KR102342993B1 - 면역 조직 화학적 착색을 위한 공정 기록 슬라이드 - Google Patents
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Abstract
분석 공정, 특히, 다단계 면역조직화학(IHC) 분석에서 이용된 파라핀 제거, 항원 회수, 및 1차 및 2차 착색 시약의 효능을 결정하기 위한 장치 및 방법들이 개시된다. 특히, 장치는 2D 또는 3D 구조에서 도트들로서 도포되고 파라핀 코팅 하에 밀봉된 복수 개의 화합물을 함유하는 접착제 코팅된 현미경 슬라이드를 포함한다. 조직 절편 또는 느슨한 세포는 이어서 동일한 슬라이드에 도포되며, 모두 조직 포집에서부터 커버슬립의 적용을 통해 IHC 처리 단계를 거친다. 화합물들은 1차 또는 2차 IHC 착색 시약 중 어느 하나와 반응하여 공존하는 조직 절편 또는 느슨한 세포의 처리 경험을 기록한다. 1차 타깃들은 구배 밀도 어레이에서 적용된 결합된 항체들로 이루어져 있다. 2차 타깃들의 2개의 어레이들이 이용되며, 하나의 어레이는 마우스이며, 나머지 하나의 어레이는 토끼이다. 각각의 2차 어레이는 2D/3D 100% 농도 타깃과 함께 10% 내지 100% 농도의 2D 구배 밀도 어레이로서 서브스트레이트에 도포된다. 2차 어레이의 외삽 및 이용 가능하다면 1차 어레이에 의해 보조되는 경우, 공존하는 조직 절편 상에서 각각의 항원 농도를 객관적으로 측정하는 척도 (또는 눈금자)를 개발한다. IHC 염색(착색) 경험은 공존하는 조직 절편 또는 느슨한 세포에 의해 영구적으로 연관되어 IHC 공정의 QC 및 항원 밀도의 객관적인 측정을 지원한다.
Description
본 발명은 새로운 공정 기록 슬라이드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 공정 기록 슬라이드 및 면역 조직 화학 착색법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 공존하는 환자 샘플에 착색 공정을 함께 경험하는 제어 타깃을 제공하는 공정 기록 슬라이드를 개시한다. 착색시, 착색된 대조군은 알려진 타깃 기준선에 대한 편차로서 만일 있다면 즉시 가능한 오차(들)를 나타낸다. 위에서 언급 한 공정 기록 슬라이드는 비용 효율적인 가격으로 높은 정확도와 정밀도로 쉽게 수용 할 수 있는 임계값으로 매우 효과적인 품질관리(QC)를 제공한다.
모든 면역 조직 화학 방법들 뿐만 아니라 다른 면역 화학 방법들도 일련의 시약 교환, 인큐베이션 및 세척으로 구성된 다단계 절차이다. 이러한 절차의 대부분은 숙련된 인력이 필요하며 결과는 실험실마다 크게 다를 수 있다. 비용 절감, 슬라이드 준비의 균일성 및 절차의 인적 오류 감소를 도입하기 위해 자동화된 시스템이 연구되었다.
자동화된 방법과 수동적인 방법 모두에 대해, 고려해야 할 다수의 중요 사항이 있다. 슬라이드에서 시편이 손실되지 않도록 주의해야 한다. 잔류물이 증폭될 때 결합되지 않은 항체를 제거하려면 시약 적용 간에 시료를 철저히 세척해야 한다. 이전 시약의 이월 및/또는 후속 시약의 원치 않는 희석을 피하기 위해 과도한 액체를 제거해야 하지만 시편이 마르지 않아야 한다. 시편이 발생할 수 있는 슬라이드 영역을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 항체 시약을 적용해야 하지만 폐기물은 최소한으로 유지해야 한다.
또한, 면역 조직 화학적 방법뿐만 아니라 효소 용액 및 과산화효소 발색 시약과 같은 면역 화학적 방법에 사용되는 많은 시약은 작동 온도 및 심지어 실온에서 제한된 안정성을 갖는다. 이를 위해서는 시약을 자주 준비해야 한다. 게다가, 잘못된 결과를 초래하는 비특이적 항체 결합은 문제로 남아 있다.
결과를 개선하고 시약 준비를 최소화하는 방법과 시약은 수동 및 자동 면역 조직 화학 방법 두 가지 모두를 용이하게 할 것이다. 많은 개선이 효소-연결 면역 흡착 분석 (ELISA), 면역 형광 분석 및 가시적 분자결합화와 같은 관련 면역 화학 방법에 손쉽게 적용될 수 있다.
유방암에서 에스트로겐 수용체의 정량적 면역 세포 화학적 분석을 위한 대조군으로서 배양된 세포의 사용이 언급 될 수 있다. 조직 고정, 가공 및 착색의 변화가 에스트로겐 수용체 (ER) 면역 조직 화학 분석의 불량한 재현성에 크게 영향을 미친다는 것을 나타내는 Quicgel 방법. 공지된 ER 함량을 갖는 동결 되고 한천-현탁된 MCF-7 세포의 알갱이를 침습성 유방 암종 (IBC)의 55 개 샘플 각각에 첨가하여 대조군으로 사용하였다. 이미지 분석은 MCF-7 세포 및 IBC의 양성 영역의 백분율 (분석된 총 핵 당 양성핵) 및 양성 착색(양의 핵 영역의 광학 밀도의 합을 연구된 모든 핵의 광학 밀도의 합으로 나눈 값)을 결정 하였다. MCF-7 세포는 덱스트란 코팅된 목탄 분석에 의해 150fmol/mg의 ER의 평균 값을 가졌다. 55가지 경우에 포함 된 MCF-7 세포의 이미지 분석은 70.81의 평균 양성 영역을 나타냈다. IBC 사례로부터의 양성 착색은 0 내지 98.5의 범위였다. 공지된 ER 함량 및 MCF-7 세포의 양성 면적을 사용함으로써, 전환 인자를 사용하여 임상 시편의 양성 면적을 펨토몰 등가로 번역하였고, 55 IBC의 경우 0 내지 1,790 범위였다 (평균, 187). 알려진 펨토몰 수량의 ER을 갖는 대조군의 포함은 품질 관리 및 ER 정량에 대한 내부 표준을 제공한다.
면역 조직 화학 공정에서 품질의 검사 및 제어를 위한 양성 제어 물질의 제조 방법을 개시하는 중국 특허 공개 제102435728호 공보를 참조 할 수있다. 상기 방법은 항체와 특이적 반응을 수행 할 수 있는 상이한 농도를 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 미리 슬라이드에 흡착시키거나, 상이한 농도를 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 미리 슬라이드 위에 배치하는 단계, 폴리펩티드 또는 단백질 및 병리 조직 절편은 종래의 면역 조직 화학 단계를 동시에 거치고, 폴리 펩타이드 또는 단백질의 착색 결과는 면역 조직 화학 공정에 대한 양성 대조군으로 사용된다; 본 발명은 양성 대조군 및 품질 관리 표준을 실현하기 위해 슬라이드 위에 양성 대조군 단백질 또는 폴리펩티드를 배열하는 방법을 채택하고, 이 방법은 기존의 품질 보증 프로그램에 대한 중요한 보충제이며, 면역 조직 화학 분석법의 품질 관리를 위한 새로운 방법이다.
이하에 열거된 상기 발명에 의해 다음과 같은 사안이 보고 되었다 :
a. 덱스트란에서 과량의 펩티드의 세척도에 의존하기 때문에 타깃의 밀도는 일정하지 않을 것이고, 온도와 침전된 중합체 펠렛의 크기는 수조 농도, 반응 온도 및 NaOH 주입의 재현성의 기능에 따라 달라질 것이다.
b. 공지된 반응성(착색 밀도)의 제조 타깃은 중합체 펠릿상의 이용 가능한 펩티드의 농도가 알려져 있지 않기 때문에 제한된다. 결과는 예/아니오 1차 항체 검출기에 불과하다.
c. 덱스트란은 이차 IgG 타깃에 대한 단백질의 포집을 지원할 수 있지만, 예/아니오 결과로 제한된다. 따라서 디지털 영상을 지원하기 위해 기준선 감지 눈금자를 설정할 수 없다.
d. 타깃은 나머지 슬라이드 및 조직 절편으로 항원을 회수하는 동안 단백질/펩티드를 누출시킬 것이다. 타깃은 조직 절편 상에 배치되므로 처리 중에 타깃으로부터 배경 및 조직 오염이 발생한다.
중국 특허 공개 제102435728호 공보와 유사한 제어 슬라이드를 만드는 Horizon Diagnostics를 참조할 수 있지만, 타깃은 매우 다르게 만들어진다. 타깃은 원하는 항원 펩타이드를 기본적으로 세포와 같이 위치시키도록, 그들의 DNA가 변형된 배양 세포주 조직으로부터 만들어진다. 이 세포주는 원하는대로 복제할 수 있으며 '재생 가능 자원'이라고 한다. 세포는 포르말린으로 고정되고 느슨한 세포 슬러리로서 조직 블록 내에 파라핀화 된다. 사용시, 타깃은 비 반응성 세포를 포함하여 동일한 절편 내에서 양성 및 음성 반응성 타깃의 혼합물을 생성할 수 있다. 타깃 어레이를 생성하기 위해, 각각의 셀 그룹은 다른 코어와 함께 정렬된 실린더 코어로서 형성될 수 있고, 전체 어레이는 슬라이드에 적용하기 위해 단일 절편으로 절단된다.
이하에 열거 된 상기 발명에 의해 다음과 같은 사안이 보고되었다 :
a. 반응성 타깃 부위 밀도에 미지수가 너무 많기 때문에 제어는 예/아니요 결과로 제한된다. 간단히 말하면: 셀을 통해 단면 슬라이스를 변경하면 착색 강도 결과가 변경된다. 세포 블록은 항원 회수 과정을 거쳐야 하기 때문에 어떤 항원 존재도 알 수 없는 변수를 초래하는 경험에 의해 영향을 받게 된다.
b. 세포의 정전기 전하가 다르기 때문에 단면을 절단할 때, 알려진 세포의 혼합(항원 대 시료들)은 그들을 개체 간 분리하고 접합시키므로 그것을 형성하는 것은 통계적으로 유효하지 않다. 따라서, 세포 블록을 통한 절편 대 절편은 개연성이 낮은 항원 밀도 스케일의 생성을 불가능하게 하는 비율로 변할 것이다.
c. 세포 재생이 제한된 복제 수명을 갖기 때문에 세포주 성능이 일치하지 않는다. 새로운 세포주가 이전의 세포주와 동일한 항원 밀도를 가질 것이라는 보장은 없다.
d. 조직 블록을 구성하고, 블록을 절단하고, 절단 절편을 슬라이드에 적용하는 수작업 때문에 비용 효율이 좋지 않다.
현미경 슬라이드 상에 장착된 세포 및 조직에서 수행되는 분석을 위한 제어 및 측정기로서 기능하는 방법 및 장치를 개시하는 미국 특허 공보 제2016/0274006A1호 공보를 참조 할 수있다. 장치는 투명한 구형 비드와 같은 입자상 물체에 연결된 펩티드 에피토프와 같은 품질 관리 모이어티를 포함하고, 비드는 바람직하게는 대략 세포의 크기이다. 품질 관리 모이어티는 분석물에서 분석물과 유사한 방식으로 작동하여 양성 분석 반응을 생성하도록 설계되었다. 비드는 새로운 액체 그물망에 의한 착색 단계 동안 현미경 슬라이드 위에 유지되며, 이는 건조시 고체화되고 비드가 현미경 슬라이드에 부착되게 한다.
이 제어 및 측정기 해법은 흥미롭지만, 서브스트레이트에 대한 타깃의 안정성이 약하고 타깃 재료가 희소하게 위치된 코팅된 비드 상에 있기 때문에 타깃 데이터를 추출하기 어려워 실제 사용하기에는 실용적이지 않다. 단일 비드를 이미징 할 때, 얼룩의 색이 비드의 상단 중앙에서 비드의 가장자리로 변화하므로, 비드 표면의 어떤 지점에서 영상 데이터가 정확한지 알기가 어렵다.
분석 공정, 특히 다단계 면역 조직 화학 분석에 사용되는 시약의 품질을 결정하기 위한 장치 및 방법을 개시하는 미국 특허 공보 제7271008B2호 공보를 참조할 수 있다. 특히, 장치는 서브스트레이트에 부착된 복수의 화합물을 갖는 서브스트레이트를 포함하며, 여기서 각 화합물은 분석에 사용된 시약과 반응을 한다.
상기 특허 문헌에 개시된 면역 착색은 IHC 처리를 거치는 조직 절편을 지원하기보다는 2차 착색 키트의 행동을 평가하기 위한 품질 관리 슬라이드로서 평가된다. 슬라이드 서브스트레이트는 아미노-실란으로, 이는 임의의 타깃에 대해 항원 회수 공정을 거칠 수 있는 공유 결합을 지원할 수 없었다. 또한, 알칼리성 포스파타제 타깃은 항원 회수 온도에 노출되면서 분해될 것이다.
일반적으로, 본 발명의 일 양태는 면역 조직 화학 착색을 위한 공정 기록 슬라이드를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서, 분석 과정, 특히 다단계 면역 조직 화학 (IHC) 분석에 사용되는 파라핀 제거, 항원 회수 및 1차 및 2차 착색 시약의 효능을 결정하기 위한 장치 및 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 2D 또는 3D 배열 내의 점들로써 응용된, 그리고 파라핀 아래 밀봉된, 복수의 화합물을 함유하는 접착제 코팅된 현미경 슬라이드를 포함하는 장치를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서, 조직 절편 또는 느슨한 세포가 후속하여 동일한 슬라이드에 적용되고, 조직 포집으로부터 커버슬립의 적용을 통해 IHC 처리 단계를 모두 경험하는 공정 기록 슬라이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 화합물이 1차 또는 2차 IHC 착색 시약과 반응하여 공존 조직 절편 또는 느슨한 세포의 가공 경험을 기록하는 공정 기록 슬라이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 1차 타깃이 담체 단백질(수송 단백질) 상의 복합된 항원으로 구성되는 공정 기록 슬라이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 1차 타깃이 상이한 항원과 복합된 다른 담체 단백질과 혼합되어 다중 포집 능력을 갖는 타깃을 형성하는 담체 단백질상의 복합된 항원으로 구성되는 공정 기록 슬라이드를 생성한다. 한 번에 하나만 사용할 수 있지만 이 방법은 1차 타깃의 수를 슬라이드 상의 실제 기본 타깃의 수를 초과하여 확장한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 1차 타깃이 다른 비 반응성 단백질과 혼합되어 동일한 항원 모두의 구배 밀도 어레이를 생성하는 담체 단백질상의 복합 항원으로 구성된 공정 기록 슬라이드를 생성한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 2차 타깃의 2개의 어레이가 사용되며, 하나의 어레이는 마우스이고 다른 어레이는 토끼인 공정 기록 슬라이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 2차 어레이가 2D/3D 100 % 농도 타깃과 함께 10%~100% 농도의 2D 구배 밀도 어레이로서 서브스트레이트에 적용되는 공정 기록 슬라이드를 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따르면, 2차 어레이의 외삽법 및 가능하다면 1차 어레이에 의해 보조되어, 공존 조직 절편 상의 각각의 항원 농도를 객관적으로 측정하는 척도 또는 눈금자를 개발하는 공정 기록 슬라이드가 제공된다. IHC 착색 경험은 공존 조직 절편 또는 느슨한 세포에 의해 영구적으로 고정되어 IHC 공정의 QC 및 항원 밀도의 객관적인 측정을 지원한다.
