KR102315217B1 - Serine protease inhibitor peptide derived from Choanephora cucurbitarum and mutants thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 코아네포라 쿠쿠르비타룸(Choanephora cucurbitarum) 유래의 펩타이드를 세린계 단백질분해효소 저해제로서 제공하여, 세균에서만 발견되었던 단백질분해효소 저해 펩타이드를 균류에서도 확인할 수 있음을 제시한다. 아울러, 본 발명은 상기 단백질분해효소 저해 활성을 향상시킨 상기 펩타이드의 변이체를 제공하는바, 코아네포라 쿠쿠르비타룸 유래의 펩타이드와 그 변이체는 세린계 단백질분해효소 저해 활성으로 항균효과를 발휘하여 항균제로서 적용될 수 있고, 단백질분해효소 저해제 의약품 개발과 설계를 위한 주형물질(template) 또는 선도체(lead compounds)로, 또는 세탁용 세제 등의 상업용 제품의 안정화 용도로 이용될 수 있다. The present invention provides a peptide derived from Choanephora cucurbitarum as a serine-based protease inhibitor, suggesting that protease inhibitory peptides found only in bacteria can be identified in fungi. In addition, the present invention provides a mutant of the peptide with improved protease inhibitory activity. The peptide and variants derived from Coanephora cucurbitarum exhibit an antibacterial effect with serine-based protease inhibitory activity. It can be applied as an antibacterial agent, and can be used as a template or lead compound for the development and design of protease inhibitor drugs, or for stabilization of commercial products such as laundry detergent.

Description

코아네포라 쿠쿠르비타룸 유래의 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 및 이의 변이체{Serine protease inhibitor peptide derived from Choanephora cucurbitarum and mutants thereof}Serine protease inhibitor peptide derived from Choanephora cucurbitarum and mutants thereof

본 발명은 코아네포라 쿠쿠르비타룸(Choanephora cucurbitarum) 유래의 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제(Streptomyces subtilisin inhibitor: SSI) 도메인(domain)을 갖는 세린계 단백질분해효소의 활성을 저해하는 펩타이드 및 이의 변이체 등에 관한 것이다.The present invention provides a peptide and variants thereof that inhibit the activity of a serine-based protease having a Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI) domain derived from Choanephora cucurbitarum about etc.

단백질분해효소는 생체 내에서 소화작용에 사용될 뿐만 아니라, 염증, 세포증식, 신호전달, 바이러스의 활성화, 암세포의 증식 등 다양한 생리적 기능을 가지고 있고, 여러 질병과도 관련된 생물학적 기능을 가진 중요한 효소이다. 단백질 분해효소는 촉매활성을 나타내는 아미노산 잔기에 의해 분류되기도 하는데, 세린(serine)계 또는 시스테인(cysteine)계 단백질 분해효소가 대포적인 예이다. 서브틸리신은 세린(serine) 아미노산 잔기를 촉매활성부위로 갖는 전형적인 세린형 단백질분해효소(serine protease)로 세린계 단백질분해효소 저해제는 세탁세제의 활성을 안정화하는 첨가물로의 사용으로부터 단백질분해효소의 저해를 통해 질병을 치료하거나 생리적인 기능을 제어하는 의약품에 이르기까지 다양한 생물공학 응용을 갖는 중요한 단백질이다. Protease is not only used for digestion in vivo, but also has various physiological functions such as inflammation, cell proliferation, signal transduction, virus activation, and cancer cell proliferation, and is an important enzyme with biological functions related to various diseases. Proteolytic enzymes are also classified by amino acid residues exhibiting catalytic activity, and serine-based or cysteine-based proteolytic enzymes are typical examples. Subtilisin is a typical serine-type protease having a serine amino acid residue as a catalytically active site. Serine-based protease inhibitors inhibit protease from use as an additive to stabilize laundry detergent activity. It is an important protein with various bioengineering applications ranging from treating diseases to pharmaceuticals to control physiological functions.

서브틸리신의 강력한 단백질 분해능력은 세제 등의 첨가물로 사용되고 있다. 특히 바이오세제는 단백질 분해효소를 이용하여 단백질 등을 분해함으로써 옷감에 얼룩을 효과적으로 제거할 수 있다. 1960년대 중반부터 미국, 서유럽, 일본 등에서 널리 판매됐으며 오늘날 전세계적으로 사용되고 있다. 알칼리성 단백질분해효소를 이용하면 단백질 성분의 때가 분해돼 옷감 조직으로부터 분리되는데 세탁물 kg당 약 200㎎의 양으로도 적절한 효과를 나타낸다. 현재 바이오세제에 가장 많이 이용되고 있는 서브틸리신(subtilisin)은 미생물이 세포 밖으로 분비하는 대표적인 단백질분해효소로서 열안정성이 높고 알칼리 범위에서 효과를 유지하는 특성을 가지고 있다.The strong proteolytic ability of subtilisin is used as an additive for detergents and the like. In particular, biodetergents can effectively remove stains from fabrics by decomposing proteins using proteolytic enzymes. It has been widely sold in the United States, Western Europe, and Japan since the mid-1960s, and is now used worldwide. When alkaline protease is used, the dirt of the protein component is decomposed and separated from the fabric tissue. Subtilisin, which is currently most used in biodetergents, is a representative protease secreted out of cells by microorganisms, and has high thermal stability and maintains the effect in the alkaline range.

그러나, 바이오세제는 생물학적 생성물인 효소를 이용한다는 점에서 대량생성, 안정성 및 촉매성 유지, 및 비용 등의 문제가 있었다. 특히, 효소의 자가분해 작용에 의해 액상세제에서의 유통 및 보관 동안 효소 안전성을 유지하는 것이 문제되는데, 바이오세제의 사용 전까지 효소의 활성 및 그 안전성 유지를 위하여 효소의 경쟁적 또는 비경쟁적 억제제를 이용하고 있다. However, the biodetergent has problems such as mass production, stability and catalytic maintenance, and cost in that it uses an enzyme, which is a biological product. In particular, it is a problem to maintain enzyme safety during distribution and storage in liquid detergents due to the autolytic action of enzymes, and competitive or non-competitive inhibitors of enzymes are used to maintain enzyme activity and safety before use of biodetergents. have.

다양한 종류의 단백질 분해효소 저해제가 자연계에 존재하지만, 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제(Streptomyces subtilisin inhibitor: SSI)는 세균에서만 발견되었고, 고초균 유래 단백질분해효소인 서브틸리신과 같은 세린 프로테아제(protease)를 강력하게 억제한다. 최근 원핵세포인 세균에서만 확인된 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 도메인을 갖는 유전자가 진핵세포인 균류에서 처음으로 보고되었지만, 균류에서 발견된 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제의 활성이나 작용기작에 관해서는 전혀 알려진 바 없다. 본 발명자들은 균류인 코아네포라 쿠쿠르비타룸(Choanephora cucurbitarum)에서 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인(SSI-like domain)을 발견하고 상기 도메인을 포함하는 유전자가 코딩하는 펩타이드에서 서브틸리신 저해활성을 확인한 후, 상기 펩타이드에서 1 이상의 아미노산을 치환하여 그 활성을 향상시킨 변이체(mutant)를 제조하여 본 발명을 완성하였다.Although various kinds of protease inhibitors exist in nature, Streptomyces subtilisin inhibitor (SSI) has been found only in bacteria, and has a strong effect on serine proteases such as subtilisin, a protease derived from Bacillus subtilis. restrain it Recently, a gene having a Streptomyces subtilisin inhibitor domain identified only in prokaryotic bacteria was reported for the first time in a eukaryotic fungus. nothing is known The present inventors discovered a Streptomyces subtilisin inhibitor-like domain (SSI-like domain) in the fungus, Choanephora cucurbitarum , and inhibited subtilisin in the peptide encoded by the gene containing the domain. After confirming the activity, the present invention was completed by preparing a mutant having improved activity by substituting one or more amino acids in the peptide.

KR 101522042KR 101522042

Scientific Reports, 7:40432, DOI: 10.1038/srep40432Scientific Reports, 7:40432, DOI: 10.1038/srep40432

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 코아네포라 쿠쿠르비타룸(C. cucurbitarum) 유래의 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 및 이의 변이체, 상기 각각의 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포, 및 상기 형질전환 세포를 배양하여 그 배양물을 수득하는 단계를 포함하는 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 또는 이의 변이체 제조방법을 제공하는 것이다.The technical problem to be achieved by the present invention is a serine-based protease inhibitory peptide and variants thereof derived from Coanephora cucurbitarum (C. cucurbitarum), a recombinant expression vector capable of expressing each of the peptides, the recombinant expression vector To provide a method for producing a serine-based protease inhibitory peptide or a variant thereof, comprising the step of culturing the transformed cell and the transformed cell to obtain a culture thereof.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 코아네포라 쿠쿠르비타룸(Choanephora cucurbitarum) 유래의 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a serine-based protease inhibitory peptide derived from Coanephora cucurbitarum.

