KR102351254B1 - Vertically Coated Graphene Oxide Micro-well plate, preparation method thereof and Drug screening method for cancer treatment using same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 산화 그래핀이 부착되어, 암세포 스페로이드 플랫폼으로 활용할 수 있는 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트, 이의 제조 방법 및 이를 활용한 암 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명의 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법은 산화 그래핀이 코팅된 기판을 가습하는 단계, 반구형의 마이크로-웰이 하나 이상 형성된 플레이트를 가습된 기판 상에 가압하는 단계, 가압 후 형성된 복합체를 건조시키는 단계, 및 상기 복합체가 형성된 플레이트를 기판으로부터 제거하는 단계를 포함한다.The present invention relates to a micro-well plate coated with graphene oxide that can be used as a cancer cell spheroid platform by attaching graphene oxide to a part of the inner wall of the micro-well, a method for manufacturing the same, and a cancer treatment drug using the same To a screening method, the method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide of the present invention comprises the steps of humidifying a substrate coated with graphene oxide, and applying one or more hemispherical micro-wells to the humidified substrate It includes the steps of pressing to, drying the composite formed after pressing, and removing the plate on which the composite is formed from the substrate.

Description

산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트, 이의 제조 방법 및 이를 활용한 암 치료용 약물 스크리닝 방법{Vertically Coated Graphene Oxide Micro-well plate, preparation method thereof and Drug screening method for cancer treatment using same}Graphene oxide is vertically coated micro-well plate, manufacturing method thereof, and drug screening method for cancer treatment using the same

본 발명은 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 산화 그래핀이 부착되어, 암세포 스페로이드 플랫폼으로 활용할 수 있는 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트, 이의 제조 방법 및 이를 활용한 암 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a micro-well plate coated with graphene oxide that can be used as a cancer cell spheroid platform by attaching graphene oxide to a part of the inner wall of the micro-well, a method for manufacturing the same, and a cancer treatment drug using the same It relates to a screening method.

암은 가장 위험한 비전염성 질병 중 하나이며, 임상 연구 및 치료의 발전에도 불구하고, 암과 관련된 사망률은 계속 증가하고 있다. 따라서 암을 치료하고 예방하기 위한 항암제 발굴에 대한 다양한 방법이 연구되고 있다.Cancer is one of the most dangerous non-communicable diseases, and despite advances in clinical research and treatment, cancer-related mortality rates continue to rise. Therefore, various methods for discovering anticancer drugs to treat and prevent cancer are being studied.

종래에는 약물을 스크리닝하기 위한 방법으로 2차원 시험관내(in vitro) 세포 배양 기술을 활용하였으나, 이 기술은 세포-세포 및 세포-세포외기질(ECM)의 상호 작용이 현저히 감소하여 생체 내 종양 미세환경의 자연적 특성을 모방하는데 한계가 있는 문제점이 있다.Conventionally, two-dimensional in vitro cell culture technology has been used as a method for screening drugs, but this technology significantly reduces the cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interaction, resulting in in vivo tumor microenvironment. There is a problem in that there is a limit to imitating the natural characteristics of the environment.

따라서, 최근에는 3차원 세포 배양 기술에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 3차원 암세포 스페로이드는 생체 내 고형 종양의 특성과 유사한 특성을 나타내기 때문에, 화학 요법 및 방사선 요법 내성과 관련하여 정확한 항암제 전달을 위한 특정 모델로 적용할 수 있으며, 암세포 스페로이드의 다세포 구조는 종양 조직 구조와 유사하므로 이를 약물 침투 조사에도 활용될 수 있다.Therefore, recently, research on 3D cell culture technology has been actively conducted. Because three-dimensional cancer cell spheroids exhibit properties similar to those of solid tumors in vivo, they can be applied as a specific model for accurate anticancer drug delivery in relation to chemotherapy and radiation therapy resistance, and the multicellular structure of cancer cell spheroids is Since it is similar to the tissue structure, it can be used for drug penetration investigation.

이에, 균일한 암세포 스페로이드를 제조하기 위해, 세포가 부착되고 성장되는 표면 상에 나노 물질을 사용하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히, ECM 성분의 강력하고 빠른 흡수를 유도하며, 세포의 접착 및 확산을 향상시킬 수 있고, 장기간 안정적인 물질인 그래핀 옥사이드(GO)를 나노 물질로 활용하는 기술이 개발되고 있다.Therefore, in order to prepare a uniform cancer cell spheroid, research on a method of using a nanomaterial on a surface to which cells are attached and grown is being actively conducted. In particular, it induces strong and rapid absorption of ECM components, and A technique for using graphene oxide (GO), which can improve adhesion and diffusion, and is stable for a long period of time, as a nanomaterial is being developed.

그러나, 상기 그래핀 옥사이드(GO)는 세포를 강하게 접착시키기에, 세포가 3차원 성장보다는 2차원적으로 평면 성장하게 되는 문제점이 존재한다.However, since the graphene oxide (GO) strongly adheres the cells, there is a problem in that the cells grow two-dimensionally rather than three-dimensionally.

본 발명의 일 목적은 습도와 압력을 조절하여 산화 그래핀을 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착시킬 수 있는 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for manufacturing a micro-well plate coated with graphene oxide vertically in which the graphene oxide can be attached to a part of the inner wall of the micro-well by controlling humidity and pressure.

본 발명의 다른 목적은 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 산화 그래핀이 부착되어, 암세포 스페로이드 플랫폼으로 활용할 수 있는 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a micro-well plate coated with graphene oxide vertically that can be used as a cancer cell spheroid platform by attaching graphene oxide to a part of the inner wall of the micro-well.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로-웰 플레이트를 활용한 암 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a drug screening method for cancer treatment using the micro-well plate.

본 발명에서 사용된 산화 그래핀은 단백질 기반의 대체 물질에 비해 현저히 낮은 가격에 공급이 가능하여 마이크로-웰 플레이트 제작에 들어가는 비용을 절감할 수 있다.The graphene oxide used in the present invention can be supplied at a significantly lower price compared to protein-based alternative materials, thereby reducing the cost of micro-well plate fabrication.

본 발명의 일 실시예에 따른 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법은 산화 그래핀이 코팅된 기판을 가습하는 단계, 반구형의 마이크로-웰이 하나 이상 형성된 플레이트를 가습된 기판 상에 가압하는 단계, 가압 후 형성된 복합체를 건조시키는 단계, 및 상기 복합체가 형성된 플레이트를 기판으로부터 제거하는 단계를 포함한다.The method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide according to an embodiment of the present invention comprises the steps of humidifying a substrate coated with graphene oxide, and a plate having one or more hemispherical micro-wells formed on the humidified substrate. It includes the steps of pressing, drying the composite formed after pressing, and removing the plate on which the composite is formed from the substrate.

일 실시예로, 상기 기판은 유리, 폴리프로필렌, 알루미늄, 철, 금 및 스테인리스합금 중에서 선택된 재질로 이루어지고, 상기 플레이트는 PDMS, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸 메타크릴레이트 및 폴리우레탄 아크릴레이트 중에서 선택된 재질로 이루어질 수 있다.In one embodiment, the substrate is made of a material selected from glass, polypropylene, aluminum, iron, gold and stainless alloy, and the plate is made of a material selected from PDMS, polyethylene glycol, polymethyl methacrylate and polyurethane acrylate. can be done

또한, 상기 가압하는 단계는, 상기 마이크로-웰의 내측벽이 상기 기판과 접촉할 때까지 가압하여 유지하는 것이 바람직하고, 상기 가압에 의해 산화 그래핀의 일부가 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착될 수 있다.In addition, in the pressing, it is preferable to press and maintain the inner wall of the micro-well until it comes into contact with the substrate, and by the pressing, a portion of graphene oxide is transferred to a portion of the inner wall of the micro-well. can be attached.

즉, 상기 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착된 산화 그래핀은 상기 반구형의 마이크로-웰의 내측벽을 따라 띠 형태를 이루게 된다.That is, graphene oxide attached to a part of the inner wall of the micro-well forms a band shape along the inner wall of the hemispherical micro-well.

한편, 상기 건조는 50 내지 90℃ 의 온도로 수행할 수 있다.On the other hand, the drying may be performed at a temperature of 50 to 90 ℃.

일 실시예로, 상기 마이크로-웰의 직경은 100 내지 175 ㎛ 인 것이 바람직하고, 상기 마이크로-웰은 2차원 어레이(two-dimensional array) 구조를 갖는 것이 바람직하다.In one embodiment, the micro-well preferably has a diameter of 100 to 175 μm, and the micro-well preferably has a two-dimensional array structure.

