KR102317131B1

KR102317131B1 - miR-4661-5p의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물

Info

Publication number: KR102317131B1
Application number: KR1020210097594A
Authority: KR
Inventors: 은정우; 조효정; 정재연; 김순선
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2021-07-26
Publication date: 2021-10-25
Also published as: KR20210051941A; KR20210095827A; KR102317125B1; KR102317132B1; KR102284575B1; KR20210095829A; KR20210095828A

Abstract

본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 조기간암 진단용 엑소좀 miRNA 패널마커 조성물에 관한 것으로서, 새로운 혈청 간암 바이오마커를 찾기 위해 간암 세포가 분비하는 엑소좀 내부의 microRNA를 분석하여, 간암 엑소좀에서 특이적으로 과발현되는 microRNA를 규명하여, 현재 신뢰성 있는 바이오마커가 없는 조기 간암에서 진단적 정확도가 높은 새로운 혈청 바이오마커를 발굴하였다. 이와 같이, 엑소좀을 이용하여 조직 검사 없이 암세포 유전체 및 단백체를 확인함으로, 향후 간암처럼 조직 검사에 따른 위험이 큰 질환군에서 유용한 진단 바이오마커로 활용될 가능성이 매우 높다.

Description

miR-4661-5p의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 간암 진단용 조성물{Composition for diagnosing liver cancer comprising an agent capable of measuring expression level of miR-4661-5p}

본 발명은 비침습적 체외진단을 위한 조기간암 진단용 엑소좀 miRNA 패널마커 조성물에 관한 것이다.

간암은 한국인에게 많이 생기는 암종 중 하나로, 2015년에는 발생률이 10만명당 남자 29.5명, 여자 8.2명으로 남성에서 4위, 여성에서 6위를 차지하였고, 사망률도 높아 2015년 전체 암사망자 중 간암이 남성에서 2위, 여성에서 3위를 차지할 만큼 예후가 나쁜 악성 종양이다.

간암 환자 대부분은 기저 간경변증으로 인해 조직 검사시 출혈의 위험성이 높아 상당한 위험을 부담해야 하는데, 이에, 혈액을 기반으로 간암을 조기 진단하고 유전 정보를 획득하는 액체 생검 기술 (Liquid biopsy) 개발이 필요하다. 조직검사는 상당한 위험 부담을 감수해야 하는 것에 비해 혈액으로 진단이 가능하므로 침습적이지 않고 간편하다. 혈액은 조직검사와 달리 치료 과정 중 여러 번 채혈이 가능, 치료 과정 중 치료 반응이나 잔존암 예측에 적합하다.

엑소좀 (exosome)은 암세포를 포함한 대부분의 유핵 세포로부터 생성/분비되는 30-150nm 크기의 작은 나노 소포체 (nano-vesicle)로서, 액체 생검 기술의 선두 주자로 혈액, 소변, 복수, 타액 등 다양한 체액에서 검출되는데, 모세포 (parent cell)의 특이 유전 정보를 수하물(exosomal cargo)로 싣고, 표적 세포에 전달한다. 최근, 엑소좀은 세포-세포간 교류 (cell-cell communication)의 핵심 물질로 주목받고 있으며, 암세포 유래 엑소좀은 종양 침투 및 전이의 핵심 물질로 지목되고 있다. 암세포 엑소좀은 모세포 유전 정보를 종양 미세환경의 다른 표적 세포에 전달하여 정상 세포를 악성화시키는데, 모세포인 암세포 아바타 역할을 수행하는 것으로 추측되고 있다.

한편, 이전부터 간암 진단 마커로 활용되는 알파태아단백(alpha-fetoprotein; AFP)의 경우, 간암 진단 예민도가 60% 가량에 불과한데, 현재까지 간암은 신뢰성 있는 혈청 바이오마커가 없어, 조기 진단 및 예후, 치료 반응 예측을 위한 차세대 혈청 간암 바이오마커 발굴이 절실한 상황이다.