또한, 본 발명은 상기 코아네포라 쿠쿠르비타룸 유래의 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드를 포함하는 세린계 단백질분해효소 저해제를 제공한다.In addition, the present invention provides a serine-based protease inhibitor comprising the serine-based protease inhibitory peptide derived from the Coanephora cucurbitarum.

또한, 본 발명은 코아네포라 쿠쿠르비타룸 유래의 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant expression vector comprising a gene encoding a serine-based protease inhibitory peptide derived from Coanephora cucurbitarum.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터가 주입된 형질전환 세포를 제공한다. In addition, the present invention provides a transformed cell injected with the recombinant expression vector.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 상기 형질전환 세포의 배양물을 수득하는 단계; 및 상기 배양물에서 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드를 분리하는 단계;를 포함하는 세린계 단백질분해효소 저해제의 제조방법을 제공하다. In addition, the present invention comprises the steps of culturing the transformed cells; obtaining a culture of the transformed cells; and isolating the serine-based protease inhibitory peptide from the culture; provides a method for producing a serine-based protease inhibitor comprising.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the peptide may include or consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 펩타이드는 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the peptide may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 세린계 단백질분해효소는 서브틸리신(subtilisin)일 수 있으며, 상기 서브틸리신은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 유래의 것일 수 있다. In another embodiment of the present invention, the serine-based protease may be a subtilisin, and the subtilisin may be derived from Streptomyces.

또한, 본 발명은 코아네포라 쿠쿠르비타룸 유래의 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 변이체(mutant)를 제공한다. In addition, the present invention provides a serine-based protease inhibitory peptide mutant derived from Coanephora cucurbitarum.

또한, 본 발명은 상기 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. In addition, the present invention provides a recombinant expression vector comprising a gene encoding the variant.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 변이체를 암호화하는 유전자는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다. As an embodiment of the present invention, the gene encoding the variant may include or consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.

또한, 본 발명은 상기 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 주입된 형질전환 세포를 제공한다. In addition, the present invention provides a transformed cell into which the recombinant expression vector containing the gene encoding the variant is injected.

또한, 본 발명은 상기 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 주입된 형질전환 세포를 배양하는 단계; 상기 형질전환 세포의 배양물을 수득하는 단계; 및 상기 배양물에서 상기 변이체를 분리하는 단계;를 포함하는 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 변이체를 제조하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of culturing transformed cells injected with a recombinant expression vector containing the gene encoding the variant; obtaining a culture of the transformed cells; and isolating the variant from the culture; provides a method for producing a serine-based protease inhibitory peptide variant comprising.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 변이체는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the variant may include or consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 변이체는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열에 의해 암호화된 것일 수 있다. In another embodiment of the present invention, the variant may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 세린계 단백질분해효소는 서브틸리신(subtilisin)일 수 있으며, 상기 서브틸리신은 스트렙토마이세스(Streptomyces) 유래의 것일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the serine-based protease may be a subtilisin, and the subtilisin may be derived from Streptomyces.

본 발명은 코아네포라 쿠쿠르비타룸 유래의 펩타이드를 세린계 단백질분해효소 저해제로서 제공하여, 세균에서만 발견되었던 단백질분해효소 저해 펩타이드를 균류에서도 확인할 수 있음을 제시한다. 아울러, 본 발명은 상기 단백질분해효소 저해 활성을 향상시킨 상기 펩타이드의 변이체를 제공하는바, 코아네포라 쿠쿠르비타룸 유래의 펩타이드와 그 변이체는 세린계 단백질분해효소 저해 활성으로 항균효과를 발휘하여 항균제로서 적용될 수 있고, 단백질분해효소 저해제 의약품 개발과 설계를 위한 주형물질(template) 또는 선도체(lead compounds)로, 또는 세탁용 세제 등의 상업용 제품의 안정화 용도로 이용될 수 있다.The present invention provides a peptide derived from Coanephora cucurbitarum as a serine-based protease inhibitor, suggesting that protease inhibitory peptides found only in bacteria can be identified in fungi. In addition, the present invention provides a variant of the peptide with improved protease inhibitory activity. The peptide and variants derived from Coanephora cucurbitarum exhibit an antibacterial effect with serine-based protease inhibitory activity. It can be applied as an antibacterial agent, and can be used as a template or lead compound for the development and design of protease inhibitor drugs, or as a stabilization of commercial products such as laundry detergent.

도 1에 (A)는 C. cucurbitarum 유래의 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인 단백질 3종(Chocu_07290, Chocu_095050, Chocu_10373)의 발현을 확인한 도면이고 (M; 단백질 마커, 1; Chocu_07290의 발현, 2; Chocu_09050의 발현, 3: Chocu_10373의 발현, 4: void vector의 발현, 5: 세균유래 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 발현) 도 1에 (B)는 C. cucurbitarum 유래의 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인 단백질 중에서 Chocu_09050의 정제를 확인한 도면이다(M; 단백질 마커, 1; 정제 전Chocu_09050, 2; 정제 후 Chocu_09050).
도 2는 아조카제인 분해측정(Azocasein assay)를 통한 단백질분해효소 저해제 활성을 확인한 도면이다. 양성대조군인 화학적 저해제 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)와 세균유래 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제(bacterial SSI)의 단백질분해효소 저해활성과 비교하였을 때, Chopin9은 비슷한 서브틸리신 활성저해능력을 보이는 반면, Chopin7과 Chopin10은 그렇지 않은 것은 확인할 수 있다.
도 3은 단백질분해효소 저해 활성이 향상된 Chopin9 변이체 제작을 위한 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 수행한 결과의 모식도이다.
도 4는 Chopin9 변이체의 서브틸리신 저해 활성을 확인한 Azocasein assay 결과 도면이다. Chopin9_T57M 및 Chopin9_T57M_A60M에서 wild type Chopin9보다 각각 76.9% 및 69.0% 우수한 서브틸리신 억제 활성을 확인할 수 있다.
도 5는 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인과 서브틸리신 단백질의 결합 구조의 모델링 도면이다. SWISS-MODEL 프로그램을 사용하여 3종류의 Chopin을 모델링하고, 기존의 세균유래 서브틸리신 저해제 유사 도메인-복합체 모델(BSSI-Subtilisin)과 동일한 방법으로 3종류의 Chopin9에 대한 Chopin9-Subtilisin 복합체 구조를 모델링하여 구조적으로 서브틸리신의 S1과 S4 site에 대한 Chopin9의 아미노산 위치(P1 = A60, P2 = T57)와 돌연변이 서열(P1 = A60M, P4 = T57M)을 예측하였다.In Figure 1 (A) is a view confirming the expression of three kinds of Streptomyces subtilisin inhibitor-like domain proteins (Chocu_07290, Chocu_095050, Chocu_10373) derived from C. cucurbitarum (M; protein marker, 1; expression of Chocu_07290, 2 ; Chocu_09050 expression, 3: Chocu_10373 expression, 4: void vector expression, 5: bacterial-derived Streptomyces subtilisin inhibitor expression) In FIG. 1 (B), C. cucurbitarum- derived Streptomyces subtilisin inhibitor It is a view confirming the purification of Chocu_09050 among similar domain proteins (M; protein marker, 1; Chocu_09050, 2 before purification; Chocu_09050 after purification).
Figure 2 is a view confirming the protease inhibitor activity through azocasein degradation measurement (Azocasein assay). When compared to the protease inhibitory activity of the positive control chemical inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and bacterial SSI, Chopin9 showed similar subtilisin activity inhibitory ability, whereas Chopin7 and Chopin10 can confirm that it is not.
Figure 3 is a schematic diagram of the result of performing multiple sequence alignment (multiple sequence alignment) for the production of a mutant Chopin9 with improved protease inhibitory activity.
4 is a diagram showing the results of an Azocasein assay confirming the subtilisin inhibitory activity of the Chopin9 mutant. In Chopin9_T57M and Chopin9_T57M_A60M, 76.9% and 69.0% superior subtilisin inhibitory activity than wild type Chopin9, respectively, can be confirmed.
5 is a modeling diagram of the binding structure of a Streptomyces subtilisin inhibitor-like domain and a subtilisin protein. Model 3 types of Chopin using SWISS-MODEL program, and model the structure of the Chopin9-Subtilisin complex for 3 types of Chopin9 in the same way as the existing bacterial-derived subtilisin inhibitor-like domain-complex model (BSSI-Subtilisin). Thus, the amino acid position of Chopin9 (P1 = A60, P2 = T57) and the mutant sequence (P1 = A60M, P4 = T57M) for the S1 and S4 sites of subtilisin were predicted structurally.

