KR102359675B1

KR102359675B1 - 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 조성물

Info

Publication number: KR102359675B1
Application number: KR1020210072612A
Authority: KR
Inventors: 김지영; 이태훈; 김강비
Original assignee: 주식회사 큐어세라퓨틱스
Priority date: 2021-06-04
Filing date: 2021-06-04
Publication date: 2022-02-08

Abstract

본 발명은 오록실린 A (Oroxylin A) 를 포함하는, 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 조성물 및 이를 이용한 간 유래 세포로부터 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 간 세포로부터 암모니아 제거능, 요소 합성능이 증진된 간 유사 세포를 효과적으로 제조할 수 있으며, 이와 같이 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포는 간 세포가 필요한 다양한 연구 및 간질환 치료 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 조성물 {Composition for inducing differentiation into hepatocyte-like cells having increased urea synthesis activity}

본 발명은 오록실린 A (Oroxylin A) 를 포함하는, 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 조성물 및 이를 이용한 간 유래 세포로부터 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 제조 방법에 관한 것이다.

간은 신체 항상성 조절에 중요한 기관이며, 생명 유지와 관련된 다수의 대사 경로 부위이다. 복잡한 대사 경로 내에서 오직 하나의 단백질이 손상되어도 고도로 해로울 수 있다. 간의 대사와 관련된 중요한 효소들이 간에 다수 존재하며, 이들에게 이상이 생기는 경우, 실질적으로 다양한 간 질환의 발생 위험도 증가하게 된다. 간 대사와 관련된 약 200가지의 상이한 선천성 이상이 존재하는 것으로 알려져 있다.

한편 간질환의 간 이식 치료에 있어서 가장 큰 문제점은 공여자의 부족이다. 이러한 간 이식의 문제점에 대한 대안으로 최근 간세포를 이용한 세포 대체 치료방법이 새로운 대안으로 떠오르고 있고, 이에 따라, 무한 증식할 수 있는 인간 배아줄기세포가 간세포를 다량 공급할 수 있는 재료로 각광을 받고 있다. 그러나 인간 배아줄기세포로부터 유도 분화한 간세포를 간질환 세포 치료제로서 사용하기에는 완벽한 정상 간 기능을 가진 간세포를 제조하기 어렵고 이에 따라 손상된 간 기능을 효율적으로 회복시킬 수 없다는 한계점이 있다. 따라서 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도한 간세포를 간질환의 세포 대체 치료 목적으로 사용하기에는 현재까지 많은 어려움이 따른다.

따라서 다양한 간질환에 사용될 수 있는 기능성이 강화된 간 세포를 수득할 수 있는 방법에 대한 필요성이 있다.

