KR102354028B1 - Skin external composition for preventing, improving or treating Psoriasis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 건선 예방, 개선 또는 치료용 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 상기 피부 외용제 조성물은 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 및 진세노사이드 Rb1을 포함함으로써 피부 병변의 크기 및 두께를 감소하며, 각질세포에서의 염증성 케모카인 분비 및 증식을 효과적으로 저해할 뿐만 아니라 세포 독성을 완화하여 건선에 의한 증상을 개선, 예방 또는 치료하는데 이용 가능하다.The present invention relates to a composition for external application for skin for preventing, improving or treating psoriasis, wherein the composition for external application for skin contains emodin, genipine, chlorogenic acid, simigenoside and ginsenoside Rb1, thereby reducing the size and thickness of skin lesions, , can be used to improve, prevent or treat symptoms of psoriasis by effectively inhibiting inflammatory chemokine secretion and proliferation in keratinocytes as well as alleviating cytotoxicity.
Description
본 발명은 건선 예방, 개선 또는 치료용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for external application to the skin for preventing, improving or treating psoriasis.
건선(psoriasis)은 피부에서 염증성 세포 침윤의 만성적 활성화와 표피 각질 세포의 조절 장애에 의해 유도된 면역-매개 자가면역 피부 질환이다. 건선이 처음 발병하면 피부에 좁쌀 같은 붉은 색을 띠는 발진이 생기는데, 그 위에 하얀 피부 각질세포가 덮이게 되고 이러한 발진의 크기가 점점 커지면 그 크기가 동전 정도로 커지기도 하고 심할 경우 손바닥 만한 크기로 확대되기도 한다. 아직까지는 건선의 발병 메커니즘이 완전히 규명되지는 않았으며, 염증성 사이토카인과 T 세포와 같은 면역 세포 침윤 간의 상호작용을 포함하는 복잡한 메커니즘과 관련되어 있는 것으로 보고되고 있다.Psoriasis is an immune-mediated autoimmune skin disease induced by chronic activation of inflammatory cell infiltration in the skin and dysregulation of epidermal keratinocytes. When psoriasis first develops, a red, millet-like rash appears on the skin, which is then covered with white keratinocytes. As the size of the rash grows, it can grow to the size of a coin or, in severe cases, to the size of a palm. can be The pathogenesis of psoriasis has not yet been fully elucidated, and it is reported that it is related to a complex mechanism including the interaction between inflammatory cytokines and infiltration of immune cells such as T cells.
일반적인 건선의 치료방법은 크게 국소치료, 전신치료 및 광치료 등이 있으며 최근에는 건선의 병인에 근거한 면역생물학 제제들이 개발되었다. 그외 효과는 높이고 부작용은 감소시키기 위하여 이들을 적절히 같이 사용하는 복합요법이 많이 쓰이고 있다. 그 중 연고나 로션, 겔 형태의 피부에 직접 바르는 국소치료제는 건선 환자의 필수 치료제로서 건선 환자의 증상 조절에 가장 먼저, 그리고 가장 많이 사용된다. 특히 국소치료제를 잘 활용하는 경우 가벼운 건선은 다른 치료 없이 단독으로도 좋은 효과를 보는 경우가 많다. 특히 건선 환자가 소화 장애나 간, 신장 장애 등 전신 질환이 있을 때에는 전신 치료법 (먹는 약) 대신 국소치료법 (바르는 약)을 사용하는 것이 보다 안전하고 효과적이다. 국소 치료는 스테로이드, 콜타르, 안트랄린, 비타민 D3 및 그의 유사체, 레티노이드 등을 포함하는 치료이며, 단점으로 피부 얇아짐, 튼살, 화상, 자극 및 광과민증 등의 부작용이 있다. 또한, 스테로이드는 내성을 유도할 수 있어 이후의 스테로이드 치료에 영향을 준다. 한편, 광치료는 자외선 B 또는 자외선 A와 함께 쏘랄렌의 투여를 포함하며, 피부가 빨리 노화되고, 피부암 발병률이 증가된다는 단점이 있다.General treatment methods for psoriasis include local treatment, systemic treatment, and phototherapy. Recently, immunobiological agents based on the etiology of psoriasis have been developed. In order to increase the effect and reduce the side effects, a combination therapy that uses them appropriately is used a lot. Among them, topical treatments applied directly to the skin in the form of ointments, lotions, or gels are essential treatments for psoriasis patients, and are the first and most used to control symptoms of psoriasis patients. In particular, when topical treatment is well used, mild psoriasis often has a good effect alone without other treatment. In particular, when psoriasis patients have systemic diseases such as digestive disorders, liver or kidney disorders, it is safer and more effective to use topical treatment (applied medicine) instead of systemic treatment (edible medicine). Topical treatment is a treatment that includes steroids, coal tar, anthralin, vitamin D3 and analogs thereof, retinoids, and the like, and has side effects such as skin thinning, stretch marks, burns, irritation, and photosensitivity as disadvantages. In addition, steroids can induce tolerance, which affects subsequent steroid treatment. On the other hand, phototherapy includes administration of psoralen along with ultraviolet B or ultraviolet A, and has disadvantages in that the skin ages quickly and the incidence of skin cancer increases.
