KR102347899B1 - Urinary exosome-derived biomarkers for diagnosis or prognosis of BK virus-associated nephropathy in kidney allografts - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비침습적인 BK 바이러스 신병증 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 키트, 상기 마커 조성물을 이용하여 신장이식 후 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 신장이식 후 BK 바이러스 신병증의 치료방침 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker for diagnosing non-invasive BK virus nephropathy and its use, specifically, any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L or a gene encoding the same. Biomarker composition and kit for diagnosing or predicting post-BK viral nephropathy, a method for providing information necessary for diagnosing or predicting prognosis of BK viral nephropathy after kidney transplantation using the marker composition, and treatment of BK viral nephropathy after kidney transplantation It's about providing the information you need to make policy decisions.
Description
본 발명은 신장이식 후 BK 바이러스 신병증(BK virus-associated nephropathy, BKVN)과 관련된 바이오마커, 신장 이식 후 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트 및 이를 이용하여 BK 바이러스 신병증의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker related to BK virus-associated nephropathy (BKVN) after kidney transplantation, a composition and kit for diagnosing or predicting BK virus nephropathy after kidney transplantation, and a kit for diagnosing or using the same for BK virus nephropathy It relates to a method of providing information for prognosis prediction.
장기이식 분야는 서서히 정밀 의료의 일부가 되고 있다. 현재의 표준 면역 억제 치료를 사용할 때 여전히 신장 이식을 받은 환자의 15 ~ 20%에서 급성 거부 반응이 발생하며, 현재까지는 혈청 크레아틴의 농도 증가 또는 새로운 단백뇨의 발현 등이 생길 경우 조직 생검을 통해 진단된다. 혈청 크레아틴 농도 증가 또는 새로운 단백뇨 발현이 있는 시점에서의 신장 상태는 이미 염증이 꽤 진행된 상태이기 때문에, 무증상의 거부반응(subclinical acute rejection)을 조기 발견할 수 있는 바이오마커의 필요성이 대두된다. 선천적/후천적 면역 반응은 조직학적 수준에서 나타나기 전에 분자 수준에서 먼저 나타난다고 알려져 있다. 따라서 신장이식 후에 임상적 상태를 미리 진단하고 모니터링하기 위한 비침습적 바이오마커의 개발은 정밀 의료에 필수적인 단계이다.The organ transplant field is slowly becoming a part of precision medicine. Acute rejection still occurs in 15 to 20% of kidney transplant recipients when using current standard immunosuppressive therapy, and to date, an increase in serum creatine levels or the development of new proteinuria is diagnosed by tissue biopsy. . Since the kidney status at the time of increased serum creatine concentration or new expression of proteinuria is already quite advanced in inflammation, there is a need for a biomarker capable of early detection of subclinical acute rejection. It is known that innate/acquired immune responses appear first at the molecular level before appearing at the histological level. Therefore, the development of non-invasive biomarkers for diagnosing and monitoring clinical status in advance after kidney transplantation is an essential step for precision medicine.
BK 바이러스(BKV)는 파포바바이러스(papovavirus)에 속하는 바이러스로서, 원숭이의 파포바바이러스인 SV40과 형태적으로 유사하며, 유전체의 유전자구성은 SV40과 동일하다. BK 바이러스는 면역이상이 있는 환자에서 주로 분리되는데, 질환과의 관련성은 분명하지 않다. 그러나, 혈청역학적조사에 따르면 BK 바이러스는 세계각국에서 광범위하게 침음하고 있다고 한다. 특히, 신장이식환자에서는 신병증(nephropathy) 및 출혈성 방광염(hemorrhagic cystitis)을 야기하는 주요 원인인데, BK 바이러스성 신병증(BKVN)은 이식된 신장의 기능 약화 및 이식 실패를 야기한다(Pakfetrat M. et al., Int J Organ Transplant Med 2015; 6: 77-84). 신장이식환자에서 BK 바이러스의 감염 비율은 1 내지 10% 사이이며, 이식 결손 빈도는 10 내지 80%로 알려져 있다. 이에, 초기 치료를 위한 BKV 감염의 적절하고 정확한 진단이 매우 중요한 실정이다. BK virus (BKV) is a virus belonging to the papovavirus (papovavirus), morphologically similar to SV40, a monkey papovavirus, and the genetic composition of the genome is the same as that of SV40. BK virus is mainly isolated from immunocompromised patients, but the relevance to the disease is not clear. However, according to serological epidemiologic investigations, the BK virus is widely invaded around the world. In particular, in kidney transplant patients, it is a major cause of nephropathy and hemorrhagic cystitis. BK viral nephropathy (BKVN) causes weakening of the transplanted kidney and transplant failure (Pakfetrat M. et al., Int J Organ Transplant Med 2015; 6: 77-84). It is known that the rate of infection with BK virus in kidney transplant patients is between 1 and 10%, and the frequency of transplantation defects is between 10 and 80%. Accordingly, an appropriate and accurate diagnosis of BKV infection for initial treatment is very important.
BK 바이러스 신병증의 진단과 관련하여 소변 엑소좀 miRNA 마커가 알려져 있다(KIM et al., Urinary exosomal viral microRNA as a marker of BK virus nephropathy in kidney transplant recipients. FLoS One.2017). 그러나, 신장이식 후 합병증인 BK 바이러스 신병증과 이식거부반응을 구별하여 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하고 이를 신장이식 후 치료 방향의 선택 및 치료 경과 판단에 활용하고자 하는 연구는 전무하다. 이에, 신장이식 후 거부반응과 이식 후 합병증 진단의 예측력을 높일 수 있는 적절한 마커를 발굴하는 것이 절실한 실정이다.Urinary exosomal miRNA markers are known for diagnosis of BK virus nephropathy (KIM et al., Urinary exosomal viral microRNA as a marker of BK virus nephropathy in kidney transplant recipients. FLoS One. 2017). However, there are no studies that attempt to discover biomarkers that can differentiate and diagnose BK virus nephropathy and transplant rejection, which are complications after kidney transplantation, and use them to select a treatment direction and determine the course of treatment after kidney transplantation. Accordingly, there is an urgent need to discover appropriate markers that can increase the predictive power of diagnosis of post-transplant rejection and post-transplant complications.