이에 본 발명자들은 간 기능성이 강화된 간세포를 분화유도할 수 있는 방법에 대하여 연구하던 중, 간 세포 분화 유도 과정에 오록실린 A 를 처리하면, 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포를 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포를 효과적으로 유도할 수 있는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오록실린 A (Oroxylin A) 를 포함하는, 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 1) 간 유래 세포를 내배엽 세포로 분화 시키는 단계; 2) 상기 1) 단계의 내배엽 세포를 간모세포로 분화시키는 단계; 3) 상기 2) 단계의 간모세포를 미성숙 간 유사 세포로 분화시키는 단계; 및 4) 상기 3) 단계의 미성숙 간 유사 세포에 오록실린 A 를 처리하는 단계; 를 포함하는 요소합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 1) 1-1) 혈청, 액티빈 A 및 Wnt3가 더 포함된 배지에서 1 내지 2일 동안 배양하는 단계; 1-2) 혈청 및 액티빈 A 가 더 포함된 배지에서 3 내지 5일 동안 배양하는 단계; 를 포함하는, 간유래 세포를 내배엽 세포로 분화 시키는 단계; 2) 상기 1) 단계의 내배엽 세포를 간세포 성장인자, 니코틴아마이드 및 다이메틸설폭사이드 가 더 포함된 배지에서 배양하여 간모세포로 분화시키는 단계; 3) 상기 2) 단계의 간모세포를 간세포 성장인자, 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제가 더 포함된 배지에서 1 내지 5일 동안 배양하여 미성숙 간 유사 세포로 분화시키는 단계; 및 4) 상기 3) 단계의 미성숙 간 유사 세포를 오록실린 A, 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제가 더 포함된 배지에서 5 내지 13일 동안 배양하는 단계; 를 포함하고, 상기 1) 내지 4) 단계는 글루타맥스 (GlutaMax), 소혈청 알부민, 젠타마이신 및 콜라겐 타입 I 이 포함된 배지에서 수행되는 것인, 요소합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 간 세포로부터 암모니아 제거능, 요소 합성능이 증진된 간 유사 세포를 효과적으로 제조할 수 있으며, 이와 같이 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포는 간 세포가 필요한 다양한 연구 및 간질환 치료 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 분화 프로토콜 4 단계를 모식화한 도이다.
도 2는 본 발명의 분화 프로토콜의 각 단계에 따른 세포 형태를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 분화 프로토콜에 따라 분화 유도된 세포에서 간 유사 세포 특유의 핵형을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 간세포(HepG2), 분화 유도 전의 간 유래 세포 (Liver-derived cell) 및 본 발명의 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 (HepaCell) 의 암모니아 제거능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 간세포(HepG2), 간유래 세포(D20) 및 본 발명의 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 (HepaCell) 의 요소 합성능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 간, 분화 유도 전의 간 유래 세포 (Liver-derived cell) 및 본 발명의 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 (Hepa cell 1, 2) 에서의 요소 회로 관련 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 분화 유도 전의 간 유래 세포 (Liver-derived cell) 및 본 발명의 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 (HepaCell) 에서의 LDL uptake 기능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 오록실린 A (Oroxylin A) 를 포함하는, 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 오록실린 A (CAS number: 480-11-5)는 O-methyl기를 가지고 있는 flavone이며 황금에서 발견되었다. 오록실린 A 는 항염, 항암, 항혈전 작용을 나타내거나, 항 바이러스 활성을 갖는 것으로 알려진 물질로, 하기 화학식 1 로 표시된 구조를 갖는다.

[화학식 1]

본 발명의 오록실린 A 는 오록실린 A 와 동등한 정도의 활성을 나타낼 수 있는 이의 유도체, 유사체를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 오록실린 A 는 간유래 세포의 분화 유도 과정에 배지에 첨가되어, 세포가 특히 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포로 분화될 수 있도록 할 수 있다.

본 발명에 있어 간 유사세포 (hepatocyte-like cell, HLC) 는 간세포와 거의 동일한 특징을 갖도록 분화된 세포를 의미한다. 상기 간세포 유사세포는 간모세포로부터 분화된 세포를 의미할 수 있으며, 시험관 내에서 제조된 간세포와 동일 유사한 의미로 사용될 수 있다. 본 발명의 간 유사세포는 오록실린 A 첨가 배양을 통해 요소합성능이 증대된 것을 특징으로 할 수 있고, 본 발명에서는 HepaCell 로 지칭된다.

상기 간 모세포는 간세포의 전구세포를 의미하며, 배아줄기세포로 유래된 것일 수 있다. ㅇ배아 줄기세포는 전능성 또는 다능성 세포일 수 있고, 배아줄기세포가 내배엽 세포를 거쳐 간모세포로 분화될 수 있다.

