KR102377500B1 - 외래 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 도입된 L-메티오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-메티오닌 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 metZ 유전자가 도입된 L-메티오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-메티오닌 생산방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 외래 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 도입된 L-메티오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-메티오닌 생산방법에 관한 것이다.
L-메티오닌 (L-methionine)은 생체내의 필수 아미노산의 한 종류로서, 사료, 수액제, 의약품의 합성 원료 등 의약 원료 및 식품 첨가제로 사용된다. 메티오닌은 생체 내에서 메틸기 전이 반응에 관여하는 중요한 아미노산이며, 황을 제공하는 역할을 한다.
메티오닌의 화학합성은 주로 5-(β-메틸머캅토에틸)하이단토인 (5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)을 가수분해시키는 반응을 통하여, L-형과 D-형이 혼합된 형태로 메티오닌을 생산하는 방법이 이용되고 있다. 그러나, 상기 화학합성은 L-형과 D-형이 혼합된 형태로 생산된다.
한편, 생물학적 방법을 이용하여 L-메티오닌을 생산할 수 있다. 보다 구체적으로 미생물이 L-메티오닌을 생산하는 방법 중 하나는 O-아실 호모세린 (O-아세틸 호모세린 또는 O-석시닐 호모세린) 및 황화수소(hydrogen sulfide)를 기질로 사용하는, 다이렉트 설프하이드릴레이션에 의해 메티오닌을 생산하는 것이다. 예를 들면, 코리네형 미생물 내 metY 유전자가 코딩하는 효소가 다이렉트 설프하이드릴레이션 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 미생물이 L-메티오닌을 생산하는 다른 방법은 O-아실 호모세린 (O-아세틸 호모세린 또는 O-석시닐 호모세린) 및 시스테인을 기질로 사용하는 트랜스 설퓨레이션에 의해 메티오닌을 생산하는 것이다. 예를 들면, 코리네형 미생물 내 metB 유전자가 코딩하는 효소가 트랜스 설퓨레이션 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 다만, metB 가 코딩하는 효소는 부산물을 많이 생성시키고, metY 유전자는 피드백 저해를 받는다는 단점이 존재하여, 산업적으로 L-메티오닌을 대량 생산하기 위해 적용하기는 어려운 실정이다(Kromer JO et al., J Bacteriol 188(2):609-618, 2006, Yeom HJ et al., J Microbiol Biotechnol 14(2): 373-378, 2004 외).
이에 본 발명자들은 상기 단백질을 대체할 수 있는 단백질을 발굴하고자 예의 노력한 끝에 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 도입한 미생물이 L-메티오닌을 고수율로 생산함을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 목적은 외래 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 도입한, L-메티오닌 생산 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 미생물을 티오설페이트를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는 L-메티오닌 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 미생물 및 티오설페이트를 포함하는 L-메티오닌 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 하나의 양태는 외래 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 도입된 L-메티오닌 생산 미생물을 제공한다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 L-메티오닌 생산 미생물을 티오설페이트를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, L-메티오닌 제조방법을 제공한다.
본 출원의 용어 'metZ 유전자' 는, 아실호모세린을 기질로 설프하이드레이션(sulfhydration)에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자이다.
본 출원에서 "아실호모세린"은 호모세린(homoserine)에 아실기(acyl)가 결합한 화합물을 의미하며, 숙시닐호모세린 및 아세틸호모세린을 모두 포함한다. 일 예로, 상기 아실호모세린은 O-숙시닐호모세린 또는 O-아세틸호모세린일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 상기 metZ 유전자가 코딩하는 효소는 숙시닐호모세린 설프히드릴라아제(succinylhomoserine sulfhydrylase), 아세틸호모세린 설프히드릴라아제(acetylhomoserine sulfhydrylase), 또는 O-숙시닐호모세린을 기질로 설프하이드레이션에 관여하는 효소를 코딩하는 것으로 알려진 유전자일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "설프하이드레이션(sulfhydration)"은 용어 "설프하이드릴레이션(sulfhydrylation)"과 상호교환적으로 사용되며, 설프하이드릴(-SH)작용기를 특정 분자에 제공하는 반응을 의미한다. 상기 용어는 본 출원의 목적상 메티오닌 합성과정에서의 반응을 의미하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 "설프하이드레이션" 에 관여하는 효소는 "설프히드릴라아제(sulfhydrylase)" 로 명명할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
종래에 메티오닌 발효반응에 있어서 metZ 유전자가 발현하는 효소는, in vitro 내 아래와 같은 반응에 사용되었다:
CH3SH + O-아세틸-L-호모세린 => 아세테이트 + 메티오닌
CH3SH + O-석시닐-L-호모세린 => 석시네이트 + 메티오닌
즉, 미생물을 이용하여 메티오닌 전구체를 제조하는 1단계; 및 메티오닌 전구체를 포함하는 발효액에 메칠머캅탄 및 메티오닌 전환 효소를 첨가하여 in vitro에서 효소반응을 수행하는 2단계의 반응으로 포함하는 메티오닌 제조방법에 있어서, metZ 유전자가 발현하는 효소는 in vitro 에서 메티오닌 전환효소로 사용되었었다 (한국등록특허 KR10-0905381 참조)
한편, 코리네박테리움 속 미생물에서의 메티오닌 발효는 두 종류의 설프하이드레이션 경로(sulfhydrylation step)를 사용한다. (Hwang BJ et al., J Bacteriol 184(5):1277-1286, 2002) 하나는 metB 라는 유전자에 의해 코딩되는 효소를 이용하여, O-아세틸호모세린(acetyl homoserine: AH)를 시스타티오닌(cystationine)으로 전환하는 것으로서, 이 경우에 시스테인(cysteine)을 황원으로 사용한다. 즉 아실호모세린과 시스테인을 반응물로 하여 시스타티오닌으로 전환하는 반응을 "트랜스설퓨레이션(transsulfuration)"이라 지칭하며, 이에 관여하는 효소를 "트랜스설퓨레이즈(transsulfurase)"라고 명명하기도 한다. 다른 하나는 metY라는 유전자에 의해 코딩되는 효소를 이용해서 O-아세틸 호모세린을 호모시스테인(homocysteine)으로 전환하는 것으로서, 이 경우에 하이드로겐 설파이드(hydrogen sulfide) 등 무기(inorganic) 황 화합물을 황원으로 사용한다. 이와 같이 아실호모세린과 하이드로겐 설파이드를 반응물로 하여 호모시스테인으로 전환하는 반응은, 전술한 트랜스설퓨레이션과 달리 메티오닌의 전구체인 호모시스테인이 생성되는 과정에서 중간산물인 시스타티오닌이 생성되지 않으므로, 이를 다이렉트 설프하이드레이션(direct sulfhydrylation)이라 지칭한다.
즉, 상기 설프하이드레이션 경로는 아실호모세린과 황원의 반응을 통해 다른 물질로 전환하는 반응 경로를 의미할 수 있고, 크게 트랜스설퓨레이션과 다이렉트 설프하이드레이션으로 나눌 수 있다.
하지만 코리네박테리움 균주에서 상기 설프하이드레이션에 관여하는 두 효소 모두 단점을 가지고 있다. 예를 들면 metB유전자에 의해 코딩되는 단백질은 시스타티오닌 이외에, 아세틸호모세린과 호모시스테인을 이용해서 호모란티오닌(homolanthionine) 이라는 부산물을 생성한다 (Kromer JO et al., J Bacteriol 188(2):609-618, 2006) 또한, metY 유전자는 메티오닌에 의해 피드백 저해(feedback inhibition)를 많이 받는다고 알려져 있다 (Yeom HJ et al., J Microbiol Biotechnol 14(2): 373-378, 2004).
본 출원은 상기 외래 metZ 유전자를 코리네박테리움 균주에 도입하여, 단일단계 반응만으로 메티오닌을 생물학적으로 제조하는 데에 상기 metZ 유전자 도입이 메티오닌 발효에 유용하게 사용될 수 있음을 규명한 것에 특징이 있다.
본 출원의 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 관여하는 메티오닌 합성 경로에서는 부산물 생성량이 감소될 수 있다. 상기 부산물은 호모란티오닌일 수 있다. 상기 부산물 생성량의 감소는, 야생형 미생물에 비해, 또는 metB에 의해 코딩되는 단백질이 관여하는 합성 경로에서의 부산물 생성량과 비교하여 감소된 것을 의미할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 출원의 외래 metZ 유전자가 도입된 미생물 및 이를 배양하는 것을 포함하는 메티오닌 생산 방법은, 외래 metZ 유전자가 도입되지 않은 메티오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 메티오닌 생산 방법에 비해 부산물 생성량이 감소된 것일 수 있다. 본 출원의 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 메티오닌에 의해 피드백 저해를 받지 않는 것일 수 있다.
본 출원의 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 O-아실호모세린 설프히드릴라아제(acylhomoserine sulfhydrylase)로서, 하이드로겐 설파이드(hydrogen sulfide)를 황원으로 사용할 수 있을 뿐 아니라, O-아실호모세린 트랜스설퓨레이즈(acylhomoserine transsulfurase)로서, cysteine을 황원으로 사용할 수 있는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 단백질은, O-아세틸호모세린 설프히드릴라아제, O-아세틸호모세린 트랜스설퓨레이즈, O-석시닐호모세린 설프히드릴라아제 또는 O-석시닐호모세린 트랜스설퓨레이즈일 수 있다. 따라서 본 출원에서 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질은, O-아실호모세린 설프히드릴라아제 활성을 갖는 단백질일 수 있고, 구체적으로, O-아세틸호모세린 설프히드릴라아제, O-아세틸호모세린 트랜스설퓨레이즈, O-석시닐호모세린 설프히드릴라아제 및 O-석시닐호모세린 트랜스설퓨레이즈 중 1 이상의 활성을 갖는 단백질 일 수 있다.
일 예로, 본 출원의 외래 metZ 유전자는, 상기 유전자가 도입되는 L-메티오닌 생산 미생물과는 상이한 유래의 유전자이거나, 또는 상기 유전자가 도입되는 L-메티오닌 생산 미생물에 내재적으로 존재하는 유전자와 상이한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자는 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium violaceum), 하이호모나스 넵튜니윰 (Hyphomonas neptunium) 또는 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 유래의 metZ로 명명된 유전자일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 본 출원의 목적상 상기 유전자는 L-메티오닌 생산능을 강화할 수 있는 것이면 제한되지 않고 어느 것이든 포함될 수 있다. 상기 metZ 유전자는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있으며, 해당 서열을 확보하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법이 적용 가능하다.
본 출원에서 외래 metZ에 의해 코딩되는 단백질은 서열번호 60, 61 및 62 중 어느 하나의 폴리펩티드 서열 및 이와 90% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열(폴리펩티드 서열)을 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 단백질은 서열번호 60, 61 및 62 중 어느 하나의 폴리펩티드 서열과 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 97.7%, 97.8%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.8% 또는 그 이상 100% 미만 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있고, 일 예로 서열번호 66 내지 71 중 어느 하나의 폴리펩티드 서열 및 이와 90% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열 중에서 선택되는 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 metZ 유전자는 서열번호 63, 64 및 65 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열과 90% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자는 서열번호 63, 64 및 65 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열과 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 97.7%, 97.8%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 99%, 99.5%, 99.7%, 99.8% 또는 그 이상 100% 미만 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 가닥이다.
본 출원에서 metZ 유전자가, 서열번호 63, 64 및 65 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질, 또는 서열번호 60, 61 및 62 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 상응하는 효과를 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우라면, 상기 서열의 일부가 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 metZ 유전자는, 상기 서열번호 60, 61 및 62 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부, 예를 들어 1 내지 20개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 다른 구현예로, 상기 metZ 유전자는, 상기 아미노산 서열의 앞뒤로 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개 또는 11개 이하의 아미노산 서열이 부가된 서열을 코딩하는 서열일 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 metZ 유전자는 전술한 치환 및 부가를 모두 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 서열 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드도 제한 없이 포함될 수 있다.
즉, 본 출원에서 특정 서열번호의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 특정 서열번호의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 특정 서열번호의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 기재되어 있다고 하더라도, 상기 서열번호의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 염기서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 본 출원의 범위에 포함되는 것은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다.
상동성(homology) 및 동일성(identity)은 두 개의 주어진 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 도입하고자 하는 미생물 내에 자연적으로 존재하는 서열이 아니면서 L-메티오닌 생산능을 증가시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 여러 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)에 구체적으로 기재되어 있고, 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 용어 "단백질의 도입"은 특정 단백질 활성이 없는 미생물에 단백질의 활성이 도입되는 것을 의미한다. 이는 특정 단백질 활성이 없는 미생물에서의 단백질의 활성 강화로도 표현할 수 있다.
상기 단백질의 도입은, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 도입된 단백질의 활성 강화는,
1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는
4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터에 본원의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가시키는 방법으로 수행될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터(대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO2006/065095), lysCP1 프로모터(WO2009/096689), spl1 프로모터, spl7 프로모터, spl13 프로모터 (대한민국 등록특허 제1783170호) EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
마지막으로, 상기 방법들의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 도입된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체에 삽입된 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
본 출원의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 도입할 수 있도록, 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 목적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 출원의 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
본 출원의 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 출원의 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어 "L-메티오닌 생산 미생물"은, 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-메티오닌 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물일 수 있다.