또한, 상기 산화 그래핀이 코팅된 기판은, 산화 그래핀 분산액을 기판 상에 스핀 코팅하여 형성될 수 있다.In addition, the graphene oxide-coated substrate may be formed by spin-coating a graphene oxide dispersion on the substrate.

한편, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트를 제공할 수 있다.Meanwhile, the present invention may provide a micro-well plate in which graphene oxide prepared by the above method is vertically coated.

구체적으로, 본 발명의 다른 실시 형태인 마이크로-웰 플레이트는 반구형의 마이크로-웰이 하나 이상 형성되고, 상기 마이크로-웰은 내측벽의 일부에 산화 그래핀이 부착된 구조를 갖는다.Specifically, in the micro-well plate according to another embodiment of the present invention, one or more hemispherical micro-wells are formed, and the micro-wells have a structure in which graphene oxide is attached to a part of an inner wall.

구체적으로, 상기 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착된 산화 그래핀은 상기 반구형의 마이크로-웰의 내측벽을 따라 띠 형태를 이루는 것을 특징으로 한다.Specifically, graphene oxide attached to a portion of the inner wall of the micro-well is characterized in that it forms a band shape along the inner wall of the hemispherical micro-well.

이때, 상기 플레이트는 PDMS, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸 메타크릴레이트 및 폴리우레탄 아크릴레이트 중에서 선택된 재질로 이루어지는 것이 바람직하다.In this case, the plate is preferably made of a material selected from PDMS, polyethylene glycol, polymethyl methacrylate, and polyurethane acrylate.

또한, 상기 마이크로-웰의 직경은 100 내지 175 ㎛ 인 것이 바람직하고, 상기 마이크로-웰은 2차원 어레이(two-dimensional array) 구조를 가질 수 있다. 이러한 직경 및 2차원 어레이 구조를 갖는 마이크로-웰 플레이트는 3차원 세포 스페로이드 플랫폼 제조용으로 활용될 수 있다.In addition, the micro-well may have a diameter of 100 to 175 μm, and the micro-well may have a two-dimensional array structure. A micro-well plate having such a diameter and a two-dimensional array structure can be utilized for the preparation of a three-dimensional cell spheroid platform.

이때, 상기 세포는 간암 세포, 전립선암 세포, 자궁경부암 세포, 교모세포종 세포, 위암 세포, 혈액암 세포, 대장암 세포, 방광암 세포, 고환암 세포, 난소암 세포, 유방암 세포, 식도암 세포, 구강암 세포, 폐암 세포, 중피종 세포, 신경아세포종 세포, 췌장암 세포, 후두암 세포 및 피부암 세포 중에서 선택된 암세포, 또는 신경줄기세포, 중간엽줄기세포, 조혈모세포, 간세포, 혈관세포, 근세포, 폐포세포, 신장세포 및 상피세포 중에서 선택된 면역세포를 하나 이상 포함하는 것이 바람직하다.In this case, the cells are liver cancer cells, prostate cancer cells, cervical cancer cells, glioblastoma cells, gastric cancer cells, blood cancer cells, colorectal cancer cells, bladder cancer cells, testicular cancer cells, ovarian cancer cells, breast cancer cells, esophageal cancer cells, oral cancer cells, Cancer cells selected from lung cancer cells, mesothelioma cells, neuroblastoma cells, pancreatic cancer cells, laryngeal cancer cells and skin cancer cells, or neural stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, hepatocytes, vascular cells, myocytes, alveolar cells, renal cells and epithelial cells It is preferred to include one or more selected immune cells.

한편, 본 발명의 다른 실시 형태인 암 치료용 약물 스크리닝 방법은 마이크로-웰 플레이트에 형성된 복수 개의 마이크로-웰에 암세포를 분주하여, 3차원 스페로이드(spheroid) 형태로 배양하는 단계, 상기 마이크로-웰 내에 후보 약물을 투여하는 단계, 및 3차원 세포 스페로이드의 크기 변화를 측정하는 단계를 포함한다.On the other hand, in another embodiment of the present invention, a drug screening method for cancer treatment comprises the steps of dispensing cancer cells into a plurality of micro-wells formed in a micro-well plate, and culturing in a three-dimensional spheroid form, the micro-well administering a candidate drug into the spheroid, and measuring a change in the size of the three-dimensional cell spheroid.

구체적으로, 상기 배양하는 단계에서, 배양 시간이 60 시간을 경과하는 경우에는, 상기 마이크로-웰을 플립 오버(flip over)시키는 것이 바람직하다.Specifically, in the culturing step, when the incubation time exceeds 60 hours, it is preferable to flip over the micro-well.

본 발명에 따르면, 습도와 압력의 적절한 조절을 통해 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트를 간편하게 제조할 수 있다.According to the present invention, it is possible to conveniently prepare a micro-well plate coated with graphene oxide vertically through appropriate control of humidity and pressure.

또한, 본 발명에 따라 제조된 마이크로-웰 플레이트는 세포의 접착 및 성장을 향상시키는 산화 그래핀이 마이크로-웰의 내측벽을 따라 띠 형태를 이루고 있기 때문에, 세포들의 2차원 평면 성장을 방지하고 수직 성장을 유도할 수 있어, 암세포 스페로이드 플랫폼 제조용으로 활용될 수 있다.In addition, in the micro-well plate prepared according to the present invention, since graphene oxide, which improves cell adhesion and growth, forms a band along the inner wall of the micro-well, it prevents the two-dimensional planar growth of cells and prevents vertical growth of cells. Since it can induce growth, it can be utilized for the manufacture of cancer cell spheroid platforms.

아울러, 본 발명의 마이크로-웰이 2차원 어레이(two-dimensional array) 구조를 갖는 경우, 복수 개의 세포 스페로이드를 균일한 크기로 성장시켜 다양한 약물의 특성을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.In addition, when the micro-well of the present invention has a two-dimensional array structure, it is possible to effectively screen the properties of various drugs by growing a plurality of cell spheroids to a uniform size.

또한, 세포들의 수직 성장 유도와 도넛 형태의 암세포 스페로이드 형성 과정은 기존에 보고된 바 없는 새로운 방식이기 때문에, 본 발명은 다양한 형태의 연구에 응용될 수 있다.In addition, since the induction of vertical growth of cells and the process of forming donut-shaped cancer cell spheroids are novel methods that have not been previously reported, the present invention can be applied to various types of research.