본 발명자들은 비-침습적이고 정확한 BK 바이러스 신병증 진단 마커 또는 신장이식 후 예후 예측 마커를 발굴하기 위해 예의 노력한 결과, 프로테오믹스 접근법을 통해 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 구별 할 수 있는 새로운 바이오마커를 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.As a result of earnest efforts to discover non-invasive and accurate BK viral nephropathy diagnostic markers or prognostic markers after kidney transplantation, the present inventors have made new biomarkers that can differentiate kidney transplant rejection from BK viral nephropathy through a proteomics approach. By elucidating the present invention was completed.
본 발명에서는 정상 대조군(NOMOA), 항체 매개성 거부반응군(ABMR), T 세포 매개성 거부반응군(TCMR) 및 BK 바이러스 감염성 신병증군(BKVN)의 소변 엑소좀 내 신장이식 거부반응 또는 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측 표지자를 발굴함으로써 신장이식 후 치료 경과를 판단하고 치료 방법을 선택하는데 기여하고자 한다.In the present invention, kidney transplant rejection or BK virus in urine exosomes of normal control group (NOMOA), antibody-mediated rejection group (ABMR), T cell-mediated rejection group (TCMR) and BK virus infectious nephropathy group (BKVN) By discovering markers for diagnosing nephropathy or predicting prognosis, we intend to contribute to judging the course of treatment after kidney transplantation and selecting a treatment method.
일 양태로, 본 발명은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, BK 바이러스 신병증 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing BK virus nephropathy, comprising any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L or a gene encoding the same.
또한, 본 발명은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 신장이식 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a biomarker composition for predicting kidney transplant prognosis, comprising any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L or a gene encoding the same.
다른 양태로서, 본 발명은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 신장이식 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a biomarker composition for predicting kidney transplant prognosis, comprising any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L or a gene encoding the same.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 신장이식 후 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for diagnosing or predicting prognosis of BK virus nephropathy after kidney transplantation comprising the composition.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 얻은 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention comprises measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L in a sample obtained from an individual or a gene encoding the same. Provided is a method for providing information necessary for diagnosing post-BK viral nephropathy or predicting the prognosis.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 신병증의 치료방침 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention includes measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L in a sample isolated from an individual or a gene encoding the same. Kidney To provide a method for providing information necessary for determining a treatment policy for BK viral nephropathy after transplantation.
또 다른 양태로서, 본 발명은 인간을 제외한 포유동물에 BK 바이러스 신병증 치료제 후보물질을 투여한 후, 소변 내 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, BK 바이러스 신병증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L in urine or a gene encoding the same after administration of a candidate substance for treatment of BK virus nephropathy to mammals other than humans It provides a screening method for a therapeutic agent for BK virus nephropathy, comprising the step of measuring the expression level of mRNA.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 실시예에서는, 신장이식 환자 및 기증자의 소변 샘플에서 특정 엑소좀 단백질의 발견을 위해, 프로테오믹스 분석을 기반으로 후보 단백질을 선택했다. 소변 엑소좀 단백질 정량 분석에서 총 1820개의 단백질이 검출되었고, 이중 "NOMOA군 및 DONOR군"과 "BKVN군" 간에 발현 프로파일이 현저하게 차이가 나는 단백질 14종을 선택했다. 마지막으로, 14종 단백질 중 "ABMR군 또는 TCMR군"과 BKVN군 사이에 유의적으로 서로 다른 발현 양상을 나타내는 4개의 단백질을 확인하였다. 확인된 단백질은 하기 [표 2]에 나타낸 바와 같이 HNRNPA1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, UNIPROT Accession No.P09651), MAT2B(Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta, UNIPROT Accession No.Q9NZL9), RPS10(40S ribosomal protein S10, UNIPROT Accession No.P46783) 및 CSE1L(Exportin-2, UNIPROT Accession No.Q9NZL9)였다.In one embodiment of the present invention, for the discovery of specific exosome proteins in urine samples of kidney transplant patients and donors, candidate proteins were selected based on proteomics analysis. A total of 1820 proteins were detected in urine exosome protein quantitative analysis, and 14 proteins with significantly different expression profiles between the "NOMOA group and DONOR group" and "BKVN group" were selected. Finally, four proteins showing significantly different expression patterns between the "ABMR group or TCMR group" and the BKVN group among 14 proteins were identified. The identified proteins are as shown in Table 2 below, HNRNPA1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, UNIPROT Accession No. P09651), MAT2B (
이에, 본 발명에서는 신장이식 후 불량한 예후에 관여하는 선별된 바이오마커, 즉, HNRNPA1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1), MAT2B(Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta), RPS10(40S ribosomal protein S10) 및 CSE1L(Exportin-2)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다. 이를 이용하여 신장이식 후 환자의 예후를 예측하고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 환자 맞춤형 치료방법의 제공이 가능하고, 불량한 예후의 신장이식 환자의 사망률을 감소시킬 수 있다.Accordingly, in the present invention, selected biomarkers involved in poor prognosis after kidney transplantation, that is, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (HNRNPA1),
본 발명에서 용어 "BK 바이러스 신병증"(BK virus-associated nephropathy; BKVN)은 BK 바이러스에 의해 야기되는 신장병을 의미하며, BK 바이러스 신장병 또는 신장병증 등으로 불린다. 신병증은 신장에 병변이 생긴 상태를 의미하는데, 질환의 단위가 확립되지 않거나 병변이 분류불능인 경우를 모두 총칭한다. 주로, 신장이식 환자에서 면역억제제 투여에 의한 합병증으로 발병되며, BK 바이러스는 이식선의 상피 세포를 침범하여 염증을 일으키고, 결국 이식된 신장의 기능 저하를 야기한다. 본 명세서에서, 상기 BK 바이러스 신병증은 'BKVN'과 혼용되어 명명될 수 있다.In the present invention, the term "BK virus-associated nephropathy" (BKVN) refers to a kidney disease caused by a BK virus, and is also called BK virus nephropathy or nephropathy. Nephropathy refers to a condition in which a lesion occurs in the kidney, and refers to all cases in which the unit of disease is not established or the lesion is unclassifiable. Mainly, it develops as a complication due to administration of immunosuppressive agents in kidney transplant patients, and the BK virus invades the epithelial cells of the transplantation gland, causing inflammation, and eventually causes deterioration of the transplanted kidney. In the present specification, the BK virus nephropathy may be named interchangeably with 'BKVN'.
