KR102380832B1

KR102380832B1 - p32의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물

Info

Publication number: KR102380832B1
Application number: KR1020200094188A
Authority: KR
Inventors: 유승우; 구본혁
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2020-07-29
Filing date: 2020-07-29
Publication date: 2022-04-01
Also published as: KR20220014516A

Abstract

본 발명은 p32를 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물에 관한 것으로, 본 발명을 통해 파킨슨병으로 의심되는 환자군의 생물학적 시료로부터 p32 유전자 또는 단백질의 수준을 측정함으로써 파킨슨병의 예측 및 진단을 위한 유효한 정보로써 제공할 수 있다.

Description

p32의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물 {Composition for diagnosing Parkinson’s disease comprising an agent for determining level of p32}

본 발명은 p32의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물에 관한 것이다.

파킨슨병 (Parkinson's Disease; PD)은 떨림, 경직, 운동 완만 및 보행 이상증 등을 주된 증상으로 하는 질병으로, 뇌의 흑색질 (substantia nigra)과 선조체 (corpus striatum) 부위에서 도파민 (dopamine)이라는 신경전달물질이 부족하게 되어 생기는 만성질환이다. 상기 도파민은 뇌의 흑색질이라는 부위에서 생성되며, 운동 기능을 조절하는 매우 중요한 부위인 기저핵 (basal ganglia)의 기능을 조절하기 위하여 분비되는 물질이다. 파킨슨병 환자는 대략 60세 이상에서 인구의 약 1% 정도로 추정된다.

파킨슨병의 원인은 정확히 밝혀져 있지 않지만 유전적 인자와 환경적 인자가 서로 상호작용하여 일어난다는 '다인성 가설'이 가장 보편적으로 받아들여지고 있다. 파킨슨병은 산발성 파킨슨병과 가족성 파킨슨병으로 나뉘며, 약 10% 정도가 가족성 파킨슨병으로 나타나고 있다. 특히 파킨슨병을 유발하는 다양한 유전적 요인 중에서 파킨 (Parkin) 유전자의 돌연변이에 의한 파킨슨병 환자가 가장 많이 나타났다.

파킨 (Parkin) 단백질은 세포 내부에 있는 손상되고, 산화되고/되거나 불규칙하게 구조화된 단백질을 제거하여 세포에서 산화 스트레스를 감소시키는 기능을 한다. 이러한 기능과 관련하여 손상된 미토콘드리아를 제거하고 알파시누클레인이 쌓이는 것을 막는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 파킨 유전자의 돌연변이가 발생하면 그것은 E3-라이게이즈로서의 특성을 상실하며; 봉입체 및/또는 불규칙 단백질이 세포 내부에 축적되어 도파민의 분비 감소 및 도파민성 신경세포의 세포자멸사를 유도한다. 파킨슨병에 관한 연구에서, 파킨 (Parkin)과 PINK1 (PTEN-induced kinase 1)의 기능이 밝혀진 도파민성 신경세포의 불활성화로 인해 도파민의 분비가 감소하였으며, PINK1을 발현하지 않은 초파리에서 파킨이 과발현되었을 때, 미토콘드리아 기능 장애 및 도파민성 신경세포의 분해와 같은 PINK1에 의해 유발되는 파킨슨병 관련 증상은 회복된 것으로 확인되었다. 이러한 연구결과는 파킨 단백질이 파킨슨 관련 질환과 밀접한 관련이 있다는 것을 의미한다. 더구나 산화질소에 의한 파킨 단백질 변형 정도는 파킨슨병을 가지지 않은 사람들보다 파킨슨병을 가진 환자의 뇌에서 2-3배 높게 나타났다.

이에, 본 발명자들은 p32 단백질과 파킨슨병 간의 연관성을 연구하던 중, 미토콘드리아 내 p32 단백질 수준이 파킨 단백질과 강력한 연관이 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국등록특허 제10-2061924호

본 발명의 목적은 p32 유전자, 단백질 또는 단백질을 구성하는 펩타이드 수준을 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 파킨슨병 진단용 조성물을 포함하는 파킨슨병 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

이어서, 본 발명의 다른 목적은 파킨슨병의 예측 및 판단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.