본 발명자들은 균류인 코아네포라 쿠쿠르비타룸(C. cucurbitarum)에서 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인(SSI-like domain)을 확인하고 실제로 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제의 기능을 수행하는 영역을 확인하고, 상기 진핵세포인 균류유래의 도메인(domain)의 57 번째 및/또는 60번째 아미노산을 메티오닌으로 치환한 펩타이드에서 향상된 서브틸리신 저해 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors identified a Streptomyces subtilisin inhibitor-like domain (SSI-like domain) in the fungus Coanephora cucurbitarum ( C. cucurbitarum ) and actually performed the function of a Streptomyces subtilisin inhibitor. The present invention was completed by confirming the improved subtilisin inhibitory activity in the peptide in which the 57th and/or 60th amino acid of the domain derived from the fungus, which is a eukaryotic cell, was substituted with methionine.

구체적으로, 본 발명자들은 C. cucurbitarum에서 세린계 단백질분해효소 저해 기능을 수행할 것으로 예측되는 영역을 추출하고, 상기 영역에 대한 코돈 최적화된 염기서열을 제작하여 pB4 벡터에 클로닝하여 대장균에 형질전환한 후 상기 영역의 단백질을 과발현(over-expression)시키고 이를 정제하여 azocasein assay를 통해 서브틸리신 저해 활성을 확인하였다. 그 결과, Chopin9에서는 서브틸리신 억제 활성을 확인할 수 있었으나, Chopin7 및 Chopin10에서는 서브틸리신 저해 활성을 확인할 수 없었다(실시예 1 내지 3 참조).Specifically, the present inventors extracted a region predicted to perform a serine-based protease inhibitory function from C. cucurbitarum , prepared a codon-optimized nucleotide sequence for the region, cloned it into a pB4 vector, and transformed E. coli. After that, the protein in the region was over-expressed and purified, and subtilisin inhibitory activity was confirmed through an azocasein assay. As a result, the subtilisin inhibitory activity was confirmed in Chopin9, but the subtilisin inhibitory activity was not confirmed in Chopin7 and Chopin10 (see Examples 1 to 3).

또한, 본 발명자들은 C. cucurbitarum 유래의 세린계 단백질분해효소 저해제로서 Chopin9를 확인한 후 구체적인 실시예를 통하여 상기 Chopin9의 단백질분해효소 저해 활성을 향상시키기 위하여 Chopin9의 변이체를 제작하고, 상기 각 변이체의 서브틸리신 저해 활성을 확인한 결과 Chopin9의 57 및/또는 60번째 아미노산을 메티오닌으로 치환한 Chopin9_T57M과 Chopin9_T57M_A60M가 Chopin9보다 각각 76.9% 및 69.0% 우수한 서브틸리신 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다(실시예 4 및 5 참조).In addition, the present inventors identified Chopin9 as a C. cucurbitarum- derived serine-based protease inhibitor, and then prepared a mutant of Chopin9 to improve the protease inhibitory activity of Chopin9 through specific examples, and sub As a result of confirming the tilisin inhibitory activity, it was confirmed that Chopin9_T57M and Chopin9_T57M_A60M in which the 57th and/or 60th amino acids of Chopin9 were substituted with methionine exhibited 76.9% and 69.0% superior subtilisin inhibitory activity, respectively, than Chopin9 (Examples 4 and 5) Reference).

상기로부터, 본 발명은 최초로 균류 유래의 세린계 단백질분해효소 저해제로서 Chopin9를 제공할 수 있으며, 상기 Chopin9의 57 및/또는 60번째 아미노산이 치환되어 단백질분해효소 억제 활성이 향상된 Chopin9 변이체를 제공할 수 있다.From the above, the present invention can provide Chopin9 as a serine-based protease inhibitor derived from fungi for the first time, and a Chopin9 variant having improved protease inhibitory activity by substituting the 57th and/or 60th amino acids of Chopin9 can be provided. have.

또한, 본 발명은 상기 Chopin9 및/또는 그 변이체(Chopin9_T57M 및/또는 Chopin9_T57M_A60M)를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자가 도입된 발현 벡터를 제공하고, 상기 벡터가 주입된 형질전환체를 제공함으로서 상기 형질전환체의 배양을 통해서 단백질분해효소 저해 펩타이드의 대량생산 방법을 제공할 수 있다. In addition, the present invention provides a gene encoding the Chopin9 and/or its variants (Chopin9_T57M and/or Chopin9_T57M_A60M) and an expression vector into which the gene is introduced, and the transformant is injected by providing the transformant It is possible to provide a method for mass production of protease inhibitory peptides through culturing.

본 발명에서 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드는 코아네포라 쿠쿠르비타룸 유래의 것으로서 C. cucurbitarum으로부터 직접 분리하여 획득할 수 있있다. 또한, 상기 펩타이드 및 그 변이체는 공지의 화학적 합성 방법에 의해 제조될 수 있으며, 화학적 합성 방법의 비제한적인 예로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법 등이 있다. In the present invention, the serine-based protease inhibitory peptide is derived from Coanephora cucurbitarum and can be directly isolated and obtained from C. cucurbitarum. In addition, the peptide and its variants may be prepared by known chemical synthesis methods, and non-limiting examples of chemical synthesis methods include liquid or solid phase synthesis, fragment condensation, F-MOC or T-BOC chemistry, and the like.

한편, 본 발명의 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 및 그 변이체는 유전자 재조합 기술을 이용하여 획득될 수도 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 본 발명의 펩타이드 및/또는 그 변이첸를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(핵산)를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환(도입)하여 본 발명의 펩타이드 및/또는 그 변이체가 발현되도록 숙주세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 상기 펩타이드를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 상기 펩타이드는 현질전환된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 펩타이드를 분리 하기 위하여 이들을 조합하여 이용할 수 있다.본 발명의 구체적인 실시예에서 "벡터 (vector)"는 변형된 pET21a 벡터인 pB4 벡터를 이용하고 있으나, 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물이라면 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이고, 본 발명의 구체적인 실시예에서 이용하고 있는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.On the other hand, the serine-based protease inhibitory peptide and variants thereof of the present invention may be obtained using genetic recombination technology. When using genetic recombination technology, a polynucleotide (nucleic acid) encoding the peptide of the present invention and/or its mutant is inserted into an appropriate expression vector, and the vector is transformed (introduced) into a host cell to transform the peptide and/or the present invention into a host cell. It can be obtained by culturing a host cell so that the variant is expressed, and then recovering the peptide from the host cell. After the peptide is expressed in the transformed host cell, for separation and purification, a conventional biochemical separation technique, for example, treatment with a protein precipitant (salting-out method), centrifugation, sonication, ultrafiltration, dialysis, and minute Various chromatography methods such as self-chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. can be used, and in general, these can be used in combination to separate high-purity peptides. In a specific embodiment of the invention, the "vector" uses a pB4 vector, which is a modified pET21a vector, but a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host. If so, it is not limited thereto. Thus, a vector may be a plasmid, a phage particle, or simply a potential genomic insert. Upon transformation into an appropriate host, the vector may replicate and function independently of the host genome, or in some cases may be integrated into the genome itself. Since the plasmid is the most commonly used form of the current vector and the form used in specific embodiments of the present invention, in the present specification, "plasmid" and "vector" are sometimes used interchangeably. used However, the present invention includes other forms of vectors that have an equivalent function as known or coming to be known in the art.

또한, 본 명세서에 "재조합 발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하 게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.In addition, as used herein, the term "recombinant expression vector" generally refers to a double-stranded DNA fragment as a recombinant carrier into which a heterologous DNA fragment is inserted. Here, heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not found naturally in host cells. An expression vector, once in the host cell, can replicate independently of the host chromosomal DNA and several copies of the vector and its inserted (heterologous) DNA can be produced.

상기 벡터는 클로닝되는 유전자와 작동가능하게 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함할 수 있으며, 본 명세서에서 “프로모터”는 형질주입하고자 하는 유전자의 발현을 촉진시키는 것으로서 상기 프로모터에는 전사에 필요한 기본인자(Basal element)뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서(enhancer)가 더 포함될 수 있다.The vector may include a promoter operatively linked to the gene to be cloned, and in the present specification, the “promoter” promotes the expression of a gene to be transfected, and the promoter includes basic factors necessary for transcription (Basal). element), as well as enhancers that can be used to promote and regulate expression may be further included.

