나노입자는 바람직하게는 표면에 스트렙타비딘이 고정된 것일 수 있다.When the diagnostic structure is based on a colorimetric diagnostic method, the
연결패드는 반응패드의 상부에 배치되고, 반응패드나 검출패드에 비해 상대적으로 폭이 좁은 구조물로 반응패드와 검출패드를 연결한다.The connection pad is disposed on the reaction pad and connects the reaction pad and the detection pad with a structure having a relatively narrow width compared to the reaction pad or the detection pad.
제2연결패드는 셀룰로오스 재질을 갖는 것을 수 있고, 반응패드와 접촉하는 부분의 제2연결패드는 저융점 아가로오스 또는 왁스로 코팅된 것일 수 있다. 패드를 코팅하면 반응패드의 등온증폭반응물의 이동이 차단되었다가, 제2연결패드를 가열하는 시점에서 코팅이 녹아 등온증폭반응물이 측방으로 다시 이동하여 시료 내 미반응 유전물질의 소실을 막을 수 있다.The second connection pad may be made of a cellulose material, and the second connection pad at a portion in contact with the reaction pad may be coated with low melting point agarose or wax. When the pad is coated, the movement of the isothermal amplification reactant of the reaction pad is blocked, but when the second connection pad is heated, the coating melts and the isothermal amplification reactant moves laterally again, thereby preventing the loss of unreacted dielectric material in the sample. .
상기 제2연결패드 하부에는 가열을 위한 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 등온증폭이 끝나는 시점에 부가 완충액을 가하면, 반응패드로부터 등온증폭된 결과물이 검출 패드로 쉽게 이동하도록 한다. 상기 가열은 60 내지 80℃로 1 분 내지 5 분간, 바람직하게는 2 분 간 수행되는 것일 수 있다.A
검출패드detection pad
검출패드(160)는 제2연결패드와 일부분 접촉하여, 제2연결패드의 하부 및 측방에 배치될 수 있다. 검출패드(160)에는 검출자와 결합할 수 있는 수용체가 고정되어 있다. 상기 수용체는 검출자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 단백질, 또는 이의 절편일 수 있다.The
상기 검출패드는 복수 개의 검출 구역을 포함하고, 상기 검출 구역은 선 또는 웰의 형태로 구분될 수 있다. 각 검출 구역 마다 각 수용체가 독립적으로 고정되고, 예를 들어, 폴리에틸렌프탈레이트 성분의 잉크로 스탬핑하여 검출 구역을 만든 후, 여기에 수용체를 포함하는 잉크로 다시 스탬핑 하거나 웰의 경우 수용체를 포함하는 용액을 적용하고, EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide) 또는 NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)를 적용할 수 있다. 하나의 반응패드에는 수십개 내지 수백개 이상의 검출 구역이 형성되어, 1회의 시료를 적용하여 형성된 검출 구역의 수 만큼의 표적 핵산을 검출할 수 있다. 도 5는 반응패드에 형성된 검출 구역의 구조를 상세히 설명하기 위한 것이고, 개수를 한정하는 의미는 아니다.The detection pad may include a plurality of detection zones, and the detection zones may be divided into lines or wells. In each detection zone, each receptor is independently fixed, for example, by stamping with an ink of polyethylene phthalate component to make a detection zone, and then stamping again with ink containing the receptor or, in the case of a well, a solution containing the receptor EDC (1-Ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide) or NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) can be applied. Dozens to hundreds of detection zones are formed in one reaction pad, and target nucleic acids as many as the number of detection zones formed by applying a single sample can be detected. 5 is for explaining in detail the structure of the detection zone formed on the reaction pad, and is not meant to limit the number.
상기 검출패드는 니트로셀룰로오스로서, 시료가 흡수패드까지 측방으로 이동할 수 있도록, 0.001㎛ 내지 0.005㎛, 바람직하게는, 0.005㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다. The detection pad is nitrocellulose, and may have a pore size of 0.001 μm to 0.005 μm, preferably 0.005 μm, so that the sample can move laterally to the absorption pad.
가열패드heating pad
상기 시료패드, 개시자패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부에는 가열패드(141)가 배치될 수 있다. 상기 가열패드는 열전도성을 갖는 금속판으로서, 철, 스테인리스, 알루미늄, 은, 구리 등의 재질로 이루어진 것일 수 있다. 상기 가열패드는 열선으로 연결될 수 있고, 각 열선은 상기 시료패드, 반응패드, 개시자패드 및 제2연결패드 하부의 가열패드에 독립적으로 연결되어 가열이 되는 패드를 제어할 수 있다.A
상기 시료패드, 제1연결패드, 개시자패드, 반응패드, 제2연결패드, 검출패드, 및 흡수패드는 시료나 완충액이 소실되지 않도록 하단에 하우징(110)가 존재할 수 있고, 전체 구조물은 지지체 또는 비공성 재질의 케이스로 둘러싸인 것일 수 있다.The sample pad, the first connection pad, the initiator pad, the reaction pad, the second connection pad, the detection pad, and the absorption pad may have a
흡수패드는 상기 시료와 완충액 등을 흡수하여 역흐름을 차단하고 측방 유동성이 유발될 수 있도록 기여한다. 흡수패드는 다공성 재질로서, 면, 융, 종이, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 유리섬유, 폴리설폰, 폴리아크릴, 폴리니트릴, 폴리피페라진, 폴리아미드, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴플로리드, 폴리에틸렌이민, 폴리디메틸실록산 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 흡수패드는 바람직하게는 유리섬유로서 0.1 내지 0.5㎛의 기공 사이즈를 갖는 것일 수 있다.The absorbent pad absorbs the sample and buffer, thereby blocking the reverse flow and contributing to induce lateral fluidity. The absorbent pad is a porous material. Cotton, wool, paper, nitrocellulose, cellulose acetate, glass fiber, polysulfone, polyacrylic, polynitrile, polypiperazine, polyamide, polyethersulfone, polyvinylidene fluoride, polyethyleneimine , polydimethylsiloxane, or a mixture thereof. The absorbent pad is preferably glass fiber and may have a pore size of 0.1 to 0.5 μm.
상기 시료패드 및 제1연결패드와 버퍼패드 및 개시자패드; 반응패드; 제2연결패드; 검출패드; 및 흡수패드는 순차적으로 서로 일부분 접촉되어 측방으로 배치된다. 구체적으로, 시료패드 및 제1연결패드와 버퍼패드 및 개시자패드는 반응패드를 기준으로 분리되어 반응패드의 일 측면에 배치되고, 반응패드의 다른 측면에 이어서 제2연결패드, 검출패드, 및 흡수패드가 순차적으로 배치된다. the sample pad, the first connection pad, the buffer pad, and the initiator pad; reaction pad; a second connection pad; detection pad; and the absorbent pad are sequentially disposed laterally in partial contact with each other. Specifically, the sample pad, the first connection pad, the buffer pad, and the initiator pad are separated from the reaction pad and disposed on one side of the reaction pad, and the second connection pad, the detection pad, and Absorbent pads are sequentially disposed.