따라서, 부작용의 발생이 적으면서 치료 효과가 우수한 새로운 건선 치료제의 개발이 필요한 실정이다.Therefore, there is a need for the development of a new psoriasis therapeutic agent with excellent therapeutic effects with fewer side effects.
본 발명은 5종의 화합물을 포함하는 건선 예방, 개선 또는 치료용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a composition for external application for skin for preventing, improving or treating psoriasis, comprising five types of compounds.
본 발명자는 부작용 없이 우수한 건선 증상의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타내는 약용식물의 활성성분에 관해 연구한 결과, 5종의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have completed the present invention by developing a composition for topical application to the skin comprising five types of compounds as active ingredients as a result of research on active ingredients of medicinal plants that exhibit excellent preventive, ameliorating or therapeutic effects of psoriasis symptoms without side effects.
본 발명의 일 양상은 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 및 진세노사이드 Rb1을 유효성분으로 포함하는 건선 예방, 개선 또는 치료용 피부 외용제 조성물을 제공한다.One aspect of the present invention provides a composition for external application for the prevention, improvement or treatment of psoriasis, comprising emodin, genipine, chlorogenic acid, simigenoside and ginsenoside Rb1 as active ingredients.
상기 에모딘(emodin)은 하수오(Reynoutria multiflora), 대황(Rheum palmatum), 프란굴라(Rhamnus frangula) 등의 약용식물에 존재하는 성분으로, 생약 추출물로서 건강식품, 영영제 등에 사용된다.The emodin is a component present in medicinal plants such as Reynoutria multiflora , rhubarb ( Rheum palmatum ), and frangula ( Rhamnus frangula ).
상기 제니핀(genipin)은 치자(梔子)의 주요 활성성분 중 하나로서 당뇨로 인한 췌장 기능 장애를 회복하는데 도움을 주며, 최근 연구를 통해 항우울, 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있다. The genipin is one of the main active ingredients of gardenia, which helps to restore pancreatic dysfunction due to diabetes, and is known to have antidepressant and anticancer effects through recent studies.
상기 클로로겐산(chlorogenic acid)은 식물계에 널리 분포하며 커피콩 속에 약 7~10% 들어있는 무색의 폴리페놀물질로서 지방질에 대한 산화억제작용을 하여 항암 기능의 유효성분으로 이용되기도 하며, 노화방지, 당뇨 예방 또는 개선 효과가 있는 것으로 알려져 있다.The chlorogenic acid is widely distributed in the plant kingdom and is a colorless polyphenol substance contained in about 7 to 10% of coffee beans. It is known to have a preventive or ameliorating effect.
상기 시미게노사이드(cimigenoside)는 촛대승마의 근경에 함유된 주요 활성성분 중 하나로 알려져 있으나, 그 성분에 의한 약효에 관해 자세히 연구된 바가 없다.The simigenoside is known as one of the main active ingredients contained in the rhizome of Candlestick horseback riding, but the medicinal effect of the ingredient has not been studied in detail.
상기 진세노사이드 Rb1(ginsenoside Rb1)는 인삼에 들어있는 사포닌 성분 중 하나로서 항암, 항산화, 콜레스테롤 저하 효과가 있는 생리활성물질로 주목을 받으며, 최근에서는 항불안 및 항우울 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.The ginsenoside Rb1 (ginsenoside Rb1) is one of the saponin components contained in ginseng, attracting attention as a physiologically active material having anticancer, antioxidant, and cholesterol lowering effects, and has recently been found to have anti-anxiety and antidepressant effects.
