KR102345699B1 - Composition of Bio-ink Comprising Human Derived Collagen and Methacrylated Low Molecular Weight Collagen and Method for Producing Tissue-Like Structure Using the Same - Google Patents

Composition of Bio-ink Comprising Human Derived Collagen and Methacrylated Low Molecular Weight Collagen and Method for Producing Tissue-Like Structure Using the Same Download PDF

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Abstract

본 발명은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포운반물질로 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 특정 함량 이상으로 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물은 높은 점탄성, 강한 구조 안정성, 우수한 프린팅성, 생체적합성 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내기 때문에 삼차원적 바이오 프린팅을 이용한 조직 유사 구조체의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a bio-ink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen, and a method for manufacturing a tissue-like structure using the same, and more particularly, human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen as a cell transport material. It relates to a bio-ink composition comprising a specific content or more and a method for manufacturing a tissue-like structure using the same.
The bio-ink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen of the present invention exhibits high viscoelasticity, strong structural stability, excellent printability, biocompatibility, and appropriate mechanical properties after printing. It can be very usefully used in the manufacture of similar structures.

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Figure 112020049356586-pat00001

Description

인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법{Composition of Bio-ink Comprising Human Derived Collagen and Methacrylated Low Molecular Weight Collagen and Method for Producing Tissue-Like Structure Using the Same}TECHNICAL FIELD [0002] Composition of Bio-ink Comprising Human Derived Collagen and Methacrylated Low Molecular Weight Collagen and Method for Producing Tissue-Like Structure Using the Same}

본 발명은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포운반물질로 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 특정 함량 이상으로 포함하는 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a bio-ink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen, and a method for manufacturing a tissue-like structure using the same, and more particularly, human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen as a cell transport material. It relates to a bio-ink composition containing more than a specific content and a method for manufacturing a tissue-like structure using the same.

삼차원적인 세포 배양기술은 실험실 내(in vitro)에서 생체조직과 유사한 환경에서 세포 및 조직을 제조할 수 있는 기술로 발달하여 세포의 성장과 분화, 조직 및 기관의 형성과 관련된 여러 연구 분야에 적용되고 있다. 이러한 조직 유사기관은 실제 조직이나 장기를 대신하여 약물의 독성 및 약물 동력학 연구에서 유용하게 사용될 수 있으며, 이에 따라 인간 검체 및 기타 포유동물에의 직접적인 실험 적용을 줄일 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 손상된 조직 및 장기를 대체 또는 치료하기 위한 목적인 조직공학(tissue engineering) 기법의 중요한 요소로 조직 및 장기의 공학적 설계에 기여하고 있다. Three-dimensional cell culture technology has developed into a technology that can manufacture cells and tissues in an environment similar to living tissue in vitro, and is applied to various research fields related to cell growth and differentiation, and formation of tissues and organs. have. These tissue-like organs can be usefully used in the study of drug toxicity and pharmacokinetics instead of actual tissues or organs, and accordingly, it is thought that direct experimental application to human samples and other mammals can be reduced. In addition, it is contributing to the engineering design of tissues and organs as an important element of tissue engineering techniques for the purpose of replacing or treating damaged tissues and organs.

삼차원 바이오 프린팅 기술은 이러한 조직 유사기관 및 이식 가능한 구조체를 정밀하게 제조하기 위한 유용한 장치가 되었다. 이러한 기술은 실제 인간의 조직을 거의 그대로 모방한 미세 및 거대 조직 구조체를 생성하는 것을 가능하게 하고 있다. 하지만 바이오 프린팅시 살아있는 세포를 운반하는 생체재료, 즉, 바이오 잉크(bio-ink)는 그 활용도에 있어서 많은 한계점을 나타내고 있다. 바이오 프린팅에 적용되기 위해 요구되는 바이오 잉크의 특성으로는 우수한 생체적합성이 요구되고, 미세구경의 디스펜싱 노즐(dispensing nozzle)을 원활히 통과하여 원하는 패턴으로 프린팅이 될 수 있는 우수한 프린팅성을 가져야 하며, 프린팅 후 세포-특이적 신호를 제공하면서 기계적인 지지체 역할을 유지할 수 있는 구조 안정성을 가져야 한다는 것 등이다. 비록, 삼차원 바이오 프린팅 분야에서 천연 유래 또는 합성 하이드로겔 바이오 잉크가 개발되어 현재 사용되고 있지만, 이러한 기존 하이드로겔을 바탕으로 한 바이오 잉크는 생체적합성, 프린팅 적합성, 기하학적 정밀성, 정밀도와 같은 물리적 및 생물학적 측면에서 상당한 한계점을 보이고 있다. 3D bioprinting technology has become a useful device for precisely manufacturing such tissue-like organs and implantable structures. This technology makes it possible to create microscopic and large tissue structures that mimic real human tissues almost as they are. However, biomaterials that transport living cells during bioprinting, that is, bio-ink, have many limitations in their utilization. As the characteristics of bio-ink required to be applied to bio-printing, excellent biocompatibility is required, and it must have excellent printability that can be printed in a desired pattern by smoothly passing through a micro-diameter dispensing nozzle, It should have structural stability that can maintain the mechanical support role while providing cell-specific signals after printing. Although, naturally-derived or synthetic hydrogel bio-inks have been developed and used in the field of 3D bio-printing, bio-inks based on such existing hydrogels are biocompatible, printing compatibility, geometrical precision, and precision in physical and biological aspects. It has significant limitations.

본 발명의 발명자들은 선행연구를 통해 특정한 함량의 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 공개한바 있다(한국공개특허 제10-2017-0012099호). 이를 통해, 전술한 종래기술의 문제점 중 일부가 해결되는 성과를 얻을 수 있었지만 손상된 조직 및 장기를 대체 또는 치료하기 위한 목적인 조직공학에는 적합하지 않은 구조 안정성, 정교한 생체조직을 모사하기 위한 프린팅 정밀성 등에서 여전히 한계점이 있다는 것을 발견하고 이를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭하였다. The inventors of the present invention have disclosed a bio-ink composition comprising a specific content of a cell carrier material, a viscosity enhancer, a lubricant, and a structural material through prior research (Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2017-0012099). Through this, some of the problems of the prior art described above could be solved, but structural stability not suitable for tissue engineering for the purpose of replacing or treating damaged tissues and organs, printing precision for simulating sophisticated biological tissues, etc. After discovering that there are limitations, intensive research was repeated to solve them.

이에, 종래 바이오 잉크 조성물에서 세포 운반물질로 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen)을 특정 함량 이상으로 포함할 경우 놀라울 정도로 향상된 구조 안정성 및 프린팅 정밀성을 갖는 바이오 잉크를 제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.Therefore, when the conventional bio-ink composition contains human-derived collagen and methacrylated low molecular weight collagen as a cell carrier material in a certain amount or more, a bio-ink having surprisingly improved structural stability and printing precision is produced. It was found that it can be prepared, and the present invention was completed.

본 발명의 목적은 세포 운반물질로 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 제공하는 데 있다. It is an object of the present invention to provide a bio-ink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen as cell transport materials.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 잉크 조성물을 이용한 조직 유사 구조체 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 조직 유사 구조체를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a tissue-like structure using the bio-ink composition and a tissue-like structure prepared by the method.

상기 목적을 달성하기 위해, In order to achieve the above purpose,

본 발명은 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하며, The present invention includes a cell carrier material, a viscosity enhancer, a lubricant and a structural material,

상기 세포 운반물질은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen)을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물을 제공한다.The cell transport material provides a bio-ink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low molecular weight collagen.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐의 분자량은 500 ~ 4000Da일 수 있다. In a preferred embodiment of the present invention, the molecular weight of the methacrylated low molecular weight collagen may be 500 ~ 4000Da.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 인체 유래 콜라겐은 콜라겐 타입 Ⅰ일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the human-derived collagen may be collagen type I.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물에 포함된 인체 유래 콜라겐은 0.1 ~ 10 w/v%일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the human-derived collagen contained in the bio-ink composition may be 0.1 to 10 w/v%.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물에 포함된 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 0.1 ~ 10 w/v%일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the methacrylated low molecular weight collagen contained in the bio-ink composition may be 0.1 to 10 w/v%.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 가교 전 점도(complex viscosity)는 0.5 ~ 2.0 Pa·s이며, 가교 후 점도는 40 ~ 3400 Pa·s일 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, the complex viscosity of the bio-ink composition before crosslinking may be 0.5 to 2.0 Pa·s, and the viscosity after crosslinking may be 40 to 3400 Pa·s.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 점도는 0.5 ~ 0.7 Pa·s, 가교 후 점도는 340 ~ 380 Pa·s일 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, when the frequency (Frequency) of the bio-ink composition is 1Hz, the viscosity before crosslinking may be 0.5 to 0.7 Pa·s, and the viscosity after crosslinking may be 340 to 380 Pa·s.

본 발멸은 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 가교 전 저장모듈러스(stroage modulus)는 0.4 ~ 3 Pa, 손실모듈러스(loss modulus)는 1 ~ 30 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2100 ~ 2400 Pa, 손실모듈러스는 180 ~ 300 Pa 일 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, the storage modulus before crosslinking of the bio-ink composition is 0.4 to 3 Pa, the loss modulus is 1 to 30 Pa, and the storage modulus after crosslinking is 2100 ~ 2400 Pa, the loss modulus may be 180 ~ 300 Pa.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 저장모듈러스는 2.7 ~ 3.1 Pa, 손실모듈러스는 2.5 ~ 2.9 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2230 ~ 2270 Pa, 손실모듈러스는 170 ~ 210 Pa일 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, when the frequency (Frequency) of the bio-ink composition is 1Hz, the storage modulus before crosslinking is 2.7 to 3.1 Pa, the loss modulus is 2.5 to 2.9 Pa, and the storage modulus after crosslinking is 2230 ~ 2270 Pa, the loss modulus may be 170 ~ 210 Pa.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물의 가교전 탄젠트 델타(tangent delta) 값은 0.5 ~ 1.5, 가교 후 탄젠트 델타 값은 11.5 ~ 12.5 일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the tangent delta value before crosslinking of the bio-ink composition may be 0.5 to 1.5, and the tangent delta value after crosslinking may be 11.5 to 12.5.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물은 상기 점성 증강제가 0.01 ~ 1 w/v%, 윤활제가 1 ~ 30 w/v% 및 구조물질이 0.1 ~ 10 w/v% 포함될 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, the bio-ink composition contains 0.01 to 1 w/v% of the viscosity enhancer, 1 to 30 w/v% of the lubricant, and 0.1 to 10 w/v% of the structural material. can

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 점성 증가제는 히알루론산 또는 덱스트란이며, 상기 윤활제는 글리세롤 및 상기 구조물질은 피브리노겐 또는 메타크릴화 젤라틴일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the viscosity increasing agent may be hyaluronic acid or dextran, the lubricant may be glycerol, and the structural material may be fibrinogen or methacrylated gelatin.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 바이오잉크 조성물은 0.05 ~ 60×106/mL의 세포를 추가로 포함할 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, the bio-ink composition may further include cells of 0.05 ~ 60 × 10 6 /mL.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the cells are stem cells, osteoblasts, myoblasts, tenocytes, neuroblasts, fibroblasts, and glioblasts. Glioblast, germ cell, hepatocyte, renal cell, Sertoli cell, chondrocyte, epithelial cell, cardiovascular cell, keratinocyte ), smooth muscle cells, cardiomyocytes, glial cells, endothelial cells, hormone-secreting cells, immune cells, pancreatic islet cells and neurons It may be at least one selected from the group consisting of.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함할 수 있다. In another preferred embodiment of the present invention, the composition may further include an optical initiator (photoinitiator).