본 출원의 목적상, 상기 L-메티오닌 생산 미생물은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물보다 L-메티오닌 생산능이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 '비변형 미생물'은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 미생물 자체이거나, 야생형 미생물 자체이거나, 또는 L-메티오닌 생합성 경로에 관여하는 유전자의 발현량이 조절되기 전의 미생물일 수 있으며, 또는, 내재적으로 존재하지 않는 metZ 유전자가 도입되기 전의 미생물일 수 있다.
상기 L-메티오닌 생산 미생물은, L-메티오닌 생합성 경로 내 단백질 일부의 활성이 강화되거나, L-메티오닌 분해 경로 내 단백질 일부의 활성이 약화되어 L-메티오닌 생산능이 강화된 미생물일 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물은 metZ 도입 이외에도, 시스타티오닌 감마 신타아제의 활성 약화 또는 불활성; O-아세틸호모세린 설피드릴라제의 활성 약화 또는 불활성; 메티오닌-시스테인 생합성 억제인자의 활성 약화 또는 불활성; 메티오닌 합성 효소의 활성 강화; 및 설파이트 환원 효소의 활성 강화로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 것일 수 있다. 또는, 상기 유전적 변형은 metB 유전자의 결실/발현 억제; metY 유전자의 결실; mcbR 유전자의 결실/발현 억제; 및 metH 발현 강화 및 cysI 유전자 발현 강화로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이가 추가로 도입된 것일 수 있으며, 일 예로, 상기 metB 유전자는 서열번호 25, metY 유전자는 서열번호 26, mcbR 유전자는 서열번호 1, metH 유전자는 서열번호 39, cysI 유전자는 서열번호 40의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 상동성 또는 동일성에 대한 설명은, metB, metY, mcbR, metH 및 cysI 유전자에 대해서도 동일하다.
다만 상기 유전자들은 한 가지 예이며 이에 제한되지 않고, 다양한 공지의 L-메티오닌 생합성경로의 단백질 활성을 강화시키거나 분해경로의 단백질 활성을 불활성화/약화시킨 미생물일 수 있다.
단백질의 활성 강화는 전술한 바와 같이, 해당 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 단백질을 암호화하는 염색체상 유전자 및/또는 이의 발현 조절 서열에 변이 도입, 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체, 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자를 단백질 활성이 증가되도록 돌연변이된 유전자로 대체, 단백질의 도입 및 이를 조합한 방법으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어 "단백질 활성의 약화/불활성화"는 효소 또는 단백질의 발현이 천연의 야생형 균주, 모균주 또는 해당 단백질이 비변형된 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 이때, 상기 감소는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 변이, 발현조절서열의 변형, 유전자 일부 또는 전체의 결손 등으로 단백질의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질의 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다. 본 출원에 있어서, 상기 불활성화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 2) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 암호화하는 상기 유전자 서열의 변형, 4) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 5) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 6) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
다만 전술한 방법은 하나의 예시로, 단백질의 활성 강화 또는 불활성화 방법 및 유전자 조작 방법은 당업계에 공지되어 있는바, 상기 L-메티오닌 생산 미생물은 공지의 다양한 방법을 적용하여 제조될 수 있다.
상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 코리네박테리움속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용될 수 있으며, 구체적으로는 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
상기 황원으로는, 메탄설포네이트(methanesulfonate), 에탄설포네이트(ethanesulfonate)를 포함하는 알칸설포네이트(alkanesulfonate), 황산염, 아황산염(sulfite), H2S와 같은 하이드로겐 설파이드, 설파이드, 설파이드 유도체, 티오글리콜라이트, 티오시아네이트 및/또는 티오유레아와 같은 유기 및 무기 황 함유성 화합물과 티오설페이트의 혼합물 형태이거나, 또는 황원으로서 티오설페이트 이외의 물질은 포함하지 않을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 목적상, 상기 L-메티오닌 제조 방법은 티오설페이트를 포함하는 배지에서 상기 미생물을 배양하는 것을 포함할 수 있고, 구체적으로, 상기 티오설페이트는 미생물의 황원으로 사용되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있고, 그 외에 상기 배지에는 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서는 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
배양물의 온도는 25℃내지 40℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 28℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 1 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 메티오닌 제조방법은 상기 미생물 또는 배지로부터 L-메티오닌을 회수하는 것을 포함할 수 있다.
본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 목적하는 황 함유 아미노산 또는 황 함유 아미노산 유도체를 회수할 수 있다. 예컨대 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법은 추가적인 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 미생물 및 티오설페이트를 포함하는 L-메티오닌 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 조성물은 L-메티오닌 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 metZ에 의해 코딩되는 단백질 활성이 도입된 미생물은, metY에 비해 부산물이 적게 생성되어 수율이 높으며, 메티오닌에 의해 피드백저해를 받는metB와 달리 피드백 저해를 받지 않으므로, 고수율로 L-메티오닌을 생산할 수 있어 L-메티오닌의 산업적 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: mcbR 유전자 결손을 위한 제조합 벡터 제작
본 실시 예에서는 메티오닌 생산 균주를 제작하기 위해, 야생형 ATCC13032 균주를 가지고, 기 공지된 메티오닌-시스테인 생합성 억제인자를 코딩하는 mcbR (J. Biotechnol. 103:51-65, 2003) 의 불활성화를 위해 벡터를 제작하였다.
구체적으로, mcbR 유전자를 코리네박테리움 ATCC13032 염색체 상에서 결손시키기 위하여 하기의 방법으로 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다. 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 mcbR 유전자 및 주변서열(서열번호 1)을 확보하였다.
결손된 mcbR 유전자를 획득하기 위한 목적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 2 및 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다(표 1).
서열번호 | 서열(5'-3') |
2 | TCGAGCTCGGTACCCCTGCCTGGTTTGTCTTGTA |
3 | CGGAAAATGAAGAAAGTTCGGCCACGTCCTTTCGG |
4 | AGGACGTGGCCGAACTTTCTTCATTTTCCGAAGGG |
5 | CTCTAGAGGATCCCCGTTTCGATGCCCACTGAGCA |
PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 700bp DNA 단편들을 수득하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)와 상기 증폭한 mcbR 유전자 단편들을 염색체 도입용 제한효소 smaI 으로 처리한 뒤, isothermal assembly cloning 반응 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자들의 결손된 단편이 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 pDZ-△mcbR 이라 명명하였다.
실시예 2: mcbR 유전자 결손된 균주 제작 및 배양
실시예 1에서 제작된 pDC-△mcbR, 벡터를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 ATCC13032 균주에 각각 전기천공법으로 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 그 후, 수크로오즈를 포함하고 있는 고체배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 서열번호 6, 7 (표 2)을 이용하여 PCR법을 통하여 mcbR 유전자가 결손된 균주를 확인하였고, 본 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CM02-0618이라 명명하였다.
상기 CM02-0618은 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 1월 4일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12425P를 부여받았다.
서열번호 | 서열(5'-3') |
6 | AATCTGGATTTCCGCCAGGT |
7 | CTTCCTAACTCCTGAGGAAG |
상기 제작된 CM02-0618의 L-메티오닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주와 함께 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032과 발명 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CM02-0618를 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다. 생산 배지에서 황원으로는 티오설페이트의 일종인 (NH4)2S2O3를 이용하였다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍, (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 8.0)>
포도당 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, Yeast extract 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1.2 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g, 시아노코발라민 (Vitamin B12) 1 ㎍ (증류수 1리터 기준).
상기 배양 방법으로 배양하여 배양액의 중의 L-메티오닌 농도를 분석하여 표 3에 나타내었다.
균주 | L-메티오닌(g/L) |
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (야생형) | 0.00 |
CM02-0618 | 0.04 |
그 결과, mcbR 단독 제거 균주에서 L-메티오닌이 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3-1: 외래 3종 metZ 유전자 도입을 위한 벡터 제작
코리네박테리움 균주에 외래 metZ를 도입하여 기존 메티오닌 생합성 방법의 단점을 보완하면서 메티오닌 생산을 강화하고자 하였다. 구체적으로, 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum), 하이호모나스 넵튜니윰 (Hyphomonas Neptunium), 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 유래 metZ를 도입하기 위한 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 3종의 외래 metZ 유전자를 각각 코리네박테리움 ATCC13032 염색체 상에서 추가 삽입시키기 위하여 하기의 방법으로 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다.
먼저 metZ를 삽입하기 위해 Ncgl1021 (Transposase)를 제거하기 위한 벡터를 제작하였다. 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 Ncgl1021 및 주변 서열 (서열변호 8)을 확보하였다. 결손된 Ncgl1021 유전자를 획득하기 위한 목적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머(표 4)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 | 서열(5'-3') |
9 | ACCCGGGGATCCTCTAGAATGTTTGTGATGCGCAG |
10 | GTCAGAGAGTACTTACGCTGATCGGGAGGGAAAGC |
11 | ATCAGCGTAAGTACTCTCTGACTAGCGTCACCCTC |
12 | CTGCAGGTCGACTCTAGAAAAGGGATTGGAGTGTT |
PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 DNA 단편들을 수득하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)와 상기 증폭한 Ncgl1021 유전자 단편들을 염색체 도입용 제한효소 smaI 으로 처리한 뒤, isothermal assembly cloning 반응 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자들의 결손된 단편이 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 pDZ-△Ncgl1021 이라 명명하였다.
metZ (크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum), 하이호모나스 넵튜니윰 (Hyphomonas Neptunium), 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 유래) 유전자들을 획득하기 위한 목적으로, 각각 크로모박테리움 비오라슘, 하이호모나스 넵튜니윰, 로도박터 스페로이드의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 13 및 14, 15 및 16, 17 및 18 이용하여 PCR을 수행하였다. 또한 3종의 metZ 유전자를 각각 발현하기 위해 Pspl1 프로모터를 사용하였으며, Pspl1은 기 공지된 spl1-GFP (KR 10-1783170 B1) 벡터 DNA를 주형으로 하여 각각 서열번호 19 및 20, 19 및 21, 19 및 22 를 이용하여 PCR을 수행하였다(표 5). PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
서열번호 | 서열(5'-3') |
13 | ATCAAAACAGATATCATGGCATCCGACGCGCCGCA |
14 | CGCTAGTCAGAGAGTTTAGTCAAGGCCCCGCAACA |
15 | ATCAAAACAGATATCATGGCGGATGCACCCGGCGG |
16 | CGCTAGTCAGAGAGTTCACAAGCTGTTAAGCGAAG |
17 | ATCAAAACAGATATCATGACGAAGGACTGGAAGAC |
18 | CGCTAGTCAGAGAGTTCAGATCACCGCGAGCGCCT |
19 | CCGATCAGCGTAAGTGGCGCTTCATGTCAACAATC |
20 | CGCGTCGGATGCCATGATATCTGTTTTGATCTCCT |
21 | GGGTGCATCCGCCATGATATCTGTTTTGATCTCCT |
22 | CCAGTCCTTCGTCATGATATCTGTTTTGATCTCCT |
그 결과 3종의 외래 metZ 유전자 단편 및 3종의 metZ 유전자를 발현하기 위한 각각의 spl1 프로모터 단편을 획득할 수 있었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ-△Ncgl1021 벡터를 제한효소 scaI 으로 처리한 뒤, 균주별로 상기 증폭한 spl1 promoter 단편 및 metZ 단편들과 같이 isothermal assembly cloning 반응 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 총 3종의 플라스미드를 획득하였고 각각 pDZ-△Ncgl1021-PsplCvimetZ (크로모박테리움 비오라슘(Chromobacterium Violaceum) metZ), pDZ-△Ncgl1021-PsplHnemetZ (하이호모나스 넵튜니윰 (Hyphomonas Neptunium) metZ), pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ (로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) metZ) 라 명명하였다.
실시예 3-2: metZ 유전자 도입을 위한 벡터 제작
종래에 알려진, 로도박터 스페로이드 유래 metZ 유전자 6개의 서열에 대한 벡터를 추가로 제작하였다. (KR10-1250651B1 및 KR10-1836719B1 참조) 전술된 실시예 3-1의 방법과 동일한 방법으로 서열번호 66 내지 71의 아미노산 서열을 코딩하는 metZ 유전자가 각각 도입된 벡터를 제작하였다. 각 metZ 유전자는, RspmetZ_long, RspmetZ_3, RspmetZ_65, RspmetZ_104, RspmetZ_196, RspmetZ_3_65_104 로 명명되었으며, 각 유전자 도입을 위하여 사용된 프라이머는 다음과 같다.