한국등록특허 제10-1987358호 (2019.06.03 등록)

본 발명의 목적은 miR-4661-5p 및 miR-4746-5p 중에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 miR-4661-5p 및 miR-4746-5p 중에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 간암 진단용 키트를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 miR-4661-5p 및 miR-4746-5p 중에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-4661-5p 및 miR-4746-5p 중에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-4661-5p 및 miR-4746-5p 중에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 환자에서 분리된 시료로부터 miR-4661-5p 및 miR-4746-5p 중에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계; (2) 상기 측정된 miRNA의 발현수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 측정된 miRNA의 발현수준이 대조군 시료보다 높을 경우 간암으로 판단하는 단계를 포함하는 간암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

도 1은 엑소좀 정제 및 분리를 위한 모식도이다.
도 2는 본 발명에 사용된 환자 코호트 구성을 나타낸다.
도 3은 조기 간암 및 진행성 간암 특이적으로 과발현되는 miRNA를 동정한 결과를 나타낸다.
도 4는 테스트 및 검증 코호트에서의 6개 miRNA 간암 진단력을 나타낸다.
도 5는 mUICC 병기에 따른 이미지이다.
도 6(A)는 전체 코호트에서 혈청 AFP 및 2가지 조합 패널의 간암 진단의 AUC 결과를 나타낸다. 도 6(B)는 전체 코호트에서 혈청 AFP 및 2가지 조합 패널의 mUICC II 이하 조기 간암 진단의 AUC 결과를 나타낸다. 도 6(C)는 전체 코호트에서 혈청 AFP 및 2가지 조합 패널의 mUICC I 이하 조기 간암 진단의 AUC 결과를 나타낸다.

본 발명은 miR-4661-5p 및 miR-4746-5p 중에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

상세하게는, 상기 조성물은 miR-25-3p 및 miR-1269a 중에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA를 추가적으로 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 miRNA는 엑소좀 유래일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 "miR-4661-5p"는 miRBase accession no. MIMAT0019729 일 수 있고, 구체적인 서열은 서열번호 1(AACUAGCUCUGUGGAUCCUGAC)로 기재하였다.

본 발명의 "miR-4746-5p"는 miRBase accession no. MIMAT0019880 일 수 있고, 구체적인 서열은 서열번호 2(CCGGUCCCAGGAGAACCUGCAGA)로 기재하였다.

본 발명의 "miR-25-3p"는 miRBase accession no. MIMAT0000081 일 수 있고, 구체적인 서열은 서열번호 3(CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA)으로 기재하였다.

본 발명의 "miR-1269a"는 miRBase accession no. MIMAT0005923 일 수 있고, 구체적인 서열은 서열번호 4(CUGGACUGAGCCGUGCUACUGG)로 기재하였다.

본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한, 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다.

상세하게는, 상기 조성물은 miR-25-3p 및 miR-1269a 중에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상세하게는 상기 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 간암은 조기 간암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

상세하게는, (1) 단계는 miR-25-3p 및 miR-1269a 중에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

상세하게는, 상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 또는 단백질 칩을 이용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "환자에서 분리된 시료"란 환자의 간암 진단용 바이오마커인 상기 miRNA의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 바람직하게는 상기 시료는 혈액일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 시료는 혈액 유래 엑소좀일 수 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 엑소좀 분리 및 검증

(1) 간암 세포, 정상 간세포, 간 성상세포 세포 배양액에서 각각의 엑소좀을 정제/분리

초원심분리를 이용한 엑소좀의 분리: 각각의 간암 세포주 배양액을 300g에서 10분간 원심분리하여 세포 찌거기(cell debris)를 제거하고, 3000g에서 20분간 원심분리하여 세포사멸체(apoptotic body)를 제거하였다. 100,000g에서 70분간 초원심분리하여, 엑소좀 분획(fraction)을 분리하였다. 0.2 μm pore 필터를 이용하여 ultrafiltration을 통해 D-PBS 배지에 부유시킨 엑소좀을 250 μl 로 농축시켰다.

