KR102315868B1

KR102315868B1 - 생체 내 이식 신경세포 추적 플랫폼

Info

Publication number: KR102315868B1
Application number: KR1020200023175A
Authority: KR
Inventors: 박장환; 이동윤; 이은혜; 김형식; 김기성; 조성래
Original assignee: 한양대학교 산학협력단; 서울대학교산학협력단; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2021-10-22
Also published as: KR20200103571A

Abstract

본 발명은 온도감응형 하이드로겔 기반 세포 전달 시스템을 통하여, 현재 난관이 되고 있는 줄기세포 치료제의 유효성 및 안전성 평가 기술을 확립하고, 국내외 연구자에게 제공함으로써 줄기세포 치료제의 상용화와 대중화에 기여할 수 있다. 임상적용이 가능한 세포 치료법 개발에는 정확한 전임상 연구가 필수적이나 현재 국내의 연구수준은 매우 미흡한 수준이며, 본 연구는 다양한 동물 모델 개발과 이를 이용한 세포 치료제 치료 효능 검증 기술 확보를 포함하고 있으므로, 난치성 신경계 질환을 대상으로 한 실용화 연구 기술 수준의 향상에 크게 기여할 수 있다. 따라서, 줄기세포의 생체 내 모니터링을 통해 임상 적용의 문제점들을 해소함으로써 실질적으로 환자에 사용될 수 있는 기술을 제공할 수 있다.

Description

생체 내 이식 신경세포 추적 플랫폼 {In vivo monitoring system for neural stem cell therapy based on neuronal differentiation specific surface antigen expression}

본 발명은 온도감응형 하이드로겔 기반의 줄기세포 치료제 및 모니터링 시스템에 관한 것이다.

배아의 중추 신경계(central nervous system, CNS)로부터 분리된 신경전구세포(Neural precursor cells, NPC)는 시험관 내에서 확장될 수 있고, 시험관 내 및 생체 내에서는 다양한 신경세포 및 성상교세포로 분화될 수 있다(비특허문헌 1 및 2). 신경전구세포에 관한 연구는 뇌 발달을 탐색하고 신경세포의 재생 가능한 원천을 개발하는데 유용하다(비특허문헌 3).

또한 줄기세포는 다양한 치료법에 적용되어 왔다. 특히 퇴행성 뇌질환의 경우, 완전히 분화된 신경세포를 이식하는 것보다 신경전구세포를 이식하는 것이 더 효과적이라는 연구 결과가 보고된 바 있다. 그러나, 줄기세포를 이용한 치료는 세포의 낮은 생존율, 줄기세포의 분화 추적의 어려움, 이식 후 낮은 세포 생착률 등을 포함한 많은 문제가 보고되고 있다(비특허문헌 4 및 5).

줄기세포 치료의 경우, 환자에게 주입된 줄기세포가 생체 내에서 제대로 기능하는지 확인할 수 없기 때문에, 이식된 줄기세포의 기능을 평가하는 것이 어렵다. 신경전구세포를 이식한 후 상기 신경전구세포의 신경세포로의 분화를 확인하기 위해서는, 이식 받은 개체를 희생시켜 얻은 조직 시료로부터 분석하여야 한다. 현재까지 이식된 신경전구세포의 분화 여부를 자기공명영상(MRI)으로 관찰하는 방법은 개발되지 않은 상태이다. 이는 분화된 신경세포를 특이적으로 추적할 수 있는 세포 표면 항원이 존재하지 않기 때문이라고 추측된다.

이에, 본 발명자들은 생체 내 이식된 줄기세포 치료제의 유효성 및 신뢰성 검증이 가능한 체외 및 체내 플랫폼을 제공하고자 한다.

Brustle et al., (1997) In vitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 14809-14814 Davis A.A. and Temple. S. (1994) A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature 372, 263-266 Park et al., (2006) Acquisition of in vitro and in vivo functionality of Nurr1-induced dopamine neurons. FASEB J 20, 2553-2555 Yamashita et al., (2006) Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci 26, 6627-6636 Arvidsson et al., (2002) Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat Med 8, 963-970

본 발명의 목적은 온도감응형 하이드로겔 기반의 줄기세포 치료제 및 모니터링 시스템을 제공하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 생체적합성 및 생리활성이 높은 온도감응형 하이드로겔의 합성 기술을 이용하여 마이크로/나노 입자 기반의 온도감응형 하이드로겔 시스템을 개발하였다. 또한, 신경줄기세포의 생착률 및 분화율 향상, 생체 내 분화 및 분포 측정을 위한 약물이 캡슐화된 마이크로/나노 입자 제작, 마이크로/나노 입자의 배합에 따른 약물 방출 속도 및 지속 시간 조절 및 경동맥 결찰 및 저산소 환경 조성을 통한 저산소 유도-허혈성 뇌손상 유발 동물 모델을 이용한 전임상 시험 및 행동기능평가를 수행하였다. 그 결과, 천연 고분자(콜라겐 및 키토산)를 합성하여 마이크로/나노 입자를 생성하면 pH에 따른 방출 시간을 조절 할 수 있음을 확인하였고, 천연 고분자 마이크로 입자에 FITC-BSA를 탑재한 후 방출 실험한 결과, pH 7.5에서는 탑재 BSA가 시간이 지나면서 방출되기 시작 하나 pH 2.0에서는 시간이 지나도 방출 되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이는 방출 시간과 pH를 천연 고분자의 합성 비율과 종류에 따라 조절할 수 있음을 의미한다.

따라서, 본 발명은 제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자로부터 형성된 온도감응형 하이드로겔; 및 생체적합성 고분자로 코팅된 나노입자를 포함하는 줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명은 제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자로부터 형성된 온도감응형 하이드로겔;

상기 하이드로겔 내 포함되는, 신경세포 분화 특이적 프로모터, Creb 5' UTR 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 신경세포로의 분화 추적용 벡터가 형질도입된 신경줄기세포; 및

분화된 신경세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 컨쥬게이션되어 있고 생체적합성 고분자로 코팅된 나노입자를 포함하는 줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물을 제공한다.

먼저, 본 발명의 줄기세포 이식 및 분화 추적용 조성물은 제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자로부터 형성된 온도감응형 하이드로겔을 포함한다.

