KR102347797B1 - 대식세포 세포 표면 항원 및 이의 다양한 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD169(Cluster of Differentiation 169) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

대식세포 세포 표면 항원 및 이의 다양한 용도{Cell surface antigen of Macrophage and the use thereof}
본 발명은 암 세포 중에서도 특히 뇌 종양에 대하여 대식세포의 표면에 특이적으로 존재하는 세포 표면 항원 단백질과 이의 다양한 용도에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 가장 보편적인 사망원인 중의 하나이다. 약 천만 건의 새로운 케이스가 매년 발생하며, 전체 사망원인의 약 12%를 차지하여 세 번째로 많은 사망의 원인이 되고 있다. 여러 가지 종류의 암 중에서 특히 뇌암은 연령에 관계없이 발생되며, 소아에 발생 빈도가 다른 암에 비하여 높은 특징이 있다. 뇌암은 뇌조직과 뇌를 싸고 있는 뇌막에서 발생되는 일차성 뇌종양과 두개골이나 신체의 다른 부위에서 발생된 암으로부터 전이된 이차성 뇌종양으로 구별되는데, 증세로는 운동 마비, 지각마비, 언어 장애, 시력 장애, 평형 장애 등과 같은 국소 증상과 두개내압항진 증상을 들 수 있다. 상기 뇌암은 조직특이적으로 1 내지 2종의 암이 발병되는 다른 조직에서 발병되는 암과는 달리 다형성아교모세포종, 악성신경교종, 임파선종, 배아세포종, 전이성 종양 등의 다양한 종류의 암을 포함하는데, 이 중에서도 신경교종 (glioma), 특히 교모세포종(glioblastoma)은 가장 악성이고 공격적이어서 예후가 매우 좋지 않으며, 수술과 화학요법 및 방사선 치료를 병용하여도 5년 이상 생존률이 1%를 겨우 넘는 수준인 매우 치명적인 질환이다. 상기 교모세포종이 발병된 환자에서는 뇌세포와 종양세포 간의 경계가 분명하지 않기 때문에, 암 조직을 외과적으로 완전히 제거하는 것은 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.
이에, 상기 교모세포종을 치료하는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구가 수행되고 있지만, 교모세포종은 다양한 유전적 돌연변이를 포함하기 때문에, 상기 병용 치료 방법이 사용되고 있는 현재에도 교모세포종 환자의 평균 생존율이 현저히 낮아, 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있다.
하지만, 상기 교모세포종이 발생하는 뇌는 면역세포의 유입과 활성이 매우 제한되어 있는 면역특권기관이기 때문에 실질적으로 종양세포를 제거하는 면역반응이 거의 일어나지 않으므로, 다른 암에 비해 교모세포종 내부로 침투한 면역세포의 대부분이 소교세포(Microglia) 혹은 항암면역반응을 억제하는 종양관련 대식세포 (Tumor associated macrophage)이며 T 세포와 같은 림프구의 침투가 매우 적다.
한편, 종양 내에 가장 많이 존재한다고 알려져 있는 대식세포는 일반적으로 종양환경에 의해 면역반응을 억제하고 종양의 성장 및 전이를 돕는 기능을 하는 종양관련 대식세포로 존재한다고 알려져 있다. 하지만 최근 연구 결과에 따르면 종양관련 대식세포는 동일한 한 종류의 세포로 이루어진 것이 아니고 다양한 특징을 나타내는 여러 아형으로 구성되어 있다.
유방암, 간암 및 흑색종 등의 암에서 대식세포가 발견되나, 각각의 밝혀진 기능과 종양면역반응에서의 역할이 다르다. 이는 같은 표면 항원을 발현하는 대식세포더라도 세포가 존재하는 조직과 암종에 따라 서로 다른 표현형을 나타내는 다른 세포이기 때문이다.
사람의 유방암을 분석한 연구에 의하면 종양 내부의 대식세포 중 CD169+ 대식세포가 CCL8을 분비하여 종양세포의 악성도를 증가시키며 종양 조직 내 CD169의 발현이 높을수록 생존기간이 감소하는 것을 보고함. 또한 마우스 lewis lung carcinoma 모델에서는 CD169대식세포를 제거하였을 때 종양 내 T 세포 침윤이 증가하고 종양의 크기가 감소한다는 보고도 있다.
반면 LN의 피막하동 대식세포 (subcapsular sinus macrophage)는 림프로 유입된 죽은 종양세포를 포식하고 T 세포 면역반응을 일으켜 종양의 성장을 억제하며 간암에서는 CD169+ 대식세포가 세포독성 T 세포의 분열 및 활성을 증가시켜 종양 성장을 억제한다는 보고가 있다.
또한 흑색종의 경우 항암면역반응을 억제시키는 종양 관련 대식세포와 그렇지 않은 일반적인 대식세포 모두 CD169를 발현하고 있음이 보고되고 있다.
이러한 세포들은 모두 CD169를 발현하고 있는 대식세포라는 공통점이 있지만 각각의 밝혀진 기능과 종양면역반응에서의 역할이 다르다. 이는 같은 CD169를 발현하는 대식세포더라도 세포가 존재하는 조직과 암종에 따라 서로 다른 표현형을 나타내는 다른 세포라는 것을 의미한다.
이에 본 발명에서는 뇌종양에 있는 대식세포의 특징과 기능을 확인하여 항-뇌종양 면역반응에 이 세포들의 역할을 규명하고 진단 및 치료에 이용하고자 한다.
본 발명은 CD169(Cluster of Differentiation 169) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 일 목적은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD169 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 목적은 CD169 단백질 또는 이의 세포 외 도메인을 포함하는 대식세포를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명에서 "종양" 또는 "암"은 세포 주기가 조절되지 않아 세포 분열을 계속하는 질병으로서, 발생 부위에 따라 암종(Carcinoma)과 육종(Sarcoma)으로 나뉜다. 암종(Carcinoma)은 점막, 피부 같은 상피성 세포에서 발생한 악성 종양을 뜻하고, 육종(Sarcoma)은 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 등의 비상피성 세포에서 발생한 악성 종양을 뜻한다.
본 발명에서 상기 암은 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 구강암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 백혈병, 흉선암, 편평상피세포암, 선암종 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 뇌암은 교모세포종(Glioblastoma, GBM)일 수 있다. 상기 교모세포종(Glioblastoma, GBM)은 난치성 뇌 종양의 일종으로, 진단 후 평균 총 생존기간이 15개월 정도에 불과하다. 교모세포종은 정상적으로 뇌조직에 풍부하게 존재하고 있는 신경교세포에서 기원한 종양을 통틀어 일컫는다.
본 발명에서 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되고(되거나) mRNA가 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 폴리뉴클레오티드가 적절한 진핵세포 숙주의 게놈 DNA로부터 유래할 경우, 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 발현에 필요한 조절 성분은 RNA 폴리머라제 결합을 위한 프로모터서열 및 리보좀 결합을 위한 전사 개시 서열을 포함한다. 예를 들어, 세균 발현 벡터 또는 카세트는 프로모터(예를 들어, lac 프로모터) 및 전사 개시를 위한 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열 및 출발 코돈 AUG를 포함한다 (Sambrook et al. (1989), 상기 문헌). 유사하게, 진핵세포 발현 벡터 또는 카세트는 일반적으로 RNA 폴리머라제 II를 위한 이종 또는 상동 프로모터, Kozak 서열, 출발 코돈 AUG, 리보좀 이탈을 위한 종결 코돈 및 하류의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 상기 벡터는 시판되는 것을 구입하거나 당업계에 공지된 방법에 기재된 서열로 만들 수 있다.
본 발명에서, "CD169(Cluster of Differentiation 169)"은 siglec-1, 사이알로어드헤진(sialoadhesin)이라고도 하며, 대식세포의 표면에서 발견되는 세포 접착 분자이다. CD169는 17 개의 면역 글로불린(Ig) 도메인(1개의 가변 도메인 및 16 개의 불변 도메인)을 함유하고, I 형 렉틴으로 정의된다. CD169 단백질은 siglec-1 유전자에 의해 코딩된다.
본 발명에서 상기 CD169 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "CD45(Cluster of Differentiation 45)"는 단백질 티로신 포스파타제 수용체 유형 C(Protein tyrosine phosphatase receptor type C; PTPRC)라고도 하며, PTPRC 유전자에 의해 코딩된다.