본 발명에서 용어 "신장이식의 거부반응(renal allograft rejection)"은 공여자의 신장을 이식받은 수여자의 면역 체계가 이식신장을 외부 항원으로 인식하여 일어나는 일련의 면역 반응을 의미하며, 발생기전과 신생검 소견에 따라 항체-매개성 거부반응(Antibody mediated rejection, ABMR), T 세포 매개성 거부반응(T cell mediated rejection, TCMR), 및 이들 모두가 복합적으로 나타나는 혼합 거부반응(mixed rejection)으로 분류될 수 있다.As used herein, the term "renal allograft rejection" refers to a series of immune responses that occur when the recipient's immune system recognizes the transplanted kidney as a foreign antigen. Depending on the findings, antibody-mediated rejection (ABMR), T cell mediated rejection (TCMR), and all of these can be classified into mixed rejection. have.
본 발명에서 상기 신장이식의 거부반응은 항체 매개성 거부반응, T 세포 매개성 거부반응 및 혼합 거부반응을 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 급성 T 세포 매개 거부 반응(Acute T cell mediated rejection, TCMR), 급성 항체-매개 거부반응(acute antibody mediated rejection), 만성 활성형 항체-매개 거부반응(chronic active antibody mediated rejection) 및 혼합 거부반응(mixed rejection)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.In the present invention, the rejection of the kidney transplant may include all of antibody-mediated rejection, T-cell-mediated rejection, and mixed rejection, and preferably, acute T-cell mediated rejection (TCMR). ), acute antibody-mediated rejection, chronic active antibody-mediated rejection, and mixed rejection.
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 마커는 신장이식 후 bK 바이러스 신병증이 발병하였는지 확인할 수 있는 유전자 또는 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 유전자를 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터(예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.As used herein, the term "biomarker" refers to a molecule that is quantitatively or qualitatively related to the presence of a biological phenomenon, and the marker of the present invention is a gene that can confirm whether bK virus nephropathy has developed after kidney transplantation, or has a good or poor prognosis. Refers to the gene that is the basis for predicting the patient. A marker may be derived from a genomic nucleotide sequence or from an expressed nucleotide sequence (eg, from RNA, nRNA, mRNA, cDNA, etc.), or from an encoded polypeptide. The term includes nucleic acids used as pairs of probes or primers capable of amplifying a nucleic acid sequence complementary to or flanking a marker sequence, such as a marker sequence.
본 발명의 일실시예에 따르면, 신장이식 환자들 중에서 조직검사 상 주요한 이상소견이 없는 정상 대조군(no major abnormality, NOMOA)과 비교하여 BK 바이러스 신병증(BKVN)을 나타내는 환자의 소변에서 상기 바이오마커들이 특이적으로 발현하였음을 확인함으로써 상기 바이오마커들이 BK 바이러스 신병증의 진단마커로서 활용될 수 있음을 알 수 있었다.According to an embodiment of the present invention, among kidney transplant patients, the biomarker in the urine of a patient exhibiting BK virus nephropathy (BKVN) compared to a normal control (no major abnormality, NOMOA) without major abnormalities on histological examination. By confirming that they were specifically expressed, it was found that the biomarkers can be utilized as diagnostic markers for BK virus nephropathy.
본 발명에서 상기 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA를 의미한다.In the present invention, the 'expression' means that a protein or nucleic acid is produced in a cell. 'Protein' is used interchangeably with 'polypeptide' or 'peptide' and refers to, for example, a polymer of amino acid residues as commonly found in proteins in their natural state. 'Polynucleotide' or 'nucleic acid' refers to deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) in single- or double-stranded form. Unless otherwise limited, known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner analogous to naturally occurring nucleotides are also included. 'mRNA' refers to RNA that transfers genetic information (gene-specific base sequence) to the ribosome, which specifies the amino acid sequence from a specific gene during protein synthesis.
본 발명에 있어서, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하여 BK 바이러스 신병증의 병리 존재 또는 발생 여부를 확인하는 것이다.In the present invention, 'diagnosis' means confirming the presence or characteristics of a pathological condition. Diagnosis in the present invention is to measure the level of any one or more proteins or mRNAs selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L to confirm the presence or occurrence of pathology of BK virus nephropathy.
본 발명에 있어서, "예후 예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 신장을 이식받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 이식거부반응, 약 저항성, 합병증 발생)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.In the present invention, "prediction of prognosis" means to guess in advance for medical reasons, and for the purpose of the present invention, the course of disease (progression, improvement, transplant rejection, drug resistance, It means predicting the occurrence of complications in advance.
본 발명은 또한, 본 발명의 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 신장이식 후 BK 바이러스 신병증의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for diagnosing or predicting prognosis of BK virus nephropathy after kidney transplantation, comprising a substance for measuring the expression level of mRNA or protein thereof of the biomarker of the present invention.
본 발명의 진단 또는 예후 예측용 조성물이 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 때에는 mRNA 발현 수준을 측정하는 물질은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트 일 수 있다.When the composition for diagnosis or prognosis of the present invention is for measuring the mRNA expression level, the material for measuring the mRNA expression level is HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L Any one or more genes or mRNA specific It may be a probe or primer set that binds to
본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 신장이식의 거부반응을 진단 또는 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.In the present invention, a "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template, and serves as a starting point for copying the template. It refers to a short nucleic acid sequence that functions. In the present invention, PCR amplification is performed using the sense and antisense primers of the marker polynucleotide of the present invention, and the rejection of kidney transplantation can be diagnosed or the prognosis can be predicted based on whether a desired product is produced. PCR conditions, the length of the sense and antisense primers can be modified based on what is known in the art.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 신장이식의 거부반응을 진단 또는 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.As used herein, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to several bases to several hundred bases in length that can form specific binding to mRNA, and is labeled The presence or absence of specific mRNA can be checked. The probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like. In the present invention, hybridization is carried out using a probe complementary to the marker polynucleotide of the present invention, and the diagnosis or prognosis of kidney transplant rejection can be predicted through hybridization. Selection of appropriate probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using a number of means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologues of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoros. amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (eg phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
한편, 본 발명에서 상기 바이오마커의 단백질 발현 수준을 측정하는 물질은 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.Meanwhile, in the present invention, the substance for measuring the protein expression level of the biomarker may be an antibody that specifically binds to any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L.
