KR102341718B1

KR102341718B1 - 파이로갈롤기로 기능화한 다당류 기반의 지혈용 조직 접착제 및 조성물

Info

Publication number: KR102341718B1
Application number: KR1020180154962A
Authority: KR
Inventors: 황동수; 노상철; 이수영
Original assignee: 주식회사 에이엔폴리
Priority date: 2018-12-05
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2021-12-22
Also published as: WO2020116924A1; KR20200068236A

Abstract

본 발명은 파이로갈롤기 또는 카테콜기를 갖는 화합물과 다당류의 복합체를 포함하는 조직 접착제에 관한 것으로서, 습윤 접착력 및 지혈 능력이 우수한 것을 특징으로하며, 하이드로겔, 매트, 필름 또는 패치 형태로 제조할 수 있어 적용 부위의 특성 및 형태에 맞게 적용이 가능하다.

Description

파이로갈롤기로 기능화한 다당류 기반의 지혈용 조직 접착제 및 조성물 {Hemostatic tissue adhesive and composition based on pyrogallol functionalized polysaccharides}

본 발명은 파이로갈롤기로 기능화한 다당류 기반의 하이드로겔 조성물 및 이를 이용하여 제조한 필름, 패치 및 매트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체 내외에서의 안전성 및 생체적합성을 갖고 지혈효과가 우수하여 생체 접착제로서 이용 가능한 지혈용 조직 접착제 조성물 및 이를 이용하여 제조한 하이드로겔, 지혈용 조직 접착제 필름, 패치 및 매트에 관한 것이다.

일상생활 및 산업현장에서 상해가 발생할 경우, 신속한 지혈은 과다 출혈과 이로 인한 생명의 위협을 막는 데에 중요한 역할을 한다. 또한 외과 수술에서 환부를 효율적으로 지혈하는 것은 환자의 출혈량을 줄이고 수혈량을 절약하는 데에 기여하며, 수술하는 의사의 시야를 확보함으로써 수술에 걸리는 시간 및 비용을 절감시킬 수 있다. 종래 지혈 방법으로는 붕대, 거즈, 수술용 복합사, 스테이플러 등 물리적 압박을 이용한 방법, 또는 전기, 초음파, 레이저 기반의 기기를 이용하는 방법이 있었지만, 출혈 부위의 추가적인 손상과 감염 가능성을 고려해야하는 문제점이 있으며, 출혈 부위의 특성에 따라 그 사용이 제한되기도 한다.

조직 접착제는 절개된 환부의 신속한 봉합 및 지혈을 위해 사용되는 수단으로써, 종래 아크릴레이트 계열의 합성 재료를 이용하는 조직 접착제와 피브린과 같은 생체 고분자 기반의 조직 접착제가 주로 사용되어 왔으며, 최근에는 하이브리드 재료 기반의 조직 접착제에 관한 연구가 이루어지고 있다. 상기 합성 재료로는 시아노아크릴레이트 및 폴리에틸렌글리콜이 많이 이용되고 있으나, 시아노아크릴레이트의 경우 생체 내에서 흡수되지 않고 포름알데히드 및 시아노아세테이트와 같은 독성 물질로 분해되는 문제가 있다. 폴리에틸렌글리코의 경우, 사용 시 자외선조사 등의 수단을 통해 구성 요소를 고분자 형태로 중합시키는 과정이 필요하므로, 응급 상황에서는 적용하기 용이하지 않으며, 부위에 따라 적용이 어려울 수 있다. 반면 생체 고분자 기반인 피브린의 경우 생체적합성이 우수하지만, 지혈 부위에 대한 접착력이 상대적으로 낮아 지혈능이 합성 재료에 비해 낮으며, 무엇보다 파보바이러스 B19에 대한 감염 가능성을 상시 염두에 두어야만 한다. 따라서 습윤한 조건에서도 조직 접착과 지혈 능력을 가지면서 생체적합성도 우수한 소재 및 이를 이용한 지혈제의 개발이 시급한 실정이다.

본 발명자들은 카테콜 및 파이로갈롤 모이어티가 금속 및 금속 이온에 대해 배위능이 있고, 수소 결합 형성을 통해 습윤한 표면에 접착할 수 있음에 착안하여, 파이로갈롤기로 기능화한 화합물과 다당류의 복합체를 포함하는 지혈용 조직 접착제 및 조성물을 제안하였다.

대한민국공개특허 제10-2015-0131951호

본 발명의 목적은 파이로갈롤기로 기능화한 다당류를 기반으로 습윤 조건에서도 조직 봉합에 적합한 접착 수단과 그 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 접착 수단을 이용하여 적용 부위에 알맞은 디자인으로 조절 가능한 소재로서, 적용 이후에 적용 부위를 외부 요인으로부터 보호할 수 있는 조직 접착제를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 파이로갈롤기로 기능화한 다당류를 기반으로 습윤 조건에서도 조직 봉합에 적합한 지혈 수단과 이를 이용하는 지혈제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 카테콜 및 파이로갈롤 모이어티가 금속 및 금속 이온에 대해 배위능이 있고, 수소 결합 형성을 통해 습윤한 표명에 접착할 수 있을 것이라는 점에 착안하여, 카테콜기 또는 파이로갈롤기를 갖는 화합물과 다당류의 복합체를 포함하는 조직 접착제 및 조성물을 제안하였다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물과 다당류의 복합체를 포함하는 조직 접착용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

식 중에서,

R₁은 H 또는 OH이고,

R₂는 H, COOH, CHO, NH₂, SH, 또는 탄소 수 1 내지 10개의 치환 또는 비치환 직선형, 분지형 또는 고리형 알킬이다.