본 발명에서 상기 CD45 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "F4/80(EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1; EMR1)"는 ADGRE1 유전자에 의해 코딩된다.
본 발명에서 상기 F4/80 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "Ly6c(Lymphocyte antigen 6 complex)" 림프구 항원 6(ly6) 또는 유로키나제 형 플라스미노겐 활성화제 수용체(uPAR)로도 알려진, 공통 구조를 공유하지만 조직 발현 패턴 및 기능이 상이한 단백질 패밀리 중 하나이다. Ly6C는 마우스 항원으로, 마우스의 Ly6C+ 단핵구(monocyte)는 고전적 단핵구(classical monocyte)로 분류된다. 사람의 경우 Ly6C+ 단핵구에 해당하는 고전적 단핵구 표지는 CD14이다.
본 발명에서, 상기 ly6c 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 "CD14(Cluster of Differentiation 14)"는 선천적 면역계의 일부로서 대식세포에 의해 주로 만들어진 인간 단백질이다. CD14는 병원체 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern; PAMP)인 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)를 결합하여 체내 박테리아를 검출하는데 도움을 준다.
본 발명에서, 상기 CD14 단백질은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, Ly6G(Lymphocyte antigen 6 complex locus G6D)는 마우스 호중구를 분류하기 위한 표지이다. Ly6G는 골수에서 발달 조절된 방식으로 골수유래 세포에 의해 발현되는 21 ~ 25kD 글리코실 포스파티딜 이노시톨 (glycosylphosphatidylinositol; GPI)과 연결된 분화 항원이다. 단핵구는 골수 발생 동안 일시적으로 Ly6G를 발현하는 반면, 과립구 및 말초 호중구에서의 Ly6G 발현은 세포의 분화 및 성숙 수준과 직접적으로 관련된다. 사람의 호중구 표지는 CD15와 CD66b를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, CD15(Cluster of Differentiation 15)는 Lewis x라고도 하며 인간 골수 세포에 대해 구별되는 마커이고, 수지상 세포에 대한 호중구 부착을 매개한다.
본 발명에서, CD66b(Cluster of Differentiation 66b)는 CEACAM8이라고도 하며 CEA 유전자 패밀리의 일종이다. 상기 CD66b의 주요 기능은 세포 부착, 세포 이동 및 병원체 결합이다.
본 발명에서, "대식세포(macrophage)"는 탐식세포라고도 하는 면역담당세포의 하나이다. 동물체내의 모든 조직에 분포하며, 이물질 ·세균 ·바이러스 ·체내 노폐세포 등을 포식하고 소화하는 대형아메바상 식세포를 총칭한다. 본 발명의 대식세포는 중추신경계의 소교세포일 수 있다.
본 발명에서, "단핵구"는 백혈구의 한 유형으로 골수에서 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell; HSC)로부터 유래하며, 분화과정동안 공통 골수선조세포로부터 분화된다. 단핵구는 큰 크기의 백혈구이며, 골수에서 성숙된 이후 혈관에서 순환하다가 조직으로 이동하여 대식세포 또는 골수의 수지상세포로 분화하며, 식작용, 항원제시 그리고 시토카인(cytokine) 생산의 기능을 수행한다.
본 발명에서, "분화"는 미분화된 세포가 특정 조직 및 기관을 구성하는 특수한 세포로 변환되는 과정으로, 분화된 세포는 미분화 세포와 달리 고유한 구조와 기능을 가진다. 세포 분화는 식물과 동물 세포에서 모두 일어나며, 세포 내 유전자 발현 패턴 변화를 수반한다. 일반적으로 분화가 일어난 세포는 형질을 영구적으로 유지하지만 특수한 조건 하에서는 다른 종류의 세포로 변환될 수도 있다.
본 발명에서, "단핵구유래"는 분화된 세포가 단핵구로부터 얻어진 것임을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, CD169(Cluster of Differentiation 169) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 암 진단용 조성물은 CD45(Cluster of Differentiation 45), F4/80(EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1) 및 CD14(Cluster of Differentiation 14)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 대식세포에서 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 대식세포는 단핵구에서 유래되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 따르면, CD169(Cluster of Differentiation 169) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 암 진단용 키트는 CD45(Cluster of Differentiation 45), F4/80(EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1) 및 CD14(Cluster of Differentiation 14)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 대식세포에서 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 대식세포는 단핵구에서 유래되는 것일 수 있다.
본 발명에서 "키트"는 바이오 마커 성분에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 항체를 검출 가능한 표지로 표지하여 바이오 마커의 발현 수준을 평가할 수 있는 도구를 말한다. 프로브 또는 항체 관련하여 검출 가능한 물질을 기질과의 반응에 의해서 직접적으로 표지하는 것뿐만 아니라, 직접적으로 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 발색하는 표지체가 접합된 간접적 표지도 포함한다. 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 기타 다른 용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하여 제작될 수 있다. 본 발명에서 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소, 역전사효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 당 업계에 공지되어 있는 것이라면, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산 서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로써, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 암 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 암 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 암 진단용 키트에서 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 암 진단용 키트에서 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 암 진단용 키트에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충 용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.
본 발명의 암 진단용 키트에서 세척액은 인산염 완충 용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충 용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합 반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지 용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD169(Cluster of Differentiation 169) CD45(Cluster of Differentiation 45), F4/80(EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1) 및 CD14(Cluster of Differentiation 14)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 대식세포에 대하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 CD169+CD14+F4/80low 대식세포에 의해 측정되는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계 시 상기 CD169+CD14+F4/80low 대식세포가 검출될 경우 암으로 진단하는, 암 진단을 위한 정보 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 대식세포는 단핵구에서 유래될 수 있고, 바람직하게는 단핵구유래 CD169+CD14+F4/80low 대식세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는, CD169 단백질 또는 이의 세포 외 도메인을 포함하는 대식세포를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 대식세포는 CD45(Cluster of Differentiation 45), F4/80(EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1) 및 CD14(Cluster of Differentiation 14)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이의 세포 외 도메인을 더 포함할 수 있고 바람직하게는 상기 대식세포는 단핵구에서 유래되는 것일 수 있다.
본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 성장, 증식, 침윤성 또는 전이성을 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 성장, 증식, 침윤성 또는 전이성을 억제하여 암 질환을 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 혹은 종전의 항암제를 혼합하여 사용할 수 있고, 혹은 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 기타 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는, CD169 단백질 또는 이의 세포 외 도메인을 포함하는 대식세포를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 대식세포는 CD45(Cluster of Differentiation 45), F4/80(EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1) 및 CD14(Cluster of Differentiation 14)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이의 세포 외 도메인을 더 포함할 수 있고 바람직하게는 상기 대식세포는 단핵구에서 유래되는 것일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 암 진단용 조성물은 CD169(Cluster of Differentiation 169) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제에 관한 것이고, 특히 뇌암세포의 진단에 관한 것이다.
도 1은 뇌종양 내 침윤한 대식세포의 단일세포 전사체를 분석한 것이다.
도 2는 교모세포종 모델에서 야생형(wild type; WT)과 CD169-DTR 마우스에서 CD169+ 대식세포를 공초점 현미경(confocal)으로 촬영한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 종양이 없는 정상 뇌조직을 나타낸 것이다.
도 4는 종양이 발생한 뇌조직에서 CD169의 발현을 나타낸 것이다.
도 5는 종양조직 내 침윤한 대식세포의 CD169와 F4/80 발현을 나타낸 것이다.
도 6은 종양 진행에 따른 CD169+ 세포의 침윤을 나타낸 것이다.
도 7은 유세포분석법을 사용한 종양 내 침윤 면역세포 중 CD169를 발현하는 대식세포 아형을 분석한 것이다.
도 8은 종양 내 대식세포의 단일세포 전사체를 분석한 것이다.
도 9는 교모세포종 모델에서 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 CD169+ 대식세포의 생존률을 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 전체 면역세포(CD45.2+)의 수를 나타낸 것이다.
도 11은 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 호중구(Ly6G+)의 세포 비율과 세포 수를 나타낸 것이다.
도 12는 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 단핵구유래 대식세포(Ly6G-Ly6C+F4/80+)의 세포 비율과 세포 수를 나타낸 것이다.
도 13은 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 소 교세포(Ly6G-Ly6C-F4/80+CD45.2low)의 세포 비율과 세포 수를 나타낸 것이다.