Optiprep density gradient centrifugation을 이용한 엑소좀의 정제: 상기에서 획득한 엑소좀을 더욱 정제하기 위해 sucrose gradient를 시행하였다. sucrose buffer와 60% Optiprep gradient media (Sigma-Aldrich)를 희석해, 40%, 20%, 10%, 5% 용액을 제조하고 원심분리 튜브에 차례로 layering하고, 상기에서 초원심분리로 추출한 엑소좀을 로딩하였다. 100,000g에서 18시간 초원심분리하고 40%와 20% 사이에 위치한 엑소좀을 수집하였다(도 1).

(2) 환자 혈청에서의 엑소좀 분리 및 RNA 추출

정상 및 간암 환자 혈청은 300ul를 사용하고 Exosome RNA isolation kit (SeraMir™ Exosome RNA Amplification (Cat #RA806A-1))로 추출하였다.

환자 혈청 300ul에 ExoQuick™ 72ul를 넣고 혼합(Vortex) 해준 후, 4℃에 하루 정도 보관한 후, 환자 혈청 300ul에 ExoQuick™ 넣어둔 샘플을 13,000rpm, 4℃, 2분 동안 원심분리하였다.

생성된 펠렛(Pellet)만 남기고 상층액은 모두 제거 후 PBS(1×) (Hyclone™) 100ul로 펠렛을 녹인 후 Lysis buffer 300ul 와 100% EtOH 200ul를 첨가 후 혼합(Vortex)를 10초간 진행하였다.

Spin Column과 Collection Tube를 준비하여 샘플 전량을(600ul)을 Column에 옮겨 준 후 13,000rpm, 4℃, 1분간 원심분리하여, Collection Tube에 내려온 용액을 제거 후 Wash Buffer 400ul를 넣어 주고, 13,000rpm, 4℃, 1분간 원심분리 및 Collection Tube에 내려온 용액을 제거 후 반복 작업 후 13,000rpm, 4℃, 2분간 원심분리 진행 후 최종 건조시켰다.

Elution buffer 30ul를 첨가하여 2,000rpm, 4℃, 2분간 원심분리 후, 13,000rpm, 4℃, 1분간 최종 원심분리하였다. 수득한 용액으로 Nano Drop으로 농도 측정하였다.

2. 간질환 병기별 miRNome 데이터로부터 간암 특이적 miRNA 마커 스크리닝

모든 암종은 수년 혹은 수십 년 동안 여러 유전자들의 조절 이상이 축적됨으로서 다양한 전암병변(precancerous lesion) 단계를 거처 비로소 암이 된다는 사실을 근거하여 정상간, 만성간염, 간경화, 조기간암, 간암인 총 88명의 환자에서 조직을 수집하여 시퀀싱을 진행하였다. 정상 대조군에 비하여 간염 및 간경화에서는 유의하게 발현이 차이 나지 않으나, 조기 간암 및 진행성 간암에서만 특이적으로 발현이 증가되는 유전자들을 선별하였다. 공공오믹스 데이터 중 하나인 GSE76903 데이터와 병합하여 공통 miRNA을 선별하였을 때 약 71개의 miRNA가 선별되었고, 이를 TCGA 간암 코호트와 비교하여 비간암군 대비 간암군에서의 AUC가 0.7이상으로 판명된 총 26개의 miRNA를 선별하였다.

3. 공공 오믹스 데이터를 이용하여 검증 진행한 엑소좀 microRNA 후보 선정

간암 엑소좀에서 과발현되는 microRNA의 간암 시료 발현량 및 예후와의 연관성을 TCGA data 세트에서 분석하여, 간암 시료에서 유의하게 과발현되고 예후와의 연관성을 보이는 microRNA를 선정하여 실제 간질환 환자 코호트에서 검증 진행하였다.

4. 검증용 간질환 코호트 혈액 및 임상정보 수집

아주대학교병원에서 IRB 심사를 통과 후, 인체자원은행을 통해 간질환 코호트 178명 (정상 28명, 만성 간염 27명, 간경변 33명, 간암 99명)의 혈청 및 임상정보를 분양받아 연구를 진행하였다.