특히, 본 발명은 다음의 실시예를 포함한다 :
1. 면역 조직 화학 착색을 위한 공정 기록 슬라이드 :
선택적으로, 슬라이드 유형을 식별하는 슬라이드 라벨 영역의 상부의 마킹 및 1차 타깃에 의해 지원되는 항원을 식별하는 코드;
선택적으로, 슬라이드 상에 인쇄된 라벨 바로 아래의 지번(로트 넘버);
조직 절편이 IHC를 통한 처리 및 후속적인 검사를 위해 적용될 공간;
조직 절편 아래에 위치한 IHC 타깃;
단백질 어레이의 어느 한쪽에 위치한 영상 기준점; 그리고
선택적으로 유리 현미경 코팅.
2. 실시예 1에 있어서, 타깃의 조합이 2차 단독, 2차 플러스 항원 회수 모니터, 또는 2차 플러스 항원 회수 모니터 플러스 1차 항원일 수 있는 공정 기록 슬라이드.
3. 실시예 1에 있어서, 조직 절편은 임의의 생물학적 기원으로부터 선택된 조직 절편을 위한 상기 공간에 적용될 수 있는 공정 기록 슬라이드.
4. 실시예 1에 있어서, 2차 IHC 2D 타깃이 4% 포르말린 혼합물과 (a) 100 내지 10% 마우스 농도의 구배 밀도 시리즈를 형성하기 위한 마우스와 당나귀 단백질 및 (b) 100 내지 10% 토끼 농도의 구배 밀도 시리즈을 형성하기 위한 토끼와 당나귀 단백질로 구성되는 과정 기록 슬라이드.
5. 실시예 1에 있어서, 2차 IHC 3D 100% 타깃이 골격으로서 다당류의 혼합물과 실시예 4A(a) 마우스 단백질 과 (b) 토끼 단백질의 100% 혼합물로 형성된 공정 기록 슬라이드.
6. 실시예 1에 있어서, 연장된 항원 회수 모니터 타깃이 두 가지 배열 내에 침전된 100% 마우스 및 토끼 단백질의 50:50 혼합물인 공정 기록 슬라이드 : (a) 2% 포르말린 고정을 갖는 2D 및 (b) 다당류를 갖는 3D와 6% 포르말린으로 과도하게 고정됨.
7. 실시예 1에 있어서, 1차 IHC 2D 타깃이, 중성화된 KLH 단백질과 혼합될 수 있는 키홀 림펫 클램 (keyhole limpet clam, KLH)과 같은 담체 단백질에 공유적으로 부착된 항원 펩티드인, 그리고 세 개 내지 다섯 개의 희석물의 구배 밀도 시리즈를 만들거나, 다른 항원이 부착된 KLH 단백질과 혼합하여 다중 항원 타깃을 형성하는 4% 포르말린인 공정 기록 슬라이드.
8. 실시예 1에 있어서, 상기 영상 기준점은 흑백 영상 기준인 공정 기록 슬라이드.
9. 실시예 1에 있어서, 상기 유리 현미경 슬라이드는 아민, 아미드, 카르 복실 및 하이드록실로 이루어진 군으로부터 선택된 반응성 말단기와 함께 유리와 보호막에 공유 결합으로 부착되는 생체 접착제로 코팅된 공종 기록 슬라이드, 그리고 생체 접착제는 써모-피셔 수퍼 프로스트 플러스 (Thermo-Fisher Super Frost Plus) # GL4951P와 같은 약간 친수성임.
10. 실시예 1에 있어서, 타깃이 조직 절편과 공존하는 타깃인 공정 기록 슬라이드.
11. 실시예 1에 따른 공정 기록 슬라이드를 사용한 면역 조직 화학 착색 방법은 다음 단계를 포함한다 :
a. 파라핀이 매립된 조직 절편 및 PRS 타깃 위의 파라핀 차폐 코팅으로부터 파라핀을 제거하는 단계;
b. 항원 회수 완충액에 의해 조직 절편의 항원 부위를 노출시키기 위해 포름알데히드 고착을 제거하는 단계;
c. 조직 절편 또는 1차 항원 타깃 부위에서 발견된 임의의 매칭 항원 부위에 결합하기 위해 한 개 또는 두 개의 1차 결합된 항체를 적용하는 단계;
d. 단계 (b)에서 얻어진 노출된 항원 부위에 착색 시약을 적용하여 타깃화 된 항원의 존재의 가시적인 색 표시를 생성하는 단계;
e. 선택적으로, 착색제의 충분한 밀도를 얻기 위한 다단계 증폭 단계;
f. 물리적 형태를 볼 수 있도록 대비색(파란색)을 제공하기 위해 헤마톡실린을 사용.
g. 마침내 시험 준비가 된 커버 슬립으로 슬라이드를 덮음.
12. 실시예 11에 따르면, 단계 (a)에서 파라핀 제거 시, 파라핀을 3-10분 동안 65℃~75℃의 온도에서 가열하여 반액체 상태의 파라핀을 얻은 후, 완충 용액에 재수화될 때까지 유기 용매 시리즈로 액화시키는 방법.
13. 실시예 11 및 12에 있어서, 유기 용매가 지방족 용매, 예컨대 자일렌 또는 자일롤, 무수 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, 50% 에탄올 및 명목상 3 분의 노출 시간을 갖는 염계 완충 용액으로 시작하는 일련의 용매로부터 선택되는 방법.
14. 실시예 11에 있어서, 열 유도 에피토프 제거 (HIER) 공정과 같은 항원 회수 공정, 또는 증류수로 보다 오랫동안, 많은 물 교환에 의한 항원 회수 공정에 의해 포름알데히드의 고정이 제거될 수 있는 방법.
15. 실시예 11에 있어서, 단계 (d)에서 이용되는 이차 착색 시약이, 효소-표지된 이차, 효소-표지된 삼차 항체가 효소-표지된 이차 항체와 반응하고, APAAP 면역 복합체가 2차 항체와 반응하고, 효소-표지된 (스트렙트) 아비딘은 비오티닐화된 2차 항체와 반응하고, 아비딘-또는 스트렙트-아비딘-비오틴-효소 복합체는 비오티닐화된 2차 항체, 1차 항체 상의 비오티닐화 된 2차 항체상의 스트레파비딘-효소 복합체와 반응하고, 2차 항체 및 1차 항체에 결합된 효소 부위를 포함하는 중합체로부터 선택되어 지는 방법.
16. 실시예 11에 있어서, 이용되는 항원 회수 완충액은 6 내지 9의 pH 범위에서 선택 될 수 있는 방법.
17. 실시예 11에 있어서, 단계 (c)에서의 1 차 항체가 일반적인 예 : ER, PR, Her2, Ki67을 포함하도록 숙주 단백질이 마우스 또는 토끼인 항체로부터 선택되는 방법.
18. 실시예 11에 있어서, 크로모겐은 3,3'- 다이아미노 벤지딘 (DAB), 아미노 -9- 에틸 카바졸 (AEC), DAB + 니켈 증강제, 패스트 레드, TMB, 스테이옐로우(StayYellow), BCIP/NBT, BCIP/TNBT, 나프톨(Naphitol)AS-MX 포스페이트 + 패스트 블루(Fast Blue) BB, 나프톨(Naphihol)AS-MX 포스페이트 + 피스트 레드(Fast Red) TR, 나프톨(Naphitol) AS-MX 포스페이트 + 새로운 푹신, 스테이그린(StayGreen) 및 NBT로부터 선택될 수 있는 방법.
19. 실시예 11에 있어서, 상기 방법이 비용 효율적이고, 재현 가능하고, 안정적이고, 오진을 유발하는 IHC 처리 단계를 식별하는데 도움이 되는 방법.
20. 실시예 11에 있어서, 상기 방법은 공존 조직 절편 또는 느슨한 세포 상의 항원 농도에 대한 공정 제어를 위한 정량적 표준으로서 사용되는 방법.
도 1은 본 발명의 하나의 실시예에 따라 이용될 수 있는 일차 및 이차 타깃의 종류를 나타낸다.
도 2A는 제조된 필수 슬라이드를 나타낸다. 슬라이드에는 페인트된 레이블 영역에 빈 영역이 있는 로트 코드 번호를 통해 최소 ID가 있다. 타깃 점들의 영역을 넘어 연장되는 두 개의 두껍게 페인트된 장축 막대가 있다. 막대는 라벨 프린터가 더미의 맨 아래에서 슬라이드를 분배하는 방법을 해결하기 위해 최근 추가한 것이다. 막대는 위의 슬라이드 더미가 슬라이드 코팅 및 더 중요하게는 파라핀 차폐 코팅과 파라핀 아래의 타깃 점들을 손상시키지 않도록 한다.
도 2B는 슬라이드가 날짜 및 2D 바코드 그리고 포집된 조직 절편이 접근 데이터 라벨 영역에 표시된 후 나타나는 필수 슬라이드를 나타낸다. 조직 부분이 파라핀 왁스보다 더 많이 나타나는 것에 주목해야 한다. 조직은 대체로 투명하기 때문에 파라핀 색상이 지배적이다. '환자 조직' 및 '제어 타깃' 텍스트는 슬라이드에 인쇄되지 않지만 파라핀으로 덮인 영역이 무엇인지 읽는 이에게 알려야 한다.
도 2C는 IHC 처리 후 나타나는 에센셜을 나타낸다. 타깃과 조직 절편이 모두 뚜렷하고 해석할 준비가 되었다.
도 3은 AR 손상의 영향에 대한 상세한 표현이다.
도 4는 조명 레벨이 너무 어둡고 (최적에서 -5 %), 최적 (+0), 그리고 너무 밝을 때 (+10 또는 + 15 %)에서 영상에 대한 효과를 나타낸다.
도 5는 파라핀 차폐가 그 침전물의 에지에서 밀봉을 어떻게 확실히 하는지를 나타낸다.
도 2A는 제조된 필수 슬라이드를 나타낸다. 슬라이드에는 페인트된 레이블 영역에 빈 영역이 있는 로트 코드 번호를 통해 최소 ID가 있다. 타깃 점들의 영역을 넘어 연장되는 두 개의 두껍게 페인트된 장축 막대가 있다. 막대는 라벨 프린터가 더미의 맨 아래에서 슬라이드를 분배하는 방법을 해결하기 위해 최근 추가한 것이다. 막대는 위의 슬라이드 더미가 슬라이드 코팅 및 더 중요하게는 파라핀 차폐 코팅과 파라핀 아래의 타깃 점들을 손상시키지 않도록 한다.
도 2B는 슬라이드가 날짜 및 2D 바코드 그리고 포집된 조직 절편이 접근 데이터 라벨 영역에 표시된 후 나타나는 필수 슬라이드를 나타낸다. 조직 부분이 파라핀 왁스보다 더 많이 나타나는 것에 주목해야 한다. 조직은 대체로 투명하기 때문에 파라핀 색상이 지배적이다. '환자 조직' 및 '제어 타깃' 텍스트는 슬라이드에 인쇄되지 않지만 파라핀으로 덮인 영역이 무엇인지 읽는 이에게 알려야 한다.
도 2C는 IHC 처리 후 나타나는 에센셜을 나타낸다. 타깃과 조직 절편이 모두 뚜렷하고 해석할 준비가 되었다.
도 3은 AR 손상의 영향에 대한 상세한 표현이다.
도 4는 조명 레벨이 너무 어둡고 (최적에서 -5 %), 최적 (+0), 그리고 너무 밝을 때 (+10 또는 + 15 %)에서 영상에 대한 효과를 나타낸다.
도 5는 파라핀 차폐가 그 침전물의 에지에서 밀봉을 어떻게 확실히 하는지를 나타낸다.
본 발명은 본 개시의 일부를 구성하는 첨부 도면과, 관련되어 있는 다음의 본 발명의 상세한 설명을 참조하여 보다 쉽게 이해될 수 있다. 본 발명은 본 명세서에서 설명된 및/또는 도시된 특정 장치, 방법, 조건 또는 파라미터에 제한되지 않으며 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 예를 위한 것이고 청구된 발명을 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 또한, 첨부된 청구 범위를 포함하는 명세서에서 사용된 단수 형태 'a', 'an'및 'the'는 복수를 포함하며, 특정 수치에 대한 언급은 그 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 적어도 그 특정 수치를 포함한다. 범위는 다른 실시예로 표현 될 때, 다른 특정 값인 "약" 또는 "대략"으로 표현 될 수 있다. 또한, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명에 언급된 치수 및 재료 특성은 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이며, 적합한 유용성의 샘플 실시예를 보다 잘 이해하기위한 것이며, 언급된 값 이외의 변화 또한 특정한 응용에 따라 본 발명의 범위 내에 있는 것임이 이해돼야 할 것이다.
본 발명은 그 적용에 있어서, 구성의 세부 사항 및 설명된 구성 요소의 배치에 제한되지 않는다. 이하의 설명에서, 또는 이하의 설명에서 보여지는, 또는 도면에 나타낸 바와 같이 본 발명은 다른 실시예들이 가능하고, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 설명의 목적으로 사용 된 어구 및 용어는 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다. "포함하는", "구성하는", "갖는", "함유하는", "관련하는" 및 이들의 변형 및 추가 항목의 사용.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 언급할 것이며, 그 예는 첨부 도면에 나타냈다. 가능한 한, 도면 및 설명에서 사용된 동일한 참조 번호는 동일하거나 유사한 부분을 지칭한다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어 "슬라이드"는 또한 "현미경 슬라이드"라고도 하며, 얇은 평평한 시트 조각 (일반적으로 유리로 만들어지기 때문에, 때때로 "유리 슬라이드"로 지칭 됨)을 의미하고, 전형적으로 75×26mm (3×1 인치)이고 약 1mm 두께이며, 현미경으로 검사하기 위해 물체를 고정하는 데 사용된다.
본 개시에서 슬라이드는 또한 "공정 기록 슬라이드 (PRS)"로 지칭되며, 이는 PRS-IHC 슬라이드로 상호 교환 적으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "검출 영역"은 임의의 생물학적 기원의 조직 및 느슨한 세포와 같은 표본이 후속 면역 조직 화학 또는 면역 화학 검출을 위해 배치되는 슬라이드 내의 공간을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "제어 영역"은 1차 및 2차 타깃 어레이, 기준 영상 및 항원 회수 모니터로부터 선택된 하나 혹은 그 이상을 포함하여, 1차 항체 시약 효능 및 2차 시약 효능을 평가하기 위해 공지된 반응성 행동의 타깃을 보유하는 공간을 지칭한다.
"검출 영역" 및 "제어 영역"은 슬라이드 상에 명확하고 뚜렷한 경계를 가질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있으며; 바람직하게는 그들의 기능에 기초하여 분류된다.
본 명세서에 사용된 용어 "1차 타깃"은 IHC 분석을 위한 1차 항체가 결합할 수 있는 타깃을 의미한다. 또한, 이는 항체에 의해 인식될 수 있는 임의의 불특정 항원성 펩타이드 단편을 지칭할 수 있다. 항원성 펩타이드 단편의 유형은 IHC 공정에 사용된 1차 항체에 의해 결정되고, 이어서 원하는 1차 타깃 어레이를 얻기 위해 담체 단백질과 결합될 수 있다. 또는, 1차 타깃은 후속 사용을 위해 공통 항원 펩티드 단편으로 미리 준비된다.