시료가 흡수패드까지 도달하는 동안 핵산 물질 외에 세포 용해물을 여과하여 핵산 물질을 정제할 수 있고, 시료의 이동 방향이 지면과 평행한 방향인 측방 유동성을 실현할 수 있다. 세포 내에서 핵산은 히스톤, 중합효소, 핵산분해효소, 전사인자 등의 단백질이 결합된 형태로 존재한다. 세포 용해 조성물과 같은 계면활성제에 의해 많은 단백질이 핵산과의 결합을 소실하게 되나, 세포 용해물이 반응패드까지 이동할 수 있도록 추가로 가해지는 증류수 또는 부가 완충액에 의해 반응패드에 도달할 쯤에는 계면활성제가 희석되어 외부 환경이 단백질의 전하를 다시 회복할 있게 된다. 이 경우 단백질은 다시 핵산 물질과 결합하여 중합효소와의 접촉 면적을 축소시키거나 증폭 반응을 방해할 수 있다. 따라서 반응패드에는 핵산과 결합할 수 있는 대부분의 세포 구성 요소가 정제되어 제거되는 것이 바람직하다.While the sample reaches the absorption pad, the nucleic acid material can be purified by filtering the cell lysate in addition to the nucleic acid material, and the lateral fluidity of the sample moving in a direction parallel to the ground can be realized. In cells, nucleic acids exist in the form of binding proteins such as histones, polymerases, nucleases, and transcription factors. Many proteins lose their binding to nucleic acids by a surfactant such as a cell lysis composition, but by the time they reach the reaction pad by distilled water or additional buffer added so that the cell lysate can move to the reaction pad, the surfactant is diluted so that the external environment can restore the protein's charge. In this case, the protein may bind to the nucleic acid material again to reduce the contact area with the polymerase or interfere with the amplification reaction. Therefore, it is preferable that most of the cell components capable of binding to nucleic acids are purified and removed from the reaction pad.
인식부recognition unit
인식부(200)는 검출패드로부터 형광 이미지를 획득하고, 획득한 형광 이미지로부터 형광 세기를 측정한다. 형광 세기는 측정 가능한 최대 값을 기준으로 실제 측정된 값의 비율로 산출할 수 있고, 복수 개의 형광 표지자를 여기하고 형광 이미지를 인식하기 위해, 다양한 파장대, 예를 들어 400 내지 700 λ 파장대의 광원과 각 여기 광의 선택적인 획득을 위한 필터를 포함할 수 있다. 인식부는 반응패드에 형성된 복수 개의 검출 구역을 독립적으로 인식하여 각 검출 구역의 형광 세기를 산출하고, "해당 검출 구역에서 측정된 형광 세기 값과 음성대조군의 형광 세기 값의 차이"를 출력부로 전송한다.The recognition unit 200 acquires a fluorescence image from the detection pad and measures fluorescence intensity from the acquired fluorescence image. The fluorescence intensity may be calculated as a ratio of an actual measured value based on a maximum measurable value, and in order to excite a plurality of fluorescent markers and recognize a fluorescence image, a light source in various wavelength bands, for example, 400 to 700 λ wavelength band, and It may include a filter for selective acquisition of each excitation light. The recognition unit independently recognizes a plurality of detection zones formed on the reaction pad, calculates the fluorescence intensity of each detection zone, and transmits "the difference between the fluorescence intensity value measured in the corresponding detection zone and the fluorescence intensity value of the negative control group" to the output part .
출력부output
출력부(210)는 인식부(200)로부터 전송된 형광 세기 값 차이를 이용하여 유의성 값을 도출한다. 유의성 값은 상기 인식부에서 측정 가능한 최대 값을 1로 설정하고, 형광 세기 값 차이가 0.3 이상인 경우 상기 유의성 값은 "70% 이상의 확률의 해당 검출 구역의 표적 핵산에 대해 양성"으로 출력하고, 형광 세기 값 차이가 0.5 이상인 경우 상기 유의성 값은 "해당 검출 구역의 표적 핵산에 대해 90% 이상의 확률의 양성"으로 출력할 수 있다. 상기 출력부는 질병, 바이러스 또는 균 감염과 관련된 유전자 정보를 포함하는 빅 데이터에 기반하여, 상기 도출된 유의성 값을 이용해 양성으로 출력된 표적 핵산과 관련된 질병, 바이러스 또는 균 감염 증상을 찾아내고, 최종적으로 시료가 획득된 개체의 질병, 바이러스 또는 균 감염 여부를 진단할 수 있도록 한다. 형광 세기 값 차이가 0.3 미만인 경우 상기 유의성 값은 "음성"으로 출력할 수 있다.The output unit 210 derives a significance value by using the difference in the fluorescence intensity values transmitted from the recognition unit 200 . As for the significance value, the maximum measurable value in the recognition unit is set to 1, and when the difference in fluorescence intensity is 0.3 or more, the significance value is output as "positive for the target nucleic acid of the corresponding detection area with a probability of 70% or more", and fluorescence When the difference between the intensity values is 0.5 or more, the significance value may be output as "positive with a probability of 90% or more for the target nucleic acid of the corresponding detection zone". The output unit finds a disease, virus or fungal infection symptom related to a positively output target nucleic acid using the derived significance value based on big data including genetic information related to disease, virus or fungal infection, and finally It enables the diagnosis of disease, viral or fungal infection of the subject from which the sample was obtained. When the difference between the fluorescence intensity values is less than 0.3, the significance value may be output as “negative”.
상기 표적 핵산은 프라이머 세트를 제작할 때에 이미 알고 있는 질병, 바이러스 또는 균 감염 증상과 관련된 것일 수 있고, 다른 예로는, 상업적으로 판매되거나 획득할 수 있는 프라이머 세트를 무작위로 적용하여 반응패드를 제작한 후, 시료로 부터 획득된 유의성 값을 빅 데이터에 기반하여 도출한 후 해당 프라이머 세트가 특이적으로 결합하는 염기서열과 관련 질병, 바이러스 또는 균 감염 증상을 매칭시킬 수 있다.The target nucleic acid may be related to a disease, virus or fungal infection symptom already known when the primer set is produced. As another example, after preparing a reaction pad by randomly applying a commercially available or commercially available primer set , after deriving the significance value obtained from the sample based on big data, it is possible to match the nucleotide sequence to which the corresponding primer set specifically binds and the symptoms of a related disease, virus, or fungal infection.
빅 데이터는 공개된 생물학적 데이터베이스로부터 획득될 수 있고, 염기서열의 경우 Genebank, EMBL(The European Molecular Biology Laboratory), DDBJ(DNA Data Bank of Japan) 등이 있고, 유전체데이터베이스로 Entrez Genome, Ensembl 등이 있고, 대사회로 데이터베이스로 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), WikiPathways 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. Big data can be obtained from publicly available biological databases, and in the case of nucleotide sequences, there are Genebank, EMBL (The European Molecular Biology Laboratory), DDBJ (DNA Data Bank of Japan), etc. , KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), and WikiPathways as metabolic circuit databases, but are not limited thereto.
