KR102308865B1 - Method for assessing Pregnancy Risk of Systemic lupus erythematosus Mother - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전신성 홍반성 루푸스를 포함한 고위험 임산부의 비정상 임신 결과를 예측하기 위한 마커, 이를 이용한 비정상 임신 위험도 평가 방법, 또는 이를 이용한 비정상 임신 진단용 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a marker for predicting abnormal pregnancy outcomes in high-risk pregnant women including systemic lupus erythematosus, a method for evaluating the risk of abnormal pregnancy using the same, or a kit for diagnosing abnormal pregnancy using the same.
Description
본 발명은 전신성 홍반성 루푸스를 포함한 고위험 임산부의 임신 결과를 예측하기 위한 마커, 상기 마커의 선정방법, 상기 마커를 이용한 비정상 임신 예측방법, 상기 마커를 이용한 비정상 임신 진단 방법, 상기 마커를 이용한 비정상 임신 진단을 위한 정보 제공방법, 상기 마커를 이용한 비정상 임신 예측 또는 진단용 조성물, 또는 상기 마커를 이용한 비정상 임신 예측 또는 진단용 키트에 관한 것이다.The present invention provides a marker for predicting the pregnancy outcome of high-risk pregnant women including systemic lupus erythematosus, a method for selecting the marker, a method for predicting an abnormal pregnancy using the marker, a method for diagnosing an abnormal pregnancy using the marker, and an abnormal pregnancy using the marker It relates to a method for providing information for diagnosis, a composition for predicting or diagnosing abnormal pregnancy using the marker, or a kit for predicting or diagnosing abnormal pregnancy using the marker.
전신성 홍반성 루푸스(Systemic lupus erythematosus; SLE)는 자가항체와 면역 복합체에 의한 자가 면역 질환으로 가임기 여성에서 주로 발생한다. 전신성 홍반성 루푸스는 신체의 일부 장기에만 증상이 나타나는 경우도 있으나, 생명을 위협하는 심각한 합병증이 동반되는 경우도 있다. 전신홍반루푸스의 유병률은 인종마다 다르지만, 대략적으로 100,000 명당 5~100명의 유병률을 보이는 것으로 알려져 있다. 대한민국의 경우, 전신성 홍반성 루푸스는 희귀난치성 질환으로 분류되어 있는데, 최근 그 빈도가 점점 증가하고 있으며, 환자 수가 2004년 15,000 명에서 2009년 20,000 명 정도로 추정되었다.Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease caused by autoantibodies and immune complexes, mainly occurring in women of childbearing age. Systemic lupus erythematosus may have symptoms only in some organs of the body, but it may be accompanied by serious, life-threatening complications. Although the prevalence of systemic lupus erythematosus varies by race, it is known that the prevalence is approximately 5-100 per 100,000 people. In the case of Korea, systemic lupus erythematosus is classified as a rare and incurable disease, and its frequency has been increasing recently, and the number of patients was estimated from 15,000 in 2004 to 20,000 in 2009.
SLE 산모는 다음과 같은 문제가 발생할 수 있다. (1) 임신 중 전신홍반루푸스의 악화: 루푸스 환자가 임신을 하면, 1/3 정도는 질환의 경과가 호전되고, 1/3 정도는 변화가 없으며, 1/3 정도는 악화된다고 알려져 있다. (2) 임신 합병증, 태아 또는 신생아 합병증이 발생할 수 있다. 예를 들어, 산모 합병증으로 신장염, 정맥혈전 색전증, 임신중독증 등의 합병증이 증가할 수 있다. 예를 들어, 태아 합병증으로 유산, 자궁내 태아 사망, 자궁내발육지연, 조산 등이 발생할 수 있다. 예를 들어, 신생아 합병증으로 저출생아, 신생아 전신홍반루푸스, 부정맥 등이 발생할 수 있다.SLE mothers may experience the following problems: (1) Exacerbation of systemic lupus erythematosus during pregnancy: It is known that when a lupus patient becomes pregnant, the course of the disease improves in about one-third, there is no change in about one-third, and worsens in about one-third. (2) Pregnancy complications, fetal or neonatal complications may occur. For example, complications such as nephritis, venous thromboembolism, and preeclampsia may increase as maternal complications. For example, fetal complications can include miscarriage, intrauterine fetal death, intrauterine growth retardation, and premature birth. For example, neonatal complications such as low birthrate, neonatal systemic lupus erythematosus, and arrhythmia may occur.
한편, 대사체학(metabolomics)은 혈액에 존재하는 대사체(metabolites) 들을 분석, 연구하는 학문으로 정의한다. 많은 질병이 유전자와는 무관하게 대사체의 변화, 단백질의 misfolding, interaction, malfunctioning 등에 의한 경우가 있기 때문에 대사체학의 중요성이 부각되고 있다. 대사체학은 혈액 내 전대사체(metabolome)를 비표적적인(Un-targeted) 방식으로 분석하는 접근방법이며, 유전적 차이나 환경적 변화에 대한 차이를 효율적으로 규명할 수 있어, 대사체학을 활용한 질병의 발병 예측 및 진단에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 그러나, 대사체를 이용하여 루푸스 환자의 정상 임신과 비정상 임신을 감별 진단하는 연구는 아직 이루어지지 않은 상태이다.Meanwhile, metabolomics is defined as the study that analyzes and studies metabolites present in blood. Since many diseases are caused by metabolite changes, protein misfolding, interaction, and malfunctioning regardless of genes, the importance of metabolomics is emerging. Metabolomics is an approach that analyzes the entire metabolome in the blood in an un-targeted way, and it can efficiently identify differences in genetic or environmental changes, so diseases using metabolomics A lot of research on the prediction and diagnosis of the onset of However, a study to differentially diagnose a normal pregnancy and an abnormal pregnancy in lupus patients using metabolites has not yet been conducted.
이에, 본 발명자들은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 전신성 홍반성 루푸스 산모의 정상 임신과 비정상 임신을 판별하기 위한 마커, 및 전신성 홍반성 루푸스 산모의 정상 임신과 비정상 임신을 판별하는 방법을 개발하고자 하였다. 그 결과, 본 발명의 일 예에 따른 비정상 임신을 예측하기 위한 마커 검출 방법을 토대로, 본원 실시예 1 내지 3에서 비정상 임신 예측용 마커를 검출하여, 혈액 내 대사체인 트립토판 (Tryptophan)과 리소포스파티딜콜린 C22:5 (LysoPC C22:5)의 발현 수준 차이를 이용하여 정상 임신과 비정상 임신을 신속 정확하게 진단할 수 있음을 본원 실시예 4에서 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.Therefore, in order to solve the problems of the prior art as described above, the present inventors have a marker for discriminating between normal and abnormal pregnancy of systemic lupus erythematosus mothers, and a marker for discriminating normal and abnormal pregnancy of systemic lupus erythematosus mothers. I wanted to develop a method. As a result, based on the marker detection method for predicting abnormal pregnancy according to an embodiment of the present invention, by detecting the marker for predicting abnormal pregnancy in Examples 1 to 3 of the present application, tryptophan and lysophosphatidylcholine C22, which are metabolites in blood By using the difference in the expression level of :5 (LysoPC C22:5), it was confirmed in Example 4 of the present application that a normal pregnancy and an abnormal pregnancy could be quickly and accurately diagnosed, thereby completing the present invention.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 비정상 임신 예측용 마커에 부여된 가중치에 의해 비정상 임신을 매우 성공적으로 판별할 수 있음을 본원 실시예 4와 비교예 1 및 비교예 2의 결과를 비교함으로서 확인할 수 있었다.In addition, it can be confirmed by comparing the results of Example 4 of the present application with Comparative Examples 1 and 2 that abnormal pregnancy can be very successfully determined by the weight assigned to the marker for predicting abnormal pregnancy according to an example of the present invention. there was.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은, 전신성 홍반성 루푸스를 포함한 고위험 임산부의 임신 결과를 예측하기 위한 마커, 상기 마커의 검출 방법, 상기 마커를 이용한 비정상 임신 위험도 평가 방법, 상기 마커를 이용한 비정상 임신 진단 방법, 또는 상기 마커를 이용한 비정상 임신 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.Accordingly, one object of the present invention is to provide a marker for predicting the pregnancy outcome of high-risk pregnant women including systemic lupus erythematosus, a method for detecting the marker, a method for evaluating the risk of abnormal pregnancy using the marker, and diagnosis of abnormal pregnancy using the marker To provide a method, or a method for providing information for diagnosing an abnormal pregnancy using the marker.