이러한 각 화합물에 대해 각종 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과가 입증되었으나, 본 발명에서 목적하는 5종의 화합물 혼합에 대해서는 건선에 관한 치료 효과에 대해 전혀 알려진 바가 없었다.For each of these compounds, the effects of preventing, improving or treating symptoms of various diseases have been proven, but for the mixture of the five compounds desired in the present invention, there is no known at all about the therapeutic effect on psoriasis.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 건선 동물 모델에 상기 5종의 화합물 혼합물을 처리한 결과, 피부 병변의 형태학적 및 조직학적 측면에서 건선 개선 효과가 우수하고, 세포 실험을 통해 상기 5종의 화합물 혼합물이 단독 화합물에 비해 염증성 케모카인 분비 및 각질세포 증식을 효과적으로 저해하며, 에모딘 또는 시미게노사이드에 의해 나타나는 세포 독성을 완화시키는 효과가 있음을 확인하였다.According to one embodiment of the present invention, as a result of treating the mixture of the five compounds in the psoriasis animal model, the psoriasis improvement effect is excellent in terms of the morphology and histology of the skin lesions, and the five compounds It was confirmed that the mixture effectively inhibited inflammatory chemokine secretion and keratinocyte proliferation compared to the single compound, and had the effect of alleviating cytotoxicity caused by emodin or simigenoside.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 5종의 화합물을 포함하는 조성물은 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 및 진세노사이드 Rb1을 1 : 0.1 ~ 10 : 0.1 ~ 10 : 0.1 ~ 10 : 0.1 ~ 10의 중량비, 1 : 0.5 ~ 5 : 0.5 ~ 5 : 0.5 ~ 5 : 0.5 ~ 5의 중량비, 또는 1 : 1 : 1 : 1 : 1의 중량비로 포함하는 것일 수 있다. 이때, 상기 조성물에 의한 세포 안정성 문제로 인해 1 : 1 : 1 : 1 : 1의 중량비를 포함하는 것이 바람직하다.According to one embodiment of the present invention, the composition comprising the five compounds is emodine, genipine, chlorogenic acid, simigenoside and ginsenoside Rb1 1: 0.1-10: 0.1-10: 0.1-10: It may be included in a weight ratio of 0.1 to 10, 1: 0.5 to 5: 0.5 to 5: 0.5 to 5: 0.5 to 5, or 1: 1: 1: 1: 1 by weight. At this time, it is preferable to include a weight ratio of 1:1: 1: 1: 1 due to the cell stability problem caused by the composition.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 5종의 화합물을 포함하는 조성물은 전체 중량에 대하여 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 및 진세노사이드 Rb1을 0.001 내지 10 중량%, 0.005 내지 5 중량%, 0.01 내지 1 중량%, 또는 0.05 내지 0.5를 포함하는 것일 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the composition including the five compounds contains 0.001 to 10% by weight, 0.005 to 5% by weight of emodin, genipine, chlorogenic acid, simigenoside, and ginsenoside Rb1, based on the total weight %, 0.01 to 1 wt%, or 0.05 to 0.5 may be included.
상기 피부 외용제 조성물은 본 발명이 목적하고 있는 건선의 증상 개선, 나아가 치료와 예방을 목적으로 사용될 수 있으며, 그 제형에 있어서는 특별히 한정되지 않는다. 이러한 피부 외용제 조성물은 건선의 증상 개선을 목적으로 하는 기능성 화장료 조성물로 제공될 수 있으며, 또한 건선의 치료 및 예방을 목적으로 하는 약학적 조성물로 제공될 수 있다.The composition for external application for skin may be used for the purpose of improving symptoms of psoriasis, further treatment and prevention, which is the object of the present invention, and the formulation thereof is not particularly limited. The composition for external application for skin may be provided as a functional cosmetic composition for the purpose of improving symptoms of psoriasis, and may also be provided as a pharmaceutical composition for the purpose of treatment and prevention of psoriasis.
본 발명이 기능성 화장료 조성물로 제공되는 경우, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 에센스 또는 피부 점착타입 화장료의 제형으로, 또는 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 등의 경피 투여형 제형으로 제제화될 수 있다.When the present invention is provided as a functional cosmetic composition, for example, in the formulation of a softening lotion, nutrient lotion, massage cream, nutrient cream, pack, gel, essence or skin adhesion type cosmetic, or a lotion, ointment, gel, cream, It may be formulated as a transdermal dosage form such as a patch or spray.