마지막으로, 본 발명의 다른 목적은 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 p32 유전자, 단백질 또는 단백질을 구성하는 펩타이드 수준을 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 파킨슨병 진단용 조성물을 포함하는 파킨슨병 진단용 키트를 제공한다.

이어서, 생물학적 시료로부터 p32 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 1단계; 및, 상기 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료로부터의 상기 유전자 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 2단계를 포함하는 파킨슨병의 예측 및 판단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

마지막으로, 파킨슨병 환자로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 1단계; 및, 상기 후보 약물이 처리된 시료에서 p32 유전자의 활성 또는 단백질의 발현 정도를 분석하는 2단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 p32 단백질은 파킨슨병과 밀접한 관련이 있는 파킨 (Parkin) 단백질에 의해 분해가 유도되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명을 통해 파킨슨병으로 의심되는 환자군의 생물학적 시료로부터 p32 유전자 또는 단백질의 수준을 측정함으로써 파킨슨병의 예측 및 진단을 위한 유효한 정보로써 제공할 수 있다.

도 1은 아르기나아제Ⅱ (ArginaseⅡ) 및 파킨 (Parkin) 단백질 돌연변이에 따른 p32 단백질의 웨스턴 블롯(Western blot) 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 p32 돌연변이에 따른 파킨 단백질의 p32 단백질 분해 여부를 나타낸 사진이다.
도 3은 p32 돌연변이에 따른 활성산소 생성량을 비교한 그래프이다.

본 발명자들은 퇴행성 신경질환 중 하나인 파킨슨병의 정확한 초기 진단 방법에 대하여 연구하던 중, 파킨슨병과 밀접한 연관이 있는 파킨 (Parkin) 단백질에 의해 p32 단백질의 분해가 유도된다는 것을 확인하고, p32 단백질이 파킨 단백질에 의해 분해되지 않는 경우, 파킨슨병의 기전으로 제시되는 산화적 스트레스와 미토콘드리아의 손상이 일어나는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “파킨슨병 (Parkinson's disease)”은 뇌의 흑질 (substantia nigra)에 분포하는 도파민의 신경세포가 점차 소실됨으로써 신경이 퇴화 (degeneration)되는 질환으로서, 안정떨림, 경직, 운동완만 (운동느림) 및 자세 불안정성이 특징적으로 나타나는 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환이다. 이러한 파킨슨병의 원인은 아직까지 밝혀지지 않고 있어, 파킨슨병을 예측 또는 판단하는데 어려움이 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다. 본 발명의 목적상 진단은 파킨슨병의 발병 여부 또는 파킨슨병의 발병 단계를 확인하는 것이다.

본 발명은 p32 유전자, 단백질 또는 단백질을 구성하는 펩타이드 수준을 측정하는 제제를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 p32 단백질은 파킨 (parkin) 단백질과 상호작용하는 기능을 가지는 전체 또는 일부 펩타이드로 구성될 수 있으며, 상기 p32 단백질의 기능적 동등물 및 변이체를 포함한다.

또한, 상기 p32 단백질을 구성하는 펩타이드는 p32 단백질의 단편을 의미하는 것으로, 파킨 (parkin) 단백질과 상호작용하는 기능을 가지는 p32 단백질을 구성하는 펩타이드라면 제한되지 않고 포함된다.

또한, 상기 단백질의 기능적 동등물이란, 단백질 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드를 포함하는 것으로 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 단백질이 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 변이체란, p32 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 예를 들면 상기 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 것, 상기 아미노산 서열과 95 ％ 이상, 바람직하게는 98 ％ 이상, 보다 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성을 갖는 것 등을 말한다. 여기서 "동일성"이란, 2개의 아미노산 서열에 갭을 도입하거나, 도입하지 않고 가장 높은 일치도가 되도록 정렬시켰을 때에, 상기 갭의 수를 포함한, 한쪽 아미노산 서열의 전체 아미노산 잔기수에 대한 다른 쪽의 아미노산 서열의 동일한 아미노산 잔기수의 비율(％)을 말한다. 또한, "수개"란, 2 내지 10의 정수, 예를 들면 2 내지 7, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3의 정수를 말한다. 천연 변이체의 구체예로는 SNP(일염기 다형) 등 의 다형에 기초하는 변이체나 스플라이스 변이체 등을 들 수 있다. 상기 치환은 보존적 아미노산 치환인 것이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환이면, 상기 아미노산 서열을 갖는 p32와 실질적으로 동등한 구조 또는 성질을 가질 수 있기 때문이다. 보존적 아미노산이란, 서로 비극성 아미노산 (글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 트립토판) 및 극성 아미노산 (비극성 아미노산 이외의 아미노산), 하전 아미노산 (산성 아미노산 (아스파라긴산, 글루탐산) 및 염기성 아미노산 (아르기닌, 히스티딘, 리신)) 및 비하전 아미노산 (하전 아미노산 이외의 아미노산), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판, 티로신), 분지상 아미노산 (류신, 이소류신, 발린) 및 지방족 아미노산 (글리신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린) 등이 알려져 있다.