오록실린 A 는 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포를 제조하는데 충분한 농도로 배지에 첨가될 수 있고, 구체적으로 1 내지 100uM 농도로 포함되는 것이 바람직하다. 오록실린 A 가 상기 범위 미만으로 포함되면, 분화 유도된 간 유사 세포에서 요소 합성능이 충분히 증대되지 않을 수 있고, 상기 범위를 초과하여 포함되면 세포에 독성을 유발할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 배지는 간세포 배양에 적절한 것으로 당분야에 알려져 있는 배지를 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DMEM 배지, IMDM 배지, RPMI 배지, a-DMEM 배지, 더욱 바람직하게는 IMDM 배지를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게 상기 배지에는 글루타맥스 (GlutaMax), 소혈청 알부민, 젠타마이신 및 콜라겐 타입 I 이 포함될 수 있다. 따라서 본 발명의 오록실린 A (Oroxylin A) 를 포함하는, 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 조성물은 in vitro 에 적합한 배지 조성물 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 오록실린 A 는 미성숙된 간 유사 세포의 배양과정에 첨가되어 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포로 분화를 유도할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 특히 간 유래 세포로부터 분화하여 수득된 미성숙된 간 유사 세포의 배양과정에 첨가되어 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포로 분화를 유도할 수 있다.

본 발명을 통해 제조되는 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포란, 암모니아 제거능 및/또는 요소 합성능이 오록실린 A 를 첨가하지 않은 분화 유도 조건에서 배양된 간세포, 간 유래 세포, 또는 HepG2 와 같은 세포와 비교하여 암모니아 제거능 및/또는 요소 합성능이 증대된 세포를 의미한다. 본 발명의 방법으로 제조되는 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포는 암모니아 제거능이 증가되어 우수한 간세포 해독 능력을 나타낼 수 있으며, 요소 합성능이 증가되어 높은 간세포 활성을 나타낸다. 본 발명의 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포는 OTC(Ornithine transcarbamoylase) 발현이 간 유래 세포와 비교하여 증가되어 있는 간 유사 세포일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 조성물을 포함하는 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 유도용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 본 발명의 조성물 외 다른 시약이나 기구를 포함할 수 있다. 예를 들면, 대상 세포를 배양하기 위한 배양 플레이트나 분화 상태를 평가할 수 있는 시약을 포함할 수 있고, 배양하는 대상이 되는 미분화된 간 유사 세포를 구비하고 있을 수도 있다.

본 발명에 따른 키트는 본 발명의 조성물 외의 시약 모두를 적절한 용량 및/또는 형태로 함유한 하나의 용기일 수 있거나, 각각 다른 용기에 의해 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 상술한 본 발명에 따른 방법을 실시하기 위한 순서 등을 기재한 설명서를 포함할 수 있다.

상기 제조방법에 있어, 상기 오록실린 A 는 1~100uM 농도로 처리될 수 있고, 상기 1) 내지 4) 단계는 간세포 배양에 적절한 것으로 당분야에 알려져 있는 배지를 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DMEM 배지, IMDM 배지, RPMI 배지, a-DMEM 배지, 더욱 바람직하게는 IMDM 배지를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게 상기 배지에는 글루타맥스 (GlutaMax), 소혈청 알부민, 젠타마이신 및 콜라겐 타입 I 이 포함될 수 있다.

본 발명의 제조방법은 총 4 단계의 배양 단계를 포함할 수 있으며, 상기 1) 단계는 세부적인 2개의 단계로 구분될 수 있다. 보다 구체적으로 상기 1) 단계는 1-1) 혈청, 액티빈 A 및 Wnt3가 더 포함된 배지에서 1 내지 2일 동안 배양하는 단계; 및 1-2) 혈청 및 액티빈 A 가 더 포함된 배지에서 3 내지 5일 동안 배양하는 단계; 를 포함할 수 있다. 여기에서 혈청은 0.1~10%(v/v), 액티빈 A 는 1~100ng/ml, Wnt3는 1~100ng/ml 로 배지에 포함될 수 있고, 바람직하게는 혈청 0.5 내지 5%(v/v), 액티빈 A 는 20~70ng/ml, Wnt3는 20~70ng/ml 로 포함되거나, 더욱 바람직하게는 혈청 0.8 내지 1.5%(v/v), 액티빈 A 는 30~60ng/ml, Wnt3는 30~60ng/ml 로 포함될 수 있다.