상기 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 신장이식 후 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.The "antibody" is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to a marker of the present invention, and such an antibody is obtained by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the marker gene , can be prepared by a conventional method from the obtained protein. This also includes a partial peptide that can be made from the protein, and the partial peptide of the present invention contains at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and any part thereof is included in the antibody of the present invention as long as it has polyclonal antibody, monoclonal antibody, or antigen-binding property, and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibody of the present invention includes a special antibody such as a humanized antibody. The antibody against the protein encoded by the biomarker gene of the present invention may be any antibody that can be prepared by methods known in the art. For example, the antibody used for diagnosing BK virus nephropathy after kidney transplantation of the present invention or detecting a prognostic marker of the present invention is not only in a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains, but also functional functionalities of the antibody molecule. It may contain fragments. The functional fragment of the antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and may be Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, etc., but is not particularly limited thereto.
다른 측면에서, 본 발명은 상술한 신장이식 후 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 신장이식 후 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for diagnosing or predicting BK viral nephropathy after kidney transplantation, comprising the composition for diagnosing or predicting the prognosis of BK virus nephropathy after kidney transplantation.
본 발명의 키트에는 상기 4종 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.The kit of the present invention may include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method as well as the primers and probes for recognizing the antibody or mRNA recognizing the above four proteins as markers as markers.
구체적인 양태로서 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.In a specific embodiment, the kit may be a diagnostic kit comprising essential elements necessary for performing a reverse transcription polymerase reaction. The reverse transcription polymerase reaction kit includes each primer pair specific for a marker gene. The primer is a nucleotide having a sequence specific to the nucleic acid sequence of each marker gene, and has a length of about 7 bp to 50 bp, more preferably about 10 bp to 30 bp. It may also include a primer specific for the nucleic acid sequence of the control gene. Other reverse transcription polymerase reaction kits include test tubes or other suitable containers, reaction buffers (with varying pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC -Water (DEPC-water), sterile water, etc. may be included.
또 다른 양태로는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.In another aspect, it may be a diagnostic kit comprising essential elements necessary for performing a DNA chip. The DNA chip kit may include a substrate to which cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or fragment thereof is attached, and reagents, agents, enzymes, etc. for preparing a fluorescently labeled probe. The substrate may also contain cDNA or oligonucleotides corresponding to control genes or fragments thereof.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체로부터 얻은 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 후 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention comprises measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L in a sample obtained from an individual or a gene encoding the same. Provided is a method for providing information necessary for diagnosing post-BK viral nephropathy or predicting the prognosis.
본 발명에서, "개체"는 BK 바이러스 신병증이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.In the present invention, "individual" may include, without limitation, mammals, farmed fish, etc. including rats, livestock, humans, etc. that are likely to develop or have developed BK virus nephropathy.
본 발명에서, 분석을 위해 사용되는 "시료"는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 복수, 질 분비물, 소변, 대변 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 BK 바이러스 신병증 특이적 단백질을 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변일 수 있으며, 가장 바람직하게는 소변일 수 있다. 상기 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.In the present invention, the "sample" used for analysis is blood, plasma, serum, saliva, nasal fluid, sputum, ascites, vaginal secretion, urine, feces, etc. BK virus nephropathy-specific protein that can be identified from the normal state. including biological samples that can be Preferably, it may be a biological liquid sample, such as blood, serum, plasma or urine, and most preferably urine. The sample may be prepared to increase the detection sensitivity of the protein marker. For example, a sample obtained from a patient may be subjected to anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography, continuous It may be pre-treated using a method such as sequential extraction or gel electrophoresis.
본 발명에서, 상기 "단백질의 발현수준 측정"은 BK 바이러스 신병증을 진단하거나 신장이식 후 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 존재여부를 검출하거나 단백질의 양을 측정할 수 있다. 단백질에 특이적인 항체는 본 발명의 진단 또는 예후 예측용 조성물에 서술한 바와 같다. 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩(chip) 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the "measurement of the expression level of the protein" is a process of confirming the presence and expression level of a protein expressed in a marker gene in a biological sample in order to diagnose BK virus nephropathy or predict the prognosis after kidney transplantation. By using an antibody that specifically binds to a protein, the presence or absence of the protein can be detected or the amount of the protein can be measured. Antibodies specific to the protein are as described in the composition for diagnosis or prognosis of the present invention. Methods for measuring the expression level of proteins can be used without limitation, methods known in the art, for example, western blotting (western blotting), dot blotting (dot blotting), enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme-linked immunosorbent assay) , ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, ochteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation, complement fixation assay, flow cytometry (FACS) or protein There is a chip method and the like, but is not limited thereto.
본 발명에서, 상기 "mRNA의 발현수준 측정"은 BK 바이러스 신병증을 진단하거나 신장이식 후 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 DNA 칩(DNA chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the "measuring the expression level of mRNA" is a process of confirming the presence and expression level of mRNA of a marker gene in a biological sample in order to diagnose BK virus nephropathy or predict the prognosis after kidney transplantation. It can be known by measuring. Analysis methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR (RT-PCR), real-time RTPCR (RT-PCR), RNase protection method, northern blotting, or DNA There is a chip (DNA chip technology), but is not limited thereto.
본 발명의 상기 방법은 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 또는 mRNA 발현 수준과 비교한 결과가 하기 a) 내지 d) 중 어느 하나에 해당하는 경우 BK 바이러스 신병증이 발병한 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In the method of the present invention, when the result of comparing the measured protein or mRNA expression level with the protein or mRNA expression level of a normal control sample corresponds to any one of a) to d) below, it is determined that BK virus nephropathy has occurred. It may further include the step of determining.
a) HNRNPA1의 상향 조절; a) upregulation of HNRNPA1;
b) MAT2B의 상향 조절;b) upregulation of MAT2B;
c) RPS10의 상향 조절;c) upregulation of RPS10;
d) CSE1L의 상향 조절.d) Upregulation of CSE1L.