이하, 상기 핵산 검출용 구조물을 이용하여 핵산을 검출하는 방법을 서술한다.Hereinafter, a method for detecting a nucleic acid using the nucleic acid detection structure will be described.
핵산을 검출하고자 하는 시료는 시료패드에 적용하기 전에 세포 용해 완충액과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 세포 용해 완충액과 혼합되면 세포 내에 존재하는 핵산 물질이 용출될 수 있으므로 시료 내에 검출 가능한 핵산 물질의 양을 증가시킬 수 있다.The sample to be detected for nucleic acid may include mixing the sample with a cell lysis buffer before application to the sample pad. When mixed with the cell lysis buffer, the nucleic acid material present in the cell may be eluted, thereby increasing the amount of detectable nucleic acid material in the sample.
시료패드에 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl, 염화칼륨 5 mM 내지 50 mM, 황산마그네슘 1 mM 내지 30 mM, 황산암모늄 5 mM 내지 50 mM, 단백질분해효소 0.01 mg/ml 내지 0.1 mg/ml, TritonX-100 또는 Tween20 0.01w/w% 내지 0.2w/w%, pH 8.0 내지 9.0인 세포 용해용 완충액과 혼합된 세포 용해물을 적가하고, 상기 시료패드를 가열하기 위한 시료패드 하방의 가열패드를 작동시킴으로서 시료의 용해를 효율성을 높인다. 상기 시료패드 하방의 가열패드를 60 내지 80℃의 온도에서 2분간 가열 처리해줌으로써 시료패드에서 균주, 바이러스, 세포 등을 포함하는 시료의 용해를 촉진한다.5 mM to 80 mM Tris-HCl, potassium chloride 5 mM to 50 mM, magnesium sulfate 1 mM to 30 mM, ammonium sulfate 5 mM to 50 mM, protease 0.01 mg/ml to 0.1 mg/ml, TritonX- 100 or Tween20 0.01w/w% to 0.2w/w%, a cell lysate mixed with a cell lysis buffer having a pH of 8.0 to 9.0 is added dropwise, and by operating a heating pad below the sample pad for heating the sample pad Increase the efficiency of sample dissolution. By heating the heating pad under the sample pad at a temperature of 60 to 80° C. for 2 minutes, dissolution of the sample including strains, viruses, and cells is promoted in the sample pad.
또한 버퍼패드에 완충액을 가할 수 있다. 상기 완충액은 핵산 물질이 반응패드까지 이동할 수 있도록 하면서, 핵산 물질을 정제하는 역할을 한다. 상기 완충액은 핵산 물질이 검출패드까지 이동할 수 있도록 하면서, 핵산 물질을 정제하는 역할을 한다. 상기 완충액은 적절한 양의 완충 성분을 함유하므로, 증류수를 첨가하는 경우 발생할 수 있는 급격한 염도나 pH 변화로 인한 단백질이나 핵산 물질의 침전 현상을 예방할 수 있다. 본 발명의 핵산 검출용 구조물의 각 패드는 핵산이 측방으로 이동하면서 정제될 수 있도록 작은 기공을 갖는 다공성 재질로 이루어진다. 따라서 단백질이나 핵산 물질이 착염이나 응집되어 기공을 막게 되면 시료의 이동속도가 감소하고 핵산 물질의 수득률이 저하될 수 있다.Buffer can also be added to the buffer pad. The buffer serves to purify the nucleic acid material while allowing the nucleic acid material to move to the reaction pad. The buffer serves to purify the nucleic acid material while allowing the nucleic acid material to move to the detection pad. Since the buffer contains an appropriate amount of the buffer component, it is possible to prevent precipitation of protein or nucleic acid material due to abrupt salinity or pH change that may occur when distilled water is added. Each pad of the nucleic acid detection structure of the present invention is made of a porous material having small pores so that the nucleic acid can be purified while moving laterally. Therefore, if the protein or nucleic acid material is complexed or aggregated to block the pores, the sample movement speed may decrease and the yield of the nucleic acid material may decrease.
상기 부가 완충액은 예를 들어 5 mM 내지 80 mM Tris-HCl, 20 mM 내지 70 mM 염화칼륨, 0.5 mM 내지 5 mM 황산마그네슘, 1 mM 내지 30 mM 황산암모늄, 및 0.01w/w% 내지 0.2 w/w% Tween® 20 내지 TritonX-100을 포함하고 산도가 pH 8.0 내지 9.0인 등온완충액 또는 인산 완충액 (50mM Na2HPO4, pH 7.2)일 수 있다. 상기 등온완충액은 보다 구체적으로 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 및 0.1% Tween® 20을 포함하고, 산도는 pH 8.8일 수 있다. 상기 부가 완충액은 단백질분해효소, 글리세롤, 또는 환원제를 포함하지 않는 것일 수 있다.The addition buffer may be, for example, 5 mM to 80 mM Tris-HCl, 20 mM to 70 mM potassium chloride, 0.5 mM to 5 mM magnesium sulfate, 1 mM to 30 mM ammonium sulfate, and 0.01 w/w% to 0.2 w/w % Tween® 20 to TritonX-100 and may be an isothermal buffer having an acidity of pH 8.0 to 9.0 or a phosphate buffer (50 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.2). The isothermal buffer may more specifically include 20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 50 mM KCl, 2 mM MgSO 4 , and 0.1% Tween® 20, and the acidity may be pH 8.8. The addition buffer may not contain a protease, glycerol, or a reducing agent.
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 클라미디아 균 감염병을 특이적으로 검출할 수 있고, 등온증폭반응을 이용하여 신속하고 정확하게 현장 검출이 가능하다. Chlamydia infection can be specifically detected using the primer set of the present invention, and rapid and accurate on-site detection is possible using an isothermal amplification reaction.
또한, 등온증폭반응은 증폭 반응을 수행하기 위한 특정 온도 및 조건을 맞추는데 요구되는 고가의 기기와 전문 인력을 필요로 하지 않으므로, 효율적이면서도 저렴한 비용으로 수행이 가능하기에 다수의 검사 대상자를 조기에 진단할 수 있다.In addition, the isothermal amplification reaction does not require expensive equipment and professional manpower required to meet a specific temperature and condition for performing the amplification reaction, so it can be performed efficiently and at a low cost, so a large number of test subjects can be diagnosed early. can do.
또한, 본 발명의 프라이머 세트를 랩온페이퍼 기반의 키트에 적용하면,시료의 전처리 (preparation), 핵산 증폭 반응 (reaction)과 검출 (detection)을 각각 별도로 수행하지 않고, 시료의 1회 적용으로 검출까지 한 번에 수행할 수 있다. 각 단계를 별도로 수행하지 않으므로, 전 과정이 단순화되어 다양한 시료나 장치를 요하지 않고, 관련 기술자가 아니어도 쉽게 수행할 수 있다.In addition, when the primer set of the present invention is applied to a lab-on-paper-based kit, the sample preparation, nucleic acid amplification reaction, and detection are not separately performed, and the sample can be detected by one application. can be done at once. Since each step is not separately performed, the entire process is simplified, and various samples or devices are not required, and it can be easily performed even by non-technical technicians.