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, In order to achieve another object of the present invention,

본 발명은 (a) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계; (b) 목적하는 삼차원 구조체를 삼차원 프린팅하는 단계; 및 (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 재생용 삼차원 구조체의 제조 방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of (a) filling the bio-ink composition in a three-dimensional printer; (b) three-dimensional printing of the desired three-dimensional structure; And (c) provides a method for producing a three-dimensional structure for tissue regeneration comprising the step of crosslinking the three-dimensional printed bio-ink composition.

또한, 본 발명은 (a) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계; (b) 목적하는 조직 유사 구조체를 삼차원 프린팅하는 단계; (c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사 구조체의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (a) filling the bio-ink composition in a three-dimensional printer; (b) three-dimensional printing of the desired tissue-like structure; (c) provides a method for preparing a tissue-like structure comprising the step of crosslinking the three-dimensionally printed bio-ink composition.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 방법은 (d) 상기 조직 유사 구조체를 배양액에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. In a preferred embodiment of the present invention, the method may further comprise (d) culturing the tissue-like construct in a culture medium.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 조직 유사 구조체 또는 조직 유사기관(organoid)을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a tissue-like structure or tissue-like organ (organoid) prepared according to the above method.

본 발명의 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오 잉크 조성물은 높은 점탄성, 강한 구조 안정성, 우수한 프린팅성, 생체적합성 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내기 때문에 삼차원적 바이오 프린팅을 이용한 조직 유사 구조체의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다. The bio-ink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen of the present invention exhibits high viscoelasticity, strong structural stability, excellent printability, biocompatibility, and appropriate mechanical properties after printing. It can be very usefully used in the manufacture of similar structures.

도 1은 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물(ColMA 바이오잉크) 및 젤라틴을 포함하는 바이오잉크 조성물(Cel4cell)의 가교 전(A) 및 가교 후(B)의 점도를 비교한 데이터이다.
도 2는 주파수 1Hz일 때 기준으로 가교 전 및 가교 후 바이오잉크 조성물의 점도를 비교한 데이터이다. 각 샘플넘버는 다음과 같다: 1) Gel4cell, 2) ColMA 1%, 3) ColMA 2%, 4) ColMA 3%, 5) ColMA 4%, 6) ColMA 5%.
도 3은 ColMA 바이오잉크 및 Cel4cell 바이오잉크의 가교 전(A) 및 가교 후(B)의 모듈러스를 비교한 데이터이다.
도 4는 주파수 1Hz일 때 기준으로 가교 전 및 가교 후 바이오잉크 조성물의 모듈러스를 비교한 데이터이다. 각 샘플넘버는 다음과 같다: 1) Gel4cell, 2) ColMA 1%, 3) ColMA 2%, 4) ColMA 3%, 5) ColMA 4%, 6) ColMA 5%.
도 5는 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물의 가교 전(A) 및 가교 후(B)의 점도를 비교한 데이터이다.
도 6은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물에 대해, 주파수 1Hz일 때 기준으로 가교 전 및 가교 후 바이오잉크 조성물의 점도를 비교한 데이터이다.
도 7은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물의 가교 전(A) 및 가교 후(B)의 모듈러스를 비교한 데이터이다.
도 8은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물에 대해, 주파수 1Hz일 때 기준으로 가교 전 및 가교 후 바이오잉크 조성물의 모듈러스를 비교한 데이터이다.
도 9는 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하는 바이오잉크 조성물에 대해, 주파수 1Hz일 때 기준으로 가교 전 및 가교 후의 탄젠트 델타(tangent delta; tanδ)값(A) 및 가교 후 탄젠트 델타 값의 상승률(B)을 확인한 데이터이다.1 is data comparing the viscosities before (A) and after (B) cross-linking of a bio-ink composition containing methacrylated low molecular weight collagen (ColMA bio-ink) and a bio-ink composition containing gelatin (Cel4cell) .
2 is data comparing the viscosity of the bio-ink composition before and after cross-linking based on a frequency of 1 Hz. Each sample number was as follows: 1) Gel4cell, 2) ColMA 1%, 3) ColMA 2%, 4) ColMA 3%, 5) ColMA 4%, 6) ColMA 5%.
3 is data comparing the modulus of ColMA bio-ink and Cel4cell bio-ink before (A) and after (B) cross-linking.
4 is data comparing the modulus of the bio-ink composition before and after cross-linking based on a frequency of 1 Hz. Each sample number was as follows: 1) Gel4cell, 2) ColMA 1%, 3) ColMA 2%, 4) ColMA 3%, 5) ColMA 4%, 6) ColMA 5%.
5 is data comparing the viscosities before (A) and after (B) cross-linking of a bio-ink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen.
6 is data comparing the viscosity of the bio-ink composition before and after cross-linking with respect to a bio-ink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen, based on a frequency of 1 Hz.
7 is data comparing the modulus before (A) and after (B) cross-linking of a bio-ink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen.
8 is data comparing the modulus of the bio-ink composition before and after cross-linking with respect to a bio-ink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen, based on a frequency of 1 Hz.
9 shows tangent delta (tanδ) values before and after crosslinking (A) and tangent delta after crosslinking for a bioink composition comprising human-derived collagen and methacrylated low molecular weight collagen, based on a frequency of 1 Hz. This is the data confirming the rate of increase (B) of the value.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 일관점에서 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하며, 상기 세포 운반물질은 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen)을 포함하는 것인 바이오 잉크 조성물에 관한 것이다. The present invention, in one aspect, includes a cell carrier material, a viscosity enhancer, a lubricant, and a structural material, wherein the cell carrier material includes human-derived collagen and methacrylated low molecular weight collagen. Bio-ink to the composition.

본 발명에서 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 식용으로 사용되는 저분자 콜라겐의 구조 안전성을 높이기 위해 메타크릴레이트(methacrylate) 반응을 진행한 것으로, 고비용의 고분자 콜라겐을 대체하여 세포의 점착이나 성장, 이동, 분화 등의 세포의 기능적인 면에 도움을 줌으로써 조직 재생 이외에도 많은 분야에 응용이 가능하다. In the present invention, the methacrylated low-molecular collagen is a methacrylate reaction to increase the structural safety of low-molecular-weight collagen used for food, and replaces high-cost high-molecular-weight collagen for cell adhesion, growth, migration, By helping functional aspects of cells such as differentiation, it can be applied to many fields other than tissue regeneration.

본 발명에서 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐이란 화학적 변형을 통하여 가교할 수 있도록 변형된 형태의 저분자 콜라겐을 의미하는 것으로서, 바람직하게는 500 ~ 4000 Da의 분자량을 가진다. In the present invention, the methacrylated low-molecular-weight collagen refers to a low-molecular-weight collagen modified to be cross-linked through chemical modification, and preferably has a molecular weight of 500 to 4000 Da.

상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 세포 운반물질 또는 구조물질로 사용될 수 있다. 세포 운반물질은 바이오 프린팅된 구조체 내에서 세포가 생존하기에 적합한 환경을 제공할 수 있는 물질로서, 생체적합성을 나타내어야 함은 물론이며 바이오 프린팅된 이후에 구조체에 안정성을 부여할 수 있는 적절한 물리적 강성 또한 나타내어야 한다. The methacrylated low molecular weight collagen may be used as a cell transport material or a structural material. The cell transport material is a material that can provide an environment suitable for cells to survive in the bioprinted structure, and should exhibit biocompatibility as well as adequate physical rigidity to provide stability to the structure after bioprinting. It should also be indicated.

따라서, 세포 운반물질로서 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 함께 사용할 경우, 세포 운반물질로 젤라틴만을 사용한 종래 바이오 잉크 조성물에 비해 프린팅 후 구조 안정성이 현저히 우수하고, 보다 정밀한 프린팅성을 나타내는 바이오잉크 조성물을 제조할 수 있다. 또한. 인체 유래 콜라겐을 사용함으로써 생체적합성을 보다 향상시킬 수 있는 장점이 있다.Therefore, when human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen are used together as a cell carrier material, the structural stability after printing is significantly superior and more precise printability compared to a conventional bio-ink composition using only gelatin as a cell carrier material. An ink composition can be prepared. Also. There is an advantage that biocompatibility can be further improved by using human-derived collagen.

또한, 상기 세포 운반물질에 젤라틴, 알기네이트, 아가(agar), 아가로스, 플루로닉(pluronic) 및 폴리비닐알콜로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 물질을 추가로 혼합하여 사용할 수 있다. In addition, any one or more materials selected from the group consisting of gelatin, alginate, agar, agarose, pluronic and polyvinyl alcohol may be additionally mixed and used in the cell transport material.

상기 점성 증강제는 우수한 프린팅 경향성 및 바이오 잉크의 초기 강성(strength)을 유지하는데 적합한 것을 선택할 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 히알루론산 또는 덱스트란일 수 있다. The viscosity enhancer may be selected to be suitable for maintaining excellent printing tendency and initial strength of the bio-ink, non-limiting examples thereof may be hyaluronic acid or dextran.

상기 윤활제는 전단율(shear rate)을 최소화할 수 있고, 분배 속도(dispensing speed)를 개선할 수 있는 물질 중에서 선택되는 것이 바람직하며, 이의 비제한적인 예시로는 글리세롤을 들 수 있다. The lubricant is preferably selected from materials capable of minimizing shear rate and improving dispensing speed, and non-limiting examples thereof include glycerol.

