KR102345183B1 - Monoolein Cubic Phase Containing Hydrophobically Modified Gelatin, Hydrophobically Modified Polyethylenimine And Hydrophobically Modified Glucose Oxidase - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소수화된 젤라틴과 소수화된 폴리에틸렌이민이 지질이중층에 고정된 상태로 수상채널내에서 복합체를 형성하여 상기 수상채널을 폐쇄하였다가 수상채널내의 pH가 저하된 환경에서 상기 복합체가 해체되어 수상채널이 개방되므로 수상채널에 탑재된 유효성분이 방출되는 특징이 있다. 특히 본 발명의 모노올레인 큐빅상은 소수화된 글루코스 산화효소를 포함하여 글루코스를 감지하여 수상채널을 개방하는 특징이 있으며 그 크기가 100nm이하여서 피부 침투가 용이한 효과가 있다.
따라서 본 발명의 모노올레인을 이용하여 화장품등을 제조하게 되면 피부나 조직 깊숙이 침투하여 글루코스가 존재하는 환경에서만 수상채널 내부에 탑재한 유효성분을 방출할 수 있는 효과가 있다. In the present invention, hydrophobized gelatin and hydrophobized polyethyleneimine are fixed in a lipid bilayer to form a complex in the aqueous channel to close the aqueous channel. As this is opened, the active ingredient loaded in the water channel is released. In particular, the cubic monoolein phase of the present invention contains a hydrophobized glucose oxidase and senses glucose to open an aqueous channel, and its size is 100 nm or less, so it has an effect of easy skin penetration.
Therefore, when a cosmetic product is manufactured using the monoolein of the present invention, there is an effect of penetrating deep into the skin or tissue and releasing the active ingredient mounted inside the aqueous channel only in an environment in which glucose is present.

Description

소수화된 젤라틴, 소수화된 폴리에틸렌이민과 소수화된 글루코스 산화효소를 포함하는 모노올레인 큐빅상{Monoolein Cubic Phase Containing Hydrophobically Modified Gelatin, Hydrophobically Modified Polyethylenimine And Hydrophobically Modified Glucose Oxidase}Monoolein Cubic Phase Containing Hydrophobically Modified Gelatin, Hydrophobically Modified Polyethylenimine And Hydrophobically Modified Glucose Oxidase

본 발명은 소수화된 젤라틴, 소수화된 폴리에틸렌이민과 소수화된 글루코스 산화효소를 포함하는 모노올레인 큐빅상을 포함하는 모노올레인 큐빅상 관한 것으로 글루코스를 감지하면 수상채널을 개방하여 탑재된 유효성분을 방출하는 모노올레인 큐빅상에 관한 것이다.The present invention relates to a monoolein cubic phase comprising a hydrophobized gelatin, a hydrophobized polyethyleneimine, and a hydrophobized monoolein cubic phase comprising a hydrophobized glucose oxidase. Upon sensing glucose, an aqueous channel is opened to release the loaded active ingredient. It relates to the monoolein cubic phase.

모노올레인(Monoolein)은 적정량의 물로 수화되는 경우 큐빅상(cubic phase)을 형성한다. 상기 모노올레인 큐빅상(Monoolein cubic phase)은 양친매성 분자로서 패킹 파라미터(packing parameter)는 1보다 약간 크며, 수용액 상에서 자가-결합하는 특성이 있다. 모노올레인 큐빅상은 두께가 약 3.5nm인 지질 이중층 및 반지름 약 5nm인 상호 교차 수상채널(intercrossing-water channel)로 구성되어 있다. 모노올레인의 지질 이중층은 지용성 물질을 포집할 수 있고 상기 수상채널은 수용성 물질을 포집할 수 있는 특징이 있다. Monoolein forms a cubic phase when hydrated with an appropriate amount of water. The monoolein cubic phase is an amphiphilic molecule and has a packing parameter slightly greater than 1, and has a property of self-binding in an aqueous solution. The cubic monoolein phase consists of a lipid bilayer with a thickness of about 3.5 nm and an intercrossing-water channel with a radius of about 5 nm. The lipid bilayer of monoolein can trap fat-soluble substances, and the aqueous channel has a feature that can trap water-soluble substances.

모노올레인 큐빅상의 수상채널에 포집되는 수용성 유효성분은 확산에 의해 빠른 시간에 방출되는 특징이 있다. 최근에는 모노올레인 큐빅상에 특정한 자극에 의해 방출여부를 조절하는 생화학적 스위치를 포함시켜 특정 자극에 의해서만 수상채널에 포집된 유효성분의 방출을 조절하는 연구들이 주목받고 있다. The water-soluble active ingredient collected in the aqueous channel of the cubic monoolein phase is rapidly released by diffusion. Recently, studies that control the release of active ingredients collected in the aqueous channel only by specific stimuli by including a biochemical switch that controls the release by specific stimuli on the cubic monoolein are attracting attention.

수용성 비타민 C의 안정한 유도체 중 하나인 마그네슘 아스코빌 포스페이트는 안정성이 높고, 항산화 효능이 우수하여 피부 미백 작용이 나타나는 것으로 알려져 있다. 그러나 상기 마그네슘 아스코빌 포스페이트는 수용성으로서 피부를 통과하지 못하여 그 효과가 반감되는 문제점이 있었다. 이에 상기 마그네슘 아스코빌 포스페이트를 모노올레인의 수상채널에 탑재하게 되면 모노올레인에 의해 피부침투효과가 향상되어 피부미백효과가 향상될 것으로 기대된다. Magnesium ascorbyl phosphate, which is one of the stable derivatives of water-soluble vitamin C, is known to have high stability and excellent antioxidant effect, resulting in skin whitening action. However, since the magnesium ascorbyl phosphate is water-soluble and does not pass through the skin, there is a problem in that the effect is halved. Accordingly, when the magnesium ascorbyl phosphate is mounted on the aqueous channel of monoolein, the skin penetration effect is improved by the monoolein, and the skin whitening effect is expected to be improved.

모노올레인의 지질 이중층에는 지용성 유효성분이 포집된다. 지용성 유효성분은 소수성 정도에 따라 지질층으로 삽입되는 정도가 결정되므로 그 안정성이 향상되는 효과가 있다. 지용성 물질인 레티놀의 유도체인 레티닐 팔미테이트(Retinyl palmitate)는 피부가 건조해져서 각질이 생기는 플레이킹 현상을 줄이고 탄력을 회복시켜 건조하거나 손상된 피부를 생기 있게 변화시키는 효과가 있어서 화장품이나 삼푸 등에 많이 사용된다. 그러나 레티닐 팔미테이트는 지용성 비타민 A의 일종으로서 열, 빛, 수분 및 산소등에 의해 화학적 변성이 쉽게 일어나 안정성이 쉽게 저하되는 문제점이 있었다. The lipid bilayer of monoolein collects fat-soluble active ingredients. Since the degree of insertion into the lipid layer is determined according to the degree of hydrophobicity of the fat-soluble active ingredient, the stability thereof is improved. Retinyl palmitate, a derivative of retinol, a fat-soluble substance, is used in cosmetics and shampoos because it has the effect of reducing the flaking phenomenon that occurs when the skin becomes dry and flaking and restores elasticity to vitalize the dry or damaged skin. do. However, as a kind of fat-soluble vitamin A, retinyl palmitate is easily chemically denatured by heat, light, moisture and oxygen, and thus stability is easily reduced.

따라서 레티닐 팔미테이트과 같은 예민한 지용성 유효성분의 안정성을 향상시키고, 마그네슘 아스코빌 포스페이트와 같은 수용성 유효성분의 보관 및 운반을 용이하게 하며, 외부환경을 감지하여 능동적으로 약물을 방출하는 약물전달체가 개발된다면 효과와 지속성이 향상된 약물이나 화장품등을 개발할 수 있을 것으로 판단된다. Therefore, if a drug delivery system that improves the stability of sensitive fat-soluble active ingredients such as retinyl palmitate, facilitates storage and transport of water-soluble active ingredients such as magnesium ascorbyl phosphate, and actively releases drugs by sensing the external environment, is developed. It is judged that it will be possible to develop drugs or cosmetics with improved effectiveness and durability.

한국공개특허 10-2018-0121103Korean Patent Laid-Open Patent No. 10-2018-0121103

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본 발명은 수상채널 내에 위치하는 소수화 젤라틴(gelatin)과 소수화 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)의 복합체가 pH 변화에 따라 형성 또는 해체되므로 수상채널을 폐쇄하거나 개방하는 모노올레인 큐빅상에 관한 것으로, 특히, 소수화된 글루코스 산화효소가 글루코스를 감지하여 수상채널 내부의 미세환경 pH를 변화시키므로 수상채널에 탑재된 유효성분을 방출할 수 있는 모노올레인 큐빅상을 제공하는데 목적이 있다. The present invention relates to a monoolein cubic phase that closes or opens an aqueous channel because a complex of hydrophobized gelatin and hydrophobized polyethyleneimine located in an aqueous channel is formed or disassembled according to a change in pH. An object of the present invention is to provide a monoolein cubic phase capable of releasing active ingredients loaded on the aqueous channel because the glucose oxidase detects glucose and changes the pH of the microenvironment inside the aqueous channel.

본 발명은 소수화된 젤라틴(gelatin); 및 소수화된 폴리에틸렌이민(polyethylenimine);을 포함하는 모노올레인 큐빅상을 제공한다.The present invention is hydrophobized gelatin (gelatin); And hydrophobized polyethyleneimine (polyethylenimine); provides a monoolein cubic phase comprising.

상기 소수화된 젤라틴과 소수화된 폴리에틸렌이민은 상기 지질이중층에 고정된 상태로 복합체를 형성하면 수상채널을 폐쇄시키고 복합체가 해체되면 수상채널을 개방하는 것을 특징으로 하며 상기 수상채널의 pH가 4.7를 초과하는 환경에서 복합체를 형성하고 pH가 4.7이하인 환경에서 복합체가 해체되므로 수상채널을 조절하게 된다.When the hydrophobized gelatin and the hydrophobized polyethyleneimine form a complex in a fixed state on the lipid bilayer, the aqueous channel is closed, and when the complex is dissociated, the aqueous channel is opened, wherein the pH of the aqueous channel exceeds 4.7 A complex is formed in the environment and the complex is dismantled in an environment with a pH of 4.7 or less, thereby controlling the aqueous channel.

상기 소수화된 젤라틴은 상기 젤라틴의 아미노기(amino group)가 데카노일 클로라이드(decanoyl chloride)의 염화카보닐기(carbonyl chloride group)와 축합반응을 하여 소수화되며, 상기 소수화된 폴리에틸렌이민은 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기(amino group)가 데카노일 클로라이드(decanoyl chloride)의 염화카보닐기(carbonyl chloride)와 축합반응을 하여 소수화된다. 상기 소수화된 젤라틴과 소수화된 폴리에틸렌이민은 지질이중층에 고정되어 있고 pH가 4.7을 초과하는 환경에서 수상채널내에서 복합체로 존재하며 pH가 4.7 미만의 환경이 되면 상기 복합체가 해체되어 수상채널을 개방하게 된다.The hydrophobized gelatin is hydrophobized by a condensation reaction of an amino group of the gelatin with a carbonyl chloride group of decanoyl chloride, and the hydrophobized polyethyleneimine is an amino group of the polyethyleneimine ( amino group) is hydrophobized by condensation reaction with the carbonyl chloride group of decanoyl chloride. The hydrophobized gelatin and hydrophobized polyethyleneimine are fixed in the lipid bilayer and exist as a complex in the aqueous channel in an environment where the pH exceeds 4.7. When the pH is less than 4.7, the complex is disassembled to open the aqueous channel. do.

본 발명의 모노올레인 큐빅상은 레티닐 팔미테이트(Retinyl Palmitate)를 더 포함할 수 있으며 상기 레티닐 팔미테이트는 지질이중층에 위치하여 그 안정성이 향상된다.The cubic monoolein phase of the present invention may further include retinyl palmitate, and the retinyl palmitate is positioned in the lipid bilayer to improve its stability.

본 발명은 소수화된 젤라틴(gelatin); 소수화된 폴리에틸렌이민(polyethylenimine); 및The present invention is hydrophobized gelatin (gelatin); hydrophobized polyethylenimine; and

소수화된 글루코스 산화효소(glucose oxidase);을 포함하는 모노올레인 큐빅상을 제공한다.It provides a cubic monoolein phase comprising; hydrophobized glucose oxidase.

상기 모노올레인 큐빅상은 pH 4.7을 초과하는 조건에서 상기 수상채널을 폐쇄하며, 소수화된 글루코스 산화효소가 글루코스(glucose)를 감지하면 상기 수상채널내 pH를 4.7 미만으로 감소시켜 상기 수상채널을 개방하게 된다.The monoolein cubic phase closes the aqueous channel under the condition of pH exceeding 4.7, and when the hydrophobized glucose oxidase senses glucose, the pH in the aqueous channel is reduced to less than 4.7 to open the aqueous channel. do.

본 발명의 모노올레인 큐빅상은 비타민 C의 유도체인 마그네슘 아스코빌 포스페이트(magnesium ascorbyl phosphate)을 포함하며 그 직경이 10 내지 100nm에 지나지 않아 피부에 침투되어 마그네슘 아스코빌 포스페이트의 세포내재화를 향상시키는 것을 특징으로 한다.The cubic monoolein phase of the present invention contains magnesium ascorbyl phosphate, a derivative of vitamin C, and its diameter is only 10 to 100 nm, so it penetrates into the skin and improves the internalization of magnesium ascorbyl phosphate into cells. do it with

본 발명은 소수화된 젤라틴과 소수화된 폴리에틸렌이민이 지질이중층에 고정된 상태로 수상채널내에서 복합체를 형성하여 상기 수상채널을 폐쇄하였다가 수상채널내의 pH가 저하된 환경에서 상기 복합체가 해체되어 수상채널이 개방되므로 수상채널에 탑재된 유효성분이 방출되는 특징이 있다. 특히 본 발명의 모노올레인 큐빅상은 소수화된 글루코스 산화효소를 포함하여 글루코스를 감지하여 수상채널을 개방하는 특징이 있으며 그 크기가 100nm이하여서 피부 침투가 용이한 효과가 있다.In the present invention, hydrophobized gelatin and hydrophobized polyethyleneimine are fixed in a lipid bilayer to form a complex in the aqueous channel to close the aqueous channel. As this is opened, the active ingredient loaded in the water channel is released. In particular, the cubic monoolein phase of the present invention contains a hydrophobized glucose oxidase and senses glucose to open an aqueous channel, and its size is 100 nm or less, so it has an effect of easy skin penetration.

따라서 본 발명의 모노올레인을 이용하여 화장품등을 제조하게 되면 피부나 조직 깊숙이 침투하여 글루코스가 존재하는 환경에서만 수상채널 내부에 탑재한 유효성분을 방출할 수 있는 효과가 있다. Therefore, when a cosmetic product is manufactured using the monoolein of the present invention, there is an effect of penetrating deep into the skin or tissue and releasing the active ingredient mounted inside the aqueous channel only in an environment in which glucose is present.

도 1은 젤라틴(Gelatin)(A), 데카노일 젤라틴(Decanoyl Gelatin, DeGel)(1/0.3)(B), DeGel(1/0.5)(C), DeGel(1/0.7)(D)의 1H NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 2는 폴리에틸렌이민(poly(ethylene imine), PEI)(A), 데카노일 폴리에틸렌이민(Decanoyl poly(ethylene imine), DePEI)(1/2.5)(B), DePEI(1/5) (C), DePEI (1/10) (D) 및 DePEI (1/20) (E) 의 1H NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3은 Gelatin(A), DeGel(1/0.3)(B), DeGel(1/0.5) (C) 및 DeGel (1/0.7) (D)의 FT-IR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 4는 PEI (A), DePEI(1/2.5) (B), DePEI(1/5) (C), DePEI(1/10) (D) 및 DePEI(1/20) (E) 의 FT-IR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 5는 Gelatin (●), DeGel(1/0.3) (△), DeGel(1/0.5) (▼) 및DeGel(1/0.7) (□)의 공기/물 계면 프로파일을 도시한 것이다.
도 6은 PEI (●), DePEI(1/2.5) (○), DePEI(1/5) (▼), DePEI (1/10) (△) 및 DePEI (1/20) (□) 의 공기/물 계면 프로파일을 도시한 것이다.
도 7은 DeGel/DePEI 복합체의 수력학적 반지름(hydrodynamical diameter, □) 및 Gelatin의 Carboxylic group과 PEI의 amino group의 몰비를 9/1에서 1/9로 변하면서 pH 7.0에서 현탁액의 광 산란 강도(light scattering intensity)(●)을 도시한 것이다.
도 8은 Gelatin의 Carboxylic group와 PEI의 amino group를 1:1의 몰비로 유지한 채 pH를 변하게끔 하면서 DeGel/DePEI 복합체의 수력학적 반지름을 도시한 것이다.
도 9의 패널 A)는 CP(nothing), CP(RP) 및 CP(RP/DeGel/DePEI)의 편광 광학 현미경 사진을 도시한 것이며 패널 B)는 Cubic(MAP), Cubic(MAP/pol), Cubic(MAP/pol/GOD)의 편광 광학 현미경 사진을 도시한 것이다.
도 10은 에멀젼의 현미경 촬영 사진으로, 에멀젼 제조직후, 5℃에서 1주, 2주, 및 3주동안 보관한 에멀젼에 대한 것이다.
도 11은 에멀젼의 현미경 촬영 사진으로, 에멀젼 제조직후, 40℃에서 1주, 2주, 및 3주동안 보관한 에멀젼에 대한 것이다.
도 12는 CP(RP)에 탑재된 RP의 시간-의존성 화학적 안정성을 도시한 것이다(범례: 5℃ (●), 20℃ (○), 30℃ (▼) 및 40℃ (△)).
도 13은 CP(RP/DeGel/DePEI)에 탑재된 RP의 시간-의존성 화학적 안정성을 도시한 것이다(범례: 5℃ (●), 20℃ (○), 30℃ (▼) 및 40℃ (△)).
도 14는 O/W 에멀젼에 탑재된 RP의 시간-의존성 화학적 안정성을 도시한 것이다(범례: 5℃ (●), 20℃ (○), 30℃ (▼) 및 40℃ (△)).
도 15는 모노올레인 큐빅상의 투과전자현미경 사진을 보여준다.
도 16은 글루코스 농도에 따른 모노올레인 큐빅상의 MAP 방출율을 보여준다.
도 17은 시간 경과에 따른 본 발명의 모노올레인 큐빅상의 MAP 유보율을 보여준다.
도 18은 본 발명의 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상 현탁액의 비타민의 피부투과도(경피투과속도)를 보여준다.
도 19는 비타민 용액과 글루코스 감지반응 특성이 있는 비타민이 탑재된 모노올레인 큐빅상 현탁액의 세포 독성 평가결과를 보여준다.
도 20은 비타민 용액과 글루코스 감지반응 특성이 있는 비타민이 탑재된 모노올레인 큐빅상 현탁액의 콜라겐 생합성량을 평가한 결과를 보여준다.1 is gelatin (Gelatin) (A), decanoyl gelatin (Decanoyl Gelatin, DeGel) (1/0.3) (B), DeGel (1/0.5) (C), DeGel (1/0.7) (D) 1 H NMR spectrum is shown.
Figure 2 is polyethyleneimine (poly(ethylene imine), PEI) (A), decanoyl polyethylenimine (Decanoyl poly(ethylene imine), DePEI) (1/2.5) (B), DePEI (1/5) (C) , show 1 H NMR spectra of DePEI (1/10) (D) and DePEI (1/20) (E).
3 shows FT-IR spectra of Gelatin (A), DeGel (1/0.3) (B), DeGel (1/0.5) (C) and DeGel (1/0.7) (D).
Figure 4 shows FT- of PEI (A), DePEI (1/2.5) (B), DePEI (1/5) (C), DePEI (1/10) (D) and DePEI (1/20) (E). The IR spectrum is shown.
Figure 5 shows the air/water interface profiles of Gelatin (●), DeGel (1/0.3) (Δ), DeGel (1/0.5) (▼) and DeGel (1/0.7) (□).
6 shows PEI (●), DePEI (1/2.5) (○), DePEI (1/5) (▼), DePEI (1/10) (Δ) and DePEI (1/20) (□) of air / The water interface profile is shown.
7 shows the hydrodynamical diameter (□) of the DeGel/DePEI complex and the light scattering intensity of the suspension at pH 7.0 while changing the molar ratio of the Carboxylic group of Gelatin and the amino group of PEI from 9/1 to 1/9. The scattering intensity (●) is shown.
8 shows the hydrodynamic radius of the DeGel/DePEI complex while changing the pH while maintaining a molar ratio of 1:1 between the carboxylic group of Gelatin and the amino group of PEI.
9, panel A) shows polarized light micrographs of CP (nothing), CP (RP) and CP (RP/DeGel/DePEI), and panel B) is Cubic (MAP), Cubic (MAP/pol), Polarized light micrographs of Cubic (MAP/pol/GOD) are shown.
10 is a photomicrograph of the emulsion, and the emulsion is stored at 5° C. for 1 week, 2 weeks, and 3 weeks immediately after the preparation of the emulsion.
11 is a photomicrograph of the emulsion, and it is about the emulsion stored at 40° C. for 1 week, 2 weeks, and 3 weeks immediately after the preparation of the emulsion.
12 shows the time-dependent chemical stability of RP mounted on CP(RP) (legend: 5°C (●), 20°C (○), 30°C (▼) and 40°C (Δ)).
13 shows the time-dependent chemical stability of RP mounted on CP (RP/DeGel/DePEI) (Legend: 5°C (●), 20°C (○), 30°C (▼) and 40°C (△ )).
Figure 14 depicts the time-dependent chemical stability of RP mounted on O/W emulsions (legends: 5°C (●), 20°C (○), 30°C (▼) and 40°C (Δ)).
15 shows a transmission electron micrograph of a cubic monoolein phase.
16 shows the release rate of MAP on cubic monoolein according to glucose concentration.
17 shows the MAP retention rate of the cubic monoolein phase of the present invention over time.
18 shows the skin permeability (transdermal permeation rate) of vitamins of the cubic monoolein suspension having glucose sensing reaction properties of the present invention.
19 shows the cytotoxicity evaluation results of a vitamin solution and a cubic monoolein suspension loaded with a vitamin having a glucose sensing reaction characteristic.
20 shows the results of evaluating the amount of collagen biosynthesis in a vitamin solution and a cubic monoolein suspension loaded with vitamins having a glucose sensing response characteristic.