도면 1은 본 발명의 실시예에 따른 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법의 모식도이다.
도면 2는 본 발명의 실시예에 따른 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 및 이를 활용한 3차원 세포 스페로이드 플랫폼을 도시한 것이다.
도면 3은 본 발명의 실시예에 따른 마이크로-웰 플레이트를 활용한 암 치료용 약물 스크리닝 방법의 모식도이다.
도면 4는 본 발명의 실시예에 따라 마이크로-웰을 플립 오버(flip over)시켜 세포를 배양하는 방법을 나타낸 것이다.
도면 5는 마이크로-라만 분광법을 사용하여 촬영한 마이크로-웰의 단면 이미지이다.
도면 6은 본 발명의 플레이트 안정성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도면 7은 다양한 직경의 마이크로-웰이 형성된 플레이트를 나타낸 것이다.
도면 8은 다양한 직경의 마이크로-웰에 인간 간암 세포를 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도면 9는 플립 오버(flip over) 방식을 사용하여 세포를 배양한 결과 및 이의 비교예를 나타낸 것이다.
도면 10a 및 10b는 60시간 배양 후, 마이크로-웰 직경 및 세포 초기 농도에 따른 암세포 스페로이드 생성율(%)을 나타낸 그래프이다.
도면 11a는 직경 150㎛ 의 마이크로-웰을 사용하여 배양한 세포의 시간에 따른 암세포 스페로이드 생성율(%)을 나타낸 그래프이고, 도 11b는 단일 마이크로-웰의 세포 커버리지 영역을 시간에 따라 측정한 그래프이다.
도면 12는 배양 시간에 따른 암세포 스페로이드의 광학/형광 이미지이다.
도면 13은 산화 그래핀이 없는 마이크로-웰에서 세포를 배양한 결과를 나타낸 그래프이다.
도면 14는 전립섭 암세포(Hela)를 사용하여 암세포 스페로이드를 배양한 이미지이다.
도면 15는 모세포종 세포주(U87-MG)을 사용하여 암세포 스페로이드를 배양한 이미지이다.
도면 16은 마이크로-웰의 직경을 300㎛, 500㎛로 늘리고, 배양 시간을 96시간으로 변경하여 암세포 스페로이드를 배양한 이미지이다.
도면 17은 하이드록시우레아(HU), 시스플라틴 및 커큐민을 처리한 간암세포 스페로이드의 크기 변화율을 나타낸 이미지 및 그래프이다.
도면 18은 CCK-8 방법과 본 발명의 실시예에 따른 플랫폼을 활용한 커큐민 처리 시의 세포 생존력 변화를 나타낸 그래프이다.1 is a schematic diagram of a method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows a micro-well plate vertically coated with graphene oxide according to an embodiment of the present invention and a three-dimensional cell spheroid platform using the same.
3 is a schematic diagram of a drug screening method for cancer treatment using a micro-well plate according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 shows a method of culturing cells by flip over a micro-well according to an embodiment of the present invention.
5 is a cross-sectional image of a micro-well taken using micro-Raman spectroscopy.
6 is a graph showing the plate stability test results of the present invention.
7 shows a plate in which micro-wells of various diameters are formed.
8 shows the results of culturing human liver cancer cells in micro-wells of various diameters.
9 shows the results of culturing cells using a flip-over method and comparative examples thereof.
Figures 10a and 10b are graphs showing the cancer cell spheroid production rate (%) according to the micro-well diameter and the initial cell concentration after culturing for 60 hours.
11a is a graph showing the cancer cell spheroid production rate (%) over time of cells cultured using a micro-well having a diameter of 150 μm, and FIG. 11b is a graph measuring the cell coverage area of a single micro-well over time. to be.
12 is an optical/fluorescence image of cancer cell spheroids according to incubation time.
13 is a graph showing the results of culturing cells in a micro-well without graphene oxide.
14 is an image of culturing cancer cell spheroids using prostatic cancer cells (Hela).
15 is an image of culturing cancer cell spheroids using a blastoma cell line (U87-MG).
16 is an image of culturing cancer cell spheroids by increasing the diameter of the micro-well to 300 μm and 500 μm, and changing the incubation time to 96 hours.
17 is an image and graph showing the rate of change in size of hepatocellular carcinoma spheroids treated with hydroxyurea (HU), cisplatin and curcumin.
18 is a graph showing changes in cell viability during curcumin treatment using the CCK-8 method and the platform according to an embodiment of the present invention.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. Since the present invention can have various changes and can have various forms, specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail in the text. However, this is not intended to limit the present invention to the specific disclosed form, it should be understood to include all modifications, equivalents and substitutes included in the spirit and scope of the present invention. In describing each figure, like reference numerals have been used for like elements.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terms used in the present application are only used to describe specific embodiments and are not intended to limit the present invention. The singular expression includes the plural expression unless the context clearly dictates otherwise. In the present application, terms such as “comprise” or “have” are intended to designate that a feature, step, operation, component, part, or combination thereof described in the specification is present, and includes one or more other features or steps. , it should be understood that it does not preclude the possibility of the existence or addition of an operation, a component, a part, or a combination thereof.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical and scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Terms such as those defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related art, and should not be interpreted in an ideal or excessively formal meaning unless explicitly defined in the present application. does not

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법의 모식도이다.1 is a schematic diagram of a micro-well plate manufacturing method in which graphene oxide is vertically coated according to an embodiment of the present invention.

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법은 산화 그래핀이 코팅된 기판을 가습하는 단계; 반구형의 마이크로-웰이 하나 이상 형성된 플레이트를 가습된 기판 상에 가압하는 단계; 가압 후 형성된 복합체를 건조시키는 단계; 및 상기 복합체가 형성된 플레이트를 기판으로부터 제거하는 단계;를 포함한다.Referring to FIG. 1 , a method for manufacturing a micro-well plate coated with graphene oxide vertically according to an embodiment of the present invention includes humidifying a substrate coated with graphene oxide; pressing the plate having one or more hemispherical micro-wells formed thereon on the humidified substrate; drying the composite formed after pressing; and removing the plate on which the composite is formed from the substrate.

먼저 도 1의 ⅰ에 도시된 바와 같이, 산화 그래핀이 코팅된 기판을 가습하는 단계를 진행한다. 이로 인해 상기 기판의 표면에는 적절한 두께의 수층이 형성되며, 이러한 수층은 다음 단계(즉, 가압하는 단계(ⅱ, ⅲ))에서 산화 그래핀의 일부가 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착되도록 하는 접착제로 작용할 수 있다.First, as shown in i of FIG. 1, a step of humidifying the graphene oxide-coated substrate is performed. Due to this, an aqueous layer of an appropriate thickness is formed on the surface of the substrate, and this aqueous layer is formed so that a part of graphene oxide is attached to a part of the inner wall of the micro-well in the next step (ie, pressing (ii, iii)) It can act as an adhesive.

이때, 상기 단계에서 사용되는 기판은 특별히 제한되는 것은 아니나, 산화 그래핀이 코팅될 수 있는 유리, 폴리프로필렌, 알루미늄, 철, 금 및 스테인리스합금 중에서 선택된 재질로 이루어지는 것이 바람직하다.At this time, the substrate used in the above step is not particularly limited, but preferably made of a material selected from glass, polypropylene, aluminum, iron, gold and stainless alloy on which graphene oxide can be coated.

또한, 산화 그래핀이 코팅된 기판은 산화 그래핀 분산액을 기판 상에 스핀 코팅하여 형성되며, 분산액의 용매로는 예를 들어, 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the graphene oxide-coated substrate is formed by spin-coating a graphene oxide dispersion on the substrate, and for example, ethanol may be used as a solvent for the dispersion, but is not limited thereto.

다음으로, 반구형의 마이크로-웰이 하나 이상 형성된 플레이트를 가습된 기판 상에 가압하는 단계를 진행한다(도 1의 ⅱ, ⅲ 참조).Next, a step of pressing the plate having one or more hemispherical micro-wells formed thereon is performed on the humidified substrate (refer to ii and iii of FIG. 1 ).

상기 플레이트는 예를 들어, PDMS, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리우레탄 아크릴레이트 등의 폴리머 재질로 이루어지며, 플레이트에 형성된 반구형의 마이크로-웰의 직경은 100 내지 250 ㎛, 더욱 바람직하게는 100 내지 175 ㎛ 일 수 있다. 또한, 상기 플레이트에 형성된 마이크로-웰은 2차원 어레이(two-dimensional array) 구조를 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.The plate is made of a polymer material such as PDMS, polyethylene glycol, polymethyl methacrylate, polyurethane acrylate, for example, and the diameter of the hemispherical micro-well formed in the plate is 100 to 250 μm, more preferably It may be 100 to 175 μm. In addition, the micro-well formed in the plate preferably has a two-dimensional array structure, but is not limited thereto.

또한, 도 1의 ⅱ에 나타나듯이, 상기 단계는 반구형의 평면부가 가습된 기판과 접촉하도록 배치하고, 반구형의 마이크로-웰의 둘레부가 가습된 기판과 접촉할 때까지 가압을 유지한다. 즉, 마이크로-웰의 내측벽이 가습된 기판과 접촉할 때까지 가압을 유지하는 것이 바람직하다.In addition, as shown in ii of FIG. 1 , in the above step, the hemispherical flat portion is placed in contact with the humidified substrate, and the pressure is maintained until the periphery of the hemispherical micro-well comes into contact with the humidified substrate. That is, it is desirable to maintain the pressurization until the inner wall of the micro-well is in contact with the humidified substrate.

가습된 기판 표면에는 수층이 형성되어 있으며, 이러한 수층은 가압 시에 기판 상에 가해지는 압력을 적절히 제어하는 동시에, 수축되어 기판과 접촉된 마이크로-웰의 둘레부에 산화 그래핀이 부착되도록 하는 접착제 역할을 한다. 따라서, 기판과 접촉된 반구형의 마이크로-웰의 둘레부에만 산화 그래핀이 부착된다. 즉, 기판과 접촉된 반구형의 마이크로-웰의 내측벽의 일부에만 산화 그래핀의 일부가 부착된다.A water layer is formed on the surface of the humidified substrate, and the water layer appropriately controls the pressure applied on the substrate when pressed, and at the same time shrinks to attach graphene oxide to the periphery of the micro-well in contact with the substrate. plays a role Therefore, graphene oxide is attached only to the periphery of the hemispherical micro-well in contact with the substrate. That is, a portion of graphene oxide is attached only to a portion of the inner wall of the hemispherical micro-well in contact with the substrate.

이후, 가압을 해제하면, 산화 그래핀의 일부가 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착된 복합체가 형성되게 되며, 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착된 산화 그래핀은 반구형의 마이크로-웰의 내측벽을 따라 띠 형태를 이루게 된다.Thereafter, when the pressure is released, a complex in which a part of graphene oxide is attached to a part of the inner wall of the micro-well is formed, and graphene oxide attached to a part of the inner wall of the micro-well is a hemispherical micro-well It forms a band along the inner wall of

다음으로, 가압 후 형성된 복합체를 건조시키는 단계를 수행한다(도 1의 ⅳ, ⅴ 참조).Next, a step of drying the composite formed after pressing is performed (refer to iv and v of FIG. 1 ).