본 명세서에 사용된 용어 "항원 펩타이드 단편"은 할로겐뿐만 아니라 항원 단백질과 동일하거나 거의 동일한 항원 특이성을 갖는 항원 단백질의 전체 길이 또는 일부를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "2차 타깃"은 IHC 공정에 사용된 2차 항체가 결합하는 타깃을 의미한다. 일반적으로, 2차 항체는 IHC에서 1차 항체에 결합하므로, 2차 타깃은 일반적으로 마우스 및 토끼와 같이 상이한 기원의 IgG를 포함한다.
용어 "숙주 단백질"은 마우스, 쥐, 토끼 및 염소 단백질 (IgG)과 같은 1차 항체와 동일한 기원을 갖는 단백질 (특히 IgG)을 의미한다.
용어 "더미 단백질"은 이차 항체에 반응하지 않고 구배 희석물을 얻기 위해 숙주 단백질과 혼합하는데 사용되는 단백질을 의미한다. 바람직한 더미 단백질은 당나귀 단백질 (IgG) 또는 말 단백질 (IgG)이다.
본 명세서에 사용된 용어 "로딩 도트"는 또한 "도트"와 상호 교환적으로 사용되며, 이는 원하는 펩타이드 또는 단백질을 슬라이드 상에 고정시킴으로써 형성된 실체를 의미한다. "도트"는 원, 타원, 정사각형, 다이아몬드 등과 같은 임의의 형상일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
슬라이드
면역 조직 화학 (IHC) 착색은 일반적으로 환자 조직 절편에서 특정 항원 부위의 존재를 평가하기 위해 사용된다. 비정상 또는 암 상태의 진단 수준을 부여하기 위해 조직 절편의 착색 밀도에 대해 주관적인 해석이 적용된다. 일반적으로 IHC 처리가 항상 올바르게 작동하고 조직 절편에 비정상적이거나 암의 상태가 있는 경우, 가시적인 크로모겐 마커가 표시된다고 가정한다. 그러나, 항원 회수 또는 착색 시약의 실패는 인공물을 식별하는 특징을 남기지 않는다. 따라서 실험실 기술자 또는 병리학자 측에서 올바른 진단 결정을 내릴 수 없는 상당한 기회가 있다. 다시 말해서, 물리적 형태는 비정상적인 상태를 나타내기에 충분하지 않을 수 있지만, 항원 부위가 표시되지 않으면 슬라이드는 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 슬라이드에서 찾을 수 있는 것 이상을 제공하지 않는다.
본 발명의 한 가지 실시예에서, "공정 기록 슬라이드"(이하, 접착 코팅 슬라이드는 동일한 범위 및 의미를 나타내는 공정 기록 슬라이드로 지칭 될 수 있음)라고 상호 교환적으로 지칭될 수 있는 새로운 접착제 코팅 슬라이드를 개시한다. 상기 언급된 "공정 기록 슬라이드-면역 조직 화학"(PRS-IHC) 슬라이드는 항원 회수 상태, 1차 항체 시약 효능 및 2차 시약 효능을 평가하기 위한 공지된 반응성 행동의 타깃들을 포함한다. 본 발명의 실시예에서, 1차 항원 타깃 부위는 비 파라핀 화, 항원 회수 공정, 1차 항체 성능, 침전된 크로모로의 2차 증폭 및 커버 미끄러짐의 누적 결과이지만 그것에 제한적이지는 않다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 2차 타깃 부위는 1차 항원 타깃의 누적 결과이지만, 1차 항원 타깃은 1차 항체 시약의 성능을 저하시키지 않는다는 것에 제한적이지는 않다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 착색된 2차 타깃 그룹 부위는 1차 부위의 항원 밀도가 객관적으로 확립될 수 있는 기준선을 제공한다. 각각의 2차 단백질 어레이의 한 가지 구성원은 또한 3D 스캐폴드로서 다당류를 사용하여 3D 타깃으로서 인쇄될 수 있음을 주목해야 한다. 또한, 동일한 농도 2D 및 3D 타깃 사이의 크로모겐 침전의 비는 3D 물질 상의 항원 농도의 객관적인 측정을 가능하게 하기 위해 1차 항원 어레이에 적용될 수 있는 척도 요인을 확립한다. 크로모겐 침전의 척도로서 3D 항원 밀도의 식별에 따라, 척도 또는 눈금자가 공존 조직 절편에 적용되어 조직 절편 내의 항원 존재를 객관적으로 정량할 수 있다. 2차 및 1차 반응성 타깃의 존재는 착색 시약 생존력 및 항원 회수 공정에 의해 가림의 해제를 확인하는데 중요한 역할을 한다. 상기 언급된 임의의 단계 또는 시약 중에서의 결함은 PRS 타깃에서 쉽게 식별될 수 있으며, 따라서 신호 오진이 가능할 수 있음을 강조되어야 한다.
면역 조직 화학 시험 공정에 이용되는 것이 가능한 타깃을 나타내는 도 1을 참조할 수 있다.
접착제 코팅된 슬라이드 또는 공정 기록 슬라이드의 구조를 나타내는 도 2를 참조할 수 있으며, 여기서 IHC 타깃은 조직 절편 아래에 위치하여 조직 절편까지 휩쓸려 포집되었을 타깃 물질로부터 단백질이 방출될 가능성을 감소시킨다. 타깃의 맨 윗열은 마우스 밀도 구배 어레이이며, 가운데 행은 토끼 밀도 구배 어레이이다. 맨 아랫열은 1차 항원 또는 1차 항원의 혼합물 또는 조합일 수 있는 12 개의 타깃을 지원할 수 있다. 흑백 영상 기준점은 이차 단백질 어레이의 좌측에 있다. 색소 타깃의 바로 오른쪽에는 3D 마우스 및 토끼 타깃이 있다. 2 차 타깃 및 모든 1차 타깃의 균형은 2D 배열이다. 본 발명의 다른 실시예에서, 사용 가능한 유리 현미경 슬라이드 접착제 코팅은 써모-피셔 수퍼프로스트(Thermo-Fisher SuperFrost) 슬라이드, GL4951P에서 발견된다. 또 다른 실시예에서 최적의 접착제 코팅 슬라이드는 유리에 결합하여 제한적이지는 않으나 두 개 이상의 (-ROH, -R(C=O)OH, -RNH3, -R(C=O)NH2, -RNH2) 말단 그룹을 생체 재료에 표시하고, 표면 습윤성를 위해 제조 시에 조정할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 언급된 "공정 기록 슬라이드-면역 조직 화학"(PRS-IHC) 슬라이드는 항원 회수 상태, 1차 항체 시약 효능 및 2 차 시약 효능을 평가하기 위한 공지된 반응성 행동의 타깃들을 포함할 수 있다. 1차 항원 타깃 부위는 탈 파라핀화, 항원 회수 공정, 1차 항체 성능, 침전 된 크로모겐으로의 2차 증폭 및 커버 미끄러짐의 누적 결과이다. 2차 타깃 부위는 일차 항체 시약의 성능을 저하시키는 일차 항원 타깃의 누적 결과이다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 언급된 접착제 코팅 슬라이드 또는 공정 기록 슬라이드의 구조와의 적합성에서, 상기 언급된 PRS-IHC 슬라이드는 흑백 영상 기준 타깃을 포함하는 구배 밀도 어레이의 생물학적 기반 타깃을 포함한다 . 타깃이 생물학적 기원이므로, 산화 및 미생물 공격으로부터 보호하기 위해 파라핀 박막이 적용될 수 있다. 파라핀 필름은 조직 절편의 포매 파라핀과 동일한 IHC 공정 단계에서 제거될 수 있다. PRS-IHC는 IHC 과정을 기록하기 위해 미끄러짐을 커버하는 동일한 조직 포집 경험을 겪고, 조직 절편과 함께 영원히 유지된다는 것이 주로 강조된다. 공정 경험을 알고, 기록하고, 사용할 수 있을 때 두 번째 의견과 원격 진단이 실행 가능해 진다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 접착제 코팅 슬라이드 또는 공정 기록 슬라이드는 제어 장치가 환자 자료와 함께 공존할 수 있게 하여 실험실 정보 시스템 (LIS) 에서와 같이 대체 및 손실될 수 없게 한다. 따라서 제어장치는 생물학적 물질 포집에서부터 미완성을 포괄하는 모든 경험을 통과해야 한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 접착제 코팅 슬라이드 또는 공정 기록 슬라이드는 재현성 있고, 시간이 지남에 따라 안정하며, 하나 이상의 항원을 각각 구배 밀도 어레이로서 IHC 슬라이드의 현재 공정에 대해 안정적으로 지원하며 비용 효과적이다. 공정 기록 슬라이드는 공정 제어를 위한 정량적 표준을 제공하고, 마우스 및 토끼 단백질이 구배 밀도 어레이를 제공하는 공존 조직 절편 또는 느슨한 세포에서의 항원 농도에 대한 객관적인 측정을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시예에서, IHC 착색 공정시, 단계는 접착제 코팅 슬라이드 또는 공정 기록 슬라이드에서 수행된 면역 조직 화학 착색의 통찰을 위해 설명될 수 있다. 고정된 조직 절편은 파라핀에 포매되며, 이 파라핀은 파라핀을 반 액체 상태로 먼저 데운 다음, 자일렌(또는 자일롤)을 통해 액화한 후, 점진적으로 희석된 에탄올 세척 및 마지막으로 완충액을 통해 절편의 세포 구조를 노출시키기 위해 제거돼야 한다. 다음으로, 포름알데히드 고정물을 제거하여 항원 부위를 노출시켜야 한다. 가장 일반적으로, 고정은 열 유도 에피토프 회수 (HIER) 공정 또는 훨씬 더 긴 온수 항원 회수 공정에 의해 제거된다. HIER 공정은 조직이 완충제(조직 유형에 따라 pH 6-10)에 노출되는 동안 열(최적 89℃ 및 95℃ 이하)을 적용하여 포름알데히드와 조직 사이의 Schiff 염기 결합을 끊는다. 이 시점에서, 항원 부위가 노출되고, 타깃 시약의 존재에 대한 가시적 색 표시를 생성하기 위해 착색 시약이 적용될 수 있다. 수성 항원 회수 공정은 포매된 파라핀 용융 온도보다 약 10℃ 정도 높은 약 60-65℃에서 작동한다. 비누와 여러 차례의 연속 세척은 파라핀을 천천히 용해시키고 파라핀을 제거한다. 파라핀 제거 및 고정 복구에서 작업자 또는 공정 결함은 착색 공정을 차단하고 잘못된 부정적 결과를 산출한다.
일단 항원 부위가 포름알데히드 고정으로부터 드러나면, 하나 또는 두 개의 1차 혼합 항체 시약이 적용된다. 이들은 조직 절편 혹은 PRS 일차 항원 타깃 부위에서 발견되는 임의의 매칭 항원 부위에 결합할 것이다. 1차 항체는 마우스 또는 토끼 단백질에 접합된 후 2 차 착색 시약에 의해 작용된다.
본 발명의 다른 실시예에서, 육안 검출용 착색제의 충분한 밀도를 달성하기 위해, 다단계 증폭 공정이 수행될 수 있다. 하나에서 세 단계 증폭에 이르는 다양한 2차 검출 키트가 있다. 모두 크로모겐 침전의 동일한 종료 상태에 도달한다. 보통, 일반적으로 사용되는 세 가지 2차 착색 그룹 중 하나 또는 두 개와 여러 대비 착색제 중 하나가 사용된다: 겨자무과산화효소 (HRP), 알칼리 포스파타제 (AP), 글루코스 산화효소 및 핵 대비 착색제. 이용될 수있는 가능한 침전된 크로모겐의 색은 하기 목록에 있는 색에서 선택될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다 :
HRP
● DAB (3,3'-Diaminobenzidine) >> 갈색에서 적갈색
● AEC (3-아미노-9-에틸카르바졸) >> 적색
● DAB + 니켈 인핸서 >> 블랙
● TNB (3,3 ', 5,5'-테트라메틸벤지딘) >> 블루
● 스테이 옐로우 >> 옐로우
AP
● BCIP/NBT >> 파랑
(5- 브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트)/(니트로 블루 테트라졸륨)
● 나프톨 AS-MX 포스페이트 + 패스트 블루 >> 블루
● 나프톨 AS-MX 포스페이트 + 패스트 레드 >> 레드
● 나프톨 AS-MX 포스페이트 + 새로운 푹신 >> 레드
● 스테이 그린 >> 그린
● 포도당 산화 효소 >> 블루
핵 착색제
● 헤마톡실린 (가장 많이 사용됨) >> 블루
DAB는 미국에서 잘 알려져 있으며 널리 사용된다. 세계의 많은 다른 지역에서 대신 AEC를 사용한다. DAB를 사용하는 사람들이 AEC를 거부하는 이유는 DAB의 갈색-빨간색에 비해 붉은색 채도가 너무 낮기 때문이다. 실험에 따르면 초기의 DAB는 짧은 시간에 걸쳐 상당한 노화가 발생하여 채도가 4시간 내에 눈에 띄게 떨어진다. 최신 버전의 DAB에는 DAB의 안정성을 몇 시간에서 며칠로 연장하는 안정제가 통합되어 있다. DAB는 또한 후속 완충액 세척 주기 동안 세척되는 경향이 있다. 반면 AEC는 몇 주에서 몇 달 동안 안정적으로 유지된다.