프라이머 | 서열(5'-3') | |
RspmetZ | 서열번호 72 | ATCAAAACAGATATCATGGGTATCGCGTTTCGTGA |
RspmetZ_3 | 서열번호 73 | CCTTCACGAAACGCGtTACCCATGATATCTG |
RspmetZ_3 | 서열번호 74 | CAGATATCATGGGTAaCGCGTTTCGTGAAGG |
RspmetZ_65 | 서열번호 75 | TAGCGGGCATAGATGtATTCGTCGGCGCCGG |
RspmetZ_65 | 서열번호 76 | CCGGCGCCGACGAATaCATCTATGCCCGCTA |
RspmetZ_104 | 서열번호 77 | ACGATCGAGGTGAGCgCGCCGTGGATCGCGG |
RspmetZ_104 | 서열번호 78 | CCGCGATCCACGGCGcGCTCACCTCGATCGT |
RspmetZ_196 | 서열번호 79 | CGGGCGTCGCGAAGAtATTGTCCACGATGAC |
RspmetZ_196 | 서열번호 80 | GTCATCGTGGACAATaTCTTCGCGACGCCCG |
먼저 RspmetZ_long 을 획득하기 위한 목적으로 로도박터 스페로이드의 염색체 DNA를 이용하여 서열번호 19 및 22, 72 및 18을 이용하여 PCR을 수행하였다.
그 결과 유전자 단편 및 spl1 프로모터 단편을 획득할 수 있었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ-△Ncgl1021 벡터를 제한효소 scaI 으로 처리한 뒤, 균주별로 상기 증폭한 spl1 promoter 단편 및 metZ 단편을 같이 isothermal assembly cloning 반응 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_long라 명명하였다.
RspmetZ_3, RspmetZ_65, RspmetZ_104, RspmetZ_196, RspmetZ_3_65_104을 획득하기 위한 목적으로, 각각 pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_long 벡터를 DNA를 주형으로 하여 서열번호 72 및 73, 74 및 18 (RspmetZ_3), 서열번호 72 및 75, 76 및 18 (RspmetZ_65), 서열번호 72 및 77, 78 및 18 (RspmetZ_104), 서열번호 71 및 79, 80 및 18 (RspmetZ_196), 서열번호 72 및 73, 74 및 75. 76 및 77, 77 및 18 (RspmetZ_3_65_104) 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과 총 10개의 단편을 획득할 수 있었다.
단편 1 | 서열번호 72, 73 |
단편 2 | 서열번호 74, 18 |
단편 3 | 서열번호 72, 75 |
단편 4 | 서열번호 76, 18 |
단편 5 | 서열번호 72, 77 |
단편 6 | 서열번호 78, 18 |
단편 7 | 서열번호 72, 79 |
단편 8 | 서열번호 80, 18 |
단편 9 | 서열번호 74, 75 |
단편10 | 서열번호 76, 77 |
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ-△Ncgl1021 벡터를 제한효소 scaI 으로 처리한 뒤, 각각 RspmetZ_3은 단편 1, 단편 2, RspmetZ_65는 단편 3, 단편 4, RspmetZ_104는 단편 5, 단편 6, RspmetZ_196은 단편 7, 단편 8, RspmetZ_3_65_104는 단편 1, 단편 11, 단편 12, 단편 6과 같이 isothermal assembly cloning 반응 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 총 6종의 플라스미드를 획득하였고 각각 pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_long, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_3, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_65, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_104, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_196, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_3_65_104 라 명명하였다.
실시예 4: 외래 metZ가 도입된 균주 제작 및 배양
실시예 2에서 제작한 메티오닌 생산균주인 CM02-0618 균주에 9종의 외래 metZ를 도입하였다.
구체적으로, 실시예 3에서 제작한 pDZ-△Ncgl1021, pDZ-△Ncgl1021-PsplCvimetZ pDZ-△Ncgl1021-PsplHnemetZ, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_long, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_3, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_65, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_104, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_196, 및 pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_3_65_104 벡터를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 실시예 2에서 제작한 메티오닌 생산균주인 CM02-0618 균주에 각각 전기천공법으로 형질전환시켰다. (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999).
그 후, 수크로오즈를 포함하고 있는 고체배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 서열번호 23, 24을 이용하여 PCR법을 통하여 Ncgl1021이 결손된 균주 및 Ncgl1021이 결손되면서 metZ 유전자가 삽입된 균주를 확인하였다. CM02-0618 에 상기 9종의 벡터가 각각 도입된 재조합 균주를 CM02-0618/ΔNcgl021 및 CM02-0757, CM02-0758, CM02-0759-1, CM02-0759-2, CM02-0759-3, CM02-0759-4, CM02-0759-5, CM02-0759 라 명명하였다.
상기 제작된 균주들의 L-메티오닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 CM02-0618균주와 함께 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 상기 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 8.0)>
포도당 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, Yeast extract 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1.2 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g, 코발라민 (Vitamin B12) 1 ㎍ (증류수 1리터 기준).
또한, 종래의 메티오닌 효소전환에서 사용된 황원과의 비교를 위하여, 상기 생산배지에서 황원을 티오설페이트(S2O3) 에서 메칠머캅탄(CH3SH)으로 변경한 후, 상기 균주들을 동일한 방법으로 배양하였다. 각각 배양이 완료된 후, 배양액 내 L-메티오닌 농도를 분석하여 표 8에 나타내었다.
균주 | L-메티오닌(g/L) (황원: S2O3) |
L-메티오닌(g/L) (황원: CH3SH) |
CM02-0618 | 0.04 | 0.01 |
CM02-0618ΔNcgl021 | 0.04 | 0.01 |
CM02-0757 (CvimetZ) | 0.13 | 0.02 |
CM02-0758 (HnemetZ) | 0.12 | 0.01 |
CM02-0759-1 (RspmetZ) | 0.13 | 0.02 |
CM02-0759-2 (RspmetZ_long) | 0.13 | 0.02 |
CM02-0759-3 (RspmetZ_3) | 0.13 | 0.02 |
CM02-0759-4 (RspmetZ_65) | 0.13 | 0.02 |
CM02-0759-5 (RspmetZ_104) | 0.13 | 0.02 |
CM02-0759-6 (RspmetZ_196) | 0.13 | 0.02 |
CM02-0759 (RspmetZ_3_65_104) | 0.14 | 0.02 |
그 결과, 9종의 metZ 유전자가 각각 도입됨에 따라 대조군 균주 대비 L-메티오닌 생산능이 266% 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 본 출원의 외래 metZ가 sulfhydrylation를 통해 메티오닌 생산능을 크게 증가시키며, 특히 메칠머캅탄을 황원으로 사용하는 종래의 방법에 비해 효율이 우수한 것임을 확인하였다. 이는 코리네박테리움 글루타미쿰 metB 및 metY와 달리 본 출원의 외래 metZ는 피드백 저해를 받지 않아 메티오닌 수율이 증가한 것으로 해석할 수 있다.
상기 CM02-0757, CM02-0758, CM02-0759 균주는 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 5월 2일자로 기탁하여 각각 수탁번호 KCCM12506P, KCCM12507P, KCCM12508P를 부여받았다.
실시예 5: metB 및 metY 유전자 결손을 위한 재조합 벡터 제작
본 출원의 metZ 가 코딩하는 단백질의 기능(활성)을 확인하고 이를 metY 및 metB 활성과 비교하기 위하여, C.gl이 가지고 있는 metB 및 metY를 각각 deletion 하였다. 구체적으로, metB 및 metY 유전자를 각각 결손시키기 위하여 하기의 방법으로 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다. 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 metB 및 metY 유전자 및 주변서열(서열번호 25, 26)을 확보하였다.
결손된 metB 및 metY 유전자를 각각 획득하기 위한 목적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30의 프라이머와 (metB), 서열번호 31 및 32, 서열번호 33 및 34 (metY) 의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다(표 9).
서열번호 | 서열(5'-3') |
27 | GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGCCAGTAAGGTGTTACCCATGC |
28 | CTGCTTGCCGCCAAATAGTTTAGTACTGGTAGATCAACTCCTGTAATCAGAATTCTA |
29 | TAGAATTCTGATTACAGGAGTTGATCTACCAGTACTAAACTATTTGGCGGCAAGCAG |
30 | TCGACTCTAGAGGATCCCCGGGCGATCTCAATTCCCATGCCTC |
31 | TCGAGCTCGGTACCCCTGCAATAGCTGCAAAGTGG |
32 | TGAGTCTATTTAAAGCGGGTAATTTTCTTGACTTT |
33 | CAAGAAAATTACCCGCTTTAAATAGACTCACCCCA |
34 | CTCTAGAGGATCCCCGCCTTAATTTGGGCGGATTG |
PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 700bp DNA 단편들을 수득하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)와 상기 증폭한 metB 및 metY 유전자 단편들을 각각 염색체 도입용 제한효소 smaI 으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자들의 결손된 단편이 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 획득한 플라스미드를 각각 pDZ-△metB 및 pDZ-△metY 라 명명하였다.
실시예 6: 3종의 metZ가 각각 강화된 균주에서 metB 및 metY 유전자를 각각 제거한 균주 제작 및 배양
상기에서 제작된 pDZ-△metB 및 pDZ-△metY 벡터를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 CM02-0618, CM02-0757, CM02-0758, CM02-0759 균주에 각각 전기천공법으로 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 그 후, 수크로오즈를 포함하고 있는 고체배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 각각 서열번호 35 및 36 (metB), 서열번호 37 및 38 (metY) 를 이용하여 metB 및 metY가 유전자가 각각 결손됐는지 확인하였다(표 10).
서열번호 | 서열(5'-3') |
35 | TTCCTGGTCTGACGACAGTG |
36 | GATGTCTTCAGCTTCACCCTG |
37 | CCGAGGATAATCCACAAGGT |
38 | CGAAGCGTTCGTCGATTTCT |
본 재조합 균주들은 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 CM02-0618/ΔmetB CM02-0757/ΔmetB, CM02-0758/ΔmetB, CM02-0759/ΔmetB, CM02-0618/ΔmetY, CM02-0757/ΔmetY, CM02-0758/ΔmetY, CM02-0759/ΔmetY 이라 명명하였다.
상기 제작된 CM02-0618/ΔmetB, CM02-0757/ΔmetB, CM02-0758/ΔmetB, CM02-0759/ΔmetB, CM02-0618/ΔmetY, CM02-0757/ΔmetY, CM02-0758/ΔmetY, CM02-0759/ΔmetY 균주의 L-메티오닌 생산능을 분석하기 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 모균주인 CM02-0618, CM02-0757, CM02-0758, CM02-0759 와 상기 제작된 CM02-0618/ΔmetB, CM02-0757/ ΔmetB, CM02-0758/ΔmetB, CM02-0759/ΔmetB, CM02-0618/ΔmetY, CM02-0757/ΔmetY, CM02-0758/ΔmetY, CM02-0759/ΔmetY 를 각각 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 8.0)>
포도당 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, Yeast extract 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1.2 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g, 코발라민 (Vitamin B12) 1 ㎍ (증류수 1리터 기준).
상기 배양 방법으로 배양하여 배양액의 중의 L-메티오닌 및 부산물인 호모란티오닌 농도를 분석하여 표 11에 나타내었다.
균주 | L-메티오닌(g/L) | 호모란티오닌 (g/L) |
CM02-0618 | 0.04 | 0.82 |
CM02-0618/ΔmetB | 0.03 | 0 |
CM02-0618/ΔmetY | 0.02 | 0.81 |
CM02-0757 | 0.13 | 0.17 |
CM02-0758 | 0.12 | 0.17 |
CM02-0759 | 0.13 | 0.18 |
CM02-0757/ΔmetB | 0.13 | 0 |
CM02-0758/ΔmetB | 0.12 | 0 |
CM02-0759/ΔmetB | 0.13 | 0 |
CM02-0757/ΔmetY | 0.08 | 0.19 |
CM02-0758/ΔmetY | 0.07 | 0.18 |
CM02-0759/ΔmetY | 0.08 | 0.19 |
이를 통해, 외래 metZ는 metB와 같은 Function을 하는 것, 즉 시스테인(cysteine)을 황원으로 하여 트랜스설퓨레이션(transsulfuration)을 통해 메티오닌(methionine)을 생산함을 확인할 수 있다. 즉 metB나 metY가 결실되어 있어도 metZ를 이용해 메티오닌 생산이 고수율로 유지되는 것이 가능하므로 기존 코리네박테리움의 metB 및/또는 metY의 단점을 보완하기 위해 상기 유전자를 외래 metZ로 대체할 수 있다.
또한 metB가 존재하고 외래 metZ가 도입된 균주에서 메티오닌 생산량은 강화되고 호모란티오닌 생성량은 대조군(CM02-0618) 대비 20% 정도에 그쳐, metZ 강화 시 부산물인 호모란티오닌 생성량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 호모란티오닌은 O-아세틸호모세린을 소모하여 합성되는 물질로, 호모란티오닌의 생성은 메티오닌 생산을 감소시키는 바, 이러한 부산물 생성을 억제하는 외래 metZ는 metB의 단점을 보완하여 부산물 생성을 억제하고 메티오닌 합성량을 강화하는 것임을 알 수 있다.