상기 1-1) 단계는 1 내지 2일 동안 배양을 수행하는 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 1일 동안 배양을 수행할 수 있다. 또한 상기 1-2) 단계는 3 내지 5일 동안 배양을 수행할 수 있고, 바람직하게는 4일동안 배양을 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 2) 단계는 간모세포로 분화를 유도하는 단계로, 간세포 성장인자, 니코틴아마이드 및 다이메틸설폭사이드가 더 포함된 배지에서 1 내지 3일 동안, 더욱 바람직하게는 2일 동안 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 2) 단계에 포함되는 간세포 성장인자, 니코틴아마이드 및 다이메틸설폭사이드는 0.1~100ng/ml 간세포성장인자 (HGF), 0.1~100mM 니코틴아마이드, 0.1~10%(v/v) 다이메틸설폭사이드 (DMSO) 농도로 배지에 포함될 수 있고, 바람직하게는 1~70ng/ml 간세포성장인자 (HGF), 1~50mM 니코틴아마이드, 0.1~5%(v/v) 다이메틸설폭사이드 농도로 배지에 포함될 수 있거나, 더욱 바람직하게는 5~20ng/ml 간세포성장인자, 3~30mM 니코틴아마이드, 0.1~3%(v/v) 다이메틸설폭사이드 농도로 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 3) 단계는 간모세포를 미성숙 간 유사 세포로 분화시키는 단계로, 간세포 성장인자, 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제가 더 포함된 배지에서 1 내지 5일 동안, 더욱 바람직하게는 3일 동안 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 3) 단계에 포함되는 간세포 성장인자, 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제는 각각 0.1~100ng/ml 간세포성장인자, 1~100ng/ml 온코스타틴 M(OSM), 0.1~10uM 덱사메타손 (DEX), 0.1~10배 항산화물질 (Anti-Oxidant supplement), 0.1~10배 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS) 으로 배지에 포함될 수 있고, 바람직하게는 1~70ng/ml 간세포성장인자, 5~50ng/ml 온코스타틴 M(OSM), 0.5~5uM 덱사메타손, 0.1~5배 항산화물질, 0.1~5배 인슐린-트랜스페린-셀레늄으로 배지에 포함되거나, 더욱 바람직하게는 5~20ng/ml 간세포성장인자, 10~30ng/ml 온코스타틴 M(OSM), 0.5~3uM 덱사메타손, 0.1~3배 항산화물질, 0.1~3배 인슐린-트랜스페린-셀레늄 농도로 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 4) 단계는 미성숙 간 유사 세포를 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포로 제조하기 위한 최종 배양 단계로, 특히 오록실린 A 를 처리하는 것을 특징으로 하는 단계이다. 추가적으로 상기 4) 단계의 배양은 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제가 더 포함된 배지에서 5 내지 13일 동안, 바람직하게는 7 내지 11일, 더욱 바람직하게는 9일 동안 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 구체적으로 1~100ng/ml 온코스타틴 M(OSM), 0.1~10uM 덱사메타손(DEX), 0.1~10배 항산화물질 (Anti-Oxidant supplement), 0.1~10배 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS) 을 포함하는 배지에서 배양하거나, 바람직하게는 5~50ng/ml 온코스타틴 M(OSM), 0.5~5uM 덱사메타손, 0.1~5배 항산화물질, 0.1~5배 인슐린-트랜스페린-셀레늄을 포함하는 배지, 더욱 바람직하게는 10~30ng/ml 온코스타틴 M(OSM), 0.5~3uM 덱사메타손, 0.1~3배 항산화물질, 0.1~3배 인슐린-트랜스페린-셀레늄을 포함하는 배지에서 배양하는 것일 수 있다.