본 발명은 지질이중층과 수상채널을 포함하는 모노올레인 큐빅상에 있어서, 소수화된 젤라틴(gelatin); 및 소수화된 폴리에틸렌이민(polyethylenimine);을 포함하는 모노올레인 큐빅상을 제공한다. 상기 젤라틴은 단백질의 종류로서 사용된 것이며 상기 폴리에틸렌이민은 이온성 고분자로서 사용된다. 상기 단백질과 이온성 고분자는 수용성이므로 지질이중층과는 혼합되거나 그 내부에 존재할 수 없다. 그러나 본 발명에서는 상기 단백질인 젤라틴과 이온성 고분자인 폴리에틸렌이민을 소수화 개질하여 소수성을 향상시킨 것이다. 그 결과 상기 젤라틴과 폴리에틸렌이민의소수화 개질부분은 모노올레인 큐빅상의 지질이중층에 고정되며 그 나머지 부분은 수상채널에 드러나 있게 된다. 상기 젤라틴과 폴리에틸렌이민은 pH 4.7 이상의 환경에서 정전기적인 결합에 의해 복합체를 형성할 수 있다. 상기 복합체는 pH가 변화하여 상기 젤라틴과 폴리에틸렌이민의 표면전하가 변화하게 되면 해체되는 가역성 복합체인 특징이 있다. The present invention relates to a monoolein cubic phase comprising a lipid bilayer and an aqueous channel, hydrophobized gelatin; And hydrophobized polyethyleneimine (polyethylenimine); provides a monoolein cubic phase comprising. The gelatin is used as a kind of protein, and the polyethyleneimine is used as an ionic polymer. Since the protein and the ionic polymer are water-soluble, they cannot be mixed with or exist in the lipid bilayer. However, in the present invention, hydrophobicity is improved by hydrophobically modifying the protein, gelatin, and the ionic polymer, polyethyleneimine. As a result, the hydrophobic modified portion of the gelatin and polyethyleneimine is fixed to the lipid bilayer of the cubic monoolein phase, and the remaining portion is exposed in the aqueous channel. The gelatin and polyethyleneimine may form a complex by electrostatic bonding in an environment of pH 4.7 or higher. The complex is characterized as a reversible complex that is disassembled when the surface charge of the gelatin and polyethyleneimine changes due to a change in pH.

상기 소수화된 젤라틴과 소수화된 폴리에틸렌이민은 상기 지질이중층에 고정된 상태로 복합체를 형성하면 수상채널은 폐쇄되고 상기 복합체가 해체되면 수상채널은 개방된다. 특별히, 상기 소수화된 젤라틴과 소수화된 폴리에틸렌이민은 pH가 4.7를 초과하는 환경에서 복합체를 형성하고 pH가 4.7이하인 환경에서 복합체가 해체된다. 따라서 수상채널내의 미세환경 pH를 조절하면 상기 복합체의 형성 또는 해체를 조절할 수 있으므로 수상채널의 폐쇄 및 개방으로 인한 유효성분의 방출을 조절할 수 있게 된다.When the hydrophobized gelatin and the hydrophobized polyethyleneimine form a complex in a state of being fixed to the lipid bilayer, the aqueous channel is closed, and when the complex is dismantled, the aqueous channel is opened. In particular, the hydrophobized gelatin and the hydrophobized polyethyleneimine form a complex in an environment in which the pH exceeds 4.7, and the complex is disintegrated in an environment in which the pH is 4.7 or less. Therefore, by adjusting the pH of the microenvironment in the aqueous channel, the formation or dissolution of the complex can be controlled, so that the release of the active ingredient due to the closing and opening of the aqueous channel can be controlled.

상기 젤라틴의 소수화는 상기 젤라틴의 아미노기(amino group)가 데카노일 클로라이드(decanoyl chloride)의 염화카보닐기(carbonyl chloride group)와 축합반응을 하여 소수화되는 것을 특징으로 하며, 상기 폴리에틸렌이민의 소수화는 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기(amino group)가 데카노일 클로라이드(decanoyl chloride)의 염화카보닐기(carbonyl chloride)와 축합반응을 하여 소수화되는 것을 특징으로 한다. 상기 소수화된 젤라틴은 아미노기와 염화카보닐기의 몰비가 1: 0.3 내지 0.7(아미노기:염화카보닐기)인 것을 특징으로 하며 상기 소수화된 소수화된 폴리에틸렌이민은 아미노기와 염화카보닐기의 몰비가 1: 0.04 내지 1.39(아미노기:염화카보닐기)인 것을 특징으로 하는데 상기 비율을 벗어나게 되면 소수화 젤라틴과 소수화 폴리에틸렌이민의 양친성이 저하되어 지질이중층에 고정되기 어렵다.The hydrophobization of the gelatin is characterized in that the amino group of the gelatin is hydrophobized by a condensation reaction with a carbonyl chloride group of decanoyl chloride, and the hydrophobization of the polyethyleneimine is the polyethylene It is characterized in that the amino group of imine is hydrophobized by condensation reaction with the carbonyl chloride group of decanoyl chloride. The hydrophobized gelatin is characterized in that the molar ratio of the amino group to the carbonyl chloride group is 1: 0.3 to 0.7 (amino group: carbonyl chloride group), and the hydrophobized polyethyleneimine has the molar ratio of the amino group to the carbonyl chloride group 1: 0.04 to It is characterized in that it is 1.39 (amino group: carbonyl chloride group), but if it is out of the above ratio, the amphiphilicity of hydrophobized gelatin and hydrophobized polyethyleneimine is lowered, making it difficult to be fixed in the lipid bilayer.

본 발명의 모노올레인 큐빅상은 레티닐 팔미테이트(Retinyl Palmitate)를 더 포함한다. 상기 레티닐 팔미테이트는 피부노화예방에 효과가 있으나 빛, 산소등에 매우 약하게 쉽게 변질되는 단점이 있다. 상기 레티닐 팔미테이트는 지질의 일종으로서 본발명의 모노올레인 큐빅상에 포함되면 지질이중층에서 위치하여 그 안정성이 향상되는 효과가 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 레티닐 팔미테이트(Retinyl Palmitate)을 포함하는 모노올레인 큐빅상은 종래의 레티닐 팔미테이트 수중유 에멀젼에 대비하여 그 안정성이 우수하여 피부노화예방용 화장품 조성물로 사용하면 보존기간 및 그 효과가 더 향상되는 것으로 확인되었다.The cubic monoolein phase of the present invention further comprises retinyl palmitate. The retinyl palmitate is effective in preventing skin aging, but has a disadvantage in that it is very weakly damaged by light, oxygen, and the like. When the retinyl palmitate is included in the cubic monoolein phase of the present invention as a kind of lipid, it is located in the lipid bilayer and has the effect of improving its stability. According to one embodiment of the present invention, the monoolein cubic phase containing retinyl palmitate of the present invention has excellent stability compared to the conventional retinyl palmitate oil-in-water emulsion, so that it is a cosmetic for preventing skin aging. It was confirmed that the storage period and its effect were further improved when used as a composition.

본 발명은 소수화된 젤라틴(gelatin); 소수화된 폴리에틸렌이민(polyethylenimine); 및The present invention is hydrophobized gelatin (gelatin); hydrophobized polyethylenimine; and

소수화된 글루코스 산화효소(glucose oxidase);을 포함하는 모노올레인 큐빅상을 제공한다. 상기 모노올레인 큐빅상은 상기에서 설명한 소수화된 젤라틴과 소수화된 폴리에틸렌이민의 수상채널내 복합체 형성을 조절하는 방법으로 수상채널을 폐쇄하거나 개방하게 된다. 본 발명의 모노올레인 큐빅상은 소수화된 글루코스 산화효소를 포함하여 글루코스가 존재하는 환경에서 모노올레인 큐빅상의 수상채널을 개방하는 것을 특징으로 한다. 상기 모노올레인 큐빅상은 pH 4.7을 초과하는 조건에서 상기 수상채널을 폐쇄하고 있다가 소수화된 글루코스 산화효소가 글루코스(glucose)를 감지하면 상기 수상채널을 개방한다. 상기 소수화된 글루코스 산화효소는 글루코스를 감지하여 글루콘산으로 변환하게 되고 이 과정에서 상기 수상채널내의 pH가 4.7 미만으로 감소되어 소수화된 젤라틴과 소수화된 폴리에틸렌이민의 수상채널 내 복합체가 해체되므로 상기 수상채널이 개방된다.It provides a cubic monoolein phase comprising; hydrophobized glucose oxidase. The monoolein cubic phase closes or opens the aqueous channel by controlling the formation of a complex in the aqueous channel of the hydrophobized gelatin and hydrophobized polyethyleneimine as described above. The cubic monoolein phase of the present invention is characterized by opening an aqueous channel of the cubic monoolein phase in an environment in which glucose is present, including hydrophobized glucose oxidase. The monoolein cubic phase closes the aqueous channel at a pH exceeding 4.7, and opens the aqueous channel when the hydrophobized glucose oxidase senses glucose. The hydrophobized glucose oxidase senses glucose and converts it to gluconic acid. In this process, the pH in the aqueous channel is reduced to less than 4.7, so that the complex in the aqueous channel of hydrophobized gelatin and hydrophobized polyethyleneimine is dismantled, so the aqueous channel this is open

본 발명의 모노올레인 큐빅상은 비타민C의 유도체인 마그네슘 아스코빌 포스페이트(magnesium ascorbyl phosphate)를 상기 수상채널 내에 탑재할 수 있다. 상기 마그네슘 아스코빌 포스페이트가 탑재된 모노올레인 큐빅상은 직경이 10 내지 100nm이어서 피부침투가 용이한 장점이 있다. 상기 직경이 10nm 미만이면 크기가 너무 작아 세포독성이 나타날 수 있으며 상기 직경이 100nm을 초과하면 피부장벽을 통과하기 어려워 그 효과가 반감될 수 있다.In the cubic monoolein phase of the present invention, magnesium ascorbyl phosphate, a derivative of vitamin C, may be loaded in the aqueous phase channel. The monoolein cubic phase loaded with the magnesium ascorbyl phosphate has a diameter of 10 to 100 nm, so it has the advantage of easy skin penetration. If the diameter is less than 10 nm, the size may be too small and cytotoxicity may appear, and if the diameter exceeds 100 nm, it is difficult to pass through the skin barrier, and the effect may be halved.

하기에서 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples.

실시예 Example

1. 데카노일 젤라틴 및 데카노일 폴리에틸렌 복합체1. Decanoyl Gelatin and Decanoyl Polyethylene Complex

1.1 데카노일 젤라틴 및 데카노일 폴리에틸렌 이민의 제조1.1 Preparation of Decanoyl Gelatin and Decanoyl Polyethylenimine

데카노일 젤라틴(Decanoyl Gelatin, DeGel)은 Matsuda et al. (2012)의 방법에 따라 준비하였다. 먼저, 젤라틴(Gelatin, Gel) 10g과 트라이메틸아민(TMA) 1㎖을 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 99㎖에 용해시켜 혼합용액을 만들었다. 젤라틴의 아미노기(amino group)와 데카노일 클로라이드(decanoyl chloride)의 염화카보닐기(carbonyl chloride)의 몰비(molar ratio)가 1:0.3, 1:0.5 및 1:0.7이 되도록 데카노일 클로라이드의 첨가량을 달리하여 혼합용액을 제조하고 상온의 질소분위기에서 12시간동안 젤라틴의 아미노기와 데카노일 클로라이드의 염화 카보닐기의 축합반응을 수행하였다. 상기 축합반응이 완료된 혼합용액에 차가운 에탄올 600㎖을 부어 DeGel을 침전시킨 후 여과지로 고액분리하여 DeGel을 수득하였다. 상기 수득한 DeGel은 다시 차가운 에탄올로 세척하고 50도 오븐에서 건조시켰다. 상기 방법에 따라 제조된 DeGel은 아미노기(a)와 염화카보닐기(b)의 몰비에 따라 DeGel(a/b)로 명명하였다. Decanoyl Gelatin (DeGel) is described by Matsuda et al. (2012) was prepared according to the method. First, 10 g of gelatin and 1 ml of trimethylamine (TMA) were dissolved in 99 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a mixed solution. The addition amount of decanoyl chloride was varied so that the molar ratio of the amino group of gelatin and the carbonyl chloride of decanoyl chloride was 1:0.3, 1:0.5 and 1:0.7. to prepare a mixed solution, and a condensation reaction of the amino group of gelatin with the carbonyl chloride group of decanoyl chloride was carried out in a nitrogen atmosphere at room temperature for 12 hours. After the condensation reaction was completed, 600 ml of cold ethanol was poured to precipitate DeGel, and then solid-liquid separation was performed with filter paper to obtain DeGel. The obtained DeGel was washed again with cold ethanol and dried in an oven at 50°C. DeGel prepared according to the above method was named DeGel (a/b) according to the molar ratio of the amino group (a) and the carbonyl chloride group (b).

데카노일 폴리에틸렌이민(Decanoyl Polyethylenimine, DePEI)은 Guo et al., (2017)의 방법에 따라 제조하였다. 폴리에틸렌이민 5g을 다이클로로메탄(DCM) 50㎖에 용해시켜 폴리에틸렌이민 용액을 제조한 후 트라이메틸아민 200㎕을 더 첨가하였다. 데카노일 클로라이드 1.3g, 2.65g, 5.3g 및 11.1g을 각각을 다이클로로메탄 50㎖에 용해시켜 데카노일 클로라이드 용액을 제조하였다. 상기 데카노일 클로라이드 용액을 상기 폴리에틸렌이민 용액에 30분 동안 천천히 첨가해면서 반응시켰으며 반응시간 동안 마그네틱 바를 이용하여 교반시켜주었다. 반응이 완료된 데카노일 클로라이드 및 폴리에틸렌이민의 혼합용액은 상온의 질소분위기에서 12시간 동안 교반하였으며 에틸에테르 700㎖을 첨가하여 DePEI를 침전시켰다. DePEI가 침전된 혼합용액은 여과지를 이용하여 고액분리하였으며 상기 고액분리를 통해 수득된 DePEI는 다이클로로메탄에 다시 용해시킨 후 비용매 조건에서 재침전시키는 방법으로 순도를 향상시켰다. 상기 재침전을 통해 수득한 DePEI는 40도 오븐에서 진공상태로 건조시켰다. 상기 방법에 따라 제조된 DePEI은 아미노기(a)와 염화카보닐기(b)의 몰비에 따라 DePEI(a/b)로 명명하였다. Decanoyl Polyethylenimine (DePEI) was prepared according to the method of Guo et al., (2017). 5 g of polyethyleneimine was dissolved in 50 ml of dichloromethane (DCM) to prepare a polyethyleneimine solution, and then 200 μl of trimethylamine was further added. Decanoyl chloride solution was prepared by dissolving 1.3 g, 2.65 g, 5.3 g, and 11.1 g of decanoyl chloride in 50 ml of dichloromethane, respectively. The decanoyl chloride solution was slowly added to the polyethyleneimine solution for 30 minutes and reacted, and stirred using a magnetic bar for the reaction time. After the reaction was completed, the mixed solution of decanoyl chloride and polyethyleneimine was stirred for 12 hours in a nitrogen atmosphere at room temperature, and 700 ml of ethyl ether was added to precipitate DePEI. The mixed solution in which DePEI was precipitated was subjected to solid-liquid separation using filter paper, and the DePEI obtained through the solid-liquid separation was dissolved again in dichloromethane and re-precipitated under non-solvent conditions to improve the purity. DePEI obtained through the reprecipitation was dried in a vacuum state in an oven at 40 degrees. The DePEI prepared according to the above method was named DePEI (a/b) according to the molar ratio of the amino group (a) and the carbonyl chloride group (b).

1.2 데카노일 젤라틴 및 데카노일 폴리에틸렌 이민의 합성 확인1.2 Synthesis confirmation of decanoyl gelatin and decanoyl polyethyleneimine

1.2.1 데카노일 젤라틴 및 데카노일 폴리에틸렌 이민의 수소핵자기 공명분석1.2.1 Hydrogen Nuclear Magnetic Resonance Analysis of Decanoyl Gelatin and Decanoyl Polyethylenimine

DeGel과 DePEI를 중수(D2O)에 10㎎/㎖이 되도록 용해시켰다. 수소핵자기공명스펙트럼은 NMR 분광기(JNM-ECZ400S/L1 400 MHz, JEOL, Japan; located in the Central Laboratory of Kangwon National University)로 얻었다. DeGel and DePEI were dissolved in heavy water (D 2 O) to 10 mg/ml. Hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum was obtained with NMR spectroscopy (JNM-ECZ400S/L1 400 MHz, JEOL, Japan; located in the Central Laboratory of Kangwon National University).