구체적으로, 상기 복합체를 50 내지 90℃ 의 온도로, 약 8 내지 20 분 동안 건조시켜 접착제 역할을 하는 수층을 제거함으로써, 다음 단계(즉, 제거하는 단계(ⅵ))에서 반구형의 평면부에 산화 그래핀이 추가로 부착되는 것을 방지할 수 있다.Specifically, the composite is dried at a temperature of 50 to 90° C. for about 8 to 20 minutes to remove the aqueous layer serving as an adhesive, thereby oxidizing the hemispherical flat part in the next step (ie, removing step (vi)). It is possible to prevent the graphene from being additionally attached.

마지막으로, 상기 복합체가 형성된 플레이트를 기판으로부터 제거하여, 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트를 제조할 수 있다(도 1의 ⅵ 참조).Finally, by removing the plate on which the composite is formed from the substrate, it is possible to prepare a micro-well plate coated with graphene oxide vertically (refer to vi of FIG. 1 ).

도 1의 ⅵ에 나타나듯이, 상기 건조시키는 단계에서 수층을 제거하였기 때문에, 플레이트를 기판으로부터 제거할 때, 반구형의 평면부에 접촉된 산화 그래핀은 기판 상에 그대로 남아있게 된다. 따라서, 제조된 마이크로-웰 플레이트는, 반구형의 마이크로-웰의 내측벽의 일부에만 산화 그래핀이 부착된 구조를 가질 수 있다.As shown in vi of FIG. 1, since the water layer is removed in the drying step, when the plate is removed from the substrate, the graphene oxide in contact with the hemispherical flat portion remains on the substrate as it is. Therefore, the prepared micro-well plate may have a structure in which graphene oxide is attached to only a part of the inner wall of the hemispherical micro-well.

본 발명에 따르면, 습도와 압력의 적절한 조절을 통해 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트를 간편하게 제조할 수 있다.According to the present invention, it is possible to conveniently prepare a micro-well plate coated with graphene oxide vertically through appropriate control of humidity and pressure.

도 2는 본 발명의 실시예에 따른 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 및 이를 활용한 3차원 세포 스페로이드 플랫폼을 도시한 것이다.Figure 2 shows a micro-well plate vertically coated with graphene oxide according to an embodiment of the present invention and a three-dimensional cell spheroid platform using the same.

도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트는, 반구형의 마이크로-웰이 하나 이상 형성되며, 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 산화 그래핀이 부착된 구조를 갖는다.Referring to FIG. 2 , in the micro-well plate vertically coated with graphene oxide according to an embodiment of the present invention, one or more hemispherical micro-wells are formed, and graphene oxide is formed on a part of the inner wall of the micro-well. It has an attached structure.

산화 그래핀은 ECM 성분의 강력하고 빠른 흡수를 유도하고, 세포의 접착 및 확산을 향상시키는 물질이며, 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착된 산화 그래핀은 반구형의 마이크로-웰의 내측벽을 따라 띠 형태를 이루게 된다.Graphene oxide is a material that induces strong and rapid absorption of ECM components and improves cell adhesion and diffusion. It will form a band shape.

본 발명의 마이크로-웰 플레이트는 세포의 접착 및 성장을 향상시키는 산화 그래핀이 마이크로-웰의 내측벽을 따라 띠 형태를 이루고 있기 때문에, 세포들의 2차원 평면 성장을 방지하고 수직 성장을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 플레이트는 3차원 세포 스페로이드 플랫폼 제조용으로 사용될 수 있다.In the micro-well plate of the present invention, since graphene oxide, which improves cell adhesion and growth, forms a band along the inner wall of the micro-well, it is possible to prevent the two-dimensional planar growth of cells and induce vertical growth. have. Therefore, the plate of the present invention can be used for the preparation of a three-dimensional cell spheroid platform.

이때, 세포가 2차원 형태가 아닌 3차원 스페로이드(spheroid) 형태로 성장하기 위해서, 상기 마이크로-웰의 직경은 100 내지 175 ㎛ 인 것이 바람직하다. 마이크로-웰의 직경이 175 ㎛ 를 초과하는 경우에는, 2차원 세포 성장이 이루어지게 된다.At this time, in order for the cells to grow in a three-dimensional spheroid form rather than a two-dimensional form, the diameter of the micro-well is preferably 100 to 175 µm. When the diameter of the micro-well exceeds 175 μm, two-dimensional cell growth is achieved.

또한, 상기 마이크로-웰은 플레이트에 복수 개로 형성되고, 2차원 어레이(two-dimensional array) 구조를 갖는 것이 바람직한데, 이는 복수 개의 세포 스페로이드를 균일한 크기로 성장시켜 다양한 약물의 특성을 용이하게 확인하기 위함이다.In addition, the micro-well is formed in plurality on the plate, and it is preferable to have a two-dimensional array structure, which facilitates the properties of various drugs by growing a plurality of cell spheroids to a uniform size. to check

한편, 본 발명의 마이크로-웰은 암세포 스페로이드 플랫폼 제조용으로 활용될 수 있고, 이를 암 치료용 약물 스크리닝에 활용할 수 있다. 여기서, 상기 암세포는 간암 세포, 전립선암 세포, 자궁경부암 세포, 교모세포종 세포, 위암 세포, 혈액암 세포, 대장암 세포, 방광암 세포, 고환암 세포, 난소암 세포, 유방암 세포, 식도암 세포, 구강암 세포, 폐암 세포, 중피종 세포, 신경아세포종 세포, 췌장암 세포, 후두암 세포, 피부암 세포 등 모든 종류의 암세포 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.On the other hand, the micro-well of the present invention can be utilized for manufacturing a cancer cell spheroid platform, and it can be utilized for drug screening for cancer treatment. Here, the cancer cells include liver cancer cells, prostate cancer cells, cervical cancer cells, glioblastoma cells, gastric cancer cells, blood cancer cells, colorectal cancer cells, bladder cancer cells, testicular cancer cells, ovarian cancer cells, breast cancer cells, esophageal cancer cells, oral cancer cells, It may include any one or more selected from all types of cancer cells, such as lung cancer cells, mesothelioma cells, neuroblastoma cells, pancreatic cancer cells, laryngeal cancer cells, and skin cancer cells.

다른 예로, 본 발명의 마이크로-웰은 면역세포 스페로이드 플랫폼 제조용으로도 활용될 수 있고, 상기 면역세포는 신경줄기세포, 중간엽줄기세포, 조혈모세포, 간세포, 혈관세포, 근세포, 폐포세포, 신장세포, 상피세포 등 모든 종류의 면역세포 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.As another example, the micro-well of the present invention can also be used for manufacturing an immune cell spheroid platform, and the immune cells are neural stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, hepatocytes, vascular cells, myocytes, alveolar cells, kidney cells. , may include any one or more selected from all types of immune cells such as epithelial cells.

도 3은 본 발명의 실시예에 따른 마이크로-웰 플레이트를 활용한 암 치료용 약물 스크리닝 방법의 모식도이다.3 is a schematic diagram of a drug screening method for cancer treatment using a micro-well plate according to an embodiment of the present invention.

도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 암 치료용 약물 스크리닝 방법은, 상기 마이크로-웰 플레이트에 형성된 복수 개의 마이크로-웰에 암세포를 분주하여, 3차원 스페로이드(spheroid) 형태로 배양하는 단계; 상기 마이크로-웰 내에 후보 약물을 투여하는 단계; 및 3차원 세포 스페로이드의 크기 변화를 측정하는 단계;를 포함할 수 있다.Referring to FIG. 3 , in the drug screening method for cancer treatment according to an embodiment of the present invention, cancer cells are dispensed into a plurality of micro-wells formed in the micro-well plate, and cultured in a three-dimensional spheroid form. to do; administering a candidate drug into the micro-well; and measuring the size change of the three-dimensional cell spheroid.

먼저, 본 발명의 마이크로-웰 플레이트에 형성된 복수 개의 마이크로-웰에 암세포를 분주하여, 3차원 스페로이드(spheroid) 형태로 배양하는 단계가 진행된다.First, by dispensing cancer cells into a plurality of micro-wells formed in the micro-well plate of the present invention, a step of culturing in a three-dimensional spheroid form is performed.