도 14는 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 단핵구(Ly6G-F4/80-MHCII-Ly6C+CD11b+)의 세포 비율과 세포 수를 나타낸 것이다.
도 15는 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 수지상세포(Ly6G-F4/80-MHCII+CD11c+)의 비율과 세포 수를 나타낸 것이다.
도 16은 1 x 105 Gl261을 주사하고 10일 뒤 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 전체 면역세포(CD45.2+)의 수를 나타낸 것이다.
도 17은 1 x 105 Gl261을 주사하고 10일 뒤 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 CD4+ T 세포 비율과 세포 수를 나타낸 것이다.
도 18은 1 x 105 Gl261을 주사하고 10일 뒤 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 CD4+ T 세포 비율과 세포 수를 나타낸 것이다.
도 19는 1 x 105 Gl261을 주사하고 10일 뒤 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 CD8 T세포 내 비율과 세포 수를 나타낸 것이다.
도 20은 1 x 105 Gl261을 주사하고 10일 뒤 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내에 존재하는 종양 내 CD4+ T세포 중 조절 T세포(CD4+Foxp3+)의 수와 비율을 나타낸 것이다.
도 21은 Gl26161을 주사하고 10일 뒤 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내 케모카인 발현을 나타낸 것이다.
도 22는 Gl26161을 주사하고 10일 뒤 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내 사이토카인 발현을 나타낸 것이다.
도 23은 Gl26161을 주사하고 10일 뒤 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 뇌종양 조직 내 저산소증 관련 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
뇌종양 내 대식세포의 다양성 확인
뇌종양 내의 대식세포의 다양성을 확인하기 위해 종양 내 침투한 면역세포의 단일세포 전사체를 분석하였다.
실험 방법 1
8주령 수컷 C57BL/6 생쥐의 뇌에 5 Х 104의 GL261 뇌종양 세포주를 주사하고 20일 후 종양을 주사한 대뇌 우반구를 분리하였다. 뇌 분리시 30 ml DPBS를 심장으로 넣어 관류시켜 조직 내 혈액을 제거하였다. 분리한 뇌를 면도날을 이용해 조각내어 2 mg/ml의 콜라게나제 IV(Collagenase IV; Worthington Biochemical Corp) 와 30 μg/ml의 디엔에이즈 I(DNase I; Roche)이 포함된 1% 우태아혈청 RPMI 미디어에 넣고 30분간 37℃에서 배양하였다. 상기 뇌 조각을 스트레이너(Strainer; SPL, 93070)에 넣어 잘게 갈은 뒤 30%/70%의 구배의 퍼콜(percoll; GE Healthcare, 17-0891-01)에 넣고 2000 rpm에서 20분 원심분리하여 면역 세포를 얻었다. 이 세포들을 αCD45.2 (104), αCD11b (M1/70) 항체를 넣어 4℃에서 30분간 염색하였다. 세포를 읽기 전 7-AAD를 넣고 FACS ARIA로 CD45 hi 세포만 분리하였다.
10X genomics Chromium single-cel 3' v3 kit (10x genomics)를 이용하여 library를 제작하고 Macrogen에서 10,000 cells/sample depth로 HiSeqXten (Illumina)를 이용하여 next generation sequencing을 하였다. Cell Ranger (10x Genomics, version 3.0.0)로 raw FASTQ data를 가공하였다. Reference genome으로 mouse genome 10-3.0.0 (10x Genomics, inc.)를 사용하여 matrix를 만들고 transcript count와 cell barcodes 정보를 가공하였다.
가공된 데이터는 R 프로그램을 사용하여 Seurat 분석법으로 분석하였다. 낮은 질의 세포를 배제하기 위하여 RNA발현 량이 200 이하이거나 6000 이상인 샘플과 미토콘드리아 유전자가 RNA 발현의 5% 이상인 샘플은 제거하였다. NormalizeData 함수를 이용해 각 데이터를 일반화 하였고 이를 FindVariableFeature 함수를 이용하여 유전자 발현량을 확인하였다. Findneighbors 함수와 FindClusters 함수를 이용하여 resolution 0.6으로 세포를 클러스터링 하였다.
실험 결과 1
위 방법으로 뇌종양에서 얻은 면역세포를 7개 세포집단 (cluster)으로 분류하였고 주된 리니지(lineage) 마커를 사용해 T 세포, B 세포, NK/γδ T 세포, 호중구, 소교세포, 골수성 세포로 분류하였다. 그 중 골수성 세포를 resolution 0.3으로 다시 분석하여 4 개의 세포집단으로 분류하였다. 도 1과 같이 뇌종양 내 CD68을 발현하는 대식세포는 적어도 3개의 아형으로 이루어져 있음을 확인하였다
0번 집단은 Ly6c를 발현하며 F4/80를 낮게 발현하는 단핵구유래 대식세포로 추정되며 이 세포에서 Siglec1 (CD169)이 발현되는 것을 확인하였다. 1, 2번 집단은 Ly6C를 발현하지 않으며 CD169를 발현하지 않았다. 2번 집단에서 F4/80가 높게 발현되었다. 이러한 면역세포가 뇌종양 내에 침투해 있는 것을 확인하기 위해 정상 뇌와 종양이 발생한 뇌의 면역세포를 도 2와 같이 공초점 현미경(confocal)으로 확인하였다.
CD169+ 대식세포의 뇌 내 위치 및 종양 내 침투 확인
실험 방법 2
8주령 수컷 C57BL/6 생쥐의 뇌에 1 Х 10의 녹색형광단백질(Green fluorescent protein, GFP)을 발현하는 Gl261 세포주를 주사하고 20일 후 뇌를 분리하였다. 뇌 분리시 30 ml DPBS를 심장으로 넣어 관류시켜 조직 내 혈액을 제거하고 4% paraformaldehyde(PFA)가 들어있는 DPBS를 관류시켜 조직을 고정하였다. 이후 뇌를 분리하여 4% PFA 용액에 넣어 4℃에서 16 시간동안 고정하였다. 고정된 조직은 30% 설탕이 들어있는 DPBS 용액에 넣어 4℃에서 48시간 이상 탈수시켰다. 이후 OCT 용액(Sakura, 4583)에 넣은 뒤 얼려 block 제작하였다. 제작된 OCT block은 cryo stat (LEICA)를 사용하여 40 μm 두께로 잘라 5% 염소 혈청과 0.3% Triton X-100이 포함된 DPBS을 넣어 상온에서 1 시간 배양한 뒤 αCD169, αF4/80 혹은 αCD31 항체로 염색하였다. 이후 DAPI가 포함된 mounting 용액 (Abcam, ab104139-20ml)을 사용하여 슬라이드를 제작하고 LSM800 confocal microscopy와 Zen software (ZEISS)를 사용하여 조직 내 면역세포 침투를 분석하였다.
실험 결과 2
도 3과 같이 정상 조직에서는 CD169를 발현하는 세포가 뇌의 실조직이 아닌 혈관 내부, 혹은 혈관 주위의 영역에 존재하며 그 수가 많지 않았다. 한편 교모세포종 모델에서는 도 4 및 도 5와 같이 뇌에 형성된 종양 내부에 CD169를 발현하는 세포가 많이 침윤해 있으며 이 세포들은 F4/80를 발현하였다. 이러한 세포들은 암이 없는 정상적인 뇌 조직에는 거의 존재하지 않으며 특히 암의 중심부에 CD169를 발현하는 세포가 주로 침윤해 있었다. 도 6과 같이 CD169를 발현하는 세포의 종양 내 침윤은 종양 발생 초기에서부터 나타나며 종양이 성장함에 따라 증가하였다. 도 7과 같이 종양 내부의 F4/80 혹은 CD169 발현을 확인 한 결과 CD169를 발현하는 세포들은 F4/80 역시 발현하지만 CD169를 발현하지 않고 F4/80만 발현하는 세포들도 있는 것을 볼 수 있었다. 이는 종양 내 대식세포가 동일한 단일세포가 아닌 다양한 세포로 구성되어 있다는 것을 의미한다.