도 1은 젤라틴(Gel), 데카노일 젤라틴(DeGel)의 수소핵자기공명 스펙트럼을 보여주며 상기 DeGel은 DeGel(1/0.3), DeGel(1/0.5) 및 DeGel(1/0.7)로 제조된 것이다. 소수성 잔기인 메틸렌기(methylene group)의 수소 핵자기공명 신호는 1.1ppm 및 2.6ppm에서 확인된다. DeGel의 경우 젤라틴에 대비하여 메틸렌기 신호가 상대적으로 강한 것으로 확인되어 소수성 잔기인 데카노일 잔기(decanoyl group)가 젤라틴에 결합된 것을 확인할 수 있었다. 1 shows hydrogen nuclear magnetic resonance spectra of gelatin (Gel) and decanoyl gelatin (DeGel), and the DeGel is made of DeGel (1/0.3), DeGel (1/0.5) and DeGel (1/0.7). . Hydrogen nuclear magnetic resonance signals of a methylene group, which are hydrophobic residues, are confirmed at 1.1 ppm and 2.6 ppm. In the case of DeGel, it was confirmed that the methylene group signal was relatively strong compared to gelatin, and it was confirmed that the decanoyl group, which is a hydrophobic residue, was bound to the gelatin.

도 2는 폴리에틸렌이민(PEI)과 데카노일 폴리에틸렌이민의 수소핵자기공명 스펙트럼을 보여주며 상기 DePEI는 DePEI(1/2.5),DePEI(1/5), DePEI (1/10) 및 DePEI (1/20)로 제조된 것이다. 수소핵자기공명 스펙트럼의 CH2는 2.53ppm에서 확인되며, DePEI의 데카노일 메틸 잔기(methyl group)는 0.87ppm에서, DePEI의 메틸렌 잔기(methylene group)는 1.29ppm에서 확인된다. 또한 PEI의 아미노 결합 주변의 메틸렌 잔기는 3.14ppm에서 발견되었다. PEI의 메틸렌 잔기와 데카노일의 메틸 잔기의 스펙트럼 면적을 적분하여 PEI와 DC의 몰비를 계산한 결과, 실제 각각 메틸렌 잔기: 메틸 잔기가 1:0.01, 1:0.02, 1:0.04 및 1.1.39로 계산되었다.Figure 2 shows the hydrogen nuclear magnetic resonance spectra of polyethyleneimine (PEI) and decanoyl polyethyleneimine, the DePEI being DePEI (1/2.5), DePEI (1/5), DePEI (1/10) and DePEI (1/ 20) was prepared. CH 2 of the hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum is confirmed at 2.53 ppm, the decanoyl methyl group of DePEI is found at 0.87 ppm, and the methylene group of DePEI is confirmed at 1.29 ppm. Also, a methylene residue around the amino bond of PEI was found at 3.14 ppm. As a result of calculating the molar ratio of PEI and DC by integrating the spectral areas of the methylene residue of PEI and the methyl residue of decanoyl, the methylene residue: methyl residue is 1:0.01, 1:0.02, 1:0.04 and 1.1.39 It was calculated.

1.2.2 데카노일 젤라틴 및 데카노일 폴리에틸렌 이민의 FT-IR 분광분석1.2.2 FT-IR spectroscopy of decanoyl gelatin and decanoyl polyethylene imine

젤라틴, DeGel 및 DePEI 각각을 KBr과 함께 분쇄한 후 프레스를 이용하여 펠릿으로 만들어 FT-IR 분광기(Frontier, PerkinElmer, UK; located in the Central Laboratory of Kangwon National University) 분석을 실시하였다.Gelatin, DeGel, and DePEI each were pulverized with KBr, and then pelleted using a press and analyzed by FT-IR spectroscopy (Frontier, PerkinElmer, UK; located in the Central Laboratory of Kangwon National University).

도 3은 젤라틴(Gelatin), DeGel(1/0.3), DeGel(1/0.5) 및 DeGel(1/0.7)의 FT-IR 스펙트럼을 보여준다. C-O-C 스트레치(stretch)는 1015㎝-1, C-N 스트레치는 1240㎝-1, -CH3는 1380㎝-1, 아마이드(Ⅱ)는 1537㎝-1, 아마이드(Ⅰ)는 1637㎝-1, -CH2 밴딩(bending)은 2933㎝-1, 아마이드(Ⅲ)는 3280㎝-1에서 발견되었다. 데카노일과 젤라틴의 몰비가 증가할수록, 아마이드에 대응하는 신호는 증가하였는데, 이는 데카노일이 젤라틴에 아마이드 결합을 통해 성공적으로 결합(conjugated)되었음을 보여준다.3 shows FT-IR spectra of Gelatin, DeGel (1/0.3), DeGel (1/0.5) and DeGel (1/0.7). COC stretch (stretch) are 1015㎝ -1, CN stretch 1240㎝ -1, -CH 3 is 1380㎝ -1, amide (Ⅱ) is 1537㎝ -1, amide (Ⅰ) is 1637㎝ -1, -CH 2 Bending (bending) was found at 2933 cm -1 , and amide (III) was found at 3280 cm -1 . As the molar ratio of decanoyl and gelatin increased, the signal corresponding to amide increased, indicating that decanoyl was successfully conjugated to gelatin via amide bond.

도 4는 폴리에틸렌이민(PEI), DePEI(1/2.5), DePEI (1/5), DePEI (1/10) 및 DePEI (1/20)의 FT-IR 스펙트럼을 보여준다. PEI 스펙트럼의 경우 CN은 1299㎝-1, CH는 1459㎝-1, 2817㎝-1 및 2937㎝-1, NH는 1578㎝-1 및 3277㎝-1, CO는 1640-1690㎝-1으로 확인되었다. DePEI 스펙트럼의 경우 데카노일 잔기의 CH2는 2843-2863cm-1, amide(Ⅰ)는 3300-3500cm-1에서 발견되었는데, 이는 데카노일이 성공적으로 폴리에틸렌이민에 성공적으로 결합(conjugated)되었음을 보여준다.4 shows FT-IR spectra of polyethyleneimine (PEI), DePEI (1/2.5), DePEI (1/5), DePEI (1/10) and DePEI (1/20). In the case of PEI's spectrum CN 1299㎝ -1, CH is 1459㎝ -1, 2817㎝ -1 and 2937㎝ -1, -1 and NH is 1578㎝ 3277㎝ -1, CO is confirmed by 1640-1690㎝ -1 became For the DePEI spectrum, CH 2 of the decanoyl residue was found at 2843-2863 cm -1 , and amide(I) was found at 3300-3500 cm -1 , indicating that decanoyl was successfully conjugated to polyethyleneimine.

1.2.3 데카노일 젤라틴 및 데카노일 폴리에틸렌 이민의 액체-기체 계면장력 분석1.2.3 Liquid-gas interfacial tension analysis of decanoyl gelatin and decanoyl polyethylene imine

수용액 상태에서 젤라틴, DeGel, 폴리에틸렌이민 및 DePEI의 계면장력(interfacial tension)을 측정하여 액체-기체 계면활성도를 조사하였다. 젤라틴 및 DeGel을 증류수에 각각 10㎎/㎖의 농도가 되도록 용해시킨 후 증류수를 이용하여 2회 희석하였다. 폴리에틸렌이민 및 DePEI 또한 증류수에 각각 10㎎/㎖의 농도가 되도록 용해시킨 후 증류수를 이용하여 2회 희석하였다. 액체-기체 계면장력은 계면장력계(DST 60, SEO, South Korea)를 이용한 환철법(ring method)로 측정하였다. Liquid-gas surface activity was investigated by measuring the interfacial tension of gelatin, DeGel, polyethyleneimine, and DePEI in an aqueous solution. Gelatin and DeGel were dissolved in distilled water to a concentration of 10 mg/ml, respectively, and then diluted twice with distilled water. Polyethylenimine and DePEI were also dissolved in distilled water to a concentration of 10 mg/ml, respectively, and then diluted twice with distilled water. The liquid-gas interfacial tension was measured by the ring method using an interfacial tensiometer (DST 60, SEO, South Korea).

도 5는 젤라틴(Gelatin), DeGel(1/0.3), DeGel(1/0.5) 및 DeGel(1/0.7)의 액체-기체 계면장력 프로파일을 보여준다. 젤라틴은 단백질의 일종으로 양친매성이 있어 오일/워터 에멀젼을 위한 유화제로 사용된다. 젤라틴 용액의 액체-기체 계면장력은 그 농도가 10㎎/㎖ 증가할 때, 72에서 61dyne/㎝으로 감소하는 것으로 확인되었다. DeGel 용액의 액체-기체 계면장력을 분석한 결과, Gelatin 용액과 같이 포화방식(saturation manner)으로 감소하는 것이 확인되었으며 데카노일과 젤라틴의 몰비가 커질수록 더 낮아지는 것이 확인되었다(DeGel(1/0.3): 59.5dyne/㎝, DeGel(1/0.5): 48.0dyne/㎝ 및 DeGel(1/0.7): 36 dyne/㎝). 이는 데카노일 잔기가 젤라틴에 결합함에 따라, 소수성이 증가하여 젤라틴의 양친매성이 향상된다는 것을 의미한다. 5 shows liquid-gas interfacial tension profiles of Gelatin, DeGel (1/0.3), DeGel (1/0.5) and DeGel (1/0.7). Gelatin is a type of protein and is used as an emulsifier for oil/water emulsions due to its amphiphilic properties. It was confirmed that the liquid-gas interfacial tension of the gelatin solution decreased from 72 to 61 dyne/cm when the concentration was increased by 10 mg/ml. As a result of analyzing the liquid-gas interfacial tension of the DeGel solution, it was confirmed that it decreased in a saturation manner like that of the Gelatin solution, and it was confirmed that the molar ratio of decanoyl to gelatin became lower as the molar ratio increased (DeGel (1/0.3). ): 59.5 dyne/cm, DeGel (1/0.5): 48.0 dyne/cm and DeGel (1/0.7): 36 dyne/cm). This means that as the decanoyl residue binds to the gelatin, the hydrophobicity increases and the amphiphilicity of the gelatin is improved.

도 6은 폴리에틸렌이민(PEI), DePEI(1/2.5), DePEI(1/5), DePEI(1/10) 및 DePEI(1/20)의 액체-기체 계면장력 프로파일을 보여준다. 폴리에틸렌이민 용액의 액체-기체 계면장력은 농도 변화에 대하여 무관하였으며 DePEI(1/2.5) 및 DePEI(1/5)의 액체-기체 계면장력 또한 거의 변화가 없었다. 수소핵자기공명스펙트럼을 이용하여 DePEI(1/2.5) 및 DePEI(1/5)의 폴리에틸렌이민(PEI)과 데카노일(DC)의 몰비를 계산한 결과, 각각 1:0.01(PEI:DC) 및 1:0.02(PEI:DC)인 것이 확인되었다. 상기 결과는 DePEI(1/2.5) 및 DePEI(1/5)의 데카노일 잔기의 양이 소수성을 증가시켜 폴리에틸렌이민의 양친매성(표면활성도)을 향상시킬 수 없다는 것을 의미한다. 6 shows liquid-gas interfacial tension profiles of polyethyleneimine (PEI), DePEI (1/2.5), DePEI (1/5), DePEI (1/10) and DePEI (1/20). The liquid-gas interfacial tension of the polyethyleneimine solution was independent of the concentration change, and the liquid-gas interfacial tension of DePEI (1/2.5) and DePEI (1/5) was also almost unchanged. As a result of calculating the molar ratio of polyethyleneimine (PEI) and decanoyl (DC) of DePEI (1/2.5) and DePEI (1/5) using hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum, 1:0.01 (PEI:DC) and It was confirmed that it is 1:0.02 (PEI:DC). The above result means that the amount of decanoyl residues in DePEI (1/2.5) and DePEI (1/5) cannot improve the amphiphilicity (surface activity) of polyethyleneimine by increasing hydrophobicity.

이에 반하여 DePEI(1/10) 용액은 그 농도가 10㎎/㎖ 증가하는 경우, 액체-기체 계면장력이 72dyne/㎝에서 65.1dyne/㎝으로 낮아졌으며 DePEI(1/20) 용액의 경우 72dyne/㎝에서 48.8dyne/㎝으로 급격히 저하된 것이 확인되었다. 이는 데카노일 잔기가 폴리에틸렌이민에 결합함에 따라, 소수성이 증가하여 폴리에틸렌이민의 양친매성(표면활성도)이 향상된다는 것을 의미한다. 수소핵자기공명스펙트럼을 이용하여 DePEI(1/10) 및 DePEI(1/20)의 폴리에틸렌이민(PEI)과 데카노일(DC)의 몰비를 계산한 결과, 각각 1:0.04(PEI:DC) 및 1:1.39(PEI:DC)인 것이 확인되었다.In contrast, when the concentration of the DePEI (1/10) solution was increased by 10 mg/ml, the liquid-gas interfacial tension was lowered from 72 dyne/cm to 65.1 dyne/cm, and in the case of the DePEI (1/20) solution, 72 dyne/cm It was confirmed that it rapidly decreased to 48.8 dyne/cm in This means that as the decanoyl moiety binds to the polyethyleneimine, the hydrophobicity increases and the amphiphilicity (surface activity) of the polyethyleneimine is improved. As a result of calculating the molar ratio of polyethyleneimine (PEI) and decanoyl (DC) of DePEI (1/10) and DePEI (1/20) using nuclear magnetic resonance spectrum, 1:0.04 (PEI:DC) and 1:1.39 (PEI:DC) was confirmed.

1.3 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민 복합체의 제조 및 분석1.3 Preparation and Analysis of Decanoyl Gelatin/Decanoyl Polyethylenimine Complex

1.3.1 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민 복합체의 제조1.3.1 Preparation of Decanoyl Gelatin/Decanoyl Polyethylenimine Complex

데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민(DeGel/DePEI) 복합체를 제조하기 위하여 DeGel와 DePEI를 동시에 시트르산-나트륨 인산 완충용액(citrate-sodium phosphate buffer, pH 7.0)에 용해시켜 젤라틴의 카르복실기와 폴리에틸렌이민의 아미노기는 몰비가 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8 및 1:9가 되도록 하였다. 상기 용해된 DeGel와 DePEI의 젤라틴과 폴리에틸렌이민의 총 농도는 1%(w/w)가 되도록 하였다. To prepare a decanoyl gelatin/decanoyl polyethyleneimine (DeGel/DePEI) complex, DeGel and DePEI were simultaneously dissolved in citrate-sodium phosphate buffer (pH 7.0) to prepare the carboxyl group of gelatin and the amino group of polyethyleneimine. was such that the molar ratios were 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8 and 1:9. The total concentration of gelatin and polyethyleneimine of the dissolved DeGel and DePEI was 1% (w/w).

1.3.2 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민 복합체의 크기분석1.3.2 Size analysis of decanoyl gelatin/decanoyl polyethyleneimine complex

DeGel/DePEI 복합체에 대한 pH의 효과를 확인하기 위하여 젤라틴의 카르복실기와 폴리에틸렌이민의 아미노기의 몰비가 5:5가 되도록 DeGel 및 DePEI를 버퍼 용액(pH 3.0 내지 9.0)에 용해시켰다. DeGel/DePEI 복합체의 수력학적 반지름(Hydraulic Radius) 및 DeGel/DePEI 복합체 현탁액의 광 산란 강도는 광 산란 장치(Plus 90, Brookheaven instrunment, USA)를 이용하여 결정하였다.In order to confirm the effect of pH on the DeGel/DePEI complex, DeGel and DePEI were dissolved in a buffer solution (pH 3.0 to 9.0) so that the molar ratio between the carboxyl group of gelatin and the amino group of polyethyleneimine was 5:5. The hydraulic radius of the DeGel/DePEI complex and the light scattering intensity of the DeGel/DePEI complex suspension were determined using a light scattering device (Plus 90, Brookheaven instrument, USA).

도 7은 DeGel/DePEI 복합체의 수력학적 반지름(㎚)과 광 산란 강도(dynamic light scattering)의 측정결과를 보여준다. DeGel/DePEI 복합체에서 젤라틴의 카르복실기와 폴리에틸렌이민의 아미노기의 몰비가 9:1에서 5:5로 변화하는 경우, DeGel/DePEI 복합체의 반지름은 669nm에서 1606nm로 증가하고 5%를 넘어서는 경우 감소하는 것이 확인되었다. 상기 결과는 DeGel/DePEI 복합체가 이온화된 카르복실기와 수소화된 아미노기의 정전기적 상호작용에 의해 형성되기 때문으로 판단된다. DeGel/DePEI 복합체는 이온화된 카르복실기와 수소화된 아미노기의 정전기적 상호작용에 의해 형성되기 때문에 상기 카르복실기와 아미노기의 몰비가 동일하게 되면 상기 복합체의 크기는 증가하게 된다. 상기 카르복실기와 아미노기의 이온화 정도는 pH 7.0에서 동일하다. 따라서 DeGel/DePEI 복합체의 최대 복합화도는 젤라틴의 카르복실기와 폴리에틸렌이민의 아미노기의 몰비가 5:5인 경우에서 확인된다. 광 산란 강도는 복합체의 크기 및 수에 비례한다. 상기 광 산란 강도 역시 가장 강한 것으로 확인되었다.Figure 7 shows the measurement results of the hydrodynamic radius (nm) and light scattering intensity (dynamic light scattering) of the DeGel / DePEI composite. When the molar ratio of the carboxyl group of gelatin and the amino group of polyethyleneimine in the DeGel/DePEI complex is changed from 9:1 to 5:5, the radius of the DeGel/DePEI complex increases from 669 nm to 1606 nm, and decreases when it exceeds 5%. became The above result is considered to be because the DeGel/DePEI complex is formed by electrostatic interaction between an ionized carboxyl group and a hydrogenated amino group. Since the DeGel/DePEI complex is formed by the electrostatic interaction of an ionized carboxyl group and a hydrogenated amino group, the size of the complex increases when the molar ratio of the carboxyl group and the amino group is the same. The degree of ionization of the carboxyl group and the amino group is the same at pH 7.0. Therefore, the maximum degree of complexity of the DeGel/DePEI complex is confirmed when the molar ratio of the carboxyl group of gelatin and the amino group of polyethyleneimine is 5:5. The light scattering intensity is proportional to the size and number of complexes. The light scattering intensity was also confirmed to be the strongest.