본 발명의 모든 배양 단계는 2 D 또는 3D 배양일 수 있으나, 생체 내 환경과 유사한 환경을 조성하기 위하여 3D 배양인 것이 바람직하다. 당 분야에 공지된 다양한 3D 배양방식을 사용할 수 있고, 본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포로의 분화를 유도하기 위하여 BioNoC™ carrier 를 이용하였다. BioNoC™ carrier 는 100% PET non-woven fabrics로, BioNoC™ carrier 와 같은 다공성의 3D 배양 방식을 이용하면, 세포들의 부착배양을 유도할 수 있고, 세포들이 공기 중에 주기적으로 노출되어 영양 및 산소를 원활하게 공급할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 바람직한 일 구현예로서, 본 발명은 1) 1-1) 혈청, 액티빈 A 및 Wnt3가 더 포함된 배지에서 1 내지 2일 동안 배양하는 단계; 1-2) 혈청 및 액티빈 A 가 더 포함된 배지에서 3 내지 5일 동안 배양하는 단계; 를 포함하는, 간유래 세포를 내배엽 세포로 분화 시키는 단계; 2) 상기 1) 단계의 내배엽 세포를 간세포 성장인자, 니코틴아마이드 및 다이메틸설폭사이드 가 더 포함된 배지에서 배양하여 간모세포로 분화시키는 단계; 3) 상기 2) 단계의 간모세포를 간세포 성장인자, 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제가 더 포함된 배지에서 1 내지 5일 동안 배양하여 미성숙 간 유사 세포로 분화시키는 단계; 및 4) 상기 3) 단계의 미성숙 간 유사 세포를 오록실린 A, 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제가 더 포함된 배지에서 5 내지 13일 동안 배양하는 단계; 를 포함하고, 상기 1) 내지 4) 단계는 글루타맥스 (GlutaMax), 소혈청 알부민, 젠타마이신 및 콜라겐 타입 I 이 포함된 배지에서 수행되는 것인, 요소합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 요소 생성능이 증대된 간 유사 세포 분화 프로토콜

미분화 간 유래 세포에 새로운 분화 프로토콜을 적용하여 요소 생성능이 증대된 간 유사 세포로 분화를 유도하기 위한 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 간 유래 세포는 인하대병원 인체유래물은행센터에서 환자 동의하에 제공받아 사용하였다. 간 유래 세포는 간에서 분리 배양된 세포이며, 인간 중간엽 줄기세포와 유사한 특성을 나타내는 MSC like cell 인 것으로 확인되었다. 먼저 간세포 분화를 위해 FBS 기반으로 배양한 간 유래 세포를 0.1 내지 1mg/ml 농도의 콜라겐 타입 I 으로 코팅된 배양 디시에서 100% 밀집도를 보일 때까지 증식시켰다. 생체 내 환경과 유사한 환경을 구축하기 위하여 3D 배양을 수행하였으며, 3D 유사환경을 제공하기 위해 모든 배양 단계에서 BioNoC™ carrier 을 이용하였다.

분화 프로토콜은 4 단계로 이루어져 있으며, 각 단계에 대한 방법을 구체적으로 설명하면 하기와 같다.

1 단계 : 내배엽 세포로의 분화

간 유래 세포를 내배엽 세포로 분화시키기 위해 간 유래세포를 총 5일 동안 내배엽세포로 분화시켰다. 기본 분화 배지는 IMDM 배지를 기반으로 1배 글루타맥스 (GlutaMax)와 1%(v/v) 소혈청알부민 (BSA), 10ng/ml 콜라겐 (Collagen) 타입 I, 그리고 10μg/ml 젠타마이신을 이용하였으며, 내배엽세포로의 분화 1일차에는 0.5% 소태아혈청 (FBS), 50ng/ml 액티빈 A (Activin A), 그리고 50ng/ml Wnt3a를 처리하고 이후 2% FBS와 50ng/ml 액티빈 A (Activin A) 등을 4일 간 처리하였다

2 단계 : 간모세포로의 분화

1 단계에서 얻은 내배엽 세포를 2일 동안 추가 배양하여 간모세포로 분화시켰다. 상기 세포의 간모세포로의 분화를 위해 기본 분화배지를 기반으로 10ng/ml 간세포성장인자 (HGF), 10mM 니코틴아마이드 (Nicotinamide), 1%(v/v) 다이메틸설폭사이드 (DMSO) 를 2일 동안 처리하여 간모세포로 분화시켰다.