본 발명에 있어서, 온도감응형 하이드로겔은 온도의 변화에 따라 용해도의 갑작스러운 변화를 보이는 고분자로서, 상온에서는 졸 상태로 존재하고 인체 온도 부근(즉, 30℃ 이상)에서는 겔을 형성함으로써 외과적인 수술 없이 주사 제형으로 사용이 가능한 지능형 하이드로겔을 의미한다. 본 발명에 따른 상기 하이드로겔은 제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자로부터 형성되는 것일 수 있다.

상기 제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자는 콜라겐, 키토산, 히알루론산, 폴리-L-라이신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-라이신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴 아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N-메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈) 및 폴리(4-아미노스티렌)으로 이루어진 군에서 각각 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한 구체예에서, 상기 제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자는 각각 콜라겐 및 키토산일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 온도감응형 하이드로겔은 제 1 천연 고분자와 제 2 천연 고분자가 0.5 내지 2: 0.5 내지 2의 농도비, 예컨대 0.7 내지 1.5: 0.7 내지 1:5의 농도비로 포함됨으로써 형성되는 것일 수 있다.

본 발명의 온도감응형 하이드로겔은 상기 제 1 천연 고분자와 제 2 천연 고분자를 혼합한 후, pH 조절을 위해 가교결합제를 첨가함으로써 겔화시킬 수 있다. 이때, 상기 가교결합제로는 NaOH, CaCl₂ 또는 FeCl₃를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한 구체예에서, 상기 가교결합제의 농도는 0.2 내지 0.4 N일 수 있다.

하기 실시예에서는, 상기 온도감응형 하이드로겔 내 신경줄기세포를 포함하고 이를 배양함으로써 신경세포로의 분화가 가능함을 확인하였으며, 상기 온도감응형 하이드로겔 내에서 신경줄기세포의 증식이 신경세포로의 분화 유도에 부정적인 영향을 끼지지 않음을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 온도감응형 하이드로겔을 세포전달체로서 활용할 수 있음을 입증하였다.

본 발명에 있어서, 상기 온도감응형 하이드로겔은 내부에 신경줄기세포를 포함할 수 있다. 상기 신경줄기세포는 신경세포로의 분화 추적용 벡터가 형질도입된 것이다. 상기 신경세포로의 분화 추적용 벡터는 신경세포 분화 특이적 프로모터, Creb 5' UTR 서열 및 리포터 유전자를 포함한다.

본 발명자들은 이전 연구를 통해 신경세포 분화 특이적 프로모터, Creb 5' UTR 서열 및 리포터 유전자를 포함하도록 벡터를 제작하고, 상기 제작된 벡터가 형질도입된 신경전구세포를 생체 내 이식하면 생체 내에서도 신경세포로의 분화 추적이 가능함을 확인하였다.

상기 벡터는 신경세포 분화 특이적 발현을 유도하는 프로모터 및 이와 작동 가능하게 연결된 리포터 유전자가 삽입 또는 도입될 수 있는 플라스미드, 바이러스성 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다.

상기 신경세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터는 신경세포에서 특징적으로 발현하는 마커 단백질들의 프로모터를 지칭하며, 이들 프로모터에 전사인자가 결합하여 신경세포 특이적 마커 단백질을 발현시키는 프로모터를 의미한다. 본 발명의 벡터는 신경세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터 하위에 리포터 유전자가 작동 가능하도록 연결되는 경우, 상기 리포터 유전자를 신경세포에서만 특이적으로 다량 발현시킬 수 있다. 본 발명에서, “작동 가능하게 연결(operably linked)” 된다는 것은 적절한 유전자 서열이 프로모터 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된다는 것을 의미한다.

상기 신경세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터는 시냅신(synapsin) 프로모터이다. 상기 시냅신 프로모터에 의해 리포터 유전자를 신경세포 특이적으로 발현시킬 수 있다.

상기 플라스미드의 예로는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스성 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 렌티바이러스 또는 벡시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포에 도입시키는데 적합한 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 벡터는 바이러스성 벡터일 수 있으며, 특히 렌티바이러스 벡터일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 신경세포 특이적 프로모터는 시냅신 프로모터(synapsin promoter)일 수 있다. 시냅신 프로모터는 신경세포로 분화시에만 특이적으로 발현하는 특성을 가지고 있으며, SEQ ID NO: 1의 염기서열로 표현되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 신경세포로의 분화 추적용 벡터에서, 상기 리포터 유전자는 유전자가 전사되어 번역된 단백질을 in vivo 또는 in vitro에서 확인할 수 있는 어떠한 리포터 유전자도 될 수 있다.

상기 벡터에 도입되는 리포터 유전자는 세포 표면 발현 형광 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 형광 단백질을 코딩하는 유전자는 적색 형광 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 형광 단백질을 코딩하는 리포터 유전자의 경우 발현된 단백질의 유무를 별도의 과정을 거치지 않고 확인할 수 있으므로 신경세포로의 분화를 추적하기 위한 시스템에 바람직하다. 상기 형광 단백질로는 mCherry, tdTomato, J-Red, DsRed, mRuby, mStrawberry, mPlum, GFP 및 YFP로 이루어진 군에서 세포 표면에 발현되도록 돌연변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질의 유전자를 리포터 유전자로서 이용하는 경우, 면역염색 또는 공촛점 현미경 등을 이용하는 방법을 사용하여 신경줄기세포에서 신경세포로의 분화를 세포를 사멸시키지 않고도 (또는 비침습적으로) 쉽게 추적 가능하다.

한 구체예에서, 상기 리포터 유전자는 분화된 세포막의 표면에 발현되는 형광 단백질 코딩 유전자일 수 있으며, 구체적으로 mCherry를 코딩하는 유전자인 CherryPicker 유전자일 수 있다. CherryPicker 유전자는 형광 단백질인 mCherry와 트랜스페린 수용체 막 앵커 도메인으로 구성된 융합 단백질이다. 상기 mCherry 단백질은 세포 표면에서 발현되기 때문에, 분화된 신경세포의 표면에 발현 가능하므로 생체 내 도입 시 자기공명영상을 통한 신경세포로의 분화 추적에 사용될 수 있다.