도 8은 젤라틴의 카르복실기와 폴리에틸렌이민의 아미노기의 몰비가 5:5로 유지된 상태에서 pH 변화에 따른 DeGel/DePEI 복합체의 수력학적 반지름을 확인한 결과를 보여준다. 실험결과 pH 값이 3 에서 6으로 증가함에 따라 반지름이 196nm에서 358nm로 증가하는 것이 확인된다. DeGel의 pK 값은 약 4에 해당한다. 따라서 pH 3의 환경에서 DeGel은 양전하를 띄게 되어 음전하 성질이 감소하므로 DeGel과 DePEI 사이의 정전기적 상호작용이 저하되어 복합체의 반지름이 줄어든다. 이에 반하여 pH 값이 3에서 6으로 증가하게 되면, DeGel이 더 강한 음전하 성질을 가지게 되므로 DePEI와의 정전기적 상호작용을 강화되어 복합체의 반지름이 증가된다. 8 shows the results of confirming the hydrodynamic radius of the DeGel/DePEI complex according to the pH change while the molar ratio of the carboxyl group of the gelatin and the amino group of the polyethyleneimine was maintained at 5:5. As a result of the experiment, it is confirmed that the radius increases from 196 nm to 358 nm as the pH value increases from 3 to 6. The pK value of DeGel corresponds to about 4. Therefore, in the environment of pH 3, DeGel becomes positively charged and the negative charge property is reduced. Therefore, the electrostatic interaction between DeGel and DePEI is lowered, and the radius of the complex is reduced. On the other hand, when the pH value is increased from 3 to 6, since DeGel has a stronger negative charge property, the electrostatic interaction with DePEI is strengthened and the radius of the complex is increased.

pH가 6에서 7로 변하는 경우 복합체의 반지름은 358에서 6724nm로 급격하게 증가하는 것이 확인되는데 이는 DeGel 및 DePEI의 정전기적 인력은 더 강해졌기 때문이다. 한편, pH가 7에서 9로 변하는 경우, 상기 복합체의 반지름은 6742nm에서 137nm로 급격히 작아지는 것이 확인된다. 이는 폴리에틸렌이민의 아미노기가 탈양성자화(deprotonated)되어 이온화도가 급격히 감소하기 때문이다. 폴리에틸렌이민의 아미노기는 pK 값이 pH 9.0에서 크게 벗어나지 않는다. 따라서 pH가 7에서 9로 변하는 경우, 폴리에틸렌이민의 아미노기는 이온화도가 급격히 저하되어 DeGel과 DePEI의 정전기적 상호작용은 약화되므로 복합체의 반지름 또한 뚜렷하게 감소되는 것이다. When the pH was changed from 6 to 7, it was confirmed that the radius of the complex increased rapidly from 358 to 6724 nm, because the electrostatic attraction of DeGel and DePEI became stronger. On the other hand, when the pH is changed from 7 to 9, it is confirmed that the radius of the complex decreases rapidly from 6742 nm to 137 nm. This is because the amino group of polyethyleneimine is deprotonated and the degree of ionization is rapidly reduced. The amino group of polyethyleneimine does not significantly deviate from the pK value of pH 9.0. Therefore, when the pH is changed from 7 to 9, the ionization degree of the amino group of polyethyleneimine is rapidly reduced, and the electrostatic interaction between DeGel and DePEI is weakened, so the radius of the complex is also significantly reduced.

2. 소수화 개질 글루코스 산화효소2. Hydrophobic Modified Glucose Oxidase

2.1 글루코스 산화효소(GOD,Glucose oxidase)의 소수화2.1 Hydrophobization of glucose oxidase (GOD, Glucose oxidase)

글루코스 산화효소를 상기 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민(DeGel/DePEI) 복합체와 함께 모노올레인 지질층에 고정시키기 위하여 소수화 하였다. 글루코스 산화효소(Glucose oxidase, 이하 GOD)의 소수성 앵커로 팔미트산(Palmitic acid)을 사용하였으며 상기 팔미트산중 Palmitic acid N-hydroxysuccinimide ester(이하 PA)을 사용하였다. GOD에 PA를 결합한 것을 소수화 개질 글루코스 산화효소(hydrophobically modified GOD, HmGOD)로 명명하였다. The glucose oxidase was hydrophobized to immobilize on the monoolein lipid layer together with the decanoyl gelatin/decanoyl polyethyleneimine (DeGel/DePEI) complex. Palmitic acid was used as a hydrophobic anchor of glucose oxidase ( hereinafter GOD), and Palmitic acid N-hydroxysuccinimide ester (hereinafter PA) of the palmitic acid was used. The binding of PA to GOD was named hydrophobically modified GOD (HmGOD).

GOD와 PA의 몰 비율은 1:40이 되도록 하였다. 먼저 GOD 40㎎를 인산완충용액(sodium phosphate 0.16M, pH 8.8, 2% deoxycholate) 10㎖에 녹였다. 동시에 PA 3.6㎎을 1,4-dioxane 0.4㎖에 녹였다. GOD 용액에 PA 용액을 2시간마다 0.1㎖씩 첨가하며 교반하였다. 0.4㎖을 모두 투입한 후, 30℃를 유지하며 12시간 동안 반응시켜주었다. The molar ratio of GOD and PA was set to 1:40. First, 40 mg of GOD was dissolved in 10 ml of a phosphate buffer solution (sodium phosphate 0.16M, pH 8.8, 2% deoxycholate). At the same time, 3.6 mg of PA was dissolved in 0.4 ml of 1,4-dioxane. The PA solution was added to the GOD solution by 0.1 ml every 2 hours and stirred. After all 0.4 ml was added, the reaction was conducted at 30°C for 12 hours.

싱기 반응이 끝난 후, 불용성 우레아(urea)를 제거하기 위해 0.45㎛ 주사 필터링을 하고, 인산완충용액(sodium phosphate 0.2M, pH8.0) 500㎖에서 투석하였다. 이때 투석 막의 pore 크기는 MW 10,000을 사용하였다. 12시간동안 투석시키되, 3시간마다 완충용액을 교체하였고, 12시간 이후 0.15M PBS 완충용액 pH 7.4 500㎖에서 12시간 투석하였다. 투석이 모두 끝난 후, 0.22㎛ 주사 필터링하고 동결 건조하여 건조 상태의 HmGOD를 얻었다. After the Singhi reaction was completed, 0.45 μm injection filtration was performed to remove insoluble urea, and dialysis was performed in 500 ml of sodium phosphate buffer solution (sodium phosphate 0.2M, pH8.0). In this case, the pore size of the dialysis membrane was MW 10,000. Dialysis was carried out for 12 hours, but the buffer was changed every 3 hours, and after 12 hours, it was dialyzed in 500 ml of 0.15M PBS buffer pH 7.4 for 12 hours. After dialysis was completed, 0.22 μm injection was filtered, and dried HmGOD was obtained by freeze-drying.

소수화 과정에서 사용되는 분산제는 hydrophilic lipophilic balance number(HLB number)가 4~15인 분산제가 적합한 것으로 확인되었다. 상기 범위를 벗어난 분산제를 사용할 경우에 글루코스 산화효소가 변성되고, palmitic acid N-hydroxysuccinimide ester를 효과적으로 분산시킬 수 없다. HLB가 4~15인 분산제는 sorbitan laurate와 sorbitan palmitate, PEO(20) sorbitan trioleate, deoxycholate 등이 있다. 또한, 용액에서의 분산제 농도는 0.1~5%가 적합하며, 가장 적합한 범위는 1~3%이다. 이 범위를 벗어나면 낮은 경우 소수성 앵커인 PA를 녹이기 위해 더 많은 양의 유기용매가 첨가되어 글루코스 산화효소가 변성되며, 높을 경우에는 PA가 용해되지 않거나 응집되어 반응이 진행되지 않을 수 있다. As a dispersant used in the hydrophobicization process, it was confirmed that a dispersant having a hydrophilic lipophilic balance number (HLB number) of 4 to 15 is suitable. When a dispersing agent outside the above range is used, glucose oxidase is denatured, and palmitic acid N-hydroxysuccinimide ester cannot be effectively dispersed. Dispersants with an HLB of 4 to 15 include sorbitan laurate, sorbitan palmitate, PEO(20) sorbitan trioleate, and deoxycholate. Also, the concentration of the dispersant in the solution is preferably 0.1 to 5%, and the most suitable range is 1 to 3%. If it is out of this range, a higher amount of organic solvent is added to dissolve the hydrophobic anchor PA, so that the glucose oxidase is denatured.

소수화시 글루코스 산화효소와 소수성 앵커의 몰 비율은 1:50~1:30이 가장 적합하다. 이보다 낮은 범위일 경우 글루코스 산화효소에 결합되는 소수성 앵커가 적어 모노올레인 큐빅상에 고정화될 수 없고, 이보다 높은 범위일 경우 소수성 앵커가 과도해 효소 활성이 저하되기 때문이다. For hydrophobization, the molar ratio of glucose oxidase and hydrophobic anchor is 1:50 to 1:30 is most suitable. If the range is lower than this, there are few hydrophobic anchors binding to glucose oxidase and thus cannot be immobilized on the cubic monoolein, and if the range is higher than this, the hydrophobic anchor is excessive and the enzyme activity is lowered.

2.2 글루코스 산화효소의 소수화 분석2.2 Hydrophobicity Analysis of Glucose Oxidase

소수화 개질 글루코스 산화효소(hydrophobically modified GOD, HmGOD)의 경우, 단백질로서 1H-NMR로 소수화 정도를 분석하기 어려운 문제점이 있어 TNBS(2,4,6-Trinitrobenzene Sulfonic Acid)법을 이용하여 소수화를 분석하였다. 먼저 인산완충용액(sodium phosphate 0.01M, pH 8.9)을 제조하였다. 상기 완충용액을 이용하여 5% sodium lauryl sulfate (SLS)용액과 0.03% TNBS 용액을 제조하였다. 5% SLS용액은 SLS 1g을 20.74㎖의 인산완충용액에 녹여 제조하였다. 0.03% TNBS 용액은 5% TNBS 용액 100μl를 인산완충용액 16.6㎖에 넣어 제조하였다. HmGOD는 1㎎/㎖이 되도록 인산완충용액에 녹였다. 5% SLS 용액 1㎖, 0.03% TNBS 용액 1㎖과 HmGOD 용액 0.5㎖을 10㎖ 바이알에 넣고 50℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이후, 1.9㎖ HCl(0.21M) 용액을 넣고, 상온에서 30분간 방치하여 반응을 종료시켰다. 이후 335nm UV spectrometer를 통해 흡광도를 관찰하여 소수화정도를 확인하였다. 이때, 다양한 농도의 아미노산 표준용액을 상기와 같은 절차에 따라 표준 곡선을 제조하였다. GOD에 결합된 팔미트산의 수는 흡광도를 표준 곡선과 비교함으로써 결정되었다. 소수화 시키지 않은 GOD도 동일한 과정으로 아미노기를 측정하였다. GOD의 흡광도는 0.222이고, HmGOD의 흡광도는 0.205로 측정되었다. 표준 곡선식에 대입하여 계산한 결과에 의하면, HmGOD의 아미노기 수는 21개이며 GOD의 아미노기 수는 24개로, 3개의 PA가 GOD에 결합되었음을 확인하였다.In the case of hydrophobically modified GOD (HmGOD), it is difficult to analyze the degree of hydrophobization by 1 H-NMR as a protein. did First, a phosphate buffer solution (sodium phosphate 0.01M, pH 8.9) was prepared. Using the buffer solution, 5% sodium lauryl sulfate (SLS) solution and 0.03% TNBS solution were prepared. A 5% SLS solution was prepared by dissolving 1 g of SLS in 20.74 ml of a phosphate buffer solution. A 0.03% TNBS solution was prepared by adding 100 μl of a 5% TNBS solution to 16.6 ml of a phosphate buffer solution. HmGOD was dissolved in a phosphate buffer solution to 1 mg/ml. 1 ml of 5% SLS solution, 1 ml of 0.03% TNBS solution, and 0.5 ml of HmGOD solution were placed in a 10 ml vial and reacted at 50° C. for 1 hour. Thereafter, 1.9 mL of HCl (0.21M) solution was added, and the reaction was terminated by standing at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the degree of hydrophobization was confirmed by observing the absorbance through a 335 nm UV spectrometer. At this time, standard curves were prepared according to the same procedure as above for amino acid standard solutions of various concentrations. The number of palmitic acid bound to GOD was determined by comparing the absorbance to a standard curve. GOD, which was not hydrophobized, was also measured for amino groups in the same manner. The absorbance of GOD was measured to be 0.222, and the absorbance of HmGOD was measured to be 0.205. According to the calculation result by substituting the standard curve formula, the number of amino groups in HmGOD was 21 and the number of amino groups in GOD was 24, confirming that 3 PAs were bound to GOD.

2.3 소수화 개질 글루코스 산화효소의 효소활성 분석2.3 Analysis of Enzyme Activity of Hydrophobic Modified Glucose Oxidase

소수화 개질 글루코스 산화효소(hydrophobically modified GOD, HmGOD) 효소 활성을 평가하였다(Jo & kim, Lipids, 43(10), 937-943, 2008). Hydrophobically modified GOD (HmGOD) enzyme activity was evaluated (Jo & Kim, Lipids , 43(10), 937-943, 2008).

10% 글루코스 용액 0.173㎖과 0.21mM o-dianisidine dihydrochloride 용액 0.827㎖를 혼합 하였다. 그 후 0.33㎎/㎖ horseradish peroxidase 용액 (60 purpurogallin units/㎖) 0.033㎖을 용액에 첨가했다. 최종적으로, 미리 제조 된 용액에 아세트산나트륨(sodium acetate) 완충용액 (0.023㎎/㎖) 중의 0.1% 효소 용액을 첨가하였다. 효소 반응의 정도는 시간에 따라 500㎚에서 흡광도를 측정하여 측정하였다. 대조군으로서, 효소가 없는 아세트산나트륨 완충용액을 사용하였다. 활성은 기울기로, HmGOD의 효소 활성은 GOD의 효소 활성의 70.54% 수준인 것으로 확인되었다.0.173 ml of 10% glucose solution and 0.827 ml of 0.21 mM o-dianisidine dihydrochloride solution were mixed. Then, 0.033 ml of 0.33 mg/ml horseradish peroxidase solution (60 purpurogallin units/ml) was added to the solution. Finally, a 0.1% enzyme solution in sodium acetate buffer (0.023 mg/ml) was added to the previously prepared solution. The degree of the enzymatic reaction was measured by measuring the absorbance at 500 nm with time. As a control, an enzyme-free sodium acetate buffer was used. The activity is a slope, and it was confirmed that the enzymatic activity of HmGOD was 70.54% of the enzymatic activity of GOD.

2.4 pH에 따른 소수화 개질 글루코스 산화효소의 효소활성 확인2.4 Confirmation of enzymatic activity of hydrophobization-modified glucose oxidase according to pH

시간에 따른 글루코스 용액의 pH를 측정함으로써 GOD와 HmGOD의 효소활성을 확인하였다. 2.5㎎의 GOD와 HmGOD를 5㎖의 글루코스 용액에 용해시켰다. 글루코스 용액의 농도는 0㎎/dL, 50㎎/dL, 100㎎/dL, 200㎎/dL, 400㎎/dL 이며, 상온에 두어 pH 변화를 12시간 동안 측정하였다. GOD의 글루코스 농도에 따른 용액의 pH 변화는 글루코스가 포함되지 않은 용액의 경우 pH 6.3 내지 6.2 로 6.25 근처에서 12시간동안 거의 일정하게 유지되지만, 글루코스 농도가 50㎎/dL인 경우, pH값이 2시간 동안 pH 6.21에서 pH 3.70으로 감소하는 것이 확인 되었다. 2시간 이후 pH 3.37까지 감소하는 것이 확인 되었는데, 이는 HmGOD가 글루코스를 글루콘산으로 전환시켜 용액의 pH가 감소하는 것으로 판단된다. 또한 1시간동안 pH가 급격히 감소한 경우, 효소반응이 1시간 이내에 종결되는 것이 확인 되었다. 글루코스 농도가 100㎎/dL, 200㎎/dL, 400㎎/dL 용액 또한 pH 3.22, 3.07, 2.98까지 감소하였는데 이는 글루코스 농도가 높음에 따라 글루콘산으로 전환되는 양이 많기 때문에 pH의 감소정도가 컸던 것으로 판단된다. HmGOD의 글루코스 농도에 따른 용액의 pH 변화는 글루코스가 포함되지 않은 용액의 경우 pH 7.2 내지 6.8로 7.0 근처에서 12시간동안 거의 일정하게 유지되지만, 글루코스 농도가 50㎎/dL인 경우, pH값이 2시간동안 pH 7.4에서 pH 4.47로 감소하는 것이 확인 되었으며 2시간 이후에는 pH 3.48까지 감소하는 것이 확인되었다. 상기 결과는 HmGOD가 글루코스를 글루콘산으로 전환시켜 용액의 pH가 감소하였다는 것을 의미하며 4시간동안 pH가 급격히 감소한 경우, 효소반응이 4시간 이내에 종결되었음을 의미한다. 추가적으로 글루코스 농도가 100㎎/dL, 200㎎/dL, 400㎎/dL 용액 또한 pH 3.31, 3.21, 3.19까지 감소하는 것이 확인되었다. 글루코스 농도가 높음에 따라 글루콘산으로 전환되는 양이 많기 때문에 감소하는 정도가 높았다. 이를 통하여 HmGOD가 GOD와 마찬가지로 글루코스를 글루콘산으로 전환시킬 수 있는 활성이 있음을 확인하였다.The enzymatic activity of GOD and HmGOD was confirmed by measuring the pH of the glucose solution over time. 2.5 mg of GOD and HmGOD were dissolved in 5 ml of glucose solution. The concentrations of the glucose solution were 0 mg/dL, 50 mg/dL, 100 mg/dL, 200 mg/dL, and 400 mg/dL, and the pH change was measured for 12 hours at room temperature. The pH change of the solution according to the glucose concentration of GOD was maintained almost constant for 12 hours near 6.25 at pH 6.3 to 6.2 for the solution without glucose, but when the glucose concentration was 50 mg/dL, the pH value was 2 It was confirmed that the pH decreased from 6.21 to pH 3.70 over time. It was confirmed that the pH decreased to 3.37 after 2 hours, which is considered to be that HmGOD converts glucose to gluconic acid, thereby reducing the pH of the solution. In addition, it was confirmed that when the pH was rapidly decreased for 1 hour, the enzymatic reaction was terminated within 1 hour. Glucose concentrations of 100 mg/dL, 200 mg/dL, and 400 mg/dL solutions also decreased to pH 3.22, 3.07, and 2.98, which is because the amount of conversion to gluconic acid was large as the glucose concentration was high. is judged to be The pH change of the solution according to the glucose concentration of HmGOD was maintained almost constant for 12 hours near 7.0 with a pH of 7.2 to 6.8 in the case of a solution without glucose, but when the glucose concentration was 50 mg/dL, the pH value was 2 It was confirmed that the pH decreased from 7.4 to 4.47 during the time, and it was confirmed that the pH decreased to 3.48 after 2 hours. The above result means that HmGOD converted glucose to gluconic acid and the pH of the solution decreased. Additionally, it was confirmed that the glucose concentration of 100 mg/dL, 200 mg/dL, and 400 mg/dL solutions also decreased to pH 3.31, 3.21, and 3.19. As the glucose concentration was high, the amount of conversion to gluconic acid was large, so the degree of decrease was high. Through this, it was confirmed that HmGOD has the same activity as GOD to convert glucose into gluconic acid.

3. 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민/레티닐 팔미테이트 모노올레인 큐빅상3. Decanoyl gelatin/decanoyl polyethyleneimine/retinyl palmitate monoolein cubic phase

3.1 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민/레티닐 팔미테이트 모노올레인 큐빅상의 제조 3.1 Preparation of decanoyl gelatin/decanoyl polyethyleneimine/retinyl palmitate monoolein cubic phase

모노올레인 2g을 20㎖ 유리용기에 넣고 50℃ 수조에서 중탕하여 용융시켜 모노올레인 용융물을 제조한 후 상온에 두었다. 상기 제조한 모노올레인 용융물의 온도가 40℃가 되면 레티닐 팔미테이트(Retinyl Palmitate, RP) 40㎎을 상기 모노올레인 용융물에 첨가하여 모노올레인-레티닐팔미테이트 혼합물을 제조하였다. 2 g of monoolein was placed in a 20ml glass container, melted by boiling in a water bath at 50° C., and then placed at room temperature to prepare a monoolein melt. When the temperature of the prepared monoolein melt reached 40° C., 40 mg of retinyl palmitate (RP) was added to the monoolein melt to prepare a monoolein-retinyl palmitate mixture.