전 세계의 규제적인 표준은, 그러한 기술이 실행 가능하고 이용 가능해지면 검증된 제어가 조직 절편 및 느슨한 세포의 공정을 위한 시약, 방법 및 기기를 확인하기 위해 사용되도록 요구하거나 주장한다. 이러한 규제 관리는 혈액학 및 임상 화학이 결과를 검증하고 품질 보증을 위해 오랫동안 확립되어 왔다. 대조군 시험의 결과는 레비-제닝스(Levey-Jennings)차트 (Westgard et al. 1981) 형식으로 표시되어 있다. Westgard J, Barry P, Hunt M, Groth T (1981)“임상 화학의 품질 관리를 위한 다중 규칙 슈와트(Shewhart)차트”. Clin Chem 27: 493-501.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 이용된 대조군은 전처리 단계 : 탈 파라핀화 및 항원 회수에 의해 크게 영향을 받지 않아야 한다. 결과는 IHC 착색 시약의 효능을 측정하고 조직의 항원 농도를 위해 조직 절편에 가까이 적용할 척도 또는 눈금자를 개발한다. 오진을 방지하는데 도움이 되는 일부 단계 또는 시약 오류가 발생했음을 식별하는 통찰력을 얻는 것이 중요하다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 언급 된 모든 2D 이차 착색 타깃은 포름 알데히드로 고정된다. 2차 타깃은 다음과 같다:
> 10-100% 사이, 3D @ 100% 마우스 2D 어레이
> 10-100% 사이, 3D @ 10 % 토끼 2D 어레이
2D 2 차 착색 타깃은 마우스 + 당나귀 및 다른 토끼 + 당나귀 중 하나의 단백질 구배 밀도 어레이를 포함한다. 구배 규모는 10%에서 100% 밀도 사이의 알려진 프로파일 곡선을 따른다. 당나귀는 2차 착색 키트에서 종종 발생하는 비특이적 착색을 지원하지 않기 때문에 더 일반적으로 사용되는 소보다 더 많이 사용된다. ABC 2차 착색 키트는 염소-안티-(마우스 또는 토끼)를 2차 착색 시약 (안티-염소 포함)과 함께 1단계 시약으로 사용한다. 염소는 2단계 2차 착색 시약의 포집을 지원하는 소와 종에서 너무 가깝다. 당나귀 또는 말 종류의 것들은 이 의도하지 않은 반응을 피한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상이한 2 차 착색 및 침전된 크로모겐은 유형 및 공급 업체 사이의 색상 밀도가 상당히 다르다. 변형을 설명하기 위해, 2D 구배 밀도 어레이는 마우스 및 토끼 단백질 농도 관계에 대한 크로모겐 밀도를 형성한다. 2차 구배 어레이 혼합물은 절대 농도 측도를 생성 할 수 있지만, 슬라이드 코팅의 물리적 구조를 설명할 수는 없다. HIER 공정을 통해 친수성 행동 및 조직 보유 둘 다를 나타내는 모든 IHC 슬라이드는 다공성 인자를 갖는다. 조직 절편의 경우, 이는 절편 표면의 단면 블레이드와 슬라이드 표면 전체에 퍼져 있는 시약 때문에 발생하는 물리적 불규칙성에 적합하게 부응하는 슬라이드 코팅 외에 중요하지 않다. 그러나, 단백질의 경우, 다공성 및 습윤성 변수는 공극을 채우는 데 필요한 침전물의 양과 표면 상단에 얼마나 효과적인 표면적이 있는 지에 영향을 미친다. 다공도는 슬라이드에서 슬라이드로는 다양하지만, 임의의 한 슬라이드에서는 거의 균질하다. 개별 단백질 1차 희석은 280nm에서의 흡광도에 의해 평가된다. 이어서, 데이터는 증착된 단백질 어레이 타깃 혼합물을 제형화하여 상이한 IgG 로트간에 일관된 성능을 보장하는데 사용된다. 모든 2차 타깃은 포름 알데히드로 고정되어 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, 2D 1차 항원 착색 타깃은 시스테인 잔기 및 설포-SMCC 가교에 의해 담체 단백질에 연결된 바람직한 항원의 펩티드 스탠드를 사용한다. 현재 혼합된 담체 단백질을 더미 단백질과 블렌딩하여 농도를 조정한다. 모든 1차 항원 타깃은 포름알데히드로 고정된다. 주요 타깃은 두 가지 형태로 생산될 수 있다:
a. 구배 밀도 쌍, 최대 밀도는 항체가 결합하는 능력을 초과하고 두 번째는 50% 농도에서 결합한다. 각각의 타깃 쌍은 단일 반응성 항원을 포함한다.
b. 항원 타깃의 어레이로서 , 각각의 타깃은 최대 밀도에서 최대 10개의 상이한 항원으로 구성된다. 각각의 타깃에서 항원 유형의 혼합은 사용하는 동안 오직 하나의 항원만이 반응성을 하도록 하는 것이다.
항원은 시스테인 잔기를 갖는 펩티드 가닥으로 구성되고, 설포-SMCC에 의해 이전에 활성화된 담체 단백질에 공유 결합된다. 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin)는 인간 항체와의 비반응성과 설포-SMCC를 지원할 수 있는 부위의 알려진 범위 때문에 사용된다. 다른 유사한 단백질은 동등한 성능으로 사용될 수 있다.
펩타이드 가닥은 항원의 짧은 조각일 뿐이므로 펩타이드 가닥을 사용하는 것에 대한 잠재적인 우려가 있다. 항체가 일치하는 것으로 구성되지 않으면, 항체가 조직 절편의 항원 또는 느슨한 세포 상에 올바르게 결합하더라도 검출이 되지 않을 것이다. 따라서, 일부 항체의 경우 1차 타깃은 최대 10개의 다른 항원 조각을 지원해야 한다. 대부분의 실험실은 75~100 개의 서로 다른 항원을 사용한다. 많은 실험실에서는 1차 항체 및 2차 착색을 사용하는 착색 재료와 함께 번들로 사용한다. 이들 항체가 완전한 항체의 단편인 경우, 일치하는 항원은 매우 특이적이다. 착색제 공급 업체는 주로 자체 항체를 개발하기 때문에 PRS는 위의 옵션 B를 사용하여 각 착색제 시약 세트를 지원하므로 시장에 더 잘 제공될 수 있다.
그러나, 새로운 항체를 개발할 때, 최적의 검출 조건에 도달하기 위해 다수의 항원 제제를 시험하는 것이 매우 중요하다. 최적의 항체 농도와 감도가 무엇인지 알 수 없기 때문에 위의 옵션 A를 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 다른 실시예에서, 3D 타깃이 2D 타깃 결과를 조직 절편에 적용시킬 수 있는 측정치로 변환할 필요성이 있다. 조직 절편 및 세포는 모두 4 내지 10micron의 높이를 갖는다. 항원 부위는 세포 구조의 어느 곳에서나 세포 구조 위 그리고 내에 있을 수 있다. 수직 구조 상에 있는 이러한 항원 부위는 크로모겐이 절편의 상단에 위치한 효소에 의해 침전될 수 있는 상당한 깊이를 가질 수 있다. 따라서, 2D 단백질 침전물에서 발생할 수 있는 것보다 훨씬 더 많은 크로모겐이 침전될 수 있다. 이것이 2D 단백질 및 펩타이드 기반 타깃이 느슨한 세포 및 조직 절편 만큼 어두울 수 없는 이유이다.
DAB 시약의 시효 효과는 착색된 결과를 짧은 시간에 걸쳐 상당한 양만큼 이동시킨다. 그러나, 3D 항원 농도 척도가 DAB 성능의 변화에 독립적이기 때문에 PRS-IHC 용액은 크로모겐 침전의 이동 감소를 교정할 수 있다. 단백질 및 항원 타깃 어레이는 공지된 농도로 구성되므로, 착색 결과는 비록 압축되더라도 동일한 상대적인 관계로 유지된다. 따라서, 관찰된 강도(어둠)가 약해지는 동안, 척도는 조직 절편 또는 느슨한 세포에 대해 동일한 항원 밀도 측정치를 계속 제공할 것이다.
영상 기준 타깃 (Imaging Reference Targets)
2D 및 3D 이차 단백질 타깃 어레이 이외에, 흑백 영상 기준 타깃이 인쇄된다.
착색된 생체 물질을 함유하는 현미경 슬라이드의 디지털 영상은 착색된 물질에 대해 사전 스크리닝 및 잠재적으로 완전한 진단 결정을 수행하도록 진화하고 있다. 일반적으로, 영상 시스템은 디지털 영상이 백색 또는 흑색 경계에서 압축되지 않도록 조명광 레벨을 조정해야 한다. 통상적인 해결책은 라벨이 위치할 것으로 예상되는 곳에 흑백 타깃을 위치시키는 것이다. 기본 가정은 백색과 흑색 타깃이 슬라이드가 나타낼 수 있는 극단을 나타낸는 것이다. 그러나, 그렇게함으로써 조직 절편의 착색에 의해 구현될 수 있는 것보다 흑색이 훨씬 더 검고 백색이 훨씬 더 하얗게 되므로 디지털 척도에 압축이 존재한다.
본 발명의 바람직한 하나의 실시예에서, 환자 조직 절편 또는 느슨한 세포 침전물과 함께 공존하는 제어 및 기준 타깃 표준을 포함하는 현미경 슬라이드가 개시된다. 기준 타깃 및 조직 절편은 착색된 슬라이드의 조직 포집 및 커버 미끄러짐 사이의 공정 경험을 기록한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 현미경 슬라이드 타깃 어레이 중 공존하는 흑백 기준 타깃이 있다. 흑백 기준 타깃은 다른 타깃 및 조직 절편에서와 같이 시약과 공정에 동일한 노출을 경험했다.
본 발명의 다른 실시예에서, 기준 타깃 둘 다, 즉 흑색 및 백색 타깃은 슬라이드를 처리하는데 사용된 임의의 시약에 대해 비 반응성인 인쇄된 도료 침전물이다. 이상적인 상황에서 백색 타깃은 완벽한 백색이다. 그러나, 흑에서 백으로 중간 정도 이상되는 착색된 생체 물질의 유용성은 거의 없다. 따라서, 백색은 완전한 백색으로부터 5-10% 떨어져 있을 수 있으며 여전히 유용한 가치가 있다. 바람직한 실시예에서, 백색은 햇빛에 노출되지 않은 경우, 시간의 경과에 따라 안정한 금속 산화물 또는 설페이트 조성물이다. 보다 바람직한 실시예에서, 백색은 알루미늄 및 산화 티타늄이다.
다른 실시예에서, 흑색 및 백색 타깃은 둘 다 명목상 365nm에서 직접적인 UV광 노출에 의해 촉매되는 무수물계 에폭시 도료 기재를 기본으로 한다. 무수물 촉매제는 메틸테트라하이드로프탈산 무수물 및 디페닐요오도늄 헥사플루오로로아르세네이트로 구성된다. UV 개시 이외의 무수물은 에폭시 가교를 촉진시키는 작용을 하기 위해 열을 첨가할 것을 요구한다. 바람직한 UV 개시 무수물 및 그 보조자가 열거되어 있지만, 무수물 제조 회사의 회수를 수행할 때 발견될 수있는 다른 해결책이 있다. 이러한 도료/잉크는 필요에 따라 구성될 수 있지만, 일반적으로 사용되는 인쇄 방법에 최적화된 구매 부품이다. 도료/잉크의 제조는 안료 입자와 에폭시 바인더 사이의 우수한 습윤성을 얻는데 어려움을 해결해야 한다. 가용 시간이 수 개월 동안 지속될 수 있으므로 무수물 기반 도료(점도가 낮은 경우 잉크라고도 함)는 종종 무수물과 에폭시가 혼합되어 있다. 점도를 낮추는 것은 인쇄 산업에 관련된 사람들에 대해 알려진 지식이며, 배합은 에폭시 혼합물이 적용되는 표면 및 사용된 인쇄 방법에 따라 다양하다. 열 유발 무수물 에폭시 도료/잉크가 일반적으로 사용되지만, 반응을 개시하는데 필요한 열은 도료/잉크와 함께 공존할 수있는 생체 물질(단백질, 펩타이드 및 화학 타깃)을 잠재적으로 손상시킬 수 있다.
다른 실시예에서, 무수물 촉매는, 다르게 비특이적 착색을 지원할 수 있는 아미노-실란계 촉매에 의해 발견된 미반응 아민을 제거한다. 유리 아민 말단기는 생체 물질과 일부 특수한 얼룩을 모두 포집할 수 있으며 포집할 것이다. 구체적으로, 이는 슬라이드 공정 시약, 특히 착색 시약에 의한 백색 타깃의 바람직하지 않은 착색 문제를 해결한다. 도료/잉크 표면의 유리 아민 말단 그룹으로서 1차 항체 및 2차 착색 시약을 모두 포집하여 착색될 수 있다. 따라서 슬라이드에 백색 타깃이 통합되어 있다는 가치를 잃게 된다.
다른 실시예에서, 흑색 안료는 직경 2micron 미만의 탄소 분진을 사용하는 반면, 백색은 알루미늄, 산화 티탄 또는 황산 바륨 비드를 사용하고; 바람직하게는, 백색은 황산 바륨을 사용한다.
다른 실시예에서, 바람직한 에폭시 잉크/도료 제제는 계면 활성제를 완전히 피하여, 이들 슬라이드가 경험할 수 있는 착색제 및 시약의 범위에 잉크/도료를 반응성으로 남겨 두는 것을 방지한다.
다른 실시예에서, 타깃의 인쇄는 패드 스탬프 또는 주사기에 의해 수행될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 주사기는 타깃 증착의 더 나은 피처 사이즈 제어를 지원하기 때문에 바람직하다.
다른 실시예서, 상기 언급 된 백색 타깃은 무수물 촉매화된 에폭시 내의 금속 산화물 또는 설페이트 안료로 구성된다. 다른 실시예에서, 상기 흑색 타깃은 UV가 개시된 무수물 촉매화 에폭시 내에서 탄소계 안료로 구성된다. 다른 구체 예에서, 무수물 촉매는 직접 UV광 노출에 의해 UV 개시된다. UV 개시 무수물 촉매제를 사용하는 주요 이점은 무수물-에폭시 반응을 개시하는데 필요한 열이 생체 물질 (단백질, 펩티드 및 화학적 타깃)이 손상없이 견딜 수 있는 것보다 높다는 것이다. 더 중요한 것은 착색 시약과 반응할 수 있는 유리 아민을 제거하는 것이다.
차폐 코팅
파라핀 왁스는 일반적으로 석유, 석탄 또는 오일 셰일로부터 유래된 백색 또는 무색의 연질 고체이며, 이는 탄소수 20 내지 40의 탄화수소 분자의 혼합물로 구성된다. 파라핀은 실온에서 고체이며 약 37℃(99℉) 이상에서 녹기 시작한다. 비점은> 370℃(698℉)이다. 파라핀 왁스의 일반적인 응용 분야는 윤활, 전기 절연 및 양초; 착색된 파라핀 왁스는 크레용으로 만들 수 있다. 그것은 때때로 파라핀이라고 불리는 등유 및 다른 석유 제품과는 전혀 다르다.
병리 실험실에서, 파라핀 왁스는 조직의 얇은 샘플을 절단하기 전에 조직을 스며들게 하는데 사용된다. 알코올의 상승 강도(75% 내지 절대치)를 통해 조직으로부터 물을 제거하고 자일렌과 같은 유기 용매 또는 자일롤과 같은 지방족 대체물 중 하나에서 조직을 제거한다. 이어서, 조직을 여러 시간 동안 파라핀 왁스에 넣은 다음 왁스와 함께 몰드에 넣어 냉각 및 고화시키고; 다음 절편들을 마이크로톰으로 절단한다.
조직 절편을 파라핀에 포매하는 것은 조직 절편을 장기간 보존하기 위한 일상적인 관행이다. 그러나, 현미경 슬라이드의 선택된 영역에서 얇은 코팅층으로서 파라핀의 적용은 보고된 바 없다. 본 발명에서, 현미경 슬라이드, 유리 또는 플라스틱 상에 침전된 타깃 단백질은 박테리아 또는 곰팡이 대항제에 풍부한 식품 공급원을 제공한다. 후속 반응 결합 부위 중 다수는 하이드록실이며, 이는 공기중 산 및 염기와의 반응을 통해 손상될 수 있다. 일반적으로 단백질 침전물이 포함된 슬라이드는 미생물 성장을 지원하는 온도 이하에서 보관된다. 그러나 이러한 제약은 침전물의 효과적인 활용을 제한한다. 또한, 단백질 침전 슬라이드는 산화 손상을 방지하기 위해 진공 밀봉 용기에 포장된다. 비보호 단백질 침전 슬라이드는 주변 온도 및 대기 오염 수준에 따라 2 일에서 5 일 사이의 야외 저장 수명을 갖는다.