상기 결과를 통해 처음으로 본 출원의 metZ가 시스테인을 이용해서 트랜스설퓨레이션 할 수 있다라는 사실을 밝혔으며, 메티오닌 생산 증가 뿐 아니라 코리네박테리움 속 균주의 metB의 단점을 보완하기 위해 본 출원의 metZ를 사용할 수 있는 것임을 확인하였다.
실시예 7:
metH, cysI
를 동시에 강화하는 재조합 벡터 제작
본 실시 예에서는 mcbR이 결손되지 않은 메티오닌 생산 균주를 제작하기 위해, 메티오닌 합성 효소를 코딩하는 metH (Ncgl1450), 설파이트 환원 효소를 코딩하는 cysI (Ncgl2718)를 동시에 강화하기 위해 벡터를 제작하였다.
구체적으로, metH 및 cysI 유전자를 코리네박테리움 ATCC13032 염색체 상에서 추가 삽입시키기 위하여 하기의 방법으로 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다. 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 metH 유전자 및 주변서열(서열번호 39)과 cysI 유전자 및 주변서열(서열번호 40)을 확보하였다.
다음 metH 및 cysI 유전자를 획득하기 위한 목적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 41 및 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 또한 metH 유전자의 발현 강화를 위해 Pcj7 프로모터가 사용되고, cysI 유전자의 발현 강화를 위해 Pspl1 프로모터를 사용하였다. 각 프로모터를 획득하기 위해, Pcj7의 경우 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 45, 46를 이용하여 PCR을 수행하였고, Pspl1은 기 공지된 spl1-GFP (KR 10-1783170 B1) 벡터 DNA를 주형으로 하여 서열번호 47, 48을 이용하여 PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머 서열을 하기 표 12에 나타내었다.
서열번호 | 서열(5'-3') |
41 | CAACGAAAGGAAACAATGTCTACTTCAGTTACTTC |
42 | TAGTCAGAGAGTGATTTAGACGTTAAAGTACTTTG |
43 | ATCAAAACAGATATCATGACAACAACCACCGGAAG |
44 | CGCTAGTCAGAGAGTTCACACCAAATCTTCCTCAG |
45 | CCGATCAGCGTAAGTAGAAACATCCCAGCGCTACT |
46 | AACTGAAGTAGACATTGTTTCCTTTCGTTGGGTAC |
47 | TACTTTAACGTCTAAGGTACCGGCGCTTCATGTCA |
48 | GGTGGTTGTTGTCATGATATCTGTTTTGATCTCCT |
PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 4분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 metH 유전자 및 cysI, Pcj7 프로모터 및 Pspl1 프로모터 DNA 단편을 확보하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ-△Ncgl1021 벡터를 제한효소 scaI 으로 처리한 뒤, 상기 증폭한 4개의 DNA 단편들을 염색체 도입용 제한효소 scaI 으로 처리한 뒤, IST 반응 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자들의 결손된 단편이 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 pDZ-△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 라 명명하였다.
실시예 8:
metH, cysI
를 동시에 강화하는 균주 제작 및 이를 이용한 L-메티오닌 생산
상기에서 제작된 pDZ-△Ncgl1021 및 pDZ-△Ncgl1021-Pcj7metH-Pspl1cysI 벡터를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 ATCC13032 균주에 각각 전기천공법으로 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 그 후, 수크로오즈를 포함하고 있는 고체배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 서열번호 23, 24를 이용하여 Ncgl1021 유전자가 결손되고 Pcj7-metH-Pspl1cysI 유전자가 잘 삽입됐는지 확인하였다. 본 재조합 균주들은 13032/ΔNcgl1021, CM02-0753으로 명명하였다.
상기 제작된 13032/ΔNcgl1021, CM02-0753 균주의 L-메티오닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주와 함께 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032과 상기 제조한 균주 13032/ΔNcgl1021, CM02-0753 를 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 8.0)>
포도당 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, Yeast extract 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1.2 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g, 코발라민 (Vitamin B12) 1 ㎍ (증류수 1리터 기준).
상기 배양 방법으로 배양하여 배양액의 중의 L-메티오닌 농도를 분석하여 표 13에 나타내었다.
균주 | L-메티오닌(g/L) |
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (야생형) | 0 |
13032/ΔNcgl1021 | 0 |
CM02-0753 | 0.03 |
그 결과, mcbR은 그대로 존재하고, metH 및 cysI 과발현 균주는 대조군 균주 대비 L-메티오닌 생산능이 0.03 g/l 향상되었음을 확인 할 수 있었다.
실시예 9-1: Ncgl1021 site가 아닌 다른 site에 metZ 유전자들 강화를 위한 벡터 제작
3종의 외래 metZ 유전자를 각각 코리네박테리움 ATCC13032 염색체 상에서 기존과 다른 위치에 삽입시키기 위하여 하기의 방법으로 재조합 플라스미드 벡터를 제작하였다.
먼저 metZ를 삽입하기 위해 Ncgl2748 (Transposase)를 제거하기 위한 벡터를 제작하였다. 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 Ncgl2748 및 주변 서열 (서열번호 49)을 확보하였다. 결손된 Ncgl2748 유전자를 획득하기 위한 목적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 50 및 서열번호 51, 서열번호 52 및 서열번호 53의 프라이머(표 14)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 DNA 단편들을 수득하였다.
서열번호 | 서열(5'-3') |
50 | GTACCCGGGGATCCTCTAGACCTGGGTAACTTCCTGTCCA |
51 | CAGGTTAGCAGTACTTCTCAAGTTTCTCGGCGGTG |
52 | AACTTGAGAAGTACTGCTAACCTGCAGAAACCTTG |
53 | GCCTGCAGGTCGACTCTAGACTCCGCAGAAATCGTGGGGC |
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)와 상기 증폭한 Ncgl2748 유전자 단편들을 염색체 도입용 제한효소 smaI 으로 처리한 뒤, IST 반응 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자들의 결손된 단편이 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 pDZ-△Ncgl2748 이라 명명하였다.
다음 3종의 metZ (크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum), 하이호모나스 넵튜니윰 (Hyphomonas Neptunium), 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 유전자들을 획득하기 위한 목적으로, 각각 상기에서 제작한 pDZ-△Ncgl1021-PsplCvimetZ (크로모박테리움 비오라슘(Chromobacterium Violaceum) metZ), pDZ-△Ncgl1021-PsplHnemetZ (하이호모나스 넵튜니윰 (Hyphomonas Neptunium) metZ), pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ (로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) metZ) 벡터를 주형으로 하여 서열번호 54 및 55, 54 및 56, 54 및 57을 이용하여(표 15) PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 53℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 3종의 PCR 단편을 획득할 수 있었다.
서열번호 | 서열(5'-3') |
54 | CGCCGAGAAACTTGAGAAGTGGCGCTTCATGTCAA |
55 | CTGCAGGTTAGCAGTTTAGTCAAGGCCCCGCAACA |
56 | CTGCAGGTTAGCAGTTCACAAGCTGTTAAGCGAAG |
57 | CTGCAGGTTAGCAGTTCAGATCACCGCGAGCGCCT |
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ-△Ncgl2748 벡터를 제한효소 scaI 으로 처리한 뒤, 균주별로 상기 증폭한 단편들과 같이 IST 반응 후, 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후 플라스미드 추출법을 이용하여 총 3종의 플라스미드를 획득하였고 각각 pDZ-△Ncgl2748-PsplCvimetZ (크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum) metZ), pDZ-△Ncgl2748-PsplHnemetZ (하이호모나스 넵튜니윰 (Hyphomonas Neptunium) metZ), pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ (로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) metZ) 라 명명하였다.
실시예 9-2: Ncgl1021 site가 아닌 다른 site에 metZ 유전자들 강화를 위한 벡터 제작
추가적으로, 서열 상동성 99%이상을 갖는 metZ 유전자가 도입된 균주에서도 메티오닌이 생산량이 증가되는지 확인하고자, 실시예 3-2의 metZ 유전자 5개에 대한 벡터를 추가로 제작하였다.
전술된 실시예 9-1의 방법과 동일한 방법으로 상기 6개의 metZ 유전자가 각각 도입된 벡터를 제작하였다.
총 6개의 벡터를 제작하였으며, 그 내용은 다음과 같다. pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_long, △Ncgl2748-PsplRspmetZ_3, pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_65, pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_104, pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_196, 및 pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_3_65_104라 명명하였으며, 위 벡터들을 만들기 위해 DNA 주형은 각각 실시예 4에서 제작된 △Ncgl1021-PsplRspmetZ_long pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_3, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_65, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_104, pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_196, 및 pDZ-△Ncgl1021-PsplRspmetZ_3_65_104 를 사용하였고, 프라이머는 공통으로 서열번호 54, 57을 이용하였다. 나머지 과정은 실시예 9-1과 동일하다.
실시예 10: mcbR이 존재하는 L-메티오닌 생산주 기반 외래 metZ 강화균주 개발 및 이를 이용한 L-메티오닌 생산
상기에서 제작된 pDZ-△Ncgl2748, pDZ-△Ncgl2748-PsplCvimetZ, pDZ-△Ncgl2748-PsplHnemetZ, pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ, pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_long, pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_3, pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_65, pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_104, pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_196, 및 pDZ-△Ncgl2748-PsplRspmetZ_3_65_104 벡터를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 CM02-0753 균주에 전기천공법으로 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 그 후, 수크로오즈를 포함하고 있는 고체배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 서열번호 58, 59(표 16)를 이용하여 Ncgl2748 자리에 각각 외래 metZ 유전자가 잘 삽입됐는지 확인하였다.
서열번호 | 서열(5'-3') |
58 | TTCTCCGTGCCGAGAAAATC |
59 | GTAGATGATCTCGCCATTTG |
본 재조합 균주를 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 13032/△Ncgl2748, CM02-0765, CM02-0766, CM02-0767-1, CM02-0767-2, CM02-0767-3, CM02-0767-4, CM02-0767-5, CM02-0767-6, CM02-0767 라 명명하였다.
상기 제작된 균주들의 L-메티오닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CM02-0753 균주와 함께 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각각의 균주를 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 ·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 8.0)>
포도당 50 g, (NH4)2S2O3 12 g, Yeast extract 5 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 1.2 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g, 코발라민 (Vitamin B12) 1 ㎍ (증류수 1리터 기준).
상기 배양 방법으로 배양하여 배양액의 중의 L-메티오닌 농도를 분석하여 표 17에 나타내었다.