상기 벡터는 상기 시냅신 프로모터와 형광 단백질을 코딩하는 리포터 유전자 사이에 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 표현되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 표현되는 폴리뉴클레오타이드는 마우스의 Creb 5' UTR을 코딩하는 염기서열 중 일부 서열이며, 본 발명의 상기 벡터에서 시냅신 프로모터와 상기 리포터 유전자 사이에 개재되어 시냅신 프로모터의 조직 특이성을 높게 유지시키며 리포터 유전자 발현의 인핸서(enhancer)로서 작용할 수 있다.

본 발명에서 “신경줄기세포(NSC, Neural stem cell)”는 증식을 계속하는 능력, 즉 자기복제능력(self-replication)을 가지고 있으며, 중추 신경계를 구성하는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 등의 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명에서 상기 리포터 유전자를 발현시키는 벡터를 형질도입하는 세포로서 신경줄기세포가 포함되어 있다. 상기 신경줄기세포는 초대 배양(primary cultured) 신경줄기세포 또는 이의 유전적으로 변형된 불사멸화된(immortalized) 신경줄기세포일 수 있다. 신경줄기세포는 “신경전구세포(neural progenitor cell 또는 neural precursor cell)”와 서로 혼용되어 사용될 수 있으며, 경우에 따라서는 신경줄기세포로부터 유래된 세포를 신경전구세포라고 지칭할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터를 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 형질도입시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 적용할 수 있다. 예컨대 상기 벡터의 세포 내 도입은 리포펙타민(Lipofectamine), 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀과 같은 형질도입용 시약을 이용하거나, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection) 또는 바이러스 감염에 의한 방법으로 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 벡터의 도입은 바이러스 감염에 의한 것일 수 있다.

상기 벡터가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 세포 치료를 필요로 하는 환자에 이식한 후, 이식된 신경줄기세포 또는 신경전구세포가 신경세포로의 분화가 어느 정도 진행되었는지 확인하는 것에 이용될 수 있다.

상기 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 신경계 질환 환자의 뇌실에 직접 투여 또는 이식할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 생착율을 증진시키기 위해 다양한 봉매제(embedding materials), 예컨대 소듐 알지네이트(sodium alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 또는 콜라겐을 세포와 복합체로 형성시켜 이를 이용할 수도 있다. 이후 MRI를 촬영하여 이식된 세포의 분화 진행 여부 및 정도를 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 포유동물에서 유래된 것일 수 있다. 상기 포유동물로는 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 소, 염소, 돼지, 마우스 또는 랫트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 신경줄기세포 또는 신경전구세포가 포유동물에서 유래된 경우, 상기 세포는 대뇌 또는 뇌의 피질을 포함한 뇌 조직의 모든 부위에서 유래한 모든 종류의 신경줄기세포 또는 신경전구세포일 수 있다. 또한, 상기 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 배아 및 성체를 포함하는 모든 발생단계에서 유래한 것일 수 있으나, 다량의 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 획득하기 위해 신경 발생이 가장 왕성한 시기의 발생 중인 배아에서 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 벡터는 인비트로(in vitro) 세포 배양 실험 또는 세포 치료(cell therapy)와 같은 임상 등 다양한 신경세포에서의 유전자 연구에 유용하게 이용될 수 있다.

다음으로, 본 발명의 줄기세포 이식 및 분화 추적용 조성물은 상기 분화된 신경세포의 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 컨쥬게이션되어 있고 생체적합성 고분자로 코팅된 나노입자를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 분화된 신경세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 면역글로불린G(IgG) 또는 면역글로불린M(IgM)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 생체적합성 고분자는 글리콜 키토산, 폴리-L-리신, 폴리(4-비닐 피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘 N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-리신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N-메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모 늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈), 키토산, 또는 폴리(4-아미노스티렌)으로부터 선택된다. 바람직하게는 글리콜 키토산을 생체적합성 고분자로 이용할 수 있다.

상기 글리콜 키토산은 생체친화적이고 생분해성을 갖는 물질로서, 조직 공학이나 약물 전달 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 그러나 고분자량 글리콜 키토산의 경우 가지고 있는 양성 전하에 의한 독성의 문제 때문에 의약 제제로 사용되는데 어려움이 있었다.

본 명세서에 사용된 용어, "나노입자(nanoparticle)"는 나노미터(㎚)의 크기를 갖는 구조 또는 물질을 의미한다. 나노미터 크기란 마이크론 미터(10^-6) 크기를 1,000 분의 1로 축소한 것으로, 물질의 크기가 나노미터 수준으로 작아지면 다양하고 특이한 물리적, 화학적, 기계적 및 전자적 특성을 나타내게 된다.

본 발명에서, 상기 나노입자는 일반적으로 평균 크기가 약 1 ㎚ 내지 약 500 ㎚, 예를 들면, 약 1 ㎚ 내지 약 50 ㎚, 약 50 ㎚ 내지 약 100 ㎚, 약 100 ㎚ 내지 약 250 ㎚, 약 250 ㎚ 내지 약 500 ㎚ 범위일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 1 내지 100 ㎚, 바람직하게는 1 내지 50 ㎚, 더욱 바람직하게는 1 내지 20 ㎚ 크기로 제조될 수 있다. 나노입자의 크기가 500 nm 이상인 경우에는 침강 속도가 빨라져 사용상 불편함을 초래하여 침강 방지를 위해 글루코스, 슈크로스, 클리세롤, 폴리에틸렌아민, 비테인 등과 같은 분산제를 사용하여야 한다.

본 발명에서, 상기 나노입자는 유기 또는 무기 나노입자일 수 있으며, 바람직하게는 자성 나노입자(magnetic nanoparticle)일 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "자성"은 물질이 나타내는 자기적인 성질을 의미한다. 모든 물질은 자기장(magnetic field)과 상호작용하여 인력(attractive force) 또는 척력(repulsive force)이 발생한다. 즉, 물질에 자기장을 가하면 자화(magnetization)되고, 상기 물체가 자화되는 양상에 따라 강자성체 (ferromagnetic substance), 상자성체(paramagnetic substance), 반자성체(diamagnetic substance), 페리자성체(ferrimagnetc substance) 등으로 구분된다.