3 단계 : 미성숙된 간 유사 세포로의 분화

2단계에서 수득된 간모세포를 미성숙된 간 유사 세포로 분화 유도하였다. 구체적으로 기본 분화배지를 바탕으로 10ng/ml 간세포성장인자, 20ng/ml 온코스타틴 M(OSM), 1uM 덱사메타손 (DEX), 1배 항산화물질, 1배 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS) 를 처리하고 3일 간 분화시켜 미성숙된 간 유사 세포를 얻었다. 항산화 물질로는 시그마-알드리치 사의 카탈로그 번호 A1345 항산화 보충물(Anti-Oxidant supplement)을 이용하였다.

4 단계 : 요소 합성능이 증진된 간 유사 세포로의 분화

성숙된 간 유사 세포로의 분화를 증진하기 위하여 3단계에서 수득한 미성숙된 간 유사 세포를 기본 분화배지를 기반으로 20ng/ml 온코스타틴 M(OSM), 1uM 덱사메타손(DEX), 1배 항산화물질, 1배 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS) 을 처리하였다. 또한 특히 요소 합성능이 증진된 간 유사 세포로의 분화를 유도하기 위하여, 10uM 오록실린 A (Oroxylin A) 을 4 단계 배양 단계에서 추가 처리하고 10일 이상 최종 분화시켰다. 항산화 물질로는 시그마-알드리치 사의 카탈로그 번호 A1345 항산화 보충물(Anti-Oxidant supplement)을 이용하였다.

상기 1 내지 4 단계의 분화 프로토콜을 본원 발명 도 1에 나타내었으며, 각 단계의 세포 형태를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 각 단계에 따라 간 유래세포의 형태가 변화되었으며, 3단계에서는 미성숙한 간세포 형태를 나타내고, 4단계에서는 분화된 간세포의 특징인 Polygonal 형태를 확인하였다. 4단계까지 분화 완료된 간 유사 세포를 Hepa Cell 로 명명하였다.

실시예 2. 분화 유도된 Hepa Cell의 간세포 특징 확인

실시예 1에서 분화유도된 Hepa cell의 핵을 DAPI 를 통해 염색하고, 간세포 특징인 다배체 핵형이 나타나는지 확인하였다. 구체적으로 DPBS를 이용해서 실시예 1에서 수득된 세포를 3번 세척한 후, 4% Paraformaldehyde를 이용해 4℃에서 30분간 고정(또는 실온에서 10분간 고정)하였다. 이후 DPBS를 이용해 세포를 3번 세척하고 0.3% Triton이 첨가된 DPBS를 처리한 후 실온에서 10분 간 배양하였다. DPBS를 이용해 다시 세포를 3번 세척한 후, 1ug/ml DAPI를 세포에 1분 간 처리하였다. DPBS를 이용해 다시 세포를 3번 세척한 후 형광현미경을 이용해 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, DAPI 염색 결과 간세포 특유의 2개 이상의 핵형을 가진 세포가 다수 관찰됨을 확인하였으며, 이를 통해 실시예 1의 분화 프로토콜이 간 유래 세포를 간 유사 세포로 효과적으로 분화 유도시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 3. 간 유사 세포 기능 확인 - 암모니아 제거능

실시예 1에서 분화유도된 Hepa cell이 간세포의 기능을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 암모니아 제거능을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 비교군으로는 실시예 1의 분화 유도 프로토콜을 수행하지 않은 간 유래 세포 및 간세포인 HepG2 세포를 이용하였다.