파라핀은 본질적으로 항원 부위의 산화 및 노출 부위의 공기중 산/염기 분해를 방지하는 항진균제 및 항균제를 함유하는 것으로 알려져 있다. 파라핀 차폐 코팅은 생체 재료의 수명을 3 내지 5 일에서 1 내지 2 년으로 변경하여 최종 사용자에게 유용한 제품 수명을 제공한다.
포매된 파라핀의 제거는 또한 조직 절편을 후속 면역 조직 화학(IHC) 또는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 착색에 노출시키기 위해 일상적인 관행이다. 동일한 현미경 슬라이드에서 다른 침전된 물질을 차폐하기 위해 동일하거나 유사한 파라핀 제형을 사용하면 IHC 또는 H&E 착색을 시작하기 전에 추가적인 슬라이드 처리가 수행되지 않아야 한다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 파라핀은 용매와 혼합되어 실온에서 물질 상태가 고체에서 액체로 변화된다. 혼합은 파라플라스트 엑스트라(X-tra) 또는 자일렌 또는 지방족 용매, 예를 들어 자일롤과의 등가물을 사용하여 점도를 감소시키고 증착 후 응고를 느리게 한다.
다른 실시예에서, 용매는 톨루엔, 도료 시너, 터펜틴, 또는 아세톤 및 등유의 50:50 혼합물로 선택될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 파라플라스트 엑스트라(X-tra)는 단백질, 펩타이드 및 무기 타깃의 산화 분해를 감소시키기 위해 페놀계 산화 방지제인 부틸화 하이드록시 톨루엔을 특이적으로 포함한다.
다른 실시예에서, 고체 파라핀은 액체가 될 때까지 파라핀 용융 온도인 75℃를 넘지 않는 온도에서 용융시킨 후, 포화점이 관찰될 때까지 지방족 용매를 천천히 첨가한다(고체가 형성됨). 혼합물을 45℃로 냉각시키고 완전히 투명해질 때까지 천천히 더 많은 지방족을 첨가한다.
다른 구체예에서, 전술한 파라핀 코팅은 생체 재료 및 접착제에 미리 적용된 특수한 스테인 반응성 침전물이 도포된 현미경 슬라이드를 코팅하는데, 여기서 생체 재료는 단백질, 펩타이드, 접합 단백질, 단백질 코팅 비드, 펩타이드 코팅 비드, 혹은 혼합 코팅 비드, 그리고 적용된 항체 및 2 차 착색 시약과 반응하는 특수한 착색 물질을 고유하게 점유하는 특수한 착색 반응성 말단기를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
다른 실시예에서, 파라핀 층은 슬라이드상의 타깃에 선택적으로 적용된다. 또 다른 실시 예에서, 파라핀 층은 스프레이, 잉크젯 침전, 전사 인쇄(패드 인쇄와 같은), 스크린 인쇄 및 증기 침전을 포함하는 현미경 슬라이드 상에 침전될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시예에서, 파라핀은 바람직하게는 약 5 미크론 이하의 얇은 층이다; 다른 바람직한 실시예에서, 파라핀은 60℃ 미만, 바람직하게는 56℃ 미만의 용융 온도를 가지며, 자일렌 또는 자일롤(지방족 대체) 용매에 노출되면서 용해된다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 파라핀은 포매 파라핀과 유사한 주변 온도 경도를 갖는다.
다른 실시예에서, 파라핀 물질을 포매하는 조직 블록은 열 피셔에 의한 티슈 프렙 및 티슈 프렙 2, 용융 온도 56℃, 라이카(Leica)에 의한 파라플라스트 & 파라플라스트 플러스, 용융 온도 56℃, 라이카(Leica)에 의한 파라플라스트 엑스트라(X-tra), 용융 온도 50-54℃,를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
다른 실시예에서, 각각은 용융된 온도, 경도 및 점도를 확립하기 위해 정제된 파라핀, 합성 중합체 및 다른 물질의 혼합이다. 파라핀에 내재된 것은 미생물 성장을 지원하지 않는다.
다른 실시예에서, 특수한 착색제는 다음과 같으나 이에 제한되지는 않는다: 알시안 블루(Alcian Blue), 알라닌 블루(Alanine Blue) - 오렌지 G 용액, 아잔(Azan) 염료, 비엘쇼프스키(Bielschowsky)은 염료, 브라우 앤 벤(Brow & Benn) - 그람 염료(Gramm Stain), 크레실 바이올렛(Cresyl Violet), DAB, 폰타나 마손(Fontana Masson), 고르돈 앤 스위트의 은 염료(Gordon and Sweet’s silver staining), 그로셋의 메탄아민 은 방법, 홀(Hall)의 빌리루빈 염료, 존스 메탄아민 은 방법, 룩솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue), 룩솔 패스트 블루 - 크레실 바이올렛, 무시카르민(Mucicarmine) (메이어의 방법), 뮬러 - 모우리(Muller-Mowry) 콜로이드 철, 오렌지 G, 뉴클리어 패스트 레드(Nuclear Fast Red), 디아스타제 소화를 이용한 PAS, 주기성 산 쉬프(PAS), 인 텅스텐 산, 헤마톡실린, 피크로 시리우스 레드(Picro Sirius Red), 톨루이딘 블루 산성화(Toluidine Blue Acidified), 트리 크롬 -- 코모리스 원-단계, 트리크롬 -- 마손(Trichrome -- Masson’s), 빅토리아 블루, 폰 코사(Von Kossa), 웨이저트의 레소르신 푹신(Weigert’s Resorcin Fuchsin), 웨이저트의 철 해마톡실린(Weigert’s Iron Haematoxylin), 젤(Zell) -- 니엘슨 방법(Neelsen Method).
다른 실시예에서, 타깃은 흑백과 같은 안료 착색 침전물에 제한되지 않고, 임의의 안료 색상을 포함할 수 있도록 선택될 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 언급된 파라핀 코트가 적용될 수 있는 현미경 슬라이드는 유리, 플라스틱 또는 임의의 중합체 재료로부터 선택될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 실시예에서, 파라핀은 정제되어 물이 없을 수 있다.
다른 실시예에서, 생성된 현미경 슬라이드는 침전물 및 침전물을 둘러싸는 슬라이드 표면 둘 모두를 밀봉하는 모놀리식 표면 코팅으로 파라핀 입자를 용융 및/또는 혼합하기 위해 후가열 될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 생성된 현미경 슬라이드는 후가열되어 용매를 파라핀 밖으로 밀어내어 반드시 경화된 상태로 되돌아 가도록 한다. 이 작업은 슬라이드의 파라핀 쪽에서 적외광을 사용하는 것이 좋다. 위에서 아래로 파라핀을 녹이면 용매가 방해없이 파라핀으로부터 올라가서 증발할 수 있다. 결과는 도 5에 나타냈으며, 파라핀이 침전물 가장자리에서 밀봉을 확실하게 하는 방법을 보여준다.
항원 회수 모니터
본 발명의 다른 실시예에서, 항원 회수 모니터는 사용된 공정 및 그의 실행에 따라 항원 회수(이후 AR로 지칭 됨) 공정에 의해 수행되며, 슬라이드 간, 그리고 착색제 간에 상당히 가변적이다. AR은 개방 고리 공정이며 AR 버퍼와 버퍼 온도를 직접 측정하는 것은 그것이 실제로 알려지지 않고 추정하고 있기 때문이다. AR 공정은 히터가 원하는 온도에서 AR 버퍼가 균일하게 동일한 온도로 작용하도록 지시받았다고 가정한다. AR 공정은 또한 사용되는 AR 버퍼가 올바른 시약 성분을 사용하는 올바른 혼합물이라고 가정한다. 두 가지 모두 실험실에 대한 실질적인 피드백 없이는 AR을 수행할 수 없다는 가정이다.
본 발명의 다른 실시예에서, PRS는 ARM3D 및 ARM2D + 2D 2차 어레이의 두 가지 AR 타깃를 포함한다. AR 상태는 복구 부족, 공칭 상태 및 복구 과잉 세 가지이다.
> 복구 부족 상태는 AR 온도가 너무 낮거나 노출 시간이 충분하지 않거나 전혀 실행되지 않아서 발생한다. ARM2D 타깃은 예를 들자면 최소 포름 알데히드 고정 내의 100% 농도에서 마우스 및 토끼 단백질(또는 다른 종의 단백질, 마우스 및 토끼 단백질에 제한되지 않음)의 50:50 혼합물이다. 이 타깃이 착색되면 AR 공정은 실패한다. 바람직하게는 단백질은 IgG이다.
> 복구 과잉 상태는 AR 온도가 너무 높거나, 노출 시간이 너무 길거나, AR 버퍼가 >pH 9.5 또는 <pH 5.5 인 경우에 발생한다. ARM3D 타깃은 포름알데히드로 과도하게 고정된 3D 스캐폴드에 침전된 100% 농도에서 마우스 및 토끼 단백질 (또는 다른 종의 단백질, 마우스 및 토끼 단백질에 제한되지 않음)의 50:50 혼합이다. 이 타깃이 착색되면 AR 공정이 너무 공격적이므로 슬라이드를 진단 평가에 사용해서는 안된다.
> 공칭 복구 상태는 마우스 및 토끼 구배 밀도 어레이의 10% 내지 30% 이하의 타깃이 가시적 착색을 나타내지 않을 때 발생한다. AR 손상 정도는 착색되지 않은 저농도 2차 타깃의 양으로 평가할 수 있다. 이 손상은 조직 절편에서도 볼 수 있다.
항원 영상 척도 외삽법
1 차 항체는 원하는 항원 일부에 의해 접종된 숙주 동물(예를 들어, 마우스 또는 토끼)로부터 얻어진 가공된 숙주 혈청으로 구성되는 것으로 알려져 있다. 이어서, 숙주는 항원 부위가 항원 대항제에 대한 항체 반응물을 함유하는 혈청 단백질을 생성한다. 이어서, 항체가 타깃 항원을 함유하는 단백질과 접촉될 때, 항원 및 항체는 함께 결합한다. 결과적으로, 숙주 종(마우스 또는 토끼)의 항체는 이차 착색 키트와 자유롭게 반응하게 된다.
1차 및 2차 타깃은 알려진 분배된 부피의 타깃 물질이 적용되는 잘 정의되고 규칙적인(예를 들어, 둥근) 침전 영역을 갖는다. 단백질 침전물은 가교 결합기를 포함하기 때문에, 단백질 깊이보다 더 깊은 슬라이드 코팅의 다공성에 가라앉을 수 없다. 단백질이 느슨하게 가교될 때, 그들의 실질적인 크기는 접착성 코팅의 다공성으로 가라앉는 능력을 저해한다. 다공성은 함께 가교된 한 쌍의 단백질보다 크지 않다. 따라서, 단백질은 대부분 많은 단백질 두꺼운 코팅으로 남아 있다. 가교는 단백질 도트가 슬라이드 상에 증착된 후 베이킹 단계까지 완전히 일어나지 않는다. 단백질 침전물이 코팅에 의해 흡수되지 않을 것임을 아는 것은, 코팅에 흡수될 때 증폭 화학 반응이 이용 가능한 공간에 존재하기 위한 충분한 공간이 없기 때문에 나중에 착색 시약과 반응할 수 없기 때문에 중요하다. 영상화의 관점에서, 항원 회수 동안 일부 단백질이 손실될 것이지만, 새로운 단백질이 노출된다. 따라서, 타깃 도트는 침전물의 상단에 있는 것만이 착색에 반응할 수 있기 때문에 단층 단백질로 나타난다.
따라서, 단백질의 원자 질량, 침전물 중의 각 단백질 유형의 단백질 수, 타깃 영역 및 타깃의 활성 표면 단백질 밀도를 아는 것이 가능하다;
1차 항체의 시약에 노출된 슬라이드 상에 적용된 농도, 분배된 부피 및 표면적은 공지되어 있다. 시약의 노출 시간 동안, 현탁된 항체의 대부분이 분해되어 수용 항원 부위에 의해 포집될 것이라고 합리적으로 추정될 수 있다.
항원 부위에 직접 떨어지는 것만 포집되며 완충액 세척 단계에 의해 나머지 부분이 세척된다. 따라서, 침전된 항체 농도는 적절한 조건, 예를 들어, 농도가 컷오프 25% 이상이거나, 포화로부터 25%보다 작을 때 확립 될 수 있으며, 여기서 컷오프는 적용된 단백질 농도을 포집하기에 불충분한 타깃 부위 밀도로 정의된다; 포화도는 적용된 단백질이 모두 포집될 수 없는 농도로 정의된다.
일차 희석 배급량을 알면, 정확한 일차 타깃 밀도 타깃이 선택될 수 있고 일차 농도가 검증될 수 있다;
본 발명의 한 실시예에서, 각각의 2차 및 1차 타깃은 [(마우스 또는 토끼) + (당나귀 + 가교제 + 곰팡이 억제제)] 또는 [(항원 A가 있는 KLH 또는 항원 B가 있는 KLH) + (비결합성 KLH + 가교제 + 곰팡이 억제제)]의 혼합물이다. 각각의 도트는 총 단백질의 동일한 부피를 갖지만, 특정 타깃을 구성하는 단백질 간에 원자 질량이 상이할 수 있기 때문에 혼합비는 약간 조정되어야 한다.
마우스 IgG = 155kDa
토끼 IgG = 150kDa
당나귀 IgG = 160kDa
항원 펩타이드 가닥과 혼합된 KLH 서브 유닛, 여기서 서브 유닛은 KLH1과 KLH2=350 & 390kDa.
본 발명의 다른 실시예에서, 2D 2차 타깃 구배는 바람직하게는 -20log (희석) 프로파일에 따라 1 내지 1000:1의 단계적 희석 증가량이며, 여기서 희석은 -3dBd 단계로 증가한다. 용어 -20log(dilution) = dBd는 모두 수정 용어를 쉽게 적용 할 수 있도록 데이터를 선형화하기 위해 반 대수(반 로그) 기반에 따라 희석을 설명하는 것을 말한다. 용어(희석)는 X가 1:1 내지 1,000: 1과 동일한 [1..1000] 인 희석 X를 지칭한다. 용어 dBd는 데시벨의 희석 또는 희석 강도로 정의된다. 변형 용어는 항원 회수 손상, 효소 이득, 1 차 항체 시약 희석을 포함한다. 단일 2D/3D 타깃을 사용하여 2D 베이스와 3D 입자 사이의 착색 밀도 델타를 측정한다. 델타는 2D 어레이의 균형에 적용되어 조직 절편 내에서 또는 조직 절편 상에서 보여지는 3D 행동에 잘 맞는 색 밀도 스케일을 생성할 수 있다.
2차 100 % 2D/3D 및 2D 타깃은 2개의 침전물이 2D 착색 밀도와 관련하여 일치함을 입증한다. 이것은 3D 입자 성분이 2D 성분의 이동을 유발하기에 충분한 100% 단백질 물질을 소비하지 않았음을 입증하는 것이다.
이차 착색은 착색시약의 구성 기능인 1 내지 20배의 효소 이득 기능을 포함한다. 따라서, 이득이 증가함에 따라, 저농도의 2차 타깃은 포화 상태로 이동하지만, 이득이 1로 떨어지면 고농도의 2차 타깃만이 눈에 띄게 착색될 것이다;
2차 및 1차 타깃 단백질 사이의 상당한 크기 차이로 인해, 단백질 농도 밀도는 1차 단백질에 의해 정해질 것이다.