본 발명의 또 다른 목적은, 혈액 내 대사체의 수준 변화를 이용하여 전신성 홍반성 루푸스 환자의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 방법, 비정상 임신 진단방법, 또는 비정상 임신을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide information for diagnosing a method for diagnosing an abnormal pregnancy, a method for diagnosing an abnormal pregnancy, or a method for evaluating the risk of abnormal pregnancy in a patient with systemic lupus erythematosus using a change in the level of a metabolite in the blood. is to provide
본 발명의 또 다른 목적은, 혈액 내 대사체의 수준변화를 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 전신성 홍반성 루푸스 환자의 비정상 임신 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing abnormal pregnancy in patients with systemic lupus erythematosus, which includes an agent capable of measuring changes in the level of metabolites in the blood.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 비정상 임신 진단용 키트를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing abnormal pregnancy comprising the composition.
본 발명의 일 예는, 시험 산모에서 분리된 생물학적 시료에서 리소포스파티딜콜린 및 트립토판 수준을 정량하는 단계; 및 상기 리소포스파티딜콜린 및 트립토판 수준을 이용하여 상기 시험 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 단계를 포함하는, 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 방법, 비정상 임신 진단 방법, 또는 비정상 임신을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 상기 시험 산모는 전신성 홍반성 루푸스(Systemic lupus erythematosus, SLE)을 갖는 산모일 수 있다.An example of the present invention, quantifying the levels of lysophosphatidylcholine and tryptophan in a biological sample isolated from the test mother; and using the lysophosphatidylcholine and tryptophan levels to evaluate the risk of abnormal pregnancy of the test mother. about how to provide The test mother may be a mother with systemic lupus erythematosus (SLE).
본 발명의 또 다른 일 예는, 정상 임신을 한 산모의 생물학적 시료와 비정상 임신을 한 산모의 생물학적 시료를 준비하는 단계; 상기 정상 임신 산모의 생물학적 시료와 상기 비정상 임신 산모의 생물학적 시료 내의 대사체 분포를 비교하는 단계; 및 상기 정상 임신 산모의 생물학적 시료와 상기 비정상 임신 산모의 생물학적 시료에서 유의한 차이를 보이는 대사체를 선정하는 단계를 포함하는, 산모의 비정상 임신 예측용 마커 검출 방법에 관한 것이다. 상기 시험 산모는 전신성 홍반성 루푸스(Systemic lupus erythematosus, SLE)을 갖는 산모일 수 있다.Another embodiment of the present invention comprises the steps of: preparing a biological sample of a mother who has a normal pregnancy and a biological sample of a mother who has an abnormal pregnancy; comparing the distribution of metabolites in the biological sample of the normal pregnant mother and the biological sample of the abnormal pregnant mother; and selecting a metabolite showing a significant difference between the biological sample of the normal pregnant mother and the biological sample of the abnormal pregnant mother, and relates to a method for detecting a marker for predicting abnormal pregnancy of a mother. The test mother may be a mother with systemic lupus erythematosus (SLE).
본 발명의 또 다른 일 예는, 전신성 홍반성 루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE) 산모에서 분리된 생물학적 시료에서 리소포스파티딜콜린 및 트립토판 수준을 정량할 수 있는 제제를 포함하는, 비정상 임신 예측 또는 진단용 조성물, 또는 비정상 임신 예측용 또는 진단용 키트에 관한 것이다.Another embodiment of the present invention is a composition for predicting or diagnosing abnormal pregnancy, including an agent capable of quantifying the levels of lysophosphatidylcholine and tryptophan in a biological sample isolated from a systemic lupus erythematosus (SLE) mother, or It relates to a kit for predicting or diagnosing abnormal pregnancy.
이하, 본 발명을 자세하게 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일예에 의하면, 시험 산모에서 분리된 생물학적 시료에서 리소포스파티딜콜린 및 트립토판 수준을 정량하는 단계; 및 상기 리소포스파티딜콜린 및 트립토판 수준을 이용하여 상기 시험 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 단계를 포함하는, 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 방법, 비정상 임신 진단 방법, 또는 비정상 임신을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 상기 산모는 전신성 홍반성 루푸스 산모일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 가래, 질액, 침, 땀, 눈물, 뇌척수액, 및 양수액으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, quantifying the levels of lysophosphatidylcholine and tryptophan in a biological sample isolated from the test mother; and using the lysophosphatidylcholine and tryptophan levels to evaluate the risk of abnormal pregnancy of the test mother. about how to provide The mother may be a mother with systemic lupus erythematosus. The biological sample may be at least one selected from the group consisting of blood, plasma, serum, urine, saliva, sputum, vaginal fluid, saliva, sweat, tears, cerebrospinal fluid, and amniotic fluid.
상기 전신성 홍반성 루푸스(Systemic lupus erythematosus)는, “루푸스”라고도 호칭되며, 만성 염증성 자가면역질환으로 결합조직과 피부, 관절, 혈액, 신장 등 신체의 다양한 기관을 침범하는 전신성 질환을 의미한다. 루푸스의 정확한 원인은 알려져 있지 않으나, 그간의 연구에 의하면 유전적 요인이 이 병의 발생과 연관이 되어 있다고 알려져 있다. 여성이 남성보다 10-15배 많이 발병하고, 주로 사춘기를 지나서 발병하며, 생리 시작이나 임신 중에 루푸스 증상이 일부 심해지는 것으로 보아 여성호르몬인 에스트로겐이 루푸스 발생과 밀접한 관계가 있을 것이라 추측된다. 미국류마티스학회(American College of Rheumatology: ACR)는 루푸스를 진단하는데 도움을 주기 위해 다른 질병과의 감별에 도움이 되는 11가지 증상, 징후 및 검사소견을 발표하였고, 11가지 항목 중 4가지 이상이 나타나면 루푸스로 진단을 내린다.The systemic lupus erythematosus, also called "lupus", is a chronic inflammatory autoimmune disease that refers to a systemic disease that invades various organs of the body, such as connective tissue, skin, joints, blood, and kidneys. Although the exact cause of lupus is not known, it is known that genetic factors are associated with the development of the disease according to previous studies. It is estimated that estrogen, the female hormone, is closely related to the occurrence of lupus, as it occurs 10-15 times more often in women than in men, and mainly occurs after puberty, and some of the symptoms of lupus worsen during menstruation or during pregnancy. The American College of Rheumatology (ACR) has published 11 symptoms, signs, and test findings that help differentiate it from other diseases to help diagnose lupus. Diagnosed with lupus.