또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

또한, 상기 유전자 수준을 측정하는 제제는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 유전자 수준의 측정은 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석 (RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 질량분석법 (Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 단백질 또는 단백질을 구성하는 펩타이드 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 단편 펩타이드에 특이적인 항체, 안티센스 RNA (antisense RNA), 앱타머 (Aptamer) 및 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 p32 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

또한, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 상기 다클론 항체는 당업자에 알려진 방법에 따라 면역원으로 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조할 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양 또는 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제 (adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리 정제한다.

또한, 상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자에 의해 발현된 단백질을 마우스에 면역화 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화 시킨다. 마우스에서 분리된 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종 (myeloma)과 융합하여 불멸화된 하이브리도마 (hybridoma)를 생성하며, 상기 하이브리도마 세포를 가지고 간접적인 효소 결합면역흡착 분석법 (enzyme-linked immunoabsorbent assays, ELISA)을 사용하여 모노클노날 항체의 생성 여부를 확인하고 양성 클론을 택하여 배양한 후 항체를 분리정제하거나 랫트의 복강에 주입한 후 복수를 채취함으로써 단일클론 항체를 제조할 수 있다.

또한, 상기 단백질 수준의 측정은 웨스턴 블롯, 엘라이자 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이어서, 본 발명은 상기 파킨슨병 진단용 조성물을 포함하는 파킨슨병 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에서 용어 "키트"는 p32 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 p32 단백질을 인지하는 항체, 안티센스 RNA, 앱타머 또는 화합물뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

아울러, 본 발명은 생물학적 시료로부터 p32 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및, 상기 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료로부터의 상기 유전자 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 파킨슨병의 예측 및 판단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 생물학적 시료는 파킨슨병 환자로부터 분리된 조직, 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 방법은 생물학적 시료의 p32 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군보다 높을 경우 파킨슨병으로 예측 및 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 정상 대조군은 파킨슨병으로 진단되지 않은 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 의미하며, 정상인 개체로부터 분리된 시료와 파킨슨병의 진단을 예측하고자 하는 개체로부터 분리된 시료에서 상기 단백질의 항체, 안티센스 RNA 또는 앱타머 수준을 비교하여 파킨슨병 발병이 의심되는 개체의 파킨슨병 발병 여부를 정확하게 예측할 수 있다.

상기 생물학적 시료의 p32 유전자 또는 단백질 발현 수준이 정상 대조군의 p32 유전자 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 유의적으로 높으면 파킨슨병이 발병했거나 발병할 위험이 높은 것으로 예측할 수 있다.

또한, 상기 방법은 정상 대조군의 미토콘드리아 내 p32 유전자 또는 단백질에 대한 생물학적 시료의 상대 강도 (relative intensity)가 1.5 내지 2.5 일 때, 파킨슨병이 발병했거나 발병할 위험이 높은 것으로 예측 또는 판단하는 것일 수 있다.

상기 상대 강도 (relative intensity) 는 p32 유전자 또는 단백질의 상대적인 발현 수준을 나타낸다.

마지막으로, 본 발명은 파킨슨병 환자로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 및, 상기 후보 약물이 처리된 시료에서 p32 유전자의 활성 또는 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 상기 후보 약물은 새롭게 합성된 또는 공지된 화합물로 파킨슨병의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질을 제한 없이 포함한다.