본 발명이 약학적 조성물로 제공되는 경우, 상기 5종의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산, 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등에 의해 형성되는 산 부가염을 사용할 수 있다. 산 부가염 이외에도, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민, 3차-부틸아민과 같은 염기 부가염도 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 유효성분에 악영향을 미치지 않는 한, 필요에 따라 의약에 사용되는 각종 보조제, 예컨대 담체나 기타 첨가제, 예컨대 안정제, 완화제, 유화제 등을 첨가하여 제제화할 수 있다. When the present invention is provided as a pharmaceutical composition, the five compounds may be used in the form of pharmaceutically acceptable salts. The salt is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrobromic acid, formic acid, acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, methanesulfonic acid , an acid addition salt formed by benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, or the like can be used. In addition to acid addition salts, base addition salts such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethylamine, tert-butylamine can also be used. The pharmaceutical composition may be formulated by adding various auxiliary agents, such as carriers or other additives, such as stabilizers, emollients, emulsifiers, and the like, used in medicine, if necessary, as long as it does not adversely affect the active ingredient.
또한, 상기 약학적 조성물은 비경구 투여될 수 있으며, 경피 투여가 바람직하고, 특히 국소 도포가 가장 바람직하다. 국소 도포에 적절한 고체 또는 액체 부형제나 희석제를 이용하여 통상적인 방법으로 제형화할 수 있다. 예를 들면, 연고, 크림, 주사제, 산제, 과립제, 정제 등의 적합한 어떠한 제형으로도 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 약제와 동등하게 또는 다른 약제를 보조하기 위해 함께 투여될 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition may be administered parenterally, and transdermal administration is preferable, and in particular, topical application is most preferable. It can be formulated in a conventional manner using solid or liquid excipients or diluents suitable for topical application. For example, it can be in any suitable dosage form such as ointment, cream, injection, powder, granule, tablet, and the like. The pharmaceutical composition may be administered alone or co-administered with other agents or co-administered to supplement other agents.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물의 투여량은 투여 대상의 나이, 상태, 질환의 증상 정도에 따라 차이가 있으나, 바람직하게는, 0.001 ~ 1000 ㎎/㎏·day일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the dosage of the pharmaceutical composition is different depending on the age, condition, and symptom level of the subject to be administered, but preferably, it may be 0.001 to 1000 mg/kg·day.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 및 진세노사이드 Rb1을 포함함으로써 피부 병변의 크기 및 두께를 감소하며, 각질세포에서의 염증성 케모카인 분비 및 증식을 효과적으로 저해할 뿐만 아니라 세포 독성을 완화하여 건선에 의한 증상을 개선, 예방 또는 치료하는데 이용 가능하다.The composition for external application for skin according to the present invention contains emodin, genipine, chlorogenic acid, simigenoside and ginsenoside Rb1, thereby reducing the size and thickness of skin lesions, and effectively inhibiting inflammatory chemokine secretion and proliferation in keratinocytes. In addition, it can be used to improve, prevent or treat symptoms caused by psoriasis by alleviating cytotoxicity.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 에모딘(emodin, Ed), 제니핀(genipin, Gp), 클로로겐산(chlorogenic acid, Ca), 시미게노사이드(cimigenoside, Cs) 및 진세노사이드 Rb1(ginsenoside Rb1, Gs)의 구조이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 5% 이미퀴모드 크림에 의해 유발된 마우스의 피부 병변에 대한 형태학적 및 조직학적 분석 결과이다. 결과 값의 유의성은 대조군(NC) 대비 #: p＜0.05, IMQ 처리군 대비 *: p＜0.05 이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 M5 (IL-1α, IL-17A, IL-22, Oncostatin M 및 TNF-α 혼합)에 의해 유도된 각질형성세포 HaCaT의 염증성 케모카인 CXCL8, CXCL10 및 CCL20 분비를 측정한 결과이다. 결과 값의 유의성은 대조군 대비 #: p＜0.05, M5 처리군 대비 *: p＜0.05 이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 IL-22에 의해 유도된 각질형성세포 HaCaT의 세포 주기를 측정한 결과이다. 결과 값의 유의성은 대조군(NC) 대비 #: p＜0.05, IL-22 처리군 대비 *: p＜0.05 이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 5종의 화합물에 대한 각질형성세포 HaCaT의 세포 생존율을 측정한 결과이다. 결과 값의 유의성은 에모딘 (Ed 50 μM) 처리군 대비 #: p＜0.05, 시미게노사이드 (Cs 50 μM) 처리군 대비 *: p＜0.05 이다.1 is a compound emodin (Ed), genipin (Gp), chlorogenic acid (Ca), simigenoside (cimigenoside, Cs) and ginsenoside Rb1 ( ginsenoside Rb1, Gs).