상기 정상 대조군이란 BK 바이러스 신병증에 걸리지 않았거나, 신장이식을 받지 않은 정상인 또는 신장이식을 받았지만 안정적인 신장 기능이 발휘되며 BK 바이러스 신병증이 발병하지 않은 상태의 신장이식 환자 또는 항체 매개성 거부반응, T 세포 매개성 거부반응 또는 혼합 거부반응이 나타나지 않은 상태의 신장이식 환자 등이며, 이들 환자로부터 채취한 시료와 BK 바이러스 신병증이 발병한 환자 또는 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 유전자 발현수준 또는 발현패턴을 수득하고, 비교함으로써 예후를 알고자 하는 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.The normal control group is a normal person who does not have BK virus nephropathy, a normal person who has not received a kidney transplant, or a kidney transplant patient who has undergone a kidney transplant but has stable kidney function and does not develop BK virus nephropathy or antibody-mediated rejection; Kidney transplant patients without T cell-mediated rejection or mixed rejection, and gene expression in samples collected from these patients, patients with BK virus nephropathy, or patients who want to know the prognosis By obtaining and comparing the level or expression pattern, it is possible to accurately predict the prognosis of a patient whose prognosis is to be known.
따라서, 본 발명에 의하면 BK 바이러스 신병증 진단 및 신장이식 후 예후를 정확하게 진단 또는 예측할 수 있고, 진단 또는 예측된 예후에 따라 적절한 치료 계획을 세울 수 있는 이점을 얻을 수 있다.Therefore, according to the present invention, the prognosis after diagnosis of BK virus nephropathy and kidney transplantation can be accurately diagnosed or predicted, and an appropriate treatment plan can be established according to the diagnosis or predicted prognosis.
이에, 본 발명은 또한, 개체로부터 분리한 시료에서 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, BK 바이러스 신병증의 치료방침 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention also includes measuring the mRNA expression level of any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10 and CSE1L in a sample isolated from an individual or a gene encoding the same, BK virus It provides a method for providing information necessary for determining a treatment policy for nephropathy.
또 다른 측면에서 본 발명은 인간을 제외한 포유동물에 BK 바이러스 신병증 치료제 후보물질을 투여한 후, 소변 내 HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, BK 바이러스 신병증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention relates to any one or more proteins selected from the group consisting of HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L in urine or a gene encoding the same after administration of a candidate for the treatment of BK virus nephropathy to mammals other than humans It provides a screening method for a therapeutic agent for BK virus nephropathy, comprising the step of measuring the expression level of mRNA.
구체적으로, BK 바이러스 신병증 치료 후보 물질의 존재 및 부존재 하에서 마커의 mRNA 또는 단백질 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 BK 바이러스 신병증 치료제를 스크리닝 하는데 유용하게 사용할 수 있다. 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 간접적으로 또는 직접적으로 증가 또는 감소시키는 물질은 BK 바이러스 신병증 치료제로서 선택할 수 있다.Specifically, it is a method of comparing the increase or decrease in mRNA or protein expression of markers in the presence and absence of a candidate for treatment of BK virus nephropathy, which can be usefully used in screening for therapeutic agents for BK viral nephropathy. Substances that indirectly or directly increase or decrease the expression level of mRNA or protein of a marker can be selected as a therapeutic agent for BK virus nephropathy.
즉, BK 바이러스 신병증 치료 후보 물질의 부존재 하에 인간을 제외한 포유동물로부터 수득한 생물학적 시료에서 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 또한 BK 바이러스 신병증 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, BK 바이러스 신병증 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 증가 또는 감소시키는 물질을 BK 바이러스 신병증 치료제로 선택할 수 있는 것이다.That is, the expression level of the marker of the present invention is measured in a biological sample obtained from a mammal other than a human in the absence of a candidate for treatment of BK virus nephropathy, and the expression level of the marker of the present invention is measured in the presence of a candidate for treatment of BK virus nephropathy. After comparing the two by measuring the expression level, a substance that increases or decreases the expression level of the marker of the present invention in the presence of a candidate substance for treatment of BK virus nephropathy compared to the expression level of the marker in the absence It can be selected as a therapeutic agent for BK virus nephropathy there will be
본 발명에서 제공하는 바이오마커는 BK 바이러스 신병증을 나타내는 환자에서 현저하게 발현이 증가하므로, 본 발명의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 본 발명의 진단용 조성물, 키트 또는 검출 방법을 통해 BK 바이러스 신병증 발병여부 또는 신장이식 후 예후를 정확하고 신속하게 진단 또는 예측 할 수 있다.Since the expression of the biomarker provided in the present invention is remarkably increased in patients with BK virus nephropathy, the diagnostic composition, kit or detection method of the present invention comprising a substance for measuring the expression level of the biomarker of the present invention. It can accurately and quickly diagnose or predict the onset of BK virus nephropathy or the prognosis after kidney transplantation.
또한, 본 발명의 바이오마커는 이식거부반응 또는 이식 후 흔히 나타나는 합병증 중 하나인 BK 바이러스 신병증 환자에서 차별적으로 발현되므로, 신장이식 거부반응과 BK 바이러스 신병증을 정확하고 신속하게 구별하여 파악할 수 있으며, 이후 치료방침을 결정하는 데 필요한 정보를 제공할 수 있다.In addition, since the biomarker of the present invention is differentially expressed in patients with BK virus nephropathy, which is one of the common complications after transplantation or transplantation rejection, it is possible to accurately and quickly distinguish between kidney transplant rejection and BK virus nephropathy. , it can provide information necessary to make a subsequent treatment policy decision.
도 1은 ABMR, TCMR 및 BKVN 군을 대표하는 바이오마커의 선발 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 t-테스트 결과와 볼케이노 플롯 결과 교차 부위에 존재하는 총 14개 단백질을 BKVN의 바이오마커 후보 물질로 선발한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 t-테스트를 사용하여 정상 대조군(NOMOA) 및 공여자군(DONOR)과 비교하여 항체 매개성 거부반응군(ABMR), T세포 매개성 거부반응군(TCMR) 및 BK 바이러스 감염성 신병증군(BKVN)에서 각각 63개, 108개 및 53개의 소변 엑소좀 단백질이 다른 군과 유의적으로 상이하게 발현되는 것을 확인한 결과를 벤다이어그램으로 나타낸 것이다.