여기서, 상기 암세포는 간암 세포, 전립선암 세포, 자궁경부암 세포, 교모세포종 세포, 위암 세포, 혈액암 세포, 대장암 세포, 방광암 세포, 고환암 세포, 난소암 세포, 유방암 세포, 식도암 세포, 구강암 세포, 폐암 세포, 중피종 세포, 신경아세포종 세포, 췌장암 세포, 후두암 세포, 피부암 세포 등의 다양한 암세포를 사용할 수 있으며, 배양 시간은 12 내지 72 시간으로 조절할 수 있다.Here, the cancer cells include liver cancer cells, prostate cancer cells, cervical cancer cells, glioblastoma cells, gastric cancer cells, blood cancer cells, colorectal cancer cells, bladder cancer cells, testicular cancer cells, ovarian cancer cells, breast cancer cells, esophageal cancer cells, oral cancer cells, Various cancer cells, such as lung cancer cells, mesothelioma cells, neuroblastoma cells, pancreatic cancer cells, laryngeal cancer cells, skin cancer cells, etc. can be used, and the incubation time can be adjusted to 12 to 72 hours.

구체적으로, 암세포들은 배양 시간의 경과에 따라 마이크로-웰의 내측벽을 따라 수직 성장하여 균일한 크기의 3차원 스페로이드(spheroid) 형태를 나타내게 된다. 이때, 상기 배양 시간이 60 시간을 경과하는 경우에는, 마이크로-웰의 제한된 부피로 인해 마이크로-웰 외부로 세포가 성장하게 되어, 균일한 암세포 스페로이드를 생성하는 데 제한이 따른다.Specifically, cancer cells grow vertically along the inner wall of the micro-well with the lapse of incubation time to exhibit a three-dimensional spheroid shape of a uniform size. At this time, when the incubation time exceeds 60 hours, the cells grow outside the micro-well due to the limited volume of the micro-well, thereby limiting the generation of uniform cancer cell spheroids.

따라서, 배양 시간이 60 시간을 경과하는 경우에는, 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 마이크로-웰을 플립 오버(flip over) 시키는 것이 바람직하며, 내측벽에 부착된 산화 그래핀의 존재로 인해, 마이크로-웰이 플립 오버(flip over)된 후에도 세포는 수직 방향으로 성장하게 된다.Therefore, when the incubation time exceeds 60 hours, as shown in FIG. 4, it is preferable to flip over the micro-well, and due to the presence of graphene oxide attached to the inner wall, Even after the micro-well is flipped over, the cells grow in a vertical direction.

다음으로, 암세포 스페로이드(spheroid)가 존재하는 마이크로-웰 내에 후보 약물을 투여하는 단계가 진행된다. 이때, 후보 약물은 암세포의 종류에 따라 변화시킬 수 있다. 일 실시예로, 상기 암세포가 간암 세포, 자궁경부암 세포, 혈액암 세포, 교모세포종 세포 또는 위암 세포인 경우, 후보 약물로는 하이드록시우레아를 사용할 수 있고, 간암 세포, 교모세포종 세포, 위암 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 고환암 세포, 난소암 세포, 유방암 세포, 식도암 세포, 구강암 세포, 폐암 세포, 중피종 세포, 신경아세포종 세포, 췌장암 세포, 후두암 세포 또는 피부암 세포인 경우, 시스플라틴을 사용할 수 있다.Next, a step of administering a candidate drug into the micro-well in which cancer cell spheroids are present is performed. In this case, the candidate drug may be changed according to the type of cancer cell. In one embodiment, when the cancer cell is a liver cancer cell, a cervical cancer cell, a blood cancer cell, a glioblastoma cell, or a gastric cancer cell, hydroxyurea may be used as a candidate drug, and a liver cancer cell, a glioblastoma cell, a gastric cancer cell, For prostate cancer cells, bladder cancer cells, testicular cancer cells, ovarian cancer cells, breast cancer cells, esophageal cancer cells, oral cancer cells, lung cancer cells, mesothelioma cells, neuroblastoma cells, pancreatic cancer cells, laryngeal cancer cells or skin cancer cells, cisplatin can be used.

또한, 다양한 후보 약물을 각각의 마이크로-웰 내에 투여하여, 복수의 후보 약물을 동시에 스크리닝할 수도 있다.In addition, a plurality of candidate drugs may be simultaneously screened by administering various candidate drugs into each micro-well.

이후, 3차원 세포 스페로이드 크기 변화를 측정하는 단계를 진행한다. 마이크로-웰 플레이트에서 성장한 복수의 암세포 스페로이드는 균일한 크기를 가지기에, 암세포 스페로이드 크기의 변화를 자동 모니터링하여 후보 약물을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.Thereafter, the step of measuring the three-dimensional cell spheroid size change is performed. Since a plurality of cancer cell spheroids grown in a micro-well plate have a uniform size, it is possible to effectively screen a candidate drug by automatically monitoring a change in the size of the cancer cell spheroid.

이하 본 발명의 다양한 실시예들 및 실험예들에 대해 상술한다. 다만, 하기의 실시예들은 본 발명의 일부 실시예에 불과한 것으로서, 본 발명이 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.Hereinafter, various embodiments and experimental examples of the present invention will be described in detail. However, the following examples are only some examples of the present invention, and the present invention should not be construed as being limited to the following examples.

마이크로-웰 플레이트 제조Micro-well plate preparation

18mm 크기의 정사각형 커버 유리를 기판으로 준비하고, PDMS로 이루어지고, 복수 개의 반구형의 마이크로-웰이 어레이 구조로 형성된 플레이트를 준비하였다.A square cover glass having a size of 18 mm was prepared as a substrate, and a plate made of PDMS, in which a plurality of hemispherical micro-wells were formed in an array structure, was prepared.

또한, 수용액 상의 단일층 산화 그래핀을 12000 rpm 으로 20분 동안 원심 분리시키고, 증류수의 70%를 에탄올(100% 농도)로 대체하여 산화 그래핀 분산액을 제조하였다.In addition, the single-layer graphene oxide in the aqueous solution was centrifuged at 12000 rpm for 20 minutes, and 70% of distilled water was replaced with ethanol (100% concentration) to prepare a graphene oxide dispersion.

이후, 100℃에서 1분 동안 커버 유리를 가열하고, 산화 그래핀 분산액을 가열한 커버 유리 상에 150㎕ 분배한 후, 약 45초 동안 가열하였다. 가열 공정 직후, 스핀 코팅 공정을 통해 산화 그래핀이 코팅된 커버 유리를 얻었다.Thereafter, the cover glass was heated at 100° C. for 1 minute, 150 μl of the graphene oxide dispersion was dispensed on the heated cover glass, and then heated for about 45 seconds. Immediately after the heating process, a cover glass coated with graphene oxide was obtained through a spin coating process.

다음으로, 준비된 커버 유리를 가습하여 표면에 수층을 형성하고, 상기 플레이트를 커버 유리 상에 배치한 후 중량으로 가압하였다. 이때, 반구형의 마이크로-웰이 수축하여, 반구형의 마이크로-웰의 둘레부가 커버 유리와 접촉하도록 가압을 유지하였다.Next, the prepared cover glass was humidified to form a water layer on the surface, and the plate was placed on the cover glass and pressed with a weight. At this time, the hemispherical micro-well contracted, and the pressure was maintained so that the periphery of the hemispherical micro-well was in contact with the cover glass.

가압 완료 후, 복합체를 오븐에서 70℃의 온도로 약 10분 동안 건조시키고, 커버 유리로부터 플레이트를 제거하여 마이크로-웰 플레이트(실시예)를 제조하였다.After completion of the pressing, the composite was dried in an oven at a temperature of 70° C. for about 10 minutes, and the plate was removed from the cover glass to prepare a micro-well plate (Example).

실험용 나이프를 사용하여 제조된 마이크로-웰을 수직으로 절단한 후, 마이크로-라만 분광법을 사용하여 마이크로-웰의 단면 이미지를 촬영한 결과를 도 5에 도시하였다.5 shows the result of taking a cross-sectional image of the micro-well by using a micro-Raman spectroscopy method after vertically cutting the prepared micro-well using an experimental knife.

도 5a-5b를 참조하면, 산화 그래핀이 마이크로-웰의 내측벽에 선택적으로 부착되어 있음을 확인할 수 있다.Referring to FIGS. 5A-5B , it can be seen that graphene oxide is selectively attached to the inner wall of the micro-well.

또한, 도 5c를 참조하면, sp2-결합 탄소 원자의 구조적 결함 및 면내(in-plane) 진동에 각각 대응하는 산화 그래핀의 D 및 G 밴드가 스펙트럼에 분명하게 나타나며, 이는 마이크로-웰의 내측벽에 산화 그래핀이 존재함을 나타낸다.In addition, referring to FIG. 5C , the D and G bands of graphene oxide corresponding to structural defects and in-plane vibrations of sp 2 -bonded carbon atoms, respectively, are clearly shown in the spectrum, which is the inner surface of the micro-well. It indicates the presence of graphene oxide on the sidewall.