본 명세서에 사용된, 용어 "자성 나노입자"는 자성을 띄는 나노미터 크기의 구조 또는 물질을 의미한다. 상기 자성 나노입자는 용액 합성, 공동 침전, 졸-겔 방법, 고 에너지 분쇄, 수열 합성, 마이크로에멀젼 합성, 열분해에 의한 합성 또는 음파 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 자성 나노입자는 철(Fe), 코발트(Co), 니켈(Ni), 망간(Mn), 가돌리늄(Gd), 이들의 산화물 또는 이들의 합금(alloy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 자성 나노입자는 철 또는 산화철로 이루어진 자성 나노입자이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생체적합성 고분자는 나노입자와 결합할 수 있는 기능기를 포함하며, 기능기는 아민기, 카복실기, 티올기, 또는 하이드록사이드기일 수 있고, 바람직하게는 하이드록사이드기일 수 있다. 따라서, 자성 나노입자 제조시 사용되는 열 분해 방법(thermal decomposition technique)을 나노입자 코팅에 이용할 수 있다. 구체적으로 산화철 나노입자와 글리콜 키토산 컨쥬게이트를 고온에서 반응시킴으로써 글리콜 키토산의 다당체에 존재하는 -OH 작용기에 의하여 상기 컨쥬게이트를 산화철 나노입자 표면에 랩핑(wrapping)시킬 수 있다. 이 방법은 다량의 -OH 작용기에 의하여 컨쥬게이트가 안정적으로 나노입자 표면에 코팅되는 장점이 있으나, 지나치게 오랜 시간 동안 고온에서 반응시킬 경우 다당체 자체가 분해되는 단점이 생길 수 있다.

또한, 본 발명은 제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자로부터 형성된 온도감응형 하이드로겔;

분화된 신경세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 컨쥬게이션되어 있고 생체적합성 고분자로 코팅된 나노입자를 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

앞서 기술한 바와 같이, 상기 온도감응형 하이드로겔, 상기 신경세포로의 분화 추적용 벡터가 형질도입된 신경줄기세포 및 상기 나노입자를 포함하는 시스템으로부터, 생체 내 신경줄기세포를 이식했을 때 분화된 신경세포의 생존과 분포를 관찰하면서 행동학적인 개선 효과가 나타나는 경우, 상기 신경줄기세포를 통한 신경계 질환의 치료 효과가 나타났음을 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 신경계 질환은 뇌졸중, 파킨슨씨 질환, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 ㎎/㎏(체중)이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명은 온도감응형 하이드로겔 기반 세포 전달 시스템을 통하여, 현재 난관이 되고 있는 줄기 세포 치료제의 유효성 및 안전성 평가 기술을 확립하고자 한다. 임상적용이 가능한 세포치료법 개발에는 정확한 전임상 연구가 필수적이나 현재 국내의 연구수준은 매우 미흡한 수준이며, 본 연구는 다양한 동물 모델 개발과 이를 이용한 세포치료제 치료효능 검증 기술 확보를 포함하고 있으므로, 난치성 신경계 질환을 대상으로 한 실용화 연구 기술수준의 향상에 크게 기여할 수 있다. 따라서, 줄기세포의 생체 내 모니터링을 통해 임상적용의 문제점들을 해소함으로써 실질적으로 환자에 사용될 수 있는 기술을 제공할 수 있다.

도 1은 천연 고분자(콜라겐 및 키토산)를 합성한 하이드로겔을 이용하여 마이크로입자를 생성하면 pH에 따른 방출 시간을 조절할 수 있음을 보여준다.
도 2a 내지 2e는 캡슐링시 천연 고분자(콜라겐 및 키토산) 및 NaOH의 적합한 NaOH 농도를 나타낸 것이다(도 2a: 0.1 N, mixture pH: 5.5; 도 2b: 0.2 N, mixture pH: 약 6.6; 도 2c: 0.3 N, mixture pH: 8.4~8.4(최적); 도 2d: 0.4 N, mixture pH: 9.6~10; 도 2e: 0.5 N, mixture pH: 12~14 이상).
도 3은 계층 구조를 이용하여 콜라겐/키토산 하이드로젤에 신경줄기세포가 둘러싸인 입자를 제조하기 위한 미세유체칩을 도식화한 것이다.
도 4는 콜라겐/키토산 하이드로젤에 신경줄기세포가 둘러싸인 입자의 합성 과정을 도식화한 것이다.
도 5는 합성된 콜라겐/키토산 하이드로젤 입자를 나타낸 것으로, (A)는 실온의 미네랄 오일을 이용하여 제조한 입자이며, (B)는 37℃로 가온한 미네랄 오일을 이용하여 제조한 입자이다(배율 200x).
도 6은 유량별 입자의 직경 크기를 나타낸 것으로, (A)는 1배 유량, (B)는 1.5배 유량, (C)는 2배 유량이다(scale bar 25㎛), 배율 200x).
도 7은 NaOH의 농도를 미세조절하여 캡슐링 최적화 조건을 확립한 결과이다.
도 8은 온도감응형 하이드로겔 내에서 신경줄기세포가 신경세포로 분화가 진행됨을 나타낸 것이다.
도 9는 α-RFP-SPIO 제조 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 10은 제타 포텐셜(Zeta-potential)을 측정하여 α-RFP 항체와 SPIO의 결합 여부를 검증한 것이다.
도 11은 UV-visible light 측정을 통한 α-RFP 항체와 SPIO의 결합 여부를 검증한 것이다.
도 12는 iron assay를 통한 α-RFP 항체와 SPIO의 결합 여부를 검증한 것이다.
도 13은 α-RFP-SPIO에 결합된 α-RFP 항체 농도를 측정한 것이다.
도 14는 GC-SPIO 및 α-RFP-SPIO의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 15는 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 SPIO를 나타낸 것이다.
도 16은 캡슐링한 세포 이식 후 체내 분포 및 생착을 확인한 결과이다.
도 17은 저산소 유발-허혈성 뇌손상으로 유도한 뇌졸중 동물모델을 구축한 후, 최적의 이식 시기 규명을 위한 시기별 뇌손상 MRI 영상을 촬영한 결과이다.
도 18은 신경세포 분화 시 세포표면 항원을 발현하는 줄기세포에 α-RFP-SPIO를 혼합하고 콜라겐/키토산으로 캡슐링하여 뇌졸중 마우스에 이식 4후에 촬영한 MRI 영상이다.
도 19는 마우스 신경줄기세포에 CherryPicker 형광 단백질 시스템을 도입시킨 후 캡슐링하여 마우스 뇌졸중 모델에 이식하였을 때의 이식 부위에서의 분화를 관찰한 것이다.
도 20은 본 발명의 전반적인 기술 요약을 나타내는 도면이다.