도 4는 BKVN 바이오마커 후보 물질 중 ABMR군 및 TCMR군 단백질과 비교하여 현저하게 발현 양상이 차이가 나는 단백질 4종을 최종 선정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 선정한 BK 바이러스 신병증 마커 4종의 발현량을 분석하여 ROC 곡선 분석을 수행한 결과이다.1 is a diagram showing the selection process of biomarkers representing the ABMR, TCMR and BKVN groups.
2 is a view showing the results of selecting a total of 14 proteins present at the intersection site as a biomarker candidate for BKVN as a result of a t-test and a volcano plot.
3 shows the antibody-mediated rejection group (ABMR), T-cell-mediated rejection group (TCMR) and BK virus-infectious nephropathy group ( BKVN), respectively, 63, 108, and 53 urine exosomal proteins are shown as a Venn diagram showing the results of confirming that they are expressed significantly differently from other groups.
4 is a diagram showing the final selection results of four proteins having significantly different expression patterns compared to the ABMR group and TCMR group proteins among BKVN biomarker candidates.
5 is a result of performing ROC curve analysis by analyzing the expression levels of four BK virus nephropathy markers selected in Examples of the present invention.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples.
<실험방법><Experiment method>
환자의 선발 및 소변 시료의 준비Selection of patients and preparation of urine samples
BK 바이러스 신병증을 진단하기 위한 바이오마커를 발굴하기 위하여, 신장이식 후 5년 이내 징후 생검 (indication biopsy)을 시행받은 환자 및 기증자를 포함하여 전체 60명을 대상으로 생검 2~3 시간 전에 소변 시료를 수집하였다. 또한 생체 신장 기증자로부터 신장 기증수술 직전에 소변 시료를 수집하였다. 환자들은 생검의 병리학적인 진단에 따라 5 군으로 분류되었다; BK 바이러스 신병증 (BKVN) 군 12개, T 세포 매개성 거부반응 (TCMR) 군 8개, BK 바이러스 신병증 (BKVN) 군 5개, 주요 이상이 없는 (NOMOA) 군 11개, 및 기증자 (DONOR) 군 24개. 혼합된 동종 이병성 병변을 가진 환자의 소변은 제외하였다. 이 연구는 아산 병원 의료기관 평가위원회의 승인을 받아 진행하였으며, 모든 환자에게서 서면 동의를 받았다.To discover biomarkers for diagnosing BK virus nephropathy, a
소변 시료의 가공 및 엑소좀의 분리Processing of urine samples and isolation of exosomes
준비된 소변 시료로부터 이전에 보고된 Pisitkun et al. (2004) 및 Alvarez et al. (2012)의 방법을 약간 수정하여 계단식 초 원심 분리(step-wise ultracentrifugation) 방법으로 엑소좀을 분리하였다. 구체적으로, 각 실험 참가자로부터 30 mL 이상의 소변 시료를 수집하였으며, 각각의 소변 시료에 400 μl 프로테아제 저해제 혼합물 [50 μM 4-(2-animoethyl) benzensulfonyl fluoride hydrolchloride(AEBSF-HCl, 시그마 알드리치), 2 μM Leupeptin-hemisulfate(시그마 알드리치), 및 3.3 mM Sodium azide(시그마 알드리치)]를 첨가하였다. 전 세포(whole cell), 거대 막 입자(large membrane particles), 및 다른 잔해를 포함하는 요침전물(urinary sediments)을 제거하기 위하여, 소변 시료를 4,000 rpm, 4
그 후, 냉동된 소변 샘플을 각각 15 mL 만큼 해동시키고 1분 동안 볼텍싱 한 다음 상온에서 15분 동안 17,000xg에서 원심 분리하고 상층액 (SN1)을 수집하였다. SN1은 Beckman Coulter Optima L-80xp 초 원심 분리기, 로터 SW40Ti (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 실온에서 70 분 동안 200,000xg에서 초 원심 분리시켰다. 상청액을 버리고 펠렛을 11 mL의 DPBS에 용해시켜 세척한 다음 실온에서 70분 동안 200,000xg에서 다시 초 원심 분리시켰다. 상청액을 버리고 엑소좀 펠릿을 단백질 분리 또는 엑소좀 입자 정량화에 사용하였다.Thereafter, the frozen urine samples were thawed by 15 mL each, vortexed for 1 minute, centrifuged at 17,000xg for 15 minutes at room temperature, and the supernatant (SN1) was collected. SN1 was ultracentrifuged at 200,000 x g for 70 min at room temperature using a Beckman Coulter Optima L-80xp ultracentrifuge, rotor SW40Ti (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). The supernatant was discarded, the pellet was washed by dissolving in 11 mL of DPBS, and then ultracentrifuged again at 200,000 x g for 70 min at room temperature. The supernatant was discarded and the exosome pellet was used for protein isolation or exosome particle quantification.
LC-MS 분석 및 단백질 확인LC-MS analysis and protein identification
프로테오믹스 분석을 위한 샘플 준비는 동결 건조, 단백질 가용화 및 소화를 거쳤다. 생성된 펩타이드 혼합물을 탈염시키고 C18 역상 크로마토그래피를 사용하여 건조시킨 다음 나노-유동 액체 크로마토그래피(nano-flow liquid chromatography)와 결합된 고분해능 질량 분석(high resolution mass spectrometry)으로 분석하였다.Sample preparation for proteomics analysis went through lyophilization, protein solubilization and digestion. The resulting peptide mixture was desalted, dried using C18 reverse phase chromatography and analyzed by high resolution mass spectrometry coupled with nano-flow liquid chromatography.
Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 서열 데이터베이스 분석 및 라벨 프리 정량(label free quantitation, LFQ) 분석을 적용하여 신장이식 BK 바이러스 신병증 진단 또는 예측을 위한 바이오마커 후보 물질을 검색하였다. 이로부터, 1820 개의 소변의 엑소좀 단백질을 확인했다. DAVID 생물정보 데이터베이스를 사용하여 유전자 온톨로지 할당(Gene ontology assignments), 분자 기능 및 Kegg 경로 분석을 수행하였다.Sequence database analysis and label free quantitation (LFQ) analysis were applied using Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Fisher Scientific) to search for biomarker candidates for diagnosing or predicting kidney transplantation BK virus nephropathy. From this, 1820 urine exosome proteins were identified. Gene ontology assignments, molecular function and Kegg pathway analysis were performed using the DAVID bioinformation database.