한편, 라만 스펙트럼을 나타내는 도 5d에 나타나듯이, 청색 영역은 산화 그래핀의 G-밴드 피크(1580cm-1)에 대응하고, 적색 영역은 PDMS 폴리머의 CH3 연신(2935 cm-1) 피크에 대응한다.On the other hand, as shown in Fig. 5d showing the Raman spectrum, the blue region corresponds to the G-band peak (1580 cm -1 ) of graphene oxide, and the red region corresponds to the CH 3 elongation (2935 cm -1 ) peak of the PDMS polymer. do.

또한, 20㎛ 간격의 단면 라만 맵(Raman map)을 나타낸 도 5e ⅰ-ⅳ에서도, G 밴드는 마이크로-웰의 내측벽에만 나타나, 산화 그래핀이 마이크로-웰의 내측벽에 수직으로 코팅되었음을 알 수 있다.In addition, in Fig. 5e i-iv showing a cross-sectional Raman map at an interval of 20 μm, the G band appeared only on the inner wall of the micro-well, indicating that graphene oxide was vertically coated on the inner wall of the micro-well. can

마이크로-웰 플레이트 안정성 평가Micro-well plate stability evaluation

실시예에 따른 플레이트의 안정성을 확인하기 위하여, 하나의 플레이트는 1시간 동안 고온(70℃) 처리하였고, 다른 하나의 플레이트는 상온에서 1개월 동안 유지시켰다. 도 6은 플레이트 안정성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.In order to confirm the stability of the plate according to the example, one plate was treated at high temperature (70° C.) for 1 hour, and the other plate was maintained at room temperature for 1 month. 6 is a graph showing the results of the plate stability test.

도 6에 나타난 바와 같이, 플레이트는 대조군과 비교하여 고온(70℃)의 조건에서도 스페로이드 생성률(%)의 차이가 거의 없어 안정성을 나타냈고, 장기간(> 1개월) 동안 매우 안정적인 상태를 유지하였다.As shown in Figure 6, the plate showed stability because there was little difference in the spheroid production rate (%) even under conditions of high temperature (70 ° C) compared to the control, and maintained a very stable state for a long period of time (> 1 month). .

이러한 높은 안정성은 종래의 ECM 단백질을 사용한 플레이트로는 달성하기 어려우며, 따라서, 본 발명의 마이크로-웰 플레이트는 암세포 스페로이드를 대규모 생산하기 위한 플랫폼으로 활용될 수 있다.Such high stability is difficult to achieve with conventional plates using ECM proteins, and therefore, the micro-well plate of the present invention can be utilized as a platform for large-scale production of cancer cell spheroids.

암세포 스페로이드 생성률 평가Evaluation of cancer cell spheroid production rate

마이크로-웰 직경에 따른 암세포 스페로이드 생성률(%)을 확인하기 위하여, 마이크로-웰 직경이 100㎛, 125㎛, 150㎛, 175㎛, 200㎛, 225㎛, 250㎛ 인 플레이트를 각각 준비하였다(도 7 참조).In order to confirm the cancer cell spheroid production rate (%) according to the micro-well diameter, micro-well diameters of 100 μm, 125 μm, 150 μm, 175 μm, 200 μm, 225 μm, and 250 μm were prepared for each plate ( see Fig. 7).

이후, 각 플레이트의 마이크로-웰 내에 인간 간암 세포(HepG2 from Korean Cell Line Bank, Korean Cell Line Research Foundation)를 초기 농도 1 x 106 으로 분주한 후 배양하였다(도 8 참조). 여기서, 세포 배양 배지로는 Dulbecco 변형 Cagle 배지(Gibco)를 사용하였고, 배양 조건은 37℃, 5% CO2 농도로 유지되었다. 배양된 세포는 12시간 주기로 확인하였다.Thereafter, human liver cancer cells (HepG2 from Korean Cell Line Bank, Korean Cell Line Research Foundation) were aliquoted into micro-wells of each plate at an initial concentration of 1×10 6 and cultured (see FIG. 8 ). Here, as the cell culture medium, Dulbecco's modified Cagle medium (Gibco) was used, and the culture conditions were maintained at 37° C. and 5% CO 2 concentration. Cultured cells were checked every 12 hours.

또한, 배양시간이 60시간을 경과한 후에는, 마이크로-웰을 "플립 오버" 방식으로 12시간 동안 추가 배양하였다. 비교예 1로, 배양시간 60시간 경과 후에도, 마이크로-웰을 지속적으로 배양시킨 샘플을 준비하였다(도 9 참조).In addition, after the incubation time of 60 hours, the micro-wells were further cultured for 12 hours in a "flip-over" method. In Comparative Example 1, even after 60 hours of incubation time, a sample in which the micro-well was continuously cultured was prepared (see FIG. 9 ).

비교예 2로, 산화 그래핀이 없는 마이크로-웰에서 동일한 조건 하에 세포를 배양시켰다.As Comparative Example 2, cells were cultured under the same conditions in a micro-well without graphene oxide.

도 9를 참조하면, 비교예의 경우, 마이크로-웰의 제한된 부피로 인해 72시간의 배양 시에 마이크로-웰의 외부까지 세포가 성장한 반면, 본 발명의 실시예에 따라 "플립 오버" 방식으로 배양한 경우, 세포에 대한 산화 그래핀의 높은 접착성으로 인해 세포의 수직 성장이 유도되었고, 마이크로-웰 외부의 세포 성장이 감소한 것을 알 수 있다.Referring to FIG. 9 , in the case of the comparative example, the cells grew to the outside of the micro-well during culturing for 72 hours due to the limited volume of the micro-well, whereas the cells were cultured in the "flip-over" method according to the embodiment of the present invention. In this case, it can be seen that the vertical growth of the cells was induced due to the high adhesion of graphene oxide to the cells, and the cell growth outside the micro-well was reduced.

도 10a 및 도 10b는 60시간 배양 후, 마이크로-웰 직경 및 세포 초기 농도에 따른 암세포 스페로이드 생성율(%)을 나타낸 그래프이다.10A and 10B are graphs showing the cancer cell spheroid production rate (%) according to the micro-well diameter and the initial cell concentration after 60 hours of incubation.

도 10a를 참조하면, 마이크로-웰의 직경이 100㎛, 125㎛, 150㎛, 175㎛, 200㎛, 225㎛ 및 250㎛ 일 때, 각각의 암세포 스페로이드 생성률(%)은 순서대로, 56.2%, 82.4%, 81.9%, 58.8%, 30.9%, 29.3% 및 24% 로 나타났다.Referring to Figure 10a, when the diameter of the micro-well is 100㎛, 125㎛, 150㎛, 175㎛, 200㎛, 225㎛ and 250㎛, each cancer cell spheroid production rate (%) in that order, 56.2% , 82.4%, 81.9%, 58.8%, 30.9%, 29.3% and 24%.

마이크로-웰의 직경이 100㎛ 내지 175㎛ 인 경우, 생성률(%)이 50% 이상으로 나타났고, 특히, 직경이 125㎛ 내지 150㎛ 인 경우, 80% 이상의 높은 효율을 나타냈다. 반면, 직경이 175㎛를 초과하는 경우에는 현저하게 생성률(%)이 낮아졌으며, 2차원 세포 성장이 유도되었다. 이러한 결과로 보아, 암세포 스페로이드를 형성하기 위해서, 마이크로-웰의 직경은 100 내지 175㎛ 인 것이 바람직하다.When the micro-well diameter was 100 μm to 175 μm, the production rate (%) was 50% or more, and particularly, when the diameter was 125 μm to 150 μm, high efficiency of 80% or more was exhibited. On the other hand, when the diameter exceeded 175㎛, the production rate (%) was significantly lowered, and two-dimensional cell growth was induced. From these results, in order to form cancer cell spheroids, the diameter of the micro-well is preferably 100 to 175 μm.

또한, 도 10b 에 나타나듯이, 모든 직경에서, 세포 초기 농도가 1 x 106 일 때, 가장 높은 암세포 스페로이드 생성율(%)이 측정되었다.In addition, as shown in FIG. 10b , in all diameters , when the initial cell concentration was 1 x 10 6 , the highest cancer cell spheroid production rate (%) was measured.

도 11a는 직경 150㎛ 의 마이크로-웰을 사용하여 배양한 세포의 시간에 따른 암세포 스페로이드 생성율(%)을 나타낸 그래프이고, 도 11b는 단일 마이크로-웰의 세포 커버리지 영역을 시간에 따라 측정한 그래프이다. 도 12는 배양 시간에 따른 암세포 스페로이드의 광학/형광 이미지를 나타낸 것이다.11A is a graph showing the cancer cell spheroid production rate (%) over time of cells cultured using a micro-well having a diameter of 150 μm, and FIG. 11B is a graph measuring the cell coverage area of a single micro-well over time. to be. 12 shows optical/fluorescence images of cancer cell spheroids according to incubation time.