본 발명에 따라 파이로갈롤기 또는 카테콜기를 갖는 화합물과 다당류의 복합체를 포함하는 조직 접착용 조성물은 개발한 복합체의 금속 및 금속 이온에 대한 배위능 및 습윤 접착 성질로 인해 외과 수술 시 또는 응급 상황에서 출혈 부위에 직접 적용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조직 접착제는 하이드로겔, 매트, 필름 또는 패치 형태로 제조할 수 있어 적용 부위의 특성 및 형태에 맞게 적용할 수 있으며, 적용 부위 보호에 적합하다.

도 1 (a)는 본 발명의 실시예 1에 따라 파이로갈롤기를 가진 갈산과 기능화 대상인 키토산과의 키토산-갈산 (CS-GA)를 제조하는 과정이다. (b)는 키토산 (CS) 및 키토산-갈산 복합체의 FTIR 스펙트럼이고, (c)는 키토산 및 키토산-갈산 복합체의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1-2 (CS-GA), 1-3 (CS-GA (Fe³⁺ complex)) 및 1-4 (CS-GA (Covalent))에 따라 제조한 다양한 조건의 조직 접합용 하이드로겔의 응집력을 확인하여 (a) 선형 점도 영역에서 피크 변형 값을 포착한 결과, (b) 저장 탄성률 (G′), 및 (c) 복합 점도 (η*) 및 탄젠트 델타 값 (δ)을 나타낸 그래프이다.
도 3 (a)는 키토산-갈산 전기방사 방법을 나타낸 모식도이고, (b)는 키토산 및 키토산-갈산 전기방사 섬유의 직경 분포 히스토그램이다. (C)는 키토산 (TFA:DCM=7:3에서 5% 농도) 전기방사 섬유의 SEM 1500X 이미지로써, 스케일바는 10μm를 나타낸다. (d)는 키토산-갈산 (TFA:DCM=7:3에서 13% 농도) 전기방사 섬유의 SEM 600X 이미지로써, 스케일바는 2μm를 나타낸다.
도 4 (a)는 실험예 1의 개념도로써, 삽도 중 좌도 및 우도는 각각 실시예 1-6 및 1-7에 따라 제조한 하이드로겔 중의 복합체의 구조를 나타낸 것이고, (b)는 실험예 1에 따라 실시예 1-5 (CS-GA), 1-6 (CS-GA FeCl₃), 1-7 (CS-GA NaIO₄)에 따라 제조한 하이드로겔 및 대조군으로 키토산 (CS) 및 피브린 글루 (Fibrin Glue)를 이용한 경우의 인장 강도를 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 통계적 유의성을 가지고 3회 반복 측정한 결과이다 (**p 및 ***p<0.05, one-way ANOVA).
도 5는 실험예 2에 따른 (a) 키토산 표면에 대한 SEM 이미지 (x1500, 스케일바는 10μm) (b) 키토산-갈산 건조 필름 표면에 대한 SEM 이미지 (x1500, 스케일바는 10μm) 및 (c) 거즈 표면에 대한 SEM 이미지 (x500, 스케일바는 50μm)이다. 각 이미지 내 화살표는 각 표면에 대한 혈소판 접착을 나타낸다. (d)는 실험예 3에 따라 키토산-갈산 건조 필름 (CS-GA 1wt%)과 대조군으로 키토산과 거즈의 상대적 혈액 응고 지수 (BCI)를 나타낸 그래프이다. 모든 데이터는 통계적 유의성을 가지고 3회 반복 측정한 결과이다 (***P<0.05, one-way ANOVA).

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물과 이에 기능화한 다당류의 복합체를 포함하는 지혈용 조직 접착제 및 조성물에 관한 것이다:

[화학식 1]

식 중에서,

R₁은 H 또는 OH이고,

상기 알킬이 치환되는 경우 그 치환기는 H, COOH, CHO, NH₂ 및 SH로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 조직 접착용 조성물은 염화철 (FeCl₃), 과요오드산나트륨 (NaIO₄), 호스래디쉬 퍼록시다제 및 과산화수소 (HRP/H₂O₂, horseradish peroxidase), 피브리노겐 또는 이들의 혼합물을 가교제로 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조직 접착용 조성물이 가교제를 더 포함하는 경우, 상기 화학식 1의 화합물과 다당류의 복합체는 서로 배위결합하거나 공유결합한 것일 수 있다. 상기 복합체가 서로 배위결합하는 경우, 금속 또는 금속 이온을 매개로 하여 배위결합하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 조직 접착용 조성물에 있어서, 상기 다당류는 키토산, 키틴, 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히알루론산, 펙틴, 레반, 카라기난 및 알긴산으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것일 수 있다.