또한, 본 명세서에서 "형질전환" 또는 “형질주입”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.In addition, as used herein, "transformation" or "transfection" means introducing DNA into a host so that the DNA becomes replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration completion.

본 발명의 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 및 이의 변이체의 아미노 말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 보호기가 결합될 수 있으며, 펩타이드의 카르복시 말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂) 등으로 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드의 말단 또는 아미노산의 R-잔기(R-group)에 지방산(fatty acids), 당사슬(oligosaccharides chains), 모든 나노입자(골드입자, 리포솜, 헤파린, 하이드로젤 등), 아미노산, 담체 단백질(carrier proteins) 등을 결합할 수 있다. 상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 역가(potency)와 안정성을 개선하는 작용을 수행할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 생체 내(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(상온, 냉장, 냉동 보관 시 저장 안정성 포함)도 의미한다.The amino terminus of the serine-based protease inhibitory peptide and variants thereof of the present invention is an acetyl group, a fluorenyl methoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group, and a protecting group such as polyethylene glycol (PEG). may be bonded, and the carboxy terminus of the peptide _{may be modified with a hydroxyl group (-OH), an amino group (-NH 2} ), an azide (-NHNH ₂ ), and the like. In addition, fatty acids, oligosaccharides chains, all nanoparticles (gold particles, liposomes, heparin, hydrogel, etc.), amino acids, carriers at the end of the peptide of the present invention or at the R-group of amino acids It can bind to proteins (carrier proteins) and the like. Modification of the above-described amino acids can perform the action of improving the potency and stability of the peptide of the present invention. As used herein, the term “stability” refers not only to in vivo stability, but also storage stability (including storage stability at room temperature, refrigeration, and frozen storage).

한편, 본 발명의 C. cucurbitarum 유래의 펩타이드 및/또는 그 변이체는 플라스민, 프로테아제 K, 및 서브틸리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세린계 단백질분해효소의 활성을 저해할 수 있다.On the other hand, the C. cucurbitarum- derived peptide and / or variant thereof of the present invention may inhibit the activity of one or more serine-based proteases selected from the group consisting of plasmin, protease K, and subtilisin.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.The present invention can apply various transformations and can have various embodiments. Hereinafter, specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail in the detailed description. However, this is not intended to limit the present invention to specific embodiments, and it should be understood to include all modifications, equivalents and substitutes included in the spirit and scope of the present invention. In describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known technology may obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.

[실시예][Example]

실시예 1. 균류 유래 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 도메인의 클로닝Example 1. Cloning of Streptomyces subtilisin inhibitor domain from fungus

Pfam database (http://pfam.xfam.org/family/PF00720)에서 25개의 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인(SSI-like domain)의 염기서열을 사용하여 C. cucurbitarum의 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인 염기서열을 추출한 결과, C. cucurbitarum 으로부터 총 9개의 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인을 갖는 유전자를 확인하였다. 이들 서열을 정렬하고(multiple sequence alignment), 유전자 계통도(gene tree)를 그려 3개의 서브그룹으로 나누고, 3개 서브그룹을 대표하는 3개의 균류유래 Chopin을 선별하였다. 상기 3개의 C. cucurbitarum의 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인(SSI-like domain)의 코돈 최적화된(codon optimized) 유전자 서열과 스트렙토마이세스 알보그리세올러스(Streptomyces albogriseolus)의 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제(SSI) 서열을 합성 제작하였다(표 1). 상기 코돈 최적화된 유전자는 변형된 pET21a 벡터인 pB4 벡터(표 2)에 각각 라이게이션 독립적인 클로닝(Ligation independent cloning: LIC) 방법으로 클로닝하여 재조합 발현 벡터를 제조하였다. Streptomyces subtilis of C. cucurbitarum using the nucleotide sequences of 25 Streptomyces subtilisin inhibitor-like domains from the Pfam database (http://pfam.xfam.org/family/PF00720) As a result of extracting the sequence of the renal inhibitor-like domain, genes having a total of 9 Streptomyces subtilisin-like domains were identified from C. cucurbitarum. These sequences were aligned (multiple sequence alignment), a gene tree was drawn and divided into three subgroups, and three fungal-derived Chopins representing the three subgroups were selected. The codon-optimized gene sequence of the three C. cucurbitarum Streptomyces subtilisin inhibitor-like domains and the Streptomyces albogriseolus Streptomyces sub A tilisin inhibitor (SSI) sequence was synthesized (Table 1). The codon-optimized gene was cloned into the modified pET21a vector, pB4 vector (Table 2), by a ligation independent cloning (LIC) method to prepare a recombinant expression vector.

SSI-like genesSSI-like genes Chocu_07290Chocu_07290 ATGGCCTCCTGTCCCGAGCGTCATACCGTTTTAGCCATTGCGTATCATAACGAAGATCAGGAGATCCGGGCGGATACGTTGGTATGCAATCCAGTGGGGGGGACCCATCCCAATGCAACGGCGGCATGTGATCTTTTGGAGTCGGTAAATGGTGAGCTTGACGATATTGAGCCGTTGGATCGTTATTGCCGGGGAACCGATTATTTTGCAAATGTCACAATCAAGGGAACATATGAGGGCAAACCCATTGATTTTAAGCACAAATACAGAAACGGGTGTTATGCGTTAGTGCGGTTGAAGGTGCTTGTCGAGCATTTTCTTGATTACAAGTAGATGGCCTCCTGTCCCGAGCGTCATACCGTTTTAGCCATTGCGTATCATAACGAAGATCAGGAGATCCGGGCGGATACGTTGGTATGCAATCCAGTGGGGGGGACCCATCCCAATGCAACGGCGGCATGTGATCTTTTGGAGTCGGTAAATGGTGAGCTTGACGATATTGAGCCGTTGGATCGTTATTGCCGGGGAACCGATTATTTTGCAAATGTCACAATCAAGGGAACATATGAGGGCAAACCCATTGATTTTAAGCACAAATACAGAAACGGGTGTTATGCGTTAGTGCGGTTGAAGGTGCTTGTCGAGCATTTTCTTGATTACAAGTAG 서열번호 2SEQ ID NO: 2 Chocu_09050Chocu_09050 ATGTTCAAATCCGCACTTTGTTTAGTTGCCAGTTTTGTTTTGCTGGTCAGCGCGGCACCGGCTACAAACGACGTCCTGACCGTCAGTTCAACCGCTCAAAATGTGAAATACACATTGTCATGCTCGCCTGTCAGCGGGAACCACCCTTATCGCCAGGAGGCCTGTAATGCTCTGAAAAAGTGCGGGGGAAACTTAGACGCGATCACTCCCACTTCGGTAACGTGTCCGGCTCTGTACGCTCCAGTGACCGTGACCATAGAAGGTACATACGGCGGGAAAGCAGTACAACTGAAGAAAGAATATAGCAATGCCTGTACTGCCCAAGCACAGTTAGGGTCTATTGCCCGCCTTTGATGTTCAAATCCGCACTTTGTTTAGTTGCCAGTTTTGTTTTGCTGGTCAGCGCGGCACCGGCTACAAACGACGTCCTGACCGTCAGTTCAACCGCTCAAAATGTGAAATACACATTGTCATGCTCGCCTGTCAGCGGGAACCACCCTTATCGCCAGGAGGCCTGTAATGCTCTGAAAAAGTGCGGGGGAAACTTAGACGCGATCACTCCCACTTCGGTAACGTGTCCGGCTCTGTACGCTCCAGTGACCGTGACCATAGAAGGTACATACGGCGGGAAAGCAGTACAACTGAAGAAAGAATATAGCAATGCCTGTACTGCCCAAGCACAGTTAGGGTCTATTGCCCGCCTTTG 서열번호 3SEQ ID NO: 3 Chocu_10373Chocu_10373 ATGGCGTCAAAGCGGGGGCTTACCAACCTTACTATAACAGCAGAAATTGACATACGGAAGGAAATTCGGTCCCTTCGCTGTAGCCCTACTGGCGGTGACCATCCCCAAAAAGAAGAGGCTTGTCGGCAATTAGGTCGGGCGAATCGGGACCTTAAAGGCCTTCAGGAAACCGACTGTCCGTTCGTCGGAATTCCTGTCACCGTGACAATCGAAGGAAAACTTAGAAACCAACCTGTCTTCTTGACCGAATCCTTTCTGGGGTATTGCGACGCGATCCGTCGCTTTGGCGTAGTTGTTAAAGATGTGTTGCCTAGTTTTTATGAGTAGATGGCGTCAAAGCGGGGGCTTACCAACCTTACTATAACAGCAGAAATTGACATACGGAAGGAAATTCGGTCCCTTCGCTGTAGCCCTACTGGCGGTGACCATCCCCAAAAAGAAGAGGCTTGTCGGCAATTAGGTCGGGCGAATCGGGACCTTAAAGGCCTTCAGGAAACCGACTGTCCGTTCGTCGGAATTCCTGTCACCGTGACAATCGAAGGAAAACTTAGAAACCAACCTGTCTTCTTGACCGAATCCTTTCTGGGGTATTGCGACGCGATCCGTCGCTTTGGCGTAGTTGTTAAAGATGTGTTGCCTAGTTTTTATGAGTAG 서열번호 4SEQ ID NO: 4 Bacterial SSIBacterial SSI ATGGATGCGCCTTCTGCTCTGTATGCCCCTAGTGCTCTGGTCTTAACAGTAGGCAAAGGTGTATCGGCTACGACGGCCGCGCCCGAGCGTGCAGTGACACTGACTTGCGCTCCCGGGCCCTCCGGGACTCATCCCGCTGCTGGTTCAGCTTGTGCCGATTTAGCTGCGGTTGGAGGGGATTTGAACGCTCTTACACGCGGGGAGGATGTGATGTGCCCTATGGTTTACGACCCTGTCTTGTTGACTGTTGACGGGGTTTGGCAAGGTAAGCGTGTTTCCTATGAACGTGTGTTCAGTAACGAGTGTGAAATGAATGCACACGGGTCCTCCGTTTTTGCGTTTTAGTAGATGGATGCGCCTTCTGCTCTGTATGCCCCTAGTGCTCTGGTCTTAACAGTAGGCAAAGGTGTATCGGCTACGACGGCCGCGCCCGAGCGTGCAGTGACACTGACTTGCGCTCCCGGGCCCTCCGGGACTCATCCCGCTGCTGGTTCAGCTTGTGCCGATTTAGCTGCGGTTGGAGGGGATTTGAACGCTCTTACACGCGGGGAGGATGTGATGTGCCCTATGGTTTACGACCCTGTCTTGTTGACTGTTGACGGGGTTTGGCAAGGTAAGCGTGTTTCCTATGAACGTGTGTTCAGTAACGAGTGTGAAATGAATGCACACGGGTCCTCCGTTTTTGCGTTTTAGTAG 서열번호 5SEQ ID NO: 5