이하, 본 출원을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 출원을 예시하는 것일 뿐 본 출원의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

[실시예 1] 콜라겐 및 키토산을 이용한 세포 캡슐링 최적화 조건 확립

1) 신경세포에 대해 무독성을 갖는 하이드로겔 물질 선정

신경줄기세포 및 분화된 신경세포에 대해 독성이 없는 물질로 콜라겐과 키토산을 선정하였다. 콜라겐과 키토산으로 합성한 하이드로겔을 이용하여 마이크로입자를 생성한 후, pH에 따른 방출 정도를 확인하였다(도 1). 도 1에서는, 콜라겐만으로 구성된 입자(Collagen), 콜라겐과 키토산을 혼합하여 제조한 입자(Collagen-Chitosan) 및 콜라겐 입자에 키토산을 코팅한 입자(Collagen-Chitosan Multi)에서의 pH에 따른 방출 정도를 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 마이크로입자는 pH에 따라 방출 시간을 조절할 수 있음을 확인하였다.

2) 콜라겐/키토산 하이드로겔 시스템을 이용한 세포 캡슐화(encapsulation)

2-1) 세포 독성 확인

콜라겐과 키토산의 겔화는 각 성분의 농도 및 pH에 의해 조절된다. 즉, 콜라겐 및 키토산으로 합성한 하이드로겔을 이용한 입자는 종래의 히알루론산과 달리 세포 생존에 적합한 pH 환경을 맞추는 일이 필수적이다. 콜라겐과 키토산은 pH가 낮은 상태의 용액으로 존재하며, NaOH 첨가시 pH가 올라가면서 겔화가 급속도로 진행된다. 또한, 캡슐화에 사용할 NaOH의 농도는 세포에 손상을 주지 않도록 최종적으로 NaOH를 혼합하였을 때 pH가 중성에 가까워져야 한다. 또한, 겔로 굳히는 역할을 하는 NaOH의 농도에 의해서 겔화되는 속도를 조절할 수 있다. 이에, 콜라겐 및 키토산이 혼합된 혼합물의 pH 조절을 위한 물질인 NaOH의 세포독성을 나타내지 않는 농도를 선정하기 위해 다양한 농도 및 pH 조건에서 겔화에 최적화된 조건을 확립하였다(도 2a 내지 도 2e).

구체적으로, 신경줄기세포에 다양한 농도로 NaOH를 처리하여 분화시킨 후 트리판 블루(trypan blue) 염색을 통해 NaOH를 처리한 후의 생존한 신경세포를 계수하여 생존률 85% 이상을 무독성으로 판단하였다(도 2a 내지 도 2e).

그 결과, 0.3N 전후가 사용하기에 가장 적절한 NaOH의 농도로 관찰되었고, NaOH이 600 내지 700㎍의 범위(total 540㎕ volume Scale, 세포수 5.4x10⁶개 기준)인 경우, 신경세포의 생존에 영향이 없는 것을 확인하였으며, 총 540 ㎕ volume 기준, 세포수 5X10⁷ 개 상태에서 콜라겐과 키토산의 최적의 혼합 비율을 [키토산 : 콜라겐 : N2 배지 : NaOH = 150 ㎕ : 150 ㎕ : 180 ㎕ : 54 ㎕]인 것으로 결정하였다. 이때 N2 배지는 DMEM/F12(Invitrogen, Carlsbad, CA), 4.4μM 인슐린, 100mg/L 트렌스페린(transferrin), 30nM 셀레나이트(selenite), 0.6μM 푸트레신(putrescine), 20nM 프로게스테론(progesterone), 200mM L-글루타민, 8.6mM D(+) 글루코오스, 20mM NaHCO₃(Invitrogen)가 포함된 배지를 의미한다.

또한, 낮은 온도에서 키토산, 콜라겐, 세포배양 배지를 먼저 섞은 뒤, NaOH, 세포 순으로 섞는 순서로 수행하는 것이 가장 세포에 손상을 주지 않으면서 천천히 굳힐 수 있다는 사실을 관찰하였으며, 순서를 변경하여 세포를 먼저 섞으면 낮은 pH에 의해 많은 수의 세포가 죽는 것을 확인하였다(데이터에 나타내지 않음).

2-2) 콜라겐 및 키토산으로 합성된 하이드로겔 입자의 합성

콜라겐 및 키토산으로 합성된 하이드로겔 입자의 합성을 위하여 기존에 알려진 방법을 응용하였다. 구체적으로, 계층 구조를 이용한 콜라겐 및 키토산으로 합성된 하이드로겔 입자의 합성을 위한 미세유체칩을 설계하였으며, 사출성형으로 미세유체칩을 제조하였다(도 3, 및 4).

콜라겐과 키토산이 혼합된 콜라겐/키토산 혼합물이 미세유체칩을 통과하기 전에 겔화되는 현상을 방지하기 위해서, NaOH 농도를 636 ㎍으로 낮춰 겔화 시간을 늦췄으며, 대신 미세유체칩을 통과한 후 빠른 겔화를 위해 37℃로 가온한 미네랄 오일을 이용하여 입자를 수집하였다(도 5).