본 명세서에서 사용되는 용어, "임신"이란, 난자와 정자의 결합으로 만들어진 수정란이 자궁에 착상하여 태아로 발육하는 과정을 의미한다.As used herein, the term “pregnancy” refers to a process in which a fertilized egg made by combining an egg and a sperm is implanted in the uterus and developed into a fetus.
본 명세서에서 사용되는 용어, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 과정을 의미한다.As used herein, the term "diagnosis" refers to a process of confirming the presence or characteristics of a pathological condition.
본 명세서에서 사용되는 용어, “수준 차이”는, 생물학적 시료 내에서의 특정 대사체의 수준이, 비교하고자 하는 그룹 간에서 높거나 혹은 낮은 것을 의미한다. 예를 들어, 시험 산모에서 분리된 생물학적 시료에서 특정 대사체의 수준이 높다 (낮다)는 것은, 정상 임신 산모에서 분리된 생물학적 시료 내의 상기 대사체 수준보다 상기 시험 산모에서 분리된 생물학적 시료에서 상기 특정 대사체의 수준이 더 높게 (낮게) 검출되는 것을 의미한다.As used herein, the term “level difference” means that the level of a specific metabolite in a biological sample is high or low between groups to be compared. For example, a higher (lower) level of a particular metabolite in a biological sample isolated from the test mother indicates that the specific metabolite level in the biological sample isolated from the test mother is higher than the level of the metabolite in the biological sample isolated from the normal pregnant mother. It means that higher (lower) levels of metabolites are detected.
상기 비정상 임신의 위험도를 평가하는 단계는, 상기 시험 산모의 시료 내 리소포스파티딜콜린의 수준이 정상 임신 SLE 산모에 비해 높은 경우, 상기 시험 산모는 비정상 임신의 위험도가 있는 것으로 결정하는 것으로 수행되는 것일 수 있다The step of assessing the risk of abnormal pregnancy, when the level of lysophosphatidylcholine in the sample of the test mother is higher than that of the SLE mother of normal pregnancy, determining that the test mother has the risk of abnormal pregnancy It may be performed.
상기 비정상 임신의 위험도를 평가하는 단계는, 상기 시험 산모의 시료 내 트립토판의 수준이 정상 임신 SLE 산모에 비해 낮은 경우, 상기 시험 산모는 비정상 임신의 위험도가 있는 것으로 결정하는 것으로 수행되는 것일 수 있다.The step of evaluating the risk of abnormal pregnancy may be performed by determining that the test mother has a risk of abnormal pregnancy when the level of tryptophan in the sample of the test mother is lower than that of the SLE mother of normal pregnancy.
상기 비정상 임신을 한 산모는, 정상적이지 않은 임신 과정을 겪었거나 겪고 있는 산모, 또는 정상적이지 않은 출산을 한 산모를 의미하며, 통상의 기술자라면 정상 임신과 구별되는 비정상 임신을 명확하게 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 상기 비정상 임신을 한 산모는, 임신중독증, 자궁 내 태아 사망, 태아 출생 후 1개월 내 신생아 사망, 출생체중 5 percentile 미만의 주수에 비해 저체중 태아의 출산, 조산, 및 36주 이전의 조산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 상태 또는 증상을 가지는 것일 수 있으나, 구체적인 상태 또는 증상으로 특정되지 않더라도 통상의 기술자는 정상 임신과 구별되는 비정상 임신을 명확하게 구별할 수 있을 것이다.The mother who has an abnormal pregnancy means a mother who has undergone or is undergoing an abnormal pregnancy process, or a mother who has given an abnormal birth, and those skilled in the art will clearly understand the abnormal pregnancy as distinguished from a normal pregnancy. . For example, the mother who has an abnormal pregnancy may have preeclampsia, intrauterine fetal death, neonatal death within 1 month after fetal birth, low birth weight compared to weeks less than 5 percentile of birth weight, premature birth, and prior to 36 weeks It may be one having one or more conditions or symptoms selected from the group consisting of premature birth, but even if it is not specified as a specific condition or symptom, a person skilled in the art will be able to clearly distinguish abnormal pregnancy from normal pregnancy.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 비정상 임신은 적어도 2단계 이상의 위험도로 구별되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 비정상 임신은 중등 비정상 임신 (Moderate adverse pregnancy outcome)과 중증 비정상임신 (Severe adverse pregnancy outcome)으로 구별될 수 있으며, 통상의 기술자는 비정상 임신의 정도에 따라 중등 비정상 임신과 중증 비정상 임신을 명확하게 구별할 수 있을 것이다.According to an example of the present invention, the abnormal pregnancy may be distinguished by at least two or more stages of risk. For example, the abnormal pregnancy can be divided into a moderate adverse pregnancy outcome and a severe adverse pregnancy outcome, and the skilled artisan can determine a moderate adverse pregnancy outcome and a severe abnormal pregnancy according to the degree of the abnormal pregnancy. can be clearly distinguished.
일예로, 상기 중증 비정상 임신은 자궁 내 태아 사망, 임신 34주 이전에 분만하게 된 임신중독증, 임신 30주 이전에 적응증에 의한 조산, 및 신생아 사망으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 상태 또는 증상을 가지는 것일 수 있으며, 통상의 기술자는 이와 동등한 수준의 예후를 보이는 산모를 중증 비정상 임신으로 명확히 구별할 수 있을 것이다.For example, the severe abnormal pregnancy is one or more conditions or symptoms selected from the group consisting of intrauterine fetal death, preeclampsia delivered before 34 weeks of pregnancy, premature birth due to indications before 30 weeks of pregnancy, and neonatal death. It may be one, and a person skilled in the art will be able to clearly distinguish a mother with a prognosis equivalent to this from a severe abnormal pregnancy.
일예로, 상기 중등 비정상 임신은 임신 34주 이후에 분만하게 된 임신중독증, 임신 30주 내지 36주 사이의 적응증에 의한 조산, 및 출생체중 5 percentile 미만의 저체중 태아 출생으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 상태 또는 증상을 가지는 것일 수 있으며, 통상의 기술자는 이와 동등한 수준의 예후를 보이는 산모를 중등 비정상 임신으로 명확히 구별할 수 있을 것이다.For example, the secondary abnormal pregnancy is one or more selected from the group consisting of preeclampsia, which was delivered after 34 weeks of pregnancy, premature delivery due to indications between 30 and 36 weeks of pregnancy, and low-weight fetal birth with less than 5 percentile of birth weight. It may be one having a condition or symptoms, and a person skilled in the art will be able to clearly distinguish a mother with a prognosis equivalent to this as a moderately abnormal pregnancy.