평균 1차 항체 원자 질량이 150kDa 인 경우, 단일 항체의 중량은 150kDa (1.6605×1012)이며, 이는 249×10-12ng의 중량과 동일하다. 노출된 부분만으로 슬라이드의 단일 영역을 선택하면, 적용되는 1 차 시약의 양을 개발할 수 있다. 따라서 닫힌 모세관 간격의 내부 치수가 20.3mm2×0.14mm 높이이면 부피는 57.2μL이다. 적용된 1차 항체 시약 2.832nl을 산출하는 1micron의 타깃 영역에 대한 비율;
1차 항체 시약은 농축물로부터 10ug/ml의 중간 희석물로 희석된다. 이어서, 중간 희석물을 슬라이드 상에 적용하기 위해 1:1 내지 1000:1로 희석시킨다. 이는 각각 1:1 내지 25.1:1의 희석을 위해 1-micron2영역 상에 31.5 내지 7.08 항체의 침전을 초래한다.
100% 포집 능력을 보장하기 위해 1차 타깃은 100 내지 1000배(x)의 안전 지수를 가져야 한다. 1000배(x) 옵션을 선택하면 1차 타깃은 4x106 항원 부분를 포함해야 한다. KHL 서브 유닛은 적용된 항체보다 크지만, 증가는 포집된 항체의 수를 1:1 이상으로 변화시키기에 충분하지 않다. 각각의 KLH 서브 유닛은 370kDa의 평균 원자 질량을 가지며, 이는 614.4×10-12ng의 중량과 동일하다.
단백질 분자의 부피는 단백질의 분자량 및 평균 단백질 부분 특이적 부피로부터 매우 간단하고 확실하게 근사치를 낼 수 있다(부분 특이적 부피 = 부피/분자량). 실험적으로 결정된 용해성 구형 단백질의 부분 특이적 부피의 평균은 ~0.73cm3/g이다. 이 값은 단백질마다 다르지만 범위는 다소 좁다. 이 방정식은 ~(1.212×103×MW)nm3의 단백질 부피로 감소한다. 따라서 KLH 서브 유닛의 경우 개별 부피는 448.44nm3이다. 단백질이 구체로서 만들어지면, 구체의 직경은 0.132×MW1/3in nm로된다. KLH 서브 유닛은 9.436nm이다.
1mm의 타깃 직경에 대해, KLH 서브 유닛의 단일층은 11.237×1027 단백질을 필요로 한다. 4×106 단백질의 활성 타깃 밀도의 경우, 최소 희석 비율은 1: 2.8x1021이 된다. 실질적으로, 1차 항체의 평가가 활성 단백질 농도에 의해 지배되므로 1:1000에 근접한 임의의 희석이 가능하다. 따라서 타깃 밀도는 낮은 농도 층 값에 의해서만 제한된다.
하나의 실시예에서, 이차 타깃 어레이는 1 내지 1000:1의 단계적 희석 증가분이다. 희석에 대한 선형기울기는 dBd=-20log(희석)로 일어난다. 1 ~ 1,000:1로 나열된 희석 범위의 경우, 세미 로그 범위는 0dB~-60dBd이다. -3dB 희석 단계를 선택하면 2차 타깃 희석이 -0, -3, -6, -9, -12, -15, -18, -21dBd가 된다.
2차 및 1차 타깃 어레이는 모두 비가역적으로 고정되며 AR 공정 동안 조직 또는 AR 타깃보다 훨씬 작은 정도로 분해가 된다. 분해는 완전한 단백질이 아닌 분해되는 단백질 조각에서 비롯된다. AR 공정이 단백질 타깃 및 조직 절편에 계속 작용함에 따라, 구배 척도 패턴이 100% 위치로 이동하면서 AR 손상이 나타난다. 한편, 2차 효소 이득은 구배 어레이가 10% 위치로 이동하게 한다. 효소 이득은 1, 2, 4, 5, 8, 10, 15 및 20이다. 이는 다음에 의해 2차 어레이를 10% 타깃로 이동시키는 것으로 해석된다.
● 20x모든 타깃 이동 -26dBd
● 15x모든 타깃 이동 -23.52
● 10x모든 타깃 이동 -20
● 5x모든 타깃 이동 -13.98
● 4x모든 타깃 이동 -12.04
● 2x모든 타깃 이동 -6.02
● 1x 흑색에 가까운 2D 100% 도트만
전형적으로, 2차 어레이를 3개 이상의 도트에 의해 100% 위치로 이동시키는 AR 손상은 과도한 것으로 간주되며, 더 높은 효소 이득 2차 착색 키트 또는 더 높은 농도의 항체를 사용하여 슬라이드가 다시 수행되야 한다.
따라서 1차 항원 타깃 색 밀도는 2 차 착색 키트의 효소 이득과 항체 농도의 총합이다. 2차 타깃 밀도는 단지 효소 이득에 2차 타깃 단백질 농도를 곱한 것이다.
디지털 영상 시스템에 따라, 조도의 변화는 영상의 다이나믹 레인지를 포화(더 어둡게) 또는 컷오프 (더 밝게)로 이동시킬 것이다. 이러한 변화는 항원 색상 척도를 이동시키지만 항원 밀도 수치 척도는 변하지 않는다. 따라서, 숫자 척도는 독립적이고 색상 척도는 조명 강도에 의존한다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 언급된 2차 단백질 타깃 어레이는 두 줄로 형성된다: 하나의 마우스 IgG와 다른 토끼 IgG는 더미 IgG 혈장 단백질과 혼합되어 5개 이상의 구성원 구배 밀도 시리즈를 형성한다. 이는 -20log (희석) 선형 기울기에서 최대 밀도로부터 최소 밀도로 진행하며, 여기서 희석은 초기 1000:1 희석 후 1:1 내지 1,000:1의 범위일 수 있다.
다른 실시예에서, 마지막 공정 단계에서, 식별된 항원 부위는 크로모겐 침전에 의해 착색된다. 따라서, 마우스 및 토끼 타깃 어레이는 2차 착색 키트 크로모겐 침전의 -20log(희석) 선형 기울기를 반영한다.
다른 실시예에서, 1차 항원 밀도 척도를 형성하는 방법에 대한 바람직한 용액은 타깃 혼합물을 성공적으로 구성하고, 이를 접착제로 코팅된 슬라이드 상에 침전시키고, 접착제와 타깃 물질 사이에 공유 결합을 갖는 것으로 예상된다.
다른 실시예에서, 타깃 어레이가 성공적으로 적용되고, 1차 및 2차 착색 시약 둘 다가 합리적으로 수행된다는 것을 추론하면 데이터 세트 사이의 곡선 맞춤은 컴퓨터 알고리즘에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 다른 실시예에서, 1차 착색은 형광 마커에 혼합되지 않거나 효소 부위(HRP 또는 AP 같은)와 통합되지 않은 마우스 또는 토끼 숙주 단백질을 사용하는 임의의 IHC 승인 항체로부터 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, 2차 착색은 각각 상이한 색상 크로모겐을 사용하는 마우스와 토끼 사이에서 각각 독립적으로 1 배(x) 에서 25 배(x)까지의 효소 이득을 갖는 2차 착색으로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다른 실시예에서, 하나의 슬라이드에 대한 절대 기준에서의 성능 결과는 다른 시간에 수행된 다른 슬라이드와 동일하지 않을 수 있음을 주목해야 한다. 이는 2차 착색 키트가 1차 결합 1차 항체와 마찬가지로 성능 로트마다 많이 다르다는 사실에서 비롯된다. 그러나, 하나의 공정 기록 슬라이드의 성능은 항원 척도가 유효하며, 다른 착색 시약을 사용하여 수행된 다른 공정 기록과 거의 동등하다.
다른 실시예에서, 1차 항원 농도 척도는 공존 조직 절편에 적용되어 암과 같은 검출된 세포 결함을 위해 조직 절편에 접근한다.
다양한 실시예들이 여기에서 예로서 설명된다. 본 명세서에 제시된 본 발명(들)의 넓은 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 다른 실시 예가 사용될 수 있음이 기술에 능숙한 사람들에게 명백할 것이다. 예시적인 실시예들에 대한 이들 및 다른 변형들은 본 발명(들)에 의해 커버되도록 의도된다.
실시예
하기 실시예들은 본 발명의 예시를 위한 방식으로 제시되며 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다 :
［실시예 1］파라핀 차폐 코팅을 위한 스프레이 적용 방법
공기 흐름이 적은 표면에 스프레이한다. 낮은 액체 대 공기 혼합이 바람직하다. 혼합물을 마스크를 통해 슬라이드 상에 분무하여 PRS 타깃을 덮는다. 파라핀 밀봉을 유동시키기 위해 재가열 할 필요없이 <5micron 두께의 층을 형성하기 위해 전형적으로 1-2 통과를 필요로 한다. 파라핀 혼합물 저장소와 스프레이 헤드는 파라핀이 유체이고 스프레이 헤드에서 슬라이드로 비행하는 동안 유체로 유지되도록 둘 다 56℃보다 약간 높게 가열된다. 헤드로부터 스프레이 적용 범위는 폭이 0.375˝이다. 단일 통과인 경우 100% 밀봉을 보장하기 위해 재가열이 필요하다.
［실시예 2］파라핀 차폐 코팅을 위한 스크린 인쇄 방법
스테인레스 스틸 스크린은 2 개의 평행한 측면 사이에서 스크린의 와이어를 통해 전류를 통과시킴으로써 가열될 것이다. 스크린의 온도는 파라핀 용융 온도보다 약간 낮아야 파라핀이 스크린의 바닥면으로 스며 들지 않는다. 기본적으로 파라핀은 액체보다 페이스트로 더 많이 작용한다. PRS는 100% 밀봉을 보장하기 위해 재가열 주기가 필요하다.
［실시예 3］파라핀 차폐 코팅을 위한 잉크 젯 방법
잉크젯 헤드는 파라핀을 액체 상태로 유지하기 위해 프린트 헤드 내에 통합된 히터를 가져야 한다. 슬라이드상의 재가열주기는 100% 밀봉을 보장한다.
［실시예 4］파라핀 차폐 코팅을 위한 롤러 전사 인쇄 방법
가열된 롤러는 가열된 저장소로부터 롤러로 파라핀 필름을 끌어 당긴다. 롤러는 털이 있는(보풀) 롤러로 벽을 페인트하는 것과 같은 방식으로 파라핀 필름을 슬라이드에 훨씬 많이 옮긴다. 슬라이드 상의 재가열주기는 100% 밀봉을 보장한다.
［실시예 5］PRS 타깃에 대한 항원 회수 노출 대 열화
시험 연구는 AR 노출에서의 변화가 2D 2차 타깃 및 AR 타깃에서 보여질 것을 검증하고자 하였다.
예상됐던 결과는 노출 시간 및 단백질 열화의 선형 기울기였다. 그러나 결과는 그렇지 않았다. 그 이유는 AR 버퍼는 예열된 가열 상태에서 슬라이드에 적용되지 않기 때문에, 92℃와 95℃ 사이의 작동 온도로 가열되어야 하기 때문이다. 따라서 89℃ 이상의 AR 버퍼를 얻는데 걸리는 시간을 무시하면 기울기가 선형이다. 백색 밸런스와 대비를 최적으로 설정하기 위해 PRS 흑백 타깃으로 8-bit 디지털화를 사용하여 기울기는 1.3lsb/minute, +/- 0.2lsb 이다. 89℃ 시간 표시를 지나 20분을 초과하면 50% 타깃에 심각한 스트레스가 가해지고 2차 타깃 시리즈의 유용성이 손상된다.
［실시예 6］2차 타깃의 일관성
시험 연구는 두 가지 요소가 탐구되고 있다 :
I. 2차 단백질의 단일 혼합 배치 내 슬라이드 사이의 점과 점(dot-to-dot).
II. 2차 단백질 어레이의 상이한 유형의 슬라이드 사이의 점과 점.
단일 혼합 배치 시험은 100% 및 40% 타깃 제형을 사용 하였다. 100 개의 슬라이드가 인쇄되었고, 모두 Scytek의 아비딘 비오틴 결합법(ABC) 유형 마우스 및 토끼 2차 착색 키트로 처리되었다. 추가 변수만 추가하므로 항원 회수가 수행되지 않았다. 둘 다의 분포는 1.5% 이내였다.
［실시예 7］2 차 더미 단백질의 선택
10 개의 상이한 2 차 희석 그룹을 마우스, 토끼 및 소 IgG 단백질의 2 개의 상이한 로트로부터 제조하였다. 희석액은 마우스와 소 및 토끼와 소의 100, 40 및 20%였다. 100 및 40% 희석 그룹에 대한 분포는 1.5% 이내였다. 20% 희석 그룹은 예상치 못한 착색 밀도 증가를 보여 주었다. 이 데이터로부터, 본 발명자들은 ABC 착색 키트의 소와 비오티닐화된 염소-대-폴리발산 시약 간의 상호 작용을 발견하였다. 문제는 소를 당나귀로 대체함으로써 해결되었다. 테스트가 반복되었고 20% 그룹은 이제 1.5% 이내로 유지되었다.
［실시예 8］PRS-IHC의 품질 관리 사용
품질 관리(QC) 모드에서, 공존 타깃은 도 3에 나타낸 바와 같이 IHC공정 피드백을제공한다. 2차 어레이의 4 가지 라인이 있으며, 그 차이는 각각 공칭 내, 초과, 매우 초과 및 과도하게 초과, 5, 10, 30 및 40%에서 수행되는 항원 회수의 정도에서 보여진다. 항원 회수 공정은 포름알데히드와 단백질 사이의 쉬프 (Schiff) 염기 결합을 역전시켜 항원 부위를 가리는 것을 추구한다. 항원이 노출되는 속도는 반응 온도에 크게 의존한다. 온도가 증가함에 따라 핵비등의 가능성이 발생한다. 핵비등은 조직 및 단백질 침전물 모두에 물리적 손상을 일으킨다. 이상적으로, 항원 회수 활성은 슬라이드를 통해 균일하지만, 실제로는 발생하지 않으므로, 사용된 방법 및 환경에 따라 다소 또는 그 미만의 항원 회수 활성을 갖는 영역이 생성된다. 균일한 항원 회수 활성을 가정하면 다음을 사용하여 슬라이드를 진단 결정에 사용할 수 있음을 나타낼 수 있다.
AR이 최소이거나 과도하면, 2 차 어레이는 고장을 반영하지 못할 수 있다. 그러나 두 AR 타깃은 과도한 고장 조건을 나타낸다.
a. 낮은 AR은 고정된 2D/3D이고 고정된 타깃의 2D는 모두 흑색이다. 2차 어레이는 AR이 타깃의 왼쪽으로 이동하지 않아도 완벽하게 나타난다. IHC 착색제의 다음과 같은 상황에서 AR 활동이 낮을 수 있다.
i. AR 히터가 작동하지 않거나 80℃ 미만으로 설정
ii. AR 버퍼는 6 또는 9가 아닌 중성 pH 7,
iii. 노출 시간이 너무 짧음
b. 고정되어 있는 2D/3D가 매우 표백되고, 고정 타깃보다 2D가 50% 미만이면 높은 AR이 나타난다. 2 차 어레이도 역시나 광범위하게 표백된다. IHC 착색제의 다음과 같은 상황에서 높은 AR 활성이 발생할 수 있다.
i. > 95℃온도에서 작동하는 히터
ii. 노출 시간이 너무 김
c. 두 가지 상황에서 크로모겐 침전 오류가 발생할 수 있다:
i. 고농도의 2차 타깃에서 얼룩 강도는 최대 어두움보다는 감소한다. 2차 어레이는 사이트 밀도와 비교하여 항상 증가해야 한다. 그렇지 않으면, 크로모겐 침전이 2차 시약 키트 용량을 소진시킨다. 해결책은 1차 항체 희석을 증가시키는 것이다(항체 농도 감소와 동일).
ii. 크로모겐 시약이 활성화된 이후 악화된다(종종 DAB에서 발생). 해결책은 새로운 DAB 혼합물을 사용하는 것이다.