실험 방법 3
8주령 수컷 C57BL/6 생쥐의 뇌에 1 Х 10의 GL261 뇌종양 세포주를 주사하고 20일 후 종양을 주사한 대뇌 우반구를 분리하였다. 실험 방법 1과 같은 방법으로 뇌에서 면역세포를 분리하였다, 이 세포들을 αCD45.2 (104), αF4/80 (BM8), αLy6C (AL-21), αCD11b (M1/70), αCD169 (3D6.112) 항체를 넣어 4℃에서 30분간 염색하였다. 세포를 읽기 전 PI를 넣어 죽은 세포를 염색하고 LSR Fortessa로 분석하였다.
실험 결과 3
종양이 없는 뇌와 종양이 생긴 뇌를 비교분석했을 때 종양이 생긴 뇌에서 CD45hiF4/80+ 세포들이 나타나며, 이러한 세포들은 종양이 없는 정상 뇌조직에는 없기 때문에 외부로부터 유입된 세포라는 것을 알 수 있었다. 대식세포와 단핵구의 표지인 F4/80와 Ly6C를 CD45hi F4/80+ 세포에서 분석해보면 크게 F4/80hi Ly6C- 세포와 F4/80low Ly6c+ 세포로 나눌 수 있으며 F4/80low Ly6c+세포에서 CD169가 발현되는 것을 볼 수 있었다. 이러한 표지의 발현은 뇌종양 내에서 CD169를 발현하는 세포가 혈액을 통해 유입된 단핵구유래의 대식세포라는 것을 의미한다. 분석 결과를 토대로 이 세포를 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포라 명명하였다. CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포는 종양이 발생했을 때 뇌의 실조직 내부로 침투할 수 있으며 종양 내에서 종양 미세환경에 직접적으로 영향을 줄 수 있다. 또한 암의 중심부에 더 많은 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 존재하는 것으로 보아 암 중심부의 저산소 혹은 암세포의 괴사로 유래된 종양 미세환경이 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포의 침윤을 촉발한다고 볼 수 있다.
CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포의 특성 확인
단일세포 전사체 분석을 통해 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포의 전사체 발현을 분석하였다.
도 8은 종양 내 대식세포의 단일세포 전사체를 분석한 것으로, 대식세포에서 (A) 케모카인 수용체, (B) 성장인자 수용체, (C) 보조자극인자, (D) 스캐빈저 수용체, (E) Fcγ 수용체, (F) IFN 수용체, (G) T 세포 케모카인 발현을 나타낸 것이다.
CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포는 단핵구의 조직 내 침윤에 중요한 CCR2를 높게 발현하였다. 모든 대식세포 아형에서 성장인자인 CSF1과 CSF2의 수용체를 높게 발현하였다. 보조자극인자인 CD80은 모든 대식세포에서 발현이 관찰되지 않았지만 CD86은 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포에서도 높게 발현하였다. 스캐빈저 수용체인 CD36은 2번 대식세포 집단에서만 특이적으로 발현되며 대식세포 스캐빈저 수용체 1(Macrophage scavenger receptor 1, MSR1)은 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포에서 특이적으로 발현하였다. 항체의존적 세포독성 혹은 대식작용을 매개하는 Fcγ 수용체는 모든 대식세포가 발현하지만 특히 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포에서 높게 발현하였다. IFN-γ 수용체 1은 2번 대식세포 집단에서 가장 높게 발현되지만 IFN-γ 수용체 2는 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포에서 높게 발현되며 1번 대식세포 집단은 발현하지 않았다. IFN-α 수용체는 모든 대식세포가 발현하지만 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포에서 가장 발현이 높았다.
T 세포의 종양 내 침윤에 중요한 케모카인인 CXCL9과 CXCL10은 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포에서 특이적으로 높게 발현하였다. 이러한 결과는 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포의 분화와 종양 내 침윤 및 증식을 CCR2와 CSF1, CSF2, IFN이 매개할 수 있다는 것을 의미한다. 스캐빈저 수용체와 Fcγ 수용체가 높게 발현되는 것은 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 종양에 대한 포식작용을 한다고 있다고 추측할 수 있다. 또한 T 세포 활성에 중요한 보조자극인자나 T 세포의 이동에 중요한 케모카인이 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포에서 높게 발현되기 때문에 이러한 세포가 뇌종양에서 항암면역반응에 중요한 T 세포 반응을 매개한다는 것을 추측할 수 있다.
CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 항암면역반응에 미치는 영향 확인
앞선 결과들로 뇌종양 내에는 다양한 대식세포들이 존재하며 그중 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 항암면역반응을 증가시키는 작용을 할 수 있다고 예상하였다. 이를 확인하기 위해 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포를 특이적으로 제거하여 종양 내 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포의 중요성을 확인하고자 하였다. CD169-DTR 마우스는 CD169를 발현하는 세포에 디프테리아 독소 수용체가 발현되는 마우스로, 디프테리아 독소를 처리하면 CD169를 발현하는 세포를 일시적으로 제거할 수 있는 마우스가 된다. 뇌종양의 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 CD169-DTR 마우스에서 제거되는지 확인하였다.
실험 방법 4
8주령 수컷 CD169-DTR hetero 생쥐의 뇌에 1 Х 10의 GL261-GFP 뇌종양 세포주를 주사하고 19일 후 디프테리아독소를 1000 ng 복강내 주사하였다. 24시간 뒤 실험 방법 2 와 같은 방법으로 뇌를 분리하고 section하였다. Section을 αCD3(SP7), αCD169 (3D6.112) 항체로 염색하고 실험 방법 2와 같은 방법으로 슬라이드를 제작하고 분석하였다.
실험 결과 4
디프테리아 독소에 의해 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 종양 내에서 사라지는 것을 확인하였다.
뇌에 형성된 교모세포종에의 진행에 미치는 CD169+ 대식세포의 영향 확인
뇌종양에서 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포의 기능을 확인하기 위해 도 9와 같이 이 세포가 있는 마우스와 없는 마우스에서 종양 주사시 생존기간을 비교하였다.
실험 방법 5
8주령 수컷 CD169-DTR hetero 혹은 야생형 마우스에 디프테리아 독소를 1000 ng을 복강내주사하고 24시간 후 1 Х 10의 GL261 뇌종양 세포주를 주사하였다. 4일 뒤 동량의 디프테리아 독소를 복강내 주사하고 30일동안 마우스 생존을 관찰하였다.
실험 결과 5
CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 없는 마우스에서 야생형 마우스에 비해 마우스의 생존기간이 크게 감소하였다. 이는 뇌종양 내의 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 종양의 성장을 억제하는데 중요한 기능을 한다는 것을 의미한다.
CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 종양 내 면역세포에 미치는 영향 분석
마우스 생존 실험에서 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 없을 경우 종양에 의해 마우스가 더 빨리 죽는 것을 확인하였고, 전사체 분석 결과에서 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 항종양 면역반응에 영향을 미칠 수 있다는 것을 확인하였기 때문에 이를 종합하여 CD169+Ly6c+F4/80low단핵구유래 대식세포가 종양 내 면역환경을 변화시킬 수 있다고 추측할 수 있었다. 이를 확인하고자 CD169+Ly6c+F4/80low단핵구유래 대식세포 유무에 따른 종양 내 면역세포 변화를 확인하였다.
실험 방법 6
8주령 수컷 CD169-DTR hetero 혹은 야생형 마우스에 디프테리아 독소를 1000 ng을 복강내 주사하고 24시간 후 1 Х 10의 GL261 뇌종양 세포주를 주사하였다. 4일 뒤 동량의 디프테리아 독소를 복강내 주사하고 주사 후 10일째 되는 날 실험 방법 3과 같이 마우스의 우뇌반구의 면역세포를 분리하였다. 이 세포들을 αCD45.2 (104), αF4/80 (BM8), αLy6C (AL-21), αCD11b (M1/70), αLy6G(1A8), MHCII (M5/144.15.2), CD11c (N418) 항체를 넣어 4℃에서 30분간 염색하였다. 세포를 읽기 전 PI를 넣어 죽은 세포를 염색하고 LSR Fortessa로 분석하였다.