상기 구조물질은 빠른 가교결합의 형성 및 기계적 강성을 유지할 수 있는 물질로부터 선택되는 것이 바람직하며, 이의 비제한적인 예시로는 피브리노겐, 화학적으로 가교할 수 있도록 변형된 히알루론산(예, 메타아크릴레이티드 히알루론산, 사이올레이티드 히알루론산, 등), 화학적으로 가교할 수 있도록 변형된 젤라틴 (예, 젤라틴 메타아크릴레이티드, 사이올레이티드 젤라틴, 등), 알기네이트, 메틸 셀룰로오스, 키토산, 키틴, 합성펩타이드 및 폴리에틸렌 글리콜 기초의 하이드로겔로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. The structural material is preferably selected from materials capable of forming rapid crosslinking and maintaining mechanical rigidity, and non-limiting examples thereof include fibrinogen, chemically crosslinkable hyaluronic acid (eg, methacrylate). hyaluronic acid, thiolated hyaluronic acid, etc.), chemically crosslinkable gelatin (eg gelatin methacrylate, thiolated gelatin, etc.), alginate, methyl cellulose, chitosan, chitin, synthetic peptide And it may be any one or more selected from the group consisting of a polyethylene glycol-based hydrogel.

상기 피브리노겐은 겔의 안정성 측면에서 구조물질로서 적합할 뿐만 아니라, 세포가 프린팅된 이후에 세포의 부착 및 분화에 적합한 미세환경을 조성한다는 점에서 바람직한 구조물질로 선택될 수 있다. 히알루론산과 글리세롤은 각각 삼차원적 바이오 프린팅 적용시 분배 균일성(dispensing uniformity) 및 노즐의 막힘 방지효과 측면에서 본 발명의 조성물에 적합하게 사용될 수 있다. The fibrinogen is not only suitable as a structural material in terms of gel stability, but also can be selected as a preferable structural material in that it creates a microenvironment suitable for cell adhesion and differentiation after the cells are printed. Hyaluronic acid and glycerol may be suitably used in the composition of the present invention in terms of dispensing uniformity and nozzle clogging prevention effect when applying three-dimensional bioprinting, respectively.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 0.01 ~ 10 w/v%, 0.05 ~ 10 w/v%, 0.5 ~ 10 w/v%, 1 ~ 10 w/v%, 0.1 ~ 8 w/v%, 0.5 ~ 8 w/v%, 1 ~ 8 w/v%, 0.1 ~ 6 w/v%, 0.5 ~ 6 w/v%, 1 ~ 6 w/v%, 0.1 ~ 5 w/v%, 0.5 ~ 5 w/v% 또는 1 ~ 5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 ~ 4 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the bio-ink composition of the present invention, the methacrylated low molecular weight collagen is 0.01 to 10 w/v%, 0.05 to 10 w/v%, 0.5 to 10 w/v%, 1 to 10 w/v%, 0.1 to 8 w/v%, 0.5 to 8 w/v%, 1 to 8 w/v%, 0.1 to 6 w/v%, 0.5 to 6 w/v%, 1 to 6 w/v%, 0.1 to 5 w/ v%, 0.5 to 5 w/v% or 1 to 5 w/v% may be included, and most preferably 1 to 4 w/v% may be included, but is not limited thereto.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 인체 유래 콜라겐은 0.01 ~ 10 w/v%, 0.05 ~ 10 w/v%, 0.1 ~ 10 w/v%, 0.05 ~ 8 w/v%, 0.1 ~ 8 w/v%, 0.05 ~ 6 w/v%, 0.1 ~ 6 w/v%, 0.05 ~ 5 w/v% 또는 0.1 ~ 5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.1 ~ 4 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the bio-ink composition of the present invention, the human-derived collagen is 0.01 to 10 w/v%, 0.05 to 10 w/v%, 0.1 to 10 w/v%, 0.05 to 8 w/v%, 0.1 to 8 w/v %, 0.05-6 w/v%, 0.1-6 w/v%, 0.05-5 w/v% or 0.1-5 w/v%, most preferably 0.1-4 w/v% However, the present invention is not limited thereto.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 세포 운반물질은 0.01 ~ 10 w/v%, 0.05 ~ 10 w/v%, 0.5 ~ 10 w/v%, 1 ~ 10 w/v%, 1.5 ~ 10 w/v%, 2 ~ 10 w/v%, 0.1 ~ 8 w/v%, 0.5 ~ 8 w/v%, 1 ~ 8 w/v%, 2 ~ 8 w/v%, 0.1 ~ 6 w/v%, 0.5 ~ 6 w/v%, 1 ~ 6 w/v%, 2 ~ 6 w/v%, 0.1 ~ 5 w/v%, 0.5 ~ 5 w/v%, 1 ~ 5 w/v% 또는 2 ~ 5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 ~ 4 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the bio-ink composition of the present invention, the cell carrier material is 0.01 to 10 w/v%, 0.05 to 10 w/v%, 0.5 to 10 w/v%, 1 to 10 w/v%, 1.5 to 10 w/v %, 2 to 10 w/v%, 0.1 to 8 w/v%, 0.5 to 8 w/v%, 1 to 8 w/v%, 2 to 8 w/v%, 0.1 to 6 w/v%, 0.5 to 6 w/v%, 1 to 6 w/v%, 2 to 6 w/v%, 0.1 to 5 w/v%, 0.5 to 5 w/v%, 1 to 5 w/v%, or 2 to 5 w/v% may be included, and most preferably 1 to 4 w/v% may be included, but is not limited thereto.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 점성 증강제는 0.01 ~ 1 w/v%, 0.05 ~ 1 w/v%, 0.1 ~ 1 w/v%, 0.2 ~ 1 w/v%, 0.01 ~ 0.8 w/v%, 0.05 ~ 0.8 w/v%, 0.1 ~ 0.8 w/v%, 0.2 ~ 0.8 w/v%, 0.01 ~ 0.5 w/v%, 0.05 ~ 0.5 w/v% 또는 0.1 ~ 0.5 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.2 ~ 0.4 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the bio-ink composition of the present invention, the viscosity enhancer is 0.01 to 1 w/v%, 0.05 to 1 w/v%, 0.1 to 1 w/v%, 0.2 to 1 w/v%, 0.01 to 0.8 w/v% , 0.05 to 0.8 w/v%, 0.1 to 0.8 w/v%, 0.2 to 0.8 w/v%, 0.01 to 0.5 w/v%, 0.05 to 0.5 w/v%, or 0.1 to 0.5 w/v% and most preferably 0.2 to 0.4 w/v%, but is not limited thereto.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 윤활제는 0.1 ~ 30 w/v%, 1 ~ 30 w/v%, 5 ~ 30 w/v%, 10 ~ 30 w/v%, 0.1 ~ 20 w/v%, 1 ~ 20 w/v%, 5 ~ 20 w/v%, 10 ~ 20 w/v%, 0.1 ~ 15 w/v%, 1 ~ 15 w/v%, 5 ~ 15 w/v% 또는 10 ~ 15 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 10 ~ 13 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the bio-ink composition of the present invention, the lubricant is 0.1-30 w/v%, 1-30 w/v%, 5-30 w/v%, 10-30 w/v%, 0.1-20 w/v%, 1 to 20 w/v%, 5 to 20 w/v%, 10 to 20 w/v%, 0.1 to 15 w/v%, 1 to 15 w/v%, 5 to 15 w/v%, or 10 to 15 w/v% may be included, and most preferably 10 to 13 w/v% may be included, but is not limited thereto.

본 발명의 바이오 잉크 조성물에서 상기 구조물질은 0.1 ~ 10 w/v%, 0.5 ~ 10 w/v%, 1 ~ 10 w/v%, 0.1 ~ 8 w/v%, 0.5 ~ 8 w/v%, 1 ~ 8 w/v%, 0.1 ~ 10 w/v%, 0.5 ~ 10 w/v% 또는 3 ~ 10 w/v% 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 3 ~ 7 w/v% 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the bio-ink composition of the present invention, the structural material is 0.1 to 10 w/v%, 0.5 to 10 w/v%, 1 to 10 w/v%, 0.1 to 8 w/v%, 0.5 to 8 w/v% , 1 to 8 w/v%, 0.1 to 10 w/v%, 0.5 to 10 w/v% or 3 to 10 w/v% may be included, and most preferably 3 to 7 w/v% may be included. , but is not limited thereto.

본 발명의 발명자들은 삼차원적 바이오 프린팅에 적용되기에 적합한 물리적 및 생물학적 특성을 나타내는 바이오 잉크 조성물을 개발하기 위해 다양한 조합의 구성을 갖는 조성물의 물리적 및 생물학적 특성을 테스트하여 본 결과, 상기 조합 및 상기 함량의 구성성분의 조합으로 이루어진 바이오 잉크 조성물이 높은 구조 안정성, 우수한 프린팅 성능 및 프린팅 후 적절한 기계적 특성을 나타내어 조직 유사 구조체의 제조를 위한 삼차원적 바이오 프린팅에 특히 적합하다는 것을 발견하였다. The inventors of the present invention tested the physical and biological properties of compositions having various combinations of compositions in order to develop a bio-ink composition that exhibits physical and biological properties suitable for application to three-dimensional bioprinting, and as a result, the combination and the content It has been found that a bio-ink composition composed of a combination of components exhibits high structural stability, excellent printing performance, and appropriate mechanical properties after printing, making it particularly suitable for three-dimensional bioprinting for the production of tissue-like structures.

상기 바이오잉크 조성물은 (a) 점성증가제와 구조물질을 혼합하여 교반하는 단계; (b) 상기 교반 용액에 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 첨가하여 교반하는 단계; 및 (c) 상기 교반 용액에 윤활제를 첨가하여 교반하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.The bio-ink composition comprises the steps of: (a) mixing and stirring a viscosity increasing agent and a structural material; (b) adding and stirring methacrylated low molecular weight collagen to the stirring solution; and (c) adding a lubricant to the stirring solution and stirring.

상기 바이오잉크 조성물의 가교 전 점도(complex viscosity)는 0.5 ~ 2.0 Pa·s이며, 가교 후 점도는 40 ~ 3400 Pa·s일 수 있다. 보다 바람직하게 주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 저장모듈러스는 2.7 ~ 3.1 Pa, 손실모듈러스는 2.5 ~ 2.9 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2230 ~ 2270 Pa, 손실모듈러스는 170 ~ 210 Pa일 수 있다. The bio-ink composition may have a complex viscosity of 0.5 to 2.0 Pa·s before crosslinking, and a viscosity of 40 to 3400 Pa·s after crosslinking. More preferably, when the frequency (Frequency) is 1Hz, the storage modulus before crosslinking is 2.7 ~ 3.1 Pa, the loss modulus is 2.5 ~ 2.9 Pa, and the storage modulus after crosslinking is 2230 ~ 2270 Pa, and the loss modulus may be 170 ~ 210 Pa .

