KR102390925B1 - Method and test kit for detecting pathogenic microorganism using nanopores - Google Patents

Abstract

본 발명은 나노포어를 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a method and a detection kit for detecting pathogenic microorganisms using nanopores.

Description

나노포어를 이용한 병원성 미생물의 검출 방법 및 검출키트{METHOD AND TEST KIT FOR DETECTING PATHOGENIC MICROORGANISM USING NANOPORES}Method and detection kit for pathogenic microorganisms using nanopores

본 발명은 나노포어를 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법 및 검출키트에 관한 것이다.The present invention relates to a method and a detection kit for detecting pathogenic microorganisms using nanopores.

바이러스 및 박테리아와 같은 병원성 미생물에 의해 야기되는 질환은 중요한공중 보건의 문제로써 매년 사망률과 이환율을 증가시키고 있다. 특히 인플루엔자 바이러스 감염은 전 세계적으로 유행하는 전염병으로 발전하여 높은 발병률 및 사망률을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 1918년 스페인 독감으로 인하여 5천만명이 사망하였다. 인플루엔자 바이러스에는 A, B, C 및 D의 네 가지 유형이 있다. 인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus, IAV)는 다른 유형보다 광범위한 숙주 종에 대해 더 치명적이며, 항원변이(antigenic drift) 및 항원대변이(antigenic shift)로 인하여 심각한 호흡기 질환을 유발한다. 또한, 조류독감(Avian flu)을 일으켜 심각한 경제적 피해를 입히기도 한다. 따라서, IAV는 계절성 유행병 및 산발적인 세계적 유행병을 예방하기 위한 감시 표적으로 광범위하게 연구되고 있다.Diseases caused by pathogenic microorganisms such as viruses and bacteria are an important public health problem, increasing mortality and morbidity every year. In particular, influenza virus infection can develop into a worldwide epidemic, resulting in high morbidity and mortality. For example, the Spanish flu in 1918 killed 50 million people. There are four types of influenza virus: A, B, C and D. Influenza A virus (IAV) is more lethal to a wide range of host species than other types, and causes serious respiratory diseases due to antigenic drift and antigenic shift. It can also cause serious economic damage by causing Avian flu. Therefore, IAV has been extensively studied as a surveillance target to prevent seasonal and sporadic global epidemics.

현재 병원성 미생물 감염의 진단은 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 미생물의 핵산을 분석하거나, 신속항원검사(rapid antigen test, RAT) 및 면역형광분석(Immunofluorescence)을 통해 미생물의 항원을 검출하는 방법을 사용한다. 그러나, PCR을 이용한 분자 분석법은 각 아형에 맞는 프라이머가 필요하다는 단점이 있고 항체를 이용한 면역학적 방법은 노동력과 시간이 많이 소요되고, 민감도가 낮으며 한번에 측정할 수 있는 샘플의 개수가 적다는 단점이 있다. 이에, 병원성 미생물의 감염 초기에 현장에서 신속한 진단을 통해 감염의 전파를 차단할 수 있는 고감도의 병원성 미생물 진단 키트의 개발이 요청된다.Currently, the diagnosis of pathogenic microbial infection uses reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) to analyze the nucleic acid of microorganisms, rapid antigen test (RAT) and immunofluorescence analysis (Immunofluorescence) The method of detecting the antigen of microorganisms is used. However, the molecular analysis method using PCR has the disadvantage that a primer suitable for each subtype is required, and the immunological method using an antibody takes a lot of labor and time, has low sensitivity, and the number of samples that can be measured at a time is small. There is this. Accordingly, there is a demand for the development of a highly sensitive pathogenic microorganism diagnostic kit capable of blocking the spread of infection through rapid diagnosis in the field at the initial stage of infection of the pathogenic microorganism.

나노포어 센싱은 생체 분자들의 단일 분자 분석을 위한 새로운 기술이다. 인가된 전압에서 단일 나노포어 채널을 통한 하전된 분석물의 이동은 이온 전류의 일시적인 차단을 유도하며, 이는 전류 세기(current amplitude) 및 통과 또는 체류 시간(dwell time)으로 측정된다. 단백질 나노포어를 이용한 호모유리딘 RNA 단편(PolyU)를 나노포어를 기반으로 검출한 이후, 다양한 나노포어 기반 접근법이 핵산을 감지하는데 사용되었다(비특허문헌 1). 단백질 나노포어 중에서는 황색 포도상구균이 분비하는 독소인 알파-헤몰라이신(α-hemolysin, αHL)이 주로 핵산 분석에 사용된다. 293개 아미노산으로 구성된 단백질 모노머 (monomer)가 지질 이중층에서 자가 조립하여 ~ 10 nm 길이의 채널을 포함하여 안정한 헵타머 (heptamer) 기공을 형성한다. αHL 나노포어는 정교한 기하학적 구조와 1.4nm 직경의 좁은 협착부(constriction)로 인해 단일 분자의 검출, 특히 핵산의 검출에 적합한 플랫폼이다. 그러나, 병원성 미생물의 검출에 나노포어를 적용하는 기술은 미미한 실정이다.Nanopore sensing is a novel technology for single-molecule analysis of biomolecules. Movement of a charged analyte through a single nanopore channel at an applied voltage induces a transient blockage of ionic current, which is measured as current amplitude and transit or dwell time. After the detection of a homouridine RNA fragment (PolyU) using protein nanopores based on nanopores, various nanopore-based approaches have been used to detect nucleic acids (Non-Patent Document 1). Among protein nanopores, α-hemolysin (αHL), a toxin secreted by Staphylococcus aureus, is mainly used for nucleic acid analysis. A protein monomer composed of 293 amino acids self-assembles in the lipid bilayer to form stable heptamer pores, including channels with a length of ~10 nm. αHL nanopores are a suitable platform for the detection of single molecules, especially nucleic acids, due to their sophisticated geometry and narrow constriction of 1.4 nm diameter. However, the technology for applying nanopores to the detection of pathogenic microorganisms is insignificant.

이에, 나노포어를 기반으로 병원성 미생물의 감염여부를 현장에서 신속하게 진단하여 전파를 차단하는 기술 개발이 더욱 필요하다.Accordingly, it is more necessary to develop a technology to block the transmission by rapidly diagnosing the infection of a pathogenic microorganism in the field based on the nanopore.

B. M. Venkatesan and R. Bashir, Nat. Nanotechnol., 2011, 6, 615-624. B. M. Venkatesan and R. Bashir, Nat. Nanotechnol., 2011, 6, 615-624.

본 발명의 일 목적은 나노포어를 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a method for detecting pathogenic microorganisms using nanopores.

본 발명의 또 다른 일 목적은 나노포어를 포함하는 병원성 미생물 검출용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting pathogenic microorganisms including nanopores.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 나노포어를 포함하는 막(membrane)으로 나뉜 두 개의 구획 중 어느 일 구획에서 표적 single-stranded RNA (ssRNA) 서열을 포함하는 미생물이 존재할 것으로 예상되는 생물학적 시료 및 상기 미생물 유래의 표적 ssRNA와 결합할 수 있는 프로브를 반응시키는 단계; 및 상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 병원성 미생물을 검출하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, one aspect of the present invention is that a microorganism comprising a target single-stranded RNA (ssRNA) sequence in any one of two compartments divided by a membrane containing nanopores is expected to exist reacting a biological sample and a probe capable of binding to a target ssRNA derived from the microorganism; And in the two compartments divided by the membrane, measuring a change in an electrical signal before and after the reaction; provides a method for detecting a pathogenic microorganism comprising a.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 나노포어를 포함하고, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane) 및 상기 막에 의해 나뉜 일 구획에 미생물 유래의 표적 ssRNA에 결합하도록 구성된 프로브를 포함하는, 병원성 미생물 검출용 키트를 제공한다.In addition, another aspect of the present invention includes a nanopore, and a membrane dividing the space in which the nanopore exists into two compartments and a target ssRNA derived from a microorganism in one compartment divided by the membrane Provided is a kit for detecting a pathogenic microorganism comprising a probe configured to bind.

본 발명에 의하면 간섭현상 없이 초고감도로 병원성 미생물을 검출 할 수 있을 뿐만 아니라, 실시간 검출 및 키트의 소형화가 가능하므로, 현장 진단이 시급한 상황에서 병원성 미생물의 현장 검출에 유용하게 활용될 수 있다.According to the present invention, it is possible to detect pathogenic microorganisms with ultra-high sensitivity without interference, as well as real-time detection and miniaturization of the kit, so that it can be usefully used for on-site detection of pathogenic microorganisms in an urgent situation where on-site diagnosis is urgent.

본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.The effects of the present invention are not limited to the above-mentioned effects, and other effects not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