상기 시험 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 단계는, 상기 리소포스파티딜콜린 및 트립토판 수준이 비정상 임신의 위험도에 미치는 정도를 고려하여, 상기 리소포스파티딜콜린 및 트립토판 수준에 가중치를 부여하여 상기 위험도를 평가하는 것일 수 있다. 상기 가중치는 리소포스파티딜콜린 또는 트립토판이 비정상 임신의 위험도에 미치는 영향력을 고려하여 각 변수에 가중치를 부여하여 비정상 임신의 위험도를 예측하는 것이며, 상기 가중치는 최대 가능성우도 추정 (maximum likelihood estimation), 도구변수추정 (instrumental variable estimation), 보통최소제곱추정 (ordinary least square estimation), 비선형 최소제곱추정 (non-linear least square estimation), 반복가중최소제곱 (iterative weighted least square estimation), 제한된 최대우도추정 (restricted maximum likelihood estimation), 및 미분방정식을 사용하지 않는 제한최대우도추정 (derivative-free restricted maximum likelihood estimation)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 부여되는 것일 수 있다. 일예로, 상기 리소포스파티딜콜린은 1816.18의 가중치가 부여될 수 있고, 상기 트립토판은 -416.57의 가중치가 부여될 수 있다.The step of evaluating the risk of abnormal pregnancy of the test mother may be to evaluate the risk by weighting the lysophosphatidylcholine and tryptophan levels in consideration of the degree to which the lysophosphatidylcholine and tryptophan levels affect the risk of abnormal pregnancy. have. The weight is to predict the risk of abnormal pregnancy by assigning a weight to each variable in consideration of the influence of lysophosphatidylcholine or tryptophan on the risk of abnormal pregnancy, and the weight is maximum likelihood estimation, instrumental variable estimation (instrumental variable estimation), ordinary least squares estimation, non-linear least squares estimation, iterative weighted least squares estimation, restricted maximum likelihood estimation It may be assigned by one or more methods selected from the group consisting of estimation) and derivative-free restricted maximum likelihood estimation without using a differential equation. For example, the lysophosphatidylcholine may be given a weight of 1816.18, and the tryptophan may be given a weight of -416.57.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 시험 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 단계는 하기 수학식 1에 의해 정량적으로 평가되는 것일 수 있다:According to an example of the present invention, the step of evaluating the risk of abnormal pregnancy of the test mother may be quantitatively evaluated by
[수학식 1][Equation 1]
비정상 임신의 위험도 = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)Risk of Abnormal Pregnancy = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)
LysoPC C22:5 : 시료 내 대사체 중 리소포스파티딜콜린 수준의 정량값으로서, 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값LysoPC C22:5: A quantitative value of the level of lysophosphatidylcholine among metabolites in the sample, a relative quantitative value when the sum of the peak areas of all detected metabolites is set to 1.
Tryptophan : 시료 내 대사체 중 트립토판 수준의 정량값으로서, 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값Tryptophan: A quantitative value of the tryptophan level among metabolites in the sample, a relative quantitative value when the sum of the peak areas of all detected metabolites is set to 1.
상기 비정상 임신의 위험도는 적어도 2단계 이상의 위험도로 구별되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 비정상 임신은 중등 비정상 임신 (Moderate adverse pregnancy outcome)과 중증 비정상임신 (Severe adverse pregnancy outcome)으로 구별될 수 있으며, 통상의 기술자는 비정상 임신의 정도에 따라 중등 비정상 임신과 중증 비정상 임신을 명확하게 구별할 수 있을 것이다.The risk of the abnormal pregnancy may be distinguished from the risk of at least two or more stages. For example, the abnormal pregnancy can be divided into a moderate adverse pregnancy outcome and a severe adverse pregnancy outcome, and the skilled artisan can determine a moderate adverse pregnancy outcome and a severe abnormal pregnancy according to the degree of the abnormal pregnancy. can be clearly distinguished.
일예로, 상기 수학식 1에 의해 정량적으로 평가된 비정상 임신의 위험도가 -2.37 미만일 경우 정상 임신으로 예측하고, 상기 비정상 임신의 위험도가 -2.37 이상일 경우 비정상 임신으로 예측되는 것일 수 있다.For example, when the risk of abnormal pregnancy quantitatively evaluated by
일예로, 상기 수학식 1에 의해 정량적으로 평가된 비정상 임신의 위험도가 -2.37 미만일 경우 정상 임신으로 예측하고, 상기 비정상 임신의 위험도가 -2.37 내지 0.26일 경우 중등 비정상 임신으로 예측하며, 상기 비정상 임신의 위험도가 0.26 초과일 경우 중증 비정상임신으로 예측하는 것일 수 있다.For example, when the risk of abnormal pregnancy quantitatively evaluated by
본 발명의 일 예에 따른 전신성 홍반성 루푸스 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 방법, 비정상 임신의 예측 방법, 비정상 임신 진단 방법, 또는 비정상 임신을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법은, 통계적으로 유의미하게 전신 홍반 루푸스 산모의 정상 임신과 비정상 임신을 구별하는 것일 수 있다.A method for estimating the risk of abnormal pregnancy in a mother with systemic lupus erythematosus according to an embodiment of the present invention, a method for predicting an abnormal pregnancy, a method for diagnosing an abnormal pregnancy, or a method for providing information for diagnosing an abnormal pregnancy are statistically significant It may be to differentiate between normal and abnormal pregnancies in mothers with systemic lupus erythematosus.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 전신성 홍반성 루푸스 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 방법, 비정상 임신의 예측 방법, 비정상 임신 진단 방법, 또는 비정상 임신을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법은, AUC (Area under the curve) 값이 0.84 이상, 0.85 이상, 0.9 이상, 0.91 이상, 0.92 이상, 0.93 이상, 또는 0.94 이상일 수 있으며, 이때 상기 AUC 값의 상한값이 특정되지 않더라도 통상의 기술자가 명확하게 본 발명을 실시할 수 있을 것이며, 일예로 상기 AUC 값의 상한값은 1 이하, 1 미만, 0.9999 이하, 0.999 이하, 0.995 이하, 0.99 이하, 0.98 이하, 0.97 이하, 0.96 이하, 또는 0.95 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For example, a method of evaluating the risk of abnormal pregnancy in a mother with systemic lupus erythematosus according to an embodiment of the present invention, a method of predicting an abnormal pregnancy, a method of diagnosing an abnormal pregnancy, or a method of providing information for diagnosing an abnormal pregnancy , AUC (Area under the curve) value may be 0.84 or more, 0.85 or more, 0.9 or more, 0.91 or more, 0.92 or more, 0.93 or more, or 0.94 or more. The present invention may be practiced, and as an example, the upper limit of the AUC value may be 1 or less, 1 or less, 0.9999 or less, 0.999 or less, 0.995 or less, 0.99 or less, 0.98 or less, 0.97 or less, 0.96 or less, or 0.95 or less, However, the present invention is not limited thereto.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 전신성 홍반성 루푸스 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 방법, 비정상 임신의 예측 방법, 비정상 임신 진단 방법, 또는 비정상 임신을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법은, 특이도 (specificity) 값이 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상일 수 있으며, 이때 상기 특이도 값의 상한값이 특정되지 않더라도 통상의 기술자가 명확하게 본 발명을 실시할 수 있을 것이며, 일예로 상기 특이도 값의 상한값은 100% 이하, 100% 미만, 99.999% 이하, 99.99% 이하, 99.9% 이하, 99.5% 이하, 99% 이하, 98% 이하, 97% 이하, 또는 96% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For example, a method of evaluating the risk of abnormal pregnancy in a mother with systemic lupus erythematosus according to an embodiment of the present invention, a method of predicting an abnormal pregnancy, a method of diagnosing an abnormal pregnancy, or a method of providing information for diagnosing an abnormal pregnancy , a specificity value of 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, or 95% or more, wherein the specificity Even if the upper limit of the degree value is not specified, those skilled in the art will be able to clearly practice the present invention, for example, the upper limit of the specificity value is 100% or less, less than 100%, 99.999% or less, 99.99% or less, 99.9% or less, 99.5% or less, 99% or less, 98% or less, 97% or less, or 96% or less, but is not limited thereto.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 전신성 홍반성 루푸스 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 방법, 비정상 임신의 예측 방법, 비정상 임신 진단 방법, 또는 비정상 임신을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법은, 민감도 (sensitivity) 값이 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 또는 83% 이상일 수 있으며, 이때 상기 민감도 값의 상한값이 특정되지 않더라도 통상의 기술자가 명확하게 본 발명을 실시할 수 있을 것이며, 일예로 상기 민감도 값의 상한값은 100% 이하, 100% 미만, 99.999% 이하, 99.99% 이하, 99.9% 이하, 99.5% 이하, 99% 이하, 98% 이하, 97% 이하, 96% 이하, 95% 이하, 94% 이하, 93% 이하, 92% 이하, 91% 이하, 90% 이하, 89% 이하, 88% 이하, 87% 이하, 86% 이하, 85% 이하, 또는 85% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For example, a method of evaluating the risk of abnormal pregnancy in a mother with systemic lupus erythematosus according to an embodiment of the present invention, a method of predicting an abnormal pregnancy, a method of diagnosing an abnormal pregnancy, or a method of providing information for diagnosing an abnormal pregnancy , the sensitivity value may be 80% or more, 81% or more, 82% or more, or 83% or more, and at this time, even if the upper limit of the sensitivity value is not specified, those skilled in the art will be able to clearly practice the present invention , for example, the upper limit of the sensitivity value is 100% or less, 100% or less, 99.999% or less, 99.99% or less, 99.9% or less, 99.5% or less, 99% or less, 98% or less, 97% or less, 96% or less, 95 % or less, 94% or less, 93% or less, 92% or less, 91% or less, 90% or less, 89% or less, 88% or less, 87% or less, 86% or less, 85% or less, or 85% or less, However, the present invention is not limited thereto.