먼저, 도 11 및 12를 참조하면, 세포가 마이크로-웰의 내측벽에 부착된 산화 그래핀의 존재로 인해 마이크로-웰의 내측벽을 따라 도넛형 구조로 성장하는 것을 확인할 수 있다. 세포는 72시간까지 수직으로 성장하였으며, 시간이 지날수록 마이크로-웰의 중심에도 성장하여 3차원 구조를 형성하며, 중심에 괴사성(necrotic) 코어가 있는 종양 스페로이드의 뚜렷한 구조가 관찰되었다.First, referring to FIGS. 11 and 12 , it can be confirmed that the cells grow in a donut-shaped structure along the inner wall of the micro-well due to the presence of graphene oxide attached to the inner wall of the micro-well. Cells were grown vertically up to 72 hours, and as time passed, they also grew in the center of the micro-well to form a three-dimensional structure, and a distinct structure of a tumor spheroid with a necrotic core in the center was observed.

또한, 도 11b를 참조하면, 세포 커버리지, 즉 세포로 덮인 면적을 마이크로-웰의 면적으로 나눈 값은 배양 48시간 후에 80.32%, 60시간 후에 88.35%, 72시간 후에 100%로 측정되었다.In addition, referring to FIG. 11B , the cell coverage, that is, the value obtained by dividing the area covered with cells by the area of the micro-well was 80.32% after 48 hours of culture, 88.35% after 60 hours, and 100% after 72 hours.

한편, 비교예 2를 나타낸 도 13을 살펴보면, 산화 그래핀이 없는 마이크로-웰의 경우, 세포 부착이나 별도의 도넛형 스페로이드 형성은 관찰되지 않았다.On the other hand, looking at FIG. 13 showing Comparative Example 2, in the case of a micro-well without graphene oxide, cell adhesion or separate donut-shaped spheroid formation was not observed.

즉, 도 10b를 참조하면, 본 발명의 간암 세포는 세포 초기 농도 1 x 106 로, 직경 150㎛ 의 마이크로-웰 내에서 72시간 동안 배양하고, 60시간 경과 후에는 "플립 오버"방식으로 세포를 배양하는 경우, 가장 높은 3차원 스페로이드 생성율(%)을 나타낼 수 있다. 또한, 이러한 조건을 적용하여, 1cm2 면적의 플레이트에서 3일 동안 약 850 개 이상의 간암 세포 스페로이드를 균일하게 생성할 수 있다.That is, referring to FIG. 10b , the liver cancer cells of the present invention are cultured for 72 hours in a micro-well having a diameter of 150 μm at an initial cell concentration of 1×10 6 , and after 60 hours, the cells in a “flip-over” manner. When culturing, it can represent the highest three-dimensional spheroid production rate (%). In addition, by applying these conditions, about 850 or more liver cancer cell spheroids can be uniformly generated in a plate of 1 cm 2 area for 3 days.

또한, 간암 세포 이외에, 전립선 암세포(Hela) 및 모세포종 세포주(U87-MG)과 같은 다른 암세포 또한 동일한 조건을 적용하여, 성공적으로 암세포 스페로이드를 균일하게 생성할 수 있다(도 14 및 15 참조).In addition, in addition to liver cancer cells, other cancer cells such as prostate cancer cells (Hela) and blastoma cell line (U87-MG) can also successfully and uniformly generate cancer cell spheroids by applying the same conditions (see FIGS. 14 and 15).

한편, 도 16은 마이크로-웰의 직경을 300㎛, 500㎛로 늘리고, 배양 시간을 96시간으로 변경하고, 나머지 조건은 동일하게 실험을 수행하여 암세포 스페로이드를 배양한 이미지이다.Meanwhile, FIG. 16 is an image of culturing cancer cell spheroids by increasing the diameter of the micro-well to 300 μm and 500 μm, changing the incubation time to 96 hours, and performing the same experiment for the rest of the conditions.

도 16에 도시된 바와 같이, 마이크로-웰의 직경 및 배양 시간을 늘리는 경우, 암세포 스페로이드의 크기를 600㎛ 까지 확보할 수 있다.As shown in FIG. 16 , when the diameter and incubation time of the micro-well are increased, the size of the cancer cell spheroids can be secured up to 600 μm.

약물 스크리닝drug screening

후보 약물로 항암제인 하이드록시우레아(HU), 시스플라틴과, 저독성 식품 유래 잠재적 항암 물질인 커큐민을 준비하였다.As candidate drugs, hydroxyurea (HU) and cisplatin, which are anticancer drugs, and curcumin, a potential anticancer substance derived from low-toxic foods, were prepared.

이후, 항암제인 하이드록시우레아, 시스플라틴을 실시예에서 형성된 간암세포 스페로이드에 각각 10 ㎍/ml, 100㎍/ml, 500㎍/ml 및 1㎎/ml 로 처리하고, 커큐민은 500μM, 1mM, 10mM 및 20mM 로 처리하였다.Then, the anticancer agents hydroxyurea and cisplatin were treated with 10 μg/ml, 100 μg/ml, 500 μg/ml and 1 mg/ml, respectively, on the liver cancer cell spheroids formed in Examples, and curcumin was 500 μM, 1 mM, 10 mM and 20 mM.

이후, 약물 처리한 간암세포 스페로이드를 48시간 동안 인큐베이션하고, 24시간 간격으로 스페로이드의 크기 변화를 광학 이미지를 통해 분석하여 변화율을 측정하였다(도 17a-17g 참조).Thereafter, the drug-treated liver cancer cell spheroids were incubated for 48 hours, and the change in the size of the spheroids at 24 hour intervals was analyzed through optical images to measure the rate of change (see FIGS. 17a-17g ).

도 17b는 간암세포 스페로이드에 대한 하이드록시우레아(HU)의 농도 의존적 독성(10㎍/ml 내지 1㎎/ml)를 나타낸 그래프이다.17B is a graph showing the concentration-dependent toxicity (10 μg/ml to 1 mg/ml) of hydroxyurea (HU) to hepatocellular carcinoma spheroids.

도 17b에 나타나듯이, 10㎍/ml 의 HU를 처리한 경우, 암세포 스페로이드 크기는 초기 크기 97.3%에서, 24시간 후 57.7%, 48시간 후 32.4% 로 각각 감소한 것을 확인할 수 있고, 고용량인 500㎍/ml 의 고농도로 처리할 때, 24시간 후 27%, 48시간 후 3.4% 로 각각 감소한 것을 알 수 있다.As shown in Figure 17b, when treated with 10㎍ / ml of HU, the cancer cell spheroid size can be confirmed that each decreased from 97.3% of the initial size, 57.7% after 24 hours, and 32.4% after 48 hours, and a high dose of 500 It can be seen that, when treated with a high concentration of μg/ml, it was reduced to 27% after 24 hours and 3.4% after 48 hours, respectively.

시스플라틴을 10㎍/ml 처리한 경우, 24 시간 및 48 시간 후 각각 54% 및 38.7% 의 크기를 나타냈고(도 17c), 커큐민은 500ㅅM 를 처리한 경우, 각각 60.3% 및 30.5% 의 크기로 측정되어 HU와 유사한 결과를 나타냈으며, 이를 통해 본 발명의 마이크로-웰 플레이트를 기반으로 제조된 플랫폼은 약물의 신속한 스크리닝에 매우 효과적임을 알 수 있다.When cisplatin was treated with 10 μg/ml, the sizes were 54% and 38.7%, respectively, after 24 hours and 48 hours ( FIG. 17c ), and when curcumin was treated with 500 μM, the sizes were 60.3% and 30.5%, respectively. was measured and showed similar results to HU, and through this, it can be seen that the platform manufactured based on the micro-well plate of the present invention is very effective for rapid screening of drugs.

도 18a는 CCK-8 방법을 활용한 커큐민 처리 시의 세포 생존력 변화를 나타낸 그래프이고, 도 18b는 본 발명의 실시예에 따른 플랫폼을 활용한 커큐민 처리 시의 세포 생존력 변화를 나타낸 그래프이다.18A is a graph showing changes in cell viability upon curcumin treatment using the CCK-8 method, and FIG. 18B is a graph showing changes in cell viability upon treatment with curcumin using a platform according to an embodiment of the present invention.

도 18을 참조하면, 커큐민 처리 시에 세포의 생존력 변화를 관찰할 때, 종래의 CCK-8 방법에 비해(도 18a 참조), 본 발명의 플랫폼을 사용하는 경우, 더 정확하게 암세포 스페로이드의 생존력 변화를 모니터링할 수 있었다(도 18b 참조).Referring to FIG. 18 , when observing the change in cell viability upon curcumin treatment, compared to the conventional CCK-8 method (see FIG. 18a ), when using the platform of the present invention, the change in viability of cancer cell spheroids more accurately could be monitored (see FIG. 18b ).