도 1은 나노포어를 사용한 보존된 인플루엔자 A 바이러스(IAV) RNA 프로모터의 단일분자 기반 검출 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 인플루엔자 A 바이러스 RNA의 고도로 보존된 서열을 나타낸 그림이다. 각각의 RNA 분절에서 보존된 서열은 부분 팬핸들 듀플렉스 (Panhandle duplex) 구조를 형성한다.
도 3은 (a) 인플루엔자 A 바이러스 프로모터(IAVp) RNA의 이차 구조, (b) IAVp 단독상태의 나노포어 이벤트의 산점도, 및 타입 I 형 및 타입 II 형 나노포어 이벤트 형태, 및 (c) IAVp의 타입 I 및 타입 II 나노포어 이벤트에 대한 체류 시간(t _d) 및 전류 차단 세기(ΔI)를 나타낸 그림 및 히스토그램이다.
도 4는 (a) DNA1로부터의 타입 I 및 타입 II 이벤트의 산점도, 및 (b) DNA1 나노포어 이벤트의 체류 시간(t _d) 및 전류 차단 세기(ΔI)을 나타낸 히스토그램이다.
도 5는 (a) IAVp RNA 및 DNA1 프로브의 혼성화를 나타낸 모식도, (b) IAVp/DNA1 복합체로부터의 산점도(좌측) 및 나노포어 이벤트의 통계적 분석 결과(우측), (c) 타입 III 및 (d) 타입 IV 나노포어 이벤트의 각 단계를 나타낸 그림 및 그래프이다.
도 6는 전압변화에 따른 IAVp RNA 및 DNA1의 타입 I과 타입 II 의 이벤트의 체류 시간(t _d)의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 나노포어 기반 검출에 사용되는 3개의 팬핸들 RNA(IAVp, IAVp-LL 및 IAVp-NS1)의 이차 구조를 나타낸 그림이다.
도 8은 (a) IAVp-LL RNA 및 DNA1 프로브의 혼성화를 나타낸 모식도, (b) IAVp-LL/DNA1 복합체로부터의 나노포어 이벤트의 산점도, 및 (c) 타입 III 및 타입 IV 나노포어 이벤트로부터의 체류 시간을 나타낸 히스토그램이다.
도 9는 (a) IAVp/DNA1 복합체 및 (b) IAVp-LL/DNA1 복합체의 나노포어 기반 검출로부터 수득된 이온 전류 기록(current trace)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 유행성 인플루엔자 A 바이러스 균주의 NS1 유전자의 서열 정렬에 따른 보존 서열을 나타낸 그림이다.
도 11은 (a) IAVp-NS1 및 DNA2의 혼성화를 나타낸 모식도, (b) IAVp-NS1/DNA2 복합체로부터의 나노포어 이벤트의 산점도, (c) 타입 III 및 타입 IV 나노포어 이벤트의 체류 시간 히스토그램, 및 (d) IAVp-NS1/DNA2 복합체의 전류 기록 (current trace)을 나타낸 그래프이다.
도 12는 IAVp-NS1 및 DNA 3 복합체의 단일분자 기반 검출 결과를 나타낸 그림이다.
도 13는 세 가지 RNA/DNA 복합체의 결합하는 이중나선 절편에 대한 UV 융해 곡선(melting curve)를 나타낸 그래프이다.
도 14는 FBS의 존재 하에서 DNA1 프로브를 사용한 IAVp-LL RNA의 단일분자 기반 검출 결과를 나타낸 그림이다.
도 15는 생체 pH 조건(pH 7.4)에서 DNA1 프로브를 사용한 IAVp RNA의 단일분자 기반 검출 결과를 나타낸 그림이다.
도 16은 5 '말단 리더 서열을 사용하여 IAV RNA에 대한 나노포어 기반 RNA-약물 복합체의 검출 방식을 나타낸 것이다: (A) 5 '말단 리더 서열 및 저분자 6,7- 디메톡시-2-(1-피페라지닐)-4-퀴나졸린아민(DPQ)을 갖는 IAV RNA의 2 차 구조, (B) 100mV에서 5 ' 말단 리더 서열 결합 DPQ를 이용한 IAV RNA의 검출, (C) 5'L-iav-RNA 단독상태 및 5'L-iav-RNA/DPQ 복합체의 증가된 결합 비율에 대한 체류 시간 및 전류 기록의 히스토그램, (D) IAV RNA와 DPQ 복합체의 감지를 위한 다이어그램을 나타낸 것이다.
도 17은 3 '말단 리더 서열 (3'L-iav-RNA)을 사용하여 IAV RNA에 대한 나노 포어 기반 RNA-약물 복합체 검출 방식을 나타낸 것이다: (A) 3'L-iav-RNA/DPQ 프로브 복합체 구조 모델 (B) 3'L-iav-RNA 단독상태 및 3'L-iav-RNA/DPQ 복합체에 대한 체류 시간 및 전류 차단(current blockade)의 히스토그램 (몰 비율 1 내지 50) (C) +140 mV의 인가 전압에서 나노포어 로우 데이터(Raw data)를 나타낸 것이다.
도 18은 아데닌에 의해 유도된 ARS의 3차원적 접힘을 NMR을 기반으로 분석한 결과를 나타낸 것이다: (a) 아데닌에 의해 유도된 ARS의 3차원적 접힘 과정에서 ARS의 3가지 분자 상태; (b) 50nM KCl 또는 1M KCl 존재 하에서 유리된 ARS 및 ARS-아데닌 복합체의 1D 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 19는 리간드를 사용하여 ARS 및 ARS-Mut의 나노포어 이벤트에 대한 통계 분석 결과를 나타낸 것이다: (a) ARS 단독상태에 대한 전류 강하 (I/I₀) 및 체류 시간 (t_d) 히스토그램; (b) ARS-아데닌 복합체에 대한 전류 하강(current drop) (I/I₀) 및 체류 시간 (t_d) 히스토그램; (c) 아데닌의 구조 및 ARS 단독상태 (검은 색 사각형)와 아데닌이 결합된 ARS (빨간색 원)의 산점도(scatter plot); (d) ARS 단독상태-Mut에 대한 전류 하강 (I/I₀) 및 체류 시간 (t_d) 히스토그램; (e) 아데닌이 결합된 ARS-Mut에 대한 전류 하강 (I/I₀) 및 체류 시간 (t_d) 히스토그램; (f) 4개의 염기 돌연변이 (U28G, G42C, U47C 및 U51C)가 있는 ARS-Mut의 구조 및 ARS 단독상태-Mut (주황색 사각형) 및 아데닌이 결합된 ARS-Mut(녹색 삼각형)의 나노포어 이벤트 산점도이다.
도 20은 ARS-아데닌 복합체의 나노포어 이벤트에 대한 통계 분석 결과를 나타낸 것이다: (a) ARS-아데닌 복합체에 대한 두 가지 타입의 전류 기록(current trace); (b) 타입 I 이벤트의 I/I₀ 및 체류 시간 히스토그램; (c) 타입 II 이벤트의 I/I₀ 및 체류 시간 히스토그램; (d) 복합체 및 ARS 단독상태 (검은 색 사각형)에 대한 타입 I (파란색 원) 및 타입 II (빨간색 원) 이벤트의 산점도; (e) ARS 단독상태, 중간체 및 복합체의 범핑(Bumping) 또는 통과(Translocation)에 대해 제안된 분자 모델을 나타낸 것이다.
도 21는 다수의 비-결합 화합물이 존재할 때 ARS와 아데닌의 특이적 상호작용에 대한 나노포어 측정 결과를 나타낸 것이다: (a) 비-결합성 화합물의 혼합물이 아데닌 없이 있는 경우 ARS의 타입 I 이벤트에 대한 t_I 가 있는 I/I₀ 히스토그램; (b) 비-결합성 화합물의 혼합물이 아데닌과 함께 있는 경우, ARS의 타입 I 이벤트에 대한 t_I 가 있는 I/I₀ 히스토그램; (c) 아데닌 및 MIX-3의 존재 하에 ARS의 유형 II 이벤트에 대한 t_II가 있는 I/I₀ 히스토그램; (d) MIX-3만 포함하는 ARS (진한 회색) MIX-3 및 아데닌을 포함하는 ARS의 타입 I 이벤트 (파란색) 및 타입 II 이벤트 (빨간색)의 I/I₀ 히스토그램 비교; (e) ARS와 아데닌의 특이적 상호작용의 나노포어 이동에 대한 개략적 모델을 나타낸 것이다.1 is a schematic diagram showing a single molecule-based detection method of a conserved influenza A virus (IAV) RNA promoter using nanopores.
Figure 2 is a diagram showing the highly conserved sequence of influenza A virus RNA. Conserved sequences in each RNA segment form a partial Panhandle duplex structure.
Figure 3 is (a) the secondary structure of the influenza A virus promoter (IAVp) RNA, (b) a scatter plot of the nanopore event in IAVp alone state, and the type I and type II nanopore event form, and (c) the IAVp Figures and histograms showing the residence time ( t _d ) and current cut-off strength (Δ I ) for type I and type II nanopore events.
4 is (a) a scatter plot of type I and type II events from DNA1, and (b) histograms showing the retention time ( t _d ) and current cutoff intensity (ΔI) of DNA1 nanopore events.
Figure 5 is (a) a schematic diagram showing the hybridization of IAVp RNA and DNA1 probe, (b) a scatter plot from the IAVp/DNA1 complex (left) and statistical analysis results of nanopore events (right), (c) type III and (d) ) Figures and graphs showing each stage of the type IV nanopore event.
6 is a graph showing the change in the retention time ( t _d ) of IAVp RNA and DNA1 type I and type II events according to the voltage change.
7 is a diagram showing the secondary structure of three panhandle RNAs (IAVp, IAVp-LL and IAVp-NS1) used for nanopore-based detection.
8 is a schematic diagram showing (a) hybridization of IAVp-LL RNA and DNA1 probes, (b) scatter plots of nanopore events from IAVp-LL/DNA1 complexes, and (c) type III and type IV nanopore events. It is a histogram showing the residence time.
9 is a graph showing ion current traces obtained from nanopore-based detection of (a) IAVp/DNA1 complex and (b) IAVp-LL/DNA1 complex.
10 is a diagram showing the conserved sequence according to the sequence alignment of the NS1 gene of the influenza A virus strain.
11 is (a) a schematic diagram showing the hybridization of IAVp-NS1 and DNA2, (b) a scatter plot of nanopore events from the IAVp-NS1/DNA2 complex, (c) retention time histograms of type III and type IV nanopore events; and (d) a graph showing the current trace of the IAVp-NS1/DNA2 complex.
12 is a diagram showing the results of single-molecule-based detection of IAVp-NS1 and DNA 3 complex.
13 is a graph showing a UV melting curve for a double-helix fragment bound to three RNA/DNA complexes.
14 is a diagram showing the results of single-molecule-based detection of IAVp-LL RNA using a DNA1 probe in the presence of FBS.
15 is a diagram showing the results of single-molecule-based detection of IAVp RNA using a DNA1 probe under in vivo pH conditions (pH 7.4).
Figure 16 shows the detection scheme of the nanopore-based RNA-drug complex for IAV RNA using the 5' end leader sequence: (A) 5' end leader sequence and small molecule 6,7-dimethoxy-2-(1 Secondary structure of IAV RNA with -piperazinyl)-4-quinazolinamine (DPQ), (B) Detection of IAV RNA using DPQ coupled to 5' end leader sequence at 100 mV, (C) 5'L-iav Histograms of retention times and current recordings for -RNA alone and increased binding ratio of 5'L-iav-RNA/DPQ complexes, (D) Diagrams for detection of IAV RNA and DPQ complexes.
17 shows a nanopore-based RNA-drug complex detection scheme for IAV RNA using a 3'-end leader sequence (3'L-iav-RNA): (A) 3'L-iav-RNA/DPQ probe Complex structural model (B) Histograms of retention time and current blockade for 3'L-iav-RNA single-state and 3'L-iav-RNA/DPQ complex (molar ratio 1 to 50) (C) + It shows nanopore raw data at an applied voltage of 140 mV.
18 shows the results of analysis of the three-dimensional folding of ARS induced by adenine based on NMR: (a) three molecular states of ARS in the process of three-dimensional folding of ARS induced by adenine; (b) 1D 1H NMR spectrum of ARS and ARS-adenine complex liberated in the presence of 50nM KCl or 1M KCl is shown.
Figure 19 shows the results of statistical analysis of nanopore events of ARS and ARS-Mut using ligands: (a) histograms of current drop (I/I ₀ ) and residence time (t _d ) for ARS alone state; (b) histograms of current drop (I/I ₀ ) and residence time (t _d ) for the ARS-adenine complex; (c) a scatter plot of the structure of adenine and ARS alone (black square) and adenine-coupled ARS (red circle); (d) Current drop (I/I ₀ ) and dwell time (t _d ) histograms for ARS standalone-Mut; (e) current drop (I/I ₀ ) and residence time (t _d ) histograms for adenine-bound ARS-Mut; (f) Structure of ARS-Mut with four base mutations (U28G, G42C, U47C and U51C) and nanopore event scatter plots of ARS-isolated-Mut (orange square) and adenine-bound ARS-Mut (green triangle) am.
20 shows the results of statistical analysis of nanopore events of the ARS-adenine complex: (a) two types of current traces for the ARS-adenine complex; (b) I/I ₀ and residence time histograms of type I events; (c) I/I ₀ and residence time histograms of type II events; (d) Scatterplots of type I (blue circles) and type II (red circles) events for complex and ARS isolated states (black squares); (e) A molecular model proposed for bumping or translocation of ARS alone, intermediates and complexes is shown.
Figure 21 shows the nanopore measurement results for the specific interaction of ARS with adenine in the presence of multiple non-binding compounds: (a) Type I event of ARS in the absence of adenine in the presence of a mixture of non-binding compounds I/I ₀ histogram with t _I for ; (b) I/I ₀ histograms with t _I for type I events of ARS when the mixture of non-binding compounds is with adenine; (c) I/I ₀ histograms with t _II for type II events of ARS in the presence of adenine and MIX-3; (d) Comparison of I/I ₀ histograms of type I events (blue) and type II events (red) of ARS containing MIX-3 only (dark gray) MIX-3 and ARS containing adenine; (e) A schematic model for nanopore migration of the specific interaction between ARS and adenine is shown.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 측면은 나노포어를 이용하여 병원성 미생물을 검출하는 방법을 제공한다.One aspect of the present invention provides a method for detecting pathogenic microorganisms using nanopores.

본 발명의 병원성 미생물을 검출하는 방법은 (a) 나노포어를 포함하는 막(membrane)으로 나뉜 두 개의 구획 중 어느 일 구획에서 표적 ssRNA 서열을 포함하는 미생물이 존재할 것으로 예상되는 생물학적 시료 및 상기 미생물 유래의 표적 ssRNA와 결합할 수 있는 프로브를 반응시키는 단계; 및 (b) 상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함한다.The method for detecting a pathogenic microorganism of the present invention is (a) a biological sample and the microorganism in which a microorganism containing a target ssRNA sequence is expected to exist in any one of two compartments divided by a membrane containing nanopores reacting a probe capable of binding to a target ssRNA of and (b) measuring a change in an electrical signal before and after the reaction in the two compartments divided by the membrane.

상기 “나노포어”는 어느 한 구획에서 다른 구획으로 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질을 통과시킬 수 있는 구조물을 의미한다. 나노포어의 “나노(nano)”는 약 1 ㎛ 미만이고 약 0.1 nm 이상의 크기를 의미한다. 상기 나노포어의 직경은 구체적으로 약 0.5 nm 내지 약 25 nm, 약 0.5 nm 내지 약 10 nm, 약 0.5 nm 내지 약 8 nm, 약 0.5 nm 내지 약 6 nm, 약 0.5 nm 내지 약 5 nm, 약 1 nm 내지 약 3 nm, 또는 약 1.5 nm일 수 있다.The “nanopore” refers to a structure capable of passing ions and/or low-molecular-weight materials having an electric charge from one compartment to another. The term “nano” of nanopores means a size of less than about 1 μm and greater than or equal to about 0.1 nm. The diameter of the nanopores is specifically about 0.5 nm to about 25 nm, about 0.5 nm to about 10 nm, about 0.5 nm to about 8 nm, about 0.5 nm to about 6 nm, about 0.5 nm to about 5 nm, about 1 nm to about 3 nm, or about 1.5 nm.

상기 나노포어는 좁은 협착부를 가지는 단백질 나노포어 일 수 있고, 예컨대, α-헤몰리신 단백질 나노포어 등 일 수 있으며, 상기 α-헤몰리신 단백질은 야생형 및 변이체를 모두 포함할 수 있다. α-헤몰리신 단백질 나노포어 단량체는 평면 지질 이중층에 길고 좁은 β-barrel(약 길이 10nm 및 직경 1.4nm)을 포함하는 칠량체성 기공(heptameric pore)을 형성한다. α-헤몰리신 단백질 나노포어는 나노포어 양단에 전압이 연결되어 제1구획에서 제2구획으로 분자를 통과시킬 수 있으며, 전하 특성에 따라 서로 다른 전기적 신호를 발생시킬 수 있다. 따라서, α-헤몰리신 단백질 나노포어는 단일 분자 수준에서 생체분자를 검출하기 위한 고감도 센서로 유용하게 활용될 수 있다.The nanopores may be protein nanopores having a narrow constriction, for example, α-hemolysin protein nanopores, etc., and the α-hemolysin protein may include both wild-type and mutants. The α-hemolysin protein nanopore monomer forms heptameric pores containing long and narrow β-barrels (about 10 nm in length and 1.4 nm in diameter) in a planar lipid bilayer. The α-hemolysin protein nanopores can have a voltage connected to both ends of the nanopores, so that molecules can pass from the first compartment to the second compartment, and different electrical signals can be generated according to charge characteristics. Therefore, α-hemolysin protein nanopores can be usefully utilized as high-sensitivity sensors for detecting biomolecules at the level of single molecules.

상기 “막(membrane)”은 상기 나노포어가 고정될 수 있는 지지대로서의 역할을 하는 한편, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획으로 나눌 수 있는 것이면 제한없이 포함될 수 있으며, 예컨대 지질 이중층(lipid bilayer) 등 일 수 있다.The "membrane" serves as a support to which the nanopores can be fixed, and may be included without limitation as long as the space in which the nanopores exist can be divided into two compartments, for example, a lipid bilayer (lipid). bilayer) and the like.

상기 “병원성 미생물(pathogenic organism)”은 사람이나 동물의 체내에서 병을 일으키는 감염원이 되는 미생물을 의미하며, 바이러스(virus) 또는 박테리아(bacteria)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The “pathogenic organism” refers to a microorganism that is a source of infection that causes disease in the body of a person or animal, and may be a virus or bacteria, but is not limited thereto.

상기 바이러스(virus)는 단일가닥 RNA (single stranded RNA) 바이러스 일 수 있고, 구체적으로, 오소믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae), 코로나바이러스과 (Coronaviridae) 또는 피코르나바이러스과 (Picornaviridae)에 속하는 바이러스 일 수 있고, 예컨대 조류독감 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스 (Influenza virus)일 수 있다.The virus may be a single-stranded RNA virus, specifically, Orthomyxoviridae, Coronaviridae or Picornaviridae It may be a virus belonging to, such as It may be an influenza virus including avian influenza virus (Influenza virus).

상기 박테리아(bacteria)는 그람양성균 또는 그람음성균 일 수 있고, 특정 RNA를 통해 생존에 필요한 유전자의 발현이 조절되는 박테리아라면 제한없이 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 박테리아는 리보스위치(riboswitch)를 갖는 박테리아일 수 있고, 보다 구체적으로 퓨린 리보스위치(purine riboswitch)를 갖는 박테리아 일 수 있으며, 예컨대 탄저균(Bacillus anthracis), 장내구균(Enterococcus faecalis), 리스테리아균(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 등 일 수 있다.The bacteria may be Gram-positive bacteria or Gram-negative bacteria, and any bacteria whose expression of genes necessary for survival is regulated through specific RNA may be included without limitation. Specifically, the bacterium may be a bacterium having a riboswitch, and more specifically, may be a bacterium having a purine riboswitch, such as Bacillus anthracis , Enterococcus faecalis , Listeria. Bacteria ( Listeria monocytogenes ), Staphylococcus aureus , Streptococcus pneumoniae ), etc. may be.

상기 “표적 ssRNA”는 병원성 미생물 유래의 RNA 표적 서열의 전부 또는 그 일부 일 수 있고, 헤어핀(hairpin) 형태의 구조를 가지는 것일 수 있으며, 구체적으로 부분적인 듀플렉스(dujplex) 구조를 가지는 것일 수 있다.The “target ssRNA” may be all or a part of the RNA target sequence derived from a pathogenic microorganism, may have a hairpin-type structure, and specifically may have a partial duplex structure.

구체적인 실시예에서, 상기 표적 ssRNA는 바이러스 RNA 중에서 보존 서열(conserved sequence)의 전부 또는 그 일부 일 수 있고, 예컨대, 서열번호 1 내지 서열번호 5로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열번호의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 보존 서열은 프로모터 서열일 수 있고, 고도로 보존된 RNA 프로모터는 유행성 바이러스의 다양한 변이체에서도 고도로 보존되어 있으므로, 이를 표적하여 특이적인 검출이 가능하다.In a specific embodiment, the target ssRNA may be all or a part of a conserved sequence among viral RNAs, for example, a nucleotide sequence of any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 5 may include. Specifically, the conserved sequence may be a promoter sequence, and the highly conserved RNA promoter is highly conserved even in various mutants of the epidemic virus, so that it is possible to specifically detect it by targeting it.

구체적인 실시예에서, 상기 표적 ssRNA는 5' 말단 또는 3' 말단에 RNA 리더 서열이 추가되도록 별도의 제작 과정을 추가로 거친 것일 수 있다.In a specific embodiment, the target ssRNA may be one that has been further subjected to a separate manufacturing process such that an RNA leader sequence is added to the 5' end or the 3' end.

구체적인 실시예에서, 상기 표적 ssRNA는 박테리아의 생존에 필요한 유전자의 발현을 조절할 수 있는 부위일 수 있고, 구체적으로 박테리아 유래의 리보스위치(riboswitch)의 전부 또는 일부 영역일 수 있으며, 리간드가 결합할 수 있는 앱타머 도메인을 포함하는 것이라면 제한없이 포함될 수 있고, 예를 들어 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.In a specific embodiment, the target ssRNA may be a region capable of regulating the expression of a gene necessary for survival of bacteria, and specifically may be all or part of a riboswitch region derived from bacteria, and a ligand may bind As long as it includes an aptamer domain, it may be included without limitation, for example, it may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16.

상기 “프로브(probe)”는 표적 바이오분자, 예컨대 핵산 전사체 등에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 의미하고, 구체적으로 핵산, 단백질, 펩티드 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 분자일 수 있으며, 병원성 미생물 유래의 표적 ssRNA에 결합할 수 있는 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다.The “probe” refers to any molecule capable of selectively binding to a target biomolecule, such as a nucleic acid transcript, and specifically any one molecule selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, peptides and compounds. And, as long as it can bind to the target ssRNA derived from a pathogenic microorganism, it may be included without limitation.