암모니아 제거능을 확인하기 위하여, DPBS를 이용해서 실시예 1에서 수득한 간 유사 세포를 세척한 후, 3mM의 염화암모늄(NH₄Cl)이 첨가된 배지를 간 유사 세포가 자라고 있는 플레이트에 첨가한 뒤 배양하였다. 배양 4시간 뒤 배양액 1mL을 회수하고 원심분리 후 700uL를 새 튜브로 옮기고 Cedex Bio Analyzer (로슈) 기기를 이용해 배양액 상의 감소된 암모니아 농도를 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 분화 유도 전의 간 유래 세포는 36.4 μM/h/10⁶cell 의 암모니아 흡수능을 나타내어 가장 낮은 암모니아 제거능을 나타냈었다. HepGe 세포는 98.9 μM/h/10⁶cell 의 흡수능을, 본 발명의 분화 프로토콜을 통해 분화 유도된 간 유사 세포 (HepaCell) 는 121.3 μM/h/10⁶cell 의 흡수능을 나타내어, 본 발명의 분화 프로토콜을 통해 분화 유도된 간 유사 세포 (HepaCell) 가 간 유래 세포 뿐만 아니라, 간세포와 비교하더라도 매우 우수한 암모니아 제거능을 나타냄을 확인하였다.

실시예 4. 간 유사 세포 기능 확인 - 요소 합성능

추가적으로 본 발명의 분화유도를 통해 제조된 간 유사 세포의 요소 합성능을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 요소 합성능을 확인하기 위하여, 배양 24시간 뒤 배양액 1mL을 회수하고 원심분리하였다. 이후 700uL를 새 튜브로 옮기고 QuantiChrom Urea Assay 키트(DIUR-100, BioAssay Systems)를 이용해 배양액에 배출된 요소 농도를 분석하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 비교군으로는 간세포인 HepaG2 세포와, 사람 간조직으로부터 분리 배양한 간유래 세포(D20) 을 사용하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 HepaCell 은 간세포와 비교하더라도 유의하게 증가된 요소 합성능을 나타내었고 간에서 단순 분리 배양한 간 유래 세포 D20에서는 요소 합성능이 확인되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 실시예 1에 의해 분화 유도되는 간 유사 세포가 일반적인 간세포와 비교하여 암모니아 제거능과 요소 합성능이 모두 증가된 요소 합성능이 증진된 간 유사 세포임을 보여주는 결과이다.

추가적으로, 본 발명의 HepaCell의 요소 합성능 증진을 유전자 수준에서 확인하기 위하여, 요소 회로 관련 유전자 발현을 확인하였다. 간 유래 세포와 분화유도된 HepaCell 에서 total RNA를 분리하고 이를 cDNA로 합성한 후, 4가지의 요소회로 관련 특이유전자, NAGS(N-acetyl glutamate synthase), CPS1 (carbamoyl phosphate synthase1), ASL (Argininosuccinate lyase), OTC (ornithine transcarbamoylae)의 프라이머를 이용하여 qPCR을 수행하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6 에 나타낸 바와 같이, NAGS, CPS1, 그리고 ASL 유전자는 간유래 세포와 HepaCell 모두에서 발현되는 것을 확인하였나, OTC(Ornithine transcarbamoylase) 의 발현은 간 유래 세포에서는 확인되지 않았고, 본 발명의 HepaCell1, HepaCell2 군에서는 간 세포와 비교하여 증가되어 있음을 확인하였다. OTC는 요소 회로의 3번째 단계인 오르니틴과 카바닐 포스페이트가 시트룰린(citrulline)으로 대사 되는데 필요한 효소이며, 이 효소가 부족하면 암모니아의 축적되어 신경학적으로 치명적인 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기와 같은 OTC 발현 증가는 본 발명의 HepaCell 에서 요소 회로의 대사에 관여하는 효소의 발현이 증가하여, 요소 합성을 증진시키고, 이를 통해 암모니아 제거능이 증대됨을 보여주는 결과이다.