균주 | L-메티오닌(g/L) |
CM02-0753 | 0.03 |
CM02-0753/△Ncgl2748 | 0.03 |
CM02-0765 (CvimetZ) | 0.10 |
CM02-0766 (HnemetZ) | 0.09 |
CM02-0767-1(RspmetZ) | 0.10 |
CM02-0767-2(RspmetZ_long) | 0.10 |
CM02-0767-3 (RspmetZ_3) | 0.10 |
CM02-0767-4 (RspmetZ_65) | 0.10 |
CM02-0767-5 (RspmetZ_104) | 0.10 |
CM02-0767-6 (RspmetZ_196) | 0.10 |
CM02-0767(RspmetZ_3_65_104) | 0.11 |
그 결과, mcbR이 존재하는 메티오닌 생산 균주에서도 외래 metZ를 각각 도입하였을 때, 메티오닌 수율이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
상기 CM02-0765, CM02-0766, CM02-0767은 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2019년 5월 2일자로 기탁하여 각각 수탁번호 KCCM12509P, KCCM12510P, KCCM12511P를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> A L-methionine-producing microorganism introduced with foreign
metZ-encoded protein and a method of preparing methionine using
the same
<130> KPA190405-KR
<160> 80
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 2642
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
ctcccgcgca ctgctgcaat ccgcaccgtg cccaatgatg gtggttcgcc cacctgagaa 60
gattaagaag tagtttcttt taagtttcga tgccccggtt tcctgatttt gtgcagggag 120
gccggggcat tggtgtttgc gggttagttc gggccattcg aaagggagaa accaagggca 180
gccagacaga cgtgccaaga atctggattt ccgccaggtt ttggcacgcc cgtctggttt 240
aggcaatgag ataccgaaca cacgtgccaa aagttcggct ttttcgccga tcttgtcacg 300
cctgcctggt ttgtcttgta aagagtgatt tcatggccga gactcctaaa agtttgacct 360
cacaggattg cttctaaggg cctctccaat ctccactgag gtacttaatc cttccgggga 420
attcgggcgc ttaaatcgag aaattaggcc atcacctttt aataacaata caatgaataa 480
ttggaatagg tcgacacctt tggagcggag ccggttaaaa ttggcagcat tcaccgaaag 540
aaaaggagaa ccacatgctt gccctaggtt ggattacatg gatcattatt ggtggtctag 600
ctggttggat tgcctccaag attaaaggca ctgatgctca gcaaggaatt ttgctgaaca 660
tagtcgtcgg tattatcggt ggtttgttag gcggctggct gcttggaatc ttcggagtgg 720
atgttgccgg tggcggcttg atcttcagct tcatcacatg tctgattggt gctgtcattt 780
tgctgacgat cgtgcagttc ttcactcgga agaagtaatc tgctttaaat ccgtagggcc 840
tgttgatatt tcgatatcaa caggcctttt ggtcattttg gggtggaaaa agcgctagac 900
ttgcctgtgg attaaaacta tacgaaccgg tttgtctata ttggtgttag acagttcgtc 960
gtatcttgaa acagaccaac ccgaaaggac gtggccgaac gtggctgcta gcgcttcagg 1020
caagagtaaa acaagtgccg gggcaaaccg tcgtcgcaat cgaccaagcc cccgacagcg 1080
tctcctcgat agcgcaacca accttttcac cacagaaggt attcgcgtca tcggtattga 1140
tcgtatcctc cgtgaagctg acgtggcgaa ggcgagcctc tattcccttt tcggatcgaa 1200
ggacgccttg gttattgcat acctggagaa cctcgatcag ctgtggcgtg aagcgtggcg 1260
tgagcgcacc gtcggtatga aggatccgga agataaaatc atcgcgttct ttgatcagtg 1320
cattgaggaa gaaccagaaa aagatttccg cggctcgcac tttcagaatg cggctagtga 1380
gtaccctcgc cccgaaactg atagcgaaaa gggcattgtt gcagcagtgt tagagcaccg 1440
cgagtggtgt cataagactc tgactgattt gctcactgag aagaacggct acccaggcac 1500
cacccaggcg aatcagctgt tggtgttcct tgatggtgga cttgctggat ctcgattggt 1560
ccacaacatc agtcctcttg agacggctcg cgatttggct cggcagttgt tgtcggctcc 1620
acctgcggac tactcaattt agtttcttca ttttccgaag gggtatcttc gttgggggag 1680
gcgtcgataa gccccttctt tttagcttta acctcagcgc gacgctgctt taagcgctgc 1740
atggcggcgc ggttcatttc acgttgcgtt tcgcgcctct tgttcgcgat ttctttgcgg 1800
gcctgttttg cttcgttgat ttcggcagta cgggttttgg tgagttccac gtttgttgcg 1860
tgaagcgttg aggcgttcca tggggtgaga atcatcaggg cgcggttttt gcgtcgtgtc 1920
cacaggaaga tgcgcttttc tttttgtttt gcgcggtaga tgtcgcgctg ctctaggtgg 1980
tgcactttga aatcgtcggt aagtgggtat ttgcgttcca aaatgaccat catgatgatt 2040
gtttggagga gcgtccacag gttgttgctg acccaataga gtgcgattgc tgtggggaat 2100
ggtcctgtga ggccaaggga cagtgggaag atcggcgcga ggatcgacat cacgatcatg 2160
aacttcagca tgccgttaga gaatccggat gcgtaatcgt tggtttggaa gctgcggtac 2220
atggacatcg ccatgttgat tgcggtgagg attgcggctg tgatgaacag tggcaaaacg 2280
aaactaagaa cttccgcctg cgtggtgctc aaatatttta gctgctcagt gggcatcgaa 2340
acataagcgg gcagaggcac attgctcacg cgaccagcga ggaaagattc cacttcctca 2400
ggagttagga agccgatcga ctggaagacg ggattttcca aaccaccttc agggcgagcc 2460
atgcggagaa gtgcccagta aagaccaagg acaatcggta tctggatcag cccaggcaca 2520
caacctgcca gcgggttaat gccgtattcc ttattcaaat cattctggcg cttctgcaac 2580
tcccgaatgg acgcttcatc gtactttccc ttgtattctt cccggagcgc agcgcggtga 2640
gg 2642
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
tcgagctcgg tacccctgcc tggtttgtct tgta 34
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
cggaaaatga agaaagttcg gccacgtcct ttcgg 35
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
aggacgtggc cgaactttct tcattttccg aaggg 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
ctctagagga tccccgtttc gatgcccact gagca 35
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
aatctggatt tccgccaggt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
cttcctaact cctgaggaag 20
<210> 8
<211> 3311
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 8
ctcattccag cgtcacgacg ttccgaaggt actggttacc tggcattggg cactaccgtt 60
tctgcagcac ttggaccagc cctagcactt tttgtcctag gaacatttga ttacgacatg 120
ctgtttatcg tggtcttggc aacctcggtc atctctttga tcgccgtcgt gttcatgtac 180
tttaagacca gcgaccctga gccttctggg gaaccagcca agttcagctt caaatctatt 240
atgaacccaa agatcatccc catcggcatc tttatcttgc ttatttgctt tgcttactct 300
ggcgtcattg cctacatcaa cgcatttgct gaagaacgcg atctgattac gggtgctgga 360
ttgttcttca ttgcctacgc agtatcaatg tttgtgatgc gcagcttcct tggcaaactg 420
caggaccgtc gcggagacaa cgtcgttatt tactttggat tgttcttctt cgttatttcc 480
ttgacgattt tgtcctttgc cacttccaac tggcacgttg tgttgtccgg agtcattgca 540
ggtctgggat acggcacttt gatgccagca gtgcagtcca tcgctgttgg tgtagtagac 600
aaaaccgaat tcggtacggc cttctccact ttgttcctgt ttgtggactt aggttttggc 660
tttggaccta ttatcctggg agcagtttct gcggcaattg gtttcggacc tatgtatgca 720
gcactggcag gtgtgggtgt gattgccgga atcttctacc tgttcacaca cgctcgcacc 780
gatcgagcta agaatggctt tgttaaacac ccagagcctg tcgctttagt tagctagttc 840
tttcagcttt ccctcccgat cagcgtaaac cggcccttcc ggttttgggg tacatcacag 900
aacctgggct agcggtgtag acccgaaaat aaacgagcct tttgtcaggg ttaaggttta 960
ggtatctaag ctaaccaaac accaacaaaa ggctctaccc atgaagtcta ccggcaacat 1020
catcgctgac accatctgcc gcactgcgga actaggactc accatcaccg gcgcttccga 1080
tgcaggtgat tacaccctga tcgaagcaga cgcactcgac tacacctcca cctgcccaga 1140
atgctcccaa cctggggtgt ttcgtcatca cacccaccgg atgctcattg atttacccat 1200
cgtcgggttt cccaccaaac tgtttatccg tctacctcgc taccgctgca ccaaccccac 1260
atgtaagcaa aagtatttcc aagcagaact aagctgcgct gaccacggta aaaaggtcac 1320
ccaccgggtc acccgctgga ttttacaacg ccttgctatt gaccggatga gtgttcacgc 1380
aaccgcgaaa gcacttgggc tagggtggga tttaacctgc caactagccc tcgatatgtg 1440
ccgtgagctg gtctataacg atcctcacca tcttgatgga gtgtatgtca ttggggtgga 1500
tgagcataag tggtcacata atagggctaa gcatggtgat gggtttgtca ccgtgattgt 1560
cgatatgacc gggcatcggt atgactcacg gtgtcctgcc cggttattag atgtcgtccc 1620
aggtcgtagt gctgatgctt tacggtcctg gcttggctcc cgcggtgaac agttccgcaa 1680
tcagatacgg atcgtgtcca tggatggatt ccaaggctac gccacagcaa gtaaagaact 1740
cattccttct gctcgtcgcg tgatggatcc attccatgtt gtgcggcttg ctggtgacaa 1800
gctcaccgcc tgccggcaac gcctccagcg ggagaaatac cagcgtcgtg gtttaagcca 1860
ggatccgttg tataaaaacc ggaagacctt gttgaccacg cacaagtggt tgagtcctcg 1920
tcagcaagaa agcttggagc agttgtgggc gtatgacaaa gactacgggg cgttaaagct 1980
tgcgtggctt gcgtatcagg cgattattga ttgttatcag atgggtaata agcgtgaagc 2040
gaagaagaaa atgcggacca ttattgatca gcttcgggtg ttgaaggggc cgaataagga 2100
actcgcgcag ttgggtcgta gtttgtttaa acgacttggt gatgtgttgg cgtatttcga 2160
tgttggtgtc tccaacggtc cggtcgaagc gatcaacgga cggttggagc atttgcgtgg 2220
gattgctcta ggtttccgta atttgaacca ctacattctg cggtgcctta tccattcagg 2280
gcagttggtc cataagatca atgcactcta aaacaggaag agcccgtaaa cctctgacta 2340
gcgtcaccct ctgattaagg cgaccgcgga tttaagagca gaggctgcca cgagcgcatc 2400
ttcacggctg tgtgttgtac taaaagtaca gcgcacagcc gttcgtgctt gatcctcctc 2460
aagccccaac gccagcaaca catgggatac ctctccggaa ccacaggcag aaccagggga 2520
gcacacaatg ccttggcgtt ccaattccag aagaacagtt tcagatccta tgctgtcgaa 2580
gagaaaagat gcgtgtccat caatgcgcat cctaggatgt ccagtcaggt gtgctcccgg 2640
gatagtgaga acttcctcga tgaattcgcc aagatctgga taggattccg ccctggccaa 2700
ttccaaggca gtggcaaagg cgatagcccc cgcaacgttt tccgtgccac tacgccgccc 2760
tttttcctgg ccgccgccat ggattaccgg ctccagggga agctttgacc ataacactcc 2820
aatcccttta ggcgcaccga atttatgacc cgacaaactt aacgcgtcaa ctcccaagtc 2880
aaaggttaaa tgtgcagctt gcactgcatc ggtgtgaaaa ggcgtactgc ttaccgccgc 2940
caactcagct atcggctgaa tggttcccac ctcattgttg gcataaccaa tgctgatcaa 3000
tgtggtgtcc ggcctgactg ctttgcggag accctccggg gagatcagcc cagtgtgatc 3060
gggggatagg taggtgatct cgaaatcatg aaacctttca agataagcag cagtttctag 3120
gacactgtca tgctcgatcg gggtggtgat gaggtgccgg ccacgaggat tagctaagca 3180
cgctcctttg atagcgaggt tgttggcttc tgatccaccc gacgtaaacg tcacctgtgt 3240
ggggcgtcct ccgataatgc gggccacccg agttcgagca tcctccagcc ccgcagaggc 3300
gagtcttccc a 3311
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
acccggggat cctctagaat gtttgtgatg cgcag 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
gtcagagagt acttacgctg atcgggaggg aaagc 35
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
atcagcgtaa gtactctctg actagcgtca ccctc 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ctgcaggtcg actctagaaa agggattgga gtgtt 35
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
atcaaaacag atatcatggc atccgacgcg ccgca 35
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
cgctagtcag agagtttagt caaggccccg caaca 35
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
atcaaaacag atatcatggc ggatgcaccc ggcgg 35
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
cgctagtcag agagttcaca agctgttaag cgaag 35
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 17
atcaaaacag atatcatgac gaaggactgg aagac 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
cgctagtcag agagttcaga tcaccgcgag cgcct 35
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 19
ccgatcagcg taagtggcgc ttcatgtcaa caatc 35
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 20
cgcgtcggat gccatgatat ctgttttgat ctcct 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 21
gggtgcatcc gccatgatat ctgttttgat ctcct 35
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
ccagtccttc gtcatgatat ctgttttgat ctcct 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 23
aatggtccag gagctcat 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 24
gatcacctac ctatcccc 18
<210> 25
<211> 3161
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 25
cggtggacga tgagggaaaa cgtttcctcg ccgcccacag aatcataaaa attttctgag 60
gttgtcatgg gtaccagtct aagccctggc cttacgccag taaggtgtta cccatgcgcg 120
aactagcact caacatggcc ggcgtcaccg tgcggcgcgg cgagaaattg cttctcgacg 180
atatctccct ctcaattccg caagggtcgc actgggccgt acttggtcca aatggcgccg 240
gtaaaaccac catgctgaag atcgcagcca ccttgctgta cccatcggaa ggcaccgtgg 300
acatcctggg gcatcgcttt ggtcgggtgg atactcgtga gctgcggaaa acaatcggcc 360
tggtggaccc gaagcaaaga tttaccaacc tgccggccca cgaaattgtg ctgtcggggt 420
taaccgcctc caacgggttg ttgccacggt ggtcggcttc ggcttcggag ttggagcggt 480
gcgctttgat gttggagttg gtgggcatga cagcgcgtgc cgatcgttac tgggccgata 540
tgagccaggg cgaaaaagcc cgcaccctga ttgctcgtgc gctgattatc tcaccgaccc 600
tactgctgct tgatgaaccc accaccggcc ttgacctgcc cggacgtgaa actttgctca 660
gtgtgattga tggtttgcga gccgctcttc ctggtctgac gacagtgatg atcacccacc 720
acgtcgaaga gatcgccgcc tccacgacag atatcctcat gatcaaggac gcccgcatac 780
tggcttcggg gactgtttca gaagtgatga ctcctgaaaa tttgggcgcg ctgtatgaca 840
tgtcggtgtc gttggaaact gtgcgcagcc ggtggttcgc gttcgatgct ctgcattaaa 900
aggggctagt tttacacaaa agtggacagc ttggtctatc attgccagaa gaccggtcct 960
tttagggcca tagaattctg attacaggag ttgatctacc ttgtcttttg acccaaacac 1020
ccagggtttc tccactgcat cgattcacgc tgggtatgag ccagacgact actacggttc 1080
gattaacacc ccaatctatg cctccaccac cttcgcgcag aacgctccaa acgaactgcg 1140
caaaggctac gagtacaccc gtgtgggcaa ccccaccatc gtggcattag agcagaccgt 1200
cgcagcactc gaaggcgcaa agtatggccg cgcattctcc tccggcatgg ctgcaaccga 1260
catcctgttc cgcatcatcc tcaagccggg cgatcacatc gtcctcggca acgatgctta 1320
cggcggaacc taccgcctga tcgacaccgt attcaccgca tggggcgtcg aatacaccgt 1380
tgttgatacc tccgtcgtgg aagaggtcaa ggcagcgatc aaggacaaca ccaagctgat 1440
ctgggtggaa accccaacca acccagcact tggcatcacc gacatcgaag cagtagcaaa 1500