도 1은 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 전체 구조 및 클라미디아 균에 감염된 환자의 시료를 이용하는 경우 결과물의 예시이다.
도 2는 검출패드(160)에 표적 핵산이 획득되는 원리를 도식화한 것이다. 도 2A는 형광분석법에 기반한 경우이고, 도 2B는 비색분석법에 기반하는 경우의 예시이다.
도 3은 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 측면 구조도이다. 형광 기반 분석의 경우, 인식부(200), 및 출력부(210)를 더 포함할 수 있다.
도 4는 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 사시도이다.
도 5는 검출패드(160)의 구조를 확대한 구조도이다.
도 6은 케이스로 둘러싸인 본 발명의 다중 핵산 검출용 구조물의 외관을 보여주는 예시이다.
도 7은 혈액 시료로 비색진단 하는 경우 클라미디아 균의 검출 결과를 보여주는 예시이다.1 is an illustration of the overall structure of the structure for detecting multiple nucleic acids of the present invention and the result when using a sample from a patient infected with Chlamydia.
2 is a schematic diagram of the principle of obtaining a target nucleic acid on the
3 is a side structural diagram of a structure for detecting multiple nucleic acids of the present invention. In the case of fluorescence-based analysis, the recognition unit 200 and the output unit 210 may be further included.
4 is a perspective view of a structure for detecting multiple nucleic acids of the present invention.
5 is an enlarged structural diagram of the
6 is an illustration showing the appearance of a structure for detecting multiple nucleic acids of the present invention surrounded by a case.
7 is an example showing the detection result of Chlamydia bacteria in the case of colorimetric diagnosis with a blood sample.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples and the like will be described in detail to help the understanding of the present invention. However, the embodiments according to the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those of ordinary skill in the art.
제조예 1: 프라이머 제작Preparation Example 1: Primer Preparation
고리매개 등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 사용하여 클라미디아 균을 검출하기 위해 프라이머를 설계 및 제작하였다. 프라이머 세트 후보군을 얻기 위해, 클라미디아 균의 유전 정보를 블라스트 분석을 통하여 확인하고, 그 중 가장 효율이 높을 것이라 예상되는 서열을 상위 순서대로 도출하였다. 구체적으로, 각 유형의 클라미디아 균 전체 염기서열은 GenBank(National Center for Biotechnology Information, NC_000117.1)에서 얻었고, 클라미디아 균(C. trachomatis)의 정제된 DNA 표준물질은 ATCC 社(American Type Culture Collection, 미국)에서 구매하였고, 클라디미아 병원균의 유전자를 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머는 Eiken 웹 사이트 (http://primerexplorer.jp/e/)의 Primer Explorer V5 프로그램을 사용하여 디자인하였다. NCBI의 BLAST(basic local alignment search tool)를 사용하여 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머를 동정하였고, 설계된 모든 프라이머는 바이오닉스로부터 합성되었다.A primer was designed and manufactured to detect Chlamydia bacteria using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). In order to obtain a primer set candidate group, the genetic information of Chlamydia was confirmed through blast analysis, and sequences expected to have the highest efficiency among them were derived in the upper order. Specifically, the entire nucleotide sequence of each type of Chlamydia was obtained from GenBank (National Center for Biotechnology Information, NC_000117.1), and the purified DNA standard of Chlamydia (C. trachomatis) was prepared by ATCC (American Type Culture Collection, USA). ), and a primer for specifically amplifying the gene of the Chlamydia pathogen was designed using the Primer Explorer V5 program of the Eiken website (http://primerexplorer.jp/e/). Primers for specific amplification were identified using NCBI's basic local alignment search tool (BLAST), and all designed primers were synthesized from Bionics.
선정된 후보군은 5 개의 세트였고, 프라이머 후보군은 외부 프라이머와 내부 프라이머, 루프 프라이머를 포함하고, Loop 형성을 촉진하고 반응의 속도를 높이기 위하여 FIP 프라이머와 BIP 프라이머 내부에 4개의 티민을 포함시켰다.The selected candidate group was a set of 5, and the primer candidate group included an external primer, an internal primer, and a loop primer, and 4 thymines were included in the FIP primer and the BIP primer to promote loop formation and speed up the reaction.
시험예 1: 프라이머 세트의 선별Test Example 1: Selection of a primer set
상기 제조예 1에서 도출된 프라이머 세트 후보들에 대해 하기의 시험을 진행하여 최종적으로 프라이머 세트를 선별하였다.The following tests were performed on the primer set candidates derived in Preparation Example 1 to finally select a primer set.
(1) 등온증폭반응(1) Isothermal amplification reaction
역전사 고리매개등온증폭 반응은 25 ㎕ PCR 튜브에 하기의 용액을 혼합한 반응액을 이용하여 수행되었다; 정방향(forward) 및 역방향(backward)의 외부 프라이머(Outer primer: F3 및 B3, 0.2 μM) 각각 1 ㎕, 내부 프라이머(Inner primer: FIP 및 BIP, 1.6 μM) 각각 1 ㎕, 고리 프라이머(Loop primer: LF 및 LB, 0.4 μM) 각각 1 ㎕, 2X 등온증폭반응액 12.5 ㎕, SYBR Green I(25X) 또는 Phenol red(250 μM) 1 ㎕, 정제수(DW) 3.5 ㎕, 및 정제된 DNA 표준물질 용액 2.0 ㎕로 하여 각 반응별 25 ㎕로 LAMP 반응 혼합액을 조제하였다. The reverse transcription loop-mediated isothermal amplification reaction was performed using a reaction solution in which the following solution was mixed in a 25 μl PCR tube; 1 μl each of the forward and backward outer primers (F3 and B3, 0.2 μM), 1 μl each of the inner primers (FIP and BIP, 1.6 μM), and loop primer: LF and LB, 0.4 μM) 1 μl each, 2X isothermal amplification reaction solution 12.5 μl, SYBR Green I (25X) or Phenol red (250 μM) 1 μl, purified water (DW) 3.5 μl, and purified DNA standard solution 2.0 In terms of μl, a LAMP reaction mixture was prepared in 25 μl for each reaction.