키토산은 천연에서는 균류의 세포벽에서 주로 발견되며, 알칼리 조건에서 키틴이 디아세틸화되어 생산될 수 있는 D-글루코사민 단량체가 β-1,4 결합으로 무수히 결합하여 이루어진 다당류이다. 키토산은 지구상에 2번째로 많이 분포된 생체 고분자로, 생체적합성 및 생분해성이 우수하고, 세포 독성이 낮으며, 면역 반응을 거의 유발하지 않으면서, 상처 치유 효과 및 항박테리아 활성이 있으며, 가격이 저렴하여 생체의학적 응용분야에서 널리 사용되어왔다. 또한, 키토산 용액을 동물의 절개 부위에 주입시 지혈 활성이 있는 것으로 보고된 바 있는데 (Klokkevold et al.), 키토산은 양전하를 띠는 아민기를 가져 음전하를 띠는 혈소판, 혈액에 존재하는 인산염 및 다른 단백질 또는 분자와 정전기적으로 상호작용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 조직 접착용 조성물에서 다당류로 키토산을 사용하는 경우 지혈 기능을 더 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.

키틴은 게와 같은 갑각류에서 흔히 볼 수 있는 천연 다당류로서, N-아세틸글루코사민 단량체가 β-1,4 결합으로 무수히 결합하여 이루어진 다당류이다. 키틴은 갑각류 뿐만 아니라 곤충 및 미생물에서도 얻을 수 있어 저렴한 가격에 쉽게 구할 수 있다는 장점이 있다.

셀룰로오스는 무미, 무취의 천연 다당류로서, D-글루코스 단량체가 β-1,4 결합으로 무수히 결합하여 이루어진 다당류이고, 자연계에 가장 많이 존재하는 유기 섬유소로서 상용화하기에 용이하다는 장점이 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 셀룰로오스는 식물, 동물, 박테리아 등으로부터 유래된 천연 셀룰로오스일 수도 있고, 재생 셀룰로오스여도 무방하다.

카르복시메틸셀룰로오스는 주로 셀룰로오스에 크로로아세트산염을 반응시켜 얻을 수 있고, 보통 나트륨염의 형태로 얻어진다. 카르복시메틸셀룰로오스는 카르복시메틸기의 치환도를 조절하여 친수성 및 점도를 조절할 수 있다는 장점이 있다.

히알루론산은 동물의 관절이나 유리액, 결합조직에서 볼 수 있는 천연 다당류로서, D-글루코론산과 N-아세틸-D-글루코사민 단량체가 번갈아가며 β-1,3 및 β-1,4 결합으로 반복적으로 결합된 것이다.

펙틴은 식물 세포막에 포함되어 셀룰로오스와 함께 세포를 유지하는 기능을 하는 천연 다당류로서, D-갈락투론산 단량체가 α-1,4 결합으로 반복적으로 결합된 것이다.

레반은 β→6 결합한 프룩토오스로 이루어진 다당으로 과당중합체의 일종으로 끈적이는 점착성이 있는 물질이다.

카라기난은 주로 홍조류로부터 열수추출로 얻을 수 있는 천연 다당류로서, 단량체 종류에 따라 κ-카라기난, λ-카라기난 및 τ-카라기난으로 분류할 수 있고, 본 발명에서는 종류에 무관하게 사용할 수 있다.

알긴산은 갈조류에서 알칼리 추출로 얻을 수 있는 천연 다당류로서, 만누론산 및 글루쿠론산 단량체가 α-1,4 결합으로 반복적으로 결합된 것이다.

본 발명에 따른 조직 접착용 조성물에 있어서, 상기 다당류는 바람직하게는 아민기를 포함하는 것이거나, 아민기가 도입된 것일 수 있다. 상기 아민기는 화학식 1의 화합물과 다당류를 EDC/NHS 커플링시키기 위한 것일 수 있다. 키틴 및 히알루론산의 경우, 염기처리법으로 탈아세틸화시켜 2번 탄소 자리에 아민기를 도입한 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 화학식 1의 화합물과 다당류 복합체를 구성하는 다당류의 15 내지 20% 아민기가 도입된 다당류일 수 있다.

본 발명에 따른 조직 접착용 조성물에 있어서, 상기 다당류는 나노섬유 또는 나노휘스커 (whisker) 형태일 수 있다. 다당류가 나노섬유 또는 나노휘스커인 경우, 상기 다당류을 포함하는 용액을 제조하여 전기 방사하는 경우, 다른 형태의 다당류나 펩타이드와 같은 다른 재료를 사용하는 경우에 비해 안정적이고, 우수한 기계적 물성 (약 40 GPa의 강도)을 나타낸다. 이와 같은 기계적 물성은 상기 화학식 1의 화합물과 다당류 나노섬유 또는 나노휘스커 복합체를 포함하는 조직 접착제가 습윤 조건에서도 그 형태를 유지하고, 조직 접착 및 지혈이 가능하도록 기여한다.

본 발명에 따른 조직 접착용 조성물에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물과 다당류의 복합체는 다당류 100 중량%에 대하여 화학식 1의 화합물을 4 내지 15% 중량으로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조직 접착용 조성물을 포함하는 조직 접착제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조직 접착제는 하이드로겔, 매트, 필름 또는 패치 형태일 수 있다.