상기 바이오잉크 조성물의 가교 전 저장모듈러스(stroage modulus)는 0.4 ~ 3 Pa, 손실모듈러스(loss modulus)는 1 ~ 30 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2100 ~ 2400 Pa, 손실모듈러스는 180 ~ 300 Pa 일 수 있다. 보다 바람직하게 주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 저장모듈러스는 2.7 ~ 3.1 Pa, 손실모듈러스는 2.5 ~ 2.9 Pa 이며, 가교 후 저장모듈러스는 2230 ~ 2270 Pa, 손실모듈러스는 170 ~ 210 Pa일 수 있다. The storage modulus before crosslinking of the bio-ink composition is 0.4 to 3 Pa, the loss modulus is 1 to 30 Pa, and the storage modulus after crosslinking is 2100 to 2400 Pa, and the loss modulus is 180 to 300 Pa. can More preferably, when the frequency (Frequency) is 1Hz, the storage modulus before crosslinking is 2.7 ~ 3.1 Pa, the loss modulus is 2.5 ~ 2.9 Pa, and the storage modulus after crosslinking is 2230 ~ 2270 Pa, and the loss modulus may be 170 ~ 210 Pa .

상기 바이오잉크 조성물의 가교전 탄젠트 델타(tangent delta) 값은 0.5 ~ 1.5, 가교 후 탄젠트 델타 값은 10 ~ 14 일 수 있다.A tangent delta value before crosslinking of the bio-ink composition may be 0.5 to 1.5, and a tangent delta value after crosslinking may be 10 to 14.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 세포 운반물질로 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 바이오잉크 조성물로 적합한지 확인하기 위해, 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 1 w/v%, 2 w/v% 3 w/v%, 4 w/v% 및 5 w/v%가 되도록 바이오잉크 조성물(ColMA)을 각각 제조하였으며, 세포 운반물질로 메타크릴화된 저분자 콜라겐 대신 젤라틴을 포함하는 바이오잉크 조성물(Gel4cell)을 비교예로 사용하였다.In a specific embodiment of the present invention, in order to confirm that low molecular weight collagen methacrylated as a cell carrier material is suitable as a bioink composition, 1 w/v%, 2 w/v% 3 w/ A bio-ink composition (ColMA) was prepared to be v%, 4 w/v%, and 5 w/v%, respectively, and a bio-ink composition (Gel4cell) containing gelatin instead of methacrylated low-molecular collagen as a cell carrier material was compared. used as an example.

본 발명에서 제조된 ColMA 바이오잉크 조성물 및 Gel4cell 바이오잉크 조성물의 물성을 비교한 결과, 가교 전후 ColMA 바이오잉크는 Gel4cell 바이오잉크에 비해 유사한거나 높은 점도(도 1) 및 모듈러스(도 3)를 보이는 것을 확인하였으며, 특히 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%일 때 점도가 가장 우수한 것으로 확인되었다. As a result of comparing the physical properties of the ColMA bio-ink composition and the Gel4cell bio-ink composition prepared in the present invention, it was confirmed that the ColMA bio-ink before and after cross-linking showed similar or higher viscosity (FIG. 1) and modulus (FIG. 3) compared to the Gel4cell bio-ink In particular, it was confirmed that the viscosity was the best when the methacrylated low molecular weight collagen content was 1 w/v%.

또한, 주파수 1Hz일 때 기준으로 점도 및 모듈러스를 비교한 결과, 가교 전후 모두 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 1 w/v% 포함된 경우, 점도, 저장모듈러스 및 손실 모듈러스 모두 최대값을 보이는 것을 확인하였다. In addition, as a result of comparing the viscosity and modulus based on the frequency of 1 Hz, it was confirmed that the viscosity, storage modulus, and loss modulus all showed maximum values when 1 w/v% of methacrylated low-molecular collagen was included before and after crosslinking. .

즉, 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%로 포함된 바이오잉크 조성물(ColMA 1%)의 기계적 물성이 젤리틴이 포함된 바이오잉크 조성물(Gel4cell)에 비해 기계적 물성이 우수한 것을 확인하였다. That is, it was confirmed that the mechanical properties of the bio-ink composition (ColMA 1%) containing methacrylated low-molecular collagen at 1 w/v% were superior to those of the bio-ink composition (Gel4cell) containing jellytin. .

또한, 본 발명의 다른 구체적인 구현예에서, 보다 우수한 생체 접합성 및 프린팅 후 기계적 특성을 나타내는 바이오잉크를 제조하기 위해, 세포 운반물질로 인체유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 모두 포함된 바이오잉크 조성물을 제조하였다. 그 결과, 인체유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 모두 포함된 바이오잉크 조성물의 경화 후 점도, 저장모듈러스 및 손실 모듈러스가 모두 증가한 것을 확인하였을 뿐만 아니라(도 5 ~ 도 8), 가교 전의 탄젠트 델타값에 비해 가교 후의 탄젠트 델타값 역시 현저하게 상승하는 것을 확인하였다.In addition, in another specific embodiment of the present invention, a bio-ink composition containing both human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen as a cell carrier material in order to produce a bio-ink that exhibits better bio-adhesiveness and mechanical properties after printing was prepared. As a result, it was confirmed that the viscosity, storage modulus, and loss modulus all increased after curing of the bio-ink composition containing both human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen ( FIGS. 5 to 8 ), and tangent delta before cross-linking It was confirmed that the tangent delta value after crosslinking also significantly increased compared to the value.

따라서, 본 발명의 인체유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함한 바이오잉크 조성물은 세포 운반물질로 젤라틴만을 사용한 종래 바이오 잉크 조성물(Gel4cell)에 비해 우수한 물성을 가진 구조체의 제작이 가능한 것을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that the bio-ink composition containing human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen of the present invention can produce a structure with superior physical properties compared to the conventional bio-ink composition (Gel4cell) using only gelatin as a cell carrier material.

한편, 본 발명의 상기 바이오 잉크 조성물은 세포 0.05 ~ 60×106/mL을 포함할 수 있다.On the other hand, the bio-ink composition of the present invention may contain cells 0.05 to 60 × 10 6 /mL.

본 발명에서 상기 세포는 바람직하게는, 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the cells are preferably stem cells, osteoblasts, myoblasts, tenocytes, neuroblasts, fibroblasts, glioblasts, embryos. Cells (germ cells), hepatocytes (hepatocytes), renal cells (renal cells), atrial cells (Sertoli cells), chondrocytes (chondrocytes), epithelial cells (epithelial cells), cardiovascular cells, keratinocytes, smooth muscle cells ( smooth muscle cells), cardiomyocytes, glial cells, endothelial cells, hormone-secreting cells, immune cells, pancreatic islet cells, and neurons selected from the group consisting of It may be any one or more, but is not limited thereto.

본 발명에서 사용되는 상기 세포 및 바이오 프린팅된 조직 유사 구조체 내에 포함된 세포는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 및 조직 배양 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures;Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본 발명에 참고 인용된다. 일반적인 포유동물 세포 배양 기술, 세포주, 및 본 발명과 함께 사용될 수 있는 세포 배양 시스템이 또한 문헌[Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G., (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본 발명에 참고 인용된다.The cells used in the present invention and the cells contained in the bioprinted tissue-like construct may be cultured in any manner known in the art. Cell and tissue culture methods are known in the art and are described, for example, in Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures; Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques; The content thereof is incorporated herein by reference. Common mammalian cell culture techniques, cell lines, and cell culture systems that may be used with the present invention are also described in Doyle, A., Griffiths, JB, Newell, DG, (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998), the contents of which are incorporated herein by reference.

세포는 또한 원하는 세포주를 따라 세포의 분화를 유도하는 세포 분화 물질과 배양될 수도 있다. 예를 들면, 줄기세포는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 됨으로써 일정 범위의 세포 유형을 생성한다. 다수 유형의 분화 배지가 적당하다. 상기 줄기세포는 비제한적 예로서 골원성(osteogenic) 분화 배지, 연골원성(chondrogenic) 분화 배지, 지방생성(adipogenic) 분화 배지, 신경 분화 배지, 심근세포 분화 배지, 및 장세포 분화 배지(예, 장표피)를 포함하는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 될 수 있다. Cells may also be cultured with a cell differentiation material that induces differentiation of cells along a desired cell line. For example, stem cells are incubated in contact with a differentiation medium to generate a range of cell types. Many types of differentiation media are suitable. The stem cells include, but are not limited to, osteogenic differentiation medium, chondrogenic differentiation medium, adipogenic differentiation medium, neural differentiation medium, cardiomyocyte differentiation medium, and enterocyte differentiation medium (eg, intestinal epidermis) and incubated in contact with a differentiation medium containing

본 발명에서 상기 세포는 삼차원적 바이오프린터로부터 바이오 잉크를 침착 또는 압출시킴으로써 바이오 프린팅될 수 있다. 본 발명의 바이오 잉크는 복수의 세포를 포함하는 액체, 반고체, 또는 고체 조성물의 형태일 수 있다. 바이오 잉크는 액체 또는 반고체 세포 용액, 세포 현탁액, 또는 세포 농축물을 포함한다. 상기 바이오 잉크 조성물은 1) 복수의 세포 또는 세포 응집체와 생체적합성 액체 또는 겔을 소정의 비율에서 혼합하여 바이오잉크를 제조하는 단계, 및 2) 바이오 잉크를 치밀화하여 원하는 세포 밀도 및 점도를 갖는 바이오 잉크를 제조하는 단계 등에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 바이오 잉크의 치밀화는 원심분리, 접선류 여과("TFF"), 또는 이의 조합에 의해 실현되며 바이오 잉크의 치밀화는 압출가능한 조성물을 제조하여 다세포 응집체 또는 다세포체를 형성한다. 상기 "압출가능한"이란 노즐(nozzle) 또는 오리피스(예, 하나 이상의 구멍 또는 튜브)를 (예를 들어, 압력 하에서) 통과시킴으로써 성형될 수 있는 것을 의미한다. 또한, 바이오 잉크의 치밀화는 적당한 밀도로 세포를 성장시키는 것으로부터 유도된다. 바이오 잉크에 필요한 세포 밀도는 사용할 세포 및 제조할 조직 또는 장기에 따라 달라진다.In the present invention, the cells may be bioprinted by depositing or extruding bio-ink from a three-dimensional bioprinter. The bio-ink of the present invention may be in the form of a liquid, semi-solid, or solid composition including a plurality of cells. Bio-inks include liquid or semi-solid cell solutions, cell suspensions, or cell concentrates. The bio-ink composition is prepared by 1) mixing a plurality of cells or cell aggregates and a biocompatible liquid or gel in a predetermined ratio to prepare a bio-ink, and 2) densifying the bio-ink to have a desired cell density and viscosity. It can be prepared by the step of preparing and the like. Specifically, densification of bio-inks is realized by centrifugation, tangential flow filtration (“TFF”), or a combination thereof, and densification of bio-inks produces extrudable compositions to form multicellular aggregates or multicellular bodies. The term “extrudable” means capable of being molded by passing (eg, under pressure) through a nozzle or orifice (eg, one or more holes or tubes). In addition, the densification of the bio-ink is derived from growing cells to an appropriate density. The cell density required for a bio-ink depends on the cells to be used and the tissue or organ to be manufactured.