즉, 본 발명의 플랫폼은 암세포 스페로이드 크기 및 어레이 균일성으로 인해, 광학 현미경을 통해 각 스페로이드의 크기 변화를 효율적으로 관찰할 수 있어, 약물 스크리닝에 효과적으로 사용될 수 있다.That is, the platform of the present invention can efficiently observe the size change of each spheroid through an optical microscope due to cancer cell spheroid size and array uniformity, and can be effectively used for drug screening.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.Although the above has been described with reference to the preferred embodiments of the present invention, those skilled in the art can variously modify and change the present invention within the scope without departing from the spirit and scope of the present invention as set forth in the following claims. You will understand that you can.

Claims (20)

산화 그래핀이 코팅된 기판을 가습하는 단계;
반구형의 마이크로-웰이 하나 이상 형성된 플레이트를 가습된 기판 상에 가압하는 단계;
가압 후 형성된 복합체를 건조시키는 단계; 및
상기 복합체가 형성된 플레이트를 기판으로부터 제거하는 단계;를 포함하고,
상기 가압하는 단계는, 상기 마이크로-웰의 내측벽이 상기 기판과 접촉할 때까지 가압하여 유지하며,
상기 가압에 의해 산화 그래핀의 일부가 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착되는 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법.
humidifying the graphene oxide-coated substrate;
pressing the plate having one or more hemispherical micro-wells formed thereon on the humidified substrate;
drying the composite formed after pressing; and
Including; removing the plate on which the composite is formed from the substrate;
In the pressing step, the inner wall of the micro-well is pressed and maintained until in contact with the substrate,
Characterized in that a part of graphene oxide is attached to a part of the inner wall of the micro-well by the pressing,
A method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제1항에 있어서,
상기 기판은 유리, 폴리프로필렌, 알루미늄, 철, 금 및 스테인리스합금 중에서 선택된 재질로 이루어진 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법.
According to claim 1,
The substrate is characterized in that it is made of a material selected from glass, polypropylene, aluminum, iron, gold and stainless alloy,
A method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제1항에 있어서,
상기 플레이트는 PDMS, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸 메타크릴레이트 및 폴리우레탄 아크릴레이트 중에서 선택된 재질로 이루어진 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법.
According to claim 1,
wherein the plate is made of a material selected from PDMS, polyethylene glycol, polymethyl methacrylate and polyurethane acrylate,
A method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착된 산화 그래핀은 상기 반구형의 마이크로-웰의 내측벽을 따라 띠 형태를 이루는 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법.
According to claim 1,
Graphene oxide attached to a part of the inner wall of the micro-well is characterized in that it forms a band shape along the inner wall of the hemispherical micro-well,
A method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제1항에 있어서,
상기 건조는 50 내지 90℃ 의 온도로 수행하는 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법.
According to claim 1,
The drying is characterized in that it is carried out at a temperature of 50 to 90 ℃,
A method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제1항에 있어서,
상기 마이크로-웰의 직경은 100 내지 175 ㎛ 인 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법.
According to claim 1,
The micro-well has a diameter of 100 to 175 μm, characterized in that
A method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제1항에 있어서,
상기 마이크로-웰은 2차원 어레이(two-dimensional array) 구조를 갖는 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법.
The method of claim 1,
The micro-well is characterized in that it has a two-dimensional array structure,
A method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제1항에 있어서,
상기 산화 그래핀이 코팅된 기판은, 산화 그래핀 분산액을 기판 상에 스핀 코팅하여 형성된 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트 제조 방법.
According to claim 1,
The graphene oxide-coated substrate is characterized in that it is formed by spin-coating a graphene oxide dispersion on the substrate,
A method for manufacturing a micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제1항 내지 제3항, 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트.
[Claim 11] The micro-well plate on which graphene oxide prepared by the method according to any one of claims 1 to 3, 6 to 10 is vertically coated.
 반구형의 마이크로-웰이 하나 이상 형성된 마이크로-웰 플레이트에 있어서,
상기 마이크로-웰은 내측벽의 일부에 산화 그래핀이 부착된 구조를 가지며,
상기 마이크로-웰의 내측벽의 일부에 부착된 산화 그래핀은 상기 반구형의 마이크로-웰의 내측벽을 따라 띠 형태를 이루는 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트.
In the micro-well plate in which one or more hemispherical micro-wells are formed,
The micro-well has a structure in which graphene oxide is attached to a part of the inner wall,
Graphene oxide attached to a part of the inner wall of the micro-well is characterized in that it forms a band shape along the inner wall of the hemispherical micro-well,
Micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 삭제delete 제12항에 있어서,
상기 플레이트는 PDMS, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸 메타크릴레이트 및 폴리우레탄 아크릴레이트 중에서 선택된 재질로 이루어진 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트.
13. The method of claim 12,
wherein the plate is made of a material selected from PDMS, polyethylene glycol, polymethyl methacrylate and polyurethane acrylate,
Micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제12항에 있어서,
상기 마이크로-웰의 직경은 100 내지 175 ㎛ 인 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트.
13. The method of claim 12,
The micro-well has a diameter of 100 to 175 μm, characterized in that
Micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제12항에 있어서,
상기 마이크로-웰은 2차원 어레이(two-dimensional array) 구조를 갖는 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트.
13. The method of claim 12,
The micro-well is characterized in that it has a two-dimensional array structure,
Micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제16항에 있어서, 상기 마이크로-웰 플레이트는 3차원 세포 스페로이드 플랫폼 제조용인 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트.
The method according to claim 16, wherein the micro-well plate is for manufacturing a three-dimensional cell spheroid platform,
Micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제17항에 있어서,
상기 세포는 간암 세포, 전립선암 세포, 자궁경부암 세포, 교모세포종 세포, 위암 세포, 혈액암 세포, 대장암 세포, 방광암 세포, 고환암 세포, 난소암 세포, 유방암 세포, 식도암 세포, 구강암 세포, 폐암 세포, 중피종 세포, 신경아세포종 세포, 췌장암 세포, 후두암 세포 및 피부암 세포 중에서 선택된 암세포, 또는 신경줄기세포, 중간엽줄기세포, 조혈모세포, 간세포, 혈관세포, 근세포, 폐포세포, 신장세포 및 상피세포 중에서 선택된 면역세포를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는,
산화 그래핀이 수직 코팅된 마이크로-웰 플레이트.
18. The method of claim 17,
The cells are liver cancer cells, prostate cancer cells, cervical cancer cells, glioblastoma cells, gastric cancer cells, hematological cancer cells, colorectal cancer cells, bladder cancer cells, testicular cancer cells, ovarian cancer cells, breast cancer cells, esophageal cancer cells, oral cancer cells, lung cancer cells , mesothelioma cells, neuroblastoma cells, pancreatic cancer cells, laryngeal cancer cells, and skin cancer cells; characterized in that it contains one or more cells,
Micro-well plate vertically coated with graphene oxide.
 제18항에 따른 마이크로-웰 플레이트에 형성된 복수 개의 마이크로-웰에 암세포를 분주하여, 3차원 스페로이드(spheroid) 형태로 배양하는 단계;
상기 마이크로-웰 내에 후보 약물을 투여하는 단계; 및
3차원 세포 스페로이드의 크기 변화를 측정하는 단계;를 포함하는,
암 치료용 약물 스크리닝 방법.
A method comprising: dispensing cancer cells into a plurality of micro-wells formed in the micro-well plate according to claim 18 and culturing in a three-dimensional spheroid form;
administering a candidate drug into the micro-well; and
Including; measuring the size change of the three-dimensional cell spheroid
A method of screening a drug for the treatment of cancer.
 제19항에 있어서,
상기 배양하는 단계에서, 배양 시간이 60 시간을 경과하는 경우에는, 상기 마이크로-웰을 플립 오버(flip over)시키는 것을 특징으로 하는,
암 치료용 약물 스크리닝 방법.20. The method of claim 19,
In the culturing step, when the incubation time exceeds 60 hours, the micro-well is flip over (flip over),
A method of screening a drug for the treatment of cancer.
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KR20190041652A (en) * 2017-10-13 2019-04-23 서울대학교산학협력단 Substrate for culturing cells

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Dongare 등. A facile process for soak-and-peel delamination of CVD graphene from substrate using water. Article in Scientific Reports. 2014.1. 1부.*
Jeon 등. A facile and fast transfer of ultrathin graphene oxide film on various substrates. Journal of Physics D:Applied Physics. 2019, 52, 455301 1부.*

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