5. qPCR 분석을 통하여 간질환 코호트 환자 혈청 엑소좀에서 microRNA의 발현량 측정

miRNA 발현을 측정하기 위하여 환자 혈청은 300ul 사용하였고, Exosome RNA isolation kit (SeraMir™ Exosome RNA Amplification (Cat #RA806A-1))(SBI, System Biosciences)를 사용하였다. miScript RT Ⅱ kit (Cat #218161)(QIAGEN)를 사용하여 cDNA 합성을 진행하였다.

Exosome RNA와 RNA Free Water (RFW)를 합하여 12ul에 맞추고, miScript RT Ⅱ Buffer를 8ul (5× miScript Hiflex buffer는 4ul, 10× miScript Nucleics Mix는 2ul, miScript Reverse TranScriptase Mix는 2ul) 총 20ul로 cDNA 합성을 진행하였다. 합성된 cDNA는 1/20 희석하여 사용하였다.

cDNA 조건은 아래와 같이 설정하였다.

A. Stage 1 : 37℃, 60분

B. Stage 2 : 95℃, 5분 후 10℃, -ing

Gene	Accession No.	Mature sequence	Primer sequence
hsa - miR -25-3p	MIMAT0000081	5'-CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA-3'	5'-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3'
hsa - miR -140-3p	MIMAT0004597	5'-UACCACAGGGUAGAACCACGG-3'	5'-TACCACAGGGTAGAACCACGG-3'
hsa - miR -423-3p	MIMAT0001340	5'-AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAGU-3'	5'-AGCTCGGTCTGAGGCCCCTCAGT-3'
hsa - miR -1269a	MIMAT0005923	5'-CUGGACUGAGCCGUGCUACUGG-3'	5'-CTGGACTGAGCCGTGCTACTGG-3'
hsa - miR -4661-5p	MIMAT0019729	5'-AACUAGCUCUGUGGAUCCUGAC-3'	5'-AACTAGCTCTGTGGATCCTGAC-3'
hsa - miR -4746-5p	MIMAT0019880	5'-CCGGUCCCAGGAGAACCUGCAGA-3'	5'-CCGGTCCCAGGAGAACCTGCAGA-3'
hsa - miR -1228-3p	MIMAT0005583	5'-UCACACCUGCCUCGCCCCCC-3'	5'-TCACACCTGCCTCGCCCCCC-3'

상기 표 1의 서열을 가진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 필요한 프라이머(primer)는 M.biotech (Hanam, Korea)에서 구입하여 사용하였다. qPCR MasterMix (2X, High ROX) (Gendepot, Cat #Q5602)는 5ul 사용하여 총 10ul로 qRT-PCR 진행하였다.

qRT-PCR 조건은 아래와 같이 설정하였다.

A. Stage 1 : 95℃에서 2분

B. Stage 2 : 95℃에서 15초, 58~60℃에서 34초 (miRNA별 상이), 72℃에서 30초

C. Stage 2를 40 cycle 반복

6. 엑소좀 microRNA 결과의 통계 분석

Microsoft Office Excel 프로그램을 사용하여 혈청의 상대적인 농도를 계산한 후, 통계 분석은 MedCalc statistical software 및 SPSS v22 분석 프로그램을 이용하여 분석 진행하였다.

< 실시예 1> 혈청 엑소좀 조기 간암 miRNA 마커 동정을 위한 환자 코호트 선별

총 250 환자가 본 발명에 사용되었다. 우선 간암 exo-miRNA 마커 후보를 도출하기 위하여 공공 오믹스 데이터인 GSE76903과 TCGA LIHC를 함께 사용하였고 ROC 분석을 통해 최종 후보를 선별하고자 하였다. 후보물질을 동정하기 위해서 본 발명에 사용된 코호트 1은 86명의 환자로부터 108개의 샘플을 얻어 NGS RNA-seq을 진행하였으며 15 NL, 20 CH, 10 LC, 18 eHCC (High grade dysplastic nodules and Edmoson grade TG1), 45 avHCC (Edmoson grade TG2 and TG3)으로 선별하였다. 이로부터 총 6개의 간암 드라이버 miRNA가 선정되었으며, 이를 아주대학교병원 24명의 환자 혈액 코호트로 qRT-PCR로 테스트를 시행하였다. 혈액 샘플에서는 modified UICC를 기준으로 간암 병기를 적용함. 테스트로 선별된 최종 4개의 miRNA에 대하여 144명의 검증코호트에서 qRT-PCR 시행하였다(도 2).