하이드로겔은 수중에서 잘 분산되고 변형이 용이하여, 수중에서 조직 접착 또는 지혈에 적합하며 적용 부위의 형태에 따른 제약을 덜 받는다. 여기서, 상기 하이드로겔은 물 100 중량%에 대하여 상기 복합체를 1 내지 10 중량% 로 함유하는 것일 수 있다. 상기 복합체의 함량이 1 중량% 보다 낮은 경우, 하이드로겔의 점도가 낮아져 조직 접착에 유효한 접착력을 유지하기 어려우며, 10 중량% 보다 높은 경우, 필요 및 적용 부위에 따른 변형이 어렵다. 상기 화학식 1의 화합물과 다당류의 복합체를 수계 용매에 용해시켜 하이드로겔 형태의 조직 접착제를 제조할 수 있다. 상기 수계 용매는 예를 들어, 생리식염수, PBS (phosphate buffer saline), 아세트산 용액일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

매트, 필름 또는 패치는 필요 및 적용 부위에 따라 그 형태를 다양하게 제조할 수 있다. 특히, 상기 화학식 1의 화합물과 다당류의 복합체를 포함하는 방사액을 제조하여 전기 방사함으로써 다양한 직경의 섬유를 제조할 수 있으며, 이러한 섬유를 이용하여 다양한 형태의 매트, 필름 또는 패치를 제조할 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물과 다당류의 복합체를 TFA-DCM 용매에 용해시켜 방사액을 제조할 수 있다. 이 때, 상기 TFA-DCM 용매는 TFA:DCM이 7:3인 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에서는 TFA:DCM이 7:3인 용매에 다당류를 용해시켜 전기 방사하는 경우에 비드 형성이 억제된다는 Ohkawa, K et al.을 참조하여 방사액을 제조하였으며, 이러한 경우 균일한 표면을 갖는 전기 방사 섬유가 제조되는 것을 확인하였다. 제조한 방사액을 주사기를 이용하여 15 내지 20kV의 고전압 및 0.5 내지 2.0 mL/h의 유속으로 전기 방사하여 매트 또는 패치 형태의 조직 접착제를 제조할 수 있다. 상기 매트, 필름 또는 패치 형태의 조직 접착제는 필요 및 적용 부위에 따라 단층이거나 복층 구조일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물과 다당류의 혼합물에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)를 첨가하여 화학식 1의 화합물과 다당류의 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 조직 접착용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

식 중에서,

R₁은 H 또는 OH이고,

본 발명에 따른 조직 접착용 조성물의 제조 방법은 염화철, 과요오드산나트륨, 호스래디쉬 퍼록시다제 및 과산화수소 (HRP/H₂O₂, horseradish peroxidase), 피브리노겐 또는 이들의 혼합물을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조직 접착용 조성물의 제조 방법에 있어서, 상기 다당류는 키토산, 키틴, 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 히알루론산, 펙틴, 레반, 카라기난 및 알긴산으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물과 다당류의 복합체를 포함하는 지혈용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

식 중에서,

R₁은 H 또는 OH이고,

본 발명에 따른 지혈용 조성물은 염화철, 과요오드산나트륨, 호스래디쉬 퍼록시다제 및 과산화수소, 피브리노겐 또는 이들의 혼합물을 가교제로 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 지혈용 조성물을 포함하는 지혈제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지혈제는 하이드로겔, 매트, 필름 또는 패치 형태일 수 있으며, 습윤 조건에서도 우수한 접착력을 바탕으로 효과적인 지혈이 가능하다.

실시예 및 실험예

이하에서는 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다. 그러나 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 키토산-갈산 복합체를 포함하는 하이드로겔

실시예 1-1. 키토산-갈산 복합체의 제조

파이로갈롤기로 다당류를 기능화하기 위하여 EDC/NHS 방법에 기반한 아미드화 반응을 이용하여 키토산 (CS, 100 kDa으로 ~80%로 디아세틸화된 것을 사용)에 갈산 (GA)을 결합시켜 키토산-갈산 (CS-GA) 복합체를 합성하였다 (도 1 (a)). 먼저, 둥근 바닥 플라스크에서 키토산 6.2 mmol을 0.1N의 염산에 용해시키고, 여기에 1N의 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 5.5로 조절하고, 키토산의 최종 농도를 1%로 맞추었다. 갈산 6.2mmol (키토산에 대해 1당량)을 에탄올 10mL에 용해시키고, 이를 상기 키토산 용액에 드롭하였다. EDC 6.8mmol (갈산에 대해 1.1당량) 및 NHS 6.8mmol (EDC에 대해 1당량)을 증류수에 용해시키고, 이를 키토산과 갈산 용액의 혼합물에 드롭하였다. 상기 혼합물을 질소 가스의 연속 흐름 하에 20℃에서 12시간 동안 교반하고, pH ~5의 산성 증류수에서 매 6시간마다 투석액을 교체해가며 투석시켰다. 이때, 투석관은 MWCO 3500 Da인 것을 이용하였다. 이렇게 변형시킨 키토산 용액을 동결건조하여 키토산-갈산 복합체를 얻었고, 상기 복합체는 사용 전에는 건조한 조건에서 보관하였다.

키토산-갈산 복합체의 결합 확인

FTIR 분광기 (Nicolet iS50, Thermo Scientific)를 이용하여, 4cm^-1의 해상도 및 ATR 모드에서 4000 내지 400 cm^-1 사이에서 32 스캔을 축적하여 키토산-갈산 복합체의 FTIR 스펙트럼을 확인하였다. 키토산 및 키토산-갈산 복합체 15mg을 각각 0.6mL의 DCl/D₂O (2% v/v)에 용해시키고, Bruker Avance (III-300MHz) FT-NMR 분광기를 이용하여 각 용액의 ¹H NMR 스펙트럼을 얻었고, 아르노 비색분석법을 이용하여 키토산 골격에 갈산이 결합된 정도를 정량하였다.