구체적인 실시예에서, 상기 프로브는 인플루엔자 바이러스의 보존 서열에 결합할 수 있는 DNA 프로브 일 수 있고, 예컨대 서열번호 6 내지 서열번호 9의 염기서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.In a specific embodiment, the probe may be a DNA probe capable of binding to a conserved sequence of influenza virus, for example, to include any one nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 9 can

구체적인 실시예에서, 상기 프로브는 RNA 내부 루프(internal-loops)에 결합할 수 있는 저분자 화합물 일 수 있고, 예컨대 6,7-디메톡시-2-(1-피페라지닐)-4-퀴나졸린아민(6,7-dimethoxy-2-(1-piperazinyl)-4-quinazolinamine, DPQ) 일 수 있다.In a specific embodiment, the probe may be a small molecule compound capable of binding to RNA internal-loops, for example, 6,7-dimethoxy-2-(1-piperazinyl)-4-quinazolinamine (6,7-dimethoxy-2-(1-piperazinyl)-4-quinazolinamine, DPQ).

구체적인 실시예에서, 상기 프로브는 박테리아의 리보스위치에 결합할 수 있는 저분자 화합물 일 수 있고, 퓨린 리보스위치에 결합할 수 있는 퓨린 계열의 저분자 화합물 일 수 있다. 상기 퓨린 계열의 저분자 화합물은 예컨대, 퓨린(Purine), 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 하이포잔틴(hypoxanthine), 잔틴(xanthine), 테오브로민(theobromine), 카페인(caffeine), 요산(uric acid), 아이소구아닌(isoguanine), 아데노신 일인산(AMP), 구아노신 일인산(GMP), 아미노퓨린(aminopurine) 등 일 수 있다.In a specific embodiment, the probe may be a low-molecular compound capable of binding to the riboswitch of bacteria, or a purine-based low-molecular compound capable of binding to the purine riboswitch. The purine-based low molecular weight compound is, for example, purine, adenine, guanine, hypoxanthine, xanthine, theobromine, caffeine, uric acid. , may be isoguanine (isoguanine), adenosine monophosphate (AMP), guanosine monophosphate (GMP), aminopurine (aminopurine), and the like.

상기 생물학적 시료는 혈액일 수 있다. 혈액은 생물학적 시료 중 가장 복합한 시료 중 하나이다. 본 발명에서 표적 RNA/프로브 복합체는 단일 또는 이중 전류 차단 세기 피크 및 실질적으로 증가된 체류 시간을 갖는 특징적인 나노포어 이벤트 형태(타입 III 및 타입 IV)를 나타내며, 혈액에서도 이와 같은 특징이 유지되므로, 이와 같은 나노포어 이벤트를 분석하여 혈액 내에 포함된 IAV의 검출이 가능함이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 프로브-매개 나노포어 검출 방법을 통하여 병원성 미생물에서 유래되지 않은 또 다른 핵산이 포함된 생물학적 시료로부터 병원성 미생물 유래의 ssRNA를 구체적으로 구별해내는데 유용하게 활용될 수 있다.The biological sample may be blood. Blood is one of the most complex biological samples. In the present invention, the target RNA/probe complex exhibits characteristic nanopore event forms (type III and type IV) with single or double current blocking intensity peaks and substantially increased residence time, and since these characteristics are maintained in blood, It was confirmed that the detection of IAV contained in blood is possible by analyzing such nanopore events. Therefore, through the probe-mediated nanopore detection method of the present invention, it can be usefully used to specifically distinguish ssRNA derived from a pathogenic microorganism from a biological sample containing another nucleic acid not derived from the pathogenic microorganism.

상기 “전기적 신호”는 막에 의해 분리된 어느 한 구획에서 다른 구획으로, 예컨대 제1 구획에서 제2 구획으로 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질이 통과하면서 발생되는 신호를 의미하고, 구체적으로 열린 포어 전류(open pore current: I₀), 전류 하강의 크기(ΔI), 체류 시간(dwell time), 나노포어 이벤트 형태(event conformation) 등일 수 있다. 상기 열린 포어 전류는 분석물은 존재하지 않고 나노포어만 존재하는 상태의 전류로써, 기본 수준(basal level)을 의미한다.The “electrical signal” refers to a signal generated while passing ions and/or low-molecular-weight substances having charges from one compartment separated by a membrane to another, for example, from the first compartment to the second compartment, specifically It may be an open pore current (I ₀ ), a magnitude of a current drop (ΔI), a dwell time, a nanopore event conformation, and the like. The open pore current is a current in a state in which only nanopores exist without an analyte, and refers to a basal level.

상기 “전류 하강의 크기(ΔI)”는 나노포어를 통한 전류 차단 세기(current blockade)로도 칭할 수 있고, 구체적으로, "전류 하강의 크기(ΔI=I-I ₀)"는 분석물에 대한 전류 차단 세기(I)에서 열린 포어 전류에 대한 전류 차단 세기(I ₀)의 차이를 의미한다.The “magnitude of the current drop ( ΔI )” may also be referred to as the current blockade through the nanopore, and specifically, the “magnitude of the current drop (Δ I = I - I ₀ )” for the analyte It means the difference between the current blocking strength ( I ₀ ) for the open pore current in the current blocking strength ( I ).

상기 “체류 시간”은 분석물이 나노포어를 통과하는데 소요되는 시간, 또는 나노포어 입구 및/또는 내부에 체류하는 시간을 의미한다.The "residence time" means the time required for the analyte to pass through the nanopore, or the time it takes to stay inside and/or at the entrance to the nanopore.

상기 “나노포어 이벤트 형태”는 분석물이 나노포어를 통과하면서 나타나는 전류 피크의 형태를 의미하고, 예컨대, 피크의 형태, 피크의 발생 비율 또는 이들의 조합으로 표현될 수 있다.The “nanopore event type” refers to the shape of a current peak that appears while the analyte passes through the nanopore, and may be expressed as, for example, the shape of the peak, the rate of occurrence of the peak, or a combination thereof.

상기 “병원성 미생물을 검출하는 방법”은 생물학적 시료 내에서 검출하고자 하는 타겟으로서 병원성 미생물을 검출하는 것을 의미하고, 구체적으로 병원성 미생물 유래의 ssRNA를 검출함으로써 시료 내에 병원성 미생물의 존재 여부를 확인할 수 있다.The "method of detecting a pathogenic microorganism" means detecting a pathogenic microorganism as a target to be detected in a biological sample, and specifically, by detecting the ssRNA derived from the pathogenic microorganism, the presence of the pathogenic microorganism in the sample can be confirmed.

상기 ssRNA의 검출은 ssRNA가 프로브와 결합하여 형성된 ssRNA-프로브 복합체의 존재 여부를 검출하는 것일 수 있다.The detection of the ssRNA may be to detect the presence of an ssRNA-probe complex formed by binding the ssRNA to the probe.

상기 검출 방법은, 상기 측정된 전기적 신호의 변화를 분석하여 전기적 신호의 변화가 유의미한 경우 시료 내 미생물이 존재하는 것으로 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.The detection method may further include a step of analyzing a change in the measured electrical signal and determining that a microorganism is present in the sample when the change in the electrical signal is significant.

상기 “전기적 신호의 변화가 유의미한 경우”는 상기 ssRNA와 프로브의 반응 전후의 체류 시간(dwell time) 및/또는 나노포어 이벤트 형태(event conformation)의 변화가 유의미한 경우를 의미하고, 구체적으로 나노포어 체류 시간이 ssRNA와 프로브의 결합 후에 증가하거나, ssRNA와 프로브의 결합 후에 새로운 나노포어 이벤트 형태가 나타나는 것을 의미할 수 있다.The "when the change in the electrical signal is significant" means a case in which the change in dwell time and / or nanopore event conformation before and after the reaction of the ssRNA and the probe is significant, specifically, nanopore retention It may mean that the time increases after the binding of the ssRNA and the probe, or that a new nanopore event form appears after the binding of the ssRNA and the probe.

본 발명의 검출 방법은, 생물학적 시료에 미생물 유래의 ssRNA가 존재하면 프로브와 결합하여 ssRNA-프로브 복합체를 형성하게 되고, 상기 ssRNA-프로브 복합체는 곧바로 나노포어를 통과하지 못하고 나노포어 내강에 캡쳐된 다음 언지핑(unzipping) 되는데 시간이 소요되어 나노포어에 체류하는 시간이 길어지게 될 것이므로, 생물학적 시료를 프로브와 반응시키기 전과 후의 나노포어 체류 시간(dwell time)을 측정하여 반응 후 체류 시간이 증가할 때 상기 생물학적 시료에 미생물 유래 ssRNA가 존재하는 것으로 판단할 수 있다.In the detection method of the present invention, when microorganism-derived ssRNA is present in a biological sample, it binds with a probe to form an ssRNA-probe complex, and the ssRNA-probe complex does not directly pass through the nanopore and is captured in the lumen of the nanopore. Since it takes time to unzipping and the time to stay in the nanopores will become longer, measure the dwell time of the nanopores before and after reacting the biological sample with the probe to increase the retention time after the reaction It can be determined that the microorganism-derived ssRNA is present in the biological sample.

또한, 본 발명의 검출 방법은, 생물학적 시료에 미생물 유래의 ssRNA가 존재하면 프로브와 결합하여 ssRNA-프로브 복합체를 형성하게 되고, 상기 ssRNA-프로브 복합체는 곧바로 나노포어를 통과하지 못하고 나노포어 내강에 캡쳐된 다음 언지핑(unzipping) 되면서 구조가 변하게 되고, 이와 같은 구조의 변화에 따라 전류 레벨이 발생하게 되므로, 생물학적 시료를 프로브와 반응시키기 전과 후의 전기적 신호를 측정하여 반응 후 새로운 타입의 이벤트 형태가 나타나면 상기 생물학적 시료에 미생물 유래 ssRNA가 존재하는 것으로 판단할 수 있다.In addition, in the detection method of the present invention, when microorganism-derived ssRNA is present in a biological sample, it binds to a probe to form an ssRNA-probe complex, and the ssRNA-probe complex does not pass directly through the nanopore and is captured in the lumen of the nanopore. Then, the structure is changed as it is unzipping, and the current level is generated according to the change in the structure. It can be determined that the microorganism-derived ssRNA is present in the biological sample.

본 발명의 일 실시예에서는 바이러스 유래의 ssRNA 및 상기 ssRNA에 결합할 수 있는 DNA 프로브가 단독상태로 각각 존재할 때는 단일단계 이온 전류 차단 세기(ΔI)을 갖는 타입 I 이벤트 및 2 단계 ΔI를 갖는 타입 II 이벤트의 2가지 유형의 나노포어 이벤트 형태만 나타났지만, ssRNA-프로브 복합체로 존재할 때는 위 2가지 타입의 이벤트 이외에 타입 III 및 타입 IV 이벤트가 추가로 나타나 4가지 유형의 나노포어 이벤트 형태를 나타나는 것을 확인함으로써 나노포어 및 DNA 프로브를 이용하여 바이러스를 검출할 수 있음을 확인하였다(도 3 내지 5).In one embodiment of the present invention, when the virus-derived ssRNA and the DNA probe capable of binding to the ssRNA are present alone, a type I event having a single-step ion current blocking intensity (ΔI) and a type II having a two-step ΔI Although only two types of events appeared in the form of nanopore events, when they were present as ssRNA-probe complexes, in addition to the above two types of events, type III and type IV events appeared additionally, indicating four types of nanopore event forms. By doing so, it was confirmed that viruses can be detected using nanopores and DNA probes ( FIGS. 3 to 5 ).

본 발명의 다른 일 실시예에서는 박테리아 유래의 ssRNA가 단독상태로 존재할 때는 단일단계의 타입 I 이벤트 형태만 나타났지만, ssRNA-프로브 복합체로 존재할 때는 위 type I 이벤트뿐만 아니라 2단계 전류 레벨을 갖는 type II 이벤트 형태가 함께 나타나고, 나노포어 체류 시간의 경우에도 ssRNA 단독상태 보다 ssRNA-프로브 복합체의 나노포어 체류 시간이 증가하는 것을 확인함으로써 나노포어 및 화합물 프로브를 이용하여 박테리아를 검출할 수 있음을 확인하였다(도 19 및 도 20).In another embodiment of the present invention, when ssRNA derived from bacteria is present alone, only a single-stage type I event form appears, but when present as an ssRNA-probe complex, not only the above type I event but also type II having a two-stage current level The event form appeared together, and it was confirmed that even in the case of nanopore retention time, the nanopore retention time of the ssRNA-probe complex increased compared to the ssRNA alone state, and bacteria could be detected using nanopores and compound probes ( 19 and 20).

본 발명의 또 다른 측면은 나노포어를 포함하는 병원성 미생물 검출용 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a kit for detecting pathogenic microorganisms comprising nanopores.

본 발명의 키트는 나노포어를 포함하고, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane) 및 상기 막에 의해 나뉜 일 구획에 미생물 유래의 표적 ssRNA에 결합하도록 구성된 프로브를 포함한다.The kit of the present invention includes a nanopore, and a membrane dividing the space in which the nanopore exists into two compartments and a probe configured to bind to a target ssRNA derived from a microorganism in one compartment divided by the membrane includes

본 발명의 병원성 미생물 검출용 키트는 나노포어를 포함하는 막(membrane)에 의해 상기 나노포어가 존재하는 공간이 두 개의 구획(compartment)(예컨대, 제1 구획 및 제2 구획, 또는 시스(cis) 구획 및 트랜스(trans) 구획)으로 나뉘어진 상태로 제공될 수 있다. 그리고, 상기 두 개의 구획 중, 어느 한 구획에 프로브가 포함된 상태로 제공될 수 있다.In the kit for detecting pathogenic microorganisms of the present invention, the space in which the nanopores are present is divided into two compartments (eg, the first compartment and the second compartment, or cis) by a membrane containing the nanopores. compartment and trans compartment) may be provided in a divided state. And, it may be provided in a state in which the probe is included in any one of the two compartments.

본 발명의 병원성 미생물 검출용 키트에서, 지질 이중층 막(DPhPC)은 약 100㎛의 구멍(aperture)을 갖는 Teflon 필름 상에 형성된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 한 쌍의 Ag/AgCl 전극이 Teflon 챔버의 시스 및 트랜스 측면에 삽입된 것일 수 있다. 각각의 챔버는 인산칼륨 및 KCl을 포함할 수 있고, RNA 및 DNA 분석물은 2nM 내지 2.5μM 범위의 농도로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the kit for detecting pathogenic microorganisms of the present invention, the lipid bilayer membrane (DPhPC) may be formed on a Teflon film having an aperture of about 100 μm. In addition, the kit of the present invention may be one in which a pair of Ag/AgCl electrodes are inserted into the cis and trans sides of the Teflon chamber. Each chamber may contain potassium phosphate and KCl, and RNA and DNA analytes may be used at concentrations ranging from 2 nM to 2.5 μM, but not limited thereto.