착색은 1차 항체의 농도 및 2차 착색 키트의 효소 이득의 함수로서 포화 또는 차단을 경험할 수 있다. 포화는 효소 부위의 밀도가 크로모겐으로부터 착색제를 침전시키는 능력을 초과할 때이다. 다시 말하면, 얼룩의 색은 실현될 수 있는만큼 어둡다. 1차 항체의 농도 및 2차 착색 키트의 효소 이득이 너무 낮을 경우, 컷오프가 발생하여 착색제 침전이 불충분해질 수 있다. 이 두 가지 요인으로 인해 보조선의 어두움이 포화(100%) 또는 컷오프(0%)로 이동한다. 도 3을 기준으로 이 움직임은 보이는 타깃의 수로 나타난다. 2차 효소 이득이 증가함에 따라 100% 도트 밀도는 0 % 위치로 이동한다. 일반적인 효소 이득은 1, 2, 4, 5, 8, 10, 15 및 20이다. 이는 다음을 통해 2차 어레이를 0% 위치로 이동시킨다.
● 20x 모든 타깃 이동 -26dBd
● 15x 모든 타깃 이동 -23.52
● 10x 모든 타깃 이동 -20
● 5x 모든 타깃 이동 -13.98
● 4x 모든 타깃 이동 -12.04
● 2x 모든 타깃 이동 -6.02
● 1x 전용 2D 100 % 흑색에 가까운 도트
1차 타깃 어레이가 존재하는 경우, 2차 효소 이득의 증가는 착색 밀도를 낮은 1차 농도 도트 쪽으로 이동시킨다. 1차 항체 농도가 증가하는 경우에도 동일하다. 항원 회수 과정은 1차 및 2차 타깃 모두를 어느 정도 수준으로 분해시켜 컷오프로의 이동을 역전시킨다. IHC 착색의 말미에 3개 이상의 도트가 사라지면 슬라이드가 과도한 항원 회수 기간, 온도 또는 둘 다를 가지고 있고, 너무 많은 항원 존재가 조직 상에서 손실되므로 진단을 미미하게 만든다고 간주될 것이다. 이 결정은 이미 2차 착색이 손상된 것으로 나타났기 때문에 1차 항체의 효능과 무관하다. 항체 단계의 어느 것도 이 손상 수준을 극복 할 수 없다.
［실시예 9］PRS는 항원 밀도 척도로 조명 수준을 추적
종래의 현미경을 통해 현미경 슬라이드를 보는 것은 조명 레벨에 대해 주관적이다. 전체 슬라이드 영상 (WSI)에서 스캐너는 완벽한 백색과 흑색 구멍을 사용하여 백색 밸런스와 대비를 설정한다. 수동 현미경의 경우에는 그렇지 않다. 도 4는 조명 수준이 너무 어둡거나 (최적에서 -5 %), 최적 (+0), 너무 밝을 때 (+10 또는 + 15 %)에서와 같이 영상에 미치는 영향을 보여준다. 광도가 최적보다 낮으면 착색 밀도가 압축된다. 암 단계의 관점에서 이것은 진단을 필요한 것보다 한 단계 높게 전환시킬 수 있다. 조명 수준이 최적보다 높으면 영상의 표백 현상이 나타난다. 암 단계의 관점에서 이것은 진단을 필요한 것보다 한 단계 아래로 이동시킬 수 있다. 항원 색 밀도 및 수치 눈금자는 1차 및 2차 타깃에서 개발되며 WSI 영상에 겹쳐질 수 있다. 수치 스케일은 독립 항이고 색상 밀도는 종속 항이다. 항원 밀도 색상 및 수치 눈금자가 WSI에 적용되면 사용자가 조명 레벨을 위 또는 아래로 이동함에 따라 수치 척도는 고정된 상태로 유지된다. 한편, 조명 레벨이 변함에 따라 색상 밀도 척도가 이동한다. 장점은 사용자가 색상 밀도와의 수치적 관계를 잃지 않으면서 조직 영상에서 가장 잘 보이는 기능으로 외관상의 조명을 상/하로 이동하도록 선택할 수 있다는 것이다. 배율이 변경될 때에도 작용한다.
［실시예 10］항원 밀도 눈금자의 구성
항원 밀도 눈금자가 개발될 수 있는 두 가지 형태가 있다.
1. 유형 A는 1차 항체가 항상 조직 항원 부위에 대하여 10% 미만의 초과 항체에 적용된다는 가정에 기초한다.
2. 유형 B는 1차 항원 구배 밀도 어레이를 사용한다.
유형 A: 2차 단독 기반 항원 눈금자
이 형태는 2차 타깃 어레이만을 사용한다. 2D 바코드에 포함된 정보는
(a) 1차 항체 데이터 : 항체에 대한 숙주종 및 -dBd의 희석 및 (b) 2차 효소 이득을 포함한다.
이차 구배 밀도 타깃 어레이는 타깃 사이의 -3dBd 감소 후 공지된 농도의 단백질로 구성된다. 최대 농도는 1차 항체에 사용되는 최소 희석에 의해 선택된다. 대부분의 사용자는 항체 시약 제조업체가 제공한 농도 사양을 사용하여 일정한 중간 농도 1ug/ml로 희석한다. 그로부터 다른 모든 희석은 다른 조직 유형을 수용하기 위해 필요에 따라 이루어진다. 일반적으로, 1차 항체 희석의 두 번째 세트는 1 : 1 내지 1,000 : 1의 범위이다.
이차 효소 이득의 범위를 수용하기 위해 2차 어레이는 더 넓은 범위의 희석도로 구성되어야 한다. 따라서, -3dBd 단계에서 2차 어레이의 최저 희석은 1,000:1 또는 -60dBd에서 시작하며, 이는 SdBd로 표시된다. 8 도트 계열의 최대 값은 -0dBd 또는 1:1이 된다. 항원 회수의 작용은 ARdBd로 표시되는 생식 단백질을 분해한다. 2 차 어레이에서 각 도트, 8개 중 하나는 -3dBd 증분을 나타낸다. 두 타깃(더 이상 보이지 않음)의 손실에 대한 항원 회수 손실은 + 6dBd이다. 이는 2 차 어레이가 2D 타깃들의 경우(-S+AR) dBd 또는 [+6 ~ -54dBd]를 의미한다. 항체 농도 및 2차 효소 이득은 이제 고려되어야 한다. 항체 농도는 AdBd이고, 효소 이득은 EdBd이다. 따라서 2차 어레이는 (-S+AR-E) dBd 인 반면, 조직은 (+AR-E+A) dBd이다. 적용해야 할 다음 요소는 100 % 2D에서 3D로의 차이이다. 100 % 2D/3D 타깃의 3D 객체와 100% 2D 사이의 착색 차이는 2차 착색 크로모겐 침전 상수를 나타내며, 이는 색 밀도를 수치 척도에 할당하고, DdBd에도 할당한다. 색상 밀도의 차이는 어레이의 각 2D 타깃에 적용된다. 따라서, 2D 어레이는 착색 색 밀도를 (+AR-E+A+D) dBd로 나타낸다.
효소 이득이 10배(x)라면, E=-20dBd이다. 그러면 2D 2차 어레이는 -14, -17, -20, -23, -26, -29, 공백, 공백 dBd가 된다. 0%를 향한 2개의 도트는 항원 회수 공정에 의해 충분히 손상되어 착색에 의해 회복될 수 없으며 따라서 공백이 되었다. 예를 들어 2D/3D 색 밀도 차이가 10×인 경우, D = + 20dBd가 3D 2차 어레이를 -34, -37, -40, -43, -46, -49, 공백, 공백 dBd로 나타낸다. 1차 항체 시약은 100% 수율이 발생하는 1차 타깃에서 적합한 항원 부위를 발견할 것으로 추정된다. 또한 KLH 단백질 당 2개 이상의 항원 펩타이드 가닥이 존재하지만, 하나의 항체만이 KLH 단백질 당 효과적으로 결합하여 착색될 수 있다고 가정된다. 동일한 KLH 단백질에서 적합한 항원을 발견하는 임의의 추가 항체는 중복 점유로 인해 2차 착색으로 완료되지 않는다. 따라서, 검출될 수 있는 1차 항원 운반 단백질 당 항원 부위의 수는 하나이다. 1차 타깃은 2차와 동일한 micron 당 단백질 수를 포함하므로, 500ug/ml 로부터 항체 마스터의 1차 희석은 2차 어레이 데이터에 적용되어 2차 색 밀도를 수치 항원 밀도로 조정한다. 2차 타깃을 모니터링 하려면 중간 색상 밀도를 가진 타깃을 선택한다. 중간 색 농도는 최대 흑색과 최대 백색 사이의 50% 지점으로 정의된다. 그러면 포인트는 3dBd 밖 범위의 1.5dBd에 해당한다. 이 포인트가 항원 밀도 눈금자가 설정되는 앵커로 기능한다. 중간점 이상의 마지막 타깃 범위를 사용하면 -41.5dBd가 된다.
2차 단백질은 10㎍/mL 마스터 희석으로 희석된다. 각각의 어레이는 당나귀 IgG 단백질과 혼합된 마우스 또는 토끼의 혼합이다. 단백질은 모두 상이한 원자 질량을 갖지만, 모두 150kDa이고 타깃 도트 당 총 단백질 수는 일정하다고 가정할 것이며, 혼합 비율은 일정하지 않다. 현재로서는 반응성 단백질 농도만 고려되고 있다. 150kDa에서 개별 단백질 분자량이 MW = 249.07×10-12ng이다. 표준 타깃 도트의 직경은 1mm이다. 착쇄된 침전물이 1μm 두께이고, 침전물 농도가 10μg/mL 인 경우, 31.5×106개 단백질들이 증착된다. 직경 1μm 면적에는 31.5개의 단백질이 있다. 하나의 단백질이 1개의 항원 부위에 해당하도록 허용하면 항원 밀도가 확립될 수 있다. 2차 어레이는 침전물 당 동일한 수의 단백질을 사용하지만, 마우스 또는 토끼의 농도가 감소함에 따라 마우스 또는 토끼와 당나귀 사이의 비율이 변한다. 100% 타깃은 전적으로 마우스 또는 토끼이며 눈금자의 0dBd 점과 일치한다.
1차 항체가 조직의 항원 부위에 결합할 때, 2차는 조직에서만 착색 될 것이다. 이용 가능한 항원 부위에 결합하기에 충분한 항체 농도가 제공되어야 한다는 것을 제외하고는 적용된 항체의 농도에 특별히 의존하지 않는다. 따라서, 조직 상에서 항원 밀도 측정은 일정하게 유지되지만, 수치는 항원 회수 손상 및 2차 효소 이득에 대해 수정되어야 한다. 그런 다음 색 밀도 대 숫자 측정을 조화시켜야 한다.
이전 예에서, 효소 이득은 10배(x)이고 항원 회수는 2차 어레이로부터 2개의 도트의 손실을 야기하였다. 항원 회수 손실은 + 6dBd 인 반면 효소 이득은 -20dBd이다. 결과는 -14dBd이다. 희석은 다음과 같다:
| 수치 밀도 dBd |
색상 밀도 dBd |
% 타깃 마우스/토끼 : 당나귀 |
1μm2에서의 항원 밀도 마우스/토끼 |
| 0 | -14 | 100 | 31.5 |
| -3 | -17 | 70.8 | 23.32 |
| -6 | -20 | 50.1 | 15.78 |
| -9 | -23 | 35.5 | 11.18 |
| -12 | -26 | 25.1 | 7.90 |
| -15 | -29 | 17.78 | 5.60 |
| -17 | -32 | 12.59 | 3.96 |
| -20 | -35 | 9.9 | 3.12 |
유형 B: 1차 항원 기반 눈금자
이 형태는 1차 및 2차 타깃 어레이를 모두 사용한다. 2D 바코드에 포매되어 전달된 정보는 (a) 일차 항체 데이터 : 항체의 숙주 종 및 dBd의 희석 그리고 (b) 이차 효소 이득을 포함한다. 로트 코드 데이터에는 사용중인 1차 타깃 조합에 대한 정보가 포함된다.
1차 타깃 계열이 존재하는 경우, 가장 농축된 도트는 2차 어레이와 동일한 100% 농도를 가진 세 개의 도트들일 것이고, 도트들은 -6dBd 단계에서 간격을 두고 있다. 사실상, 1차 어레이와 2차 어레이는 동일한 희석 기울기를 갖는다. 1차 타깃은 -0, -6, -12dBd가 되고 PdBd로 표시된다. 항원 회수가 2차 어레이의 손상과 거의 동일하게 손상될 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 1차 어레이는 2차 착색에 의해 작용하므로 동일한 효소 이득 기능을 경험한다. 따라서, 1차 어레이는 (-A + AR -E) dBd가 되며, 일차 타깃 밀도는 1차 항체 희석에 의해 제어된다. 유일한 요구 사항은 P가 항상 A보다 크다이다. 10x 효소 이득 = -20dBd 및 + 6dbd 항원 회수 손실의 경우 1차 어레이는 -20, -26, -32dBd이다. 항원 회수 손실은 2차 어레이에 대한 영향에 기초하여 이들을 제거할 수 있을 만큼 1차 타깃에 작용하지 않는다. 2차 어레이는 항원 밀도 눈금자를 생성하기에 충분하지만, 1차 희석이 올바르게 적용되었는지 확인하는 것이 중요하다. 따라서 1차 타깃은 해당 용량에서 작동한다.