2 is a morphological and histological analysis result of skin lesions in mice induced by 5% imiquimod cream according to an embodiment of the present invention. The significance of the result value was #: p<0.05 compared to the control group (NC), and *: p<0.05 compared to the IMQ-treated group.
Figure 3 shows the secretion of inflammatory chemokines CXCL8, CXCL10 and CCL20 of keratinocytes HaCaT induced by M5 (a mixture of IL-1α, IL-17A, IL-22, Oncostatin M and TNF-α) according to an embodiment of the present invention; is the measurement result. The significance of the result value is #: p<0.05 compared to the control group, and *: p<0.05 compared to the M5 treatment group.
4 is a result of measuring the cell cycle of keratinocytes HaCaT induced by IL-22 according to an embodiment of the present invention. The significance of the result value was #: p<0.05 compared to the control group (NC), and *: p<0.05 compared to the IL-22 treatment group.
5 is a result of measuring the cell viability of keratinocytes HaCaT for 5 types of compounds according to an embodiment of the present invention. Significance of the result value is #: p<0.05 compared to the emodin (
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail. However, these descriptions are provided for illustrative purposes only to help the understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these illustrative descriptions.
1. 화합물 및 시약1. Compounds and Reagents
에모딘(emodin), 제니핀(genipin), 클로로겐산(chlorogenic acid), 시미게노사이드(cimigenoside) 및 진세노사이드 Rb1(ginsenoside Rb1)은 Chemfaces (중국)에서 구입되었다. 이미퀴모드(imiquimod)는 3M Health Care (영국)에서 입수하였다. DMEM (High glucose Dulbecco's modified Eagle's medium)는 Welgene Inc. (한국)에서 입수하였다. FBS(Fetal bovine serum) 및 항체(antibiotics)는 Invitrogen Inc. (미국)에서 공급받았다. 인간 CXCL8 및 CXCL10 ELISA 키트는 Koma Biotech Inc. (한국)에서 구입되었다. 인간 CCL20 ELISA 키트는 R&D system (미국)에서 구매하였다. Emodin, genipin, chlorogenic acid, cimigenoside and ginsenoside Rb1 were purchased from Chemfaces (China). Imiquimod was obtained from 3M Health Care (UK). DMEM (High glucose Dulbecco's modified Eagle's medium) was obtained from Welgene Inc. (Korea). Fetal bovine serum (FBS) and antibodies (antibiotics) are manufactured by Invitrogen Inc. Supplied from (USA). Human CXCL8 and CXCL10 ELISA kits are available from Koma Biotech Inc. It was purchased from (Korea). Human CCL20 ELISA kit was purchased from R&D system (USA).
2. 통계 처리2. Statistical processing
모든 실험 결과에 대해 통계 처리를 수행하였다. 각 실험의 결과 값은 독립적으로 3회 반복 실험을 통해 얻은 값을 평균±표준오차(SEM)로 나타냈다. 처리군 간의 비교는 student's t-test로 수행되었으며, 결과 값에서 p<0.05 일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.Statistical processing was performed on all experimental results. The result value of each experiment was expressed as the mean ± standard error (SEM) of the value obtained through three replicates independently. Comparison between treatment groups was performed by student's t-test, and was considered statistically significant when p<0.05 in the results.