이렇게 제공되는 본 발명의 병원성 미생물 검출용 키트에, 상기 프로브가 포함된 구획으로 병원성 미생물 유래의 ssRNA가 존재할 것으로 예상되는 시료를 공급하면, 상기 시료에 포함된 병원성 미생물의 ssRNA에 프로브가 결합하여 ssRNA-프로브 복합체를 형성하게 되고, 상기 복합체는 나노포어 내강에 캡쳐된 후 듀플렉스가 언지핑(unzipping)되는 과정을 거치므로 구조 변화에 따라 전기적 신호의 변화가 발생된다. 이때 나타나는 전기적 신호의 변화를 측정 및 비교하여 시료 내의 병원성 미생물을 검출할 수 있다. 즉, 시료 내에 병원성 미생물 유래의 ssRNA가 존재할 경우에는 반응 전후에 걸쳐 전기적 신호가 유의미하게 변화하게 되고, 시료 내에 병원성 미생물이 존재하지 않는 경우에는 반응 전과 후에 측정된 전기적 신호의 변화가 유의미하지 않게 되므로 시료 내의 병원성 미생물 존재 여부를 검출 할 수 있는 것이다.When a sample in which ssRNA derived from a pathogenic microorganism is expected to exist is supplied to the kit for detecting a pathogenic microorganism of the present invention provided in this way to the compartment containing the probe, the probe binds to the ssRNA of the pathogenic microorganism included in the sample and the ssRNA -A probe complex is formed, and the complex is captured in the lumen of the nanopore, and then the duplex undergoes a process of unzipping, so a change in electrical signal is generated according to the structural change. At this time, the change in the electrical signal appearing can be measured and compared to detect the pathogenic microorganism in the sample. That is, when ssRNA derived from a pathogenic microorganism is present in the sample, the electrical signal changes significantly before and after the reaction, and when the pathogenic microorganism is not present in the sample, the change in the electrical signal measured before and after the reaction is not significant. It is possible to detect the presence of pathogenic microorganisms in the sample.

본 발명의 키트는 이온 전류, 전류 차단의 세기, 나노포어 체류 시간 및 나노포어 이벤트 형태를 측정할 수 있는 구성이 추가로 구비될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 전압을 인가할 수 있는 나노포어; 상기 나노포어의 전기적 통과 신호 세기 측정 모니터링부; 및 병원성 미생물 유래의 RNA에 상보적으로 결합하는 프로브를 포함하는 형태로 제공될 수 있다.The kit of the present invention may be further provided with a configuration capable of measuring the ion current, the strength of the current blocking, the nanopore residence time and the nanopore event type. For example, the kit of the present invention may include nanopores capable of applying a voltage; an electrical passage signal strength measurement monitoring unit of the nanopores; And it may be provided in a form comprising a probe that complementarily binds to the RNA derived from the pathogenic microorganism.

또한, 본 발명의 키트는 다양한 병원성 미생물 유래의 RNA와 다양한 종류의 프로브가 결합된 다양한 ssRNA-프로브 복합체가 나노포어를 통과하면서 발생하는 전기적 신호를 모니터링한 결과를 나타내는 설명서를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 사용설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.In addition, the kit of the present invention may further include instructions indicating the results of monitoring electrical signals generated while various ssRNA-probe complexes in which RNAs derived from various pathogenic microorganisms and various types of probes are combined pass through the nanopores. In addition, the kit of the present invention may further include an instruction manual describing optimal conditions for performing the reaction. Instructions for use include a brochure in the form of a pamphlet or leaflet, a label affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. In addition, the guide may include information published or provided through an electronic medium such as the Internet.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples and Experimental Examples. However, the following Examples and Experimental Examples are only for illustrating the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following Examples and Experimental Examples.

나노포어를 이용한 바이러스 감염 진단용 RNA 표적의 DNA 프로브 결합 측정 및 분석Measurement and Analysis of DNA Probe Binding of RNA Targets for Diagnosis of Virus Infection Using Nanopores

[1-1] IAV 프로모터 검출을 위한 나노포어 및 DNA 프로브 준비[1-1] Preparation of nanopores and DNA probes for IAV promoter detection

실험 재료experimental material

RNA 및 DNA는 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA, USA)에서 합성되었다. 모든 RNA 및 DNA 샘플을 10mM 인산칼륨(pH6.2) 버퍼에 대하여 50mM KCl로 12시간 이상 투석시켰다. 표적 RNA 및 DNA 프로브의 혼성화를 위하여, RNA 및 DNA 샘플을 1:5의 몰비로 혼합하고, 95℃에서 가열한 후, 25℃에서 서서히 냉각하여 어닐링하였다. α-헤몰리신(α-hemolysin, αHL) 단백질은 List Biological Laboratories Inc.(Campbell, CA, USA)에서 구입하였다. DPhPC(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)는 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)에서 구입하였다. 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. 냉동된 FBS를 4℃에서 완전히 해동시키고, 0.22μm 필터를 통해 여과하였으며, 나노포어 실험을 시작하기 전에 실온에서 30분 이상 인큐베이션하였다. FBS는 챔버의 시스 측에 2%(v/v)의 최종 농도로 첨가되었다.RNA and DNA were synthesized at Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA). All RNA and DNA samples were dialyzed against 10 mM potassium phosphate (pH 6.2) buffer with 50 mM KCl for at least 12 hours. For hybridization of target RNA and DNA probe, RNA and DNA samples were mixed in a molar ratio of 1:5, heated at 95° C., and then slowly cooled at 25° C. and annealed. α-Hemolysin (αHL) protein was purchased from List Biological Laboratories Inc. (Campbell, CA, USA). DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) was purchased from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Fetal bovine serum (FBS) was purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Frozen FBS was completely thawed at 4° C., filtered through a 0.22 μm filter, and incubated for at least 30 minutes at room temperature before starting the nanopore experiment. FBS was added to a final concentration of 2% (v/v) on the sheath side of the chamber.

단일-단백질 포어 형성 및 나노포어 검출 방법Single-protein pore formation and nanopore detection method

지질 이중층 막(DPhPC)은 약 100㎛의 구멍(aperture)을 갖는 Teflon 필름 상에 형성되었다. 한 쌍의 Ag/AgCl 전극을 맞춤형 Teflon 챔버의 시스 및 트랜스 측면에 삽입하였다. 각각의 챔버는 10mM 인산칼륨(pH6.2) 및 1M KCl의 용액 2ml을 함유한다. 나노포어 전류 신호는 +100mV에서 획득되었다. 나노포어 실험에서 모든 RNA 및 DNA 분석물은 0.5 내지 2.5μM 범위의 농도로 사용되었다. αHL 용액을 챔버의 시스 측에 첨가하여 지질 이중층 막에 단일-단백질 기공을 형성시켰다. 패치 클램프 증폭기(patch clamp amplifier)(Axopatch 200B, Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 이온 전류를 측정하였다. 250kHz의 샘플링 속도로 기록된 전류 신호는 5kHz의 추가 필터링과 함께 10kHz의 내장(built-in) 4극 저주파 통과 베셀 필터(4-pole low-pass Bessel Filter)를 사용하여 필터링되었다. pClamp 10.4 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 나노포어 데이터를 획득 및 분석하였다. 전류 차단 세기(current blockade)는 ΔI(I-I ₀)로 표현되며, I 및 I ₀는 각각 분석물 및 개방 포어 전류에 대한 전류 차단 세기이다. ΔI 및 체류 시간(dwell time, t _d)의 평균값은 각각 가우스 함수(Gaussian function) 및 단일 지수감쇠 함수(single exponential decay function)에 맞는 히스토그램의 피크 값으로부터 계산되었다. 모든 나노포어 실험은 25 ℃에서 수행되었다.A lipid bilayer membrane (DPhPC) was formed on a Teflon film with an aperture of about 100 μm. A pair of Ag/AgCl electrodes were inserted into the cis and trans sides of a custom Teflon chamber. Each chamber contains 2 ml of a solution of 10 mM potassium phosphate (pH 6.2) and 1 M KCl. The nanopore current signal was acquired at +100 mV. All RNA and DNA analytes in the nanopore experiments were used at concentrations ranging from 0.5 to 2.5 μM. The αHL solution was added to the cis side of the chamber to form single-protein pores in the lipid bilayer membrane. Ion currents were measured using a patch clamp amplifier (Axopatch 200B, Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA, USA). Current signals recorded at a sampling rate of 250 kHz were filtered using a built-in 4-pole low-pass Bessel Filter at 10 kHz with additional filtering at 5 kHz. Nanopore data were acquired and analyzed using pClamp 10.4 software (Molecular Devices). The current blockade is expressed as ΔI ( I - I 0 ), where I and I 0 are _the current blockade _strengths for the analyte and open pore current, respectively. The average values of ΔI and dwell time ( t _d ) were calculated from the peak values of the histogram fitted to a Gaussian function and a single exponential decay function, respectively. All nanopore experiments were performed at 25 °C.

인플루엔자 A 바이러스 검출용 DNA 프로브 설계DNA Probe Design for Influenza A Virus Detection

인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus, IAV)는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)에 속하며, 8개의 음성-극성 단일가닥(negative-sense single-stranded) RNA 분절(segment)을 포함한다. 각 RNA 분절은 바이러스 단백질 합성 및 유전자 조절에 중요한 리보핵단백질(ribonucleoprotein, RNP) 복합체로 캡슐화된다. 모든 8개의 RNA 분절은 5'- 및 3'- 말단에 각각 13 및 12 개의 뉴클레오티드(nt)로 구성된 고도로 보존된 서열(highly conserved sequence)을 포함하며, 이들 보존된 5'- 및 3'- 말단 서열은 부분 팬핸들 듀플렉스 구조(partial duplex panhandle structure)를 형성한다(도 2). 비-코딩 영역의 RNA 프로모터는 RNA-의존적 RNA 폴리머라아제와 상호 작용하고 바이러스 전사 및 복제를 조절하는데 중추적인 역할을 한다. 바이러스 RNA의 코딩 영역에서 IAV의 게놈 돌연변이는 숙주 면역 활성으로부터 바이러스를 보호한다. 특히, 혈구응집소(hemagglutinin) 및 뉴라미나다아제(neuraminidase)와 같은 바이러스 표면 단백질의 유전자 돌연변이는 IAV 감염 및 백신 개발의 정확한 진단을 방해한다. 그러나, IAV의 프로모터 서열은 고도로 보존되어 있기 때문에, IAV 프로모터는 IAV 감염의 진단을 위한 매력적인 표적이다. Influenza A virus (IAV) belongs to the family Orthomyxoviridae, and includes eight negative-sense single-stranded RNA segments. Each RNA segment is encapsulated in a ribonucleoprotein (RNP) complex that is important for viral protein synthesis and gene regulation. All eight RNA segments contain a highly conserved sequence consisting of 13 and 12 nucleotides (nt) at the 5'- and 3'-ends, respectively, and these conserved 5'- and 3'-ends The sequence forms a partial duplex panhandle structure ( FIG. 2 ). The non-coding region of the RNA promoter interacts with RNA-dependent RNA polymerase and plays a pivotal role in regulating viral transcription and replication. Genomic mutations of IAV in the coding region of viral RNA protect the virus from host immune activity. In particular, gene mutations in viral surface proteins such as hemagglutinin and neuraminidase prevent accurate diagnosis of IAV infection and vaccine development. However, since the promoter sequence of IAV is highly conserved, the IAV promoter is an attractive target for the diagnosis of IAV infection.

따라서, IAV의 특이적 검출을 위하여, IAV RNA 프로모터 3'- 말단의 12nt에 상보적 서열을 포함하는 신규 DNA 프로브를 설계하였다. 팬핸들 RNA 표적 염기서열 및 이의 검출에 사용된 DNA 프로브의 염기서열은 표 1과 같다. XXX는 임의의 염기 및 길이를 갖는 서열을 말한다.Therefore, for the specific detection of IAV, a novel DNA probe comprising a sequence complementary to 12 nt of the 3'-end of the IAV RNA promoter was designed. Table 1 shows the panhandle RNA target base sequence and the DNA probe used for its detection. XXX refers to a sequence having any base and length.

구분division 염기 서열(5'→3')Base sequence (5'→3') 핵산 종류Nucleic Acid Type 서열번호SEQ ID NO: IAVpIAVp AGUAGAAACAAGGCUUCGGCCUGCUUUUGCUAGUAGAAACAAGGCUUCGGCCUGCUUUUUGCU riboribo 서열번호 1SEQ ID NO: 1 IAVp-LLIAVp-LL AGUAGAAACAAGGGUGUUUUUUACCCCCUUUGUCACCCUGCUUUUGCUAGUAGAAACAAGGGUGUUUUUUACCCCCUUUGUCACCCUGCUUUUGCU riboribo 서열번호 2SEQ ID NO: 2 IAVp-NS1IAVp-NS1 AGUAGAAACAAGGAAAAAGAAAGAAAAGAAAAACCCUGCUUUUGCUAGUAGAAACAAGGAAAAAGAAAGAAAAGAAAAACCCUGCUUUUGCU riboribo 서열번호 3SEQ ID NO: 3 IAV promoterIAV promoter AGUAGAAACAAGG(XXX)_nCCUGCUUUUGCUAGUAGAAACAAGG(XXX) _n CCUGCUUUUGCU riboribo 서열번호 4SEQ ID NO: 4 NS1 promoterNS1 promoter AGUAGAAACAAGGGUGUUUUUUA(XXX)_nUUUGUCACCCUGCUUUUGCUAGUAGAAACAAGGGUGUUUUUUA(XXX) _n UUUGUCACCCUGCUUUUGCU riboribo 서열번호 5SEQ ID NO: 5 DNA1DNA1 (dA)₂₉ AGCAAAAGCAGGC(dA) ₂₉ AGCAAAAGCAGGC deoxyribodeoxyribo 서열번호 6SEQ ID NO: 6 DNA1'DNA1' (dAdC)₁₅ AGCAAAAGCAGGC(dAdC) ₁₅ AGCAAAAGCAGGC deoxyribodeoxyribo 서열번호 7SEQ ID NO: 7 DNA2DNA2 (dAdC)₁₅ AGCAAAAGCAGGGTGACAAA(dAdC) ₁₅ AGCAAAAGCAGGGTGACAAA deoxyribodeoxyribo 서열번호 8SEQ ID NO: 8 DNA3DNA3 TAAAAAACACCCTTGTTTCTACT(dAdC)₁₅ TAAAAAACACCCTTGTTTCTACT(dAdC) ₁₅ deoxyribodeoxyribo 서열번호 9SEQ ID NO: 9 IAVpbIAVpb GCCUGCUUUUGCUGCCUGCUUUUGCU riboribo 서열번호 10SEQ ID NO: 10 IAVp-LLbIAVp-LLb CCUGCUUUUGCUCCUGCUUUUGCU riboribo 서열번호 11SEQ ID NO: 11 IAVp-NS1bIAVp-NS1b UUUGUCACCCUGCUUUUGCUUUUGUCACCCUGCUUUUGCU riboribo 서열번호 12SEQ ID NO: 12 DNA1bDNA1b AGCAAAAGCAGGCAGCAAAGCAGGC deoxyribodeoxyribo 서열번호 13SEQ ID NO: 13 DNA2bDNA2b AGCAAAAGCAGGGTGACAAAAGCAAAAGCAGGGTGACAAA deoxyribodeoxyribo 서열번호 14SEQ ID NO: 14

열역학 변수 측정 방법How to Measure Thermodynamic Variables

RNA/DNA 복합체의 결합 부분에 대한 용해 온도(T_m, melting temperature)를 측정하기 위하여, 실시예 1-3에서 설계한 RNA 및 DNA에서 결합하는 서열만을 사용하여 RNA/DNA 절편(IAVpb, IAVp-LLb, IAVp-NS1b, DNA1b 그리고 DNA2b)을 제작하였다. UV 융해 곡선(melting curve)는 Cary 400 UV-Vis spectrometer(Agilent) 를 이용하여 25℃에서 90℃까지 온도를 상승시켜 획득하였다. 각각의 RNA 및 DNA 절편의 농도는 5 내지 10uM로 사용하였고, 10mM 인산칼륨(pH 6.2) 용액에서 수행하였다.In order to measure the melting temperature (T _m , melting temperature) for the binding portion of the RNA/DNA complex, RNA/DNA fragments (IAVpb, IAVp- LLb, IAVp-NS1b, DNA1b and DNA2b) were prepared. UV melting curve (melting curve) was obtained by increasing the temperature from 25 ℃ to 90 ℃ using a Cary 400 UV-Vis spectrometer (Agilent). The concentration of each RNA and DNA fragment was 5 to 10 uM, and it was performed in a 10 mM potassium phosphate (pH 6.2) solution.