2X Master Mix(등온증폭반응액)은 당사에서 조제하여 사용하였고 최종반응액 기준 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50nM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20, pH 8.8이 된다. Bst 3.0 DNA 중합효소 및 dNTPs는 New England Biolabs(미국)에서 구입하였다. 비색분석용 시약인 Phenol red은 Sigma-Aldrich(미국), 형광염색물질인 SYBR™ Green I은 Thermo Fisher Scientific(미국)에서 구입하였다. 반응액의 조제와 반응에 첨가되는 증류수는 초순수제조장치(New-P.NIX® Power, 대한과학, 한국)를 통해 생산하여 사용하였다.2X Master Mix (isothermal amplification reaction solution) was prepared and used by our company. Based on the final reaction solution, 20mM Tris-HCl, 10mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 50nM KCl, 2mM MgSO 4 , and 0.1% Tween-20, pH 8.8 becomes this Bst 3.0 DNA polymerase and dNTPs were purchased from New England Biolabs (USA). Phenol red, a reagent for colorimetric analysis, was purchased from Sigma-Aldrich (USA), and SYBR™ Green I, a fluorescent dye, was purchased from Thermo Fisher Scientific (USA). Distilled water added to the preparation of the reaction solution and the reaction was produced and used through an ultrapure water manufacturing device (New-P.NIX® Power, Daehan Science, Korea).
음성 대조군으로는 정제수를 사용하였고, LAMP 반응은 65℃의 온도에서 30분 동안 SimpliampTM Thermal Cycler(비색분석)/QuantStudioTM 3 및 CFX96TM(형광분석)을 사용하여 수행하였다. DNA 농도는 분광광도계(Epoch, Agilent Biotek, 미국)를 사용하여 측정하였고, 등온증폭반응에 사용된 기기는 비색분석용 SimpliampTM Thermal Cycler(Thermo Fisher Scientific, 미국)와 형광물질분석용 QuantStudioTM 3(Thermo Fisher Scientific, 미국) 및 Bio-Rad CFX96TM(BIO-RAD, 미국)을 사용하였다.Purified water was used as a negative control, and the LAMP reaction was performed using Simpliamp TM Thermal Cycler (colorimetric analysis)/QuantStudio TM 3 and CFX96 TM (fluorescence analysis) at a temperature of 65° C. for 30 minutes. DNA concentration was measured using a spectrophotometer (Epoch, Agilent Biotek, USA), and the instruments used for the isothermal amplification reaction were Simpliamp TM Thermal Cycler for colorimetric analysis (Thermo Fisher Scientific, USA) and QuantStudio TM 3 for fluorescence analysis ( Thermo Fisher Scientific, USA) and Bio-Rad CFX96 ™ (BIO-RAD, USA) were used.
(2) 비특이적 반응(위음성 및 위양성)의 발생 여부(2) Whether non-specific reactions (false negatives and false positives) occur
음성/양성 대조군 및 기타 성병 관련 감염균 검체(각 임질(Neisseria gonorrhoeae) 및 매독균(Treponema pallidum))를 사용하여, 모든 검사 항목에서 비특이적 반응이 발생하지 않은 프라이머 쌍을 선정하였다. 검사에 사용된 검체의 농도는 표준물질 기준 10 copies/rxn이며, 반응 시간은 30분으로 수행하였다.Using negative/positive controls and samples of other sexually transmitted infections (Neisseria gonorrhoeae and Treponema pallidum, respectively), primer pairs that did not cause non-specific reactions in all test items were selected. The concentration of the sample used for the test was 10 copies/rxn based on the standard, and the reaction time was 30 minutes.
서로 다른 검체 3개를 각 3회 반복 검사한 결과에서 오진단 발생 비율이 0.3% 미만으로 확인된 프라이머 쌍을 선별하였다.Primer pairs confirmed to have a false diagnosis rate of less than 0.3% were selected as a result of repeating each of three different samples three times.
(3) 비색분석(3) colorimetric analysis
구체적으로 시험예 1과 각 균주의 DNA 10 copies/rnx를 주형으로 사용하여 시험예 1-(1)과 같이 증폭 반응을 위한 혼합액을 준비하고, 30분, 35분, 40 분, 50 분, 및 60 분으로 구간을 나누고 등온증폭반응을 실시하였다. 반응 시간의 선정 방법은 검사 1회 기준 93/100 개의 이상의 반응에서 반응액의 색상이 붉은색에서 노란색으로 변화한 것이 구분되는 시간을 기준으로 하고, 각 프라이머별로 서로 다른 검체 3개를 각 3 회반복 검사한 결과로 재현성을 확보하였다.Specifically, using Test Example 1 and 10 copies/rnx of DNA of each strain as a template, prepare a mixture for the amplification reaction as in Test Example 1-(1), 30 minutes, 35 minutes, 40 minutes, 50 minutes, and The section was divided into 60 minutes and an isothermal amplification reaction was performed. The method of selecting the reaction time is based on the time at which the color of the reaction solution changes from red to yellow in more than 93/100 reactions based on one test, and 3 different samples for each primer are used 3 times each. Reproducibility was ensured as a result of repeated testing.
(4) 형광분석(4) Fluorescence analysis
검체 농도 10 copies/rnx, 1 cycle을 1분으로 설정하여 프라이머의 반응 효율성을 확인하였다. 반응 시간의 선정 방법은 검사 1회 기준 93/100개 이상의 반응에서 형광물질 검출값 기준점(Threshold) 500 기준으로 Ct 값이 30 이하인 것으로 선별하였다.The reaction efficiency of the primer was confirmed by setting the sample concentration to 10 copies/rnx and 1 cycle to 1 minute. In the method of selecting the reaction time, the C t value of 30 or less was selected based on the fluorescent substance detection value threshold of 500 in 93/100 or more reactions based on one test.
설계된 각 프라이머별로 서로 다른 검체 3개를 각 3 회 반복 검사한 결과로 재현성을 확보하였다. Reproducibility was ensured as a result of repeating three different samples for each designed primer three times each.
(5) 등온증폭 반응의 민감도(검출한계)(5) Sensitivity of isothermal amplification reaction (detection limit)
클라미디아 균의 정제된 DNA 표준물질을 ATCC 社(American Type Culture Collection, 미국)에서 구입하여 각 물질의 농도(Copy number)를 1,000, 100, 50, 25, 및 10 copy/rxn으로 나누어 등온증폭반응의 검출한계를 확인하였다. 반응 시간 30분으로 검사 1회 기준 93/100개 이상의 반응을 나타낸 농도를 검출한계(Limit of detection, LOD)로 설정하였다.Purchasing the purified DNA standard of Chlamydia from ATCC (American Type Culture Collection, USA), dividing the concentration (copy number) of each material into 1,000, 100, 50, 25, and 10 copy/rxn, the isothermal amplification reaction was performed. The detection limit was confirmed. The concentration showing 93/100 or more reactions based on one test with a reaction time of 30 minutes was set as the limit of detection (LOD).
설계된 각 프라이머별로 서로 다른 검체 3개를 각 3회 반복 검사한 결과로 재현성을 확보하였다. Reproducibility was ensured as a result of repeating three different samples for each designed primer three times each.
(6) 프라이머 선별(6) Primer selection
그 결과를 정리하면 표 2와 같고, 모든 조건을 만족시킨 선별된 프라이머인 실시예 2의 프라이머 세트의 각 프라이머 염기서열은 표 3에 표시하였다.The results are summarized in Table 2, and each primer nucleotide sequence of the primer set of Example 2, which is the selected primer that satisfies all conditions, is shown in Table 3.