DeGel 카르복실기와 DePEI 아미노기의 몰비가 5:5가 되도록 DeGel 및 DePEI를 증류수에 용해시키고 pH를 5.0으로 맞춘 후 35℃로 가열하여 DeGel-DePEI 혼합용액을 제조하였다. 이때 DeGel 및 DePEI의 양은 합하여 증류수 총 농도의 1%(w/w)가 되도록 하였다. 상기 DeGel-DePEI 혼합용액 0.714㎖를 상기 제조한 모노올레인-레티닐 팔미테이트 혼합물에 상기 20㎖ 유리용기에 담겨 제조된 모노올레인-레티닐 팔미테이트 혼합물에 조심스럽게 도포하였다. 7일 이후, 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민 복합체를 형성하기 위하여, 0.143㎖의 pH 7.4 PBS를 첨가하였다. 그 후 질소가스로 충진하여 상기 20㎖ 유리용기의 입구를 밀봉하고 DeGel-DePEI 혼합용액과 PBS용액이 모노올레인에 완전히 흡수되어 깨끗하고 투명한 겔이 될 때까지 30℃ 오븐에 두어 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민/레티닐 팔미테이트 모노올레인 큐빅상을 제조하였다. 이와 함께 모노몰레인만으로 구성된 모노올레인 큐빅상, DeGel/DePEI과 모노올레인만으로 구성된 모노올레인 큐빅상을 제조하였다.DeGel and DePEI were dissolved in distilled water so that the molar ratio of the DeGel carboxyl group and the DePEI amino group was 5:5, the pH was adjusted to 5.0, and then heated to 35° C. to prepare a DeGel-DePEI mixed solution. At this time, the amounts of DeGel and DePEI were added to be 1% (w/w) of the total concentration of distilled water. 0.714 ml of the DeGel-DePEI mixed solution was carefully applied to the monoolein-retinyl palmitate mixture prepared by putting the prepared monoolein-retinyl palmitate mixture in the 20 ml glass container. After 7 days, in order to form a decanoyl gelatin/decanoyl polyethyleneimine complex, 0.143 ml of pH 7.4 PBS was added. After that, fill with nitrogen gas, seal the mouth of the 20ml glass container, and place in an oven at 30°C until the DeGel-DePEI mixed solution and PBS solution are completely absorbed in monoolein to become a clean and transparent gel. A cubic phase of decanoyl polyethyleneimine/retinyl palmitate monoolein was prepared. In addition, a cubic monoolein phase composed of only monomolin and a cubic monoolein phase composed of only DeGel/DePEI and monoolein were prepared.

RP, DeGel 및 DePEI를 포함하는 모노올레인 큐빅상을 CP(RP/DeGel/DePEI)라고 명명하였으며, 모노올레인만으로 구성된 큐빅상을 CP(nothing)이라 하였으며, 레티닐 팔미테이트(RP)와 모노올레인만으로 구성된 큐빅상을 CP(RP)라고 명명하였다. The cubic phase of monoolein containing RP, DeGel and DePEI was named CP (RP/DeGel/DePEI), and the cubic phase consisting of monoolein alone was called CP (nothing), and retinyl palmitate (RP) and mono The cubic phase composed only of olein was named CP (RP).

3.23.2 CP(nothing), CP(RP), CP(RP/DeGel/DePEI)에 대한 편광 광학 현미경 분석Polarized light microscopy analysis for CP(nothing), CP(RP), CP(RP/DeGel/DePEI)

상기 제조한 모노올레인 큐빅상을 커버 글라스의 O-링 스페이서에 채워 넣고 커버 글라스를 올린 후 상기 큐빅상이 위치한 셀을 만들었다. 상기 셀은 고온반응기(heating block, HS81, Mettler Toledo, USA)에서 30℃에서 80℃까지 분당 2도씩 온도를 상승시키면서 편광 광학 현미경을 통하여 큐빅상의 상전이를 관찰하였다.The prepared cubic monoolein phase was filled in the O-ring spacer of the cover glass, and the cover glass was raised to make a cell in which the cubic phase was located. In the cell, the cubic phase transition was observed through a polarized light microscope while increasing the temperature from 30°C to 80°C by 2 degrees per minute in a high-temperature reactor (heating block, HS81, Mettler Toledo, USA).

도 9의 패널 A)는 상기의 방법으로 관찰한 CP(nothing), CP(RP), and CP(RP/DeGel/DePEI)의 편광 광학 현미경 사진을 보여준다. CP(nothing)은 61℃ 보다 낮은 온도에서 평평한 재질감을 보여주었으며, 61.7℃에서 복굴절(birefringence)을 나타내어 고온에서는 복굴절이 더 명확히 관찰되었다. 모노올레인 큐빅상은 편광을 조사하는 경우 복굴절을 나타내지 않는 광학적 등방성을 가지며 80℃ 부근에서 육각상(hexagonal phase)으로 상전이가 일어나는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 육각상은 광학적 이방성(anisotropic)을 가지기 때문에, 편광 조사시 복굴절을 나타내며 상기 복굴절이 일어나기 시작하는 온도는 큐빅-육각 상전이 온도로부터 확인이 가능하다. Panel A of FIG. 9 shows polarized light micrographs of CP (nothing), CP (RP), and CP (RP/DeGel/DePEI) observed by the above method. CP (nothing) showed a flat texture at a temperature lower than 61°C, and exhibited birefringence at 61.7°C, so that the birefringence was more clearly observed at high temperature. It is known that the monoolein cubic phase has optical isotropy that does not exhibit birefringence when irradiated with polarized light, and a phase transition to a hexagonal phase occurs near 80°C. In addition, since the hexagonal phase is optically anisotropic, it exhibits birefringence when polarized light is irradiated, and the temperature at which the birefringence starts can be confirmed from the cubic-hexagonal phase transition temperature.

본 발명에서는 실시예를 통하여 모노올레인 큐빅상의 상전이 온도를 확인하였다. 본 발명의 CP(nothing)의 상전이 온도는 61.7℃로 종래의 모노올레인 큐빅상에 대비하여 낮은 상전이 온도를 가지는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 사용된 모노올레인은 리놀레산의 글리세라이드, 스테아릭산 및 팔리틱 산과 같은 불순물이 약 14%정도 포함하고 있다, CP(nothing)은 상기 불순물에 의해 모노올레인 큐빅상 이중층의 상전이 온도가 감소하게 되었고 이로 인해 유동성을 가지게 된 것으로 판단된다. In the present invention, the phase transition temperature of the cubic monoolein phase was confirmed through Examples. The phase transition temperature of CP (nothing) of the present invention was 61.7° C., which was confirmed to have a lower phase transition temperature compared to the conventional cubic monoolein phase. The monoolein used in this study contains about 14% of impurities such as linoleic acid glyceride, stearic acid, and pallitic acid. decreased, and it is judged to have liquidity as a result.

본 발명의 CP(RP)는 상전이 온도가 58.2℃로 CP(nothing)보다 약 3.5℃ 낮은 것으로 확인 되었다. 상기 RP는 지용성 화합물로서 모노올레인 큐빅상의 이중층에 녹이 들어가게 되며 그 함량은 모노올레인 질량 기준 2%(w/w)이다. 상기 RP는 이중층 막에 끼어들어가 유동성을 증가시킨다. 따라서 CP(RP)의 상전이 온도는 CP(nothing)보다 낮다. 추가적으로 CP(RP)의 등방성 성질(isotropic property)이 보다 낮은 온도 범위(30 내지 57.8℃)에서 관찰되는 것으로 보아 상기 RP는 모노올레인 큐빅상 이중층의 구조붕괴 없이도 안전하게 탑재될 수 있는 것으로 판단된다(도 9 참조).The CP (RP) of the present invention has a phase transition temperature of 58.2° C., which is about 3.5° C. lower than that of CP (nothing). The RP is a fat-soluble compound, and rust enters the double layer of the cubic monoolein phase, and its content is 2% (w/w) based on the monoolein mass. The RP intercalates in the bilayer film to increase the fluidity. Therefore, the phase transition temperature of CP(RP) is lower than that of CP(nothing). Additionally, since the isotropic property of CP (RP) is observed in a lower temperature range (30 to 57.8 ° C), it is determined that the RP can be safely mounted without structural collapse of the monoolein cubic bilayer ( see Fig. 9).

CP(RP/DeGel/DePEI)의 상전이 온도는 약 56.9℃로 CP(RP)의 상전이 온도보다 1.3℃ 더 낮은 것으로 확인 되었다. 이는 DeGel 및 DePEI가 양친매성이 있는 표면-활성적인 화합물이며 DeGel 및 DePEI에 존재하는 소수성인 데카노일 잔기가 이중층 막에 삽입되어 존재하기 때문으로 판단된다. 상기 모노올레인 큐빅상에 포함된 DeGel 및 DePEI는 모노올레인 질량 대비 0.43%(w/w)이다. The phase transition temperature of CP (RP/DeGel/DePEI) was about 56.9°C, which was confirmed to be lower than that of CP(RP) by 1.3°C. This is thought to be because DeGel and DePEI are amphipathic, surface-active compounds, and hydrophobic decanoyl residues present in DeGel and DePEI are inserted into the bilayer membrane. DeGel and DePEI included in the cubic monoolein phase are 0.43% (w/w) relative to the monoolein mass.

도 9의 결과에 따르면, CP(RP/DeGel/DePEI)는 30 내지 56.9℃의 저온 범위에서 광학적 등방성이기 때문에 DeGel 및 DePEI가 모노올레인 큐빅상의 구조가 붕괴되지 않고도 탑재될 수 있는 것으로 판단된다. According to the results of FIG. 9, since CP (RP/DeGel/DePEI) is optically isotropic in the low temperature range of 30 to 56.9° C., it is determined that DeGel and DePEI can be mounted without collapse of the monoolein cubic phase structure.

4. 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민/레티닐 팔미테이트 모노올레인 큐빅상에 포함된 레티닐 팔미테이트의 안정성 평가4. Stability evaluation of retinyl palmitate contained in decanoyl gelatin/decanoyl polyethyleneimine/retinyl palmitate monoolein cubic phase

4.1 레티닐 팔미테이트 수중유(O/W) 에멀젼의 제조4.1 Preparation of Retinyl Palmitate Oil-in-Water (O/W) Emulsion

유상(oil phase)으로서 레티닐 팔미테이트(RP) 용액을 사용하였다. 상기 RP 용액은 레티닐 팔미테이트(RP) 1.26g를 30㎖ 대두유에 용해시켜 그 농도가 4.2%(w/v)가 되도록 하였다. 수상(water phase)으로서 유화제 용액을 사용하였다. 상기 유화제 용액은 트윈 80(tween 80) 1.5g를 증류수 150㎖에 용해시켜 그 농도가 1%(w/v)가 되도록 하였다. 상기 RP 용액을 유화제 용액에 서서히 첨가하면서, 호모게나이저(120V/60Hz, PC-420D, CORNING, USA)를 이용하여 1150rpm으로 혼합하였으며, 그 후 5분 동안 고속 호모믹서(high speed homomixer, HG-15D, WiseTis, South Korea)로 5000rpm에서 균질화하였다.A retinyl palmitate (RP) solution was used as the oil phase. The RP solution was prepared by dissolving 1.26 g of retinyl palmitate (RP) in 30 ml soybean oil so that the concentration was 4.2% (w/v). An emulsifier solution was used as the water phase. For the emulsifier solution, 1.5 g of tween 80 was dissolved in 150 ml of distilled water so that the concentration was 1% (w/v). While the RP solution was slowly added to the emulsifier solution, it was mixed at 1150 rpm using a homogenizer (120V/60Hz, PC-420D, CORNING, USA), and then a high speed homomixer (HG-) for 5 minutes. 15D, WiseTis, South Korea) was homogenized at 5000 rpm.

4.24.2 레티닐 팔미테이트 수중유 에멀젼의 안정성 평가Stability evaluation of retinyl palmitate oil-in-water emulsion

상기 제조한 RP 수중유 에멀젼 20㎖을 50㎖짜리 유리용기 4개에 각각 담고, 뚜껑을 닫아 단단히 밀봉한 뒤 5℃, 20℃, 30℃ 및 40℃에서 4주 동안 보관하였다. 정해진 시간에 각 유리용기에 담긴 RP 수중유 에멀젼 시료를 채취하여 광학 현미경(CX31, OLYMPUS, Japan)으로 관찰하였으며 이미지 분석기(Image-Pro Plus, Media Cybernetics, USA)를 이용하여 광학현미경 사진을 분석하고 그 반지름을 추정하였다. 20 ml of the prepared RP oil-in-water emulsion was placed in 4 50 ml glass containers, respectively, tightly sealed with a lid, and stored at 5° C., 20° C., 30° C. and 40° C. for 4 weeks. At a set time, samples of RP oil-in-water emulsion contained in each glass container were collected and observed with an optical microscope (CX31, OLYMPUS, Japan), and optical micrographs were analyzed using an image analyzer (Image-Pro Plus, Media Cybernetics, USA). The radius was estimated.

도 10은 4도에서 RP 수중유 에멀젼의 시간에 따른 변화를 현미경으로 촬영한 사진을 보여준다. 제조된 직후의 RP 수중유 에멀젼은 오일드롭(oil drop)의 반지름은 평균 26.83±10.80㎛로서 성공적으로 제조되었다. 본 발명에서 사용한 트윈 80의 경우 poly(oxyethylene) 부분이 완전히 수화되면, 트윈 80의 poly(oxyethylene) 부분은 수상 벌크쪽으로 배향되고, 트윈 80의 올레산 사슬(oleic hydrocarbon chain) 부분은 오일 드롭쪽으로 배향되므로 오일 드롭을 안정화시키는 효과가 있다. 제조 후 1, 2, 3 및 4주 동안 5℃에서 보관한 RP 수중유 에멀젼의 경우, 그 반지름이 각각 27.24±13.74㎛, 28.56±15.17㎛, 28.90±16.46㎛, 및 28.90±19.26㎛인 것으로 확인 되어 시간이 지남에 따라 반지름이 증가하는 것이 확인된다. 이는 시간이 지남에 따라오일 드롭 사이의 융합(coalescence)이 진행되어 에멀젼이 비균질화 되었기 때문으로 판단된다. 상기와 같은 에멀젼의 불안정화 과정은 크리밍(creaming), 응결(agglomeration) 및 융합(coalescence)로 구성되어 있다. 상기 오일드롭은 통상 연속상의 수분에 비하여 가벼운 특성이 있어 뜨기 쉬우며 크리미층(creamy layer)과 같은 짙은 막을 형성하는 특징이 있다. 상기 크리미층에서 상기 오일 드롭은 다른 드롭들과 서로 접하게 되고, 응결(agglomeration)하게 된다. 그러면 오일 드롭 간의 얇은 수분층은 빠져나가게 되고, 오일 드롭을 둘러싸고 있는 유화제가 측면으로 이동하게 되므로 융합이 진행된다. 오일 드롭의 반지름의 증가는 이러한 에멀젼의 불안정화 과정에 기인하게 되는 것이다. Figure 10 shows a microscopic photograph of the change with time of the RP oil-in-water emulsion at 4 degrees. The RP oil-in-water emulsion immediately after preparation was successfully prepared with an average oil drop radius of 26.83±10.80 μm. In the case of Tween 80 used in the present invention, when the poly(oxyethylene) portion is completely hydrated, the poly(oxyethylene) portion of Tween 80 is oriented toward the aqueous bulk, and the oleic hydrocarbon chain portion of Tween 80 is oriented toward the oil drop. It has the effect of stabilizing the oil drop. In the case of the RP oil-in-water emulsion stored at 5 ° C for 1, 2, 3 and 4 weeks after preparation, the radii were found to be 27.24 ± 13.74 µm, 28.56 ± 15.17 µm, 28.90 ± 16.46 µm, and 28.90 ± 19.26 µm, respectively. It is confirmed that the radius increases with time. This is considered to be because the emulsion became non-homogeneous due to the progress of coalescence between the oil drops over time. The emulsion destabilization process as described above consists of creaming, agglomeration and coalescence. The oil drop has a light characteristic compared to the moisture of the continuous phase, so it is easy to float and has a characteristic of forming a thick film such as a creamy layer. In the creamy layer, the oil drop comes into contact with other drops and causes agglomeration. Then, the thin water layer between the oil drops escapes, and the emulsifier surrounding the oil drop moves to the side, so that the fusion proceeds. The increase in the radius of the oil drop is due to this emulsion destabilization process.

추가적으로 20℃ 및 30℃도에서 저장된 RP 수중유 에멀젼에서도 5℃에서 저장된 RP 수중유 에멀젼와 유사한 안정성을 보이는 것으로 확인 되었다. 1, 2, 3 및 4주 동안 20℃에서 저장된 RP 수중유 에멀젼의 반지름은 각각 27.43±13.81㎛, 28.79±16.27㎛, 28.95±17.06㎛, 및 29.21±19.66㎛인 것으로 확인 되었으며 1, 2, 3 및 4주 동안 30℃에서 저장된 RP 수중유 에멀젼의 반지름은 각각 27.87±14.07㎛, 28.37±17.34㎛, 28.98±18.77㎛, 및 29.95±21.1㎛인 것으로 확인 되었다. Additionally, it was confirmed that the RP oil-in-water emulsion stored at 20°C and 30°C showed similar stability to the RP oil-in-water emulsion stored at 5°C. The radii of the RP oil-in-water emulsions stored at 20 °C for 1, 2, 3 and 4 weeks were 27.43±13.81㎛, 28.79±16.27㎛, 28.95±17.06㎛, and 29.21±19.66㎛, respectively. And it was confirmed that the radii of the RP oil-in-water emulsion stored at 30°C for 4 weeks were 27.87±14.07 μm, 28.37±17.34 μm, 28.98±18.77 μm, and 29.95±21.1 μm, respectively.

도 11은 RP 수중유 에멀젼의 제조 직후 및 40℃에서 1, 2, 3 및 4주 동안 저장한 후의 에멀젼 상태를 촬영한 현미경 사진을 보여준다. 40℃에서 보관한 RP 수중유 에멀젼은 처음 2주 동안은 5℃, 20℃ 및 30℃에서 보관한 RP 수중유 에멀젼과 유사하게 큰 변화가 없었으나 3, 4주 동안 보관하게 되면 불안정해 지는 것으로 확인 되었으며 융합을 통해 생겨난 큰 오일 덩어리가 발견되었다. 40℃에서 보관한 RP 수중유 에멀젼은 보관 후 3, 4주에서 급격히 불안정해 지는데 그 이유는 유화제로 사용한 트윈 80 때문인 것으로 판단된다. 상기 트윈 80은 비이온성 계면활성제로서 높은 온도(40도)에서 보관되면, 머리에 해당하는 poly(oxyethylene) sorbitan group이 탈수되어 유화능이 저하되기 때문으로 판단된다.11 shows photomicrographs of the state of the emulsion immediately after preparation of the RP oil-in-water emulsion and after storage at 40° C. for 1, 2, 3 and 4 weeks. The RP oil-in-water emulsion stored at 40°C did not show significant changes for the first 2 weeks similar to the RP oil-in-water emulsion stored at 5°C, 20°C and 30°C. It was confirmed and a large mass of oil formed through fusion was found. The RP oil-in-water emulsion stored at 40°C becomes unstable at 3 or 4 weeks after storage, which is thought to be due to Tween 80 used as an emulsifier. The Tween 80 is a nonionic surfactant, and when stored at a high temperature (40 degrees), it is determined that the poly(oxyethylene) sorbitan group corresponding to the head is dehydrated and the emulsification ability is lowered.