키토산-갈산 복합체 형성에 EDC/NHS 방법을 이용한 것은, 파이로갈롤 전구체를 갖는 갈산의 카르복시기를 EDC로 활성화하여 갈산의 o-아실우레아 유도체를 형성하고, 그 자리에서 더 안정한 NHS-에스터 유도체를 형성하기 위한 것이다 (도 1 (a)). 갈산의 NHS-에스터 유도체는 키토산의 아미노기와 아미드 결합을 형성하여 파이로갈롤 키토산 유도체를 형성하게된다. 이러한 키토산-갈산 복합체의 형성은 키토산의 FTIR 진동대에서 ν_max 3359 cm^-1 (-OH 및 -NH 스트레칭), 2875 cm^-1(CH 스트레칭), 1645 cm^-1 (C=O 스트레칭 아미드 I), 1589 cm^-1 (N-H 밴딩 아미드 II), 1375 cm^-1 (C-N 스트레칭 아미드 III), 1149 cm^-1 (C-O 비대칭 스트레칭), 1024 cm^-1 (C-O-C 스트레칭) 및 890 cm^-1 (C1-H 변형)을 통해 확인하였다 (도 1 (b)의 CS). 갈산의 결합은 1618 cm^-1 (아미드 I)에 대한 밴드의 현저한 이동으로서 관찰되었고, 1529 cm^-1에서 새로운 밴드가 뚜렷하게 나타난 것은 방향족 히드록실 스트레칭에 기인한 것으로 키토산에 화학적 변형이 일어난 것을 나타내는 것이다. 또한, 1589 cm^-1 (아민)에서 IR 흡수대가 사라진 것은 갈산이 키토산의 아민기에 결합한 것을 의미한다 (도 1 (b)의 CS-GA).

기능화된 키토산의 양성자-NMR 스펙트럼은 7.0 δppm에서 피크를 나타냈는데, 이는 갈산 모이어티의 페놀릭 양성자에 기인한 것이고, 갈산이 키토산에 결합된 것을 뒷받침하였다 (도 1 (c)). 아르노 분석에 따르면 키토산 골격의 아민기에 갈산이 결합한 정도는 4.27%인 것으로 나타났다.

키토산은 ~6.5 정도의 pKa 때문에 pH가 6.0보다 높은 조건에서는 낮은 용해도를 가지는데, 이는 키토산을 다양한 생체기술에 적용함에 있어 한계로 작용해왔다. 그러나, 키토산의 아미노기에 파이로갈롤 모이어티가 결합되는 경우 생리적 pH에서도 용해도가 극적으로 증가하였다. 키토산은 불용성이지만, 키토산-갈산 복합체는 50mg/ml의 농도로 0.1M PBS 버퍼 (pH ~7.4)에 용해되었다. 키토산의 아미노기에 파이로갈롤 모이어티가 결합하는 경우 용해도가 증가하는 것은 키토산 분자 구조가 연장된 2중 나선 구조 (즉, 키틴과 비슷한 키토산 구조)에서 이완된 2중 나선 구조 (즉, 희석된 산에서의 키토산 구조)로 변하기 때문인 것으로 판단된다.

실시예 1-2 내지 1-7. 키토산-갈산 복합체 하이드로겔의 제조

실시예 1-1에 따른 키토산-갈산 복합체를 0.1M 농도의 PBS 버퍼 (pH 7.4)에 4 w/w% 농도로 밤새 용해시켜 하이드로겔을 제조하였다 (실시예 1-2). 이때, 10mM의 염화철 (FeCl₃)을 추가적인 가교제로 첨가 (실시예 1-3)하거나, 10mM의 과요오드산나트륨 (NaIO₄)을 추가적인 가교제로 첨가 (실시예 1-4)하여 하이드로젤을 제조하였다.

실시예 1-1에 따른 키토산-갈산 복합체를 0.2M 농도의 아세트산 용액 (pH ~3.0)에 10 w/v% 농도로 2시간 동안 용해시켜 하이드로겔을 제조하였다 (실시예 1-5). 이때, 10mM의 염화철 (FeCl₃)을 추가적인 가교제로 첨가 (실시예 1-6)하거나, 10mM의 과요오드산나트륨 (NaIO₄)을 추가적인 가교제로 첨가 (실시예 1-7)하여 하이드로젤을 제조하였다.

키토산-갈산 복합체 하이드로겔의 물성 확인

지름 20 mm, 갭 1 mm인 평형판을 사용하는 유동계 (HR-2 Discovery Hybrid Rheometer)를 이용하여 실시예 1-2 내지 1-4에 따른 하이드로겔의 점탄성을 측정하였다. 이때, ATC (Active Temperature Control)를 이용하고 물을 순환시켜 온도를 25℃로 유지하였다. 10 rad/s으로 일정한 각주파수에서 0.1~100%의 변형 범위로 진동 변형 스윕을 수행하여 각 하이드로겔의 선형 점탄성 영역 (LVR)을 탐색하였다. 나아가, 이러한 LVR에서 0.1~100 rad/s의 범위 내에서 진동 변형 스윕을 수행하여 저장 탄성률, 복합 점도 및 탄젠트 델타 값을 측정하였다.