실험 결과 6
도 10, 도 11 및 도 13과 같이 종양조직 내에 존재하는 전체 면역세포(CD45.2+)의 수와 소교세포 (Ly6G-Ly6C-F4/80+CD45.2low), 단핵구(Ly6G-F4/80-MHCII-Ly6C+CD11b+)의 수와 면역세포 내 비율은 큰 차이가 나타나지 않았지만, 도 11과 같이 호중구(Ly6G+)의 수와 비율이 증가하였다. 도 14와 같이 종양 조직에 침투한 단핵구유래 대식세포(Ly6G-Ly6C+F4/80+)의 수와 비율은 통계적으로 유의하지는 않지만 감소하는 경향을 보였고 도 15와 같이 수지상세포(Ly6G-F4/80-MHCII+CD11c+)의 수와 비율이 감소하였다. 비장에서의 면역세포 변화와 뇌종양 내 면역세포 변화 양상이 비슷한 것으로 보아 뇌종양에 유입된 면역세포들이 비장에서 유래되어 혈액을 통해 뇌로 유입된 것으로 유추할 수 있었다. 이는 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 면역세포에 직접적으로 영향을 줄 뿐 아니라 뇌의 혈관-뇌 장벽에서 면역세포의 투과성에도 영향을 끼친다고 볼 수 있다.
CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 T 세포의 교모세포종 내 침투와 활성 및 기능에 미치는 영향 분석
기존 실험결과에 따르면 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 제거된 마우스는 교모세포종에서 생존기간이 짧아지는 것을 확인하였다. 이는 항암면역반응이 억제되어 있다는 것을 의미한다. 이를 확인하기 위해 항암면역반응에 중요하게 작용하는 면역세포인 T 세포의 교모세포종 내 침윤과 종양 내에 존재하는 T 세포의 기능을 분석하였다.
실험방법 7
실험방법 5와 같이 마우스에 디프테리아 독소와 종양세포주를 주사한 뒤 뇌종양 내 면역세포를 얻었다. 분리된 면역세포는 50 ng/ml의 PMA 과 1 μg/ml의 이노마이신, 1/1500으로 희석된 골지 플러그 (BD Bioscience)가 들어있는 RPMI media에서 4 시간 배양한 뒤 αCD45.2 (104), CD3e (17A2), CD4 (GK1.5), CD8a (53-6.7), IFN-γ (XMG1.2), Foxp3 (FJK16s), CD44 (IM7) 항체와 Fixable viability stain 450 (BD bioscience)로 염색한 뒤 유세포분석기를 통해 분석하였다.
실험결과 7
도 16과 같이 종양조직 내에 존재하는 전체 면역세포(CD45.2+)의 수는 그룹 간에 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 도 17과 같이 종양 조직에 침투한 CD4 T세포(CD3+CD4+)와 CD8 T세포(CD3+CD8+)의 수는 DPBS만을 주사한 마우스에서는 두 그룹 사이에 차이가 없었지만 종양을 주사한 마우스에서 모두 증가하였다. CD8 T세포의 수는 야생형과 CD169-DTR 마우스에서 차이가 없었지만 CD4 T세포의 수는 CD169-DTR 마우스에서 감소하였다. 도 18과 같이CD4 T세포 중 활성화된 세포(CD4+CD44+)와 IFN-γ를 발현하는 세포 (CD4+IFN-γ+)의 CD4 T세포 내 비율에는 거의 차이가 없지만 수는 CD169-DTR 마우스에서 감소하였다. 도 19와 같이 CD8 T세포 중 활성화된 세포(CD8+CD44+)와 IFN-γ(CD8+IFN-γ+)를 발현하는 세포의 CD4 T세포 내 비율과 수 모두 CD169-DTR 마우스에서 감소하였다. 도 20과 같이 조절 T세포(CD4+Foxp3+)의 경우 CD4 T세포 내 비율과 세포 수 모두 감소하였다.
이러한 결과를 통해 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 없을 경우 항암면역반응에 중요한 CD4 T세포와 CD8 T 세포의 종양 내 침투와 기능 및 활성이 감소하며 항암면역반응을 억제하는 조절 T세포의 침투가 증가한다는 것을 알 수 있다.
CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 교모세포종 내 면역환경에 미치는 영향 분석
CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 제거된 마우스에서 T세포의 종양 내 침투와 활성 및 기능이 감소한 것은 CD169+ 대식세포가 교모세포종 내의 면역환경에 영향을 미친다는 것을 의미한다. 단일세포 전사체 분석 결과에서도 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포에서 주로 CXCL9과 CXCL10이 발현되었다. 이를 확인하기 위해 T세포의 이동과 기능 및 활성을 조절하는 케모카인과 사이토카인의 발현을 분석하였다.
실험방법 8
실험방법 5와 같이 마우스에 디프테리아독소와 종양세포주를 주사하고 10일 후 뇌의 우반구 조직을 분리하였다. 분리된 조직을 1 ml RPMI media와 함께 스트레이너에 넣어 잘게 갈은 뒤 500g, 5분동안 원심분리하여 가라앉은 조직에서 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 RNA를 추출하고 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
합성된 cDNA SYBR Green Realitime PCR Master Mix (Toyobo)와 primer (표1)를 사용하여 케모카인 및 사이토카인의 발현을 분석하였다.
실험결과 8
도 21과 같이 T세포의 종양 내 침투에 중요한 케모카인중 CXCL9은 야생형과 CD169-DTR 마우스 사이에 차이가 없었지만 CXCL10은 증가하였고, 조절 T세포의 유입에 중요한 CCL22는 CD169-DTR 마우스에서 증가하였다. 이러한 결과로 종양 내 케모카인 발현 변화가 조절 T세포의 유입 변화를 매개한다는 것을 유추할 수 있었다. 사이토카인의 경우 도 22와 같이 다른 사이토카인은 유의미한 차이가 없었지만 IL-12p40의 발현이 CD169-DTR 마우스에서 감소하였다. IL-12는 주로 수지상세포 등의 선천면역세포에서 발현되는 사이토카인이며 T세포의 활성화에 중요하게 작용하였다. 이러한 결과는 CD169-DTR 마우스에서 종양 내 수지상세포의 유입이 감소된 이전 실험 결과와 더불어 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포에 의해 종양 내 다양한 면역세포의 기능과 유입이 조절되고 있다는 것을 의미한다. 또한 종양 내 면역세포의 활성에 영양을 미친다고 알려져 있는 저산소증의 정도를 확인하기 위해 도 23과 같이 저산소에서 증가하는 VEGF와 HIF-1α의 발현을 확인 한 결과 VEGF의 발현은 차이가 없었지만 HIF-1α의 발현이 CD169-DTR 마우스에서 증가하였다. 이는 CD169+Ly6c+F4/80low 단핵구유래 대식세포가 종양 내 저산소증을 감소시킬 수 있다는 것을 의미하며 종양 내 저산소증 조절이 항종양면역반응을 조절하는 하나의 메커니즘이 될 수 있다고 유추할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Gln Glu Lys Gln Val Ser Leu Gln Trp 165 170 175 Arg Gly Gln Asp Pro Thr His Ser Val Thr Ser Ser Phe Gln Ser Leu 180 185 190 Glu Pro Thr Gly Val Tyr His Gln Thr Thr Leu His Met Ala Leu Ser 195 200 205 Trp Gln Asp His Gly Arg Thr Leu Leu Cys Gln Phe Ser Leu Gly Ala 210 215 220 His Ser Ser Arg Lys Glu Val Tyr Leu Gln Val Pro His Ala Pro Lys 225 230 235 240 Gly Val Glu Ile Leu Leu Ser Ser Ser Gly Arg Asn Ile Leu Pro Gly 245 250 255 Asp Pro Val Thr Leu Thr Cys Arg Val Asn Ser Ser Tyr Pro Ala Val 260 265 270 Ser Ala Val Gln Trp Ala Arg Asp Gly Val Asn Leu Gly Val Thr Gly 275 280 285 His Val Leu Arg Leu Phe Ser Ala Ala Trp Asn Asp Ser Gly Ala Tyr 290 295 300 Thr Cys Gln Ala Thr Asn Asp Met Gly Ser Leu Val Ser Ser Pro Leu 305 310 315 320 Ser Leu His Val Phe Met Ala Glu Val Lys Met Asn Pro Ala Gly Pro 325 330 335 Val Leu Glu Asn Glu Thr Val Thr Leu Leu Cys Ser Thr Pro Lys Glu 340 345 350 Ala Pro Gln Glu Leu Arg Tyr Ser Trp Tyr Lys Asn His Ile Leu Leu 355 360 365 Glu Asp Ala His Ala Ser Thr Leu 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Pro Pro Lys Leu Ser Ala Leu 785 790 795 800 Leu Asp Val Gly Gln Gly His Met Ala Val Phe Ile Cys Thr Val Asp 805 810 815 Ser Tyr Pro Leu Ala His Leu Ser Leu Phe Arg Gly Asp His Leu Leu 820 825 830 Ala Thr Asn Leu Glu Pro Gln Arg Pro Ser His Gly Arg Ile Gln Ala 835 840 845 Lys Ala Thr Ala Asn Ser Leu Gln Leu Glu Val Arg Glu Leu Gly Leu 850 855 860 Val Asp Ser Gly Asn Tyr His Cys Glu Ala Thr Asn Ile Leu Gly Ser 865 870 875 880 Ala Asn Ser Ser Leu Phe Phe Gln Val Arg Gly Ala Trp Val Gln Val 885 890 895 Ser Pro Ser Pro Glu Leu Arg Glu Gly Gln Ala Val Val Leu Ser Cys 900 905 910 Gln Val Pro Thr Gly Val Ser Glu Gly Thr Ser Tyr Ser Trp Tyr Gln 915 920 925 Asp Gly Arg Pro Leu Gln Glu Ser Thr Ser Ser Thr Leu Arg Ile Ala 930 935 940 Ala Ile Ser Leu Arg Gln Ala Gly Ala Tyr His Cys Gln Ala Gln Ala 945 950 955 960 