예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 전신성 홍반성 루푸스 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 방법, 비정상 임신의 예측 방법, 비정상 임신 진단 방법, 또는 비정상 임신을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법은, 위양성 (false positive)률이 낮은 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어 위양성률이 50% 미만, 45% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 9% 이하일 수 있다.For example, a method of evaluating the risk of abnormal pregnancy in a mother with systemic lupus erythematosus according to an embodiment of the present invention, a method of predicting an abnormal pregnancy, a method of diagnosing an abnormal pregnancy, or a method of providing information for diagnosing an abnormal pregnancy , may be characterized by a low false positive rate, for example, a false positive rate of less than 50%, less than 45%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, less than 15%, less than 10%, or 9% or less.
일예로, 본 발명의 일 예에 따른 전신성 홍반성 루푸스 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 방법, 비정상 임신의 예측 방법, 비정상 임신 진단 방법, 또는 비정상 임신을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법은, AUC (Area under the curve) 값이 0.9 이상, 특이도 (specificity) 값이 90% 이상, 또는 민감도 (sensitivity) 값이 80% 이상으로 정확하게 전신 홍반 루푸스 산모의 임신 예후를 예측할 수 있다.As an example, a method of evaluating the risk of abnormal pregnancy in a mother with systemic lupus erythematosus according to an embodiment of the present invention, a method of predicting an abnormal pregnancy, a method of diagnosing an abnormal pregnancy, or a method of providing information for diagnosing an abnormal pregnancy, If the AUC (Area under the curve) value is 0.9 or more, the specificity value is 90% or more, or the sensitivity value is 80% or more, it is possible to accurately predict the pregnancy prognosis of a mother with systemic lupus erythematosus.
본 발명의 일 예는 정상 임신을 한 산모의 생물학적 시료와 비정상 임신을 한 산모의 생물학적 시료를 준비하는 단계; 상기 정상 임신 산모의 생물학적 시료와 상기 비정상 임신 산모의 생물학적 시료 내의 대사체 분포를 비교하는 단계; 및 상기 정상 임신 산모의 생물학적 시료와 상기 비정상 임신 산모의 생물학적 시료에서 유의한 차이를 보이는 대사체를 선정하는 단계를 포함하는, 산모의 비정상 임신 예측용 마커 검출 방법에 관한 것이다. 상기 산모는 전신성 홍반성 루푸스 산모일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 가래, 질액, 침, 땀, 눈물, 뇌척수액, 및 양수액으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.An example of the present invention comprises the steps of preparing a biological sample of a mother having a normal pregnancy and a biological sample of a mother having an abnormal pregnancy; comparing the distribution of metabolites in the biological sample of the normal pregnant mother and the biological sample of the abnormal pregnant mother; and selecting a metabolite showing a significant difference between the biological sample of the normal pregnant mother and the biological sample of the abnormal pregnant mother, and relates to a method for detecting a marker for predicting abnormal pregnancy of a mother. The mother may be a mother with systemic lupus erythematosus. The biological sample may be at least one selected from the group consisting of blood, plasma, serum, urine, saliva, sputum, vaginal fluid, saliva, sweat, tears, cerebrospinal fluid, and amniotic fluid.
상기 전신성 홍반성 루푸스는 전술한 바와 같다.The systemic lupus erythematosus is the same as described above.
상기 비정상 임신은 전술한 바와 같다. 상기 비정상 임신은 적어도 2단계 이상의 위험도로 구별되는 것일 수 있으며, 예를 들어 중등 비정상 임신 (Moderate adverse pregnancy outcome)과 중증 비정상임신 (Severe adverse pregnancy outcome)으로 구별될 수 있으며, 상기 중등 비정상 임신과 상기 중증 비정상 임신은 전술한 바와 같다.The abnormal pregnancy is as described above. The abnormal pregnancy may be one that is distinguished by the risk of at least two or more stages, for example, it can be distinguished into a moderate adverse pregnancy outcome and a severe adverse pregnancy outcome, and the moderate adverse pregnancy outcome and the Severe abnormal pregnancy is as described above.
본 발명의 일 예에 따르면, 상기 정상 임신 산모의 생물학적 시료와 상기 비정상 임신 산모의 생물학적 시료에서 유의한 차이를 보이는 대사체를 선정하는 단계는, 정상 임신 산모와 비정상 임신 산모의 생물학적 시료 내의 대사체 분포를 비교하여 유의한 차이를 보이는 대사체를 선정하는 단계로, 예를 들면 주성분분석(principal component analysis, PCA), 부분최소자승판별 (partial least squares discriminant analysis, PLS-DA) 분석, 분산분석 (Analysis of variance, ANOVA), 및 이분형 로지스틱 회귀분석(binary logistic regression analysis) 으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 상기 대사체를 선정할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the step of selecting a metabolite showing a significant difference between the biological sample of the normal pregnant mother and the biological sample of the abnormal pregnant mother includes the metabolites in the biological sample of the normal pregnant mother and the abnormal pregnant mother. This is a step in which a metabolite with a significant difference is selected by comparing the distribution. For example, principal component analysis (PCA), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) analysis, analysis of variance ( The metabolite may be selected by at least one method selected from the group consisting of Analysis of variance (ANOVA), and binary logistic regression analysis.