응집력 및 접착력은 하이드로겔의 극한 강도에 대해 핵심적인 역할을 한다. 염화철을 이용하여 금속 이온 복합체를 형성하는 것 (실시예 1-3)이나, 공유결합 (실시예 1-4)을 통해 분자간 인력을 촉진하는 것은 키토산-갈산 하이드로겔의 응집력을 향상시킬 수 있고, 이는 하이드로겔의 동적 탄성률을 측정하여 평가할 수 있다. 갈산의 파이로갈롤 모이어티는 다양한 pH 범위에서 금속 이온과의 bis 또는 tris 복합체 형성을 촉진하는데, 실시예 1-3에 따른 하이드로겔에서 염화철은 킬레이트제로 사용되는 것이다. 반면에, 과요오드산나트륨은 갈산을 산화시키고 가교시켜 퀴논을 형성하는 점에서 차이가 있다. 따라서, 실시예 1-2 내지 1-4에 따른 하이드로겔을 제조하여 가교 전략에 따른 기계적 물성을 확인하였다. 진동 변형 스윕을 수행하여 진동수 스윕을 수행하기 전의 하이드로겔의 선형 점탄성 영역 (LVR)을 결정하였다 (도 2 (a)). LVR은 하이드로겔 구조가 안정하게 유지되는 변형률을 나타내며, 외부 변형은 점도가 감소하기 시작하는 즉시 정지시켜 하이드로겔이 구조적으로 붕괴되지 않도록 하였다. 가교하거나, 가교하지 않은 하이드로겔 샘플의 저장과 탄성률의 손실을 진동수에 관한 함수로 측정하였다 (도 2 (b)). 구조화된 겔은 탄성 거동을 보여주었는데, 즉, G′≒ω⁰, G′≫G″로, 3가지 하이드로겔 모두에서 저장 탄성률 (G′)>탄성률 손실 (G″)인 것으로 나타났으며, 이는 각 하이드로겔이 높은 각주파수 (100 rad/s)에서도 겔과 같은 구조를 유지한다는 것을 나타낸다. 공유결합 및 금속이온 복합체 형성은 모 중합체 (키토산-갈산, 75.57Pa)에 비해 더 높은 G′(각주파수 10rad/s 조건에서 각각 378.74Pa 및 231.22Pa)를 나타내어, 가교 과정에서 향상된 고유 응집력을 보장하였다.

실시예 1-8. 키토산-갈산 전기방사 매트의 제조

실온에서 실시예1-1의 키토산-갈산 복합체를 TFA-DCM (7:3) 용매에 용해 (8-14%w/w)시켜 방사 용액을 제조하였다. 상기 용액을 23 게이지 바늘이 있는 1mL 플라스틱 주사기에 넣고, 16-18kV의 고전압 및 0.5-1.0mL/h의 유속으로 전기방사하여 키토산-갈산 전기방사 매트를 제조하였다. 주사기 끝부분으로부터 수집기의 거리는 5-10cm로 하고, 수집 플레이트는 알루미늄 호일로 감싼 것을 사용하여 바늘 끝으로부터 배출되는 방사 제트가 알루미늄 호일 상에 섬유 형태로 수집되도록 하였다 (도 3 (a)).

전기방사 나노섬유의 표면 형태는 SEM으로 5kV의 가속전압으로 확인하였다. 나노섬유 샘플을 알루미늄 토막 위의 탄소 테이프 상에 올리고 백금으로 30초 동안 스퍼터링하였다. 나노섬유의 지름은 이미지 분석 소프트웨어 (Image J)를 이용하여 분석하였다. 대조군으로 변형되지 않은 키토산 용액을 5% w/w 농도로 준비하여 동일한 방법으로 전기방사하였다.

생체 고분자에 기반한 전기방사 섬유 매트는 생체적합성이 뛰어나고, 보습 효과가 있으며, 매트의 기공을 통해 공기 확산이 가능한 점, 및 상피 형성 능력이 있다는 장점이 있다. 본 발명의 전기방사 매트 또한 넓은 표면적 및 높은 다공성을 갖는 것으로 이를 지혈에 이용하였다. 추가적으로, 섬유상 구조에 약물을 함침시켜, 구조 및 섬유상 구조의 치수에 의해 조절되는 치료적 응용도 가능하다. 종래에는 일부 연구에서는 키토산을 첨가한 방사액으로 전기방사하여 매트를 제조하였으나, 키토산은 사슬 얽힘 구조로 인해 높은 점도를 가져 단일 구성 요소 시스템으로 전기방사하기에는 상당히 어려운 문제점이 있었다. 이를 해결하기 위해 일반적으로 PEO, PVA와 같은 합성 고분자를 혼용하여 점도를 낮추어 사용하였는데, 본원 실시예에 따라 키토산-갈산 복합체를 형성하는 경우, 상기와 같은 합성 고분자의 첨가 없이도 전기방사에 적합한 점도가 되는 것을 확인하였다 (도 2 (a)).