Pro Asp Thr Ala Ile Ala Ser Leu Ala Ala Pro Val Ser Leu His Val 965 970 975 Ser Tyr Thr Pro Arg His Val Thr Leu Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asp 980 985 990 Pro Glu Arg Leu Gly His Leu Val Cys Ser Val Gln Ser Asp Pro Pro 995 1000 1005 Ala Gln Leu Gln Leu Phe His Arg Asn Arg Leu Val Ala Ser Thr Leu 1010 1015 1020 Gln Gly Ala Asp Glu Leu Ala Gly Ser Asn Pro Arg Leu His Val Thr 1025 1030 1035 1040 Val Leu Pro Asn Glu Leu Arg Leu Gln Ile His Phe Pro Glu Leu Glu 1045 1050 1055 Asp Asp Gly Thr Tyr Thr Cys Glu Ala Ser Asn Thr Leu Gly Gln Ala 1060 1065 1070 Ser Ala Ala Ala Asp Phe Asp Ala Gln Ala Val Arg Val Thr Val Trp 1075 1080 1085 Pro Asn Ala Thr Val Gln Glu Gly Gln Gln Val Asn Leu Thr Cys Leu 1090 1095 1100 Val Trp Ser Thr His Gln Asp Ser Leu Ser Tyr Thr Trp Tyr Lys Gly 1105 1110 1115 1120 Gly Gln Gln Leu Leu Gly Ala Arg Ser Ile Thr Leu Pro Ser Val Lys 1125 1130 1135 Val Leu Asp Ala Thr Ser Tyr Arg Cys Gly Val Gly Leu Pro Gly His 1140 1145 1150 Ala Pro His Leu Ser Arg Pro Val Thr Leu Asp Val Leu His Ala Pro 1155 1160 1165 Arg Asn Leu Arg Leu Thr Tyr Leu Leu Glu Thr Gln Gly Arg Gln Leu 1170 1175 1180 Ala Leu Val Leu Cys Thr Val Asp Ser Arg Pro Pro Ala Gln Leu Thr 1185 1190 1195 1200 Leu Ser His Gly Asp Gln Leu Val Ala Ser Ser Thr Glu Ala Ser Val 1205 1210 1215 Pro Asn Thr Leu Arg Leu Glu Leu Gln Asp Pro Arg Pro Ser Asn Glu 1220 1225 1230 Gly Leu Tyr Ser Cys Ser Ala His Ser Pro Leu Gly Lys Ala Asn Thr 1235 1240 1245 Ser Leu Glu Leu Leu Leu Glu Gly Val Arg Val Lys Met Asn Pro Ser 1250 1255 1260 Gly Ser Val Pro Glu Gly Glu Pro Val Thr Val Thr Cys Glu Asp Pro 1265 1270 1275 1280 Ala Ala Leu Ser Ser Ala Leu Tyr Ala Trp Phe His Asn Gly His Trp 1285 1290 1295 Leu Gln Glu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Gln Phe Leu Val Thr Thr Arg 1300 1305 1310 Ala His Ala Gly Ala Tyr Phe Cys Gln Val His Asp Thr Gln Gly Thr 1315 1320 1325 Arg Ser Ser Arg Pro Ala Ser Leu Gln Ile Leu Tyr Ala Pro Arg Asp 1330 1335 1340 Ala Val Leu Ser Ser Phe Arg Asp Ser Arg Thr Arg Leu Met Val Val 1345 1350 1355 1360 Ile Gln Cys Thr Val Asp Ser Glu Pro Pro Ala Glu Met Val Leu Ser 1365 1370 1375 His Asn Gly Lys Val Leu Ala Ala Ser His Glu Arg His Ser Ser Ala 1380 1385 1390 Ser Gly Ile Gly His Ile Gln Val Ala Arg Asn Ala Leu Arg Leu Gln 1395 1400 1405 Val Gln Asp Val Thr Leu Gly Asp Gly Asn Thr Tyr Val Cys Thr Ala 1410 1415 1420 Gln Asn Thr Leu Gly Ser Ile Ser Thr Thr Gln Arg Leu Leu Thr Glu 1425 1430 1435 1440 Thr Asp Ile Arg Val Thr Ala Glu Pro Gly Leu Asp Val Pro Glu Gly 1445 1450 1455 Thr Ala Leu Asn Leu Ser Cys Leu Leu Pro Gly Gly Ser Gly Pro Thr 1460 1465 1470 Gly Asn Ser Ser Phe Thr Trp Phe Trp Asn Arg His Arg Leu His Ser 1475 1480 1485 Ala Pro Val Pro Thr Leu Ser Phe Thr Pro Val Val Arg Ala Gln Ala 1490 1495 1500 Gly Leu Tyr His Cys Arg Ala Asp Leu Pro Thr Gly Ala Thr Thr Ser 1505 1510 1515 1520 Ala Pro Val Met Leu Arg Val Leu Tyr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Leu 1525 1530 1535 Ile Val Phe Val Glu Pro Gln Gly Gly His Gln Gly Ile Leu Asp Cys 1540 1545 1550 Arg Val Asp Ser Glu Pro Leu Ala Ile Leu Thr Leu His Arg Gly Ser 1555 1560 1565 Gln Leu Val Ala Ser Asn Gln Leu His Asp Ala Pro Thr Lys Pro His 1570 1575 1580 Ile Arg Val Thr Ala Pro Pro Asn Ala Leu Arg Val Asp Ile Glu Glu 1585 1590 1595 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Gln Thr Phe Ser Ser Gln Ala Asp Asn Pro Thr 100 105 110 Leu Thr Pro Ala Pro Gly Gly Gly Thr Asp Pro Pro Gly Val Pro Gly 115 120 125 Glu Arg Thr Val Pro Gly Thr Ile Pro Ala Asp Thr Ala Phe Pro Val 130 135 140 Asp Thr Pro Ser Leu Ala Arg Asn Ser Ser Ala Ala Ser Pro Thr His 145 150 155 160 Thr Ser Asn Val Ser Thr Thr Asp Ile Ser Ser Gly Ala Ser Leu Thr 165 170 175 Thr Leu Thr Pro Ser Thr Leu Gly Leu Ala Ser Thr Asp Pro Pro Ser 180 185 190 Thr Thr Ile Ala Thr Thr Thr Lys Gln Thr Cys Ala Ala Met Phe Gly 195 200 205 Asn Ile Thr Val Asn Tyr Thr Tyr Glu Ser Ser Asn Gln Thr Phe Lys 210 215 220 Ala Asp Leu Lys Asp Val Gln Asn Ala Lys Cys Gly Asn Glu Asp Cys 225 230 235 240 Glu Asn Val Leu Asn Asn Leu Glu Glu Cys Ser Gln Ile Lys Asn Ile 245 250 255 Ser Val Ser Asn Asp Ser Cys Ala Pro Ala Thr Thr Ile Asp Leu Tyr 260 265 270 Val Pro Pro Gly Thr Asp Lys Phe Ser Leu His Asp Cys Thr Pro Lys 275 280 285 Glu Lys Ala Asn Thr Ser Ile Cys Leu Glu Trp Lys Thr Lys Asn Leu 290 295 300 Asp Phe Arg Lys Cys Asn Ser Asp Asn Ile Ser Tyr Val Leu His Cys 305 310 315 320 Glu Pro Glu Asn Asn Thr Lys Cys Ile Arg Arg Asn Thr Phe Ile Pro 325 330 335 Glu Arg Cys Gln Leu Asp Asn Leu Arg Ala Gln Thr Asn Tyr Thr Cys 340 345 350 Val Ala Glu Ile Leu Tyr Arg Gly Val Lys Leu Val Lys Asn Val Ile 355 360 365 Asn Val Gln Thr Asp Leu Gly Ile Pro Glu Thr Pro Lys Pro Ser Cys 370 375 380 Gly Asp Pro Ala Ala Arg Lys Thr Leu Val Ser Trp Pro Glu Pro Val 385 390 395 400 Ser Lys Pro Glu Ser Ala Ser Lys Pro His Gly Tyr Val Leu Cys Tyr 405 410 415 Lys Asn Asn Ser Glu Lys Cys Lys Ser Leu Pro Asn Asn Val Thr Ser 420 425 430 Phe Glu Val Glu Ser Leu Lys Pro Tyr Lys Tyr Tyr Glu Val Ser Leu 435 440 445 Leu Ala Tyr Val Asn Gly Lys Ile Gln Arg Asn Gly Thr Ala Glu Lys 450 455 460 Cys Asn Phe His Thr Lys Ala Asp Arg Pro Asp Lys Val Asn Gly Met 465 470 475 480 Lys Thr Ser Arg Pro Thr Asp Asn Ser Ile Asn Val Thr Cys Gly Pro 485 490 495 Pro Tyr Glu Thr Asn Gly Pro Lys Thr Phe Tyr Ile Leu Val Val Arg 500 505 510 Ser Gly Gly Ser Phe Val Thr Lys Tyr Asn Lys Thr Asn Cys Gln Phe 515 520 525 Tyr Val Asp Asn Leu