상기 대사체는 대사에서 사용되는 임의의 분자를 포함한다. 대사체는 생성물, 기질, 또는 대사 과정 동안의 중간체일 수 있다. 상기 대사체에는 1차 대사물질, 2차 대사물질, 유기 대사물질 또는 무기 대사물질이 포함된다. 상기 대사체는 아미노산, 펩티드, 아실카르니틴, 모노사카라이드, 지질 및 인지질, 프로스타글란딘, 히드록시에이코사테트라엔산, 히드록시옥타데카디엔산, 스테로이드, 담즙산, 및 당지질 및 인지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 대사체는 스핑고지질, 당스핑고지질, 스핑고신, 세라미드, 스핑고마이엘린, 스핑고실포스포릴콜린, 디히드로스핑고신, 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜이노시톨, 리소포스파티딜세린, 플라스메닐포스파티딜콜린, 플라스마닐포스파티딜콜린, 단백질성 아미노산, 알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 류신, 이소류신, 리신, 메티오닌, 프롤린, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 티로신, 비대칭적 디메틸 아르기닌, 대칭적 디메틸 아르기닌, 글루타민, 아스파라진, 니트로티로신, 히드록시프롤린, 키누레닌, 3-히드록시 키누레닌, 비-단백질성 아미노산, 오르니틴, 시트룰린, 아실카르니틴, 카르니틴, 유리 카르니틴, 아실카르니틴, 히드록실아실카르니틴, 디카르복실아실카르니틴, 환원 모노사카라이드, 헥소스, 펜토스, 데옥시헥소스, 크레아티닌, 크레아틴, 스페르미딘 스페르민, 푸트레신, 도파민, 세로토닌, 프로스타글란딘, 히드록시에이코사테트라에노산, 히드록시옥타데카디엔산, 류코트리엔, 트롬복산, 담즙산, 스테롤, 콜레스테롤, 비타민 및 보조인자, 약물, 및 약물 대사물질일 수 있다. 일예로, 상기 대사체는 리소포스파티딜콜린 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 대사체 중 정상 임신 산모의 생물학적 시료와 비정상 임신 산모의 생물학적 시료에서 유의한 차이를 보이는 경우, 비정상 임신과 정상 임신을 구별하기 위한 마커 (marker)로 선정될 수 있다. 예를 들어, 상기 선정된 대사체는 리소포스파티딜콜린 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.Such metabolites include any molecule used in metabolism. A metabolite may be a product, a substrate, or an intermediate during a metabolic process. The metabolites include primary metabolites, secondary metabolites, organic metabolites or inorganic metabolites. Such metabolites include, but are not limited to, amino acids, peptides, acylcarnitines, monosaccharides, lipids and phospholipids, prostaglandins, hydroxyeicosatetraenoic acid, hydroxyoctadecadenoic acid, steroids, bile acids, and glycolipids and phospholipids. does not Exemplary metabolites include sphingolipids, glycosphingolipids, sphingosine, ceramides, sphingomyelin, sphingosylphosphorylcholine, dihydrosphingosine, phosphatidylcholine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylinositol, Lysophosphatidylserine, Plasmenylphosphatidylcholine, Plasmanylphosphatidylcholine, proteinaceous amino acids, alanine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, leucine, isoleucine, lysine, methionine, proline, arginine, serine, threonine, valine, tryptophan, tyrosine , asymmetric dimethyl arginine, symmetric dimethyl arginine, glutamine, asparagine, nitrotyrosine, hydroxyproline, kynurenine, 3-hydroxy kynurenine, non-proteinaceous amino acids, ornithine, citrulline, acylcarnitine, carnitine, free Carnitine, acylcarnitine, hydroxylacylcarnitine, dicarboxylacylcarnitine, reduced monosaccharide, hexose, pentose, deoxyhexose, creatinine, creatine, spermidine spermine, putrescine, dopamine, serotonin , prostaglandins, hydroxyeicosatetraenoic acid, hydroxyoctadecadenoic acid, leukotriene, thromboxane, bile acids, sterols, cholesterol, vitamins and cofactors, drugs, and drug metabolites. For example, the metabolite may be at least one selected from the group consisting of lysophosphatidylcholine and tryptophan. Among the metabolites, when there is a significant difference between a biological sample of a normal pregnant mother and a biological sample of an abnormal pregnant mother, the metabolite may be selected as a marker for distinguishing between the abnormal pregnancy and the normal pregnancy. For example, the selected metabolite may be at least one selected from the group consisting of lysophosphatidylcholine and tryptophan.
본 명세서에서 사용되는 용어, "정상 임신과 비정상 임신 진단용 바이오마커"는, 루푸스 환자의 혈액 내에 트립토판 (Tryptophan)과 리소포스파티딜콜린 C22:5 (LysoPC C22:5)의 대사체들이 발현되어, 상기 대사체들의 발현 수준을 이용하여 정상 임신과 비정상 임신을 진단할 수 있는 바이오마커로 사용할 수 있다는 뜻이다. 예를 들어, 상기 전신성 홍반성 루푸스 환자의 정상 임신과 비정상 임신 진단용 바이오마커로 트립토판, 및/또는 리소포스파티딜콜린 C22:5를 사용할 수 있다.As used herein, the term "biomarker for diagnosing normal and abnormal pregnancy" refers to the expression of metabolites of tryptophan and lysophosphatidylcholine C22:5 (LysoPC C22:5) in the blood of a lupus patient, and the metabolites This means that it can be used as a biomarker for diagnosing normal and abnormal pregnancy using their expression level. For example, tryptophan and/or lysophosphatidylcholine C22:5 may be used as biomarkers for diagnosing normal and abnormal pregnancy of the systemic lupus erythematosus patient.
상기 선정된 대사체 (비정상 임신과 정상 임신을 구별하기 위한 마커)는, 상기 대사체의 수준이 비정상 임신의 위험도에 미치는 정도를 고려하여, 비정상 임신 예측 시 가중치가 부여되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 가중치는 최대 가능성우도 추정 (maximum likelihood estimation), 도구변수추정 (instrumental variable estimation), 보통최소제곱추정 (ordinary least square estimation), 비선형 최소제곱추정 (non-linear least square estimation), 반복가중최소제곱 (iterative weighted least square estimation), 제한된 최대우도추정 (restricted maximum likelihood estimation), 및 미분방정식을 사용하지 않는 제한최대우도추정 (derivative-free restricted maximum likelihood estimation)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되어 부여되는 것일 수 있다.The selected metabolite (a marker for discriminating between an abnormal pregnancy and a normal pregnancy) may be weighted when predicting an abnormal pregnancy in consideration of the degree to which the level of the metabolite affects the risk of an abnormal pregnancy. For example, the weight may be determined by maximum likelihood estimation, instrumental variable estimation, ordinary least squares estimation, non-linear least squares estimation, One selected from the group consisting of iterative weighted least squares estimation, restricted maximum likelihood estimation, and derivative-free restricted maximum likelihood estimation It may be provided by performing the above method.
본 발명의 일 예에 따르면, 비정상 임신은 상기 선정된 대사체를 이용하여 하기 수학식 1에 의해 예측되는 것일 수 있다:According to an example of the present invention, abnormal pregnancy may be predicted by
[수학식 1][Equation 1]
비정상 임신의 위험도 = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)Risk of Abnormal Pregnancy = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)
LysoPC C22:5 : 시료 내 대사체 중 리소포스파티딜콜린 수준의 정량값LysoPC C22:5: quantitative value of lysophosphatidylcholine level in metabolites in the sample
Tryptophan : 시료 내 대사체 중 트립토판 수준의 정량값.Tryptophan: Quantitative value of tryptophan level among metabolites in the sample.