3. 실험방법 및 결과3. Experimental method and results
3-1. 실험동물 처리 및 조직 분석3-1. Laboratory animal treatment and tissue analysis
C57BL/6 (8주령 수컷) 마우스를 실험동물자원센터(Laboratory Animal Resource Center) (한국)에서 구입하였다. 모든 실험동물의 실험 절차는 동국대학교의 기관 동물관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인받았다 (승인번호 IACUC-2017-015). 마우스를 무작위로 대조군(control, NC), 5% 이미퀴모드 크림 (IMQ) 처리군, 0.1% 혼합물 (0.1% PSM) 처리군 및 1% 혼합물 (1% PSM) 처리군으로 나누었다. 혼합물은 아세톤과 올리브 오일을 3:1로 혼합한 10 mL의 용매에 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 및 진세노사이드 Rb1을 각각 20 mg씩 용해하여 1%의 PSM을 준비한 후, 지시된 농도에 맞추어 처리하였다. C57BL/6 (8-week-old male) mice were purchased from the Laboratory Animal Resource Center (Korea). All experimental animal experimental procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Dongguk University (Approval No. IACUC-2017-015). Mice were randomly divided into control group (control, NC), 5% imiquimod cream (IMQ) treatment group, 0.1% mixture (0.1% PSM) treatment group, and 1% mixture (1% PSM) treatment group. The mixture was prepared by dissolving 20 mg each of emodin, genipine, chlorogenic acid, simigenoside and ginsenoside Rb1 in 10 mL of a solvent mixed with acetone and olive oil in a ratio of 3:1 to prepare 1% PSM, and then It was treated according to the specified concentration.
대조군을 제외한 각 그룹의 마우스 등(back)을 면도한 후 건선과 같은 피부 병변을 유도하기 위해 연속적으로 6일 동안 매일 5% 이미퀴모드 크림 62.5 mg을 발라주었다. IMQ 처리 1시간 전에, 마우스의 등 피부에 0.1% PSM 또는 1% PSM를 미리 발라주었다. 처리 6일 후 마우스를 희생하고, 피부 조직을 채취하였다. 건선 중증도는 피부 홍조(redness), 크기(scaling), 두께(thickness)를 측정하여 건선 영역 중증도 지수(Psoriasis Area Severity Index, PASI)를 통해 실험 종료 시 평가하였다. 평가 점수는 0: 증상 없음, 1: 경증, 2: 중간, 3: 심각, 4: 매우 심각으로 해석되었다. 등 부위의 병변을 절제하여 조직학적 분석을 위해 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 보관하거나, 또는 단백질 발현 분석을 위해 조직 추출 시약으로 균질화하였다(homogenized).After shaving the back of mice in each group except for the control group, 62.5 mg of 5% imiquimod cream was applied daily for 6 consecutive days to induce skin lesions such as psoriasis. One hour before IMQ treatment, 0.1% PSM or 1% PSM was pre-applied to the back skin of mice. After 6 days of treatment, mice were sacrificed and skin tissues were collected. The severity of psoriasis was evaluated at the end of the experiment through the Psoriasis Area Severity Index (PASI) by measuring skin redness, scaling, and thickness. The evaluation score was interpreted as 0: no symptoms, 1: mild, 2: moderate, 3: severe, 4: very severe. The lesion on the back was excised and stored in 4% paraformaldehyde for histological analysis, or homogenized with a tissue extraction reagent for protein expression analysis.
그 결과, 도 2의 B 및 D를 참조하면, 0.1% 및 1% PSM 처리군은 IMQ 처리군 대비 PASI 및 피부 두께가 유의적으로 감소한 것으로 확인되었다. As a result, referring to B and D of FIG. 2 , it was confirmed that the 0.1% and 1% PSM treatment groups significantly reduced PASI and skin thickness compared to the IMQ treatment group.
각 그룹의 마우스에서 채취된 등 피부 시료를 4% 파라포름알데히드에 고정한 후 파라핀에 포매하였다(embedded). 이후, 각 절편(section)으로 절단하여 H/E(hematoxylin & eosin)로 염색하였다. 조직학적 분석은 Lionheart FX Automated Microscope 및 Gen5 Imager software (Biotek Instruments Inc., 미국)를 사용하여 수행되었다. Back skin samples collected from mice of each group were fixed in 4% paraformaldehyde and then embedded in paraffin. Thereafter, each section was cut and stained with hematoxylin & eosin (H/E). Histological analyzes were performed using a Lionheart FX Automated Microscope and Gen5 Imager software (Biotek Instruments Inc., USA).