Tyr Tyr Ser Thr Asp Tyr Glu Phe Leu Val Ser 530 535 540 Phe His Asn Gly Val Tyr Glu Gly Asp Ser Val Ile Arg Asn Glu Ser 545 550 555 560 Thr Asn Phe Asn Ala Lys Ala Leu Ile Ile Phe Leu Val Phe Leu Ile 565 570 575 Ile Val Thr Ser Ile Ala Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp 580 585 590 Leu Arg Lys Lys Arg Ser Ser Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val 595 600 605 Glu Arg Asp Asp Glu Lys Gln Leu Met Asp Val Glu Pro Ile His Ser 610 615 620 Asp Ile Leu Leu Glu Thr Tyr Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg 625 630 635 640 Leu Phe Leu Ala Glu Phe Gln Ser Ile Pro Arg Val Phe Ser Lys Phe 645 650 655 Pro Ile Lys Asp Ala Arg Lys Pro His Asn Gln Asn Lys Asn Arg Tyr 660 665 670 Val Asp Ile Leu Pro Tyr Asp Tyr Asn Arg Val Glu Leu Ser Glu Ile 675 680 685 Asn Gly Asp Ala Gly Ser Thr Tyr Ile Asn Ala Ser Tyr Ile Asp Gly 690 695 700 Phe Lys Glu Pro Arg Lys Tyr Ile Ala Ala Gln Gly Pro Arg Asp Glu 705 710 715 720 Thr Val Asp Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp Glu Gln Lys Ala Thr Val 725 730 735 Ile Val Met Val Thr Arg Cys Glu Glu Gly Asn Arg Asn Lys Cys Ala 740 745 750 Glu Tyr Trp Pro Ser Met Glu Glu Gly Thr Arg Ala Phe Lys Asp Ile 755 760 765 Val Val Thr Ile Asn Asp His Lys Arg Cys Pro Asp Tyr Ile Ile Gln 770 775 780 Lys Leu Asn Val Ala His Lys Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Glu Val 785 790 795 800 Thr His Ile Gln Phe Thr Ser Trp Pro Asp His Gly Val Pro Glu Asp 805 810 815 Pro His Leu Leu Leu Lys Leu Arg Arg Arg Val Asn Ala Phe Ser Asn 820 825 830 Phe Phe Ser Gly Pro Ile Val Val His Cys Ser Ala Gly Val Gly Arg 835 840 845 Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ile Asp Ala Met Leu Glu Gly Leu Glu Ala 850 855 860 Glu Gly Lys Val Asp Val Tyr Gly Tyr Val Val Lys Leu Arg Arg Gln 865 870 875 880 Arg Cys Leu Met Val Gln Val Glu Ala Gln Tyr Ile Leu Ile His Gln 885 890 895 Ala Leu Val Glu Tyr Asn Gln Phe Gly Glu Thr Glu Val Asn Leu Ser 900 905 910 Glu Leu His Ser Cys Leu His Asn Met Lys Lys Arg Asp Pro Pro Ser 915 920 925 Asp Pro Ser Pro Leu Glu Ala Glu Tyr Gln Arg Leu Pro Ser Tyr Arg 930 935 940 Ser Trp Arg Thr Gln His Ile Gly Asn Gln Glu Glu Asn Lys Lys Lys 945 950 955 960 Asn Arg Asn Ser Asn Val Val Pro Tyr Asp Phe Asn Arg Val Pro Leu 965 970 975 Lys His Glu Leu Glu Met Ser Lys Glu Ser Glu Pro Glu Ser Asp Glu 980 985 990 Ser Ser Asp Asp Asp Ser Asp Ser Glu Glu Thr Ser Lys Tyr Ile Asn 995 1000 1005 Ala Ser Phe Val Met Ser Tyr Trp Lys Pro Glu Met Met Ile Ala Ala 1010 1015 1020 Gln Gly Pro Leu Lys Glu Thr Ile Gly Asp Phe Trp Gln Met Ile Phe 1025 1030 1035 1040 Gln Arg Lys Val Lys Val Ile Val Met Leu Thr Glu Leu Val Asn Gly 1045 1050 1055 Asp Gln Glu Val Cys Ala Gln Tyr Trp Gly Glu Gly Lys Gln Thr Tyr 1060 1065 1070 Gly Asp Met Glu Val Glu Met Lys Asp Thr Asn Arg Ala Ser Ala Tyr 1075 1080 1085 Thr Leu Arg Thr Phe Glu Leu Arg His Ser Lys Arg Lys Glu Pro Arg 1090 1095 1100 Thr Val Tyr Gln Tyr Gln Cys Thr Thr Trp Lys Gly Glu Glu Leu Pro 1105 1110 1115 1120 Ala Glu Pro Lys Asp Leu Val Ser Met Ile Gln Asp Leu Lys Gln Lys 1125 1130 1135 Leu Pro Lys Ala Ser Pro Glu Gly Met Lys Tyr His Lys His Ala Ser 1140 1145 1150 Ile Leu Val His Cys Arg Asp Gly Ser Gln Gln Thr Gly Leu Phe Cys 1155 1160 1165 Ala Leu Phe Asn Leu Leu Glu Ser Ala Glu Thr Glu Asp Val Val Asp 1170 1175 1180 Val Phe Gln Val Val Lys Ser Leu Arg Lys Ala Arg Pro Gly Val Val 1185 1190 1195 1200 Cys Ser Tyr Glu Gln Tyr Gln Phe Leu Tyr Asp Ile Ile Ala Ser Ile 1205 1210 1215 Tyr Pro Ala Gln Asn Gly Gln Val Lys Lys Thr Asn Ser Gln Asp Lys 1220 1225 1230 Ile Glu Phe His Asn Glu Val Asp Gly Gly Lys Gln Asp Ala Asn Cys 1235 1240 1245 Val Arg Pro Asp Gly Pro Leu Asn Lys Ala Gln Glu Asp Ser Arg Gly 1250 1255 1260 Val Gly Thr Pro Glu Pro Thr Asn Ser Ala Glu Glu Pro Glu His Ala 1265 1270 1275 1280 Ala Asn Gly Ser Ala Ser Pro Ala Pro Thr Gln Ser Ser 1285 1290 <210> 3 <211> 931 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Trp Gly Phe Trp Leu Leu Leu Phe Trp Gly Phe Ser Gly Met Tyr 1 5 10 15 Arg Trp Gly Met Thr Thr Leu Pro Thr Leu Gly Gln Thr Leu Gly Gly 20 25 30 Val Asn Glu Cys 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Leu Glu Thr Val Glu Ser Thr Met 450 455 460 Leu Ala Ala Leu Leu Ile Pro Ser Gly Asn Ala Ser Gln Met Ile Gln 465 470 475 480 Thr Glu Tyr Leu Asp Ile Glu Ser Lys Val Ile Asn Glu Glu Cys Lys 485 490 495 Glu Asn Glu Ser Ile Asn Leu Ala Ala Arg Gly Asp Lys Met Asn Val 500 505 510 Gly Cys Phe Ile Ile Lys Glu Ser Val Ser Thr Gly Ala Pro Gly Val 515 520 525 Ala Phe Val Ser Phe Ala His Met Glu Ser Val Leu Asn Glu Arg Phe 530 535 540 Phe Glu Asp Gly Gln Ser Phe Arg Lys Leu Arg Met Asn Ser Arg Val 545 550 555 560 Val Gly Gly Thr Val Thr Gly Glu Lys Lys Glu Asp Phe Ser Lys Pro 565 570 575 Ile Ile Tyr Thr Leu Gln His Ile Gln Pro Lys Gln Lys Ser Glu Arg 580 585 590 Pro Ile Cys Val Ser Trp Asn Thr Asp Val Glu Asp Gly Arg Trp Thr 595 600 605 Pro Ser Gly Cys Glu Ile Val Glu Ala Ser Glu Thr His Thr Val Cys 610 615 620 Ser Cys Asn Arg Met Ala Asn Leu Ala Ile Ile Met Ala Ser Gly Glu 625 630 635 640 Leu Thr Met Glu Phe Ser Leu Tyr Ile Ile Ser His Val Gly Thr Val 645 650 655 Ile Ser Leu Val Cys Leu Ala Leu Ala Ile Ala Thr Phe Leu Leu Cys 660 665 670 Arg Ala Val Gln Asn His Asn Thr Tyr Met His Leu His Leu Cys Val 675 680 685 Cys Leu Phe Leu Ala Lys Ile Leu Phe Leu Thr Gly Ile Asp Lys Thr 690 695 700 Asp Asn Gln Thr Ala Cys Ala Ile Ile Ala Gly Phe Leu His Tyr Leu 705 710 715 