본 발명의 상기 바이오 잉크 조성물은 구성성분의 가교결합을 촉진하기 위한 가교제 또는 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함할 수 있다. The bio-ink composition of the present invention may further include a cross-linking agent or an optical initiator (photoinitiator) for promoting cross-linking of the components.

상기 가교제는 통상적인 하이드로겔 조성물에 사용되는 다가 금속이온을 포함하는 화합물일 수 있다. 다가 금속이온 화합물은 알루미늄 화합물, 칼슘 화합물 및 마그네슘 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 수산화알루미늄, 함수규산알루미늄, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화알루미늄, 메타규산알루미늄산마그네슘, 아세트산알루미늄 및 규산알루미늄산마그네슘으로 구성되는 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다.The crosslinking agent may be a compound containing a polyvalent metal ion used in a conventional hydrogel composition. The polyvalent metal ion compound is preferably selected from the group consisting of an aluminum compound, a calcium compound and a magnesium compound. For example, it may be one or more selected from the group consisting of aluminum hydroxide, hydrous aluminum silicate, calcium chloride, magnesium chloride, aluminum chloride, magnesium alumina metasilicate, aluminum acetate, and magnesium aluminum silicate.

상기 광학개시제는 빛에 노출됨에 따라 신속한 가교결합을 유발하는 물질을 의미한다. 본 발명에서 상기 광학개시제의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 자외선(UV)의 조사에 의해 가교반응이 일어나는 광학개시제 또는 가시광선의 조사에 의해 가교반응이 일어나는 광학개시제가 사용이 될 수 있다. 적절한 광학개시제의 비제한적인 예시로는, 아세토페논, 벤조인 메틸 에티르, 디에톡시아세토페논, 벤조일 포스핀 옥사이드 및 1-히드록시사이클로헥실 페닐 케톤, 에오신 등을 들 수 있다. 첨가되는 광학개시제의 양은 노출되는 빛의 파장 및 시간에 따라 달라질 수 있다. The optical initiator refers to a material that induces rapid crosslinking upon exposure to light. In the present invention, the type of the optical initiator is not particularly limited, but an optical initiator in which a crosslinking reaction occurs by irradiation of ultraviolet (UV) light or an optical initiator in which a crosslinking reaction occurs by irradiation of visible light may be used. Non-limiting examples of suitable optical initiators include acetophenone, benzoin methyl ethyr, diethoxyacetophenone, benzoyl phosphine oxide and 1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone, eosin, and the like. The amount of the added optical initiator may vary depending on the wavelength and time of the light to be exposed.

본 발명은 다른 관점에서, The present invention from another point of view,

(a) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계; (a) filling the bio-ink composition in a three-dimensional printer;

(b) 목적하는 삼차원 구조체를 삼차원 프린팅하는 단계; 및 (b) three-dimensional printing of the desired three-dimensional structure; and

(c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 재생용 삼차원 구조체의 제조방법에 관한 것이다.(c) relates to a method for producing a three-dimensional structure for tissue regeneration comprising the step of crosslinking the three-dimensionally printed bio-ink composition.

본 발명은 또 다른 관점에서, In another aspect, the present invention

(a) 상기 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계; (a) filling the bio-ink composition in a three-dimensional printer;

(b) 목적하는 조직 유사 구조체를 삼차원 프린팅하는 단계; 및 (b) three-dimensional printing of the desired tissue-like structure; and

(c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합 시키는 단계를 포함하는 조직 유사 구조체의 제조 방법에 관한 것이다. (c) relates to a method for producing a tissue-like structure comprising the step of crosslinking the three-dimensionally printed bio-ink composition.

상기 방법은 (d) 상기 조직 유사 구조체를 배양액에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 조직 유사 구조체의 배양을 통해 조직 유사 기관(organoid)을 제조할 수 있다.The method may further include the step of (d) culturing the tissue-like structure in a culture medium, and a tissue-like organoid may be prepared through the culturing of the tissue-like structure.

또한, 필요에 따라 상기 조직 유사 구조체는 세포를 포함한 바이오잉크 조성물을 프린팅하여 제조할 수 있으며, 세포를 포함하지 않은 바이오잉크 조성물을 프린팅 하여 구조체를 제조한 후, 구조체에 세포를 추가하여 배양할 수 있다.In addition, if necessary, the tissue-like structure can be prepared by printing a bio-ink composition containing cells, and after preparing the structure by printing a bio-ink composition containing no cells, cells can be added to the structure and cultured. have.

본 발명에서 제공되는 바이오 잉크 조성물은 다양한 조직 재생용 삼차원 구조체, 조직 유사 구조체 또는 조직 유사기관의 제조에 용이하다. 바이오 프린팅 기술은 삼차원 구조체 또는 조직 유사 구조체를 제조하기 위한 유용한 도구로서 당업계에서 발전되고 있다. 한편, 바이오 프린팅에 사용되기 위한 종래의 바이오 잉크 조성물들은 액상 형태이기 때문에 충분한 물리적 강성을 갖기가 힘들거나, 또는 지나치게 물리적 강성이 강하여 프린팅 과정에서 세포의 생존이 충분히 보장되지 않는다는 문제점이 있었다. 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 삼차원적 바이오 프린팅에 적용하여 조직 유사 구조체를 제조함에 있어서 충분한 물리적 강성은 유지하고, 바이오 프린터에 의해 분사됨에 있어서 세포의 생존이 충분히 보장된다는 장점이 있어 조직 유사 구조체의 제조에 굉장히 적합한 물리적 및 생물학적 특성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 일실시예에 따르면 본 발명의 바이오 잉크 조성물은 종래 젤라틴만을 세포 운반물질로 사용한 바이오 잉크 조성물과 비교하여 정교한 프린팅 성능을 나타내는 것으로 확인되었다. The bio-ink composition provided in the present invention is easy to manufacture various three-dimensional structures for tissue regeneration, tissue-like structures, or tissue-like organs. Bioprinting technology is being developed in the art as a useful tool for manufacturing three-dimensional structures or tissue-like structures. On the other hand, conventional bio-ink compositions for use in bio-printing have a problem in that it is difficult to have sufficient physical rigidity because they are in a liquid form, or the survival of cells during the printing process is not sufficiently ensured due to excessive physical rigidity. The bio-ink composition of the present invention is applied to three-dimensional bioprinting to maintain sufficient physical rigidity in preparing a tissue-like structure, and has the advantage that the survival of cells is sufficiently guaranteed when sprayed by a bio-printer. It exhibits very suitable physical and biological properties for In addition, according to an embodiment of the present invention, it was confirmed that the bio-ink composition of the present invention exhibits sophisticated printing performance compared to the conventional bio-ink composition using only gelatin as a cell carrier material.

본 발명에서의 바이오 잉크 조성물은 삼차원적인 구조체의 적층을 가능하게 한다. 충분한 양의 세포가 포함된 본 발명의 바이오 잉크 조성물이 삼차원 바이오 프린터에 의해 적층됨으로써 조직 유사 구조체를 형성하는데 이용될 수 있다. The bio-ink composition in the present invention enables the lamination of three-dimensional structures. The bio-ink composition of the present invention containing a sufficient amount of cells can be used to form a tissue-like structure by being laminated by a three-dimensional bio-printer.

본 발명에서의 "바이오 프린팅"이란 자동화된, 컴퓨터 보조의, 삼차원 시제품화 장치(예, 바이오프린터)와 상용되는 방법론을 통해 삼차원의 정확한 세포 침착(예, 세포 용액, 세포 함유 겔, 세포 현탁액, 세포 농축물, 다세포 응집체, 다세포체 등)을 이용하는 것을 의미한다. In the present invention, "bioprinting" means accurate three-dimensional cell deposition (e.g., cell solution, cell-containing gel, cell suspension, cell concentrates, multicellular aggregates, multicellular bodies, etc.).

본 발명에서의 바이오 프린팅 방법은 연속 및/또는 실질적으로 연속이다. 연속 바이오 프린팅 방법의 비제한적 예는 바이오 잉크의 저장소에 연결되는 분사 팁(dispense tip) (예, 주사기, 모세관 등)을 통해 바이오 프린터로부터 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 연속 바이오 프린팅 방법은 기능 단위의 반복 패턴에서 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 상기 반복 기능 단위는 예를 들어 원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 다각형, 및 불규칙 기하구조를 포함하는 임의의 적당한 기하구조를 갖는다. 또한, 바이오 프린팅된 기능 단위의 반복 패턴은 층을 포함하고 복수의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 바이오 프린팅 될 수 있다.(예를 들면, 적층된다). 구체적으로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 바이오 프린팅 될 수 있다.The bioprinting method in the present invention is continuous and/or substantially continuous. A non-limiting example of a continuous bioprinting method is to eject bio-ink from a bio-printer through a dispense tip (eg, syringe, capillary, etc.) connected to a reservoir of bio-ink. The continuous bioprinting method is to eject bio-ink in a repeating pattern of functional units. The repeating functional unit may have any suitable geometry including, for example, circles, squares, rectangles, triangles, polygons, and irregular geometries. In addition, a repeating pattern of bioprinted functional units can be bioprinted (eg, laminated) contiguously to include layers and multiple layers to form an engineered tissue or organ. Specifically, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or more layers may be contiguously bioprinted to form an engineered tissue or organ.