[1-2]. IAV 프로모터 검출 DNA 프로브 설계 및 검증[1-2]. IAV promoter detection DNA probe design and validation

IAV 프로모터 검출 양상 확인Confirmation of IAV promoter detection pattern

표적 IAV 프로모터/DNA 프로브 복합체의 검출 전 IAV 프로모터 검출 양상을 확인하기 위하여, 긴 단일가닥 코딩 영역 대신에 하나의 여분의 G-C 염기쌍 및 UUCG 루프를 갖는 프로모터 서열을 포함하는 모델 팬핸들 RNA로 설계된 IAV 프로모터(IAVp) RNA 단독상태(도 3a)의 검출이 가능한지 확인하였다. 구체적으로, 서열번호 1의 IAVp RNA 단독상태를 시스 측 챔버 상에 αHL과 함께 첨가하고, +100mV에서 나노포어 실험을 수행하였다.IAV promoter designed as a model panhandle RNA containing a promoter sequence with one extra G-C base pair and a UUCG loop instead of a long single-stranded coding region to confirm the IAV promoter detection profile before detection of the target IAV promoter/DNA probe complex. (IAVp) It was confirmed whether the detection of the RNA alone state (FIG. 3a) is possible. Specifically, the IAVp RNA of SEQ ID NO: 1 alone was added together with αHL on the cis side chamber, and the nanopore experiment was performed at +100 mV.

그 결과, IAVp 단독상태의 나노포어 기반 검출은 다음과 같이 두 가지 유형의 나노포어 이벤트 형태를 나타내는 것으로 확인되었다: 단일 단계 이온 전류 차단 세기(ΔI)을 갖는 타입 I 이벤트 및 2 단계 ΔI를 갖는 타입 II 이벤트(도 3b). 또한, 타입 I 및 타입 II 나노포어 이벤트는 평균 체류 시간(dwell time, t _d)이 현저히 다른 것으로 확인되었다(도 3c). 타입 II 이벤트(1.23ms)는 타입 I 이벤트(0.41ms)보다 더 큰 평균 t _d 값을 나타냈다. 나노포어 측정 데이터에 따르면, 타입 I 나노포어 이벤트는 안정한 점착-말단(blunt-ended) IAVp의 범핑(bumping) 또는 비접힘 IAVp의 통과(translocation)에 의해 생성된 것인 반면, 타입 II 이벤트는 유연한 말단 염기쌍(flexible terminal base pair)을 포함하는 IAVp의 통과에 의해 생성된 것으로 확인되었다. 즉, IAVp의 2차 구조는 ΔI의 단계 1에서 풀린 다음, 단계 2에서 αHL을 통과하는 것으로 확인되었다.As a result, it was confirmed that the nanopore-based detection of IAVp alone exhibits two types of nanopore event patterns: a type I event with a single-step ion current blocking intensity (ΔI) and a two-step ΔI Type II event with ( FIG. 3B ). In addition, it was confirmed that the type I and type II nanopore events had significantly different average residence times (dwell time, t _d ) ( FIG. 3c ). Type II events (1.23 ms) exhibited higher mean t _d values than type I events (0.41 ms). According to the nanopore measurement data, type I nanopore events were generated by bumping of stable blunt-ended IAVp or translocation of unfolded IAVp, whereas type II event was not flexible. It was confirmed that it was generated by passage of IAVp containing a flexible terminal base pair. That is, it was confirmed that the secondary structure of IAVp was resolved in step 1 of ΔI and then passed through αHL in step 2.

또한, 이를 증명하기 위한 전압 의존성 실험을 수행한 결과, 타입 Ⅰ 나노포어 이벤트는 +100 mV 에서 +160 mV까지 전압이 증가함에 따라 평균 t _d 값의 변화가 거의 일정하고, 타입 Ⅱ 나노포어 이벤트는 전압이 증가함에 따라 감소되는 평균 t _d 값이 확인되었다(도 4).In addition, as a result of conducting a voltage dependence experiment to prove this, the change in the average t _d value of the type I nanopore event was almost constant as the voltage increased from +100 mV to +160 mV, and the type II nanopore event was It was confirmed that the average t _d value decreased as the voltage increased ( FIG. 4 ).

IAV 프로모터 특이적 검출을 위한 DNA1 프로브 검증DNA1 probe validation for IAV promoter specific detection

IAVp를 특이적으로 검출하기 위한 DNA 프로브 1(DNA1)을 설계하였다. 서열번호 4의 DNA1은 나노포어 통과를 촉진하기 위한 5'-말단의 poly(dA) 리더 서열 및 IAVp의 혼성화를 위한 상보적 서열을 포함한다.DNA probe 1 (DNA1) was designed to specifically detect IAVp. DNA1 of SEQ ID NO: 4 includes a poly(dA) leader sequence at the 5'-end for promoting nanopore passage and a complementary sequence for hybridization of IAVp.

DNA1의 나노포어 기반 검출을 수행한 결과, IAVp와 유사한 2가지 타입의 나노포어 이벤트가 나타나는 것으로 확인되었다(도 4a). 타입 I 이벤트는 단일가닥 DNA1의 통과 이벤트이다. 타입 II 이벤트는 poly(dA)의 부분적으로 접힌 구조의 풀림 및 통과에 의해 유도된다. 이러한 결과는 단일가닥 올리고뉴클레오티드의 나노포어 기반 검출에 대한 이전 보고와 일치하는 것이다.As a result of performing nanopore-based detection of DNA1, it was confirmed that two types of nanopore events similar to IAVp appeared (FIG. 4a). Type I events are single-stranded DNA1 transit events. Type II events are induced by unwinding and passage of partially folded structures of poly(dA). These results are consistent with previous reports on nanopore-based detection of single-stranded oligonucleotides.

한편, 단일가닥 DNA 프로브(타입 I, 0.2ms; 타입 II, 1.12ms)는 IAVp RNA(타입 I, 0.41ms; 타입 II, 1.23ms)보다 체류 시간이 더 짧은 것으로 확인되었고(도 4b), 통계 분석에 따르면, DNA1과 IAVp 사이에 ΔI의 유의적인 차이는 나타나지 않는 것으로 확인되었다.On the other hand, it was confirmed that the single-stranded DNA probe (type I, 0.2 ms; type II, 1.12 ms) had a shorter retention time than the IAVp RNA (type I, 0.41 ms; type II, 1.23 ms) ( FIG. 4b ), and statistical According to the analysis, it was confirmed that there was no significant difference in ΔI between DNA1 and IAVp .

[1-3].[1-3]. IAVp/DNA1 복합체의 나노포어 기반 검출 확인Confirmation of nanopore-based detection of IAVp/DNA1 complexes

실시예 1-2에 기초하여, αHL 나노포어를 사용하여 IAVp/DNA1 복합체의 단일분자 기반 검출을 수행하였다. 구체적으로, IAVp/DNA1 복합체의 형성 후, 나노포어 이벤트를 관찰하였다(도 5a). Based on Example 1-2, single-molecule-based detection of the IAVp/DNA1 complex was performed using αHL nanopores. Specifically, after the formation of the IAVp/DNA1 complex, a nanopore event was observed (Fig. 5a).

그 결과, 표적/프로브 복합체는 4가지 유형의 나노포어 이벤트 형태를 나타낸 것으로 확인되었다. 타입 I 및 타입 II 이벤트는 표적 RNA 또는 DNA 프로브로부터 얻어진 반면, 타입 III 및 타입 IV 이벤트는 IAVp/DNA1 복합체에서만 얻어졌다. 또한, 타입 III 및 타입 IV 이벤트(각각 2.66 및 2.16ms)는 타입 I 및 타입 II 이벤트(각각 0.38 및 1.14ms)보다 평균 체류 시간이 상당히 긴 것으로 나타났다(도 5b 및 도 6). 타입 III 및 타입 IV는 전류 차단 세기 신호를 나타냈기 때문에, 타입 III 및 타입 IV 나노포어 이벤트에 대한 분자 모델을 확립하였다(도 5c 및 도 5d).As a result, it was confirmed that the target/probe complex exhibited four types of nanopore event types. Type I and type II events were obtained from target RNA or DNA probes, whereas type III and type IV events were obtained only from the IAVp/DNA1 complex. In addition, type III and type IV events (2.66 and 2.16 ms, respectively) showed significantly longer mean residence times than type I and type II events (0.38 and 1.14 ms, respectively) ( FIGS. 5B and 6 ). Since type III and type IV exhibited current blocking intensity signals, molecular models for type III and type IV nanopore events were established ( FIGS. 5c and 5d ).

이 모델에서, 표적 RNA/프로브 복합체는 αHL 통로로 들어가고(단계 1), 이어서 표적 프로브 듀플렉스가 풀린다. 단계 2에서, 리더 서열을 포함하는 DNA1은 기공을 통과하여 전류 차단 세기의 첫 번째 피크를 유도한다. 단계 3 및 4에서, 통로에 위치한 단일 가닥 표적 RNA는 기공을 통과하거나 범프 아웃(bump out)된다. 도 5c 및 도 5d에 도시된 바와 같이, 타입 III 및 타입 IV 이벤트 사이에서 현저한 차이가 단계 4에서 관찰된다: 타입 IV 이벤트는 IAVp RNA 표적의 통과를 나타내는 두 번째 피크 신호를 생성한다. 그러나 타입 III 이벤트는 단계 4에서 IAVp의 범프 아웃으로 인하여 두 번째 피크를 생성하지 않으며, DNA1과 분리된 IAVp의 2차 구조가 회복될 수 있다.In this model, the target RNA/probe complex enters the αHL pathway (step 1), followed by unwinding of the target probe duplex. In step 2, DNA1 containing the leader sequence passes through the pore to induce the first peak of the current blocking intensity. In steps 3 and 4, single-stranded target RNA located in the passage passes through the pore or is bumped out. As shown in Figures 5c and 5d, a significant difference between type III and type IV events is observed in step 4: the type IV event produces a second peak signal indicating passage of the IAVp RNA target. However, the type III event does not generate a second peak due to the bump-out of IAVp in step 4, and the secondary structure of IAVp separated from DNA1 can be recovered.

즉, 타입 III 및 IV 이벤트 나노포어 기반 검출 결과에 따르면, 표적 특이적 프로브 DNA1을 사용한 나노포어 측정에 의하여 단일분자 수준에서 IAVp 표적이 구체적으로 검출될 수 있는 것으로 확인되었다.That is, according to the detection results based on the type III and IV event nanopores, it was confirmed that the IAVp target could be specifically detected at the single molecule level by measuring the nanopores using the target-specific probe DNA1.

[1-4]. IAVp-LL/DNA1 복합체의 나노포어 기반 검출 확인[1-4]. Confirmation of nanopore-based detection of IAVp-LL/DNA1 complex

IAV의 각각의 RNA 유전자 분절은 부분 이중나선 프로모터 및 코딩 영역의 긴 루프(800-2300nt)를 포함하는 팬핸들 RNA 구조를 형성한다. IAV RNA 분절을 모방하기 위하여, 프로모터 서열을 갖는 23nt의 큰 루프로 구성된 팬핸들 RNA 구조체(IAVp-LL, 서열번호 2)를 설계하였다(도 7). DNA1 프로브와 함께 IAVp-LL 표적을 결합시킨 후, 나노포어 기반 검출을 수행하였다. Each RNA gene segment of IAV forms a panhandle RNA structure comprising a partial double-stranded promoter and a long loop (800-2300 nt) of the coding region. To mimic the IAV RNA segment, a panhandle RNA construct (IAVp-LL, SEQ ID NO: 2) consisting of a 23 nt large loop with a promoter sequence was designed (FIG. 7). After binding of the IAVp-LL target with the DNA1 probe, nanopore-based detection was performed.

그 결과, IAVp/DNA1 복합체의 나노포어 이벤트와 유사하게, 타입 III 및 타입 IV 이벤트가 IAVp-LL/DNA1 복합체로부터 확인되었다(도 8 및 도 9). 또한, 타입 III(12.67ms) 및 타입 IV(3.55ms) 이벤트는 타입 I(0.63ms) 및 타입 II(1.52ms) 이벤트보다 실질적으로 더 긴 체류 시간을 나타내는 것으로 확인되었다(도 8 및 도 9). As a result, similar to the nanopore event of the IAVp/DNA1 complex, type III and type IV events were identified from the IAVp-LL/DNA1 complex ( FIGS. 8 and 9 ). In addition, it was confirmed that Type III (12.67 ms) and Type IV (3.55 ms) events exhibited substantially longer residence times than Type I (0.63 ms) and Type II (1.52 ms) events ( FIGS. 8 and 9 ). .

이와 같은 결과를 통하여, 긴 단일 가닥 코딩 영역을 갖는 IAV RNA 역시 나노포어를 사용하여 검출될 수 있음을 확인하였다.Through these results, it was confirmed that IAV RNA having a long single-stranded coding region can also be detected using nanopores.

[1-5]. IAVp-NS1/DNA1 복합체의 나노포어 기반 검출 확인[1-5]. Confirmation of nanopore-based detection of IAVp-NS1/DNA1 complexes

표적 RNA 길이에 따른 체류 시간 비교Comparison of retention times according to target RNA length

DNA 프로브와 함께 염기쌍의 증가를 수반하는 IAV의 연장 보존 RNA 서열이 나노포어 기반 검출에서 더 긴 체류 시간을 생성하는지 여부를 확인하였다.It was investigated whether the extended conserved RNA sequence of IAVs accompanied by base pair increase with DNA probes resulted in longer residence times in nanopore-based detection.

구체적으로, RNA 표적/프로브 복합체의 나노포어 기반 검출 방법을 NS1(nonstructural protein 1) 및 NEP(nuclear export protein)의 2개의 바이러스 단백질을 코딩하는 IAV의 NS 유전자 분절에 적용하여 IAVp-NS1/DNA2 복합체의 형성에 따라 나노포어 기반 검출을 수행하였다. 4개의 유행성 IAV 계통의 NS1 유전자의 정렬(alignment)로부터 얻은 NS1 유전자의 프로모터 서열 및 연장 보존 서열(도 10)을 포함하는 IAVp-NS1 팬핸들 RNA를 제작하였다(서열번호 3). 또한, IAVp-NS1을 표적하기 위하여 설계한 서열번호 8의 프로브 DNA2 프로브는 IAVp-NS1의 3'- 말단에서 20nt에 대한 상보적 서열 및 poly(dAdC) 리더 서열로 구성된다.Specifically, the nanopore-based detection method of the RNA target/probe complex was applied to the NS gene segment of IAV, which encodes two viral proteins, NS1 (nonstructural protein 1) and NEP (nuclear export protein), to the IAVp-NS1/DNA2 complex. Nanopore-based detection was performed according to the formation of IAVp-NS1 panhandle RNA containing the promoter sequence and extension conserved sequence (FIG. 10) of the NS1 gene obtained from the alignment of the NS1 gene of four epidemic IAV lines was prepared (SEQ ID NO: 3). In addition, the probe DNA2 probe of SEQ ID NO: 8 designed to target IAVp-NS1 consists of a sequence complementary to 20 nt from the 3'-end of IAVp-NS1 and a poly(dAdC) leader sequence.