VectorVector Fusion SequenceFusion Sequence pB4pB4 MGSSHHHHHHGTKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTGTDYDIPTTENLYFQGGGGGG
MGSSHHHHHHGTKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTGTDYDIPTTENLYFQGGGGGG
서열번호 6SEQ ID NO: 6

실시예 2. 균류 유래 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제도메인 의 발현 및 정제Example 2. Expression and purification of Streptomyces subtilisin inhibitor domain derived from fungi

상기 실시예 1에서 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인(SSI-like domain)을 클로닝한 벡터를 대장균(Escherichia coli)에 형질전환한 후 100 μg/μL의 암피실린을 포함한 LB(Luria-Bertani) 배지에서 37℃로 배양하였다. 단백질의 발현을 위해 1mM의 IPTG(isopropyl-β를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 induction(단백질 발현의 유도)시킨 후 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)와 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)를 이용하여 단백질을 정제하였다(도 1). 최종적으로 염제거 컬럼(desalting column)으로 20 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl (pH 7.5)로 버퍼를 변경하였다.After transforming the vector cloning the Streptomyces subtilisin inhibitor-like domain (SSI-like domain) in Example 1 into Escherichia coli , LB (Luria-Bertani) medium containing 100 μg/μL of ampicillin incubated at 37°C. For protein expression, 1 mM IPTG (isopropyl-β) was added and induction was performed at 37° C. for 4 hours, followed by affinity chromatography and ion-exchange chromatography. was used to purify the protein (Fig. 1) Finally, the buffer was changed to 20 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl (pH 7.5) as a desalting column.

실시예 3. 균류 유래 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 도메인의 활성 확인Example 3. Confirmation of activity of Streptomyces subtilisin inhibitor domain derived from fungus

상기 실시예 2에서 정제한 각 단백질의 활성을 확인하기 위해 azocasein assay를 이용하였다. Azocasein은 프로테아제가 작용하면 azo기와 casein으로 분리되며, 분리된 azo기는 분광광도계를 이용하여 440nm의 파장에서 측정할 수 있다. 이 방법을 통해 정제한 SSI-like 단백질들의 활성을 확인하였다. In order to confirm the activity of each protein purified in Example 2, an azocasein assay was used. Azocasein is separated into an azo group and casein when the protease acts, and the separated azo group can be measured at a wavelength of 440 nm using a spectrophotometer. The activity of the purified SSI-like proteins was confirmed by this method.

Azocasein assay를 이용하여 저해제의 활성을 확인한 결과, 기존에 알려진 세균(S. albogriseolus)의 SSI와 화학적 프로테아제 저해제인 PMSF, 그리고 Chopin9 (Chocu_09050의 단백질 명명)은 대조군에 비해 흡광도가 크게 낮게 나온 반면, Chopin7 (Chocu_07290의 단백질 명명)과 Chopin10 (Chocu_10373의 단백질 명명)은 대조군과 거의 차이가 없는 흡광도를 보였다. 따라서, 세가지의 SSI-like 단백질 중 Chopin9에서만 서브틸리신이 억제되는 것을 확인했다(도 2).As a result of confirming the activity of the inhibitor using the Azocasein assay, the absorbance of SSI, a chemical protease inhibitor, and Chopin9 (the protein name of Chocu_09050) was significantly lower than that of the control group, whereas Chopin7 (The protein name of Chocu_07290) and Chopin10 (the protein name of Chocu_10373) showed almost no difference in absorbance from the control group. Therefore, it was confirmed that subtilisin was inhibited only in Chopin9 among the three SSI-like proteins (FIG. 2).

실시예 4. 균류 유래 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인의 활성부위 예측 및 변이체 제작Example 4. Prediction of active site of Streptomyces subtilisin inhibitor-like domain derived from fungus and production of variants

상기 실시예 3에서 서브틸리신 억제 효과를 확인한 Chopin9의 그 억제 활성을 향상시키기 위하여 3차 구조모델 분석을 수행하였다(도 5). In order to improve the inhibitory activity of Chopin9, which confirmed the subtilisin inhibitory effect in Example 3, a tertiary structural model analysis was performed (FIG. 5).

스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메인과 서브틸리신 단백질의 결합 구조분석을 위해, SWISS-MODEL 프로그램을 사용하여 기존의 세균유래 서브틸리신 저해제 유사 도메인(PDB ID: 3SIC)의 모델로부터 상기 3종류의 Chopin(Chopin9, Chopin9_T57M, 및 Chopin9_T57M_A60M)을 모델링하였다. 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 유사 도메일과 서브틸리신 단백질의 복합체의 결합부분에 대한 구조분석은 기존의 세균유래 서브틸리신 저해제 유사 도메인-복합체 모델(BSSI-Subtilisin)과 동일한 방법으로 3종류의 Chopin9에 대한 Chopin9-Subtilisin 복합체 구조를 모델링하고, 이를 바탕으로 복합체 단백질의 구조를 비교분석하였다. For structural analysis of the binding structure between the Streptomyces subtilisin inhibitor-like domain and the subtilisin protein, the three types of subtilisin inhibitor-like domains (PDB ID: 3SIC) from the existing model using the SWISS-MODEL program were used. Chopin (Chopin9, Chopin9_T57M, and Chopin9_T57M_A60M) were modeled. The structural analysis of the binding portion of the complex of the Streptomyces subtilisin inhibitor-like domain and subtilisin protein was performed in the same way as the existing bacterial-derived subtilisin inhibitor-like domain-complex model (BSSI-Subtilisin). The structure of the Chopin9-Subtilisin complex for Chopin9 was modeled, and the structure of the complex protein was compared and analyzed based on this.

그 결과, 서브틸리신의 S1과 S4 site에 결합하는 Chopin9의 아미노산 위치와 돌연변이 서열을 예측하였고, 이를 통해 Chopin에서의 P1과 P4 site의 단백질의 아미노산을 예측하였다. BSSI-Subtilisin 복합체에서 서브틸리신의 S1과 S4 pocket과 Chopin9의 P1, P4 site와의 결합력에 따라 단백질 저해 활성이 높을 것으로 예측하고, 이를 통해 Chopin의 저해활성에 대한 위치(P1 = A60, P4 = T57)와 구조적으로 결합력을 높일 수 있는 돌연변이 아미노산(P1 = A60M, P4 = T57M)을 예측하였다.As a result, the amino acid position and mutant sequence of Chopin9 binding to the S1 and S4 sites of subtilisin were predicted, and the amino acid of the protein at the P1 and P4 sites in Chopin was predicted through this. In the BSSI-Subtilisin complex, the protein inhibitory activity is predicted to be high depending on the binding force between the S1 and S4 pockets of subtilisin and the P1 and P4 sites of Chopin9, and through this, the position for the inhibitory activity of Chopin (P1 = A60, P4 = T57) and structurally mutated amino acids (P1 = A60M, P4 = T57M) that can increase binding strength were predicted.