gctcaccgaa ggcaccaacg ccaagctggt tgttgacaac accttcgcat ccccatacct 1560
gcagcagcca ctaaaactcg gcgcacacgc agtcctgcac tccaccacca agtacatcgg 1620
aggacactcc gacgttgttg gcggccttgt ggttaccaac gaccaggaaa tggacgaaga 1680
actgctgttc atgcagggcg gcatcggacc gatcccatca gttttcgatg catacctgac 1740
cgcccgtggc ctcaagaccc ttgcagtgcg catggatcgc cactgcgaca acgcagaaaa 1800
gatcgcggaa ttcctggact cccgcccaga ggtctccacc gtgctctacc caggtctgaa 1860
gaaccaccca ggccacgaag tcgcagcgaa gcagatgaag cgcttcggcg gcatgatctc 1920
cgtccgtttc gcaggcggcg aagaagcagc taagaagttc tgtacctcca ccaaactgat 1980
ctgtctggcc gagtccctcg gtggcgtgga atccctcctg gagcacccag caaccatgac 2040
ccaccagtca gctgccggct ctcagctcga ggttccccgc gacctcgtgc gcatctccat 2100
tggtattgaa gacattgaag acctgctcgc agatgtcgag caggccctca ataaccttta 2160
gaaactattt ggcggcaagc agcttttcaa tataagcaat gcgagcctcc accatgtagc 2220
cgaagagttc gtcagaagtt gagacggact cttcgactgc tttacgggtc agtggcgctt 2280
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cgccctctgg acgattgtca aaggtgtagt cagaagtcag ggtgaagctg aagacatcag 2400
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catcgatgat gcgcacccag acgcgatcaa tgatttcttg acgatttagc acatggttat 2700
acagtgcgcg aggggtgaca cccatgtctc gggcgaggcg gttcatggtc acggcagcga 2760
atccttcgcg gccggcaatg tttaaagtgc gctccactat ggattcgacg gaaaggatac 2820
gttgggtggg gcgtccagga cgacgtcccg tggaagtggc cgccagagtt gacgctacgg 2880
ctggtttcat agtttcgcta ggcatgttat atgacgttac gcctttttct acaagacaac 2940
cagcgttttc agcgagatac tggacatatc aactaaaatc cctgaataaa acatctaaca 3000
tgggttttat acagaaaatt catacgaaag gttgatcatg aagaagaaga ttgcggtcgt 3060
taccggagcg accggaggca tgggaattga gatcgtcaaa gacctctccc gcgaccacat 3120
tgtctacgcc ttgggccgaa atccagagca tctggcagct c 3161
<210> 26
<211> 3314
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 26
gataccggca gctccaccga ccgtgcccat ttcatcacga accatctggc caagtgagcg 60
tccacgccta cgagtagaca cccacagcac taggtagtcc tgcactgcac cggcgaaaat 120
cacaccgagg ataatccaca aggtgcctgg caggtagccc atctgcgcgg ccatgacagg 180
tccaaccaat ggaccggcac ctgcaatagc tgcaaagtgg tggccaaaaa gcacacgacg 240
atccgttggg acatagtcct tgccgtcatt aacgtattcc gccggggttg ctcgctgatc 300
tttcggctta acaactttgt attcaatcag tcgggcatag aaagaaaacg caatgatata 360
ggaaccaact gccgccaaaa ccagccacac agagttgatt gtttcgccac gggagaaagc 420
gattgctccc caacccaccg ccgcgataac cccaaagaca aggagaccaa cgcgggcggt 480
cggtgacatt ttaggggact tcttcacgcc tactggaagg tcagtagcgt tgctgtacac 540
caaatcatcg tcattgatgt tgtcagtctg ttttatggtc acgatcttta ctgttttctc 600
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agaataaatt tataccacac agtctattgc aatagaccaa gctgttcagt agggtgcatg 960
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<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 28
ctgcttgccg ccaaatagtt tagtactggt agatcaactc ctgtaatcag aattcta 57
<210> 29
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 29
tagaattctg attacaggag ttgatctacc agtactaaac tatttggcgg caagcag 57
<210> 30
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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tcgactctag aggatccccg ggcgatctca attcccatgc ctc 43
<210> 31
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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tcgagctcgg tacccctgca atagctgcaa agtgg 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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tgagtctatt taaagcgggt aattttcttg acttt 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 33
caagaaaatt acccgcttta aatagactca cccca 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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ctctagagga tccccgcctt aatttgggcg gattg 35
<210> 35
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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ttcctggtct gacgacagtg 20
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<212> DNA
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<220>
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gatgtcttca gcttcaccct g 21
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<220>
<223> primer
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ccgaggataa tccacaaggt 20
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<220>
<223> primer
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cgaagcgttc gtcgatttct 20
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 40
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gtgggagagt acgtcactcg cgttgttacc cacttcaagg aacagcgcca cgaggacgag 2640
cacttccgcg attgggtcca gcgggccgct gaggaagatt tggtgtgagt cttcggagga 2700
aacccaatcc caaccgcaac caccctctgt actgcccata ctgcgcggga gaagttcttt 2760
tccccgatga gcaaacagaa ttcgcgtggt tgtgtgcgga ttgcaccaga gtttttgaag 2820
tgaaatatca cggccaggac gatccagtgc acaggccagc accagcaaag tccacatcgc 2880
aagcattaaa agaatctctc gaaagacaca aaagaggtga gtcgcaacaa tgagctttca 2940
actagttaac gccctgaaaa atactggttc ggtaaaagat cccgagatct cacccgaagg 3000
acctcgcacg accacaccgt tgtcaccaga ggtagcaaaa cataacgagg aactcgtcga 3060
aaagcatgct gctgcgttgt atgacgccag cgcgcaagag atcctggaat ggacagccga 3120
gcacgcgccg ggcgctattg cagtgacctt gagcatggaa aacaccgtgc tggcggagct 3180
ggctgcgcgg cacctgccgg aagctgattt cctctttttg gacaccggtt accacttcaa 3240
ggagaccctt gaagttgccc gtcaggtaga tgagcgctat tcccagaagc ttgtcaccgc 3300
gctgccgatc ctcaagcgca cggagcagga ttccatttat ggtctcaacc tgtaccgcag 3360
caacccagcg gcgtgctgcc gaatgcgcaa agttgaaccg ctggcggcgt cgttaagccc 3420
atacgctggc tggatcaccg gcctgcgccg cgctgatggc ccaacccgtg ctcaagcccc 3480
tgcgctgagc ttggatgcca ccggcaggct caagatttct ccaattatca cctggtcatt 3540
ggaggaaacc aacgagttca ttgcggacaa caacctcatc gatcacccac ttacccatca 3600
gggttatcca tca 3613
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 41
caacgaaagg aaacaatgtc tacttcagtt acttc 35
<210> 42
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 42
tagtcagaga gtgatttaga cgttaaagta ctttg 35
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 43
atcaaaacag atatcatgac aacaaccacc ggaag 35
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 44
cgctagtcag agagttcaca ccaaatcttc ctcag 35
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 45
ccgatcagcg taagtagaaa catcccagcg ctact 35
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 46
aactgaagta gacattgttt cctttcgttg ggtac 35
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 47
tactttaacg tctaaggtac cggcgcttca tgtca 35
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 48
ggtggttgtt gtcatgatat ctgttttgat ctcct 35
<210> 49
<211> 3261
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 49
cctcactggc gaacacggcc gactcctgga acagcgcaac atggcatgga cgaaactcaa 60
cgaaatccca ggtgtcagct gtgtgaaacc aatgggagct ctatacgcgt tccccaagct 120
cgaccccaac gtgtacgaaa tccacgacga cacccaactc atgctggatc ttctccgtgc 180
cgagaaaatc ctcatggttc agggcactgg cttcaactgg ccacatcacg atcacttccg 240
agtggtcacc ctgccatggg catcccagtt ggaaaacgca attgagcgcc tgggtaactt 300
cctgtccact tacaagcagt agtagttgtt aggattcacc acgaatctca ggatttttga 360
gattcgtggt gaatttttgc gttttccagt caggctcctg caactttcgg accgatttca 420
gaggggcgga gctggtttgt ggtggatcct tgaaatggaa cctcgcagga agctttcagg 480
aagaccaagt tgggcctagg ggtggcggga ttgcaaaaat ccgtccccgg ttcgccatga 540
aatgctgatt ttgatcgaat ctttgcgcta actgtagggc gggttcaggg ggtgaatgca 600
ccacgagcaa cccgaagggt gcgaagtggg cattcgtaga acaatcccag aggaaagccg 660
tacggctttc ctcgacatga tcaatcaagg tatgtcaggt cttgctgcgt ctacagcggt 720
cggggtcagt gaattcaccg ggcgaaagtg ggcgaaggcc gccggggtga aactgacccg 780
cggcccgcga ggtggcaatg cttttgacac cgccgagaaa cttgagattg cagccagcat 840
gctagagaaa ggatgcctac cccgagaaat cggcgagtat gtcggcatga ctcgggccaa 900
tatatcccta tggcgcaaac aaggcccaga caagcttcgc caacgcgcag ccaccttgcg 960
caccggcaag cgagcagctg aattcatcca cgccccggtg atgggccctt attatgggcc 1020
acgcacactc catcaagtgt tgcgtgagga ctacacaaca ctgtttgacg agttatctgc 1080
gttggggttg ccagcacagg tgtgtggggc cttacttcat cttgctccac caccatcatt 1140
acgcttttct tatatgtcgt gtgtagtgcc gttatttgct gatgaaatca aagtcgtagg 1200
acaaggcaca cgattatcgt tagaagagaa aatgatgatc caacgtttcc atgacaccgg 1260
ggtcagtgca gcagaaatcg gtcgacgcct gggtcggtgt cggcaaacaa tttccaggga 1320
acttcgacgt ggtcaagatg atgatggacg ttatcgtgca cgcgactcct atgaaggtgc 1380
gatcaggaaa ctagcgcgtc cgaaaacacc gaaacttgat gccaatcgta ggcttcgggc 1440
tgtggtggtc gaggcgttga ataataaatt atctccggag cagatttctg gtcttttagc 1500
caccgagcat gctaacgata gctctatgca gattagtcat gaaactattt accaggcgtt 1560
atatgttcaa ggtaaagggg cgttgcgtga tgaattgaag gtggagaaat ttcttcgtac 1620
cggtcggaag ggacgtaaac cgcagtcgaa gttgccatcg agaggtaagc cgtgggtgga 1680
gggtgcgttg attagtcaac gcccagcaga agttgctgat cgtgctgtgc ctgggcactg 1740
ggagggcgat ttagtaattg gtggtgaaaa ccaagcgaca gcgttggtga cgttggtgga 1800
gcgcacgagc cggttgacgt tgattaagcg gttgggggtt aatcatgagg cgtcgactgt 1860
gacggatgcg ttggtggaga tgatgggtga tttgccgcag gcgttgcgtc ggagtttgac 1920
gtgggatcag ggtgtggaga tggcagagca tgcgcggttt agcgtggtga ccaagtgtcc 1980
ggtgtttttc tgtgatcctc attcgccgtg gcagcgtggg tcgaatgaga atacgaatgg 2040
attggtcagg gattttttcc cgaagggcac taattttgct aaagtaagtg acgaagaagt 2100
tcagcgggca caggatctgc tgaattaccg gccgcggaaa atgcatggtt ttaaaagcgc 2160
gacgcaggta tatgaaaaaa tcgtagttgg tgcatccacc gattgaattc gcctaggaga 2220
ttgtacgaaa attcgttcgg ctttcggatt tcctggcgat ctgagacgag aagttgaaca 2280
gctaacctgc agaaaccttg caagaatcac aacagcccca atggcctcaa aagtcacgcc 2340
ctcagaatcg ctgccaggcg tctaaatccc ctaaaacggg acaataggtc actgggcgat 2400
cccaagccct taaaacgtga tccttaaata cccactgtcc tctattctgg gttaggcttc 2460
actgggtaaa agtgcctgcc tatgcctgaa acttgagcat ggcaacagca aggagacacc 2520
gtgggaaaac atgcagctga aacatcggaa ccgaagaaaa attcaccgtg gcgcattggt 2580
ttgttgacgt ttttgatttc ttcagttgtc gtgacgctgg tgggcatggt gatgctgtgg 2640
ccggattctg atgatgtggt gttggcggat aacttttcgc agacgtttgc gggaaatcat 2700
gagcaggtgg atggaacgat cacgctcgtt gataattctg cgtgtaattc gccagacacc 2760
ggccgagttt ttgcggaaag ccccacgatt tctgcggagc cggcaacgtt ggagtgcgtg 2820
cgtgcactcg tagacatcac atcgggtgcc aatgaggggc agaaaactca gctgatcact 2880
tacgcgcaac ctggtgatcc ggagttttcc gagggcgaca agatccgcat ggtggaaaca 2940
ccggatacaa atggcgagat catctacacc tttgctgatt accagcgcgg accggcgttg 3000
atcatttggg gtgtggttct cattgtggcg atgggagctt tcgcggcgtg gcgaggtgtg 3060
cgtgcgctgg ttggtttggt cgtcaccttg ggaattgttg gtattttctt gctgccagga 3120
ttggccagcg ggcacgatgc gatgtggttg gcgctggtgt gtggcgcggc gatcttgttg 3180
attgtggtgc cgatggttca cggaatcaac tggaaatcgg cagctgcgtt ggcgggcacg 3240
ctggtggcat tgttgttgtc g 3261
<210> 50
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 50
gtacccgggg atcctctaga cctgggtaac ttcctgtcca 40
<210> 51
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 51
caggttagca gtacttctca agtttctcgg cggtg 35
<210> 52
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 52
aacttgagaa gtactgctaa cctgcagaaa ccttg 35
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 53
gcctgcaggt cgactctaga ctccgcagaa atcgtggggc 40
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 54
cgccgagaaa cttgagaagt ggcgcttcat gtcaa 35
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 55
ctgcaggtta gcagtttagt caaggccccg caaca 35
<210> 56
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 56
ctgcaggtta gcagttcaca agctgttaag cgaag 35
<210> 57
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 57
ctgcaggtta gcagttcaga tcaccgcgag cgcct 35
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 58
ttctccgtgc cgagaaaatc 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 59
gtagatgatc tcgccatttg 20
<210> 60
<211> 394
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 60
Met Ala Ser Asp Ala Pro His Leu Pro Leu His Pro Glu Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ile Arg Ala Gly Leu Glu Thr Ser Gln Phe Asn Glu His Ser Gln Gly
20 25 30
Leu Phe Leu Thr Ser Ser Phe Thr Tyr Glu Ser Ala Ala Gln Ala Ala
35 40 45
Ala Met Phe Leu Gly Glu Ile Asp Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Phe Thr
50 55 60
Asn Pro Thr Val Ala Ala Phe Gln His Arg Leu Ala Gln Met Glu Gly
65 70 75 80