그 결과, IAVp/DNA1 복합체와 유사하게, 타입 III 및 타입 IV 이벤트는 IAVp-NS1/DNA2 복합체에서만 검출되었다. 즉, IAVp-NS1/DNA1 복합체에 대한 타입 III(16.29ms) 및 타입 IV(3.48ms) 이벤트의 평균 체류 시간은 모두 IAVp/DNA1 복합체에 대한 타입 III(2.66ms) 및 타입 IV(2.16ms) 이벤트의 평균 체류 시간보다 긴 것으로 확인되었다(도 11). As a result, similar to the IAVp/DNA1 complex, type III and type IV events were detected only in the IAVp-NS1/DNA2 complex. That is, the average residence times of type III (16.29 ms) and type IV (3.48 ms) events for the IAVp-NS1/DNA1 complex were both type III (2.66 ms) and type IV (2.16 ms) events for the IAVp/DNA1 complex. was confirmed to be longer than the average residence time of (Fig. 11).

또한, IAVp-NS1을 표적하기 위하여 설계한 서열번호 8의 DNA2 프로브 이외에 IAVp-NS1의 5'- 말단에서 23nt에 대한 상보적 서열 및 poly(dAdC) 리더 서열로 구성된 서열번호 9의 DNA3 프로브에서도 IAVp-NS1/DNA3 복합체에 대한 타입 III 및 타입 IV 가 확인되었다(도 12).In addition, in addition to the DNA2 probe of SEQ ID NO: 8 designed to target IAVp-NS1, the DNA3 probe of SEQ ID NO: 9 consisting of a complementary sequence to 23nt from the 5'-end of IAVp-NS1 and a poly(dAdC) leader sequence Type III and type IV for the -NS1/DNA3 complex were identified (FIG. 12).

RNA 표적과 DNA 프로브 사이에 형성된 염기쌍의 영향 분석Analysis of the influence of base pairs formed between RNA targets and DNA probes

DNA2가 IAVp-NS1과 20개의 염기쌍을 형성하는 반면, DNA1은 IAVp와 13개의 염기쌍을 형성한다. IAVp-NS1/DNA1 복합체에 대한 타입 III 및 타입 IV 이벤트의 평균 체류 시간이 IAVp/DNA1 복합체에 대한 타입 III 및 타입 IV 이벤트의 평균 체류 시간보다 긴 것으로 나타난 이유를 확인하기 위하여, RNA 표적과 DNA 프로브 사이에 형성된 염기쌍의 영향을 분석하였다.DNA2 forms 20 base pairs with IAVp-NS1, whereas DNA1 forms 13 base pairs with IAVp. To determine why the average retention times of type III and type IV events for the IAVp-NS1/DNA1 complex were longer than the average retention times of type III and type IV events for the IAVp/DNA1 complex, RNA targets and DNA probes The effect of base pairs formed between them was analyzed.

구체적으로, RNA/DNA 혼성체에 대한 융해 온도(melting temperature, T_m)로 계산된 염기쌍의 수 및 3개의 RNA 표적/프로브 복합체 사이의 복합체-유도된 나노포어 이벤트(타입 III 및 타입 IV)의 비율을 비교하였다. T_m 값은 UV 융해 곡선(melting curve)를 사용하여 측정되었다(도 13).Specifically, the number of base pairs calculated as the melting temperature (T _m ) for the RNA/DNA hybrid and the complex-induced nanopore event (type III and type IV) between the three RNA target/probe complexes. The ratios were compared. T _m values were determined using a UV melting curve ( FIG. 13 ).

그 결과, IAVpb/DNA1b의 13 염기쌍에 대해 얻어진 Tm 값은 44.9℃, IAVp-LLb/DNA1b의 12 염기쌍에 대하여는 39.9℃, IAVp-NS1b/DNA2b의 20 염기쌍에 대한 값은 54.7℃로 측정되었다.As a result, the Tm value obtained for 13 base pairs of IAVpb/DNA1b was 44.9 °C, 39.9 °C for 12 base pairs of IAVp-LLb/DNA1b, and the value for 20 base pairs of IAVp-NS1b/DNA2b was 54.7 °C.

RNA/DNA 혼성체에서, 13에서 20으로의 염기쌍 수의 증가는 T_m 값(약 9.8℃)의 실질적인 증가를 나타내는데, 이는 향상된 RNA/DNA 상호 작용을 나타낸다. 또한, IAVp-NS1/DNA2 복합체는 다른 두 복합체(9.5% 및 8.4%)보다 타입 III 및 타입 IV 이벤트의 비율(13.5%)이 더 높은 것으로 확인되어(표 2), 표적과 프로브 사이의 염기쌍은 총 나노포어 이벤트에 대한 복합체-유도된 이벤트의 비율과 직접적인 상관 관계를 나타내는 것으로 확인되었다.In the RNA/DNA hybrid, an increase in the number of base pairs from 13 to 20 indicates a substantial increase in the T _m value (about 9.8° C.), indicating enhanced RNA/DNA interaction. In addition, it was confirmed that the IAVp-NS1/DNA2 complex had a higher rate of type III and type IV events (13.5%) than the other two complexes (9.5% and 8.4%) (Table 2), so the base pairing between the target and probe was It was found to exhibit a direct correlation with the ratio of complex-induced events to total nanopore events.

구분division DNA 프로브DNA probe 복합체
염기쌍 수complex
number of base pairs Tm(℃)Tm(℃) 복합체 이벤트 수(C)Complex Event Count (C) 나노포어 이벤트 수(N)Number of nanopore events (N) 복합체 이벤트 비율(C/N, %)Complex Event Rate (C/N, %) IAVpIAVp DNA1DNA1 13bp13bp 48.2648.26 105105 11011101 9.59.5 IAVp-LLIAVp-LL DNA1DNA1 12bp12bp 40.3940.39 9797 11591159 8.48.4 IAV-NS1IAV-NS1 DNA2DNA2 20bp20bp 57.5357.53 162162 11961196 13.513.5

이와 같은 결과를 통하여, DNA2는 나노포어를 사용하여 IAVp-NS1 표적의 실시간 단일분자 기반 검출을 위한 매우 정확한 프로브로 사용될 수 있음을 확인하였다.Through these results, it was confirmed that DNA2 can be used as a very accurate probe for real-time single-molecule-based detection of IAVp-NS1 targets using nanopores.

[1-6]. 혈액 샘플에 대한 나노포어 기반 검출 확인[1-6]. Confirmation of Nanopore-Based Detection for Blood Samples

IAV 프로모터 검출을 위한 나노포어 센서가 비특이적 거대 분자를 포함하는 혈액 샘플에 적용될 수 있는지 확인하기 위하여, FBS의 존재하에 나노포어 기반 측정을 수행하였다.To confirm that the nanopore sensor for IAV promoter detection can be applied to blood samples containing non-specific macromolecules, nanopore-based measurements were performed in the presence of FBS.

구체적으로, +100mV의 인가 통과에서 1M KCl 및 2%(v/v) FBS를 갖는 10mM 인산칼륨 버퍼(pH6.2) 중의 DNA1을 사용하여 IAVp-LL RNA의 나노포어 기반 검출을 수행하였다.Specifically, nanopore-based detection of IAVp-LL RNA was performed using DNA1 in 10 mM potassium phosphate buffer (pH6.2) with 1M KCl and 2% (v/v) FBS at an applied pass of +100 mV.

그 결과, FBS의 존재 하에서도 IAVp-LL/DNA1 복합체로부터 특징적인 타입 III 및 타입 IV 이벤트가 관찰되었다. FBS에서 비특이적 거대 분자로부터의 많은 범핑 이벤트(타입 I)가 전류 기록(current trace)에서 확인되었으나, 프로브가 결합된 IAVp-LL의 타입 III 및 타입 IV 신호 이벤트는 1분 이내에 명백하게 검출되었다(도 12 내지 도 14).As a result, characteristic type III and type IV events were observed from the IAVp-LL/DNA1 complex even in the presence of FBS. Although many bumping events (type I) from non-specific macromolecules in FBS were identified in the current trace, type III and type IV signaling events of probe-bound IAVp-LL were clearly detected within 1 min (Fig. 12). to 14).

이와 같은 결과를 통하여, 혈청에서 IAV 프로모터 분석물을 빠르고 구체적으로 감지하는데 본원발명의 DNA 프로브 및 αHL 나노포어 센서가 사용될 수 있음을 확인하였다.Through these results, it was confirmed that the DNA probe and αHL nanopore sensor of the present invention can be used to quickly and specifically detect IAV promoter analytes in serum.

[1-7]. 생체 pH 조건에서 나노포어 기반 검출 확인[1-7]. Confirmation of nanopore-based detection in living pH conditions

IAV 프로모터 검출을 위한 나노포어 센서가 pH 6.2 조건 이외에 생체 pH 조건(pH 7.4)에서도 적용될 수 있는지 확인하기 위하여, PBS(pH 7.4) 및 1M KCl 용액에서 나노포어 기반 측정을 수행하였다.In order to confirm that the nanopore sensor for detecting the IAV promoter can be applied at in vivo pH conditions (pH 7.4) in addition to pH 6.2 conditions, nanopore-based measurements were performed in PBS (pH 7.4) and 1M KCl solution.

구체적으로, +100 mV의 인가 전위에서 DNA1 프로브를 사용하여 IAVp RNA의 나노포어 기반 검출을 수행하였다.Specifically, nanopore-based detection of IAVp RNA was performed using a DNA1 probe at an applied potential of +100 mV.

그 결과, 생체 pH 조건 하에서도 IAVp/DNA1 복합체로부터 특징적인 타입 III 및 타입 IV 이벤트가 명확하게 관찰되었다(도 15).As a result, characteristic type III and type IV events were clearly observed from the IAVp/DNA1 complex even under in vivo pH conditions ( FIG. 15 ).

이와 같은 결과를 통하여, 생체 조건하에서도 IAV 프로모터 분석물을 빠르고 구체적으로 감지하는데 본 발명의 DNA 프로브 및 αHL 나노포어 센서가 사용될 수 있음을 확인하였다.Through these results, it was confirmed that the DNA probe and αHL nanopore sensor of the present invention can be used to quickly and specifically detect IAV promoter analytes even under in vivo conditions.

나노포어를 이용한 바이러스 감염 진단용 RNA 표적의 약물 프로브 결합 측정 및 분석Measurement and Analysis of Binding of Drug Probes to RNA Targets for Diagnosis of Virus Infection Using Nanopores

[2-1] IAV 검출을 위한 약물 프로브 발굴 및 RNA 표적 준비[2-1] Drug probe discovery and RNA target preparation for IAV detection

인플루엔자 감염 진단에 사용하기 위해, IAV RNA에 고특이적으로 결합하는 약물 probe를 발굴하였다. 팬핸들 RNA 표적 염기서열은 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 서열을 사용하였으며, 신규 약물 probe (6,7-dimethoxy-2-(1-piperazinyl)-4-quinazolinamine, DPQ) 와 IAV RNA 간의 고특이적 상호작용을 나노포어를 통해 관찰하였다. IAV RNA 단독상태가 나노포어를 더욱 효율적으로 통과하도록 팬핸들 RNA 표적 염기서열의 5' 말단 또는 3' 말단에 RNA leader 서열을 설계·추가 하여 신규 RNA 표적인 5'L-iav-RNA 및 3'L-iav-RNA를 제작하였다.For use in the diagnosis of influenza infection, a drug probe that specifically binds to IAV RNA was discovered. The panhandle RNA target base sequence was the same sequence as that used in Example 1, and high specificity between the novel drug probe (6,7-dimethoxy-2-(1-piperazinyl)-4-quinazolinamine, DPQ) and IAV RNA The interaction was observed through the nanopores. 5'L-iav-RNA and 3' as a novel RNA target by designing and adding an RNA leader sequence at the 5' or 3' end of the panhandle RNA target base sequence so that IAV RNA alone passes through the nanopore more efficiently L-iav-RNA was constructed.

구분division 염기 서열(5'→3')Base sequence (5'→3') 핵산 종류Nucleic Acid Type 서열번호SEQ ID NO: 5'L-iav-RNA5'L-iav-RNA (A)₂₄AGUAGAAACAAGGCUUCGGCCUGCUUUUGCU(A) ₂₄ AGUAGAAACAAGGCUUCGGCCUGCUUUUGCU riboribo 서열번호 15SEQ ID NO: 15 3'L-iav-RNA3'L-iav-RNA AGUAGAAACAAGGCUUCGGCCUGCUUUUGCU(A)₂₄ AGUAGAAACAAGGCUUCGGCCUGCUUUUUGCU(A) ₂₄ riboribo 서열번호 16SEQ ID NO: 16

[2-2] 5'L-iav-RNA/DPQ 복합체의 나노포어 기반 검출 확인[2-2] Confirmation of nanopore-based detection of 5'L-iav-RNA/DPQ complex

500nM 농도의 5'L-iav-RNA를 1M KCl이 존재하는 10mM potassium phosphate buffer pH 6.2 상에 첨가하고, α-hemolysin 나노포어에 (+) voltage 전압을 걸어주었을 때 매우 활발한 나노포어 통과 신호를 관측하였다.When 5'L-iav-RNA at a concentration of 500nM was added to 10mM potassium phosphate buffer pH 6.2 in the presence of 1M KCl, and a (+) voltage was applied to the α-hemolysin nanopore, a very active nanopore passage signal was observed. did

이러한 IAV RNA의 translocation events들을 분석한 결과, translocation의 전기적 신호 세기(ΔI)는 76.9pA 으로 측정되었고, translocation이 일어나는 시간(dwell time)은 0.58 ms 로 측정되었다. RNA leader 서열 길이를 단축하여 설계한 5'L-iav-RNA-s 의 경우에도 비슷한 결과를 나타낸다.As a result of analyzing these translocation events of IAV RNA, the electrical signal intensity (ΔI) of translocation was measured to be 76.9 pA, and the time for translocation to occur (dwell time) was measured to be 0.58 ms. In the case of 5'L-iav-RNA-s designed by shortening the length of the RNA leader sequence, similar results are shown.

DPQ 약물 프로브는 인플루엔자 RNA의 internal loop 부분에 결합함에 따라 RNA의 헤어핀 구조를 안정화 시키는 것으로 알려져 있다(Chem commun (2014), 50(3), 368-370). 이러한 5'L-iav-RNA와 약물 프로브 간의 안정적인 결합을 나노포어를 이용하여 측정하였을 때, RNA 단독 상태와 RNA-약물 프로브 복합체 간 translocation events 에서 뚜렷한 변화가 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 약물 프로브의 결합 비율에 따라 complex translocation events 들을 통계분석 한 결과, 1:50 비율의 complex에서는 translocation의 전기적 신호 세기(ΔI)는 78.6 pA 으로 측정되었고, translocation이 일어나는 시간 (dwell time)은 1.14 ms 으로 측정되었다. 그리고 1:100 비율의 complex에서는 75 pA의 전기적 신호 세기와 1.47 ms 의 체류시간(dwell time)이 측정되었다. 최종적으로, RNA 단독상태와 1:50, 1:100 비율로 약물 프로브의 농도을 증가시킬수록 5'L-iav-RNA 가 단백질 나노포어를 통과하는 시간은 현저히 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 16).DPQ drug probe is known to stabilize the hairpin structure of RNA as it binds to the internal loop portion of influenza RNA ( Chem commun (2014), 50(3), 368-370). When the stable binding between the 5'L-iav-RNA and the drug probe was measured using nanopores, it was confirmed that a distinct change appeared in the translocation events between the RNA-only state and the RNA-drug probe complex. In addition, as a result of statistical analysis of complex translocation events according to the binding ratio of the drug probe, the electrical signal intensity (ΔI) of the translocation was measured to be 78.6 pA in the 1:50 ratio complex, and the translocation time (dwell time) was 1.14. It was measured in ms. In the 1:100 ratio complex, an electrical signal strength of 75 pA and a dwell time of 1.47 ms were measured. Finally, as the concentration of the drug probe was increased in the RNA alone state and the ratio of 1:50, 1:100, it was observed that the time for 5'L-iav-RNA to pass through the protein nanopore was significantly increased (Fig. 16). ).