※ Ct, Chlamydia trachomatis; F3, forward primer; B3, backward primer; FIP, forward inner primer; BIP, backward inner primer; LF, forward loop primer; LB, backward loop primer※ Ct, Chlamydia trachomatis; F3, forward primer; B3, backward primer; FIP, forward inner primer; BIP, backward inner primer; LF, forward loop primer; LB, backward loop primer
시험예 2: 4T의 유무에 따른 효율 변화의 확인Test Example 2: Confirmation of efficiency change with or without 4T
표 3과 같은 염기서열을 갖되 4개의 티민이 추가되지 않은 경우 효율 변화를 확인하였다. 구체적으로 프라이머 세트로서 실시예 2를 준비하고, 실시예 2에서 4개의 티민을 포함하지 않는 프라이머 세트로 각각 비교예 1을 제작하였다. 그런 다음 각 프라이머 세트를 이용하여 시험예 1과 같이 특이성 및 효율 등을 시험하였고, 그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.Efficiency change was confirmed when it had the nucleotide sequence as shown in Table 3, but four thymines were not added. Specifically, Example 2 was prepared as a primer set, and Comparative Example 1 was prepared using the four thymine-free primer sets in Example 2. Then, specificity and efficiency were tested as in Test Example 1 using each primer set, and the results are shown in Table 4 below.
그 결과, 실시예 2는 상기 시험항목을 모두 만족한 반면, 비교예 1은 효율이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다.As a result, Example 2 satisfies all of the above test items, while Comparative Example 1 confirmed that the efficiency was significantly reduced.
시험예 3: 가상 검체를 이용한 분석능 평가Test Example 3: Assessing the analytical ability using a virtual sample
실제 임상 검체에서 분석이 가능할지 평가하기 위해, 가상의 검체를 제조하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 분석능을 평가하였다.In order to evaluate whether analysis is possible in an actual clinical specimen, a virtual specimen was prepared and the analysis ability of the primer set according to the present invention was evaluated.
구체적으로, 건강한 사람 3명의 혈액샘플을 채취하여 소분하고, 혈액샘플 당 10 copies/25㎕로 클라미디아 균 유전물질을 혼합하여 가상의 환자 검체로 하였다. 음성대조군으로는 유전물질을 혼합하지 않은 것으로 준비하였고, 비교예1과 효율을 비교하였다. 상기의 시료를 이용하여 증폭반응을 위한 혼합액을 준비하고 등온증폭반응을 실시하였다.Specifically, blood samples from 3 healthy people were collected and divided, and the chlamydia genetic material was mixed at 10 copies/25 μl per blood sample to make a hypothetical patient sample. A negative control group was prepared without mixing the genetic material, and the efficiency was compared with Comparative Example 1. A mixed solution for the amplification reaction was prepared using the above sample, and an isothermal amplification reaction was performed.
그 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.The results are shown in Table 5 below.
그 결과 가상 검체에서도 프라이머 세트가 작동하는 것으로 확인되어, 검체로부터 병원균의 유전 물질을 별도로 정제하지 않아도 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 클라미디아 균 감염병을 진단할 수 있음을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the primer set works even in a virtual sample, and it was confirmed that a chlamydia infection can be diagnosed using the primer set of the present invention without separately purifying the genetic material of the pathogen from the sample.
제조예 2. 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물의 제조Preparation Example 2. Preparation of a structure for detecting lab-on-paper nucleic acid
(1) 형광분석법용 구조물(1) Structures for fluorescence analysis
랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물을 제조하기 위해, 시료패드(120) 및 버퍼패드(121)로는 0.5 ㎛ 폴리설폰, 제1연결패드(131) 또는 개시자패드(132)로는 0.01㎛ 셀룰로오스, 반응패드(140)로는 0.005㎛ 셀룰로스아세테이트, 제2연결패드(150)로는 0.05㎛ 셀룰로오스, 검출패드(160)로는 0.005㎛ 니트로셀룰로오스, 및 흡수패드(170)로는 0.5 ㎛ 유리섬유 재질로 준비하였다.In order to prepare a structure for detecting lab-on-paper nucleic acid, 0.5 μm polysulfone as the
반응패드(140)는 셀룰로오스아세테이트 막을 겹쳐서 패드로 만들고 이를 45 mM 수크로오스, 0.005 w/w% TritonX-100, 및 0.2 w/w% 글리세롤을 포함하는 용액에 담근 후 건조시켜 준비하였다. 그리고 여기에 미세 드릴로 웰을 형성하고, 상기 웰의 바닥에 실시예 2의 프라이머 세트를 포함하는 히드로겔 층을 형성하였다. 상기 히드로겔 층을 형성하기 위해 우선 히드로겔 용액 총 부피를 기준으로 UV-광가교성 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 (PEGDA, Sigma-Aldrich, MW700) 20% v/v, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, Sigma-Aldrich, MW600) 40% v/v 및 광개시제 2-하이드록시-2-메틸프로피오페논 (Sigma-Aldrich) 5% v/v 및 버퍼(PBS 완충액, pH7.5) 35%를 혼합하고, 여기에 각 프라이머 세트를 혼합하여 하이드로겔 용액을 제조하였다. 상기 폴리(에틸렌 글리콜)은 히드로겔 미세입자의 공극율을 증가시키기 위하여 포함되는 것이 바람직하다. 그런 다음, 상기 히드로겔 용액을 반응 패드의 각 웰 내부 표면에 도포하고, 1분간 UV 노출(360 nm wavelength, 35 mJ/cm2)하여 히드로겔 코팅층을 형성하였다.The
그런 다음 반응패드(140)의 표면에 dNTP(1.4mM, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 등온증폭버퍼(1X, 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 50mM KCl, 2mM MgSO4, 및 0.1% Tween-20, pH7.5)를 함유하는 파우더와 Bst 3.0 DNA 중합효소(320U/㎖)를 도포하고, 약 38℃ 오븐에서 약 30분 간 가열하여 고정하였다.Then, on the surface of the
검출패드(160)는 미세 드릴로 지름 5mm의 웰을 형성하고, 여기에 폴리에틸렌프탈레이트 잉크를 적용하고, 그 위에 FAM, HEX, 및 Cy5에 결합할 수 있는 항체를 함유하는 용액을 적가한 후, NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 용액을 적용하고 반응시켜 항체를 고정하였다.The
상기 개시자 패드(132) 및 제2연결패드(150)는 반응패드와 접촉하는 부분에 5%의 저융점 아가로오스(Lonza, NuSieve GTG Agarose) 용액으로 코팅하였다.The