이에, 57번째 아미노산(P4 site)을 트레오닌(Threonine)에서 메티오닌(Methionine)으로 치환한 Chopin9_T57M과 57번째 아미노산을 메티오닌으로 치환하고 60번째 아미노산(P1 site)을 알라닌(Alanine)에서 메티오닌으로 치환한 Chopin9_T57M_A60M 변이체를 각각 제작하였다(도 3). Chopin9의 각 변이체 제작을 위하여 하기 표 3의 염기서열을 PCR을 통해 증폭하고, 생어 시퀀싱을 통해 서열을 확인한 각 변이체 유전자를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 변형된 pET21a 벡터인 pB4 벡터에 클로닝하여 재조합 발현 벡터를 제작한 후, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 E. coli BL21 (DE3)에 형질주입하여 형질전환체를 제조하였다. 이어서, 상기 형질전환체를 100 μg/μL의 암피실린을 포함한 LB배지에 37℃로 배양하고 1mM의 IPTG를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 상기 Chopin9 변이체의 발현을 유도한 후 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 최종적으로 desalting column으로 20 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl (pH 7.5)로 버퍼를 변경하였다.Accordingly, Chopin9_T57M in which the 57th amino acid (P4 site) was substituted with methionine from threonine, and Chopin9_T57M_A60M in which the 57th amino acid was substituted with methionine and the 60th amino acid (P1 site) was substituted from alanine to methionine Each variant was constructed ( FIG. 3 ). To prepare each variant of Chopin9, the nucleotide sequence of Table 3 was amplified through PCR, and each mutant gene whose sequence was confirmed through Sanger sequencing was cloned into the pB4 vector, a pET21a vector modified in the same manner as in Example 1, and recombinated. After preparing the expression vector, E. coli BL21 (DE3) was transfected in the same manner as in Example 2 to prepare a transformant. Then, the transformant was incubated in LB medium containing 100 μg/μL of ampicillin at 37° C., and 1 mM IPTG was added to induce the expression of the Chopin9 variant at 37° C. for 4 hours, followed by affinity chromatography. Purified. Finally, the buffer was changed to 20 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl (pH 7.5) by desalting column.

SSI-like genesSSI-like genes Chopin9 T57MChopin9 T57M ATGGCACCGGCTACAAACGACGTCCTGACCGTCAGTTCAACCGCTCAAAATGTGAAATACACATTGTCATGCTCGCCTGT
CAGCGGGAACCACCCTTATCGCCAGGAGGCCTGTAATGCTCTGAAAAAGTGCGGGGGAAACTTAGACGCGATCACTCCCA
CTTCGGTAATGTGTCCGGCTCTGTACGCTCCAGTGACCGTGACCATAGAAGGTACATACGGCGGGAAAGCAGTACAACTG
AAGAAAGAATATAGCAATGCCTGTACTGCCCAAGCACAGTTAGGGTCTATTGCCCGCCTTTAGATGGCACCGGCTACAAACGACGTCCTGACCGTCAGTTCAACCGCTCAAAATGTGAAATACACATTGTCATGCTCGCCTGT
CAGCGGGAACCACCCTTATCGCCAGGAGGCCTGTAATGCTCTGAAAAAGTGCGGGGGAAACTTAGACGCGATCACTCCCA
CTTCGGTAATGTTGTCCGGCTCTGTACGCTCCAGTGACCGTGACCATAGAAGGTACATACGGCGGGAAAGCAGTACAACTG
AAGAAAGAATATAGCAATGCCTGTACTGCCCAAGCACAGTTAGGGTCTATTGCCCGCCTTTAG 서열번호 9SEQ ID NO: 9 Chopin9 T57M A60MChopin9 T57M A60M ATGGCACCGGCTACAAACGACGTCCTGACCGTCAGTTCAACCGCTCAAAATGTGAAATACACATTGTCATGCTCGCCTGTCAGCGGGAACCACCCTTATCGCCAGGAGGCCTGTAATGCTCTGAAAAAGTGCGGGGGAAACTTAGACGCGATCACTCCCA
CTTCGGTAATGTGTCCGATGCTGTACGCTCCAGTGACCGTGACCATAGAAGGTACATACGGCGGGAAAGCAGTACAACTG
AAGAAAGAATATAGCAATGCCTGTACTGCCCAAGCACAGTTAGGGTCTATTGCCCGCCTTTAGATGGCACCGGCTACAAACGACGTCCTGACCGTCAGTTCAACCGCTCAAAATGTGAAATACACATTGTCATGCTCGCCTGTCAGCGGGAACCACCCTTATCGCCAGGAGGCCTGTAATGCTCTGAAAAAGTGCGGGGGAAACTTAGACGCGATCACTCCCA
CTTCGGTAATGTTGTCCGATGCTGTACGCTCCAGTGACCGTGACCATAGAAGGTACATACGGCGGGAAAGCAGTACAACTG
AAGAAAGAATATAGCAATGCCTGTACTGCCCAAGCACAGTTAGGGTCTATTGCCCGCCTTTAG 서열번호 10SEQ ID NO: 10

실시예 5. 균류 유래 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제 도메인 변이체의 향상된 활성 확인Example 5. Confirmation of improved activity of Streptomyces subtilisin inhibitor domain variants derived from fungi

상기 실시예 4에서 정제한 각 Chopin9 변이체의 활성을 확인하기 위하여 상기 실시예 3의 방법과 마찬가지로 azocasein assay를 실시하였다. In order to confirm the activity of each Chopin9 mutant purified in Example 4, an azocasein assay was performed in the same manner as in Example 3 above.