상기 수학식 1에서 각 변수는 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값이다.In
상기 비정상 임신의 위험도는 적어도 2단계 이상의 위험도로 구별되는 것일 수 있음은 전술한 바와 같다. 예를 들어, 상기 비정상 임신은 중등 비정상 임신 (Moderate adverse pregnancy outcome)과 중증 비정상임신 (Severe adverse pregnancy outcome)으로 구별될 수 있으며, 통상의 기술자는 비정상 임신의 정도에 따라 중등 비정상 임신과 중증 비정상 임신을 명확하게 구별할 수 있을 것이다. 일예로, 상기 비정상 임신의 위험도가 -2.37 미만일 경우 정상 임신으로 예측하고, 상기 비정상 임신의 위험도가 -2.37 이상일 경우 비정상 임신으로 예측하며, 구체적으로 상기 비정상 임신의 위험도가 -2.37 내지 0.26일 경우 중등 비정상 임신으로 예측하고, 상기 비정상 임신의 위험도가 0.26 초과일 경우 중증 비정상임신으로 예측하는 것일 수 있다.As described above, the risk of the abnormal pregnancy may be distinguished from the risk of at least two stages or more. For example, the abnormal pregnancy can be divided into a moderate adverse pregnancy outcome and a severe adverse pregnancy outcome, and the skilled artisan can determine a moderate adverse pregnancy outcome and a severe abnormal pregnancy according to the degree of the abnormal pregnancy. can be clearly distinguished. For example, when the risk of the abnormal pregnancy is less than -2.37, it is predicted as a normal pregnancy, and when the risk of the abnormal pregnancy is -2.37 or more, it is predicted as an abnormal pregnancy, specifically, when the risk of the abnormal pregnancy is -2.37 to 0.26, it is moderate It may be predicted as an abnormal pregnancy, and if the risk of the abnormal pregnancy is greater than 0.26, it may be predicted as a severe abnormal pregnancy.
본 발명의 또 다른 일 예는, 전신성 홍반성 루푸스 (Systemic lupus erythematosus; SLE) 산모에서 분리된 생물학적 시료에서 리소포스파티딜콜린 및 트립토판 수준을 정량할 수 있는 제제를 포함하는, 비정상 임신 예측 또는 진단용 조성물, 또는 비정상 임신 예측 또는 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에 따른 전신성 홍반성 루푸스 환자의 정상 임신과 비정상 임신 진단용 키트는, 트립토판, 및/또는 리소포스파티딜콜린 C22:5의 바이오마커를 포함한 시료의 대사체를 정량 분석함으로써, 정상 임신과 비정상 임신을 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 가래, 질액, 침, 땀, 눈물, 뇌척수액, 및 양수액으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.Another embodiment of the present invention is a composition for predicting or diagnosing abnormal pregnancy, including an agent capable of quantifying the levels of lysophosphatidylcholine and tryptophan in a biological sample isolated from a systemic lupus erythematosus (SLE) mother, or It relates to a kit for predicting or diagnosing abnormal pregnancy. The kit for diagnosing normal pregnancy and abnormal pregnancy of a systemic lupus erythematosus patient according to an embodiment of the present invention quantitatively analyzes a metabolite of a sample containing a biomarker of tryptophan, and/or lysophosphatidylcholine C22:5, so that normal pregnancy and abnormal pregnancy It is characterized in that it can diagnose pregnancy. The biological sample may be at least one selected from the group consisting of blood, plasma, serum, urine, saliva, sputum, vaginal fluid, saliva, sweat, tears, cerebrospinal fluid, and amniotic fluid.
상기 전신성 홍반성 루푸스는 전술한 바와 같다.The systemic lupus erythematosus is the same as described above.
상기 비정상 임신은 전술한 바와 같다. 상기 비정상 임신은 적어도 2단계 이상의 위험도로 구별되는 것일 수 있으며, 예를 들어 중등 비정상 임신 (Moderate adverse pregnancy outcome)과 중증 비정상임신 (Severe adverse pregnancy outcome)으로 구별될 수 있으며, 상기 중등 비정상 임신과 상기 중증 비정상 임신은 전술한 바와 같다.The abnormal pregnancy is as described above. The abnormal pregnancy may be one that is distinguished by the risk of at least two or more stages, for example, it can be distinguished into a moderate adverse pregnancy outcome and a severe adverse pregnancy outcome, and the moderate adverse pregnancy outcome and the Severe abnormal pregnancy is as described above.
본 발명의 일 예에 따른 키트는 하기 수학식 1을 이용하여 비정상 임신의 위험도를 정량하는 계산부를 추가로 포함하는 것일 수 있다:The kit according to an embodiment of the present invention may further include a calculator for quantifying the risk of abnormal
[수학식 1][Equation 1]
비정상 임신의 위험도 = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)Risk of Abnormal Pregnancy = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)
LysoPC C22:5 : 시료 내 대사체 중 리소포스파티딜콜린 수준의 정량값LysoPC C22:5: quantitative value of lysophosphatidylcholine level in metabolites in the sample
Tryptophan : 시료 내 대사체 중 트립토판 수준의 정량값.Tryptophan: Quantitative value of tryptophan level among metabolites in the sample.
상기 수학식 1에서 각 변수는 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값이다.In
상기 비정상 임신의 위험도는 적어도 2단계 이상의 위험도로 구별되는 것일 수 있음은 전술한 바와 같다. 예를 들어, 상기 비정상 임신은 중등 비정상 임신 (Moderate adverse pregnancy outcome)과 중증 비정상임신 (Severe adverse pregnancy outcome)으로 구별될 수 있으며, 통상의 기술자는 비정상 임신의 정도에 따라 중등 비정상 임신과 중증 비정상 임신을 명확하게 구별할 수 있을 것이다. 일예로, 상기 비정상 임신의 위험도가 -2.37 미만일 경우 정상 임신으로 예측하고, 상기 비정상 임신의 위험도가 -2.37 이상일 경우 비정상 임신으로 예측하며, 구체적으로 상기 비정상 임신의 위험도가 -2.37 내지 0.26일 경우 중등 비정상 임신으로 예측하고, 상기 비정상 임신의 위험도가 0.26 초과일 경우 중증 비정상임신으로 예측하는 것일 수 있다.As described above, the risk of the abnormal pregnancy may be distinguished from the risk of at least two stages or more. For example, the abnormal pregnancy can be divided into a moderate adverse pregnancy outcome and a severe adverse pregnancy outcome, and the skilled artisan can determine a moderate adverse pregnancy outcome and a severe abnormal pregnancy according to the degree of the abnormal pregnancy. can be clearly distinguished. For example, when the risk of the abnormal pregnancy is less than -2.37, it is predicted as a normal pregnancy, and when the risk of the abnormal pregnancy is -2.37 or more, it is predicted as an abnormal pregnancy, specifically, when the risk of the abnormal pregnancy is -2.37 to 0.26, it is moderate It may be predicted as an abnormal pregnancy, and if the risk of the abnormal pregnancy is greater than 0.26, it may be predicted as a severe abnormal pregnancy.