그 결과, 도 2의 A 및 C를 참조하면, 0.1% 및 1% PSM 처리군은 이미퀴모드에 의해 유발된 피부 병변이 감소하며, 특히 1% PSM 처리군에서 피부 병변이 거의 사라진 것으로 확인되었다.As a result, referring to A and C of FIG. 2 , the 0.1% and 1% PSM treatment groups decreased skin lesions induced by imiquimod, and in particular, it was confirmed that the skin lesions almost disappeared in the 1% PSM treatment group. .
3-2. 케모카인 발현 측정3-2. Measuring chemokine expression
인간 각질형성세포(keratinocyte) 세포주인 HaCaT 세포를 DMEM 배지 (10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 함유)로 37℃, 5% CO2, 습기가 있는 조건에서 배양하였다. 배양 기간 중 2일 마다 배지를 바꿔주고, 24시간 동안 무혈청 배지에서 세포를 기아상태로 정지시켰다. 세포에 에모딘(Ed), 제니핀(Gp), 클로로겐산(Ca), 시미게노사이드(Cs), 진세노사이드 Rb1(Gs) (10 μM) 또는 PSM (10, 50 μM)를 1시간 동안 사전 처리한 후 M5 (각각 10 ng/mL의 IL-1α, IL-17A, IL-22, Oncostatin M 및 TNF-α 혼합)를 24시간 동안 처리하였다. PSM 50 μM는 DMSO에 동일한 농도 (10 μM)의 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 및 진세노사이드 Rb1을 혼합 용해하여 준비하였다.HaCaT cells, a human keratinocyte cell line, were cultured in DMEM medium (containing 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin) at 37° C., 5
HaCaT 세포의 배양 배지 내 케모카인 CXCL8, CXCL10 및 CCL20의 발현 수준은 제조사의 프로토콜(manufacturer's protocol)에 따라 상용 키트를 사용하여 평가하였다. 흡광도는 microplate reader (Tecan, 스위스)를 사용하여 450 ~ 550 nm에서 측정되었다. The expression levels of the chemokines CXCL8, CXCL10 and CCL20 in the culture medium of HaCaT cells were evaluated using a commercial kit according to the manufacturer's protocol. Absorbance was measured at 450 ~ 550 nm using a microplate reader (Tecan, Switzerland).
그 결과, 도 3을 참조하면, PSM를 처리한 경우에는 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 또는 진세노사이드 Rb1를 단독으로 처리한 경우에 비해 M5에 의해 유도된 염증성 케모카인 CXCL8, CXCL10 및 CCL20 분비가 현저한 수준으로 감소한 것으로 확인되었다.As a result, referring to FIG. 3 , in the case of PSM treatment, the inflammatory chemokines CXCL8, CXCL10 and It was confirmed that the secretion of CCL20 was reduced to a significant level.
3-3. 세포 주기 측정3-3. cell cycle measurement
세포 주기 분석은 제조사의 프로토콜에 따라 Muse Cell Cycle 키트 (Merck KGaA, 독일)를 사용하여 수행되었다Cell cycle analysis was performed using the Muse Cell Cycle kit (Merck KGaA, Germany) according to the manufacturer's protocol.
HaCaT 세포에 PSM (50 μM)를 1시간 동안 사전 처리한 후 IL-22 (100 ng/mL)를 48시간 동안 처리하였다. PSM 50 μM는 DMSO에 동일한 농도 (10 μM)의 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 및 진세노사이드 Rb1을 혼합 용해하여 준비하였다.HaCaT cells were pre-treated with PSM (50 μM) for 1 hour and then treated with IL-22 (100 ng/mL) for 48 hours.
처리 후 세포를 회수하여 3시간 동안 -20℃에서 70% 차가운 에탄올 1 mL로 고정시키고, Muse Cell Cycle 시약 200 μL를 처리하여 어두운 곳, 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, Muse Cell Analyzer (Merck KGaA, 독일)를 사용하여 세포 주기 G0/G1, S 및 G2/M기에서의 세포 백분율을 측정하였다. PI(proliferation index)는 다음과 같은 식으로 계산되었다: PI = (S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M).After treatment, the cells were recovered and fixed with 1 mL of 70% cold ethanol at -20°C for 3 hours, treated with 200 μL of Muse Cell Cycle reagent, and reacted for 30 minutes at room temperature in a dark place. Thereafter, cell percentages in G0/G1, S and G2/M phases of the cell cycle were measured using Muse Cell Analyzer (Merck KGaA, Germany). PI (proliferation index) was calculated as follows: PI = (S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M).