그 결과, wild type Chopin9을 처리한 경우 48.73 ± 2.18 % 서브틸리신 활성을 확인할 수 있었고, 세균 유래 스트렙토마이세스 서브틸리신 저해제(BSSI) 처리의 경우 3.36 ± 0.36 %, Chopin9_T57M 처리의 경우 9.15 ± 0.79 %, Chopin_T57M_A60M 처리의 경우 11.67 ± 1.93 % 서브틸리신 활성을 확인할 수 있었다. 상기로부터 Chopin9_T57M 및 Chopin9_T57M_A60M는 wild type Chopin9보다 각각 76.9% 및 69.0% 우수한 서브틸리신 억제 활성을 가짐을 알 수 있다. As a result, when treated with wild type Chopin9, 48.73 ± 2.18% subtilisin activity could be confirmed, in the case of bacterial-derived Streptomyces subtilisin inhibitor (BSSI) treatment, 3.36 ± 0.36%, and in the case of Chopin9_T57M treatment, 9.15 ± 0.79 %, 11.67 ± 1.93% subtilisin activity was confirmed in the case of Chopin_T57M_A60M treatment. From the above, it can be seen that Chopin9_T57M and Chopin9_T57M_A60M have 76.9% and 69.0% superior subtilisin inhibitory activity than wild type Chopin9, respectively.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those of ordinary skill in the art, it is clear that this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Korea University Research and Buisness Foundation <120> Serine protease inhibitor peptide derived from Choanephora cucurbitarum and mutants thereof <130> DHP18-612 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chopin9 <400> 1 Met Ala Pro Ala Thr Asn Asp Val Leu Thr Val Ser Ser Thr Ala Gln 1 5 10 15 Asn Val Lys Tyr Thr Leu Ser Cys Ser Pro Val Ser Gly Asn His Pro 20 25 30 Tyr Arg Gln Glu Ala Cys Asn Ala Leu Lys Lys Cys Gly Gly Asn Leu 35 40 45 Asp Ala Ile Thr Pro Thr Ser Val Thr Cys Pro Ala Leu Tyr Ala Pro 50 55 60 Val Thr Val Thr Ile Glu Gly Thr Tyr Gly Gly Lys Ala Val Gln Leu 65 70 75 80 Lys Lys Glu Tyr Ser Asn Ala Cys Thr Ala Gln Ala Gln Leu Gly Ser 85 90 95 Ile Ala Arg Leu 100 <210> 2 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chocu_07290 <400> 2 atggcctcct gtcccgagcg tcataccgtt ttagccattg cgtatcataa cgaagatcag 60 gagatccggg cggatacgtt ggtatgcaat ccagtggggg ggacccatcc caatgcaacg 120 gcggcatgtg atcttttgga gtcggtaaat ggtgagcttg acgatattga gccgttggat 180 cgttattgcc ggggaaccga ttattttgca aatgtcacaa tcaagggaac atatgagggc 240 aaacccattg attttaagca caaatacaga aacgggtgtt atgcgttagt gcggttgaag 300 gtgcttgtcg agcattttct tgattacaag tag 333 <210> 3 <211> 353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chocu_09050 <400> 3 atgttcaaat ccgcactttg tttagttgcc agttttgttt tgctggtcag cgcggcaccg 60 gctacaaacg acgtcctgac cgtcagttca accgctcaaa atgtgaaata cacattgtca 120 tgctcgcctg tcagcgggaa ccacccttat cgccaggagg cctgtaatgc tctgaaaaag 180 tgcgggggaa acttagacgc gatcactccc acttcggtaa cgtgtccggc tctgtacgct 240 ccagtgaccg tgaccataga aggtacatac ggcgggaaag cagtacaact gaagaaagaa 300 tatagcaatg cctgtactgc ccaagcacag ttagggtcta ttgcccgcct ttg 353 <210> 4 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chocu_10373 <400> 4 atggcgtcaa agcgggggct taccaacctt actataacag cagaaattga catacggaag 60 gaaattcggt cccttcgctg tagccctact ggcggtgacc atccccaaaa agaagaggct 120 tgtcggcaat taggtcgggc gaatcgggac cttaaaggcc ttcaggaaac cgactgtccg 180 ttcgtcggaa ttcctgtcac cgtgacaatc gaaggaaaac ttagaaacca acctgtcttc 240 ttgaccgaat cctttctggg gtattgcgac gcgatccgtc gctttggcgt agttgttaaa 300 gatgtgttgc ctagttttta tgagtag 327 <210> 5 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial SSI <400> 5 atggatgcgc cttctgctct gtatgcccct agtgctctgg tcttaacagt aggcaaaggt 60 gtatcggcta cgacggccgc gcccgagcgt gcagtgacac tgacttgcgc tcccgggccc 120 tccgggactc atcccgctgc tggttcagct tgtgccgatt tagctgcggt tggaggggat 180 ttgaacgctc ttacacgcgg ggaggatgtg atgtgcccta tggtttacga ccctgtcttg 240 ttgactgttg acggggtttg gcaaggtaag cgtgtttcct atgaacgtgt gttcagtaac 300 gagtgtgaaa tgaatgcaca cgggtcctcc gtttttgcgt tttagtag 348 <210> 6 <211> 301 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pB4_vector <400> 6 mgsshhhhhh gtktgkvwng dkgyngavgk kkdtgkvtvh dkkvaatgdg dwahdrggya 60 sgatdkadky twdavryngk ayavasynkd nktwadkkak gksamnytwa adggyakyng 120 kydkdvgvdn agakagtvdk nkhmnadtdy saaankgtam tngwawsndt skvnygvtvt 180 kgskvgvsag naasnkakny tdgleavnkd kplgavalks yeeelakdpr iaatmenaqk 240 geimpnipqm safwyavrta vinaasgrqt vdealkdaqt gtdydiptte nlyfqggggg 300 g 301 <210> 7 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chopin9 T57M <400> 7 Met Ala Pro Ala Thr Asn Asp Val Leu Thr Val Ser Ser Thr Ala Gln 1 5 10 15 Asn Val Lys Tyr Thr Leu Ser Cys Ser Pro Val Ser Gly Asn His Pro 20 25 30 Tyr Arg Gln Glu Ala Cys Asn Ala Leu Lys Lys Cys Gly Gly Asn Leu 35 40 45 Asp Ala Ile Thr Pro Thr Ser Val Met Cys Pro Ala Leu Tyr Ala Pro 50 55 60 Val Thr Val Thr Ile Glu Gly Thr Tyr Gly Gly Lys Ala Val Gln Leu 65 70 75 80 Lys Lys Glu Tyr Ser Asn Ala Cys Thr Ala Gln Ala Gln Leu Gly Ser 85 90 95 Ile Ala Arg Leu 100 <210> 8 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chopin9_T57M_A60M <400> 8 Met Ala Pro Ala Thr Asn Asp Val Leu Thr Val Ser Ser Thr Ala Gln 1 5 10 15 Asn Val Lys Tyr Thr Leu Ser Cys Ser Pro Val Ser Gly Asn His Pro 20 25 30 Tyr Arg Gln Glu Ala Cys Asn Ala Leu Lys Lys Cys Gly Gly Asn Leu 35 40 45 Asp Ala Ile Thr Pro Thr Ser Val Met Cys Pro Met Leu Tyr Ala Pro 50 55 60 Val Thr Val Thr Ile Glu Gly Thr Tyr Gly Gly Lys Ala Val Gln Leu 65 70 75 80 Lys Lys Glu Tyr Ser Asn Ala Cys Thr Ala Gln Ala Gln Leu Gly Ser 85 90 95 Ile Ala Arg Leu 100 <210> 9 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chopin9_T57M <400> 9 atggcaccgg ctacaaacga cgtcctgacc gtcagttcaa ccgctcaaaa tgtgaaatac 60 acattgtcat gctcgcctgt cagcgggaac cacccttatc gccaggaggc ctgtaatgct 120 ctgaaaaagt gcgggggaaa cttagacgcg atcactccca cttcggtaat gtgtccggct 180 ctgtacgctc cagtgaccgt gaccatagaa ggtacatacg gcgggaaagc agtacaactg 240 aagaaagaat atagcaatgc ctgtactgcc caagcacagt tagggtctat tgcccgcctt 300 tag 303 <210> 10 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chopin9_T57M_A60M <400> 10 atggcaccgg ctacaaacga cgtcctgacc gtcagttcaa ccgctcaaaa tgtgaaatac 60 acattgtcat gctcgcctgt cagcgggaac cacccttatc gccaggaggc ctgtaatgct 120 ctgaaaaagt gcgggggaaa cttagacgcg atcactccca cttcggtaat gtgtccgatg 180 ctgtacgctc cagtgaccgt gaccatagaa ggtacatacg gcgggaaagc agtacaactg 240 aagaaagaat atagcaatgc ctgtactgcc caagcacagt tagggtctat tgcccgcctt 300 tag 303 <110> Korea University Research and Business Foundation <120> Serine protease inhibitor peptide derived from Choanephora cucurbitarum and mutants thereof <130> DHP18-612 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chopin9 <400> 1 Met Ala Pro Ala Thr Asn Asp Val Leu Thr Val Ser Ser Thr Ala Gln 1 5 10 15 Asn Val Lys Tyr Thr Leu Ser Cys Ser Pro Val Ser Gly Asn His Pro 20 25 30 Tyr Arg Gln Glu Ala Cys Asn Ala Leu Lys Lys Cys Gly Gly Asn Leu 35 40 45 Asp Ala Ile Thr Pro Thr Ser Val Thr Cys Pro Ala Leu Tyr Ala Pro 50 55 60 Val Thr Val Thr Ile Glu Gly Thr Tyr Gly Gly Lys Ala Val Gln Leu 65 70 75 80 Lys Lys Glu Tyr Ser Asn Ala Cys Thr Ala Gln Ala Gln Leu Gly Ser 85 90 95 Ile Ala Arg Leu 100 <210> 2 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chocu_07290 <400> 2 atggcctcct gtcccgagcg tcataccgtt ttagccattg cgtatcataa cgaagatcag 60 gagatccggg cggatacgtt ggtatgcaat ccagtggggg ggacccatcc caatgcaacg 120 gcggcatgtg atcttttgga gtcggtaaat ggtgagcttg acgatattga gccgttggat 180 cgttattgcc ggggaaccga ttattttgca aatgtcacaa tcaagggaac atatgagggc 240 aaacccattg attttaagca caaatacaga aacgggtgtt atgcgttagt gcggttgaag 300 gtgcttgtcg agcattttct tgattacaag tag 333 <210> 3 <211> 353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chocu_09050 <400> 3 atgttcaaat ccgcactttg tttagttgcc agttttgttt tgctggtcag cgcggcaccg 60 gctacaaacg acgtcctgac cgtcagttca accgctcaaa atgtgaaata cacatgtca 120 tgctcgcctg tcagcgggaa ccacccttat cgccaggagg cctgtaatgc tctgaaaaag 180 tgcgggggaa acttagacgc gatcactccc acttcggtaa cgtgtccggc tctgtacgct 240 ccagtgaccg tgaccataga aggtacatac ggcgggaaag cagtacaact gaagaaagaa 300 tatagcaatg cctgtactgc ccaagcacag ttagggtcta ttgcccgcct ttg 353 <210> 4 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chocu_10373 <400> 4 atggcgtcaa agcgggggct taccaacctt actataacag cagaaattga catacggaag 60 gaaattcggt cccttcgctg tagccctact ggcggtgacc atccccaaaa agaagaggct 120 tgtcggcaat taggtcgggc gaatcgggac cttaaaggcc ttcaggaaac cgactgtccg 180 ttcgtcggaa ttcctgtcac cgtgacaatc gaaggaaaac ttagaaacca acctgtcttc 240 ttgaccgaat cctttctggg gtattgcgac gcgatccgtc gctttggcgt agttgttaaa 300 gatgtgttgc ctagttttta tgagtag 327 <210> 5 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterial SSI <400> 5 atggatgcgc cttctgctct gtatgcccct agtgctctgg tcttaacagt aggcaaaggt 60 gtatcggcta cgacggccgc gcccgagcgt gcagtgacac tgacttgcgc tcccgggccc 120 tccgggactc atcccgctgc tggttcagct tgtgccgatt tagctgcggt tggaggggat 180 ttgaacgctc ttacacgcgg ggaggatgtg atgtgcccta tggtttacga ccctgtcttg 240 ttgactgttg acggggtttg gcaaggtaag cgtgtttcct atgaacgtgt gttcagtaac 300 gagtgtgaaa tgaatgcaca cgggtcctcc gtttttgcgt tttagtag 348 <210> 6 <211> 301 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pB4_vector <400> 6 mgsshhhhhh gtktgkvwng dkgyngavgk kkdtgkvtvh dkkvaatgdg dwahdrggya 60 sgatdkadky twdavryngk ayavasynkd nktwadkkak gksamnytwa adggyakyng 120 kydkdvgvdn agakagtvdk nkhmnadtdy saaankgtam tngwawsndt skvnygvtvt 180 kgskvgvsag naasnkakny tdgleavnkd kplgavalks yeeelakdpr iaatmenaqk 240 geimpnipqm safwyavrta vinaasgrqt vdealkdaqt gtdydiptte nlyfqggggg 300 g 301 <210> 7 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chopin9 T57M <400> 7 Met Ala Pro Ala Thr Asn Asp Val Leu Thr Val Ser Ser Thr Ala Gln 1 5 10 15 Asn Val Lys Tyr Thr Leu Ser Cys Ser Pro Val Ser Gly Asn His Pro 20 25 30 Tyr Arg Gln Glu Ala Cys Asn Ala Leu Lys Lys Cys Gly Gly Asn Leu 35 40 45 Asp Ala Ile Thr Pro Thr Ser Val Met Cys Pro Ala Leu Tyr Ala Pro 50 55 60 Val Thr Val Thr Ile Glu Gly Thr Tyr Gly Gly Lys Ala Val Gln Leu 65 70 75 80 Lys Lys Glu Tyr Ser Asn Ala Cys Thr Ala Gln Ala Gln Leu Gly Ser 85 90 95 Ile Ala Arg Leu 100 <210> 8 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chopin9_T57M_A60M <400> 8 Met Ala Pro Ala Thr Asn Asp Val Leu Thr Val Ser Ser Thr Ala Gln 1 5 10 15 Asn Val Lys Tyr Thr Leu Ser Cys Ser Pro Val Ser Gly Asn His Pro 20 25 30 Tyr Arg Gln Glu Ala Cys Asn Ala Leu Lys Lys Cys Gly Gly Asn Leu 35 40 45 Asp Ala Ile Thr Pro Thr Ser Val Met Cys Pro Met Leu Tyr Ala Pro 50 55 60 Val Thr Val Thr Ile Glu Gly Thr Tyr Gly Gly Lys Ala Val Gln Leu 65 70 75 80 Lys Lys Glu Tyr Ser Asn Ala Cys Thr Ala Gln Ala Gln Leu Gly Ser 85 90 95 Ile Ala Arg Leu 100 <210> 9 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chopin9_T57M <400> 9 atggcaccgg ctacaaacga cgtcctgacc gtcagttcaa ccgctcaaaa tgtgaaatac 60 acattgtcat gctcgcctgt cagcgggaac cacccttatc gccaggaggc ctgtaatgct 120 ctgaaaaagt gcgggggaaa cttagacgcg atcactccca cttcggtaat gtgtccggct 180 ctgtacgctc cagtgaccgt gaccatagaa ggtacatacg gcgggaaagc agtacaactg 240 aagaaagaat atagcaatgc ctgtactgcc caagcacagt tagggtctat tgcccgcctt 300 tag 303 <210> 10 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chopin9_T57M_A60M <400> 10 atggcaccgg ctacaaacga cgtcctgacc gtcagttcaa ccgctcaaaa tgtgaaatac 60 acattgtcat gctcgcctgt cagcgggaac cacccttatc gccaggaggc ctgtaatgct 120 ctgaaaaagt gcgggggaaa cttagacgcg atcactccca cttcggtaat gtgtccgatg 180 ctgtacgctc cagtgaccgt gaccatagaa ggtacatacg gcgggaaagc agtacaactg 240 aagaaagaat atagcaatgc ctgtactgcc caagcacagt tagggtctat tgcccgcctt 300 tag 303