또한, 상기 유전자의 활성은 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석 (RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 질량분석법 (Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 단백질의 발현은 웨스턴 블롯, 엘라이자 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 파킨슨병 동물모델에 파킨슨병 치료제 후보 약물을 투여하여 파킨슨병 증상 (예를 들어, 도파민 신경 감소, 뇌신경 염증, 각 조직의 증가된 LPS 수준, 알파-시누클레인의 축적 (또는 증가) 또는 운동능력의 소실 (또는 손상) 등)의 완화가 관찰되면, 해당 약물이 파킨슨병의 예방 또는 치료에 효과가 있는 물질로 판단한다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.

<실시예 1> 재료 및 방법

1-1. 세포 배양

인간 탯줄 정맥 내피세포 (HUVEC)는 탯줄을 plastic two-way valve로 묶고 Type II collagenase (250 units/ml in PBS)를 주입하여 세포를 회수하였다. 이를 성장배지 (20% FBS, 1X penicillin/streptomycin, 5 units/ml heparin, 6 ng/ml bFGF in M199 medium)로 현탁시켜 100 mm 배양접시에 분주하고 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다.

1-2. 실험 동물

본 실험은 강원대학교 기관생명윤리위원회(Institutional Review Board)의 승인 하에 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침에 따라 수행되었다.

혈관 내피세포 특이적으로 p32 유전자가 적중된 생쥐를 이용하였다. 유전자 배경은 C57BL/6J이고 Tie 프로모터를 이용하여 제작되었고, 재조합 단백질인 Cre 유전자에 의해 재조합이 일어나면 p32 유전자의 적중이 일어난다.

p32 flox/flox 유전자를 갖는 마우스와 tie Cre 유전자를 갖는 마우스를 교배시켜 p32 flox/- Cre+ 마우스를 얻었고 이를 다시 교배 시켜 p32 flox/flox Cre+ 마우스를 제작하였다. 제작된 마우스는 내피세포 특이적으로 Cre recombinase가 발현되어 p32 유전자가 결손 되어있는 것을 확인하였다.

1-3. 웨스턴 블롯 (Westurn blot) 분석

세포 추출과 조직 추출은 SDS-PAGE를 이용하여 모으고, NIH Image J를 사용하여 밴드의 농도계를 분석하였다.

1-4. 활성산소 (reactive oxygen species, ROS) 측정

생쥐의 대동맥을 분리한 뒤 2% fetal bovine serum (FBS)과 1X P/S (penicillin/streptomycin)를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium에서 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간 동안 배양하였다. 형광현미경의 heating block의 온도를 34.5°C로 설정하여 미리 예열시킨 뒤, HEPES buffer (NaCl 7.92 g, KCl 0.44 g, MgCl2 0.12 g, HEPES 2.77 g, glucose 2.07 g (pH7.4), CaCl2 0.25 g, 증류수 1 L)를 채운 dish에 혈관을 펼쳐 고정시켰다. 이 후 활성산소 (ROS) 측정을 위해, dihydroethidium (DHE, 5 uM)을 처리한 뒤 DHE (470/580 nm) 파장에서 intensified camera (Luca 658M-TL)와 custom image acquisition program(Cell software, Olympus)를 이용하여 형광 값을 결정하였다. 활성산소 (ROS) 측정 시 MnTBAP (10-5 mol/L)을 처리하여 형광 값을 측정하여 대조군으로 사용하였으며, 형광값 변화량은 선형 회기분석 (version7.5, OriginLab Corp, Northampton, MA)을 통해 결정하였다.

1-5. 미토콘드리아 분획 (fractionation)

세포를 준세포분획(subcellular fraction) 버퍼용액 [250 mM sucrose, 20 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, protease inhibitors(Roche Co.)] 에서 3분 동안 2회 파쇄하고, 1000g에서 10분동안 원심분리하여 세포의 잔재와 파쇄되지 않은 세포들을 제거하였다. 상층액은 21000g로 45분동안 4℃에서 원심분리 하였고, 20μg 단백질을 포함하는 세포질과 미토콘드리아 분획은 웨스턴 블롯 (Westernblot)에 사용하였다.

<실시예 2> 파킨 단백질에 의한 p32 단백질의 분해

2-1. 파킨 단백질의 p32 단백질 분해

파킨 단백질에 의해 p32 단백질이 분해되는 것을 확인하기 위해 미토콘드리아 (mitochondria) 및 세포기질 (cytosol)에서 아르기나아제Ⅱ (ArginaseⅡ) 및 파킨 (Parkin) 단백질 돌연변이 시킨 후 p32 단백질 수준을 측정하였다. p32 단백질의 아미노산 서열은 표 1에 나타내었다.