본 출원은 2017년 6월 15일에 출원된 제목이 "면역 조직 화학 착색을 위한 공정 기록 슬라이드"인 미국 가출원 번호 62/520,319; 2017년 7월 31일에 출원된 제목이 "면역 조직 화학 착색법에 대한 공정 기록 슬라이드"인 미국 가출원 번호 US62/539,281; 2017년 6월 15일에 출원된 제목이 "현미경 슬라이드의 단백질 침전을 위한 차폐 코팅"인 미국 가출원 번호 62/520,169; 2017년 6월 15일에 출원된 제목이 "IHC Imaging Baseline Reference"인 미국 가출원 번호 62/520,178; 2017년 6월 15일에 출원된 제목이 "IHC 항원 이미징 스케일 외삽법"인 미국 가출원 번호 US62/520,187의 우선권을 주장하며, 각각의 개시는 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
Claims (30)
- 검출 영역 및 제어 영역을 포함하는 슬라이드로서,
상기 검출 영역은 조직 절편 또는 느슨한 세포가 면역조직화학(IHC) 또는 면역화학(ICC) 검출 또는 후속 검사를 통한 처리를 위해 적용될 공간이고;
상기 제어 영역은 상기 면역조직화학 또는
상기 면역화학 검출 공정의 하나 이상의 중간 단계들에서 존재하는 가능한 오류를 나타내거나, 착색 조직 또는 세포의 색상 밀도를 정성적으로 또는 정량적으로 결정하는 기준을 제공하는 제어 타깃을 가지며;
상기 중간 단계들은 파라핀 제거, 항원 회수, 1차 착색 및 2차 착색으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계인 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 1 항에 있어서,
상기 슬라이드를 펩티드, 단백질, 슈가, 지질, 작은 무기 분자와 같은
일부분(moieties)과 결합하도록 하는 접착제 코팅을 가지며;
상기 접착제 코팅은 유리와 공유적으로 결합하며 -ROH, -R(C=O)OH, -RNH3, -R(C=O)NH2, 및 -RNH2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 말단기들을 제공하며;
상기 접착제 코팅은 친수성인 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제어 영역은 1차 타깃 어레이들의 하나 이상의 세트들을 함유하며, 상기 1차 타깃 어레이는 하나 이상의 1차 타깃 로딩 도트들을 포함하며, 각각의 상기 1차 타깃 로딩 도트는 상기 슬라이드 상에 고정화된 항원 펩티드 단편들인 하나 이상의 1차 타깃들을 포함하며, 상기 1차 타깃들은 적어도 하나의 항원 단백질 또는 상기 항원 단백질의 항원 특이성을 변경하지 않는 변이체의 전장 또는 일부에 해당하며;
상기 1차 타깃 로딩 도트들 중 하나에서 상기 1차 타깃들의 적어도 하나는 상기 면역조직화학 또는 상기 면역화학 검출용으로 사용되는 1차 항체에 의해 인지될 수 있는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 3 항에 있어서,
상기 1차 타깃의 펩티드 가닥은 시스테인 잔기를 통해 담체 단백질과 결합되고, 설포-SMCC(Sulfo-SMCC) 교차에 의해, 선택적으로, 접합된 상기 담체 단백질은 더미 단백질(dummy protein)과 혼합되어 농도를 조절하며;
상기 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 및 2차 염료 시약에 달리 비반응성인 다른 단백질에 해당되는 달걀 흰자로부터의 오발부민(OVA) 또는 말, 당나귀 또는 얼룩말과 같은 에쿠스(Equus) 속 과로부터의 어느 것으로부터 선택되며;
상기 1차 타깃은 파라포름알데히드 또는 포르말린과 같은 고정제로 고정되는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 4 항에 있어서,
상기 1차 타깃 로딩 도트들은 구배 타깃 밀도 쌍들을 형성하고, 각각의 상기 타깃 밀도 쌍은 단일 반응성 항원을 포함하며; 결합된 펩티드는 중성 KLH 단백질 및 4% 포르말린과 혼합되어 2 내지 10 희석의 구배 밀도 시리즈; 또는
모두 최대 밀도에서 서로 다른 상기 항원 펩티드 단편들로 이루어진 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제어 영역은 2차 타깃 어레이들의 하나 이상의 세트들을 더 포함하며, 상기 2차 타깃 어레이는 하나 이상의 2차 타깃 로딩 도트들을 포함하며, 각각의 상기 2차 타깃 로딩 도트는 일정 비율로 상기 슬라이드에 고정된 숙주 단백질 및 더미 단백질의 혼합물이며;
동일 상이한 상기 2차 타깃 어레이에서 상이한 도트들에 대하여, 상기 숙주 단백질은 동일하며; 상기 더미 단백질은 동일하거나 그렇지 않을 수 있으며;
상기 2차 타깃 어레이들의 상이한 세트들에 대하여, 상기 숙주 단백질들은 상이하며;
상기 더미 단백질은 동일하거나 그렇지 않으며;
상기 2차 타깃 도트 어레이들은 구배 희석 시리즈를 형성하고,
상기 구배 밀도는 1 내지 1000:1의 단계별 희석 증분을 포함하고; -dBd 프로파일에 해당되는 0 내지 -80dBd (100% 내지 0.01%) 숙주 단백질 농도, 또는 0 내지 -100dBd 내에서 동일한 dBd 증분의 하나 이상의 희석과 절충되는 시리즈를 따르며;
상기 2차 타깃들은 파라포름알데히드 또는 포르말린과 같은 고정제로 고정되는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 6 항에 있어서,
상기 숙주 단백질은 상기 면역조직화학(IHC) 또는 상기 면역화학 검출에 이용되는 1차 항체를 생성하는 동물의 단백질이며; 상기 숙주는 마우스, 쥐, 토끼 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 6 항에 있어서,
상기 더미 단백질은 2차 착색 키트에서 발생하는 비특이적 염색을 지지하지 않는 단백질이며; 상기 더미 단백질은 당나귀 또는 말 단백질인 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제어 영역은 각각이 골격으로서 다당류 및 특정 농도의 숙주 단백질의 혼합물로 형성되며, 상기 슬라이드 상에 적재된, 하나 이상의 3D 2차 타깃 로딩 도트들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제어 영역은 하나 이상의 영상 기준 로딩 도트들을 더 포함하며, 상기 영상 기준 로딩 도트들은 흑색 타깃 또는 백색 타깃을 포함하며, 상기 흑색 및 백색 타깃 양쪽 모두가 포함되고, 2차 타깃들의 어느 한 쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 10 항에 있어서,
상기 흑색 타깃은 탄소 먼지로부터 선택되며; 탄소 화합물은 0.1 내지 2 마이크론의 크기 범위에 있고;
상기 백색 타깃은 산화 티타늄, 산화 알루미늄, 황산 알루미늄, 또는 황산 바륨과 같은 산화물 또는 황산염 상태의 원소의 주기율표 내의 ‘전이후 금속’(poor metals)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 10 항에 있어서,
상기 흑색 타깃 및 상기 백색 타깃은 365nm에서 자외선 노출에 의해 촉매된 무수물계 에폭시 도료 베이스를 바탕으로 하지만, 메틸 테트라히드로프탈산 무수물 및 디페닐이오듐 헥사플루오로아세네이트로 구성된 UV 개시 무수물 촉매에 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제어 영역은 항원 회수 공정의 복구 부족 상태에서 검출하기 위한 하나 이상의 항원 회수 모니터 로딩 도트를 더 포함하고, 각각의 상기 항원 회수 모니터 로딩 도트는 생쥐 및 토끼 단백질의 혼합물을 특정 비율로 고정하여 처리된 하나 이상의 숙주 단백질의 혼합물인 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제어 영역은 항원 회수 공정의 과다 회복된(over recovered) 조건 하의 검출을 위한 하나 이상의 다른 항원 회수 모니터 로딩 도트들을 더 포함하며; 상기 항원 회수 모니터 로딩 도트는 고정제로 과다 고정된(over fixed) 3D 스캐폴드 내에 침전된 특정 비율의 생쥐 및 토끼 단백질의 혼합물인 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
파라핀 코팅은 1차 타깃, 2차 타깃, 영상 기준, 슬라이드 상의 항원 회수 모니터 탑재(로딩) 도트들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오 물질들에 도포되거나 또는 무기 침전물에 5 마이크론 이하로 도포된 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 15 항에 있어서,
상기 파라핀 코팅의 도포는,
(a) 60 내지 70℃의 범위의 온도에서 고체 파라핀을 액체로 용융할 때까지 용융하며, 상기 용융 온도는 75℃를 초과하지 않아야 하는 단계;
(b) 포화 혼합물이 수득될 때까지 상기 단계 (a)에서 얻어진 파라핀에 지방족 용매를 첨가하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 얻어진 혼합물을 30 내지 33℃ 범위의 온도에서 냉각시킨 후, 매우 맑은 액체로 될 때까지 천천히 유기 용매를 첨가하는 단계;
(d) 상기 슬라이드 상의 바이오 물질 또는 무기 침전물에 상기 단계 (c)에서 얻어진 맑은 액체의 박층을 도포하여 차폐 코팅용으로 상기 슬라이드 상에 차폐 코팅을 형성하는 단계;
(e) 상기 침전된 파라핀 혼합물을 적외선 열에 노출시켜 방출된 용매를 용융하고 증발시켜, 상기 파라핀을 원래 고체 상태로 되돌리는 단계를 포함하며;
상기 파라핀은 용융 온도 56℃의 써모 피셔(Thermo Fisher)사의 티슈프랩 & 티슈프랩(TissuePrep & TissuePrep) 2, 용융 온도 56℃의 레이카(Leica) 사의 파라플라스트 & 파라플라스트 플러스(Paraplast & Paraplast plus), 용융 온도 50 내지 54℃의 레이카(Leica) 사의 파라플라스트 엑스트라(Paraplast X-tra)로부터 선택되고;
상기 유기 용매는 자일렌, (자일롤 같은) 지방족 자일렌 치환체, 톨루엔, 도료 희석제, 테레빈유, 또는 아세톤 및 등유의 50:50 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 16 항에 있어서,
상기 단계 (c)에서 얻어진 파라핀 맑은 액체는 스프레이 도포법, 잉크젯 침전법, 전사 인쇄법, 스크린 인쇄법, 또는 증착법을 통해 도포될 수 있는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 슬라이드 유형을 식별하는 마킹 및 1차 타깃들에 의해 지원되는 항원들을 식별하는 코드; 및
로트 번호를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 슬라이드. - b. 고정제 고정을 제거하여 조직 섹션의 항원 부위를 노출하는 단계;
c1. 하나 이상의 1차 항체들을 적용하여 조직 절편/느슨한 세포 또는 1차 항원 타깃들 중 어느 하나에서 발견되는 매칭 항원 부위에 결합하는 단계; 착색 시약의 존재 하에 색상을 생성할 수 있는 부분(moiety)과 결합된 하나 이상의 2차 항체들을 적용하여 조직 절편/느슨한 세포, 2차 항원 타깃들 또는 항원 회수 모니터 중 어느 하나에서 사용된 상기 1차 항체에 결합하는 단계; 또는
c2. 착색 시약의 존재 하에 색상을 생성할 수 있는 부분(moiety)과 결합된 하나 이상의 상기 1차 항체들을 적용하여 조직 절편/느슨한 세포 또는 1차 항원 타깃들 중 어느 하나에서 발견되는 매칭 항원 부위에 결합하는 단계;
e. 2차 착색 시약을 적용하여 상기 타깃된 항원의 존재의 가시적 색상 표시를 생성하는 단계;
f. 선택적으로, 착색제의 충분한 밀도를 얻는 다단계 증폭 단계;
g. 상기 2차 항원 밀도 구배를 기준으로 정량적으로,
상기 1차 항원 밀도 구배에 의해 보조되는 착색된 조직 또는 세포의 색상 밀도를 결정하는 단계;
h. 상기 1차 타깃들, 상기 2차 타깃들 및 상기 항원 회수 모니터의 염색 밀도를 기준으로 검출 공정의 질에 대한 평가를 수행하는 단계;
선택적으로, 파라핀 코팅이 슬라이드 상의 타깃들에 선택적으로 도포되며 상기 조직 절편/느슨한 세포가 또한 파라핀에 포매된다면,
a. 파라핀 포매된 조직 절편 또는 느슨한 세포 및 타깃들 상의 파라핀 차폐 코팅으로부터 파라핀을 제거하는 단계를 포함하는 제 1 항에서 청구된 슬라이드에 의한 면역조직화학 염색 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 단계 (a)에서 파라핀의 제거는 섭씨 65 내지 75℃에 이르는 온도에서 3 내지 10 분 동안 상기 파라핀을 가온함으로써 수행되어 파라핀의 반-액체화된 상태를 얻은 후에 완충 용액 내에서 재수화될 때까지 유기 용매 시리즈로 액체화하는 것을 특징으로 하는 슬라이드에 의한 면역조직화학 염색 방법. - 제 20 항에 있어서,
상기 유기 용매는 자일렌 또는 자일롤, 무수 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, 50% 에탄올, 및 3분의 노출 시간을 갖는 염계 완충 용액으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 슬라이드에 의한 면역조직화학 염색 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 고정제(포름알데히드)의 고정은 열 유도 에피토프 회수법(HIER) 또는 증류수 항원 회수 공정 중 어느 하나에 의해 제거될 수 있는 것을 특징으로 하는 슬라이드에 의한 면역조직화학 염색 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 단계 (e)에서 활용되는 2차 착색 시약은 효소-표지된 2차로부터 선택될 수 있으며, 효소-표지된 3차 항체는 효소-표지된 2차 항체와 반응하고, APAAP 면역 복합체는 2차 항체와 반응하고, 효소-표지된 (스트렙트)아비딘은 비오티닐화된 2차 항체와 반응하고, 아비딘- 또는 스트렙타비딘-비오틴-효소 복합체는 비오티닐화된 2차 항체, 1차 항체 상의 비오티닐화된 2차 항체 상의 스트렙타비딘-효소 복합체, 및 2차 항체들 및 1차 항체와 결합하는 효소 부위들을 함유하는 중합체와 반응하는 것을 특징으로 하는 슬라이드에 의한 면역조직화학 염색 방법. - 제 22 항에 있어서,
활용된 항원 회수 완충액은 6 내지 9의 pH 범위로부터 선택될 수 있는 것을 특징으로 하는 슬라이드에 의한 면역조직화학 염색 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 단계 (c1, c2)의 1차 항체는 숙주 단백질이 마우스 또는 토끼인 항체로부터 선택되어 ER, PR, Her2, Ki67을 포함하는 것을 특징으로 하는 슬라이드에 의한 면역조직화학 염색 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 2차 착색 시약(chromogens)은 3,3’-디아미노벤지딘(DAB), 아미노-9-에틸 카르바졸 (AEC), DAB + 니켈 인헨서(enhancer), 패스트 레드(Fast Red), TMB, 스테이옐로유(StayYellow), BCIP/NBT, BCIP/TNBT, 나피톨 AS-MX 포스페이트 + 패스트 블루(Fast Blue) BB, 나피톨 AS-MX 포스페이트 + 패스트 레드(Fast Red) TR, 나피톨 AS-MX 포스페이트 + 신규 푹신, 스테이그린(StayGreen) 및 NBT로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 것을 특징으로 하는 슬라이드에 의한 면역조직화학 염색 방법. - 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 오진으로 이어지는 IHC 처리 단계들의 식별을 보조하는 것을 특징으로 하는 슬라이드에 의한 면역조직화학 염색 방법. - 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 공존하는 조직 절편 또는 느슨한 세포 상의 항원 농도에 대한 공정 제어용 정량 표준으로 활용되는 것을 특징으로 하는 슬라이드에 의한 면역조직화학 염색 방법. - 복구 부족 조건 타깃의 검출용 항원 회수 모니터 로딩 도트가 염색된다면, AR 공정이 발생하지 않았다는 것을 의미하고;
복구 과잉 조건의 상기 검출용 항원 회수 모니터 로딩 도트가 염색된다면, AR 공정이 공격적이었고 상기 슬라이드는 진단 평가용으로 이용되어서는 안 된다는 것을 의미하며,
2차 타깃 어레이들의 10% 내지 30% 이하의 타깃들이 가시적인 착색을 보여주지 않는다면, 이는 공칭 회복 상태가 일어나며 이후 AR 피해 정도는 염색되지 않는 저 농도의 2차 타깃들의 양에 의해 평가된다는 것을 의미하는 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 회수에 대한 평가 기준 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 슬라이드를 포함하거나,
제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트.
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