< 실시예 2> 조기 간암 판별 혈청 exo - miRNA 선별을 위한 통합 유전체 분석

코호트1인 108명의 샘플로 구성된 조직 시퀀싱 데이터로부터 발현 프로파일링(expression profiling)을 진행한 후, HCC 특이 gene signature를 도출하였다. 이를 ROC 분석을 통해 한번 더 추린 후 최종적으로 TCGA 생존분석을 통하여 선별하고자 하였다.

정상군에 비하여 각 간질환 병기에서 통계적으로 유의하게 과발현된 miRNA(Up-regulated DEGs : welch’s t-test p<0.05 & >=1.3 fold)를 선별하여 벤다이어그램으로 나타냈다. 간염 (CH)이나 간경화 (LC)를 제외하고 조기간암 (eHCC)와 진행성간암 (avHCC)에서 과발현된 총 140개의 miRNA를 찾아냈다.

코호트 1 Catholic LIHC와 칭화대학교 RNA-seq data (Tsinghua LIHC, GSE76903)를 통합분석하여 Tsinghua LIHC 데이터에서 간암 특이 과발현된 305 miRNA (welch’s t-test p<0.05 & >=1.5 fold)와 비교하여 공통적으로 포함되는 총 71개의 miRNA를 찾아냈다.

71개 공통적으로 과발현된 miRNA들을 3개 간암 코호트 (Catholic LIHC, Tsinghua LIHC, TCGA LIHC)에서 heatmap으로 나타냈을 때 간암에서 뚜렷이 과발현 되어있음을 확인할 수 있었다.

선별된 miRNA들이 비간암과 간암을 정확히 구분지을 수 있는지에 대한 평가로 ROC분석을 시행하고 AUC가 0.7이상인 miRNA들을 최종 선별하였다. Catholic LIHC에서 62개 miRNA, Tsinghua LIHC에서 67개 miRNA, TCGA LIHC에서는 32개 miRNA가 선별되었다. 이 중 조기간암에서 유의하게 발현되고 간암 환자의 생존과 연관된 최종 6개 miRNA를 선별하였다(도 3).

< 실시예 3> 후보 6개 exo - miRNA의 테스트 및 검증 코호트에서의 진단력 평가

6개의 후보 microRNA가 실제 환자에서 과발현되어 있는지를 확인하기 위해 정상간(n=4), 만성간염(n=4), 간경화(n=4), mUICC I/II(n=6), mUICC III/IV(n=6) 환자 혈청 엑소좀에서 Quantitative real-time PCR로 miRNA 발현 확인하였다. 비간암(NL,CH,LC)에 비해 간암환자 혈청 엑소좀에서 4개 miRNA (miR-25-3p, miR-1269a, miR-4661-5p, miR-4746-5p)의 통계적으로 유의하게 발현이 증가됨을 확인하였다(Welch’s t-test, **P<0.01, ***P<0.001).

6개의 exo-miRNA 후보 간암 진단의 AUC를 확인하였을 때, 4개 miRNA (miR-25-3p, miR-1269a, miR-4661-5p, miR-4746-5p)가 AUC 0.8 이상의 좋은 결과를 보였다. 따라서 총 4개의 microRNA에 대해 140명의 검증 코호트에서 검증을 진행하기로 하였다.

전체 140명의 코호트에서 발굴한 혈청 엑소좀 microRNA 후보들의 발현량을 검증하였다(Welch’s t-test, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).