Gly Glu Arg Ala Ile Ala Thr Ala Thr Gly Met Ala Ala Ile Gln Ala
85 90 95
Ile Met Met Thr Leu Leu Gln Ala Gly Asp His Ile Val Ser Ser Gln
100 105 110
Ser Leu Phe Gly Ser Thr Thr Asn Leu Phe Ala Asn Gln Leu Ala Lys
115 120 125
Phe Ala Val Ala Thr Asp Phe Val Asp Ala Arg Asp Leu Ser Ala Trp
130 135 140
Arg Glu Ala Leu Arg Pro Asn Thr Lys Leu Leu Phe Leu Glu Thr Pro
145 150 155 160
Ser Asn Pro Leu Thr Glu Val Ala Asp Ile Ala Ala Ile Ala Asp Ile
165 170 175
Ala His Ala His Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Asn Ser Phe Cys Ser
180 185 190
Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Lys Leu Gly Ala Asp Leu Val Met His
195 200 205
Ser Ala Thr Lys Phe Ile Asp Gly His Gly Arg Val Met Gly Gly Ala
210 215 220
Val Val Gly Ser Asp Lys Leu Val Glu Gln Val Tyr Leu His Val Arg
225 230 235 240
Ala Ala Gly Pro Ser Leu Ala Pro Phe Asn Ala Trp Thr Leu Leu Ser
245 250 255
Gly Leu Glu Thr Leu His Leu Arg Met Glu Lys His Ser Ala Asn Ala
260 265 270
Leu Glu Leu Ala Arg Trp Leu Glu Ala Gln Pro Asn Val Glu Arg Val
275 280 285
Tyr Tyr Pro Gly Leu Glu Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Leu Arg
290 295 300
Gln Gln Lys Ser Gly Gly Ala Val Val Ser Phe Val Val Lys Gly Gly
305 310 315 320
Arg Lys Ala Ala Trp Lys Val Val Asp Ala Val Arg Val Ile Ser Arg
325 330 335
Thr Ala Asn Leu Gly Asp Val Lys Thr Thr Leu Thr His Pro Ala Ser
340 345 350
Thr Thr His Ala Arg Val Thr Gln Glu Ala Arg Glu Arg Ala Gly Ile
355 360 365
Val Glu Gly Leu Leu Arg Val Ser Val Gly Leu Glu Asn Val Arg Asp
370 375 380
Leu Gln Gln Asp Leu Leu Arg Gly Leu Asp
385 390
<210> 61
<211> 399
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Hyphomonas neptunium
<400> 61
Met Ala Asp Ala Pro Gly Gly Asp Lys Lys Gly Trp Lys Pro Ala Thr
1 5 10 15
Gln Ala Val Arg Gly Gly Leu Met Arg Ser Gln His Gly Glu Ile Ser
20 25 30
Glu Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Gly Tyr Ala Tyr Asp Ser Ala Glu Gln
35 40 45
Ala Met Arg Arg Met Ala Gly Glu Glu Glu Gly Phe Val Tyr Ser Arg
50 55 60
Tyr Gly Ser Pro Thr Asn Glu Met Leu Gln Gln Arg Leu Ala Leu Ile
65 70 75 80
Glu Gly Ala Glu Ala Cys Arg Val Thr Gly Ser Gly Met Gly Ala Ile
85 90 95
Ser Ser Ala Ile Leu Ala Pro Leu Lys Ala Gly Asp Arg Val Val Ala
100 105 110
Ala Thr Ala Leu Phe Gly Ser Cys Arg Trp Ile Ile Ala Asn Gln Met
115 120 125
Pro Lys Phe Gly Ile Glu Ala Val Phe Val Asp Gly Ala Asp Leu Asp
130 135 140
Ala Trp Lys Arg Glu Ile Asp Lys Gly Cys Gln Leu Val Leu Ile Glu
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asn Pro Leu Leu Asp Gly Val Asp Ile Glu Ala Val Ala
165 170 175
Arg Leu Ala Lys Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Asn Val Phe
180 185 190
Ala Thr Pro Val Leu Gln Arg Pro Leu Glu Met Gly Ala Asp Val Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Ala Thr Lys His Met Asp Gly Gln Gly Arg Val Leu Leu
210 215 220
Gly Ala Ile Leu Thr Asp Ala Lys Arg Met Ser Asp Val Tyr Asp Pro
225 230 235 240
Trp Leu Arg His Met Gly Pro Ala Ala Ser Pro Phe Asn Ala Trp Val
245 250 255
Val Leu Lys Gly Leu Glu Thr Met Gln Leu Arg Val Glu Ala Gln Ser
260 265 270
Arg Thr Ala Ala Arg Leu Ala Asp Val Leu Ala Asp His Pro Ala Val
275 280 285
Asn Ala Val Arg Tyr Pro His Arg Lys Asp His Pro His Tyr Glu Val
290 295 300
His Lys Arg Gln Met Lys Ser Gly Gly Thr Leu Leu Ala Leu Ser Leu
305 310 315 320
Lys Gly Gly Gln Asp Ala Ala Phe Arg Phe Leu Asn Gly Leu Gln Leu
325 330 335
Val Asp Ile Cys Asn Asn Leu Gly Asp Thr Lys Ser Leu Ala Cys His
340 345 350
Pro Ser Thr Thr Thr His Arg Ala Leu Ser Asp Glu Asp Gln Ala Ala
355 360 365
Met Gly Leu Asp Arg Ser Trp Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp
370 375 380
Ala Asp Asp Leu Glu Ala Asp Leu Leu Ala Ser Leu Asn Ser Leu
385 390 395
<210> 62
<211> 393
<212> PRT
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 62
Met Thr Lys Asp Trp Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ser Gln Tyr Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln
20 25 30
Gly Phe Val Tyr Asp Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu
35 40 45
Thr Gly Ala Asp Glu Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr
50 55 60
Arg Met Phe Glu Glu Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala
65 70 75 80
Phe Ala Thr Ala Ser Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser
85 90 95
Ile Val Arg Ala Gly Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly
100 105 110
Ser Cys Ile Tyr Ile Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu
115 120 125
Val Thr Phe Val Asp Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val
130 135 140
Arg Pro Gly Thr Lys Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr
145 150 155 160
Leu Glu Val Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val
165 170 175
Gly Ala Leu Val Ile Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser
180 185 190
Thr Ala Val Arg Gln Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys
195 200 205
His Ile Asp Gly Gln Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser
210 215 220
Gln Ala Phe Ile Arg Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly
225 230 235 240
Gly Ser Met Ser Pro Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala
245 250 255
Thr Leu Asp Leu Arg Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile
260 265 270
Ala Arg Ala Leu Glu Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro
275 280 285
Ala Leu Glu Ser His Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu
290 295 300
Arg Pro Gly Thr Met Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala
305 310 315 320
Ala Phe Arg Phe Leu Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn
325 330 335
Leu Gly Asp Ala Arg Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His
340 345 350
Gln Arg Leu Ser Asp Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly
355 360 365
Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala
370 375 380
Asp Leu Lys Gln Ala Leu Ala Val Ile
385 390
<210> 63
<211> 1185
<212> DNA
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 63
atggcatccg acgcgccgca tcttccgctg caccctgaaa ccctggccat ccgggccggg 60
ttggaaacca gccagttcaa cgagcacagc cagggcctgt tcctgacgtc cagcttcacc 120
tacgaatcgg ccgcgcaggc ggcggcgatg ttcctgggcg agatcgacgg ctacacctat 180
tcccgcttca ccaatccgac cgtcgccgcg ttccagcata ggctggcgca gatggagggc 240
ggggagcgcg ccatcgccac cgccaccggc atggcggcga tccaggccat catgatgact 300
ttgctgcagg ctggcgacca catcgtgtcg tcgcaaagcc tgttcggctc caccaccaat 360
ctgttcgcca accagttggc caagttcgcc gtggccaccg acttcgtcga cgcgcgcgac 420
ctgtccgcct ggcgggaggc gctgcggccg aacaccaagc tgctgttcct ggagacgccg 480
tccaatccct tgaccgaagt ggccgacatc gcggccatcg ccgacatcgc ccacgcgcat 540
ggcgcgctgc tggtggtgga caacagcttc tgttcgccgg ccttgcagca gccgttgaaa 600
ctgggcgccg atctggtcat gcattccgcc accaagttca tcgacggcca tggccgggtg 660
atgggcgggg cggtggtcgg cagcgacaag ctggtcgagc aggtctattt gcacgtgcgc 720
gccgccggtc cctcgctggc gccgttcaat gcctggacgc tgctgtccgg tttggagacg 780
ctgcacctgc ggatggagaa gcacagcgcc aacgcgctgg agctggcgcg ctggctggag 840
gcgcagccca atgtggagcg cgtctattac ccgggcctgg agagccaccc ccagcacgag 900
ctggcgctgc gccagcagaa gagcggcgga gcggtggtgt ccttcgtggt caagggcggc 960
cgcaaggccg cgtggaaagt ggtggacgcg gtcagggtga tctcgcgcac cgccaatctg 1020
ggcgatgtga aaaccaccct cactcatccg gccagcacca cccacgcccg cgtgacgcag 1080
gaggcgcgcg agcgcgccgg catcgtcgag gggctgttgc gcgtcagcgt cggcctggaa 1140
aatgtacggg accttcaaca agatctgttg cggggccttg actaa 1185
<210> 64
<211> 1200
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Hyphomonas neptunium
<400> 64
atggcggatg cacccggcgg cgacaagaag ggctggaagc ctgcgaccca ggcggtacgc 60
ggcggcctga tgcggtccca gcatggggag atttccgagg cgctgtatct gacctccggc 120
tacgcttacg actcggccga gcaggcgatg cgccggatgg cgggcgagga agaaggcttc 180
gtctattccc gctatggcag cccgaccaat gagatgctgc aacagcgcct cgcgctgatt 240
gaaggcgccg aagcgtgccg ggtgacgggc tctggcatgg gcgcgatttc gtcggccatc 300
ctggcgccgc ttaaagcggg cgaccgggtg gtggcggcga ccgcgctgtt tggctcgtgc 360
cgctggatca ttgccaacca gatgccgaag tttggcatcg aggcagtgtt cgtggacggg 420
gccgatcttg atgcttggaa gcgcgagatc gacaagggct gccagctggt gctgatcgaa 480
agcccggcca atccgttgct cgacggcgtg gacatcgaag cggtcgccag gctcgccaag 540
gcggcgggcg cgctgctggt ggtggacaat gtgtttgcca cgccggtgct tcagcggccg 600
ctggaaatgg gcgccgatgt gatcgcctat tcggccacca aacatatgga cgggcagggc 660
cgcgttctgc tgggcgcgat cctgacggac gccaagcgga tgagtgatgt gtatgatccg 720
tggctgcgcc atatggggcc ggcggcctcg ccgtttaacg cctgggtagt gctgaagggc 780
cttgagacga tgcagctgcg cgtggaagcg cagagccgca cggcggcgcg gctggcggat 840
gttctggccg atcatccggc ggtcaatgcc gtgcgctatc cccaccgcaa ggatcacccg 900
cattatgagg tgcacaagcg ccagatgaaa tcgggcggca cgctgctcgc gctgtcgctc 960
aagggcgggc aggacgcggc gttccgcttc ctcaacgggc tgcagctggt cgacatctgc 1020
aacaaccttg gcgatacgaa atcgctggcc tgtcatccct ccaccacgac gcaccgcgcg 1080
ttgagtgatg aggatcaggc ggcgatgggg cttgaccgca gctgggtccg gctctctgtt 1140
ggtcttgaag acgcagatga tctggaagct gatcttctcg cttcgcttaa cagcttgtga 1200
1200
<210> 65
<211> 1182
<212> DNA
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 65
atgacgaagg actggaagac aaggacgcaa ctcgtccacg ggggcagccg ccggagccag 60
tatggcgaaa tggccgaggc gatcttcctg acccagggct tcgtctacga ctcggccgaa 120
caggccgaag cgcgcttcat cgagaccggc gccgacgaat tcatctatgc ccgctacggc 180
aaccccacga cgcgcatgtt cgaagagcgc atcgcggccg tcgagggcac cgaggatgcg 240
ttcgccaccg cctcgggcat ggccgcgatc cacggcgtgc tcacctcgat cgtgcgggcg 300
ggcgatcatc tggtggcggc gcgcgctctg ttcggctcct gcatctacat cctcgaggag 360
gtgctgggcc gattcggcgt cgaggtgacc ttcgtcgacg gcaccgatct cgatcagtgg 420
cgcgcggcgg tgcggcccgg cacgaaggcc gtgttcttcg agtcggtctc gaatccgacg 480
ctcgaggtgg ccgatatcgg cgccatcgcc gagatcgccc atgccgtggg cgcgctcgtc 540
atcgtggaca atgtcttcgc gacgcccgtc ttctcgacgg cggtgcggca gggcgcggat 600
gtggtgatct attcggccac caagcacatc gacgggcaag ggcgcgcgct cggcggcgtg 660
gtctgcgcct cgcaggcctt catccgcaag gtgctcgaac ccttcatgaa gcacaccggc 720
ggctcgatga gccccttcaa cgcctggctc atgctgaacg ggatggcgac gctcgacctg 780
cgctgccgcg cgatggccga cacggccgag aagatcgccc gcgcgctcga gggccatccg 840
cagctcggcc gcgtgatcca tcccgcgctg gaaagccacc cgcagcacga gatggccaag 900
gcgcagatgg agcgtcccgg cacgatgatc gcgctcgacc tcgccggggg caaggaggcg 960
gccttccgct tcctcgacgc cctgaggatc gtgaagatct ccaacaatct gggcgatgcc 1020
cgctcgatcg cgacccaccc ggcaacgacc acccaccagc gtctttccga cgcgcagaag 1080
gcccatctcg gcatcacgcc cgggctcgtg cggctgtcgg tggggctcga ggatgcggac 1140
gacctgatcg ccgatctgaa acaggcgctc gcggtgatct ga 1182
<210> 66
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RspmetZ_long
<400> 66
Met Gly Ile Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp
1 5 10 15
Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr
20 25 30
Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu
50 55 60
Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser
85 90 95
Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly
100 105 110
Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile
115 120 125
Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys
145 150 155 160
Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp
165 170 175
Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile
180 185 190
Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln
195 200 205
Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln
210 215 220
Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg
225 230 235 240
Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro
245 250 255
Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg
260 265 270
Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu
275 280 285
Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His
290 295 300
Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met
305 310 315 320
Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu
325 330 335
Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg
340 345 350
Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp
355 360 365
Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser
370 375 380
Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala
385 390 395 400
Leu Ala Val Ile
<210> 67