[2-3] 3'L-iav-RNA/DPQ 복합체의 나노포어 기반 검출 확인[2-3] Confirmation of nanopore-based detection of 3'L-iav-RNA/DPQ complex

IAV RNA 단독상태가 나노포어를 효율적으로 통과하도록 3' 말단에 RNA leader 서열을 설계·추가한 RNA 표적 (3'L-iav-RNA)을 제작하였다.An RNA target (3'L-iav-RNA) was prepared by designing and adding an RNA leader sequence at the 3' end so that IAV RNA alone passes through the nanopores efficiently.

흥미롭게도 5'L-iav-RNA 단독상태의 dwell time (0.58 ms) 보다 3'L-iav-RNA 단독상태의 dwell time (7.30 ms)이 현저히 증가하였으며, DPQ probe 가 3'L-iav-RNA 결합했을 때 9.52 ms로 유의적인 dwell time 증가를 나타낸다. 또한 probe 결합에 의한 3'L-iav-RNA translocation event들의 빈도수가 증가하였다. Interestingly, the dwell time (7.30 ms) of the 3'L-iav-RNA alone state was significantly increased compared to the dwell time (0.58 ms) of the 5'L-iav-RNA alone state, and the DPQ probe When combined, it shows a significant dwell time increase to 9.52 ms. Also, the frequency of 3'L-iav-RNA translocation events by probe binding increased.

이로부터 DPQ probe가 효과적으로 인플루엔자 RNA를 검출하는데 활용될 수 있음을 확인하였다. 게다가 나노포어 1분 데이터 만으로도 인플루엔자 A 바이러스 RNA를 검출 할 수 있으므로 신속한 진단이 가능하였다(도 17c). RNA leader 서열 길이를 단축하여 설계한 3'L-iav-RNA-s 의 경우에 비슷한 결과를 나타낸다.From this, it was confirmed that the DPQ probe can be effectively used to detect influenza RNA. In addition, it was possible to detect influenza A virus RNA with only 1 minute data of nanopores, so a rapid diagnosis was possible (FIG. 17c). In the case of 3'L-iav-RNA-s designed by shortening the length of the RNA leader sequence, similar results are shown.

이러한 단백질 나노포어 데이터들을 통하여, 고특이적으로 IAV RNA에 결합하는 약물 프로브의 사용은 인플루엔자 바이러스에 존재하는 RNA를 검출을 용이하게 할 뿐 아니라, 단분자 수준에서 극미량, 초고속 인플루엔자 감염 진단의 플랫폼 기술을 확립했다고 볼 수 있다.Through these protein nanopore data, the use of a drug probe that specifically binds to IAV RNA not only facilitates the detection of RNA present in influenza virus, but also a platform technology for ultra-trace, ultra-fast influenza infection diagnosis at the single molecule level can be considered to have been established.

[3-1]. ARS 및 단백질 나노포어의 준비[3-1]. Preparation of ARS and Protein Nanopores

RNA 는 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA, USA)에서 합성되었다. 염기서열 정보는 아래 표 4에 표기하였다. 모든 RNA 10mM 인산칼륨(pH6.2) 버퍼에 대하여 12시간 이상 투석시켰다. RNA 95℃에서 가열한 후, 5분 동안 얼음에서 빠르게 어닐링(annealing)하였다. 나노포어 실험은 10 ~ 500 nM RNA 농도에서 수행하였다. α-헤몰리신(α-hemolysin, αHL) 단백질은 List Biological Laboratories Inc.(Campbell, CA, USA)에서 구입하였다. DPhPC(1,2-diphytanoylsn-glycero-3-phosphocholine)는 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL, USA)에서 구입하였다.RNA was synthesized at Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA). Base sequence information is shown in Table 4 below. All RNA was dialyzed against 10 mM potassium phosphate (pH 6.2) buffer for at least 12 hours. RNA was heated at 95° C. and then rapidly annealed on ice for 5 min. Nanopore experiments were performed at 10 ~ 500 nM RNA concentration. α-Hemolysin (αHL) protein was purchased from List Biological Laboratories Inc. (Campbell, CA, USA). DPhPC (1,2-diphytanoylsn-glycero-3-phosphocholine) was purchased from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA).

구분division 염기서열 (5'->3')base sequence (5'->3') 핵산종류Nucleic Acid Type 서열번호SEQ ID NO: ARSARS GGC UUC AUA UAA UCC UAA UGA UAU GGU UUG GGA GUU UCU ACC AAG AGC CUU AAA CUC UUG AUU AUG AAG UCGGC UUC AUA UAA UCC UAA UGA UAU GGU UUG GGA GUU UCU ACC AAG AGC CUU AAA CUC UUG AUU AUG AAG UC riboribo 서열번호 17SEQ ID NO: 17 ARS-MutARS-Mut GGC UUC AUA UAA UCC GAA UGA UAU GGU UUC GGA GCU UCC ACC AAG AGC CUU AAA CUC UUG AUU AUG AAG UCGGC UUC AUA UAA UCC GAA UGA UAU GGU UUC GGA GCU UCC ACC AAG AGC CUU AAA CUC UUG AUU AUG AAG UC riboribo 서열번호 18SEQ ID NO: 18

[3-2] 리간드에 의해 유도된 ARS의 구조 변화 확인 [3-2] Confirmation of structural change of ARS induced by ligand

먼저, NMR 분석을 통해 리간드가 리보스위치에 결합함에 따라 리보스위치의 구조가 3차원적으로 변화하는 것을 아데닌-센싱 리보스위치(Adenine-sensing riboswitch, ARS)와 아데닌을 이용하여 확인하였다.First, it was confirmed using an adenine-sensing riboswitch (ARS) and adenine that the structure of the riboswitch changes in three dimensions as the ligand binds to the riboswitch through NMR analysis.

ARS는 박테리아 퓨린 대사에 필수적인 아데노신 탈아미노화효소(adenosine deaminase, ADD)의 번역을 조절한다. 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)의 ARS의 앱타머 도메인은 3개의 나선형 줄기 (P1-P3), 2개의 헤어핀 루프 (L2 및 L3) 및 3개의 결합 부위 (J1-2, J3-1 및 J2-3)로 구성된다 (도 18의 a). ARS는 단독상태(free state)에서는 유연하지만 아데닌에 결합하면 튜닝포크(tuning-fork)와 같은 3차 구조로 접힌다. 중간상태(intermediate state)를 통해 복합체의 3차 구조는 아데닌 결합 부위의 새로운 염기 삼중체 형성과 루프 L2와 L3 사이의 수소 결합을 통해 안정화 된다(도 18의 a). ARS는 박테리아 퓨린 대사의 번역을 제어한다.ARS regulates the translation of adenosine deaminase (ADD), which is essential for bacterial purine metabolism. The aptamer domain of ARS of Vibrio vulnificus has three helical stems (P1-P3), two hairpin loops (L2 and L3) and three binding sites (J1-2, J3-1 and J2-). 3) (Fig. 18a). ARS is flexible in its free state, but when it binds to adenine, it folds into a tertiary structure like a tuning-fork. Through the intermediate state, the tertiary structure of the complex is stabilized through the formation of a new base triplet at the adenine binding site and hydrogen bonding between loops L2 and L3 (FIG. 18a). ARS controls the translation of bacterial purine metabolism.

구체적으로, 아데닌 결합에 의해 유도되는 ARS의 3차원적 접힘(tertiary folding)을 모니터링하기 위해 아데닌이 부재 또는 존재하는 상태에서 ARS로 1D NMR 실험을 수행했다. ARS-아데닌 복합체(ARS-adenine complex)는 ARS가 3차원적으로 접히는 동안 새로운 수소 결합 형성에 의해 생성된 U31, U39, U47 및 U49의 4가지 특징적인 이미노 양성자 피크를 나타냈다. 아데닌 결합시 U31-U39의 비정규 염기쌍이 형성되었으며, 이는 L2와 L3 루프 사이의 장거리 3차 상호 작용에 중요하다(도 18). 또한 새로운 수소가 추가되었다. 아데닌 결합 부위의 결합 네트워크는 U47 및 U49 이미노 양성자 피크를 생성했다. NMR 분석은 ARS에 대한 아데닌의 결합이 극적인 구조적 재배열을 유도하고 복합체의 3차 구조를 실질적으로 안정화시키는 것으로 나타났다. 나노포어 측정에 앞서 ARS는 복합체의 4가지 특징적인 이미노 양성자 피크를 검출하여 높은 염 농도 (1M KCl)에서도 아데닌에 결합함을 확인했다(도 18의 b).Specifically, to monitor the tertiary folding of ARS induced by adenine binding, 1D NMR experiments were performed with ARS in the absence or presence of adenine. The ARS-adenine complex exhibited four characteristic imino proton peaks, U31, U39, U47 and U49, generated by the formation of new hydrogen bonds during three-dimensional folding of ARS. Upon adenine binding, non-canonical base pairing of U31-U39 was formed, which is important for the long-range tertiary interaction between the L2 and L3 loops (Fig. 18). In addition, new hydrogen was added. The binding network of adenine binding sites produced U47 and U49 imino proton peaks. NMR analysis showed that binding of adenine to ARS induces a dramatic structural rearrangement and substantially stabilizes the tertiary structure of the complex. Prior to nanopore measurement, ARS detected four characteristic imino proton peaks of the complex, confirming that it binds to adenine even at a high salt concentration (1M KCl) (FIG. 18 b).

[3-3]. ARS-아데닌 복합체의 나노포어 기반 검출 확인[3-3]. Confirmation of nanopore-based detection of ARS-adenine complex

아데닌 결합 여부에 따른 체류 시간 비교Comparison of retention time with or without adenine binding

α-헤모라이신(α-hemolysin, α-HL) 나노포어를 사용하여 리보스위치와 리간드의 상호작용을 단일분자 수준에서 검출할 수 있는지 확인하였다.Using α-hemolysin (α-HL) nanopores, it was confirmed whether the interaction between the riboswitch and the ligand could be detected at the single molecule level.

구체적으로, 10mM 인산칼륨(pH 6.2), 2mM MgCl₂ 및 1M KCl을 포함하는 버퍼 상에서 ARS 단독상태(free ARS) 또는 ARS-아데닌 복합체(ARS-adenine complex)를 단일의 αHL 나노포어가 있는 지질 이중층의 cis면에 추가했다. 나노포어에 (+) 100mV의 전압을 걸어주면 ARS 단독상태 또는 ARS-아데닌 복합체가 전기 영동으로 구동되어 이온 전류가 차단된다. ARS 단독상태와 ARS-아데닌 복합체의 나노포어 이벤트를 통계적으로 분석했다 (도 19의 a 내지 c). ARS 단독상태의 나노포어 이벤트는 평균 체류 시간 (dwell time, t_d)이 0. 38ms인 0.69 및 0.86의 두 가지 평균 전류 차단 (I/I₀ )을 나타냈다(도 19의 a). 특히, ARS-아데닌 복합체는 I/I₀값 (0.69 및 0.87)과 ARS 단독상태보다 유의적으로 증가한 평균 t_d d (0.63 ms)를 가진 전류 차단을 생성했다(도 19의 b). Specifically, ARS alone (free ARS) or ARS-adenine complex (ARS-adenine complex) in a buffer containing 10mM potassium phosphate (pH 6.2), 2mM MgCl ₂ and 1M KCl with a single αHL nanopore lipid bilayer added on the cis side. When a voltage of (+) 100 mV is applied to the nanopores, the ARS alone state or the ARS-adenine complex is driven by electrophoresis to block the ion current. The nanopore events of the ARS alone state and the ARS-adenine complex were statistically analyzed (FIGS. 19 a to c). ARS alone nanopore event exhibited two average current cutoffs (I/I ₀ ) of 0.69 and 0.86 with an average dwell time (dwell time, t _d ) of 0.38 ms (FIG. 19 a). In particular, the ARS-adenine complex produced current blockage with I/I ₀ values (0.69 and 0.87) and mean t _d d (0.63 ms) significantly increased compared to ARS alone ( FIG. 19 b ).

다음으로, 4개의 염기 돌연변이 (U28G, G42C, U47C 및 U51C)가 있는 ARS 돌연변이 (ARS-Mut)를 사용하여 나노포어 이벤트를 측정하여 ARS-아데닌 결합을 방해했다 (도 19의 d 내지 f). ARS-Mut의 I/I₀ (0.68 및 0.82) 및 t_d (0.50ms) 값은 ARS 단독상태-Mut의 값과 크게 다르지 않았다 (도 19의 d 내지 e). 또한, 아데닌이 있는 ARS-Mut의 산점도는 ARS 단독상태-Mut의 분포와 매우 유사한 분포를 보여주었다(도 19의 f).Next, nanopore events were measured using an ARS mutation (ARS-Mut) with four base mutations (U28G, G42C, U47C and U51C) to disrupt ARS-adenine binding (Fig. 19 d to f). The I/I ₀ (0.68 and 0.82) and t _d (0.50 ms) values of ARS-Mut were not significantly different from those of ARS alone-Mut ( FIGS. 19 d to e ). In addition, the scatter plot of ARS-Mut with adenine showed a very similar distribution to the distribution of ARS alone-Mut ( FIG. 19 f ).

이로부터, ARS-아데닌 복합체에서 관찰된 체류 시간의 유의적인 증가는 ARS와 아데닌의 특이적인 상호작용에 의한 것이며, 이를 나노포어를 이용하여 검출할 수 있음을 알 수 있다.From this, it can be seen that the significant increase in the retention time observed in the ARS-adenine complex is due to the specific interaction between ARS and adenine, which can be detected using nanopores.

ARS-아데닌 복합체의 특징적인 이벤트 형태 확인Identification of the characteristic event form of the ARS-adenine complex

ARS-아데닌 복합체로부터 두 가지 타입의 특징적인 전류 차단 이벤트를 관찰하였다.Two types of characteristic current blocking events were observed from the ARS-adenine complex.

구체적으로, ARS 단독상태는 단일레벨의 이온 전류 차단이 있는 타입 I 이벤트만 보였지만 ARS-아데닌 복합체는 타입 I 및 타입 II의 이벤트가 섞여서 이중레벨의 전기신호가 관측되었다(도 20의 a). 타입 II 이벤트는 구별되는 지속시간 (t_II1 및 t_II2)과 함께 두 가지 전류 레벨 (I_II1 및 I_II2로 지칭 됨)의 특징적인 패턴을 보였으며, 이는 이들이 아데닌이 결합된 ARS RNA에서 발생했음을 나타낸다. 타입 II 이벤트의 레벨 1 (I_II1)의 평균 I/I₀ 값은 0.45로 레벨 2 (I_II2)의 약 50 %에 해당한다. 이후 복합체의 타입 I 및 II 나노포어 이벤트를 분리한 후 각 타입의 이벤트를 통계적으로 분석했다. ARS-아데닌 복합체의 타입 I 및 II 이벤트는 I/I₀ 의 평균 값과 체류 시간에서 차이가 있었다 (도 20의 b 내지 c). 특히, 체류 시간은 타입 II 이벤트(t_II, 2.14ms)가 타입 I 이벤트 (t_I, 0.28ms) 보다 더 길게 측정되었으며, 현저한 차이를 나타내었다. 또한, 타입 I 및 II 이벤트의 산점도는 명확하게 구별되는 분포를 나타냈다 (도 20의 d).Specifically, the ARS alone state showed only type I events with a single level of ion current blocking, but in the ARS-adenine complex, type I and type II events were mixed, so that double-level electrical signals were observed (FIG. 20a). Type II events showed a characteristic pattern of two current levels (referred to as I _II1 and I _II2 ) with distinct durations (t _II1 and t _II2 ), suggesting that they occurred in adenine-bound ARS RNA. indicates. The average I/I ₀ value of level 1 (I _II1 ) of type II events is 0.45, which corresponds to about 50% of level 2 (I _II2 ). After separating the type I and II nanopore events of the complex, each type of event was statistically analyzed. Type I and II events of the ARS-adenine complex were different from the average value of I/I ₀ and the retention time ( FIGS. 20 b to c ). In particular, the retention time of type II events (t _II , 2.14 ms) was measured longer than that of type I events (t _I , 0.28 ms), showing a significant difference. In addition, the scatter plots of type I and II events showed clearly distinct distributions (Fig. 20d).