입자의 합성은 하기의 방법으로 제조하였다:

□ 콜라겐/키토산 하이드로겔 내 줄기세포 캡슐화 프로토콜

1. 시약 준비

- 콜라겐(Collagen): 8.91 mg/mL (0.02 N 아세트산 내) [Corning, 354249]

- 키토산(Chitosan): 30 mg/mL (0.35 N 아세트산 내) [TCI, C0831]

- NaOH: 1 N (N₂ 배지 내)

- N₂ 배지 + 신경줄기세포(고정)

- Mineral Oil / 2% Span80

2. 비드(Beads) 제조

(1) 혼합(Mixing)

- 부피 및 비율(Volume & Ratio)

총 혼합물: 600 ㎕(콜라겐:키토산=5 mg/ml:5 mg/ml)

NaOH (1N)	8.91mg/ml Collagen (0.02N AA)	30mg/ml Chitosan (0.35N AA)	DMEM _(10X)	DMEM _(1X)	PBS (1X)	D.W	pH (strip)
35㎕	337㎕	100㎕	30㎕	30㎕	30㎕	38㎕	7.4

① Collagen - Chitosan	Stirring / 30~50sec
② DMEM - PBS - NaOH - DW

(2) Inlet1

30mL/Hr

Mineral Oil / 50uM Span80

(3) Inlet2

- 2mL/Hr

*25㎛ 기공 크기의 스텐실 사용

3. 겔링화

- 콜라겐/키토산 캡슐(Collagen/Chitosan Capsule)을 받는 용기의 온도를 핫플레이트를 이용하여 40℃로 맞췄다.

- 수집한 비드를 37℃의 인큐베이터에서 30분간 배양하였다.

4. Oil 제거

① 원심분리(Centrifuge)

a. 생성된 비드를 E-tube에 옮긴 후 원심분리하였다(100G, 10초).

b. 원심분리 후 여액을 제거한 후 오일 패드를 이용하여 펠렛에 남아 있는 나머지 오일을 제거하였다.

c. 펠렛을 배지에 재분산하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 실온 상태의 미네랄 오일을 사용한 경우(도 5에서 A), 입자간 결합으로 인해 평균 직경 크기가 점점 커지는 경향을 보였으나, 37℃를 유지시킨 미네랄 오일을 사용한 결과(도 5에서 B), 겔화가 빠르게 진행되어 보다 안정적인 직경 크기의 콜라겐-키토산 입자를 얻을 수 있었다. 즉, 본 발명은 인체의 온도 부근에서 겔을 형성하는, 콜라겐과 키토산으로 합성된 온도감응형 하이드로겔을 이용한 입자를 제공할 수 있다.

또한, 미세유체칩을 이용한 콜라겐/키토산으로 캡슐화된 세포 입자 제조시, 제조 시간이 5분에 가까워지면 콜라겐/키토산이 겔화되어 미세유체칩을 막는 현상이 발생하였다. 이 문제를 해결하기 위해서 유량별 입자의 직경 크기를 확인한 결과, 유량이 많아질수록 콜라겐/키토산 하이드로겔 입자가 미세유체칩을 막는 현상이 줄어듦을 확인함으로써, 미세유체칩에 하이드로겔과 미네랄 오일의 주입 속도를 증가시켜 막힘 현상을 최소화할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 6).

또한, 콜라겐-키토산 하이드로겔로 캡슐화(encapsulation)한 세포를 형광현미경을 통해 관찰한 결과(도 7), 세포가 하이드로겔 내부에 함입되어 있음을 관찰할 수 있었다. 또한, 도 7을 통해 본 발명에서 확립한 NaOH의 미세 조절(NaOH 0.257~0.263N)을 통한 단일세포 수준에 가깝게 캡슐링하는 적절한 조건을 나타내었다.

3) 콜라겐과 키토산을 이용한 세포표면항원 발현 신경줄기세포의 캡슐링

히알루론산을 대체하여 세포 내 독성이 없는 것이 확인된 온도감응형 하이드로겔 성분인 콜라겐과 키토산을 단일세포 캡슐링 기술에 도입하였다. 세포 캡슐링은 단일세포 단위로 세포를 둘러싸야 하고 세포들 전체를 둘러싸는 온도감응형 하이드로겔보다 단단한 점도로 굳어야 하기 때문에, 기존에 사용하던 콜라겐과 키토산의 농도를 높였다. 콜라겐과 키토산은 pH에 매우 민감하게 반응하므로 다양한 조건으로 실험을 수행하여 최적의 조건을 구축하였다.

대한민국 특허 10-2019-0003253에 기술된 내용으로, 신경줄기세포에 Synapsin1 프로모터에 의해 CherryPicker 형광 단백질이 발현되는 렌티바이러스를 도입시킨 후, 상기 신경줄기세포를 콜라겐과 키토산에 혼합하여 세포 캡슐링을 진행한 후 형광 현미경으로 관찰하였다(도 8).

4) 신경줄기세포가 신경세포로 분화할 때 미치는 온도감응형 하이드로겔의 효과 확인

온도감응형 하이드로겔이 신경세포 분화에 방해가 되는지 확인하기 위하여 세포표면에 CherryPicker 형광 단백질이 발현되는 신경줄기세포를 온도감응형 하이드로겔로 굳힌 뒤 5일 동안 200μM의 아스코르브산(AA, Sigma, St Louis, MO)이 포함된 무혈청 N2 배지 내에서 분화를 유도하였다. 5% CO₂ 배양기에서 37℃ 배양을 유지하고, 이틀에 한번씩 배지를 갈아주었다.

그 결과(도 8), 신경줄기세포가 하이드로겔 안에서 신경세포로 분화하여 세포질이 나뭇가지처럼 뻗는 모양을 관찰할 수 있었고, 신경세포 표지인자인 neuron-specific Class III β-tubulin (TUJ1)이 하이드로겔에 전체적으로 분포하여 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 세포 이식시 온도감응형 하이드로겔을 사용하여도 이식된 세포가 성숙한 신경세포로 분화하는 데에는 전혀 방해가 되지 않는다는 것을 알 수 있다.

[실시예 2] 세포표면 항원 결합 α-RFP-SPIO 융합체 기반 분화세포 추적 기술 개발

1) α-RFP-SPIO 융합체 제조

Superparamagnetic iron oxide (SPIO)는 MRI 추적이 가능한 나노조영제로서, 동물 뇌에 이식할 세포와 세포표면 특이 항원에 결합하는 SPIO를 결합시켜 이식 후 MRI로 추적 관찰할 수 있는 시스템을 구축하였다.