간암 진단에 있어 혈청 엑소좀 miR-25-3p는 간암 진단의 AUC가 0.758 (95% CI: 0.679-0.827), miR-1269a는 AUC가 0.844 (95% CI: 0.773-0.900), miR-4661-5p는 AUC=0.918 (95% CI: 0.860-0.958), miR-4746-5p는 AUC=0.687(95% CI: 0.542-0.707)로 4개 혈청 엑소좀 miRNA 중 miR-4661-5p가 가장 높은 AUC를 보였다(도 4).

< 실시예 4> 엑소좀 microRNA 패널의 조기 간암 마커로서의 검증 결과

전체 코호트의 구성은 아래 표 2와 같다.

검증 코호트에서의 후보 microRNA 임상적 유의성 검증하였다. 전체 168명의 코호트에서 조기 간암 판별 여부를 판단하기 위하여 mUICC 병기를 나누어 AUC를 측정하였다(도 5).

간암 진단을 위한 혈청 AFP와 엑소좀 miRNA의 패널 조합을 통하여 기존 간암 혈청 마커인 AFP를 보완하거나 개선할 수 있는 마커의 패널을 찾기 위해 패널 조합별 AUC를 측정하였다(표 3).

	N,CHB,LC vs HCC
	AUC	95% CI
AFP	0.704	0.625-0.782
AFP+miR-25	0.790	0.723-0.857
AFP+miR-1269a	0.872	0.820-0.924
AFP+miR-4661	0.921	0.883-0.959
AFP+miR-4746	0.741	0.665-0.817
miR-25+miR-1269a	0.850	0.793-0.907
miR-25+miR-4661	0.919	0.880-0.957
miR-25+miR-4746	0.790	0.720-0.860
miR-1269a+miR-4661	0.918	0.879-0.956
miR-1269a+miR-4746	0.874	0.821-0.927
miR-4661+miR-4746	0.942	0.908-0.975

전체 간암 코호트에서의 간암 진단에 있어서는 AFP와의 조합이 가장 좋은 것은 AFP+miR-4661-5p의 AUC가 0.921로 가장 좋았으나 2가지 조합 전체에서는 miR-4661-5p+miR-4746-5p의 AUC가 0.942로 가장 좋은 것으로 나타났다.

따라서 2개의 조합에 대해 조기 간암 판별 분석을 시행하였다. 패널을 구성한 것 중에서 miR-4661-5p와 miR-4746-5p의 조합으로 ROC분석을 하였을 때, 모든 경우에서 0.9 이상의 우수한 진단력을 보이는 것으로 확인되었다(도 6).

결론적으로, 본 발명은 간암 엑소좀에서 과발현된 microRNA를 이용한 간암 진단력에 관한 것으로 소량의 혈액만으로도 상당히 우수한 민감도와 특이도를 나타내어 조기 간암의 정확한 진단이 가능한 바, 진단의 정확성, 간편성, 그리고 경제성에 효과가 있다고 할 수 있다.

본 발명은 간암 세포 엑소좀에서 과발현되는 microRNA를 발굴하고, 이를 1차로 공공 오믹스 데이터에서 검증하여 후보를 선별하였으며, 선별된 후보의 임상적 유효성을 독립적인 간질환 코호트에서 검증하여 우수한 진단적 정확도를 확인하였다.

초음파를 이용한 조기 간암의 발견율이 60-80%로 기대에 미치지 못하고, 혈청 바이오마커로 알려진 AFP 또한 조기 간암에서의 역할이 미미한 상황에서, 본 발명은 소량의 혈액을 이용하여 놀라운 간암 진단 정확도를 보이고 있어, 향후 간암 고위험군 선별 검사에 있어 본 발명이 혁신적 역할을 할 것으로 예상된다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for diagnosing liver cancer comprising an agent capable of measuring expression level of miR-4661-5p <130> ADP-2021-0407 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 aacuagcucu guggauccug ac 22 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 ccggucccag gagaaccugc aga 23 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 cauugcacuu gucucggucu ga 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 cuggacugag ccgugcuacu gg 22

Claims

miR-4661-5p의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 간암 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 miR-4746-5p, miR-25-3p 및 miR-1269a로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 간암은 조기 간암인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.