제조된 키토산 매트는 비드의 형성 없이 섬유의 평균 지름이 704±103nm인 것으로 형성되었다 (도 3 (b) 및 (c)). 키토산-갈산 매트는 다양한 농도 (8-14%)의 방사액을 전기방사하여 제조하였고, ~13% 농도에서 방사한 나노섬유는 비드 형성 없이 섬유의 평균 지름이 346±100nm인 것으로 형성되었다 (도 3 (b) 및 (d)). 이처럼, 키토산-갈산 매트의 경우보다 미세한 섬유로서 바람직한 크기를 갖는데, 이는 키토산-갈산 복합체가 키토산에 비해 더 높은 용해도를 갖기 때문인 것으로 판단된다.

실험예 1. 벌크 접착 시험

하이드로겔의 조직 접착력을 ASTM 표준에 따라 범용 시험기 (UTM)를 이용하여 단일-랩 전단 접근 방식으로 평가하였다. 돼지 피부 (Stellen Medical)를 조직 재료로 사용하여, 10×10mm의 크기로 준비하고, 이를 0.1M PBS (pH 7.4)로 37℃에서 1시간 동안 수화시켰다. 시아노아크릴레이트 접착제를 이용하여 상기 돼지 피부 조각을 10×100mm 크기의 알루미늄 바에 접착시켰다. 상기 알루미늄 바에 접착된 상기 돼지 피부의 반대면에 실시예 1-5 내지 1-7에 따라 제조한 하이드로겔 40mg을 각각 도포하고, 돼지 피부 조각을 접착시킨 다른 알루미늄바의 돼지 피부면과 겹친 뒤, 0.1M PBS 용액 (pH 7.4) 중에 2시간 동안 방치하였다 (도 4 (a)). 10kN의 로드 셀이 장착된 범용 시험기 (Instron 5544)를 이용하여 5mm/mm의 헤드 스피드로 각 샘플의 극한 전단 응력을 측정하였다. 이때, 피브린 글루 (녹십자) 및 키토산 용액을 대조군으로 사용하여 확인하였으며, 모든 실험 데이터는 3회 측정하여 평균±표준편차로 표시하였다.

그 결과, 상업적으로 사용되는 피브린 글루 대조군에 대한 인장강도는 22.59kPa로 나타난 데에 비해, 실시예 1-5의 하이드로겔에 대한 인장강도는 47kPa인 것으로 나타나 대략 2배의 차이가 나는 것으로 확인하였다 (도 4 (b)). 이러한 차이는 실시예 1-5에 따라 제조한 하이드로겔의 경우, 키토산-갈산 복합체의 파이로갈롤기, 히드록시기 및 아민기가 생체 표면과 각각 일정한 상호작용을 하는데 이러한 상호작용이 복합적으로 작용한 것으로 판단된다. 키토산의 아민기는 정전기적 인력을 통해 생체 조직 표면과 상호작용하고, 히드록시기는 수소 결합을 통해 상호작용하는 것으로 판단된다. 파이로갈롤기는 생리적 pH 조건에서 부분적으로 탈양자되어, 반응성이 있는 퀴논기로 전환되어 조직에 존재하는 생체 거대분자의 티올 및 아민 말단과 상호작용하는 것으로 판단된다. 또한, 파이로갈롤 모이어티는 양이온-π 상호작용을 통해 생체 표면의 양이온 그룹과 함께 가역적인 가교를 형성할 수 있다.

실시예 1-6 및 1-7에 따라 제조한 하이드로겔은 각각 51 kPa 및 53kPa의 최대 인장 강도를 나타냈으며, 이는 염화철과 및 요오드산나트륨이 각각 키토산-갈산 복합체 섬유 상호간을 가교시킨 결과로 판단된다.

추가적으로, 피브린 글루와 같은 피브린 접착제는 습윤한 조건에서 쉽게 씻겨져 나가 상대적으로 약한 접착력 및 내구성을 나타냈다. 이에 비해, 실시예 1-6 및 1-7에 따라 제조한 하이드로겔은 가교 형성으로 인해 더 안정적이었다. 의학적 응용을 위해 키토산-카페산 복합체 (15kPa 정도의 인장강도)가 보고된 적이 있으나, 카테콜 전구체는 일반적으로 고가이고 대량 생산하기 어렵다는 문제가 있다. 반면에 갈산은 타닌을 수소화시켜 얻을 수 있어 저렴하고, 풍부하고 자연에 널리 존재하여, 지구상에서 2번째로 풍부한 유기 물질인 키토산과 함께 사용하여 더욱 실용적으로 접근할 수 있다.

실험예 2. 지혈 능력 시험 - 혈소판 접착

마취한 돼지로부터 혈액을 채취하고, 구연산-덱스트로스 용액을 돼지 피에 대해 1:9의 부피비로 첨가하여 응고를 방지하였다. 준비한 혈액을 4℃에서 100×g로 10분간 원심분리하여 다혈소판혈장 (PRP)을 수득하고, 이를 37℃에서 배양하였다. 동결건조 된 키토산-갈산을 증류수에 녹인 후 페트리디쉬에 부은 후 하루 동안 자연건조 시켜 제작한 키토산-갈산 건조 필름을 20×20 mm 크기의 사각형으로 준비하고, 패트리디쉬에 배치하고, 상기 다혈소판혈장에 침지시킨 후 1시간 동안 배양하였다. 이후, 접착되지 않은 혈소판을 0.1M PBS 용액으로 제거하고, 접착된 혈소판은 2% 글루타르알데히드로 4℃에서 5분 동안 안정화시키고, 이 덩어리를 0.1M PBS 용액으로 3회 세척하였다. 샘플을 진공 건조하고 알루미늄 토막에 올린 후 백금 스퍼터링하여 SEM (JSM-7401F, JEOL)으로 표면을 확인하였다. 대조군으로는 키토산 필름 및 거즈를 동일한 방법으로 처리하여 준비하였다.