1-1) α-RFP-Glycol Chitosan-SPIO (α-RFP-SPIO) 제조

α-RFP 항체를 SPIO에 결합시키기 위한 전 단계로서, SPIO에 글리콜 키토산(glycol chitosan)을 결합시켜 GC-SPIO를 제조하였다. 글리콜 키토산 이 코팅된 GC-SPIO에 항체를 컨쥬게이션(conjugation) 시키기 위하여 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)를 링커로 사용하였다. 글루타르알데하이드의 말단 부위(terminal part)의 알데하이드기와 항체의 라이신(lysine)에 존재하는 아민기간의 EDC(1-ethyl-3-(4-dimethylaminopropyl)/NHS(N-hydroxysuccinimide) 반응을 이용하여 이를 컨쥬게이션시켜 α-RFP-SPIO를 제조하였다(도 9).

1-2) α-RFP-SPIO 특성 분석

[제타 포텐셜 값 측정]

글리콜 키토산(GC)이 코팅된 SPIO에서의 제타 포텐셜(Zeta-potential) 값을 측정한 결과(도 10), GC-SPIO의 제타 포텐셜 값이 약 40 내지 60mv인 결과를 얻을 수 있었으며, 항체를 컨쥬게이션시킨 항체-GC-SPIO 경우 (-) 전하로 제타 포텐셜 값의 변화를 관찰할 수 있었다. 제타 크기(Zeta size)의 경우 나노입자에 리간드(ligand) 혹은 항체를 컨쥬게이션시키게 되면 유체역학적 직경(hydrodynamic size)이 감소하는 특징을 가지고 있어, 이와 같은 결과를 통해 정상적으로 α-RFP 항체가 GC-SPIO에 앵커링(anchoring)되었음을 알 수 있었다.

[자외 및 가시선 분광분석법(UV-visible light spectrophotometer)]

UV-visible light 실험의 경우, SPIO에 대한 정확한 흡광 피크(absorbance peak)에 대한 레퍼런스가 없어, 항체를 붙였을 때와 붙이지 않았을 때의 물질 각각을 측정한 결과 항체가 컨쥬게이션되었을 때 피크 시프팅(peak shifting)이 일어났으며, 이와 같은 변화를 통해 α-RFP 항체가 GC-SPIO에 결합했음을 유추하였다(도 11).

[미량철 측정(Iron assay)]

미량철 측정 키트(Iron assay kit)를 이용하여 표준 곡선(standard curve)을 만들었을 때, R 제곱 값이 0.9944로 높은 상관관계(correlation)를 보였다. 각 well에 GC-SPIO와 α-RFP-GC-SPIO를 10 ㎕씩 넣어주고 흡광도 값을 측정하여 결과를 도출했을 때 각각 0.59 mM, 0.17 mM의 농도로 나와 이 값에 철 이온 MW (55.845 ㎍/mol)을 곱하여 9.5 ㎍/㎖ 단위의 α-RFP-GC-SPIO 농도를 구하였다(도 12).

RFP 항체를 이용하여 0 ~ 2 (mg/㎖)의 농도로 표준 곡선 형성 시 R 제곱 값이 0.9938로 높은 상관관계를 얻었다. α-RFP-GS-SPIO 샘플 (2 mg/㎖)을 N=5로 넣어주고 562 nm 파장에서 soft max pro 5X를 통해 측정하였다. BCA(Bicinchorinic acid) 분석법 특성상 버퍼를 넣었을 때의 색깔 변화를 통해 단백질의 양을 측정하는 것인데, SPIO 자체가 짙은 보라색이기 때문에 상수(blank) 값으로 간주하여 SPIO를 562 nm에서 측정하여 얻은 값을 상수로 두고 각 샘플의 측정값에서 상수로 빼주었다. 그 결과(도 13), 2000 ㎍/㎖의 α-RFP-GC-SPIO에 약 630 ㎍/㎖의 α-RFP 항체가 붙어 있음을 알 수 있었다.

[전자현미경 관찰]

전자현미경을 통하여 GC-SPIO 및 α-RFP-SPIO의 나노 입자 형태를 관찰한 결과(도 14), 두 가지 모두 적절한 크기로 나노입자를 형성하고 있음을 검증하였다.

2) α-RFP-SPIO의 세포 표면 항원 결합 특이성 분석

합성한 α-RFP-SPIO가 RFP 항원에만 특이적으로 잘 결합하는지 확인하기 위하여 세포 표면에 CherryPicker 형광 단백질이 발현되는 신경줄기세포와 합성한 α-RFP-SPIO를 혼합하여 프러시안 블루(Prussian blue) 염색법으로 확인하였다. 그 결과(도 15), Cherrypicker 형광 단백질이 발현되는 신경줄기세포에만 α-RFP-SPIO가 특이적으로 결합하여 푸른색을 띄는 것을 관찰할 수 있었다. 뿐만 아니라 면역염색법으로 SPIO의 RFP 항체에 결합하는 2차 항체 (Alexa 488)를 반응 시에도 형광이 잘 발현되며 이는 Cherrypicker 발현과 일치하는 것을 확인하였다(도 15).

3) 캡슐링 세포를 동물에 이식하여 안정성 및 기능 확인

캡슐링한 신경줄기세포를 동물 뇌에 이식하였을 때, 생체 내에서 신경줄기세포가 생존하여 분화할 수 있는지 확인하였다. CherryPicker 형광 단백질이 발현되는 신경줄기세포를 α-RFP-SPIO와 결합시킨 후 단일세포 캡슐링을 수행하고, 다음 날 래트 뇌에 이식하여 수술 3일 뒤 이식된 세포를 조직염색법으로 관찰하였다. 그 결과(도 16), 이식된 부위에 CherryPicker 형광 단백질이 발현되는 세포들이 모여 있는 것을 확인하였고, 신경세포 표지인자인 TUJ1 단백질도 발현, 이식한 세포들이 신경세포로 분화된 것을 알 수 있었다.

[실시예 3] 뇌졸중 모델에서의 효과 확인

저산소유발-허혈성 뇌손상(hypoxic-ischemic brain injury)을 통한 뇌졸중 동물모델을 구축하였으며, 최적의 이식 시기 규명을 위한 시기별 뇌손상 MRI 영상을 촬영하였다(도 17).