Claims (12)

코아네포라 쿠쿠르비타룸(Choanephora cucurbitarum) 유래의 펩타이드를 포함하는 세린계 단백질분해효소 저해용 조성물로서,
상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 세린계 단백질분해효소 저해용 조성물.
As a composition for inhibiting serine-based protease comprising a peptide derived from Coanephora cucurbitarum,
The peptide is characterized in that consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, serine-based protease inhibitory composition.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화된 것을 특징으로 하는, 세린계 단백질분해효소 저해용 조성물.
According to claim 1,
The peptide is a serine-based protease inhibitory composition, characterized in that encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
제1항에 있어서,
상기 세린계 단백질분해효소는 서브틸리신(subtilisin)인 것을 특징으로 하는, 세린계 단백질분해효소 저해용 조성물.
According to claim 1,
The serine-based protease is a serine-based protease inhibitory composition, characterized in that the subtilisin (subtilisin).
삭제delete 삭제delete 하기의 단계를 포함하는 세린계 단백질분해효소 저해용 조성물의 제조방법:
(1) 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 재조합 발현 벡터가 주입된 형질전환 세포를 제조하는 단계;
(3) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계;
(4) 상기 형질전환 세포의 배양물을 수득하는 단계; 및
(5) 상기 배양물에서 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드를 분리하는 단계.
A method for preparing a composition for inhibiting serine-based protease comprising the steps of:
(1) preparing a recombinant expression vector comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3;
(2) preparing transformed cells into which the recombinant expression vector is injected;
(3) culturing the transformed cells;
(4) obtaining a culture of the transformed cells; and
(5) isolating the serine-based protease inhibitory peptide from the culture.
코아네포라 쿠쿠르비타룸(Choanephora cucurbitarum) 유래의 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 변이체로서,
상기 변이체는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 변이체.
As a serine-based protease inhibitory peptide variant derived from Coanephora cucurbitarum ( Choanephora cucurbitarum ),
The variant is a serine-based protease inhibitory peptide variant, characterized in that it comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
제7항에 있어서,
상기 변이체는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열에 의해 암호화된 것을 특징으로 하는, 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 변이체.
8. The method of claim 7,
The variant is characterized in that encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10, a serine-based protease inhibitory peptide variant.
제7항에 있어서,
상기 세린계 단백질분해효소는 서브틸리신(subtilisin)인 것을 특징으로 하는, 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 변이체.
8. The method of claim 7,
The serine-based protease is a serine-based protease inhibitory peptide variant, characterized in that the subtilisin (subtilisin).
세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로서,
상기 변이체를 암호화하는 유전자는 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
A recombinant expression vector comprising a gene encoding a serine-based protease inhibitory peptide variant,
The gene encoding the variant is characterized in that it comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10, recombinant expression vector.
제10항의 재조합 발현 벡터가 주입된 형질전환 세포.
A transformed cell into which the recombinant expression vector of claim 10 is injected.
하기의 단계를 포함하는 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 변이체의 제조방법:
(1) 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 재조합 발현 벡터가 주입된 형질전환 세포를 제조하는 단계;
(3) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계;
(4) 상기 형질전환 세포의 배양물을 수득하는 단계; 및
(5) 상기 배양물에서 세린계 단백질분해효소 저해 펩타이드 변이체를 분리하는 단계.A method for preparing a serine-based protease inhibitory peptide variant comprising the steps of:
(1) preparing a recombinant expression vector comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10;
(2) preparing transformed cells into which the recombinant expression vector is injected;
(3) culturing the transformed cells;
(4) obtaining a culture of the transformed cells; and
(5) isolating a serine-based protease inhibitory peptide variant from the culture.

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