그 결과, 키토산-갈산 샘플은 향상된 접착력과 함께 향상된 지혈 능력을 갖는 것으로 나타났다. 대조군인 키토산과 거즈의 표면에는 혈소판이 거의 붙지 않은 데에 비해 (도 5 (a) 및 (c)), 키토산-갈산 필름 표면에는 다수의 혈소판이 타원형으로 응집 및 접착된 것으로 나타났다 (도 5 (b)).

실험예 3. 생체내 전혈 응고 시험

돼지 혈액에 항응고제 (구연산-덱스트로스 용액 : 혈액 1:9)를 첨가하여 ACD-혈액 325mL를 준비하고, 1M 농도의 CaCl₂ 용액 (12.5 당량)을 첨가하였다. 20×20 mm 크기의 키토산-갈산 건조 필름을 준비하고, 이를 수조에서 침지하여 37℃에서 5분 동안 수화시켰다. CaCl₂-ACD 혈액을 수화된 샘플 표면 상에 천천히 올리고, 샘플을 37℃에서 20초간 배양하였다. 25mL의 증류수를 배양된 샘플에 천천히 첨가하고, 100×g에서 60초 동안 원심분리하였다. 상등액 5mL를 조심스럽게 취하고, 50mL의 증류수를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 혈전에 포집되지 않은 적혈구를 용혈시키고 그 결과 얻어지는 헤모글로빈 용액을 마이크로플레이트 흡수분광기 (Multiskan™ GO)로 542nm에서 측정하여 상대적 혈액 응고 수치(BCI)를 계산하였다. BCI는 아래 식 1을 이용하여 계산하였다.

[식 1]

식 중에서, 상기 Blank(Abs)는 ACD 전혈의 총 헤모글로빈의 흡수율이다. 따라서, BCI 수치가 낮게 나타날수록 샘플이 상대적으로 더 강한 지혈 능력을 가진다는 것을 의미한다.

대조군으로는 키토산 필름과 거즈를 동일한 방법으로 처리하여 준비하였다. 모든 실험 데이터는 3회 측정하여 평균±표준편차로 표시하였다.

대조군인 거즈의 상대적 BCI는 92.56%이고, 키토산은 95.27%인 것으로 나타났다. 반면에, 키토산-갈산 필름은 상대적 BCI가 82.19±1.19%인 것으로 나타나, 본 발명에 따른 키토산-갈산 복합체가 더 우수한 지혈 능력이 있음을 확인하였다 (도 5 (d)).

추가적으로, 필름에 혈액을 떨어뜨렸을 때, 키토산-갈산 필름이 혈액과의 상호작용으로 인해 즉시 응고되는 것을 확인하였는데, 이는 즉각적인 겔화가 요구되는 심각한 출혈에 대해서도 적용할 수 있음을 의미한다.

이상과 같이 실시 예를 통하여 본 발명을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실시예들은 모든 면에 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(1) 하기 화학식 1의 화합물과 키토산의 혼합물에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 및 N-하이드록시숙신이미드를 첨가하여 화학식 1의 화합물과 키토산의 복합체를 형성하는 단계;
(2) (1) 단계의 복합체를 트리플루오로아세트산 및 디클로로메탄의 혼합 비율이 7:3인 혼합 용매에 용해시켜 방사 용액을 제조하는 단계; 및
(3) (2) 단계의 방사 용액을 전기방사하는 단계;를 포함하는 키토산 복합체의 전기방사 매트의 제조방법으로서,
상기 (2) 단계의 방사 용액에서 상기 복합체의 농도는 13 중량%인 제조방법:
[화학식 1]

식 중에서,
R₁은 H 또는 OH이고,
R₂는 H, COOH, CHO, NH₂, SH, 또는 탄소 수 1 내지 10개의 치환 또는 비치환 직선형, 분지형 또는 고리형 알킬이다.
제1항에 있어서,
상기 알킬기가 치환되는 경우 그 치환기는 H, COOH, CHO, NH₂및 SH로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것인, 키토산 복합체의 전기방사 매트의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (1) 단계의 복합체 형성 시 염화철, 과요오드산나트륨, 호스래디쉬 퍼록시다제 및 과산화수소, 피브리노겐 또는 이들의 혼합물을 첨가하는 단계;를 더 포함하는 것인, 키토산 복합체의 전기방사 매트의 제조방법.
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제1항에 있어서,
상기 (3) 단계의 전기방사는 16 내지 18 kV의 전압 및 0.5 내지 1.0 mL/h의 유속으로 전기방사하는 것인, 키토산 복합체의 전기방사 매트의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (3) 단계의 전기방사는 전기방사 주사기 끝에서 수집기까지의 거리가 5 내지 10 cm인, 키토산 복합체의 전기방사 매트의 제조방법.
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