720 Phe Leu Ala Cys Phe Phe Trp Met Leu Val Glu Ala Val Met Leu Phe 725 730 735 Leu Met Val Arg Asn Leu Lys Val Val Asn Tyr Phe Ser Ser Arg Asn 740 745 750 Ile Lys Met Leu His Leu Cys Ala Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Val Leu 755 760 765 Val Val Ile Ile Ser Ala Ser Val Gln Pro Arg Gly Tyr Gly Met His 770 775 780 Asn Arg Cys Trp Leu Asn Thr Glu Thr Gly Phe Ile Trp Ser Phe Leu 785 790 795 800 Gly Pro Val Cys Met Ile Ile Thr Ile Asn Ser Val Leu Leu Ala Trp 805 810 815 Thr Leu Trp Val Leu Arg Gln Lys Leu Cys Ser Val Ser Ser Glu Val 820 825 830 Ser Lys Leu Lys Asp Thr Arg Leu Leu Thr Phe Lys Ala Ile Ala Gln 835 840 845 Ile Phe Ile Leu Gly Cys Ser Trp Val Leu Gly Ile Phe Gln Ile Gly 850 855 860 Pro Leu Ala Ser Ile Met Ala Tyr Leu Phe Thr Ile Ile Asn Ser Leu 865 870 875 880 Gln Gly Ala Phe Ile Phe Leu Ile His Cys Leu Leu Asn Arg Gln Val 885 890 895 Arg Asp Glu Tyr Lys Lys Leu Leu Thr Arg Lys Thr Asp Leu Ser Ser 900 905 910 His Ser Gln Thr Ser Gly Ile Leu Leu Ser Ser Met Pro Ser Thr Ser 915 920 925 Lys Met Gly 930 <210> 4 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Asp Ser Thr His Ala Thr Lys Ser Cys Leu Leu Ile Leu Leu Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Cys Ala Gly Arg Ala Gln Gly Leu Gln Cys Tyr Glu Cys 20 25 30 Tyr Gly Val Pro Ile Glu Thr Ser Cys Pro Ala Val Thr Cys Arg Ala 35 40 45 Ser Asp Gly Phe Cys Ile Ala Gln Asn Ile Glu Leu Ile Glu Asp Ser 50 55 60 Gln Arg Arg Lys Leu Lys Thr Arg Gln Cys Leu Ser Phe Cys Pro Ala 65 70 75 80 Gly Val Pro Ile Lys Asp Pro Asn Ile Arg Glu Arg Thr Ser Cys Cys 85 90 95 Ser Glu Asp Leu Cys Asn Ala Ala Val Pro Thr Ala Gly Ser Thr Trp 100 105 110 Thr Met Ala Gly Val Leu Leu Phe Ser Leu Ser Ser Val Ile Leu Gln 115 120 125 Thr Leu Leu 130 <210> 5 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Glu Arg Ala Ser Cys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val His 1 5 10 15 Val Ser Ala Thr Thr Pro Glu Pro Cys Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe 20 25 30 Arg Cys Val Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala 35 40 45 Phe Gln Cys Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu 50 55 60 Asn Leu Glu Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg 65 70 75 80 Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val 85 90 95 Gly Ala Ala Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val 100 105 110 Leu Ala Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile 115 120 125 Thr Gly Thr Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu 130 135 140 Ser Ser Leu Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp 145 150 155 160 Leu Ala Glu Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser 165 170 175 Ile Ala Gln Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Ala 180 185 190 Phe Pro Ala Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly 195 200 205 Glu Arg Gly Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile 210 215 220 Gln Asn Leu Ala Leu Arg Asn Thr Gly Met Glu Thr Pro Thr Gly Val 225 230 235 240 Cys Ala Ala Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu 245 250 255 Ser His Asn Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys 260 265 270 Met Trp Ser Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu 275 280 285 Glu Gln Val Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu 290 295 300 Ser Cys Asn Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu 305 310 315 320 Val Asp Asn Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly Thr 325 330 335 Ala Leu Pro His Glu Gly Ser Met Asn Ser Gly Val Val Pro Ala Cys 340 345 350 Ala Arg Ser Thr Leu Ser Val Gly Val Ser Gly Thr Leu Val Leu Leu 355 360 365 Gln Gly Ala Arg Gly Phe Ala 370 375

Claims (20)

  1. CD169(Cluster of Differentiation 169) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌암 진단용 조성물로,
    상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준은 뇌 조직 내 대식세포에 대하여 측정되는 것인, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    CD45(Cluster of Differentiation 45), F4/80(EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1) 및 CD14(Cluster of Differentiation 14)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 대식세포는 단핵구에서 유래되는, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 뇌암은 교모세포종인, 조성물.
  8. 제 1항의 진단용 조성물을 포함하는 뇌암 진단용 키트.
  9. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CD169(Cluster of Differentiation 169) CD45(Cluster of Differentiation 45), F4/80(EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1) 및 CD14(Cluster of Differentiation 14)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 뇌암 진단을 위한 정보 제공 방법으로,
    상기 생물학적 시료는 뇌 조직이고,
    상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준은 상기 뇌 조직 내 대식세포에 대하여 측정되는 것인, 방법.
  10. 삭제
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 대식세포는 CD169+CD14+F4/80low 대식세포인, 방법.
  12. 삭제
  13. 제 9항에 있어서,
    상기 대식세포는 단핵구에서 유래되는, 방법.
  14. 삭제
  15. 제 9항에 있어서,
    상기 뇌암은 교모세포종인, 방법.
  16. CD169 단백질 또는 이의 세포 외 도메인을 포함하는 대식세포를 유효 성분으로 포함하는, 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 대식세포는 CD45(Cluster of Differentiation 45), F4/80(EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1) 및 CD14(Cluster of Differentiation 14)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이의 세포 외 도메인을 더 포함하는, 약학적 조성물.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 대식세포는 단핵구에서 유래되는, 약학적 조성물.
  19. 삭제
  20. 제 16항에 있어서,
    상기 뇌암은 교모세포종인, 약학적 조성물.
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