아르기나아제Ⅱ (ArginaseⅡ), PINK1 (PTEN-induced kinase 1) 및 파킨 (Parkin) 단백질에 대한 유전자에 대한 siRNA를 제작하고 이를 직접 HUVEC에 처리하였다. 아르기나아제Ⅱ 항체, PINK1 항체 (Cat. No. #PA5-13402, invitrogen), 파킨 항체 (Cat. No. ab15494, abcam), p32 항체 (Cat. No. ab101267, abcam), HSP60 항체 및 액틴 (Actin) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석을 수행하였다. 본 발명에서 사용한 siRNA는 하기 표 2에 나타내었다. p32 단백질에 대한 상대 강도 (relative intensity)는 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1은 아르기나아제Ⅱ (ArginaseⅡ) 및 파킨 (Parkin) 단백질 돌연변이에 따른 p32 단백질의 웨스턴 블롯(Western blot) 결과를 나타낸 사진이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 아르기나아제Ⅱ (ArginaseⅡ) siRNA는 미토콘드리아 및 세포기질 모두에서 p32 단백질을 유도하였다. 그러나 PINK1 (PTEN-induced kinase 1) siRNA와 파킨 (Parkin) siRNA를 이용하여 이를 돌연변이 시킨 경우 아르기나아제Ⅱ (ArginaseⅡ) siRNA에 의해 감소되었던 p32 단백질 수준을 다시 상승시키는 것을 확인하였다. 또한, PINK1 (PTEN-induced kinase 1) 과 파킨 (Parkin)은 손상된 미토콘드리아를 식별하고 파괴하여 미토콘드리아의 품질 관리와 밀접하게 연관된 단백질로서 이의 유전자 또는 단백질의 돌연변이는 파킨슨병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 파킨슨병이 유발된 PINK 1 또는 파킨 (Parkin) 단백질 양을 siRNA로 저하시킨 경우 실험군에서 미토콘드리아 내 p32 단백질의 상대 강도 (relative intensity)는 각각 1.9, 2.1, 1.9로 나타났으며 정상 대조군에 비해 p32 단백질 수준이 유의적으로 증가한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 파킨 단백질에 의해 p32 단백질이 분해되었으며, 파킨 단백질과 밀접하게 관련이 있는 p32 유전자 또는 단백질의 수준을 측정하여 파킨슨병을 예측 또는 판단하는데 유용하게 사용될 수 있다는 것을 의미한다.

Protein	Sequence
p32	MLHTDGDKAF VDFLSDEIKE ERKIQKHKTL PKMSGGWELE LNGTEAKLVR KVAGEKITVT FNINNSIPPT FDGEEEPSQG QKVEEQEPEL TSTPNFVVEV IKNDDGKKAL VLDCHYPEDE VGQEDEAESD IFSIREVSFQ STGESEWKDT NYTLNTDSLD WALYDHLMDF LADRGVDNTF ADELVELSTA LEHQEYITFL EDLKSFVKSQ

name	target	sequence
sip32	p32	TGT CTC CGT CGG TGT GCA GC
siparkin	parkin	UUU ACA GAG AAA CAC CUU GUC AAU
siparkin	parkin	CCG ACU CUC UCC AUC AGA AGG GUU
siPINK 1	PINK 1	AAG GAU GUU GUC GGA UUU
siPINK 1	PINK 1	UUC AUA GGC GAU GGC UCC

2-2. p32 돌연변이에 따른 파킨 단백질의 p32 단백질 분해

파킨 단백질에 의해 p32 단백질의 분해가 유도되는지 확인하기 위해 p32를 돌연변이 시켜 파킨 (Parkin) 단백질 유무에 따른 p32와 유비퀴틴의 결합여부를 알아보았다.