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RspmetZ_3
<400> 67
Met Gly Asn Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp
1 5 10 15
Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr
20 25 30
Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu
50 55 60
Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser
85 90 95
Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly
100 105 110
Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile
115 120 125
Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys
145 150 155 160
Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp
165 170 175
Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile
180 185 190
Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln
195 200 205
Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln
210 215 220
Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg
225 230 235 240
Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro
245 250 255
Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg
260 265 270
Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu
275 280 285
Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His
290 295 300
Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met
305 310 315 320
Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu
325 330 335
Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg
340 345 350
Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp
355 360 365
Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser
370 375 380
Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala
385 390 395 400
Leu Ala Val Ile
<210> 68
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RspmetZ_65
<400> 68
Met Gly Ile Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp
1 5 10 15
Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr
20 25 30
Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu
50 55 60
Tyr Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser
85 90 95
Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly
100 105 110
Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile
115 120 125
Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys
145 150 155 160
Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp
165 170 175
Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile
180 185 190
Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln
195 200 205
Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln
210 215 220
Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg
225 230 235 240
Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro
245 250 255
Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg
260 265 270
Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu
275 280 285
Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His
290 295 300
Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met
305 310 315 320
Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu
325 330 335
Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg
340 345 350
Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp
355 360 365
Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser
370 375 380
Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala
385 390 395 400
Leu Ala Val Ile
<210> 69
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RspmetZ_104
<400> 69
Met Gly Ile Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp
1 5 10 15
Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr
20 25 30
Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu
50 55 60
Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser
85 90 95
Gly Met Ala Ala Ile His Gly Ala Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly
100 105 110
Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile
115 120 125
Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys
145 150 155 160
Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp
165 170 175
Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile
180 185 190
Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln
195 200 205
Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln
210 215 220
Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg
225 230 235 240
Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro
245 250 255
Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg
260 265 270
Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu
275 280 285
Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His
290 295 300
Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met
305 310 315 320
Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu
325 330 335
Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg
340 345 350
Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp
355 360 365
Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser
370 375 380
Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala
385 390 395 400
Leu Ala Val Ile
<210> 70
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RspmetZ_196
<400> 70
Met Gly Ile Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp
1 5 10 15
Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr
20 25 30
Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu
50 55 60
Phe Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser
85 90 95
Gly Met Ala Ala Ile His Gly Val Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly
100 105 110
Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile
115 120 125
Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys
145 150 155 160
Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp
165 170 175
Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile
180 185 190
Val Asp Asn Ile Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln
195 200 205
Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln
210 215 220
Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg
225 230 235 240
Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro
245 250 255
Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg
260 265 270
Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu
275 280 285
Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His
290 295 300
Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met
305 310 315 320
Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu
325 330 335
Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg
340 345 350
Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp
355 360 365
Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser
370 375 380
Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala
385 390 395 400
Leu Ala Val Ile
<210> 71
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RspmetZ_3_65_104
<400> 71
Met Gly Asn Ala Phe Arg Glu Gly Arg Thr Gly Met Thr Lys Asp Trp
1 5 10 15
Lys Thr Arg Thr Gln Leu Val His Gly Gly Ser Arg Arg Ser Gln Tyr
20 25 30
Gly Glu Met Ala Glu Ala Ile Phe Leu Thr Gln Gly Phe Val Tyr Asp
35 40 45
Ser Ala Glu Gln Ala Glu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Gly Ala Asp Glu
50 55 60
Tyr Ile Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Thr Arg Met Phe Glu Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ala Ala Val Glu Gly Thr Glu Asp Ala Phe Ala Thr Ala Ser
85 90 95
Gly Met Ala Ala Ile His Gly Ala Leu Thr Ser Ile Val Arg Ala Gly
100 105 110
Asp His Leu Val Ala Ala Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Ile Tyr Ile
115 120 125
Leu Glu Glu Val Leu Gly Arg Phe Gly Val Glu Val Thr Phe Val Asp
130 135 140
Gly Thr Asp Leu Asp Gln Trp Arg Ala Ala Val Arg Pro Gly Thr Lys
145 150 155 160
Ala Val Phe Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Thr Leu Glu Val Ala Asp
165 170 175
Ile Gly Ala Ile Ala Glu Ile Ala His Ala Val Gly Ala Leu Val Ile
180 185 190
Val Asp Asn Val Phe Ala Thr Pro Val Phe Ser Thr Ala Val Arg Gln
195 200 205
Gly Ala Asp Val Val Ile Tyr Ser Ala Thr Lys His Ile Asp Gly Gln
210 215 220
Gly Arg Ala Leu Gly Gly Val Val Cys Ala Ser Gln Ala Phe Ile Arg
225 230 235 240
Lys Val Leu Glu Pro Phe Met Lys His Thr Gly Gly Ser Met Ser Pro
245 250 255
Phe Asn Ala Trp Leu Met Leu Asn Gly Met Ala Thr Leu Asp Leu Arg
260 265 270
Cys Arg Ala Met Ala Asp Thr Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ala Leu Glu
275 280 285
Gly His Pro Gln Leu Gly Arg Val Ile His Pro Ala Leu Glu Ser His
290 295 300
Pro Gln His Glu Met Ala Lys Ala Gln Met Glu Arg Pro Gly Thr Met
305 310 315 320
Ile Ala Leu Asp Leu Ala Gly Gly Lys Glu Ala Ala Phe Arg Phe Leu
325 330 335
Asp Ala Leu Arg Ile Val Lys Ile Ser Asn Asn Leu Gly Asp Ala Arg
340 345 350
Ser Ile Ala Thr His Pro Ala Thr Thr Thr His Gln Arg Leu Ser Asp
355 360 365
Ala Gln Lys Ala His Leu Gly Ile Thr Pro Gly Leu Val Arg Leu Ser
370 375 380
Val Gly Leu Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp Leu Lys Gln Ala
385 390 395 400
Leu Ala Val Ile
<210> 72
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 72
atcaaaacag atatcatggg tatcgcgttt cgtga 35
<210> 73
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 73
ccttcacgaa acgcgttacc catgatatct g 31
<210> 74
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 74
cagatatcat gggtaacgcg tttcgtgaag g 31
<210> 75
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 75
tagcgggcat agatgtattc gtcggcgccg g 31
<210> 76
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 76
ccggcgccga cgaatacatc tatgcccgct a 31
<210> 77
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 77
acgatcgagg tgagcgcgcc gtggatcgcg g 31
<210> 78
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 78
ccgcgatcca cggcgcgctc acctcgatcg t 31
<210> 79
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 79
cgggcgtcgc gaagatattg tccacgatga c 31
<210> 80
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 80
gtcatcgtgg acaatatctt cgcgacgccc g 31
Claims (18)
- 외래 metZ 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질 자체가 도입된 코리네박테리움 속 미생물을 티오설페이트를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, L-메티오닌 제조방법으로,
상기 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium violaceum), 하이호모나스 넵튜니윰 (Hyphomonas neptunium) 또는 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides)유래인 것인, L-메티오닌 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질은 O-아실호모세린 트랜스설퓨레이즈(acylhomoserine transsulfurase)활성을 갖는 것인, L-메티오닌 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질은 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium violaceum) 또는 하이호모나스 넵튜니윰 (Hyphomonas neptunium) 유래인 것인, L-메티오닌 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 60, 61 및 62 중 어느 하나의 폴리펩티드 서열 및 이와 90% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, L-메티오닌 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은, 시스타티오닌 감마 신타아제의 활성 약화 또는 불활성; O-아세틸호모세린 설피드릴라제의 활성 약화 또는 불활성; 메티오닌-시스테인 생합성 억제인자의 활성 약화 또는 불활성; 메티오닌 합성 효소의 활성 강화; 및 설파이트 환원 효소의 활성 강화로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는, L-메티오닌 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, L-메티오닌 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제조방법은 L-메티오닌을 상기 미생물 또는 배지로부터 회수하는 것을 포함하는, L-메티오닌 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 호모란티오닌 생성량이 감소되는 것인, L-메티오닌 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (8)
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---|---|---|---|
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EP20883239.4A EP4032981A4 (en) | 2019-10-28 | 2020-10-28 | L-METHIONINE-PRODUCING MICROORGANISM INTO WHICH A PROTEIN ENCODED BY A FOREIGN METZ GENE IS INTRODUCED AND METHOD FOR PRODUCING L-METHIONINE USING THE SAME |
US17/754,988 US20230212623A1 (en) | 2019-10-28 | 2020-10-28 | L-methionine producing microorganism to which protein encoded by foreign metz gene is introduced and method for producing l-methionine using same |
PCT/KR2020/014780 WO2021085999A1 (ko) | 2019-10-28 | 2020-10-28 | 외래 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 도입된 L-메티오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-메티오닌 생산방법 |
CN202080076044.6A CN114729379A (zh) | 2019-10-28 | 2020-10-28 | 引入外源metZ基因编码蛋白的L-蛋氨酸生产微生物及利用其生产L-蛋氨酸的方法 |
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