그런 다음, 각 구조물의 구성요소를 도 3과 같이 배치하고, 상기 시료패드(120), 개시자패드(132), 반응패드(140), 및 제2연결패드(150)의 하단에는 가열패드로(141)로 열선이 연결된 구리판을 배치하고, 반응패드의 상부에는 차단패드(142)로 폴리아크릴 막을 배치하였다.Then, the components of each structure are arranged as shown in FIG. 3 , and a heating pad is used at the lower ends of the
(2) 비색진단용 구조물(2) Structure for colorimetric diagnosis
구조물을 비색 진단법에 적용하려는 경우, 반응패드(140)까지는 상기와 동일하게 제조하고, 제2연결패드(150)에는 금 나노입자를 고정한다. 구체적으로, 제2연결패드(150)에 고정된 금 나노입자는 콜로이드 입자로서 하기와 같이 제조하였다. 0.1% HAuCl4용액을 교반 가열하면서 끓기 시작하면 0.5% 소듐시트르산 용액을 첨가하여 용액을 환원시켜 금 입자를 만들고, 여기에 스트렙타비딘(streptavidin)을 금 입자용액 100㎖당 각각 1mg을 첨가하여 축합시켰다. 축합체를 10,000g에서 원심분리하여 침전시키고 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수(PBS)로 용해하여 OD450값이 10이 되도록 만들어 보관하였다. If the structure is to be applied to the colorimetric diagnostic method, the
제2연결패드(150)는 하기와 같이 제조하였다. 구체적으로, 셀룰로오스 막을 여러 겹쳐 준비하여 절단하고, 0.4 M의 Tris (pH 6.5), 0.2%의 Tween-20, 1%의 카제인나트륨, 0.1%의 소듐아지드(sodium azide), 및 0.05%의 Proclin 300으로 제조된 용액에 담궈 적셔 두었다. 상기 제조된 금 축합체는 상기 용액과 동일한 조성의 용액에 투석하여 준비하였다. 그런 다음, 상기 셀룰로오스 막에 상기 투석한 금 축합체를 처리하고 건조하여 제2연결패드(150)를 완성하였다.The
검출패드(160)는 폴리에틸렌프탈레이트 잉크로 검출 구역을 스탬핑하여 지정하고, 그 위에 FAM, HEX, 및 Cy5 등의 형광 표지자에 결합할 수 있는 항체를 함유하는 용액으로 다시 스탬핑 한 후, NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 용액을 적용하고 반응시켜 항체를 고정하였다. 이하 과정은 제조예 2-(1)과 같다.The
시험예 4. 혈액 시료를 이용한 핵산 추출 및 증폭Test Example 4. Extraction and Amplification of Nucleic Acids Using Blood Samples
(1)(One) 시험 시료 및 페이퍼 칩의 준비Preparation of test samples and paper chips
본 발명의 랩온페이퍼 핵산 검출용 구조물을 이용하여 혈액 시료로부터 핵산을 추출하고 이를 증폭하여 형광을 나타낼 수 있는지 확인하였다.It was confirmed whether nucleic acids could be extracted from a blood sample using the lab-on-paper nucleic acid detection structure of the present invention and amplified to exhibit fluorescence.
먼저 인간 혈액을 전혈로서 Innovative research (IWB1K2E10ML, USA)에서 구입하여 준비하고, 양성 대조군인 18S rRNA의 프라이머는 Tocris(# 7325, USA)에서 구입하였다. 사용된 전혈은 일체의 바이러스나 박테리아에 감염된 것이 아님을 data sheet를 통해 확인하였다. 상기 인간 혈액에 클라미디아 균 DNA 표준물질을 각각 10 copies/25㎕로 혼합하여 1 개의 시험 시료를 준비하였다. First, human blood was purchased from Innovative Research (IWB1K2E10ML, USA) as whole blood and prepared, and the primer of 18S rRNA as a positive control was purchased from Tocris (#7325, USA). It was confirmed through the data sheet that the whole blood used was not infected with any virus or bacteria. One test sample was prepared by mixing 10 copies/25 μl of each Chlamydia DNA standard in the human blood.
혈액에 혼합된 균주의 검출을 위한 프라이머 세트는 실시예 2의 프라이머 세트를 사용하였고, 각 프라이머 세트에서 F3 프라이머는 5' 말단에 형광 표지자를 결합하였고, 양성대조군인 인간 18s RNA (A)는 FAM, 및 실시예 2 (B)는 HEX 로 표지하고, 음성대조군(C)에는 표적유전물질인 template를 넣지 않은 시료를 이용하였다.The primer set of Example 2 was used as the primer set for the detection of the strain mixed in blood, and the F3 primer in each primer set bound a fluorescent marker to the 5' end, and human 18s RNA as a positive control (A) was FAM. , and Example 2 (B) was labeled with HEX, and a sample without a target genetic material template was used for the negative control group (C).
(2)(2) 시료로부터 핵산 검출Nucleic Acid Detection from Samples
상기 시료 50㎕를 취하여 Lysis buffer (20mM Tris·HCl (pH 8.8), 15mM MgSO4, 15mM KCl, 15mM (NH4)2SO4, 0.1 w/w% Tween20, 0.05 mg/ml 단백질분해효소 (Protenase K)) 50㎕를 첨가하고 가볍게 탭핑(tapping)한 후, 5분 정도 상온에서 인큐베이션 하였다. 그런 다음, 시료패드(120) 하부의 가열패드(141)를 60℃로 작동시킨 상태에서 제조예 2에서 제조된 핵산 검출용 구조물의 시료패드(120)에 5 분 내로 천천히 적가하고, 부가 완충액 (20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Tween® 20, pH 8.8) 250㎕를 시료패드에 약 2 분 동안 천천히 적가한 후, 반응패드 하부의 가열패드를 65℃로 가열하여 30분 간 반응시켰다. 그런 다음, 개시자패드 및 제2연결패드 하부의 가열패드를 65℃로 가열하고 상기 부가 완충액 250㎕을 버퍼패드에 2 분 동안 천천히 적가하였다. Take 50 μl of the sample, Lysis buffer (20mM Tris HCl (pH 8.8), 15mM MgSO 4 , 15mM KCl, 15mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1 w/w% Tween20, 0.05 mg/ml Protease (Protenase) K)) 50 μl was added and lightly tapped, followed by incubation at room temperature for about 5 minutes. Then, while the
그런 다음, 인식부(200)인 400 내지 700 λ의 파장대 광원 필터가 세팅된 Chemi-Doc XRS + 이미징 시스템 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용하여 각 형광 표지자에 해당하는 파장대에서 형광 이미지를 획득하고, 상기 형광 이미지로부터 형광을 측정하여 형광 세기를 최대 값 1 및 최소값 0으로 하고 그에 대한 비율로 산출한 후 하기의 식에 따라 형광세기 값을 구하였다. Then, using the Chemi-Doc XRS + imaging system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) set with a light source filter in the wavelength band of 400 to 700 λ, which is the recognition unit 200, in the wavelength band corresponding to each fluorescent marker. A fluorescence image was obtained, fluorescence was measured from the fluorescence image, and the fluorescence intensity was calculated as a maximum value of 1 and a minimum value of 0, and the fluorescence intensity value was obtained according to the following equation.
형광 세기 값 = Fluorescence intensity value = II -- II NN
(I N : 음성대조군의 형광 세기, I : 시료의 형광 세기)( I N : fluorescence intensity of negative control, I : fluorescence intensity of sample)
검출된 형광세기 값에 기반하여 도출된 유의성 값을 산출하면 하기의 표 6과 같다.The significance values derived based on the detected fluorescence intensity values are calculated as shown in Table 6 below.