그 결과, 도 4를 참조하면, PSM 를 처리한 경우에는 IL-22에 의해 유도된 각질세포의 증식을 현저한 수준으로 저해한 것으로 확인되었다.As a result, referring to FIG. 4 , it was confirmed that the treatment with PSM significantly inhibited the proliferation of keratinocytes induced by IL-22.
3-4. 세포 생존 측정3-4. Cell viability measurement
XTT assays는 HaCaT 세포에 미치는 PSM의 세포독성 효과를 확인하기 위해 사용되었다.XTT assays were used to determine the cytotoxic effect of PSM on HaCaT cells.
HaCaT 세포에 각각 에모딘(Ed), 제니핀(Gp), 클로로겐산(Ca), 시미게노사이드(Cs), 진세노사이드 Rb1(Gs) 및 PSM (10, 50 μM)를 24시간 동안 처리한 후 XTT 시약(Sigma-Aldrich, 미국) 50 μL를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 흡광도는 microplate reader (Tecan, 스위스)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.HaCaT cells were treated with emodin (Ed), genipin (Gp), chlorogenic acid (Ca), simigenoside (Cs), ginsenoside Rb1 (Gs) and PSM (10, 50 μM) for 24 hours, respectively. 50 μL of XTT reagent (Sigma-Aldrich, USA) was added and reacted for 4 hours. Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (Tecan, Switzerland).
그 결과, 도 5를 참조하면, 에모딘 또는 시미게노사이드를 처리한 경우에는 세포 생존율이 각각 67.57%, 68.38%인 것으로 독성을 나타냈으나, 동일한 농도로 5종의 화합물을 혼합하여 처리한 경우에는 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 즉, 5종의 화합물 혼합물 처리 시 에모딘 또는 시미게노사이드 대비 통계적으로 유의한 세포 생존율을 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 5종의 화합물 혼합물은 세포 보호 효과를 나타내는 진세노사이드 Rb1 및 제니핀을 혼합함으로써 세포 독성이 낮아지는 것으로, 단일 화합물에 비해 현저히 우수한 세포 생존율을 갖는 것임을 알 수 있다.As a result, referring to FIG. 5 , when treated with emodin or simigenoside, cell viability was 67.57% and 68.38%, respectively, indicating toxicity, but when treated with a mixture of five types of compounds at the same concentration was found to be non-cytotoxic. That is, it was confirmed that a statistically significant cell viability compared to emodin or simigenoside when treated with a mixture of five compounds. It can be seen that the cytotoxicity of this five-compound mixture is lowered by mixing ginsenoside Rb1 and genipine, which exhibit a cytoprotective effect, and has significantly superior cell viability compared to a single compound.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been looked at with respect to preferred embodiments thereof. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments are to be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is indicated in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the present invention.
Claims (4)
A pharmaceutical composition for external application for the prevention or treatment of psoriasis comprising emodin, genipin, chlorogenic acid, cimigenoside and ginsenoside Rb1 as an active ingredient.
상기 조성물은 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 및 진세노사이드 Rb1을 1 : 0.1 ~ 10 : 0.1 ~ 10 : 0.1 ~ 10 : 0.1 ~ 10의 중량비로 포함하는 것인 건선 예방 또는 치료용 피부 외용제 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
The composition includes emodin, genipine, chlorogenic acid, simigenoside and ginsenoside Rb1 in a weight ratio of 1: 0.1 to 10: 0.1 to 10: 0.1 to 10: 0.1 to 10 for preventing or treating psoriasis skin A pharmaceutical composition for external use.
상기 조성물은 전체 중량에 대하여 에모딘, 제니핀, 클로로겐산, 시미게노사이드 및 진세노사이드 Rb1을 0.001 내지 10 중량%를 포함하는 것인 건선 예방 또는 치료용 피부 외용제 약학적 조성물.
The method according to claim 1,
The composition comprises 0.001 to 10% by weight of emodin, genipine, chlorogenic acid, simigenoside and ginsenoside Rb1 based on the total weight of the pharmaceutical composition for external application for the prevention or treatment of psoriasis.
Emodin (emodin), genipin (genipin), chlorogenic acid (chlorogenic acid), simigenoside (cimigenoside) and ginsenoside Rb1 (ginsenoside Rb1) for preventing or improving psoriasis comprising a cosmetic composition for external use on the skin.
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