4.34.3 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민/레티닐 팔미테이트 모노올레인 큐빅상에 포함된 레티닐 팔미테이트의 안정성 평가Stability evaluation of retinyl palmitate contained in decanoyl gelatin/decanoyl polyethyleneimine/retinyl palmitate monoolein cubic phase

모노올레인 큐빅상에 탑재된 레티닐 팔미테이트(RP)의 시간-의존적인 화학적 안정성을 조사하기 위하여, 5℃, 20℃, 30℃ 및 40℃에서 4주 동안 CP(RP) 및 CP(RP/DeGel/DePEI)를 보관한 후 특정 시간에 각 큐빅상으로부터 RP 시료를 채취하였다. 상기 채취된 시료는 에멀젼과 에탄올의 비율이 1:100(w/v)이 되도록 하였으며 액체 크로마토그래피 시스템을 이용하여 RP의 농도를 분석하였다. 상기 액체 크로마토그래피 시스템은 Eclipis XDB-C18(4.6 x 150, 3.5 μm) 컬럼을 이용하였으며 분당 1.5㎖의 유속으로 메탄올과 함께 5u㎕의 RP 용액을 상기 컬럼에 주입하고 280nm에서 검출하였다. To investigate the time-dependent chemical stability of retinyl palmitate (RP) mounted on cubic monoolein, CP (RP) and CP (RP) at 5 °C, 20 °C, 30 °C and 40 °C for 4 weeks. /DeGel/DePEI) was stored and RP samples were collected from each cubic phase at a specific time. The sample collected was such that the ratio of emulsion to ethanol was 1:100 (w/v), and the concentration of RP was analyzed using a liquid chromatography system. As the liquid chromatography system, an Eclipis XDB-C18 (4.6 x 150, 3.5 μm) column was used, and 5 μl of RP solution with methanol was injected into the column at a flow rate of 1.5 ml per minute, and detection was performed at 280 nm.

상기 제조한 RP 수중유 에멀젼에 탑재된 RP의 시간-의존적인 화학적 안정성을 조사하기 위하여, 5℃, 20℃, 30℃ 및 40℃에서 4주 동안 보관하였다. 상기 보관된 RP 수중유 에멀젼으로 부터 특정 시간에 시료를 채취하고, 상기 채취된 시료를 트라하이드로퓨란(THF)에 RP 수중유 에멀젼:THF=1:200(w/w)이 되도록 용해 시켰다. HPLC를 이용하여 RP를 분석하기 위하여 이동상으로 아세토나이트릴(acetonitrile)로 하였다. RP의 화학적 안정성은 초기 RP의 양 대비 특정 시간에서의 레티닐 팔미테이트의 잔류량 %로 표현하였다.In order to investigate the time-dependent chemical stability of the RP loaded in the prepared RP oil-in-water emulsion, it was stored at 5 °C, 20 °C, 30 °C and 40 °C for 4 weeks. A sample was collected at a specific time from the stored RP oil-in-water emulsion, and the collected sample was dissolved in trihydrofuran (THF) so that RP oil-in-water emulsion:THF=1:200 (w/w). In order to analyze RP using HPLC, acetonitrile was used as a mobile phase. The chemical stability of RP was expressed as a percentage of the residual amount of retinyl palmitate at a specific time compared to the amount of initial RP.

도 12는 5℃, 20℃, 30℃ 및 40℃에서 CP(RP)에 탑재된 RP의 시간에 따른 화학적 안정성을 평가한 결과를 보여준다. CP(RP)를 5℃에서 보관하는 경우, 4주 이내에서 99%의 RP가 유지되어 화학적 안정성이 높은 것으로 확인 되었다. 이에 반하여 CP(RP)를 20℃에서 보관하는 경우, 4주 내 약 93%가 유지되어 화학적 안정성이 다소 감소한 것으로 확인 되었다. 또한 30℃에서 보관하는 경우, 4주 후 52%로 현저히 감소하였으며, 40℃에서 보관하는 경우, 4주 후 16.8%로 현저히 감소하였다. RP는 열, 빛, 습기 및 산소에 대해 불안정한 것으로 알려져 있으며, 이러한 요인은 화학적으로 RP를 저하시킨다. 따라서 보관 온도가 상승하는 경우 열에너지에 의한 화학적 열화로 RP의 안정성이 저하된 것으로 판단된다.Figure 12 shows the results of evaluating the chemical stability over time of the RP mounted on the CP (RP) at 5 ℃, 20 ℃, 30 ℃ and 40 ℃. When CP (RP) is stored at 5 ℃, 99% of RP is maintained within 4 weeks, and it was confirmed that the chemical stability is high. On the other hand, when CP (RP) was stored at 20 °C, about 93% was maintained within 4 weeks, confirming that the chemical stability was somewhat decreased. In addition, when stored at 30°C, it significantly decreased to 52% after 4 weeks, and when stored at 40°C, it significantly decreased to 16.8% after 4 weeks. RP is known to be unstable to heat, light, moisture and oxygen, and these factors chemically degrade RP. Therefore, when the storage temperature is increased, it is judged that the stability of the RP is lowered due to chemical deterioration due to thermal energy.

도 13은 5℃, 20℃, 30℃ 및 40℃에서 CP(RP/DeGel/DePEI)에 탑재된 RP의 시간에 따른 화학적 안정성을 평가한 결과를 보여준다. CP(RP)에 탑재된 RP와 마찬가지로, CP(RP/DeGel/DePEI)에 탑재된 RP 역시 5℃(99%) 및 20℃(97%)의 저온에서 상대적으로 안정한 것으로 확인 되었으며 30℃(66.6%) 및 40℃(17.5%)의 고온에서는 상대적으로 불안정한 것으로 확인 되었다. 잔류량 %는 저온에서 4주 동안 현저하게 감소하지 않았다. 이를테면, 보관 온도가 5도와 20도일 때, 4주 잔존율은 각각 99%와 97%였다. Figure 13 shows the results of evaluating the chemical stability over time of the RP mounted on the CP (RP / DeGel / DePEI) at 5 ℃, 20 ℃, 30 ℃ and 40 ℃. Like the RP mounted on the CP(RP), the RP mounted on the CP(RP/DeGel/DePEI) was also confirmed to be relatively stable at low temperatures of 5°C (99%) and 20°C (97%), and 30°C (66.6%). %) and at a high temperature of 40 °C (17.5%), it was confirmed to be relatively unstable. Residual % did not significantly decrease during 4 weeks at low temperature. For example, when the storage temperature was 5°C and 20°C, the 4-week survival rates were 99% and 97%, respectively.

상기 분석 결과에 따르면, 열에너지가 RP를 저하시키는 주된 원인으로 판단된다. CP(RP/DeGel/DePEI)에 탑재된 RP의 잔류량 %는 대부분의 온도에서 CP(RP)에 탑재된 RP의 잔량보다 더 높은 결과가 확인된다. 이를테면, 보관 온도가 30도 일 때, CP(RP/Degel/DePEI)에 탑재된 RP의 4주 잔류량 %는 약 66.6%였고, CP에 탑재된 RP의 잔류량%보다 높았다. CP(RP/DeGel/DePEI)에 탑재된 RP는 CP(RP)에 탑재된 RP보다 더 안정적으로 보였다. 상기 CP(RP/DeGel/DePEI)는 상기 CP(RP)에 대비하여 DeGel 및 DePEI를 수상채널에 포함하고 있다는 점에서 차이점이 있다. DeGel/DePEI 복합체는 큐빅상의 수상채널에서 형성되어, 이중지질층에 고정되므로 상기 수상채널을 차폐할 수 있다. CP(RP/DeGel/DePEI)의 수상채널은 DeGel/DePEI 복합체에 의해 폐쇄되므로 그 내부에 위치하는 RP가 외부의 수상벌크로부터 보호되는 효과가 있다. 따라서 CP(RP)의 수상채널에 탑재된 RP보다 주위 온도변화에 더 안정적인 것으로 판단된다.According to the analysis result, it is determined that thermal energy is the main cause of lowering the RP. The % of residual amount of RP loaded on CP (RP/DeGel/DePEI) is confirmed to be higher than the residual amount of RP loaded on CP (RP) at most temperatures. For example, when the storage temperature was 30 degrees, the % residual amount of 4 weeks of RP mounted on CP (RP/Degel/DePEI) was about 66.6%, which was higher than that of RP loaded on CP. RP mounted on CP(RP/DeGel/DePEI) appeared more stable than RP mounted on CP(RP). The CP (RP/DeGel/DePEI) is different from the CP (RP) in that it includes DeGel and DePEI in the water channel. The DeGel/DePEI complex is formed in the aqueous channel of the cubic phase and is fixed to the double lipid layer, so it can shield the aqueous channel. Since the aqueous channel of the CP (RP/DeGel/DePEI) is closed by the DeGel/DePEI complex, the RP located therein has the effect of protecting it from the external aqueous bulk. Therefore, it is judged that it is more stable to the ambient temperature change than the RP mounted on the water channel of the CP(RP).

도 14는 5℃, 20℃, 30℃ 및 40℃에서 RP 수중유 에멀젼에 탑재된 RP의 시간에 따른 화학적 안정성을 보여준다. 테스트한 모든 보관 온도에서 잔류량 %는 4주 동안 경과 시간에 따라 감소했으며 보관 온도가 높을수록 잔류량%가 낮았다. 상기 실험은 온도를 제외한 모든 조건이 동일하고 암실서 보관하기 때문에 RP의 화학적 안정성을 저하시키는 것은 온도에 의한 것으로 판단된다.Figure 14 shows the chemical stability over time of RP loaded in RP oil-in-water emulsion at 5 °C, 20 °C, 30 °C and 40 °C. At all storage temperatures tested, the % residue decreased with the elapsed time for 4 weeks, and the higher the storage temperature, the lower the % residue. All conditions except for the temperature of the experiment are the same, and since it is stored in a dark room, it is judged that the lowering of the chemical stability of the RP is due to the temperature.

5. 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상5. Cubic monoolein phase with glucose sensing response

상기 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상은 데카노일 젤라틴/데카노일 폴리에틸렌이민/소수화 개질 글루코스 산화효소/마그네슘 아스코빌 포스페이트 모노올레인 큐빅상이 포함된 제형을 의미한다. The cubic monoolein phase having the glucose sensing reaction characteristic refers to a formulation containing a cubic phase of decanoyl gelatin/decanoyl polyethyleneimine/hydrogenation-modified glucose oxidase/magnesium ascorbyl phosphate monoolein.

상기 데카노일 젤라틴, 데카노일 폴리에틸렌이민, 소수화 개질 글루코스 산화효소는 상기에서 설명한 바와 같이 제조되어 사용되며 추가적으로 수용성 비타민 C의 유도체인 마그네슘 아스코빌 포스페이트(magnesium ascorbyl phosphate, MAP)을 수상채널에 탑재하여 제조한다.The decanoyl gelatin, decanoyl polyethyleneimine, and hydrophobization-modified glucose oxidase are prepared and used as described above, and additionally, magnesium ascorbyl phosphate, a derivative of water-soluble vitamin C, is mounted on an aqueous channel to prepare it. do.

5.1 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상의 제조5.1 Preparation of Cubic Monoolein Phase with Glucose Sensing Reaction Characteristics

소수화된 단백질로서 데카노일 젤라틴(DeGel), 소수화된 이온성 고분자로서 데카노일 폴리에틸렌이민(DePEI), 소수화 개질 글루코스 산화효소(Hyphobically modified Glucose Oxidase, HmGOD)와 비타민(MAP)이 탑재한 모노올레인 큐빅상을 제조하였다. 상기 모노올레인 큐빅상은 용융-수화법으로 제조하였으며 등방성 지질 액정과 동일한 용어로서 사용된다. 상기에서 설명한 방법과 2g의 모노올레인을 20㎖ 유리용기에 넣고 50℃ 항온조에서 용융시킨 후 상기 모노올레인 용융액이 40℃로 냉각되면, 상기 DeGel, DePEI, HmGOD, MAP의 혼합용액을 조심스럽게 첨가하였다. 이때, DeGel 카르복실기와 DePEI 아미노기의 몰비가 5:5가 되도록 DeGel과 DePEI를 증류수에 함께 용해시킨 용액이고, pH는 5.0으로 조정하였다. 또한, 마그네슘 아스코빌 포스페이트(magnesium ascorbyl phosphate, MAP)의 농도가 4%가 되도록 용해시켰다. 35℃의 DeGel/DePEI/HmGOD/MAP 혼합수용액 0.714㎖을 모노올레인 위에 조심스럽게 첨가하고 투명한 겔이 형성될 때까지 30℃, 암소에서 보관하였다. 이후 모든 수용액이 수화된 후, 0.143㎖의 pH 7.4 PBS를 첨가하였다. Decanoyl gelatin (DeGel) as a hydrophobized protein, decanoyl polyethyleneimine (DePEI) as a hydrophobized ionic polymer, hydrophobically modified Glucose Oxidase (HmGOD) and monoolein cubic loaded with vitamins (MAP) The phase was prepared. The monoolein cubic phase was prepared by a melt-hydration method and is used as the same term as isotropic lipid liquid crystal. After the method described above and 2 g of monoolein are put in a 20 ml glass container and melted in a thermostat at 50°C, when the monoolein melt is cooled to 40°C, the mixed solution of DeGel, DePEI, HmGOD, and MAP is carefully prepared added. At this time, it was a solution in which DeGel and DePEI were dissolved together in distilled water so that the molar ratio of the DeGel carboxyl group and the DePEI amino group was 5:5, and the pH was adjusted to 5.0. In addition, it was dissolved so that the concentration of magnesium ascorbyl phosphate (magnesium ascorbyl phosphate, MAP) was 4%. 0.714 ml of a mixed aqueous solution of DeGel/DePEI/HmGOD/MAP at 35°C was carefully added on monoolein, and stored at 30°C in a dark place until a clear gel was formed. After all aqueous solutions were hydrated, 0.143 ml of pH 7.4 PBS was added.

대조군으로서 상기 방법과 동일하게 비타민이 탑재되지 않은 모노올레인 큐빅상을 제조하였고, 각 모노올레인 큐빅상의 이름과 조성은 하기 표 1과 같다. As a control, a mono-olein cubic phase without vitamins was prepared in the same manner as in the above method, and the names and compositions of each mono-olein cubic phase are shown in Table 1 below.

이름name DeGel/DePEIDeGel/DePEI HmGODHmGOD MAPMAP 직경diameter pHpH Cubic(No)Cubic(No) XX XX XX 100.2nm100.2nm 5.875.87 Cubic(MAP)Cubic (MAP) XX XX OO 84.9nm84.9nm 6.516.51 Cubic(MAP/pol)Cubic (MAP/pol) OO XX OO 83.1nm83.1nm 6.756.75 Cubic(MAP/pol/GOD)Cubic (MAP/pol/GOD) OO OO OO 80.7nm80.7nm 5.765.76

모노올레인 큐빅상을 나노 크기로 제조한 후 모노올레인 큐빅상 현탄액을 제조하였다. 증류수 10㎖에 360㎎의 pluronic F127을 첨가하여 pluronic F127 용액(3.6%)을 만들고, pH를 7.0이 되도록 조정하였다. 여기서 pluronic F127은 분산제로 사용되었다. 모노올레인 큐빅상을 100㎎을 10㎖ 유리용기에 넣고 pluronic F127용액 0.417㎖을 넣어 모노올레인:pluronic F127=100:15 (w/w) 비율이 되도록 하였다. 모노올레인 큐빅상을 스패출라로 잘게 분쇄하고, 초음파를 처리하였다. 초음파 처리 조건은 tip type (VC 505, Sonic & Materials, USA)으로 pulse on 30초, pulse off 30초로 5분간 처리하여 모노올레인 큐빅상 현탁액을 제조하였다. After the cubic monoolein phase was prepared in nano size, a monoolein cubic phase suspension was prepared. 360 mg of pluronic F127 was added to 10 ml of distilled water to make a pluronic F127 solution (3.6%), and the pH was adjusted to 7.0. Here pluronic F127 was used as a dispersant. 100 mg of the cubic monoolein phase was placed in a 10 ml glass container, and 0.417 ml of pluronic F127 solution was added so that monoolein:pluronic F127=100:15 (w/w) ratio was made. The cubic monoolein phase was finely pulverized with a spatula and treated with ultrasonic waves. The ultrasonic treatment conditions were tip type (VC 505, Sonic & Materials, USA), pulse on 30 sec, pulse off 30 sec for 5 minutes to prepare a cubic monoolein suspension.

5.25.2 Cubic(MAP), Cubic(MAP/pol), Cubic(MAP/pol/GOD)에 대한 편광 광학 현미경 분석Polarized light microscopy analysis for Cubic (MAP), Cubic (MAP/pol) and Cubic (MAP/pol/GOD)

상기 제조한 모노올레인 큐빅상 현탄액을 커버 글라스의 O-링 스페이서에 채워 넣고 커버 글라스를 올린 후 상기 제형이 위치한 셀을 만들었다. 상기 셀은 고온반응기(heating block, HS81, Mettler Toledo, USA)에서 30℃에서 80℃까지 분당 2도씩 온도를 상승시키면서 편광 광학 현미경을 통하여 큐빅상의 상전이를 관찰하였다.The prepared monoolein cubic phase suspension was filled in the O-ring spacer of a cover glass, and the cover glass was raised, and then a cell in which the formulation was located was made. In the cell, the cubic phase transition was observed through a polarized light microscope while increasing the temperature from 30°C to 80°C by 2 degrees per minute in a high-temperature reactor (heating block, HS81, Mettler Toledo, USA).

도 9의 패널 B)는 상기의 방법으로 관찰한 Cubic(MAP), Cubic(MAP/pol), Cubic(MAP/pol/GOD)의 편광 광학 현미경 사진을 보여준다. 모노올레인 큐빅상은 편광을 조사하는 경우 복굴절을 나타내지 않는 광학적 등방성을 가지며 80℃ 부근에서 육각상(hexagonal phase)으로 상전이가 일어나는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 육각상은 광학적 이방성(anisotropic)을 가지기 때문에, 편광 조사시 복굴절을 나타내며 상기 복굴절이 일어나기 시작하는 온도는 큐빅-육각 상 전이 온도로부터 확인이 가능하다. Panel B of FIG. 9 shows polarized light micrographs of Cubic (MAP), Cubic (MAP/pol), and Cubic (MAP/pol/GOD) observed by the above method. It is known that the monoolein cubic phase has optical isotropy that does not exhibit birefringence when irradiated with polarized light, and a phase transition to a hexagonal phase occurs near 80°C. In addition, since the hexagonal phase is optically anisotropic, it exhibits birefringence when polarized light is irradiated, and the temperature at which the birefringence starts can be confirmed from the cubic-hexagonal phase transition temperature.