바이오마커 후보 선발Biomarker candidate selection
바이오마커 후보 물질로 단백질을 선택하는 과정을 [도 1]에 요약하였다. 각각의 병리학적 그룹을 대표하는 특정 바이오마커를 선택하기 위해, t-테스트를 사용하여 NOMOA 및 DONOR 그룹과 비교하여 유의하게 다른 평균 존재비 (abundance)를 갖는 단백질을 선택했다. 또한 볼케이노 플롯(volcano plot)을 사용하여 NOMOA 군과 비교할 때 2 배 이상의 차이를 보이는 단백질을 선택했다. 두 가지 분석에서 중복된 단백질을 선택하고 나머지 두 병리학적 군과 다시 비교하여 평균 존재비의 유의한 차이를 비교 하였다. 모든 분석은 p <0.05의 컷 오프(cut off)로 수행되었다.The process of selecting a protein as a biomarker candidate is summarized in FIG. 1 . To select specific biomarkers representative of each pathological group, t-tests were used to select proteins with significantly different mean abundances compared to the NOMOA and DONOR groups. Also, using a volcano plot, proteins showing a difference of more than 2 fold compared to the NOMOA group were selected. In the two analyzes, overlapping proteins were selected and compared again with the other two pathological groups to compare significant differences in mean abundance. All analyzes were performed with a cut off of p <0.05.
<실험결과><Experiment result>
1. BKVN 환자의 단백질 바이오마커 확인 및 1차 선별1. Identification of protein biomarkers and primary screening of BKVN patients
4193개의 소변 단백질로부터 각각의 병리학적 그룹을 대표하는 특정 바이오마커를 선택하고자 하였으며, Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 서열 데이터베이스 분석 및 라벨 프리 정량(label free quantitation, LFQ) 분석을 적용하여 1820개의 소변 엑소좀 단백질을 확인하였다. To select specific biomarkers representing each pathological group from 4193 urine proteins, sequence database analysis and label free quantitation (LFQ) analysis were applied using Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Fisher Scientific). 1820 urine exosome proteins were identified.
1820개의 소변 엑소좀 단백질 중에서 BKVN 군을 구별할 수 있는 마커를 선발하기 위하여, 먼저 T 테스트를 사용하여 NOMOA 및 Donor 그룹과 비교하여 BKVN 그룹에서 유의하게 다른 평균 존재비(abundance)를 갖는 단백질을 1차적으로 선발한 결과 53개의 단백질이 BKVN 군에서만 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다(p<0.05).In order to select markers capable of discriminating the BKVN group from among 1820 urine exosomal proteins, first, a protein with a significantly different mean abundance in the BKVN group compared with the NOMOA and Donor groups was first selected using the T test. As a result of selection, it was confirmed that 53 proteins were specifically expressed only in the BKVN group (p<0.05).
다음으로, NOMOA 그룹과 BKVN 그룹 만을 비교하여 2배 이상의 발현량 차이를 보이는 단백질을 확인한 결과 785개 단백질이 선별되었다(p<0.05).Next, by comparing only the NOMOA group and the BKVN group, proteins showing a difference in expression level of more than two-fold were identified. As a result, 785 proteins were selected (p<0.05).
상기 1차 선발된 53종의 단백질과 2배 이상의 발현량 차이를 보이는 785개 단백질 중에서 중복되는 단백질 14종을 BKVN 마커 후보로 최종 선발하고, ABMR 군 및 BKVN과 존재비의 유의한 차이를 다시 비교한 결과를 하기 [표 1]에 나타내었다.Among the 785 proteins showing a difference of two-fold or more in the expression level of the 53 proteins selected above, 14 overlapping proteins were finally selected as BKVN marker candidates, and the significant difference in abundance with the ABMR group and BKVN was compared again. The results are shown in [Table 1] below.
[표 1][Table 1]
NOMOA, DONOR 군과 BKVN 군에서 차이를 보이는 단백질 목록(14종)List of proteins showing differences between NOMOA, DONOR and BKVN groups (14 types)
2. BKVN 특이적 바이오마커의 최종 선발2. Final selection of BKVN-specific biomarkers
ABMR, BKVN 및 BKVN 군에서 각각 특이적인 엑소좀 단백질을 발견하기 위하여 T 테스트 분석을 기반으로 최종 후보 단백질을 선택했다. 소변 엑소좀 단백질 중에서 NOMOA 군 또는 DONOR 군과 비교하여 BKVN 군에서만 특이적으로 발현되는 단백질 중에서 NOMOA 군과 비교하여 발현 프로파일이 2배 이상 차이가 나는 단백질만 선별하는 과정을 통해 상기 [표 1]의 14종 단백질을 1차 선별하였다.Final candidate proteins were selected based on T-test analysis to discover specific exosome proteins in the ABMR, BKVN and BKVN groups, respectively. Among the proteins specifically expressed only in the BKVN group compared to the NOMOA group or the DONOR group among the urine exosome proteins, through the process of selecting only proteins that have a difference of at least 2 fold compared to the NOMOA group, 14 proteins were first selected.
상기 [표 1]의 1차 선별된 13종 단백질 중에서, ABMR 군과 비교하여 BKVN 군에서만 유의하게 다른 평균 존재비(abundance)를 갖는 단백질을 후보 바이오마커로 선택하고, TCMR 군과 비교하여 BKVN 군에서만 유의하게 다른 평균 존재비(abundance)를 갖는 단백질을 후보 바이오마커로 선택하였고, 마지막으로 상기 각 후보 바이오마커 단백질 중 중복되는 4가지 단백질을 ABMR, TCMR과 BKVN 군에서 차이가 예상되는 최종 BKVN 바이오마커 단백질로 선정하였다. 확인된 단백질은 하기 [표 2]에 나타낸 바와 같이 HNRNPA1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, UNIPROT Accession No.P09651), MAT2B(Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta, UNIPROT Accession No.Q9NZL9), RPS10(40S ribosomal protein S10, UNIPROT Accession No.P46783) 및 CSE1L(Exportin-2, UNIPROT Accession No.Q9NZL9)였다.Among the 13 primary proteins shown in [Table 1], a protein having a significantly different average abundance only in the BKVN group compared to the ABMR group was selected as a candidate biomarker, and compared to the TCMR group, only in the BKVN group. Proteins with significantly different average abundances were selected as candidate biomarkers, and finally, four overlapping proteins among the candidate biomarker proteins were selected as the final BKVN biomarker protein, which is expected to differ in ABMR, TCMR, and BKVN groups. was selected as The identified proteins are as shown in Table 2 below, HNRNPA1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, UNIPROT Accession No. P09651), MAT2B (
3. 선발된 BKVN 특이적 바이오마커의 특성 확인3. Confirmation of characteristics of selected BKVN-specific biomarkers
최종 선발된 바이오마커의 특성을 확인하기 위하여, DAVID 생물정보 데이터베이스를 사용하여 유전자 온톨로지 할당(Gene ontology assignments), 분자 기능 및 Kegg 경로 분석을 수행하였으며, 그 결과를 [표 2]에 나타내었다.In order to confirm the characteristics of the finally selected biomarkers, gene ontology assignments, molecular functions, and Kegg pathway analysis were performed using the DAVID bioinformation database, and the results are shown in [Table 2].