바이오 프린팅된 기능 단위는 격자무늬(tessellated) 패턴으로 반복될 수 있다. "격자무늬 패턴"은 중첩되지 않고 갭이 없는 평면을 충전하는 평면 도형이다. 연속 및/또는 격자무늬 바이오프린팅의 이점은 바이오 프린팅된 조직의 증가된 생산성을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적 잠재적 이점은 이전에 침착된 바이오 잉크의 요소와 바이오 프린터를 정렬할 필요를 없앨 수 있다는 것이다. 연속 바이오프린팅은 또한 경우에 따라 시린지 메커니즘을 사용하여 바이오 잉크의 대형 저장소로부터 보다 큰 조직을 인쇄하는 것을 용이하게 할 수 있다.The bioprinted functional units may be repeated in a tessellated pattern. A "lattice pattern" is a planar figure that fills a non-overlapping, gap-free plane. Advantages of continuous and/or grid bioprinting may include increased productivity of bioprinted tissue. Another non-limiting potential advantage is that it may eliminate the need to align the bioprinter with elements of the previously deposited bioink. Continuous bioprinting may also facilitate printing of larger tissues from large reservoirs of bio-ink, optionally using a syringe mechanism.

바이오 프린터로부터 적당한 및/또는 최적의 분사 거리는 재료 편평화 또는 분사 바늘에의 부착화를 생성하지 않는다. 바이오 프린터 분사 팁은 약 1, 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ㎛ 이상 및 이 범위 내의 증분의 내경을 갖는다. 또한, 바이오 프린터의 바이오 잉크 저장소는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 입방 센티미터 이상 및 이 범위 내의 증분의 용적을 갖는다. 펌프 속도는 시스템에서의 잔류 압력 상승이 낮을 경우 적당하고/하거나 최적일 수 있다. 양호한 펌프 속도는 저장소의 단면적과 분사 바늘 사이의 비율에 의존할 수 있고, 보다 높은 비율은 보다 낮은 펌프 속도를 필요로 한다.A suitable and/or optimal jet distance from the bioprinter does not produce flattening of the material or adhesion to the jet needle. Bioprinter jet tips are approximately 1, 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 μm or greater, and increments within this range. Also, the bio-ink reservoir of the bio printer is about 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 cubic centimeters or more and volumes in increments within this range. The pump speed may be moderate and/or optimal when the residual pressure rise in the system is low. A good pump speed may depend on the ratio between the dispense needle and the cross-sectional area of the reservoir, with higher ratios requiring lower pump speeds.

다양한 종류의 조직 재생용 삼차원 구조체 또는 조직 유사 구조체가 상기한 방법에 의해 생성될 수 있다. 바이오 잉크 조성물을 적층하는 패턴이나 적층 배열은 제조하고자 하는 조직 유사 구조체의 크기 및 직경 등에 의해 결정될 수 있다. 또한, 삼차원 구조체 또는 조직 유사 구조체를 제조하기 위해 사용되는 바이오 잉크에 포함되는 세포의 개수는 세포의 종류, 바이오 잉크 조성물에 포함된 세포 영양성분의 함량 등에 따라 조절될 수 있다. 또한, 바이오 잉크 조성물에 포함되는 세포의 종류는 상기 방법에 따라 제조하고자 하는 삼차원 구조체 또는 조직 유사 구조체의 종류에 따라 다양하게 변경이 가능하다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자라면, 삼차원 바이오 프린팅을 통해 제조하고자 하는 삼차원 구조체 또는 조직 유사 구조체의 종류에 따라 적절한 세포를 선택하여 이에 적용할 수 있을 것이다. Various types of three-dimensional structures for tissue regeneration or tissue-like structures may be generated by the above-described method. The pattern or stacking arrangement for laminating the bio-ink composition may be determined by the size and diameter of the tissue-like structure to be manufactured. In addition, the number of cells included in the bio-ink used to prepare the three-dimensional structure or tissue-like structure may be adjusted according to the type of cell, the content of cell nutrients included in the bio-ink composition, and the like. In addition, the type of cells included in the bio-ink composition can be variously changed according to the type of the three-dimensional structure or tissue-like structure to be manufactured according to the above method. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will be able to select and apply appropriate cells according to the type of three-dimensional structure or tissue-like structure to be manufactured through three-dimensional bioprinting.

바이오 잉크 조성물이 삼차원 바이오 프린터에 의해 분사되어 적층된 이후에는 이를 광(자외선 또는 가시광선)에 노출시키거나 또는 가교 결합용액을 첨가함으로써 바이오 잉크 조성물의 가교결합을 촉진할 수 있다. 이러한 가교결합은 적층된 바이오 잉크 조성물이 보다 단단한 구조물로 완성될 수 있도록 해준다. 한편, 상기 광(자외선 또는 가시광선)은 적층된 바이오 잉크 조성물의 표면에 직접적으로 노출시킬 수 있으며, 예를 들어 광(자외선 또는 가시광선) 발생기로부터 발생된 300 nm 내지 800 nm 의 파장을 이용하여 적층된 바이오 잉크 조성물로부터 1~20 cm 거리에서 1초 내지는 1000초간 노출이 될 수 있고, 또는 20초 내지 500초, 또는 40초 내지 240초간 노출될 수 있다. 이러한 광(자외선 및 가시광선) 노출 거리 및 시간은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 기술자라면, 짧은 거리 및 강한 파장이라면 짧은 시간 동안의 노출로도 충분한 가교결합을 형성할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. After the bio-ink composition is sprayed and laminated by a three-dimensional bio-printer, cross-linking of the bio-ink composition can be promoted by exposing it to light (ultraviolet or visible light) or adding a cross-linking solution. This cross-linking allows the laminated bio-ink composition to be completed into a more rigid structure. On the other hand, the light (ultraviolet or visible light) can be directly exposed to the surface of the stacked bio-ink composition, for example, using a wavelength of 300 nm to 800 nm generated from a light (ultraviolet or visible light) generator. It may be exposed for 1 second to 1000 seconds at a distance of 1 to 20 cm from the stacked bio-ink composition, or may be exposed for 20 seconds to 500 seconds, or 40 seconds to 240 seconds. Such light (ultraviolet light and visible light) exposure distance and time is that those skilled in the art to which the present invention pertains can form sufficient crosslinks even with short exposures for short distances and strong wavelengths. you will be able to recognize

가교결합을 위한 바람직한 광(자외선 또는 가시광선)의 파장은 300 nm ~ 800 nm일 수 있으며, 바람직하게는 자외선의 경우 350 nm ~ 380 nm, 가시광선의 경우 400nm ~ 600nm, 보다 바람직하게는 자외선의 경우 355 nm ~ 375 nm, 가시광선의 경우 400 nm ~ 500 nm, 가장 바람직하게는 자외선의 경우 360 nm ~ 370 nm, 가시광선의 경우 400nm ~ 480nm일 수 있다. A preferred wavelength of light (ultraviolet or visible light) for crosslinking may be 300 nm to 800 nm, preferably 350 nm to 380 nm for ultraviolet light, 400 nm to 600 nm for visible light, more preferably UV light 355 nm to 375 nm, 400 nm to 500 nm for visible light, most preferably 360 nm to 370 nm for ultraviolet light, 400 nm for visible light It may be ~480 nm.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 따라 제조된 체내 이식 가능한 조직 유사기관 또는 조직 구조체에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to an implantable tissue-like organ or tissue construct manufactured according to the method.

삼차원 바이오 프린팅 기술은 모양 및 크기 면에서 임상적으로 적용이 가능한 조직 또는 기관 구조물을 제작할 수 있는 가능성을 가지고 있다. 조직-특이적인 세포 종류 및 삼차원적 구조물에 적용된 바이오 잉크의 조합을 통하여, 세포에 내재된 재생산 능력을 이용할 수 있고, 이를 통해 필요한 조직 또는 장기를 생산해 내는 것이 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 바이오 잉크 조성물을 이용하여 바이오 프린팅된 조직 구조체들은, 포유류 조직 및 기관과 해부학적으로 및 기능학적으로 유사성을 지닌 구조체를 제공할 수 있다.3D bioprinting technology has the potential to produce clinically applicable tissue or organ structures in terms of shape and size. Through the combination of tissue-specific cell types and bioinks applied to three-dimensional structures, it is possible to utilize the reproductive ability inherent in cells, and through this, it may be possible to produce necessary tissues or organs. Accordingly, tissue structures bioprinted using the bio-ink composition according to the present invention can provide structures having anatomical and functional similarity to mammalian tissues and organs.

본 발명의 조성물을 이용하면 조직 유사기관 또는 체내 이식 가능한 조직의 단일 구조체를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 여러 가지 세포를 동시에 프린팅하여 조직과 조직간의 연계를 재연할 수 있는, 기능성이 현저히 향상된 조직 구조체를 제조할 수도 있다.By using the composition of the present invention, it is possible to provide a single structure of a tissue-like organ or a tissue that can be transplanted into the body, as well as a tissue structure with significantly improved functionality that can reproduce the linkage between tissues by printing various cells at the same time. can also be manufactured.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된Contains methacrylated low molecular weight collagen 바이오 잉크 조성물의 제조Preparation of bio-ink composition

메타크릴화된 저분자 콜라겐은 약 3500Da 분자량을 가지는 저분자 콜라겐에 메타크릴산무수물(methacrylic anhydride)을 반응시켜 공지된 방법에 따라 제조하였다(R. Ravichandran et al., Journal of Materials Chemistry B, 4(2):318-326, 2016).Methacrylated low molecular weight collagen was prepared according to a known method by reacting methacrylic anhydride with low molecular weight collagen having a molecular weight of about 3500 Da (R. Ravichandran et al. , Journal of Materials Chemistry B , 4(2). ):318-326, 2016).

바이오잉크 조성물은 상온에서 제조하였으며, 먼저 0.7 mL/mL DMEM(biowest)에 4 mg/mL 히알루론산(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 1시간 동안 혼합하였다. 그 다음, 50 mg/mL 메타크릴화된 젤라틴(GelMA, 자체제작)을 첨가하고 1시간 동안 교반시킨 후, 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 각각 1 w/v%, 2 w/v%, 3 w/v%, 4 w/v% 및 5 w/v%로 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 0.1 mL/mL 글리세롤(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 30분 동안 교반하여 바이오잉크 조성물(이하, ColMA로 혼용 표기함)을 제조하였다. The bio-ink composition was prepared at room temperature, and 4 mg/mL hyaluronic acid (Sigma-Aldrich) was first added to 0.7 mL/mL DMEM (biowest) and mixed for 1 hour. Then, 50 mg/mL methacrylated gelatin (GelMA, manufactured in-house) was added and stirred for 1 hour, followed by 1 w/v%, 2 w/v%, and 3 w of methacrylated low molecular weight collagen, respectively. /v%, 4 w/v% and 5 w/v% were added and stirred for 1 hour. Thereafter, 0.1 mL/mL glycerol (Sigma-Aldrich) was added and stirred for 30 minutes to prepare a bio-ink composition (hereinafter, referred to as ColMA mixed).