본 발명에서는 실시예를 통하여 모노올레인 큐빅상의 상전이 온도를 확인하였다. 본 발명의 Cubic(MAP)의 상전이 온도는 59.1℃로 확인되며, Cubic(MAP/pol)는 상전이 온도가 54℃로 CP(nothing)보다 약 5.1℃ 낮은 것으로 확인 되었다. 또한 Cubic(MAP/pol/GOD)의 상전이 온도는 약 52.9℃로 Cubic(MAP/pol)의 상전이 온도보다 1.1℃ 더 낮은 것으로 확인 되었다. 도 9의 패널 B)의 결과에 따르면, Cubic(MAP/pol/GOD)는 30 내지 52.9℃의 저온 범위에서 광학적 등방성이기 때문에 MAP 및 GOD가 모노올레인 큐빅상의 구조가 붕괴되지 않고도 탑재될 수 있는 것으로 판단된다. In the present invention, the phase transition temperature of the cubic monoolein phase was confirmed through Examples. Cubic (MAP) of the present invention has a phase transition temperature of 59.1°C, and Cubic (MAP/pol) has a phase transition temperature of 54°C, which is about 5.1°C lower than CP (nothing). Also, it was confirmed that the phase transition temperature of cubic (MAP/pol/GOD) was about 52.9°C, which was 1.1°C lower than that of cubic (MAP/pol). According to the results of panel B) of FIG. 9, since Cubic (MAP/pol/GOD) is optically isotropic in the low temperature range of 30 to 52.9°C, MAP and GOD can be mounted without collapse of the monoolein cubic phase structure. is judged to be

5.3 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상의 구조관찰5.3 Structural observation of cubic monoolein with glucose sensing response characteristics

글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상의 구조를 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였다. Phosphotungstic acid(PTA)를 DW에 2% 농도가 되도록 용해시키고, 1M KOH를 사용하여 pH 6.8로 조정하였다. 0.22㎛ 실린더 필터를 이용하여 필터링을 해주었다. 모노올레인 큐빅상 현탁액과 PTA 용액을 1:1 (v/v)로 혼합하고, 실온 암소조건에서 8시간동안 방치하여 염색하였다. 염색 이후, formavar/copper-coated grid 위에 조심스럽게 상기 혼합액을 올려 건조하였다. 건조된 formavar/copper-coated grid를 투과전자현미경(TEM, ransmission electron microscope, LEO 912AB OMEGA, Germany))을 통해 관찰하였다. The structure of the cubic monoolein phase with glucose sensing reaction characteristics was observed using a transmission electron microscope. Phosphotungstic acid (PTA) was dissolved in DW to a concentration of 2%, and pH was adjusted to 6.8 using 1M KOH. It was filtered using a 0.22㎛ cylinder filter. The cubic monoolein suspension and the PTA solution were mixed at a ratio of 1:1 (v/v), and left for 8 hours in the dark at room temperature for dyeing. After dyeing, the mixture was carefully placed on a formavar/copper-coated grid and dried. The dried formavar/copper-coated grid was observed through a transmission electron microscope (TEM, ransmission electron microscope, LEO 912AB OMEGA, Germany).

도 15는 모노올레인 큐빅상의 투과전자현미경 사진을 보여준다. TEM 상에서 모든 모노올레인 큐빅상은 DeGel, DePEI, HmGOD, MAP 탑재 여부와 관계없이 모노올레인 큐빅상의 특정 구조인 라멜라 이중층 구조가 관찰되었다. 모노올레인 큐빅상의 모노올레인이 양친매성 분자로 수상에서 자가 결집하여 이중층 구조가 관찰되는데, DeGel, DePEI, HmGOD, MAP은 모노올레인 큐빅상의 형성에 영향을 미치지 않은 것으로 확인되었다. DeGel, DePEI, HmGOD는 모노올레인의 매트릭스에 고정되어 모노올레인의 팩킹에 영향을 줄 가능성이 있으나, 모노올레인의 2% 미만으로 매우 적은 양으로 모노올레인 큐빅상 구조에 영향을 미치지 않았다고 볼 수 있다.15 shows a transmission electron micrograph of a cubic monoolein phase. The lamellar bilayer structure, a specific structure of the monoolein cubic phase, was observed in all cubic monoolein phases on TEM regardless of whether DeGel, DePEI, HmGOD, or MAP were loaded. Monoolein on cubic monoolein is an amphiphilic molecule and self-assembly in the aqueous phase results in a double-layer structure. It was confirmed that DeGel, DePEI, HmGOD, and MAP did not affect the formation of the cubic monoolein phase. DeGel, DePEI, and HmGOD are immobilized in the matrix of monoolein and have the potential to affect the packing of monoolein. can see.

5.4 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상의 크기 측정5.4 Size Measurement of Cubic Monoolein Phase with Glucose Sensing Reaction Characteristics

Cubic(No), Cubic(MAP), Cubic(MAP/pol), Cubic(MAP/pol/GOD)의 모노올레인 큐빅상의 입자 크기를 확인하기 위하여 상기 모노올레인 큐빅상 현탁액을 증류수로 희석시킨 후 공인인증 시험기관인 한국 세라믹 기술원의 광산란 장치를 이용하여 수력학적 직경을 측정하였다(표 1 참조). 분석결과 DeGel, DePEI, HmGOD, MAP 탑재 여부에 상관없이 100nm 이하의 크기를 나타내어, 나노제형이 성공적으로 제조되었음을 확인 하였다. 상기 모노올레인 큐빅상은 그 직경은 100nm 이하이므로 피부 세포 간격을 통해 피부로 침투될 수 있어 향상된 피부 침투성을 보일 것으로 판단된다. Cubic (No), Cubic (MAP), Cubic (MAP/pol), Cubic (MAP/pol/GOD) After diluting the mono-olein cubic phase suspension with distilled water to confirm the particle size of the cubic mono-olein phase The hydraulic diameter was measured using the light scattering device of the Korea Ceramic Technology Institute, an accredited testing institute (see Table 1). As a result of the analysis, it was confirmed that the nano-formulation was successfully manufactured by showing a size of 100 nm or less regardless of whether DeGel, DePEI, HmGOD, or MAP were loaded. Since the monoolein cubic phase has a diameter of 100 nm or less, it can penetrate into the skin through the skin cell gap, and thus it is judged to show improved skin permeability.

5.5 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상 현탁액의 pH 측정 5.5 Measurement of pH of Cubic Monoolein Suspension with Glucose Sensing Reaction Characteristics

글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상 현탁액의 pH를 측정하였다. 상기 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상의 현탁액은 보관조건에서 수상채널에 탑재한 비타민인 MAP을 방출하지 않아야 한다. 모노올레인 큐빅상 현탁액의 보관 pH가 단백질(DeGel)의 pI 값(~4.7)보다 높으면 단백질과 이온성 고분자가 반응하여 코아세르베이트를 형성하게 되고 상기 코아세르베이트가 생성되면 비타민이 방출되지 않는다. The pH of the cubic monoolein suspension having glucose sensing reaction properties was measured. The suspension of monoolein cubic phase having the glucose sensing reaction characteristic should not release MAP, a vitamin loaded in the aqueous channel, under storage conditions. If the storage pH of the cubic monoolein suspension is higher than the pI value (~4.7) of the protein (DeGel), the protein and the ionic polymer react to form a coacervate, and when the coacervate is generated, the vitamin is not released.

본 발명의 모노올레인 큐빅상 현탁액은 pH가 5.76 이상이므로 코아세르베이트에 의해 방출이 억제되어 MAP을 방출하지 않을 것으로 판단된다(표 1 참조). 또한 화장품의 일반적인 pH는 5.0~7.0 범위이므로 보관조건에서 수상채널에 탑재한 비타민인 MAP을 방출되지 않아 글루코스 감지반응에만 MAP을 방출하는 나노제형 현탁액으로서 화장품 원료로 사용될 수 있음을 확인하였다.Since the cubic monoolein suspension of the present invention has a pH of 5.76 or higher, it is judged that the release is inhibited by coacervate and thus does not release MAP (see Table 1). In addition, since the general pH of cosmetics is in the range of 5.0 to 7.0, it was confirmed that MAP, which is a vitamin loaded in the aqueous channel, is not released under storage conditions, so that it can be used as a cosmetic raw material as a nanoformulation suspension that releases MAP only in the glucose sensing reaction.

5.6 생리학적 조건에서 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상에 탑재된 비타민의 방출 평가5.6 Evaluation of release of vitamins loaded on cubic monoolein with glucose sensing response under physiological conditions

모노올레인 큐빅상 현탁액 1㎖을 투석막 (MWCO 15,000)에 넣어 방출을 24시간 동안 관찰하였다. 피부 생리학적 조건을 맞추기 위해 방출매질로 사용할 증류수를 pH 5.0로 조정하였고, 여기에 글루코스 농도를 0, 50, 100, 200㎎/dL로 달리하여 방출을 관찰하였다. 50㎖의 바이알에 각 농도의 글루코스 용액 10㎖을 넣고, 모노올레인 큐빅상 현탁액이 들어있는 투석막을 넣고 roller mixer로 균질화하며 방출 실험을 진행하였다. 시간 경과에 따라 20㎕의 방출매질을 채취하고, 투석막을 통해 방출되어 나온 MAP의 양을 HPLC 분석법을 이용하여 정량하였다. 또한 취한 만큼 새로운 글루코스 용액을 더 넣어줌으로써 동일한 부피를 유지하였다. 모노올레인 큐빅상의 MAP 방출율은 하기 수학식1에 따라 계산하였다.1 ml of the cubic monoolein suspension was placed in a dialysis membrane (MWCO 15,000) and the release was observed for 24 hours. Distilled water to be used as a release medium was adjusted to pH 5.0 to match the physiological conditions of the skin, and the release was observed by varying the glucose concentration to 0, 50, 100, and 200 mg/dL. 10ml of each concentration of glucose solution was put into a 50ml vial, a dialysis membrane containing a cubic monoolein suspension was put, and the release test was conducted while homogenizing with a roller mixer. Over time, 20 μl of the release medium was collected, and the amount of MAP released through the dialysis membrane was quantified using HPLC analysis. In addition, the same volume was maintained by adding more new glucose solution as much as it was taken. The release rate of MAP on cubic monoolein was calculated according to Equation 1 below.

Figure 112019127706221-pat00001
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도 16은 글루코스 농도에 따른 모노올레인 큐빅상의 MAP 방출율을 보여준다. Cubic(MAP)의 경우, 외부로 방출되는 비타민을 차폐시킬 코아세르베이트(DeGel, DePEI)가 없기 때문에 글루코스 농도에 관계없이 방출되는 것이 확인 되었다. Cubic(MAP/pol)의 경우, 코아세르베이트의 차폐 효과로 인해 비타민이 외부로 방출되지 않는 것이 확인되었으며 HmGOD가 없으므로 글루코스의 농도에 상관없이 비타민이 외부로 방출되지 않는 것이 확인되었다. Cubic(MAP/pol/GOD)의 경우, 글루코스 농도가 증가할수록 방출이 증가하는 것이 확인 되었다. 24시간이 경과된 후, 글루코스 농도가 50, 100, 200㎎/dL으로 증가하는 경우 방출율 또한 20.23%, 30.21%, 40.23%로 증가되었다. 글루코스 농도에 따라 방출율(%)이 증가하는 이유는 HmGOD의 작용으로 인해 글루코스가 글루콘산으로 변환되므로 모노올레인 큐빅상 주위의 국소 pH가 단백질(DeGel)의 pI(~4.7) 보다 낮아졌기 때문으로 판단된다. 상기 HmGOD에 의해 글루코스가 클루콘산으로 변환되면 pH가 낮아지게 되고 이는 모노올레인 큐빅상 내부의 DeGel과 DePEI 사이에 형성된 코아세르베이트를 해체하게 되면서 비타민이 외부로 방출되는 것이다. 상기 글루코스 반응에 의한 MAP의 방출은 6시간 이내로 모두 이루어지는 것으로 확인 되었다. 16 shows the release rate of MAP on cubic monoolein according to glucose concentration. In the case of Cubic (MAP), it was confirmed that it was released regardless of the glucose concentration because there was no coacervate (DeGel, DePEI) to block the externally released vitamin. In the case of Cubic (MAP/pol), it was confirmed that the vitamin was not released to the outside due to the shielding effect of coacervate, and since there was no HmGOD, it was confirmed that the vitamin was not released to the outside regardless of the concentration of glucose. In the case of Cubic (MAP/pol/GOD), it was confirmed that the release increased as the glucose concentration increased. After 24 hours, when the glucose concentration increased to 50, 100, or 200 mg/dL, the release rate also increased to 20.23%, 30.21%, and 40.23%. The reason that the release rate (%) increases according to the glucose concentration is that the local pH around the cubic monoolein phase is lower than the pI (~4.7) of the protein (DeGel) because glucose is converted to gluconic acid due to the action of HmGOD. is judged When glucose is converted to gluconic acid by the HmGOD, the pH is lowered, which disintegrates the coacervate formed between DeGel and DePEI inside the cubic monoolein phase, and the vitamin is released to the outside. It was confirmed that the release of MAP by the glucose reaction was all made within 6 hours.

5.7 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상에 탑재된 비타민의 경시 유보율 측정5.7 Measurement of retention rate over time of vitamins loaded on cubic monoolein with glucose sensing response characteristics

본 발명의 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상 현탁액을 보관조건(상온)에서 투석막(MWCO 15,000)에 넣고 보관용액에서 30일 동안 투석하였다. 시간경과(1주, 2주, 3주, 4주)동안 투석막을 통해 방출되어 나온 비타민의 양을 HPLC 분석법을 통하여 정량하였다. 상기 방출평가와 마찬가지로, 50㎖의 유리용기에 각 보관용액인 증류수(pH 7.0) 10㎖을 넣은 후 모노올레인 큐빅상 현탁액이 들어있는 투석막을 넣고 roller mixer로 균질화하며 방출실험을 진행하였다. 시간 경과에 따라 20㎕의 매질을 채취한 후 상기 투석막을 통해 방출되어 나온 MAP의 양은 HPLC 분석법을 이용하여 정량하였다. 경시유보율은 하기 수학식2에 따라 계산하였다. 상기 경시 유보율은 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상에 탑재된 비타민의 양에 대비하여 방출되지 않고 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상에 유보되어 있는 비타민의 양의 백분율로 정의한다. The cubic monoolein suspension having glucose sensing reaction properties of the present invention was placed in a dialysis membrane (MWCO 15,000) under storage conditions (room temperature) and dialyzed in the storage solution for 30 days. The amount of vitamin released through the dialysis membrane over time (1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks) was quantified through HPLC analysis. As in the above release evaluation, 10 ml of distilled water (pH 7.0), each storage solution, was put into a 50 ml glass container, and then a dialysis membrane containing cubic monoolein suspension was put in and homogenized with a roller mixer to conduct a release test. After 20 μl of the medium was collected over time, the amount of MAP released through the dialysis membrane was quantified using HPLC analysis. The retention rate over time was calculated according to Equation 2 below. The retention rate over time is defined as the percentage of the amount of the vitamin that is not released and is reserved on the monoolein cubic phase having the glucose sensing response characteristic, compared to the amount of the vitamin loaded on the monoolein cubic phase having the glucose sensing response characteristic. .

Figure 112019127706221-pat00002
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도 17은 시간 경과에 따른 본 발명의 모노올레인 큐빅상의 MAP 유보율을 보여준다. DeGel, DePEI, 및 HmGOD가 탑재되어있는 모노올레인 큐빅상(Cubic(MAP/pol/GOD))은 시간이 흘러도 높은 경시 유보율을 보이는 것으로 확인 되었다. Cubic(MAP/pol/GOD)의 경시유보율은 1주차, 2주차, 3주차 및 4주차에 각각 70.3%, 71.27%, 71.50%, 72.5%을 보여 비타민을 방출하지 않는 것으로 확인 되었다. 이에 반하여 코아세르베이트가 형성되지 않은 Cubic(MAP)은 24시간 경과, 1주, 2주, 3주, 및 4주차 일 때 각각 51.63%, 34.87%, 32.19%, 23.51%, 및 14.56%로 낮은 경시유보율을 보일 뿐 아니라 시간이 흐름에 따라 방출량이 증가하는 것이 확인되었다. 상기 결과는 Cubic(MAP)의 경우 외부로 방출되는 비타민을 막아줄 코아세르베이트가 없어 글루코스 농도에 관계없이 방출되기 때문인 것으로 판단된다. Cubic(MAP/pol) 또한 Cubic(MAP/pol/GOD)와 유사하게 각 주마다 86.14%, 81.75%, 80.14%, 80.24%의 높은 유보율을 나타내었다. Cubic(MAP/pol)와 Cubic(MAP/pol/GOD)는 코아세르베이트의 차폐 효과로 인해 비타민의 높은 유보율을 관찰할 수 있었다. 이는 상기 모노올레인 큐빅상의 보관조건에서는 보관조건의 pH가 단백질(DeGel)의 pI보다 높은 상태이므로 내부에 탑재된 이온성 고분자(DePEI)가 양이온고분자로 존재하게 되고, 수상채널 내부에서 단백질(DeGel)과 코아세르베이트를 형성하게 되므로 비타민의 방출을 억제하는 것으로 판단된다. 추가적으로 공인인증시험기관인 순천향대 생물소재 지역혁신센터를 통하여 “1개월간 보관 후 모노올레인 큐빅상에 남아있는 유효성분의 양”을 확인한 결과 상기 결과와 동일하게 비타민의 방출이 유보되는 것이 확인 되었다.17 shows the MAP retention rate of the cubic monoolein phase of the present invention over time. It was confirmed that the cubic monoolein cubic phase (Cubic (MAP/pol/GOD)) loaded with DeGel, DePEI, and HmGOD showed a high retention rate with time. The retention rates of Cubic (MAP/pol/GOD) were 70.3%, 71.27%, 71.50%, and 72.5% at the 1st, 2nd, 3rd, and 4th weeks, respectively, confirming that they did not release vitamins. On the other hand, Cubic (MAP) without coacervate formation had a low retention rate at 24 hours, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, and 4 weeks, respectively, 51.63%, 34.87%, 32.19%, 23.51%, and 14.56%. It was also confirmed that the emission amount increased with the passage of time. The above result is considered to be because in the case of Cubic (MAP), there is no coacervate to block the externally released vitamin, so it is released regardless of the glucose concentration. Cubic (MAP/pol) also showed high retention rates of 86.14%, 81.75%, 80.14%, and 80.24% in each state, similar to Cubic (MAP/pol/GOD). Cubic (MAP/pol) and Cubic (MAP/pol/GOD) could observe a high vitamin retention rate due to the shielding effect of coacervate. This is because in the storage condition of the monoolein cubic phase, the pH of the storage condition is higher than the pI of the protein (DeGel), so the ionic polymer (DePEI) loaded therein exists as a cationic polymer, and the protein (DeGel) inside the aqueous channel ) and coacervate, so it is judged to inhibit the release of vitamins. Additionally, as a result of confirming “the amount of active ingredient remaining in the monoolein cubic phase after storage for one month” through the Soonchunhyang University Biomaterials Regional Innovation Center, an accredited certification testing institution, it was confirmed that the release of vitamins was withheld in the same way as the above results.

5.8 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상에 탑재된 비타민의 피부 투과도 관찰5.8 Observation of skin permeability of vitamins loaded on cubic monoolein with glucose sensing response characteristics

인공피부를 확산셀(diffusion cell)의 receptor chamber에 장착한 뒤, 리셉터 셀(receptor cell)에 피부의 생리학적 조건의 완충용액(PBS, pH 5.5) 5㎖을 채웠다. 리셉터 셀의 완충용액의 온도를 32℃가 되도록 설정하고, 12시간동안 인공피부가 충분히 수화되도록 하였다. donor cell에 대조군인 비타민 용액과 본 발명의 비타민이 탑재된 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상 현탁액을 각각 1㎖씩 첨가하였다. 리셉터 셀에는 마그네틱바를 넣어 200rpm으로 교반하였으며 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간마다 리셉터 용액에서 일정량을 채취하였다. 상기 채취한 용액은 HPLC 분석법을 통하여 비타민의 양을 정량하였으며 채취한 만큼 새로운 완충용액을 넣어주어 부피를 동일하게 하였다. 비타민이 피부를 통해 침투된 누적량은 하기 수학식 3을 통해 계산하였다.After the artificial skin was mounted in the receptor chamber of the diffusion cell, 5 ml of a buffer solution (PBS, pH 5.5) of the physiological condition of the skin was filled in the receptor cell. The temperature of the receptor cell buffer solution was set to 32° C., and the artificial skin was sufficiently hydrated for 12 hours. To the donor cell, 1 ml each of a vitamin solution as a control and a cubic monoolein suspension having glucose sensing reaction properties loaded with the vitamin of the present invention were added. A magnetic bar was placed in the receptor cell and stirred at 200 rpm, and a certain amount was collected from the receptor solution every 1 hour, 3 hours, 6 hours, 12 hours, and 24 hours. In the collected solution, the amount of vitamin was quantified through HPLC analysis, and a new buffer solution was added to equalize the volume. The cumulative amount of vitamin penetration through the skin was calculated using Equation 3 below.