상기 유의성 값에 기반하여 판단하면, 양성대조군(A)로서 구조물은 정상적으로 작동하였고, 클라미디아 균(B)에 감염되었다는 결과가 출력된다. Judging based on the significance value, the structure as a positive control (A) operated normally, and the result of being infected with Chlamydia bacteria (B) is output.
한편, A 및 B 시료를 이용하여 비색 진단하는 경우, 각 프라이머 세트에서 F3 프라이머는 5' 말단에 검출자로서 양성대조군인 인간 18s RNA는 FAM, 실시예 2는 HEX로 표지하였고, 각 검출패드는 FAM에 특이적인 수용체와 각 검출 라인에 따라 HEX에 특이적인 수용체를 포함하는 검출구역을 갖는다. 도 7과 같이 시험 시료 및 희석된 혈액 시료만 포함하는 음성대조군에서 모두 양성대조군(FAM) 밴드를 확인함으로써 구조물이 정상적으로 작동함을 확인하고, 시험 시료에서는 클라미디아 균 (시험군, HEX)이 검출된 반면, 음성대조군 시료에서는 양성대조군(FAM) 만 관찰되는 것을 확인하여 본 발명의 프라이머 세트 및 이를 포함하는 진단키트가 비색 진단에서도 작동함을 확인할 수 있다.On the other hand, when colorimetric diagnosis was performed using samples A and B, the F3 primer in each primer set was labeled at the 5' end as a detector, and human 18s RNA as a positive control was labeled with FAM and HEX in Example 2, and each detection pad was It has a detection zone including a receptor specific for FAM and a receptor specific for HEX according to each detection line. As shown in Figure 7, it was confirmed that the structure works normally by confirming the positive control (FAM) band in both the negative control group including the test sample and the diluted blood sample, and Chlamydia bacteria (test group, HEX) was detected in the test sample. On the other hand, by confirming that only the positive control (FAM) was observed in the negative control sample, it can be confirmed that the primer set of the present invention and the diagnostic kit including the same also work in colorimetric diagnosis.
110: 하우징 구조물
120: 시료패드
121: 버퍼패드
131: 제1연결패드
132: 개시자패드
140: 반응패드
141: 가열패드
142: 차단패드
150: 제2연결패드
160: 검출패드
170: 흡수패드
161: 검출구역
200: 인식부
210: 출력부110: housing structure
120: sample pad
121: buffer pad
131: first connection pad
132: initiator pad
140: reaction pad
141: heating pad
142: blocking pad
150: second connection pad
160: detection pad
170: absorbent pad
161: detection zone
200: recognition unit
210: output unit
SEQUENCE LISTING <110> NUTRIGENE <120> Composition comprising primer set for diagnosis of Chlamydia infection disease, and molecular diagnosis method and kit based on Lab-on-paper <130> NUTRIGENE_2021-10(3) <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia forward primer <400> 1 gaacagatgc agcgacag 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia backward primer <400> 2 tgggtttaga gtagtgaata tc 22 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia forward inner primer <400> 3 ttaactccaa tgtaaggagt tttcaatgcc tctattgact accat 45 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia backward inner primer <400> 4 ggtctagagc aagttttgat gccgcaagat agcttcagcc aatt 44 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia forward loop primer <400> 5 catattcaaa tccgtatagc tcagcc 26 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chlamydia backward loop primer <400> 6 attcgtatag ctcagcc 17 SEQUENCE LISTING <110> NUTRIGENE <120> Composition comprising primer set for diagnosis of Chlamydia infection disease, and molecular diagnosis method and kit based on Lab-on-paper <130> NUTRIGENE_2021-10(3) <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> <220> <223> Chlamydia forward primer <400> 1 gaacagatgc agcgacag 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> <220> <223> Chlamydia backward primer <400> 2 tgggtttaga gtagtgaata tc 22 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> <220> <223> Chlamydia forward inner primer <400> 3 ttaactccaa tgtaaggagt tttcaatgcc tctattgact accat 45 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> <220> <223> Chlamydia backward inner primer <400> 4 ggtctagagc aagttttgat gccgcaagat agcttcagcc aatt 44 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> <220> <223> Chlamydia forward loop primer <400> 5 catattcaaa tccgtatagc tcagcc 26 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> <220> <223> Chlamydia backward loop primer <400> 6 attcgtatag ctcagcc 17
Claims (8)
상기 시료패드와 분리되어 배치되고, 재수화(rehydration) 완충액을 수용하는 버퍼패드;
상기 시료패드의 상부에 배치되고, 시료패드와 반응패드를 연결하는 제1연결패드;
상기 버퍼패드의 상부에 배치되고, 버퍼패드 또는 반응패드와 접촉하는 부분은 저융점 아가로오스 또는 왁스로 코팅된 것이고, 버퍼패드와 반응패드를 연결하는 개시자 (opener) 패드;
상기 제1연결패드 및 개시자 패드의 하부에 배치되고, 표적 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트와 등온증폭반응 (LAMP)을 위한 시약을 포함하고, 등온증폭반응이 일어나는 반응패드;
상기 반응패드의 상부에 배치되고, 상기 등온증폭반응물을 운반하는 제2연결패드;
상기 제2연결패드의 하부에 배치되고, 상기 등온증폭반응물로부터 증폭된 표적 핵산을 획득하는 검출패드; 및
상기 검출패드의 측방에 배치되고, 잔류하는 시료를 흡수하는 흡수패드를 포함하고,
상기 시료패드, 개시자 패드, 반응패드, 및 제2연결패드 하부에 배치된 가열패드를 포함하고,
상기 프라이머 세트는 클라미디아 균에 특이적인 것으로서, 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 것인,
클라미디아 균 감염증 진단용 키트.a sample pad for receiving a biological sample;
a buffer pad disposed separately from the sample pad and accommodating a rehydration buffer;
a first connection pad disposed on the sample pad and connecting the sample pad and the reaction pad;
an initiator pad disposed on the buffer pad, a portion in contact with the buffer pad or the reaction pad coated with low-melting agarose or wax, and connecting the buffer pad and the reaction pad;
a reaction pad disposed under the first connection pad and the initiator pad, the reaction pad comprising a primer set capable of specifically binding to a target nucleic acid and a reagent for an isothermal amplification reaction (LAMP), in which an isothermal amplification reaction occurs;
a second connection pad disposed on the reaction pad and carrying the isothermal amplification reactant;
a detection pad disposed under the second connection pad and configured to obtain a target nucleic acid amplified from the isothermal amplification reaction product; and
and an absorption pad disposed on the side of the detection pad and absorbing the remaining sample,
a heating pad disposed under the sample pad, the initiator pad, the reaction pad, and the second connection pad;
The primer set is specific to chlamydia, and includes a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 6,
A kit for diagnosing chlamydial infections.
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Also Published As
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