이로부터, ARS-아데닌 복합체에서 관찰된 특징적인 전류차단 이벤트를 이용하여 리보스위치와 리간드의 상호작용을 나노포어를 이용하여 검출할 수 있음을 알 수 있다.From this, it can be seen that the interaction between the riboswitch and the ligand can be detected using nanopores using the characteristic current blocking event observed in the ARS-adenine complex.

나노포어를 이용한 ARS-아데닌 복합체 검출 모델 구축Construction of ARS-Adenine Complex Detection Model Using Nanopores

상기에서 분석한 나노포어 데이터를 기반으로 리보스위치 단독 및 리간드-결합 리보스위치의 나노포어 이벤트에 대한 분자모델을 구축하였다 (도 20의 e).Based on the nanopore data analyzed above, a molecular model for the nanopore event of the riboswitch alone and the ligand-bound riboswitch was constructed (FIG. 20e).

아데닌에 의해 유도된 ARS RNA의 3차원적 접힘이 진행되는 동안 3가지 분자 상태 (ARS 단독, 중간체 및 ARS-아데닌 복합체)가 생성될 수 있다. 평활말단(Blunt end) A형 RNA 듀플렉스(Duplex)는 A형 듀플렉스의 직경이 크기 때문에 α-HL 나노포어를 통과하지 못한다는 것이 알려져 있다. 따라서 ARS 단독상태는 짧은 평균 체류 시간 (0.38ms)과 단일레벨 전류 차단으로 빈번한 범핑(Bumping) 신호를 발생시킨다(도 19의 a). 마찬가지로, 접힘 공정의 최종 생성물인 안정된 평활말단의 P1 스템(Stem)을 가진 ARS-아데닌 복합체는 포어에 들어갈 수 없으므로 평균 t_I가 0.28ms 인 타입 I 범핑 이벤트가 발생한다 (도 20의 b). During the three-dimensional folding of ARS RNA induced by adenine, three molecular states (ARS alone, intermediate and ARS-adenine complex) can be generated. It is known that the blunt end A-type RNA duplex does not pass through the α-HL nanopores because the diameter of the A-type duplex is large. Therefore, the ARS alone state generates a frequent bumping signal due to a short average residence time (0.38 ms) and a single-level current cutoff (FIG. 19a). Similarly, the ARS-adenine complex with a stable blunt-ended P1 stem, which is the final product of the folding process, cannot enter the pore, so a type I bumping event with an average t _I of 0.28 ms occurs (Fig. 20b).

ARS 단독 또는 복합체와는 달리, 유연한 말단 스템과 준안정(Matastable) 상태의 2차 구조를 가지는, 부분적으로 접힌 ARS 중간체는 두 단계 공정을 통해 나노포어를 통과 할 수 있다. 1단계는 아데닌-결합 ARS의 2차 구조를 포착하고 단일 가닥으로 언지핑(unzipping)하는 것이다 (도 20의 e). 서브-체류 시간 t_II1 동안, 아데닌-결합 ARS의 나선형 듀플렉스가 α-HL 나노포어의 통로(vestibule) 외부에서 염기쌍이 풀리는 언지핑(unzipping)이 일어난다. ARS의 언지핑 과정이 완료되면 2단계에서 나노포어를 통과하는 과정을 거치게 된다. 서브-체류 시간 t_II2 동안 나노포어에서 즉시 방출된다 (도 20의 e, 중간 컬럼). 전압-의존적인 나노포어 검출을 통해 타입 II 이벤트가 포어 통과(translocation)의 결과임을 확인하였다.Unlike ARS alone or complexes, partially folded ARS intermediates with flexible terminal stems and metastable secondary structures can pass through nanopores through a two-step process. The first step is to capture the secondary structure of the adenine-binding ARS and unzipping it into a single strand (Fig. 20e). During the sub-residence time t _II1 , unzipping occurs in which the helical duplex of adenine-binding ARS is unpaired outside the vestibule of the α-HL nanopore. When the unzipping process of ARS is completed, it goes through the process of passing through the nanopores in step 2. It is immediately released from the nanopores during the sub-retention time t _II2 ( FIG. 20E , middle column). Through voltage-dependent nanopore detection, it was confirmed that the type II event was a result of pore translocation.

타입 II 나노포어 통과 이벤트(translocation event)와 달리 ARS 단독 및 복합체의 타입 I 이벤트는 인가 전압이 증가해도 유사한 체류 시간을 나타내었다.Unlike the type II nanopore translocation event, the type I event of ARS alone and the complex exhibited similar residence times even when the applied voltage was increased.

종합하면, 아데닌-결합 ARS는 2단계 이온 전류 차단과 타입 I 이벤트 보다 ~ 7.64배 더 긴 체류 시간 (2.14ms)으로 타입 II 이동 신호를 생성한다. 이러한 상당한 시간의 지연은 유연한 말단 스템을 사용하여 아데닌-결합 중간체의 듀플렉스의 단일가닥으로 분리 즉, 언지핑 (Unzipping) 한 결과로 발생할 수 있다.Taken together, adenine-binding ARS produces a type II migration signal with a two-step ionic current blockade and a residence time (2.14 ms) that is ~7.64 times longer than that of type I events. This significant time delay can occur as a result of single-stranded separation, ie, unzipping, of the duplex of the adenine-binding intermediate using a flexible terminal stem.

이로부터, 단일 분자 기반 나노포어 센서가 리간드 결합-커플링된 RNA 접힘 경로에서 생성된 일시적이고 부분적으로 접힌 중간체를 감지하는데 유용한 플랫폼임을 알 수 있다.From this, it can be seen that single-molecule-based nanopore sensors are a useful platform for detecting transient and partially folded intermediates generated in the ligand binding-coupled RNA folding pathway.

[3-4]. 천연물 복합물 샘플에 대한 나노포어 기반 검출 확인[3-4]. Confirmation of Nanopore-Based Detection of Natural Product Complex Samples

리보스위치와 리간드의 상호작용을 나노포어로 검출함으로써 여러 성분의 천연물이 포함된 상태에서도 리보스위치와 리간드의 특이적 결합을 검출할 수 있음을 확인하였다.By detecting the interaction between the riboswitch and the ligand with nanopores, it was confirmed that the specific binding of the riboswitch and the ligand could be detected even in the presence of natural products of various components.

구체적으로, 아데닌의 부재 또는 존재 하에서 ARS에 결합하지 않는 비-결합 화합물 (MIX-3: ATP, (-)-에피카테킨 및 트라미프로세이트)의 혼합물을 이용하여 나노포어 측정을 수행하였다 (도 21). MIX-3은 타입 I 이벤트만 생성했으며 평균 I/I₀ 이 0.69 및 0.87이고 상대적으로 짧은 t_d (0.31ms)를 나타내었다. 이는 MIX-3이 ARS에 결합하여 삼차원적 구조변화를 유도하지 않음을 의미한다(도 21의 a).Specifically, nanopore measurements were performed using a mixture of non-binding compounds (MIX-3: ATP, (-)-epicatechin and tramiprosate) that do not bind ARS in the absence or presence of adenine (FIG. 21) ). MIX-3 generated only type I events, and showed a relatively short t _d (0.31 ms) with mean I/I ₀ of 0.69 and 0.87. This means that MIX-3 does not bind to ARS and induce a three-dimensional structural change (FIG. 21 a).

그러나 MIX-3에 아데닌을 첨가하면 타입 I 및 타입 II 이벤트가 혼합되어 나타났으며, 후자는 ARS 단독상태 보다 나노포어 체류 시간 (t_II, 2.52ms)이 ~ 6.6 배 더 증가하였다 (도 21의 c). However, when adenine was added to MIX-3, type I and type II events were mixed, and the latter increased the nanopore residence time (t _II , 2.52 ms) by ~6.6 times more than in the ARS alone state (Fig. c).

이로부터, 타입 II 통과 이벤트의 특징적인 깊은 전류 차단은 ARS에 대한 약물 결합을 식별하고 체류 시간을 늘리는 데 사용할 수 있음을 알 수 있다. 또한, ARS에 대한 아데닌의 특이적 결합은 여러 물질을 포함하는 복잡한 샘플에서도 나노포어에 의해 검출될 수 있음을 알 수 있다(도 21의 e).From this, it can be seen that the characteristic deep current block of type II transit events can be used to identify drug binding to ARS and increase the residence time. In addition, it can be seen that the specific binding of adenine to ARS can be detected by nanopores even in a complex sample containing several substances (FIG. 21 e).

<110> Korea Reasearch Institute of Bioscience and Biotechnology <120> METHOD AND TEST KIT FOR DETECTING PATHOGENIC MICROORGANISM USING NANOPORES <130> 2020-DPA-3905 <150> KR 10-2019-0138885 <151> 2019-11-01 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAV promoter <400> 1 aguagaaaca aggcuucggc cugcuuuugc u 31 <210> 2 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAVp-LL <400> 2 aguagaaaca aggguguuuu uuacccccuu ugucacccug cuuuugcu 48 <210> 3 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAVp-NS1 <400> 3 aguagaaaca aggaaaaaga aagaaaagaa aaacccugcu uuugcu 46 <210> 4 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAV promoter <220> <221> unsure <222> (14)..(16) <223> nnn is repeated mulitple times <400> 4 aguagaaaca aggnnnccug cuuuugcu 28 <210> 5 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS1 promoter <220> <221> unsure <222> (24)..(26) <223> nnn is repeated mulitple times <400> 5 aguagaaaca 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Claims (11)

나노포어를 포함하는 막(membrane)으로 나뉜 두 개의 구획 중 어느 일 구획에서 헤어핀 구조를 갖는 표적 ssRNA 서열을 포함하는 미생물이 존재할 것으로 예상되는 생물학적 시료 및 상기 미생물 유래의 헤어핀 구조를 갖는 표적 ssRNA와 결합할 수 있는 프로브를 반응시키는 단계; 및
상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함하고,
상기 프로브는 상기 헤어핀 구조를 갖는 표적 ssRNA 에 상보적으로 결합하여 상기 표적 ssRNA의 RNA/RNA 듀플렉스를 언지핑하는 핵산인 것인, 병원성 미생물을 검출하는 방법.A biological sample in which a microorganism containing a target ssRNA sequence having a hairpin structure is expected to exist in any one of two compartments divided by a membrane containing nanopores and a target ssRNA having a hairpin structure derived from the microorganism Binds to reacting a capable probe; and
In the two compartments divided by the membrane, measuring the change in electrical signal before and after the reaction;
The probe is a nucleic acid that complementarily binds to the target ssRNA having the hairpin structure and unzips the RNA/RNA duplex of the target ssRNA, the method of detecting a pathogenic microorganism. 나노포어를 포함하는 막(membrane)으로 나뉜 두 개의 구획 중 어느 일 구획에서 헤어핀 구조를 갖는 표적 ssRNA 서열을 포함하는 미생물이 존재할 것으로 예상되는 생물학적 시료 및 상기 미생물 유래의 헤어핀 구조를 갖는 표적 ssRNA와 결합할 수 있는 프로브를 반응시키는 단계; 및
상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함하고,
상기 프로브는 상기 헤어핀 구조를 갖는 표적 ssRNA에 특이적으로 결합하여 상기 헤어핀 구조를 안정화시키는 단백질, 펩티드 또는 화합물인 것인, 병원성 미생물을 검출하는 방법.A biological sample in which a microorganism containing a target ssRNA sequence having a hairpin structure is expected to exist in any one of two compartments divided by a membrane containing nanopores and a target ssRNA having a hairpin structure derived from the microorganism Binds to reacting a capable probe; and
In the two compartments divided by the membrane, measuring the change in electrical signal before and after the reaction;
The method of detecting a pathogenic microorganism, wherein the probe is a protein, peptide or compound that specifically binds to the target ssRNA having the hairpin structure to stabilize the hairpin structure. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 병원성 미생물은 바이러스 또는 박테리아인, 병원성 미생물을 검출하는 방법.The method according to claim 1 or 2,
The pathogenic microorganism is a virus or bacteria, the method of detecting a pathogenic microorganism. 삭제delete 청구항 1에 있어서,
상기 프로브는 서열번호 6 내지 서열번호 9의 서열로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 구성된 것인, 병원성 미생물을 검출하는 방법.The method according to claim 1,
The method of detecting a pathogenic microorganism, wherein the probe is composed of any one nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequence of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 9. 청구항 2에 있어서,
상기 프로브는 6,7-디메톡시-2-(1-피페라지닐)-4-퀴나졸린아민인, 병원성 미생물을 검출하는 방법.3. The method according to claim 2,
The method of detecting a pathogenic microorganism, wherein the probe is 6,7-dimethoxy-2-(1-piperazinyl)-4-quinazolinamine. 청구항 2에 있어서,
상기 프로브는 퓨린 계열의 저분자 화합물인, 병원성 미생물을 검출하는 방법.3. The method according to claim 2,
The probe is a low molecular weight compound of the purine series, a method of detecting a pathogenic microorganism. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 측정된 전기적 신호의 변화를 분석하여 전기적 신호의 변화가 유의미한 경우 시료 내 미생물이 존재하는 것으로 판단하는 단계;를 더 포함하는 병원성 미생물을 검출하는 방법.The method according to claim 1 or 2,
The method of detecting a pathogenic microorganism further comprising; analyzing the change in the measured electrical signal and determining that the microorganism is present in the sample when the change in the electrical signal is significant. 청구항 8에 있어서,
상기 전기적 신호는 전류 차단 세기(ΔI), 체류 시간(dwell time) 및 나노포어 이벤트 형태로 구성된 군에서 선택되는 것인 병원성 미생물을 검출하는 방법.9. The method of claim 8,
The electrical signal is a method for detecting a pathogenic microorganism that is selected from the group consisting of a current cut-off strength (ΔI), a dwell time (dwell time) and a nanopore event type. 나노포어를 포함하고, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane) 및
상기 막에 의해 나뉜 일 구획에 미생물 유래의 헤어핀 구조를 갖는 표적 ssRNA에 결합하도록 구성된 프로브를 포함하고,
상기 프로브는 상기 헤어핀 구조를 갖는 표적 ssRNA 에 상보적으로 결합하여 상기 표적 ssRNA의 RNA/RNA 듀플렉스를 언지핑하는 핵산인 것인, 병원성 미생물 검출용 키트.A membrane comprising nanopores, dividing the space in which the nanopores exist into two compartments; and
A probe configured to bind to a target ssRNA having a hairpin structure derived from a microorganism in one compartment divided by the membrane,
The probe is a nucleic acid that complementarily binds to the target ssRNA having the hairpin structure and unzips the RNA/RNA duplex of the target ssRNA, a kit for detecting pathogenic microorganisms. 나노포어를 포함하고, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane) 및
상기 막에 의해 나뉜 일 구획에 미생물 유래의 헤어핀 구조를 갖는 표적 ssRNA에 결합하도록 구성된 프로브를 포함하고,
상기 프로브는 상기 헤어핀 구조를 갖는 표적 ssRNA에 특이적으로 결합하여 구조를 안정화시키는 단백질, 펩티드 또는 화합물인 것인, 병원성 미생물을 검출하는 방법, 병원성 미생물 검출용 키트.A membrane comprising nanopores, dividing the space in which the nanopores exist into two compartments; and
A probe configured to bind to a target ssRNA having a hairpin structure derived from a microorganism in one compartment divided by the membrane,
The probe is a protein, peptide or compound that specifically binds to the target ssRNA having the hairpin structure and stabilizes the structure, a method for detecting a pathogenic microorganism, a kit for detecting a pathogenic microorganism.

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