[표 2][Table 2]
선발된 BKVN 특이적 마커의 기능적 특성Functional Characterization of Selected BKVN-Specific Markers
상기 [표 2]에 나타난 바와 같이, 선발된 BKVN 특이적 마커는 대부분 번역 개시(translational initiation) 및 단백질 결합(protein binding)에 관여하는 것으로 확인되었다.As shown in [Table 2], it was confirmed that most of the selected BKVN-specific markers were involved in translational initiation and protein binding.
4. BKVN 특이적 바이오마커의 검증4. Verification of BKVN-specific biomarkers
46명의 신장이식 환자 및 기증자의 소변 샘플에서 특정 엑소좀 단백질의 발견을 위해, 프로테오믹스 분석을 기반으로 후보 단백질을 선택했다. 소변 엑소좀 단백질 정량 분석에서 총 1820개의 단백질이 검출되었다. 이중 "NOMOA 및 DONOR 군"과 "BKVN군" 간에 발현 프로파일이 현저하게 차이가 나는 단백질 14종을 선택했다. 마지막으로, 14종 단백질 중 ABMR군 또는 TCMR 군과 유의적으로 서로 다른 발현 양상을 나타내는 4개의 단백질(HNRNPA1, MAT2B, RPS10 및 CSE1L)이 확인되어 최종 BKVN 특이적 마커로 선택되었다.For the detection of specific exosomal proteins in urine samples from 46 kidney transplant patients and donors, candidate proteins were selected based on proteomics analysis. A total of 1820 proteins were detected in urine exosome protein quantitative analysis. Among them, 14 proteins with significantly different expression profiles between the "NOMOA and DONOR group" and the "BKVN group" were selected. Finally, four proteins (HNRNPA1, MAT2B, RPS10, and CSE1L) showing significantly different expression patterns from the ABMR group or the TCMR group among 14 proteins were identified and selected as final BKVN-specific markers.
ROC 분석을 통해 NOMOA, ABMR, TCMR군과 BKVN군을 구별할 수 있는 바이오마커의 잠재력을 평가하여 [도 5]에 나타내었다. 그 결과, 곡선 아래 면적은 모든 바이오 마커에서 0.5 이상이며, 민감도와 특이도에 있어서 매우 높은 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다.The potential of the biomarkers to discriminate the NOMOA, ABMR, TCMR and BKVN groups through ROC analysis was evaluated and shown in FIG. 5 . As a result, it was confirmed that the area under the curve was 0.5 or more for all biomarkers, indicating a very high level in sensitivity and specificity.
Claims (10)
HNRNPA1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1), MAT2B (Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta), RPS10 (40S ribosomal protein S10) and CSE1L (Exportin-2) protein or a biomarker composition for diagnosing BK virus nephropathy comprising a protein or a gene encoding the same.
HNRNPA1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1), MAT2B (Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta), RPS10 (40S ribosomal protein S10) and CSE1L (Exportin-2) protein or a biomarker composition for predicting prognosis after kidney transplantation, including a gene encoding the same .
HNRNPA1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1), MAT2B (Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta), RPS10 (40S ribosomal protein S10) and CSE1L (Exportin-2) proteins or substances that measure the mRNA expression level of the gene encoding the protein A composition for diagnosing or predicting prognosis of BK virus nephropathy after kidney transplantation.
상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 조성물.
4. The method of claim 3,
The composition for measuring the expression level of the mRNA is a primer or probe that specifically binds to the gene.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질은 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 올리고펩타이드, 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA), 나노입자 또는 앱타머인 조성물.
4. The method of claim 3,
The substance for measuring the expression level of the protein is an antibody, an interacting protein, a ligand, an oligopeptide, a peptide nucleic acid (PNA), a nanoparticle or an aptamer that specifically binds to the protein or a fragment thereof.
A kit for diagnosing or predicting prognosis of BK virus nephropathy after kidney transplantation comprising the composition of claim 3.
In a sample obtained from an individual, the mRNA expression level of HNRNPA1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1), MAT2B (Methionine adenosyltransferase 2 subunit beta), RPS10 (40S ribosomal protein S10) and CSE1L (Exportin-2) proteins or their coding genes is measured. A method of providing information necessary for diagnosing or predicting prognosis of BK virus nephropathy after kidney transplantation, comprising the steps of.
상기 시료는 소변 또는 소변 유래 엑소좀인 것인, 방법.
8. The method of claim 7,
The sample is urine or urine-derived exosomes, the method.
상기 방법은 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 또는 mRNA 발현 수준과 비교한 결과가 하기 a) 내지 d) 에 해당하는 경우 BK 바이러스 신병증으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법:
a) HNRNPA1의 상향 조절;
b) MAT2B의 상향 조절;
c) RPS10의 상향 조절; 및
d) CSE1L의 상향 조절.
8. The method of claim 7,
The method further comprises the step of determining the BK virus nephropathy when the result of comparing the measured expression level of the protein or mRNA with the expression level of the protein or mRNA of a normal control sample corresponds to the following a) to d) How to be:
a) upregulation of HNRNPA1;
b) upregulation of MAT2B;
c) upregulation of RPS10; and
d) Upregulation of CSE1L.
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