Figure 112019127706221-pat00003
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상기 계산한 누적량은 시간별로 나누어 Flux(경피투과속도)를 계산하였다. 상기 경피투과속도는 하기 수학식 4를 이용하여 계산하였다.The calculated cumulative amount was divided by time to calculate Flux (transdermal permeation rate). The transdermal permeation rate was calculated using Equation 4 below.

Figure 112019127706221-pat00004
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도 18은 본 발명의 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상 현탁액의 비타민의 피부투과도(경피투과속도)를 보여준다. 비타민 용액의 경우, 24시간 동안 피부를 전혀 투과하지 못하였다. 이에 반하여 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상의 비타민은 24시간에서의 피부투과도로서 1.21㎍/㎝2·h을 보이는 것이 확인되었다. 비타민은 수용성 물질로 피부 속으로 침투시키기 어려운 문제점이 있다. 모노올레인 큐빅상은 그 구성성분인 모노올레인이 피부지질과 친화성이 우수하기 때문에 피부 투과 촉진제로 작용하여 유효성분의 경피 흡수를 촉진시키는 것으로 판단된다. 또한, 상기 모노올레인 큐빅상의 사이즈가 100nm이하인 나노제형이므로 피부 세포간격을 통한 피부 침투가 용이한 것으로 판단된다. 18 shows the skin permeability (transdermal permeation rate) of vitamins of the cubic monoolein suspension having glucose sensing reaction properties of the present invention. In the case of the vitamin solution, it did not penetrate the skin at all for 24 hours. On the other hand, it was confirmed that the vitamin in cubic monoolein with glucose sensing reaction property showed 1.21 μg/cm 2 ·h as the skin permeability at 24 hours. Vitamins are water-soluble substances, and there is a problem that it is difficult to penetrate into the skin. It is judged that the monoolein cubic phase acts as a skin permeation promoter and promotes the percutaneous absorption of the active ingredient because its component, monoolein, has excellent affinity with the skin lipids. In addition, since the monoolein cubic phase is a nano-formulation having a size of 100 nm or less, it is judged that the skin penetration through the skin cell gap is easy.

5.9 글루코스 감지반응 특성이 있는 모노올레인 큐빅상에 탑재된 비타민의 주름개선 효능 평가5.9 Evaluation of anti-wrinkle efficacy of vitamins loaded on cubic monoolein with glucose sensing response

5.9.1 모노올레인 큐빅상의 세포독성 평가 5.9.1 Evaluation of Cytotoxicity on Cubic Monoolein Phase

한국 식약처 고시 “기능성화장품의 유효성평가를 위한 가이드라인(Ⅱ)”에 의거하여 주름 개선 효능을 collagen synthesis assay로 측정하였다. 섬유아세포가 생성하는 콜라겐 양을 정량하기 전, 모노올레인 큐빅상의 세포독성을 확인하기 위해 피부섬유아세포인 Detroit 551를 사용하여 MTT assay를 실시하였다. MTT assay는 다음과 같이 진행하였다. Detroit 551(사람 피부 섬유아세포)을 배양 접시에 접종한 후 FBS(fetal bovine serum) 10%와 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL) 1% 를 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 넣어 배양하였다. 세포는 37℃, 5.0% 이산화탄소를 조절하는 배양기에서 배양하였다. 섬유아세포를 96-well plate에 1×104 cells/well로 분주한 다음 세포배양조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 버리고 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음 비타민이 탑재된 모노올레인 큐빅상 현탁액 20ul를 FBS가 없는 DMEM배지 180ul에 투입하고 8시간 배양하였다. 본 발명의 모노올레인 큐빅상의 농도는 각각 5, 10, 15, 20, 50㎍/㎖이었다. 8시간 배양을 마친 후, 모노올레인 큐빅상 현탁액과 배지를 제거하고 FBS가 없는 DMEM 배지 180ul와 MTT 용액(5㎎/㎖) 20㎕을 투입하였다. 그 후 37℃, 5.0% 이산화탄소 분위기 및 암소조건에서 4시간동안 배양하였다. 이후, 배지와 용액을 제거하여 dimethyl sulfoxide((DMSO) 200㎕로 formazan을 용해시켰다. 용해시킨 formazan을 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 하기 수학식 5를 이용하여 계산하였다. The anti-wrinkle efficacy was measured by collagen synthesis assay in accordance with the “Guideline for Efficacy Evaluation of Functional Cosmetics (II)” announced by the Ministry of Food and Drug Safety of Korea. Before quantifying the amount of collagen produced by fibroblasts, MTT assay was performed using Detroit 551, a skin fibroblast, to confirm the cytotoxicity of monoolein cubic phase. MTT assay was performed as follows. After inoculation of Detroit 551 (human skin fibroblasts) into a culture dish, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's) containing 10% FBS (fetal bovine serum), penicillin (100 IU/mL), and streptomycin (100 μg/mL) 1% medium) was added and cultured. Cells were cultured in an incubator controlled at 37°C and 5.0% carbon dioxide. Fibroblasts were seeded in a 96-well plate at 1×10 4 cells/well and cultured for 24 hours under cell culture conditions. The medium was discarded, washed with PBS (phosphate buffered saline), and 20ul of a cubic monoolein suspension loaded with vitamins was added to 180ul of DMEM medium without FBS and cultured for 8 hours. The concentrations of the cubic monoolein phase of the present invention were 5, 10, 15, 20, and 50 μg/ml, respectively. After 8 hours of incubation, the monoolein cubic phase suspension and medium were removed, and 180ul of DMEM medium without FBS and 20ul of MTT solution (5mg/ml) were added. Then, it was cultured for 4 hours at 37° C., in a 5.0% carbon dioxide atmosphere and in the dark. Then, the medium and the solution were removed, and formazan was dissolved in 200 μl of dimethyl sulfoxide ((DMSO). The absorbance of the dissolved formazan was measured at a wavelength of 540 nm. Cell viability was calculated using Equation 5 below.

Figure 112019127706221-pat00005
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도 19는 비타민 용액과 글루코스 감지반응 특성이 있는 비타민이 탑재된 모노올레인 큐빅상 현탁액의 세포 독성 평가결과를 보여준다. 8시간 후 모노올레인 큐빅상의 detroit 551 세포 독성 평가를 한 결과, cell viability가 80%이상인 5μg/㎖의 농도를 선택하였다. 80%이상의 cell viability는 세포의 생존에 영향을 주지 않음을 뜻한다. 이에, 모노올레인 큐빅상 5μg/㎖ 농도에서 주름개선 효능 평가를 진행하였다. 19 shows the cytotoxicity evaluation results of a vitamin solution and a cubic monoolein suspension loaded with a vitamin having a glucose sensing reaction characteristic. As a result of evaluating detroit 551 cytotoxicity on cubic monoolein after 8 hours, a concentration of 5 μg/ml with cell viability of 80% or more was selected. A cell viability of 80% or more means that the cell viability is not affected. Accordingly, the wrinkle improvement efficacy was evaluated at a concentration of 5 μg/ml in cubic monoolein phase.

5.9.2 모노올레인 큐빅상의 주름개선 효능 평가(콜라겐 생합성량 확인) 5.9.2 Evaluation of anti-wrinkle efficacy of monoolein cubic phase (confirmation of collagen biosynthesis amount)

한국 식약처 고시 “기능성화장품의 유효성평가를 위한 가이드라인(Ⅱ)”에 의거하여 주름 개선 효능을 collagen synthesis assay로 측정하였다. 먼저, Detroit 551 세포를 FBS(fetal bovine serum) 10%와 페니실린(100 IU/㎖L), 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖) 1%를 함유하는 DMEM 배지에서 37℃, 5.0% 이산화탄소를 조절하는 배양기에서 배양하였다. 배양 후, 48well plate에 5x104cells/well가 되도록 분주하였다. 24시간동안 세포가 plate에 부착하도록 배양하였다. 이 후, 배지를 모두 제거하고 FBS가 없는 DMEM 배지 180㎕와 비타민을 탑재한 모노올레인 큐빅상 20㎕을 첨가하고, 24시간동안 배양하였다. 이때, 비타민을 탑재한 모노올레인 큐빅상을 함유한 배지에서 모노올레인 큐빅상의 농도는 MTT assay를 이용한 예비 실험을 통해 세포독성을 나타내지 않는 농도를 선택하였다. 24시간동안 배양을 마친 후, 배양액을 취하여 ELISA kit 방법중 하나인 procollagen type IC-peptide(PIP EIA kit)를 이용하여 콜라겐 생합성량을 측정하였다. 각 흡광 값을 검량곡선에서 PIP 농도(ng/㎖)를 읽어 결과 값을 산출하였다. 이후, 상온에서 모노올레인 큐빅상 현탁액을 보관하며 0일, 5일, 10일 20일, 30일 경과마다 실험을 실시하여 동일한 조건에서 콜라겐 생합성량에 따른 모노올레인 큐빅상에 탑재된 비타민의 주름개선 효능과 비유리 비타민의 주름개선 활성 평가를 실시하였다. The anti-wrinkle efficacy was measured by collagen synthesis assay in accordance with the “Guideline for Efficacy Evaluation of Functional Cosmetics (II)” announced by the Ministry of Food and Drug Safety of Korea. First, Detroit 551 cells were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 IU/mlL), and streptomycin (100 μg/ml) 1% in an incubator conditioned at 37°C and 5.0% carbon dioxide. cultured in After incubation, it was aliquoted in a 48- well plate to 5x10 4 cells/well. Cells were incubated to adhere to the plate for 24 hours. After that, all the medium was removed, 180 μl of DMEM medium without FBS and 20 μl of cubic monoolein loaded with vitamins were added, and incubated for 24 hours. At this time, the concentration of the cubic monoolein phase in the medium containing the vitamin-loaded monoolein cubic phase was selected as a concentration that does not exhibit cytotoxicity through a preliminary experiment using the MTT assay. After culturing for 24 hours, the culture medium was taken and the amount of collagen biosynthesis was measured using procollagen type IC-peptide (PIP EIA kit), which is one of the ELISA kit methods. Each absorbance value was calculated by reading the PIP concentration (ng/ml) from the calibration curve. After that, the monoolein cubic phase suspension was stored at room temperature and experiments were conducted every 0 days, 5 days, 10 days, 20 days, and 30 days. The anti-wrinkle efficacy and anti-wrinkle activity of non-free vitamins were evaluated.

도 20은 비타민 용액과 글루코스 감지반응 특성이 있는 비타민이 탑재된 모노올레인 큐빅상 현탁액의 콜라겐 생합성량을 평가한 결과를 보여준다. 콜라겐은 주름과 밀접한 관계가 있으며, 콜라겐 생합성의 양은 전구체인 procollagen인 propeptide의 양을 측정하여 생합성의 결과를 유추한다. 유리 MAP 용액의 경우, 실험이 진행되는 동안 안정적으로 주름개선 효능을 유지하였다. 시간이 0일, 5일, 10일, 20일, 30일이 지남에 따라 각 콜라겐 생성량은 65.1ng/㎖, 59.1ng/㎖, 64.5ng/㎖, 58.1ng/㎖, 59.2ng/㎖를 나타내어 시간에 따라 콜라겐의 생성량이 안정적임을 확인하였다. 모노올레인 큐빅상에 탑재된 비타민은 시간이 흐름에 따라 콜라겐의 생성량이 0일, 5일, 10일, 20일, 30일에서 95.4ng/㎖, 60.5ng/㎖, 87.5ng/㎖, 81.5ng/㎖, 72.6ng/㎖인 것으로 확인되었다. 본 발명의 비타민이 탑재된 모노올레인 큐빅상은 유리 MAP 용액에 비해 1.4배가량 높은 콜라겐 생성량을 나타내는 것으로 확인되었는데 이는 모노올레인 큐빅상을 사용함으로써 비타민(MAP)의 세포내재화가 촉진되었기 때문으로 판단된다.20 shows the results of evaluating the amount of collagen biosynthesis of a vitamin solution and a cubic monoolein suspension loaded with vitamins having a glucose sensing response characteristic. Collagen is closely related to wrinkles, and the amount of collagen biosynthesis is inferred by measuring the amount of propeptide, which is a precursor, procollagen. In the case of the free MAP solution, the wrinkle improvement effect was stably maintained during the experiment. As time passed by 0 days, 5 days, 10 days, 20 days, and 30 days, each collagen production amount was 65.1 ng/ml, 59.1 ng/ml, 64.5 ng/ml, 58.1 ng/ml, 59.2 ng/ml. It was confirmed that the amount of collagen production was stable over time. Vitamins loaded on the monoolein cubic phase with the passage of time, the production of collagen at 0 days, 5 days, 10 days, 20 days, 30 days 95.4ng/ml, 60.5ng/ml, 87.5ng/ml, 81.5 ng/ml, it was confirmed to be 72.6ng/ml. It was confirmed that the cubic monoolein phase loaded with the vitamin of the present invention exhibited about 1.4 times higher collagen production compared to the free MAP solution. do.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다. The specific examples described herein are meant to represent preferred embodiments or examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereby. It will be apparent to those skilled in the art that modifications and other uses of the present invention do not depart from the scope of the invention as set forth in the claims herein.

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Claims (11)

지질이중층과 수상채널을 포함하는 모노올레인 큐빅상 나노 구조체에 있어서,
상기 모노올레인 큐빅상 나노 구조체는 상기 수상채널내에 소수화된 젤라틴(gelatin); 및 소수화된 폴리에틸렌이민(polyethylenimine);을 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 소수화된 젤라틴과 소수화된 폴리에틸렌이민은 pH가 4.7를 초과하는 환경에서 복합체를 형성하여 수상채널을 폐쇄시키고, pH가 4.7이하인 환경에서 복합체가 해체되어 수상채널을 개방시키는 것을 특징으로 하는 모노올레인 큐빅상 나노 구조체.
In the monoolein cubic-phase nanostructure comprising a lipid bilayer and an aqueous channel,
The mono-olein cubic-phase nanostructure includes: gelatin hydrophobized in the aqueous channel; And hydrophobized polyethyleneimine (polyethylenimine); characterized in that it comprises,
Monoolein, characterized in that the hydrophobized gelatin and hydrophobized polyethyleneimine form a complex in an environment where the pH exceeds 4.7 to close the aqueous channel, and the complex is disassembled to open the aqueous channel in an environment where the pH is 4.7 or less Cubic-phase nanostructures.
 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 소수화된 젤라틴은 상기 젤라틴의 아미노기(amino group)가 데카노일 클로라이드(decanoyl chloride)의 염화카보닐기(carbonyl chloride group)와 축합반응을 하여 소수화되며, 상기 소수화된 폴리에틸렌이민은 상기 폴리에틸렌이민의 아미노기(amino group)가 데카노일 클로라이드(decanoyl chloride)의 염화카보닐기(carbonyl chloride)와 축합반응을 하여 소수화되는 것을 특징으로 하는 모노올레인 큐빅상 나노 구조체.
The method of claim 1, wherein the hydrophobized gelatin is hydrophobized by a condensation reaction of an amino group of the gelatin with a carbonyl chloride group of decanoyl chloride, and the hydrophobized polyethyleneimine is Cubic monoolein nanostructure, characterized in that the amino group of the polyethyleneimine is hydrophobized by a condensation reaction with the carbonyl chloride group of decanoyl chloride.
 제 4 항에 있어서, 상기 소수화된 젤라틴은 아미노기와 염화카보닐기의 몰비가 1: 0.3 내지 0.7(아미노기:염화카보닐기)이며, 상기 소수화된 소수화된 폴리에틸렌이민은 아미노기와 염화카보닐기의 몰비가 1: 0.04 내지 1.39(아미노기:염화카보닐기)인 것을 특징으로 하는 모노올레인 큐빅상 나노 구조체.
5. The method of claim 4, wherein the hydrophobized gelatin has an amino group and a carbonyl chloride group in a molar ratio of 1: 0.3 to 0.7 (amino group: carbonyl chloride group), and in the hydrophobized hydrophobized polyethyleneimine, a molar ratio of the amino group and carbonyl chloride group is 1 : Monoolein cubic nanostructure, characterized in that 0.04 to 1.39 (amino group: carbonyl chloride group).
 제 1 항에 있어서, 상기 모노올레인 큐빅상 나노 구조체는 레티닐 팔미테이트(Retinyl Palmitate)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 모노올레인 큐빅상 나노 구조체.
According to claim 1, wherein the cubic mono-olein nano-structure is mono-olein cubic nano-structure characterized in that it further comprises retinyl palmitate (Retinyl Palmitate).
 지질이중층과 수상채널을 포함하는 모노올레인 큐빅상 나노 구조체에 있어서,
상기 모노올레인 큐빅상 나노 구조체는 상기 수상채널내에 소수화된 젤라틴(gelatin); 소수화된 폴리에틸렌이민(polyethylenimine); 및 소수화된 글루코스 산화효소(glucose oxidase);을 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 소수화된 젤라틴과 소수화된 폴리에틸렌이민은 pH가 4.7를 초과하는 환경에서 복합체를 형성하여 수상채널을 폐쇄시키고, pH가 4.7이하인 환경에서 복합체가 해체되어 수상채널을 개방시키는 것을 특징으로 하며,
상기 소수화된 글루코스 산화효소는 글루코스를 감지하여 글루콘산으로 변환시키는 방법으로 상기 수상채널내 pH를 4.7 미만으로 감소시켜 상기 수상채널을 개방시키는 것을 특징으로 특징으로 하는 모노올레인 큐빅상 나노 구조체.
In the monoolein cubic-phase nanostructure comprising a lipid bilayer and an aqueous channel,
The mono-olein cubic-phase nanostructure includes: gelatin hydrophobized in the aqueous channel; hydrophobized polyethylenimine; And hydrophobized glucose oxidase (glucose oxidase); characterized in that it comprises,
The hydrophobized gelatin and hydrophobized polyethyleneimine form a complex in an environment where the pH exceeds 4.7 to close the aqueous channel, and the complex is disassembled in an environment where the pH is 4.7 or less to open the aqueous channel,
The hydrophobized glucose oxidase detects glucose and converts it into gluconic acid, and reduces the pH in the aqueous channel to less than 4.7 to open the aqueous channel.
 삭제delete 삭제delete 제 7 항에 있어서, 상기 모노올레인 큐빅상 나노구조체는 마그네슘 아스코빌 포스페이트(magnesium ascorbyl phosphate)를 상기 수상채널내에 탑재한 것을 특징으로 하는 모노올레인 큐빅상나노 구조체.
[Claim 8] The cubic mono-olein nanostructure according to claim 7, wherein the cubic monoolein nanostructure is loaded with magnesium ascorbyl phosphate in the aqueous phase channel.
 제 7 항에 있어서, 상기 모노올레인 큐빅상 나노 구조체는 직경이 10 내지 100nm인 것을 특징으로 하는 모노올레인 큐빅상나노 구조체.
[Claim 8] The cubic mono-olein nanostructure according to claim 7, wherein the cubic mono-olein nanostructure has a diameter of 10 to 100 nm.
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