α-RFP-SPIO와 하이드로젤로 캡슐링한 마우스 신경줄기세포를 뇌졸중 동물 모델의 급성 시기에 이식 4주 후 이식된 세포를 MRI를 통해 관찰하였다(도 18). 그 결과, SPIO-RFP tagging mNPCs 그룹에서만 이식된 세포와 세포표면 특이 항원(RFP)에 결합하는 SPIO를 MRI로 추적 관찰할 수 있었다.

또한, 뇌에 캡슐링되지 않은(non-capsuling) mNPCs (RFP tagging mNPCs)와 SPIO 및 하이드로겔 캡슐링 mNPCs 이식 4주 후, 조직학적 검사를 통해 세포의 생존 여부 및 분화 여부를 관찰한 결과(도 19), 이식된 세포가 신경세포 표지자인 βIII-튜불린과 성상교세포 표지자인 GFAP와 함께 염색이 되는 것을 관찰할 수 있었다.

<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY <120> In vivo monitoring system for neural stem cell therapy based on neuronal differentiation specific surface antigen expression <130> P20U10C0814 <150> KR 10-2019-0021691 <151> 2019-02-25 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synapsin promoter_pSYN <400> 1 ctagactgca gagggccctg cgtatgagtg caagtgggtt ttaggaccag gatgaggcgg 60 ggtgggggtg cctacctgac gaccgacccc gacccactgg acaagcaccc aacccccatt 120 ccccaaattg cgcatcccct atcagagagg gggaggggaa acaggatgcg gcgaggcgcg 180 tgcgcactgc cagcttcagc accgcggaca gtgccttcgc ccccgcctgg cggcgcgcgc 240 caccgccgcc tcagcactga aggcgcgctg acgtcactcg ccggtccccc gcaaactccc 300 cttcccggcc accttggtcg cgtccgcgcc gccgccggcc cagccggacc gcaccacgcg 360 aggcgcgaga taggggggca cgggcgcgac catctgcgct gcggcgccgg cgactcagcg 420 ctgcctcagt ctgcggtggg cagcggagga gtcgtgtcgt gcctgagagc gcagtcggga 480 480 <210> 2 <211> 147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Creb 5' UTR <400> 2 cggctgggag aagccgagtg ttggtgagtg acgcggcgga ggtgtagttt gacgcggtgt 60 gttacgtggg ggagagaata aaactccagc gagatccggg ccgcgaacga aagcagtgac 120 ggaggagctt gtaccaccgg tgactag 147

Claims

제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자로부터 형성된 온도감응형 하이드로겔;
상기 하이드로겔 내 포함되는, 신경세포 분화 특이적 프로모터, Creb 5' UTR 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 신경세포로의 분화 추적용 벡터가 형질도입된 신경줄기세포; 및
상기 신경세포로의 분화 추적용 벡터에 의해 발현되는, 이식된 신경줄기세포로부터 분화된 신경세포의 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 컨쥬게이션되어 있고 생체적합성 고분자로 코팅된 나노입자를 포함하는 신경줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물.
제1항에 있어서,
제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자는 콜라겐, 키토산, 히알루론산(hyaluronic acid), 폴리-L-라이신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-라이신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴 아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N_메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈) 및 폴리(4-아미노스티렌)으로 이루어진 군에서 각각 선택된 것인 신경줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물.
제1항에 있어서,
생체적합성 고분자는 콜라겐, 키토산, 폴리-L-라이신, 폴리(4-비닐피리딘/디비닐벤젠), 키틴, 폴리(부타디엔/아크릴로니트릴) 아민 말단, 폴리에틸렌이민, 폴리아닐린, 폴리(에틸렌글리콜)비스(2-아미노에틸), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리(비닐아민)하이드로클로라이드, 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(2-비닐피리딘N-옥사이드), 폴리-ε-Cbz-L-라이신, 폴리(2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(알릴 아민), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(N_메틸비닐아민), 폴리(디알릴디메틸암모늄클로라이드), 폴리(N-비닐피롤리돈) 및 폴리(4-아미노스티렌)으로 이루어진 군에서 각각 선택된 것인 신경줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물.
제1항에 있어서,
온도감응형 하이드로겔은 상온에서 졸 상태이며, 30℃ 이상에서는 겔화되는 것인 신경줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물.
제1항에 있어서,
온도감응형 하이드로겔 형성시, 제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자는 0.5 내지 2: 0.5 내지 2의 농도비로 포함되는 것인 신경줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물.
제1항에 있어서,
온도감응형 하이드로겔의 형성은 0.2 내지 0.4 N 농도의 가교결합제에 의해 겔화되어 수행되는 것인 신경줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 나노입자는 무기 나노입자인, 신경줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 무기 나노입자는 철(Fe), 코발트(Co), 니켈(Ni), 망간(Mn), 가돌리늄(Gd), 이들의 산화물 또는 이들의 합금(alloy)으로 이루어진 군에서 선택되는 자성 나노입자(magnetic nanoparticle)인, 신경줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생체적합성 고분자는 나노입자와 결합할 수 있는 기능기를 포함하는 것인, 신경줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 기능기는 아민기, 카복실기, 티올기, 또는 하이드록사이드기인, 신경줄기세포의 이식 및 분화 추적용 조성물.
제 1 천연 고분자 및 제 2 천연 고분자로부터 형성된 온도감응형 하이드로겔;
상기 하이드로겔 내 포함되는, 신경세포 분화 특이적 프로모터, Creb 5' UTR 서열 및 리포터 유전자를 포함하는 신경세포로의 분화 추적용 벡터가 형질도입된 신경줄기세포; 및
상기 신경세포로의 분화 추적용 벡터에 의해 발현되는, 이식된 신경줄기세포로부터 분화된 신경세포의 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 컨쥬게이션되어 있고 생체적합성 고분자로 코팅된 나노입자를 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제11항에 있어서,
상기 신경계 질환은 뇌졸중, 파킨슨씨 질환, 치매, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측색 경화증, 기억력 저하, 중증근무력증, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환 및 픽병으로 이루어진 군에서 선택된 것인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.