실시예 5. 간 유사 세포 기능 확인 - LDL 흡수능

혈청이 제거된 배지를 이용해 실시예 1에서 분화유도된 간 유사 세포 (HepaCell)를 세척하고 12-14시간 동안 혈청이 없는 0.3% BSA가 첨가된 배지로 배양을 수행하였다. 배양 후 0.3% BSA를 녹인 DPBS (Ca2+ 와 Mg2+ 함유)로 한번 세척하였으며 이후 표지된 LDL (Low density lipoprotein) 용액(L3484, Invitrogen™을 세포에 처리하고 2-4시간 동안 37℃에서 배양한 뒤 실온에서 0.3% BSA를 녹인 DPBS로 2-3번 세척하였다. NucBlue™ Live ReadyProbes™ 시약을 이용해 실온에서 30분간 핵을 염색한 후 0.3% BSA를 녹인 DPBS를 이용해 2-3번 세척하였다. 4% formaldehyde을 이용해 15-30분 간 실온에서 세포를 고정한 뒤 Antifade Mountant를 처리한 후 형광 현미경을 이용해 분석하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 HepcCell 은 분화 유도 전인 간유래 세포와 달리 간세포의 기능들 중의 하나인 LDL uptake 기능이 있는 것을 확인하였다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims

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1) 하기 단계를 포함하는 간 유래 세포를 내배엽 세포로 분화시키는 단계;
1-1) 혈청, 액티빈 A 및 Wnt3가 포함된 배지에서 간 유래 세포를 1 내지 2일 동안 배양하는 단계; 및
1-2) 혈청 및 액티빈 A 가 포함된 배지에서 간 유래 세포를 3 내지 5일 동안 배양하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 내배엽 세포를 간모세포로 분화시키는 단계;
3) 상기 2) 단계의 간모세포를 미성숙 간 유사 세포로 분화시키는 단계; 및
4) 상기 3) 단계의 미성숙 간 유사 세포에 오록실린 A 를 처리하는 단계; 를
포함하는 암모니아 제거능 및 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 오록실린 A 는 1~100uM 농도로 처리되는 것인, 암모니아 제거능 및 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 1) 내지 4) 단계는 글루타맥스 (GlutaMax), 소혈청 알부민, 젠타마이신 및 콜라겐 타입 I 이 포함된 배지에서 수행되는 것인, 암모니아 제거능 및 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법.
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제8항에 있어서,
상기 2) 단계는 간세포 성장인자, 니코틴아마이드 및 다이메틸설폭사이드가 더 포함된 배지에서 1 내지 3일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 암모니아 제거능 및 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 3) 단계는 간세포 성장인자, 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제가 더 포함된 배지에서 1 내지 5일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는,
암모니아 제거능 및 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 4) 단계는 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제가 더 포함된 배지에서 5 내지 13일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 암모니아 제거능 및 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법.
제6항 내지 제8항, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1) 내지 4) 단계의 배양은 3D 배양인, 암모니아 제거능 및 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법.
1) 1-1) 혈청, 액티빈 A 및 Wnt3가 더 포함된 배지에서 1 내지 2일 동안 배양하는 단계;
1-2) 혈청 및 액티빈 A 가 더 포함된 배지에서 3 내지 5일 동안 배양하는 단계; 를 포함하는, 간유래 세포를 내배엽 세포로 분화 시키는 단계;
2) 상기 1) 단계의 내배엽 세포를 간세포 성장인자, 니코틴아마이드 및 다이메틸설폭사이드 가 더 포함된 배지에서 배양하여 간모세포로 분화시키는 단계;
3) 상기 2) 단계의 간모세포를 간세포 성장인자, 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제가 더 포함된 배지에서 1 내지 5일 동안 배양하여 미성숙 간 유사 세포로 분화시키는 단계; 및
4) 상기 3) 단계의 미성숙 간 유사 세포를 오록실린 A, 온코스타틴 M, 덱사메타손, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 및 항산화제가 더 포함된 배지에서 5 내지 13일 동안 배양하는 단계; 를 포함하고,
상기 1) 내지 4) 단계는 글루타맥스 (GlutaMax), 소혈청 알부민, 젠타마이신 및 콜라겐 타입 I 이 포함된 배지에서 수행되는 것인, 암모니아 제거능 및 요소 합성능이 증대된 간 유사 세포 제조방법.