p32 단백질 서열 중 154, 220번 리신 (lysine) 잔기를 아르기닌 (arginine) 으로 치환된 플라스미드를 제작하였고 정상 p32 plasmid, 돌연변이 p32 plasmid를 HUVEC에 처리하였다. 돌연변이가 유도된 p32 단백질은 Flag 꼬리표를 가진다. p32 항체 또는 Flag에 대한 항체를 이용하여 p32 단백질에 대한 면역 침강을 수행하고, SDS-PAGE 방법으로 단백질을 분리한 다음, ubiquitin에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 (Westurn blot) 분석을 수행하였다. 파킨 단백질에 의해 유비티퀸화 (ubiquitination)가 유도되는지를 웨스턴 블롯 분석을 통해 대조군과 비교하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2는 p32 돌연변이에 따른 파킨 단백질의 p32 단백질 분해 여부를 나타낸 사진이다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 정상 p32 단백질은 파킨 단백질에 의해 유비퀴틴 (Ubiquitin)과 결합하여 분해되는 것을 확인하였다. 그러나 p32 단백질에 대하여 돌연변이를 유도한 경우, 그렇지 않은 경우와 비교하여 p32 단백질은 파킨 단백질에 의해 유비퀴틴화 되지 않아 분해되지 않은 것을 확인하였다. 이러한 결과는 파킨 단백질에 의해 p32 단백질이 분해된다는 것을 의미하고, p32 유전자 또는 단백질의 수준을 측정하여 파킨슨병을 예측 또는 판단하는데 유용하게 사용될 수 있다는 것을 의미한다.

<실시예 3> p32 단백질이 활성산소 생성량에 미치는 영향

p32 단백질이 활성산소 생성량에 미치는 영향을 확인하기 위해 마우스에 p32를 적중하여 활성산소 생성량을 측정하였다.

내피세포 특이적으로 p32가 결여된 실험 생쥐의 대동맥 세포를 분리하고, 활성산소에 대한 형광염색약인 DHE를 사용하여 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry) 후 Clara digital camera (Andor Technol)가 연결된 형광현미경 (Olympus)을 사용하여 활성산소 생성을 분석하였다. MnTBAP는 활성산소 제거제로 양성대조군으로 사용하였다.

그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3은 p32 돌연변이에 따른 활성산소 생성량을 비교한 그래프이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, p32 유전자적중 마우스 (knockout mouse)에서 활성산소 생성량을 측정한 결과, p32가 돌연변이 되지 않은 야생형 마우스와 비교하여 활성산소의 생성량이 약 50 % 정도 감소한 것을 확인하였다. 산화적 스트레스는 파킨슨병의 여러 기전 중 하나로, 이러한 결과는 p32 단백질이 파킨 단백질 또는 PINK 1 단백질에 의해 분해되지 않는 경우 파킨슨병을 유발할 수 있다는 것을 의미하고, p32 유전자 또는 단백질의 수준을 측정하여 파킨슨병을 예측 또는 판단하는데 유용하게 사용될 수 있다는 것을 의미한다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

p32 유전자, 단백질 또는 단백질을 구성하는 펩타이드 수준을 측정하는 제제를 포함하는, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 수준을 측정하는 제제는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질 또는 단백질을 구성하는 펩타이드 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩타이드에 특이적인 항체, 안티센스 RNA 또는 앱타머를 포함하는 것인, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 수준의 측정은 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석 (RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 질량분석법 (Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되는 것인, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질 또는 단백질을 구성하는 펩타이드 수준의 측정은 웨스턴 블롯, 엘라이자 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되는 것인, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병 진단용 조성물.
제1항의 파킨슨병 진단용 조성물을 포함하는 파킨슨병 진단용 키트.
생물학적 시료로부터 p32 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및,
상기 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료로부터의 상기 유전자 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병의 예측 및 판단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 파킨슨병 환자로부터 분리된 조직, 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 군에서 선택된 것인, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병의 예측 및 판단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 방법은 생물학적 시료의 p32 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료보다 높으면 파킨슨병으로 예측 및 판단하는 단계를 추가로 더 포함하는, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병의 예측 및 판단을 위한 정보를 제공하는 방법.
파킨슨병 환자로부터 분리된 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 및,
상기 후보 약물이 처리된 시료에서 p32 유전자의 활성 또는 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제10항에 있어서, 상기 유전자의 활성은 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석 (RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 질량분석법 (Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되는 것인, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제10항에 있어서, 상기 단백질의 발현은 웨스턴 블롯, 엘라이자 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되는 것인, PINK 1(PTEN-induced kinase 1) 및 파킨(Parkin) 단백질의 발현이 감소되어 발생한 파킨슨병 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.