비교예로 메타크릴화된 저분자 콜라겐 대신 젤라틴을 포함하는 바이오잉크 조성물(Gel4cell)을 상기와 같이 제조하였다.As a comparative example, a bio-ink composition (Gel4cell) containing gelatin instead of methacrylated low molecular weight collagen was prepared as described above.

메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오 잉크 조성물의 물리화학적 특성 확인 - 점도Confirmation of physicochemical properties of bio-ink composition containing methacrylated low molecular weight collagen - Viscosity

상기 실시예 1에서 제조한 바이오잉크 조성물의 점도를 확인하기 위해, 광학개시제를 혼합한 다음, 365 nm 파장의 UV로 2분간 가교하였다.In order to check the viscosity of the bio-ink composition prepared in Example 1, an optical initiator was mixed, and then cross-linked with UV of 365 nm wavelength for 2 minutes.

가교 전(Before curing) 및 가교 후(After curing)로 나누어 측정하였으며, 복합 점도(complex viscosity)는 Rheometer(mcr 301, Anton paar)를 활용하여 측정하였다. 점도 측정은 0.1 ~ 10Hz 주파수 범위(Frequency range; logarithm uniformly 11 pts), 온도 25℃, 진폭(Amplitude) 0.1　~1000 % 조건으로 수행하였다.The measurements were divided into Before curing and After curing, and the complex viscosity was measured using a Rheometer (mcr 301, Anton paar). Viscosity measurement was performed under the conditions of a frequency range of 0.1 to 10Hz (Frequency range; logarithm uniformly 11 pts), a temperature of 25°C, and an amplitude of 0.1　 to 1000%.

메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량에 따른 가교 전후 점도 비교Comparison of viscosity before and after crosslinking according to the content of methacrylated low molecular weight collagen 가교전 점도 (Pa·s)Viscosity before crosslinking (Pa·s) 가교후 점도(Pa·s)Viscosity after crosslinking (Pa·s) Gel4cellGel4cell 7 ~ 5007 to 500 10 ~ 100010 to 1000 ColMA 1%ColMA 1% 16 ~ 100016 to 1000 40 ~ 300040 to 3000 ColMA 2%ColMA 2% 10 ~ 60010 to 600 20 ~ 130020 to 1300 ColMA 3%ColMA 3% 8 ~ 4008 to 400 20 ~ 100020 to 1000 ColMA 4%ColMA 4% 8 ~ 4008 to 400 30 ~ 180030 to 1800 ColMA 5%ColMA 5% 8 ~ 4008 to 400 30 ~ 180030 to 1800

주파수 1Hz에서의 가교 전후 점도 비교Viscosity comparison before and after crosslinking at a frequency of 1 Hz 가교전 점도 (Pa·s)Viscosity before crosslinking (Pa·s) 가교후 점도(Pa·s)Viscosity after crosslinking (Pa·s) Gel4cellGel4cell 6262 109109 ColMA 1%ColMA 1% 136136 324324 ColMA 2%ColMA 2% 9696 166166 ColMA 3%ColMA 3% 7070 138138 ColMA 4%ColMA 4% 6464 229229 ColMA 5%ColMA 5% 7070 219219

그 결과, 도 1 및 표 1에 나타난 바와 같이 가교 전후 모두 ColMA 바이오잉크는 Gel4cell 바이오잉크에 비해 유사한 점도를 보이거나 높은 점도를 보이는 것을 확인하였으며, 특히 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%일 때 점도가 가장 우수한 것으로 확인되었다. As a result, as shown in FIG. 1 and Table 1, it was confirmed that ColMA bio-ink showed similar or higher viscosity than Gel4cell bio-ink both before and after cross-linking, and in particular, the methacrylated low molecular weight collagen content was 1 w/v %, it was confirmed that the viscosity was the best.

또한, 주파수 1Hz일 때 기준으로 점도를 비교한 결과, 도 2 및 표 2에 나타난 바와 같이, 가교 전후 모두 젤라틴 대신 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함한 바이오잉크 조성물의 점도가 우수한 것을 확인하였으며, 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%일 때 점도가 가장 높은 것을 확인하였다. In addition, as a result of comparing the viscosity based on a frequency of 1 Hz, as shown in FIG. 2 and Table 2, it was confirmed that the viscosity of the bio-ink composition including methacrylated low-molecular collagen instead of gelatin was excellent both before and after cross-linking, and methacrylic It was confirmed that the viscosity was highest when the low molecular weight collagen content was 1 w/v%.

메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오 잉크 조성물의 물리화학적 특성 확인 - Confirmation of physicochemical properties of bio-ink composition containing methacrylated low molecular weight collagen - 모듈러스modulus

상기 실시예 1에서 제조한 바이오잉크 조성물의 모듈러스(modulus)를 확인하였다. 가교 전(Before curing) 및 가교 후(After curing)로 나누어 측정하였다.The modulus of the bio-ink composition prepared in Example 1 was confirmed. The measurements were divided into Before curing and After curing.

모듈러스 측정은 상기 실시예 2의 점도 측정과 동일한 조건으로 수행하였다.The modulus measurement was performed under the same conditions as the viscosity measurement of Example 2.

메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량에 따른 가교 전후 모듈러스 비교Comparison of modulus before and after crosslinking according to methacrylated low molecular weight collagen content 가교전 모듈러스 (Pa)Modulus before crosslinking (Pa) 가교후 모듈러스(Pa)Modulus after crosslinking (Pa) stroage modulusstorage modulus loss modulusloss modulus stroage modulusstorage modulus loss modulusloss modulus Gel4cellGel4cell 350 ~ 400350 to 400 14 ~ 4814 to 48 680 ~ 690680 to 690 47 ~ 4847 to 48 ColMA 1%ColMA 1% 650 ~ 1000650 to 1000 150 ~ 160150 to 160 1700 ~ 23001700 to 2300 380 ~ 400380 to 400 ColMA 2%ColMA 2% 400 ~ 700400 to 700 100 ~ 120100 to 120 800 ~ 1300800 to 1300 220 ~ 270220 to 270 ColMA 3%ColMA 3% 300 ~ 550300 to 550 80 ~ 10080 to 100 700 ~ 1100700 to 1100 160 ~ 250160 to 250 ColMA 4%ColMA 4% 250 ~ 500250 to 500 70 ~ 9070 to 90 1100 ~ 17001100 to 1700 220 ~ 330220 ~ 330 ColMA 5%ColMA 5% 300 ~ 550300 to 550 80 ~ 9580 to 95 1100 ~ 16001100 to 1600 260 ~ 320260 to 320

주파수 1Hz에서의 가교 전후 모듈러스 비교Comparison of modulus before and after crosslinking at a frequency of 1 Hz 가교전 모듈러스 (Pa)Modulus before crosslinking (Pa) 가교후 모듈러스(Pa)Modulus after crosslinking (Pa) stroage modulusstorage modulus loss modulusloss modulus stroage modulusstorage modulus loss modulusloss modulus Gel4cellGel4cell 390390 2525 680680 3030 ColMA 1%ColMA 1% 830830 170170 20002000 200200 ColMA 2%ColMA 2% 590590 120120 10001000 150150 ColMA 3%ColMA 3% 430430 9595 850850 140140 ColMA 4%ColMA 4% 400400 8585 14001400 200200 ColMA 5%ColMA 5% 430430 9090 13601360 190190

그 결과, 도 3 및 표 3에 나타난 바와 같이, 점도와 마찬가지로 가교 전 및 가교 후 모두 가교 전후 모두 ColMA 바이오잉크는 Gel4cell 바이오잉크에 비해 유사하거나 높은 모듈러스를 보이는 것을 확인하였으며, 특히 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%일 때 모듈러스가 가장 우수한 것으로 확인되었다.As a result, as shown in FIG. 3 and Table 3, it was confirmed that the ColMA bio-ink showed a similar or higher modulus compared to the Gel4cell bio-ink both before and after cross-linking, and especially after cross-linking, and especially after cross-linking, like the viscosity. It was confirmed that the modulus was the best when the collagen content was 1 w/v%.

또한, 주파수 1Hz일 때 기준으로 점도 및 모듈러스를 비교한 결과, 가교 전후 모두 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 1% 포함된 경우, 저장모듈러스 및 손실 모듈러스 모두 최대값을 보이는 것을 확인하였다. In addition, as a result of comparing the viscosity and modulus at a frequency of 1 Hz, it was confirmed that both storage modulus and loss modulus showed maximum values when 1% of methacrylated low-molecular collagen was included before and after cross-linking.

즉, 메타크릴화된 저분자 콜라겐 함량이 1 w/v%로 포함된 바이오잉크 조성물(ColMA 1%)의 기계적 물성이 젤리틴이 포함된 바이오잉크 조성물(Gel4cell)에 비해 기계적 물성이 우수한 것을 확인하였다. That is, it was confirmed that the mechanical properties of the bio-ink composition (ColMA 1%) containing methacrylated low-molecular collagen at 1 w/v% were superior to those of the bio-ink composition (Gel4cell) containing jellytin. .

따라서, 본 발명의 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함한 바이오잉크 조성물은 세포 운반물질로 젤라틴만을 사용한 종래 바이오 잉크 조성물(Gel4cell)에 비해 우수한 물성을 가진 구조체의 제작이 가능한 것을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that the bio-ink composition including methacrylated low-molecular collagen of the present invention can produce a structure having superior physical properties compared to the conventional bio-ink composition (Gel4cell) using only gelatin as a cell carrier material.

인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물의 제조Preparation of bio-ink composition containing human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen

본 발명에서는 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물을 제조하였다. In the present invention, a bio-ink composition containing human-derived collagen and methacrylated low molecular weight collagen was prepared.

상기 실시예 1 내지 실시예 4를 참고로 하여 메타크릴화된 저분자 콜라겐의 함량은 1 w/v%가 되도록, 인체 유래 콜라겐(Huma Skin Collagen Type I; Humabiologics, 미국)은 0.1 w/v%가 되도록 바이오잉크 조성물을 제조하였다. With reference to Examples 1 to 4, the content of methacrylated low molecular weight collagen is 1 w/v%, and human collagen (Huma Skin Collagen Type I; Humabiologics, USA) is 0.1 w/v%. A bio-ink composition was prepared as possible.

구체적으로, 바이오잉크 조성물은 상온에서 제조하였으며, 먼저 0.7 mL/mL DMEM(biowest)에 4 mg/mL 히알루론산(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 1시간 동안 혼합하였다. 그 다음, 50 mg/mL 메타크릴화된 젤라틴(GelMA, 자체제작)을 첨가하고 1시간 동안 교반시킨 후, 1 w/v% 메타크릴화된 저분자 콜라겐 및 0.1 w/v% 인체 유래 콜라겐을 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 0.1 mL/mL 글리세롤(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 30분 동안 교반하여 바이오잉크 조성물을 제조하였다. Specifically, the bio-ink composition was prepared at room temperature, and 4 mg/mL hyaluronic acid (Sigma-Aldrich) was first added to 0.7 mL/mL DMEM (biowest) and mixed for 1 hour. Then, 50 mg/mL methacrylated gelatin (GelMA, manufactured in-house) was added and stirred for 1 hour, followed by addition of 1 w/v% methacrylated low molecular weight collagen and 0.1 w/v% human-derived collagen and stirred for 1 hour. Then, 0.1 mL/mL glycerol (Sigma-Aldrich) was added and stirred for 30 minutes to prepare a bio-ink composition.

인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물의 물리화학적 특성 확인Confirmation of physicochemical properties of bio-ink composition containing human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen

5-1 : 점도 확인 5-1: Viscosity check

상기 실시예 4에서 제조한 바이오잉크 조성물의 점도를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다. The viscosity of the bio-ink composition prepared in Example 4 was measured in the same manner as in Example 2.

가교 전후 점도 비교Viscosity comparison before and after crosslinking 가교전 점도 (Pa·s)Viscosity before crosslinking (Pa·s) 가교후 점도(Pa·s)Viscosity after crosslinking (Pa·s) Col + ColMACol + ColMA 0.5 ~ 2.00.5 to 2.0 40 ~ 340040 to 3400 Col + ColMA
(주파수 1Hz)Col + ColMA
(frequency 1Hz) 0.60.6 360360

그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물의 가교 후 점도는 40 ~ 3400 Pa·s, 주파수 1Hz 일때 기준 360 Pa·s로, 메타크릴화된 저분자 콜라겐만 포함된 경우(상기 표 1 및 표 2 참고)에 비해 높은 점도를 보이는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIGS. 5 and 6, the viscosity after crosslinking of the bio-ink composition containing human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen was 40 to 3400 Pa·s, and the standard 360 Pa·s at a frequency of 1 Hz. , it was confirmed that the viscosity was higher than when only methacrylated low molecular weight collagen was included (see Table 1 and Table 2 above).

5-2 : 모듈러스 확인5-2 : Check the modulus

상기 실시예 4에서 제조한 바이오잉크 조성물의 모듈러스를 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다. The modulus of the bio-ink composition prepared in Example 4 was measured in the same manner as in Example 2.

가교 전후 모듈러스 비교Comparison of modulus before and after crosslinking 가교전 모듈러스 (Pa)Modulus before crosslinking (Pa) 가교후 모듈러스(Pa)Modulus after crosslinking (Pa) stroage modulusstorage modulus loss modulusloss modulus stroage modulusstorage modulus loss modulusloss modulus Col + ColMACol + ColMA 0.4 ~ 30.4 to 3 1 ~ 301 to 30 2100 ~ 24002100 to 2400 180 ~ 300180 to 300 Col + ColMA
(주파수 1Hz)Col + ColMA
(frequency 1Hz) 2.92.9 2.72.7 22502250 190190

그 결과, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물의 가교 후 저장모듈러스는 2100 ~ 2400 Pa, 주파수 1Hz 일때 기준 2250 Pa으로, 메타크릴화된 저분자 콜라겐만 포함된 경우(상기 표 3 및 표 4 참고)에 비해 높은 저장모듈러스를 보이는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIGS. 7 and 8 , the storage modulus after crosslinking of the bio-ink composition containing human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen was 2100 to 2400 Pa, at a frequency of 1Hz, 2250 Pa, based on methacryl It was confirmed that the storage modulus was higher than that in the case where only the low molecular weight collagen was included (see Table 3 and Table 4 above).

5-3 : 탄젠트 델타(tangent delta; tanδ)측정5-3: Tangent delta (tanδ) measurement

상기 실시예 4에서 제조한 바이오잉크 조성물의 탄젠트 델타는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하였다. 탄젠트 상수는 하기 수학식 1과 같이 계산하였다. The tan delta of the bio-ink composition prepared in Example 4 was measured in the same manner as in Example 2. The tangent constant was calculated as in Equation 1 below.

[수학식 1][Equation 1]

탄젠트 상수 = 가교 후 탄젠트 델타 / 가교 전 탄젠트 델타Tangent constant = Tangent delta after crosslinking / Tangent delta before crosslinking

가교 전후 탄젠트 델타값 비교Comparison of tangent delta values before and after crosslinking 가교전 tanδtanδ before crosslinking 가교후 tanδtanδ after crosslinking tangent deltatangent delta 1One 1212 Delta constantDelta constant 1111

탄젠트 델타값은 절대치 보다 가교 전에 대비하여 가교 후의 증가량이 중요하며, 도 9에 나타난 바와 같이, 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐이 포함된 바이오잉크 조성물은 가교 전의 탄젠트 델타값에 비해 가교 후의 탄젠트 델타값이 현저하게 상승하는 것을 확인하였다. The tangent delta value is more important than the absolute value in the amount of increase after crosslinking compared to before crosslinking, and as shown in FIG. 9 , the bioink composition containing human-derived collagen and methacrylated low-molecular collagen has a tangent delta value after crosslinking compared to the tangent delta value before crosslinking. It was confirmed that the tangent delta value increased remarkably.

Claims (11)

세포 운반물질로서, 인체 유래 콜라겐 및 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen);
점성 증강제로서, 히알루론산;
윤활제로서, 글리세롤; 및
구조물질로서, 메타크릴화된 젤라틴을 포함하는 바이오 잉크 조성물로서,
상기 바이오 잉크 조성물에 포함된 인체 유래 콜라겐은 0.1 ~ 4 w/v%이고, 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 1 ~ 4 w/v%이며,
상기 바이오 잉크 조성물의 주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 저장모듈러스는 2.7 ~ 3.1 Pa 및 가교 전 손실모듈러스는 2.5 ~ 2.9 Pa 이고, 가교 후 저장모듈러스는 2230 ~ 2270 Pa 및 가교 후 손실모듈러스는 170 ~ 210 Pa 인 것을 특징으로 하는, 바이오 잉크 조성물.
As the cell carrier material, human-derived collagen and methacrylated low molecular weight collagen;
As a viscosity enhancing agent, hyaluronic acid;
As a lubricant, glycerol; and
As a structural material, a bio-ink composition comprising methacrylated gelatin,
Human-derived collagen contained in the bio-ink composition is 0.1 to 4 w/v%, and methacrylated low-molecular collagen is 1 to 4 w/v%,
When the frequency (Frequency) of the bio-ink composition is 1Hz, the storage modulus before crosslinking is 2.7 to 3.1 Pa and the loss modulus before crosslinking is 2.5 to 2.9 Pa, the storage modulus after crosslinking is 2230 to 2270 Pa, and the loss modulus after crosslinking is 170 ~ 210 Pa, characterized in that the bio-ink composition.
 제1항에 있어서, 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐의 분자량은 500 ~ 4000Da인 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
The bio-ink composition according to claim 1, wherein the molecular weight of the methacrylated low molecular weight collagen is 500 to 4000 Da.
 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 바이오 잉크 조성물의 가교 전 점도(complex viscosity)는 0.5 ~ 2.0 Pa·s이고, 가교 후 점도는 40 ~ 3400 Pa·s이며,
주파수(Frequency) 1Hz 조건일 때 가교 전 점도는 0.5 ~ 0.7 Pa·s이고, 가교 후 점도는 340 ~ 380 Pa·s인 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
According to claim 1, wherein the bio-ink composition before crosslinking (complex viscosity) is 0.5 ~ 2.0 Pa · s, the viscosity after crosslinking is 40 ~ 3400 Pa · s,
The bio-ink composition, characterized in that the viscosity before crosslinking is 0.5 to 0.7 Pa·s, and the viscosity after crosslinking is 340 to 380 Pa·s under the frequency (Frequency) condition of 1Hz.
 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 바이오 잉크 조성물은 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
The method of claim 1, wherein the bio-ink composition comprises stem cells, osteoblasts, myoblasts, tenocytes, neuroblasts, fibroblasts, glioblasts, Germ cells, hepatocytes, renal cells, Sertoli cells, chondrocytes, epithelial cells, cardiovascular cells, keratinocytes, smooth muscle cells From the group consisting of smooth muscle cells, cardiomyocytes, glial cells, endothelial cells, hormone-secreting cells, immune cells, pancreatic islet cells and neurons Bio-ink composition, characterized in that it further comprises one or more selected cells.
 제1항에 있어서, 상기 바이오 잉크 조성물은 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
The bio-ink composition of claim 1, wherein the bio-ink composition further comprises a photoinitiator.
 (a) 제1항, 제2항, 제4항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 바이오 잉크 조성물을 삼차원 프린터에 충전하는 단계;
(b) 목적하는 조직 유사 구조체를 삼차원 프린팅하는 단계; 및
(c) 삼차원 프린팅된 바이오 잉크 조성물을 가교결합시키는 단계를 포함하는 조직 유사 구조체의 제조방법.
(a) charging the bio-ink composition of any one of claims 1, 2, 4, 8 and 9 to a three-dimensional printer;
(b) three-dimensional printing of the desired tissue-like structure; and
(c) a method for producing a tissue-like structure comprising the step of crosslinking the three-dimensionally printed bio-ink composition.
 제10항의 방법에 따라 제조된 조직 유사 구조체.A tissue-like construct prepared according to the method of claim 10 .
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CN115282340A (en) * 2022-08-15 2022-11-04 深圳大洲医学科技有限公司 GelMA-based biological ink and preparation method and application thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180280578A1 (en) * 2015-07-21 2018-10-04 Bioink Solutions Inc. Bio-ink composition having improved physical and biological properties
US11850324B2 (en) * 2016-10-12 2023-12-26 Advanced Biomatrix, Inc. Three-dimensional (3-D) printing inks made from natural extracellular matrix molecules

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190106673A1 (en) * 2017-10-11 2019-04-11 Wake Forest University Health Sciences Bioink compositions and methods of preparing and using the same

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