본 발명의 일 예에 따른 전신성 홍반성 루푸스 환자의 정상 임신과 비정상 임신 진단용 키트는, 질환이 의심되는 환자의 생물학적 시료, 예컨대 혈액 시료로부터 상기 대사체를 검출하거나 정량분석하여 정상 임신과 비정상 임신을 진단하는데 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.The kit for diagnosing normal pregnancy and abnormal pregnancy of a patient with systemic lupus erythematosus according to an embodiment of the present invention detects or quantitatively analyzes the metabolite from a biological sample, such as a blood sample, of a patient suspected of having a disease to detect normal pregnancy and abnormal pregnancy It may be used for diagnosis, but is not particularly limited thereto.
또한, 전신성 홍반성 루푸스 환자의 정상 임신과 비정상 임신 진단용 키트는, 대사체를 검출하기 위한 직접적인 수단뿐만 아니라 분석 방법에 사용되는 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 예에 따른 진단용 키트는 테스트 튜브, 컨테이너, 반응 완충액, 분석용 효소, 멸균수 등을 추가로 포함할 수 있다.In addition, the kit for diagnosing normal and abnormal pregnancy in patients with systemic lupus erythematosus may include direct means for detecting metabolites, as well as other components, solutions or devices used in the assay method. For example, the diagnostic kit according to an embodiment of the present invention may further include a test tube, a container, a reaction buffer, an enzyme for analysis, sterile water, and the like.
본 발명은 생물학적 시료 내 대사체의 수준 변화를 이용하여 전신성 홍반성 루푸스 환자의 비정상 임신을 판정할 수 있고, 비정상 임신으로 인한 질병 등을 조기에 진단하고 치료할 수 있는 기회를 제공 가능하며, 산모의 합병증 위험을 줄이고, 태아의 사산률을 낮출 수 있다.The present invention can determine an abnormal pregnancy in a patient with systemic lupus erythematosus using a change in the level of metabolites in a biological sample, and provide an opportunity to diagnose and treat diseases caused by abnormal pregnancy at an early stage, It can reduce the risk of complications and lower the fetal stillbirth rate.
도 1은 부분최소자승판별 분석 (Partial least squares discriminant analysis, PLS-DA) 결과로, 정상 임산부와 SLE 임산부의 정상임신과 비정상임신에 따른 혈장에서 검출된 대사체들의 차이를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 비정상 임신 예측용 변수값에 의해 임산부의 정상임신 그룹과, 비정상임신 중에서도 덜 심한 그룹, 심한 그룹에서의 상대 존재비(Relative abundances)를 나타낸 도면으로, y축은 수학식 1에 의한 계산값이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 2가지 대사체를 이용하였을 때, SLE 환자의 정상 임신과 비정상 임신에 대한 판별 결과를 나타내는 AUC curve 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 비정상 임신 예측방법 (실시예 4)과, 본 발명에서 확립된 비정상임신을 예측하기 위한 대사체에 가중치를 부여하지 않은 경우 (비교예 1 및 비교예 2)의 비정상 임신에 대한 판별능력을 판별능력을 ROC curve로 나타낸 도면이다.1 is a diagram showing the difference between metabolites detected in plasma according to normal and abnormal pregnancy of normal pregnant women and SLE pregnant women as a result of partial least squares discriminant analysis (PLS-DA).
2 is a diagram showing the relative abundances in the normal pregnancy group of pregnant women, the less severe group among the abnormal pregnancy, and the severe group by the variable values for predicting abnormal pregnancy according to an example of the present invention, the y-axis is mathematical It is a calculated value according to
3 is a view showing the AUC curve results showing the discrimination results for normal and abnormal pregnancy in SLE patients when two metabolites according to an example of the present invention are used.
4 is an abnormal pregnancy prediction method according to an example of the present invention (Example 4), and when no weight is given to a metabolite for predicting an abnormal pregnancy established in the present invention (Comparative Example 1 and Comparative Example 2) It is a diagram showing the ability to discriminate against abnormal pregnancy in the ROC curve.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1. 시료 내 대사체 준비Example 1. Preparation of metabolites in samples
(1) 대상 선정 및 혈장 시료의 준비(1) Target selection and plasma sample preparation
전신홍반루푸스 (SLE) 임산부의 혈장 시료는 서울대학교병원에서 제공받았으며, 대사체 추출 전까지 영하 80℃에서 냉동 보관하는 방법으로 전처리하였다. SLE 산모 33 명과 정상 산모 10명을 포함하는 총 43명의 혈장 시료를 얻어 시험을 수행하였다. Plasma samples from pregnant women with systemic lupus erythematosus (SLE) were provided by Seoul National University Hospital, and pre-treated by freezing at −80° C. until metabolite extraction. A total of 43 plasma samples including 33 SLE mothers and 10 normal mothers were obtained and tested.
또한, SLE 산모 33명에 대해 추가로 분류하고자, 중등 비정상임신 (Moderate adverse pregnancy outcome) 결과를 보인 SLE 산모 그룹 (5명), 중증 비정상임신 (Severe adverse pregnancy outcome) 결과를 보인 SLE 산모 그룹 (7명) 및 정상 임신 결과를 보인 SLE 산모 그룹 (21명)으로 분류하였다. In addition, to further classify the 33 SLE mothers, the SLE mother group (5 patients) with a moderate adverse pregnancy outcome, and the SLE mother group (7) with a severe adverse pregnancy outcome women) and SLE mothers with normal pregnancy results (21 women).
구체적으로, 상기 중등 비정상임신 결과를 보인 SLE 산모 그룹은, 34주 이상의 주수에서 분만한 임신 중독증, 30주와 36주 사이에 적응증에 따라 조산을 한 경우, 또는 출생체중 5 percentile 미만의 주수에 비해 저체중 태아를 출산한 임신 결과를 보였다. 상기 중증 비정상임신 SLE 산모 그룹은 자궁 내 태아사망, 34주 이전에 분만하게 된 임신중독증, 신생아 사망, 또는 30주 이전에 적응증에 따라 조산한 결과를 나타냈다. 상기 정상 임신 결과를 보인 SLE 산모 그룹은 중등 비정상임신 및 중증 비정상 임신의 증상을 모두 나타내지 않은 경우였다.Specifically, the SLE mothers group who showed the above secondary abnormal pregnancy results, compared to the number of weeks of less than 5 percentile of birth weight, or preterm birth according to indications between 30 and 36 weeks, or preeclampsia delivered at 34 or more weeks of age. Pregnancy results with low birth weight fetuses were shown. The severe abnormal pregnancy SLE mother group showed intrauterine fetal death, preeclampsia resulting from delivery before 34 weeks, neonatal death, or premature delivery according to indications before 30 weeks. The SLE mothers group who showed the normal pregnancy result did not show any symptoms of moderate abnormal pregnancy and severe abnormal pregnancy.
(2) 일차대사산물 추출 및 분석 준비(2) Preparation of primary metabolite extraction and analysis
상기 SLE 산모의 혈장 시료 내 일차 대사산물 추출을 위해, 상기 냉동 보관 되어 있는 혈장을 50 ㎕씩 튜브에 담은 후 750 ㎕의 추출용제 (메탄올:이소프로프라놀:증류수, 3:3:2, v/v/v)를 첨가하였다. 이 혼합물을 4℃에서 10분간 초음파 분쇄한 후, 5분간 13,200 rpm 으로 원심분리하여 750 ㎕의 상등액을 다른 튜브에 담고 고속진공농축기(speed vacuum concentrator)를 사용하여 건조시켰다. 건조된 추출물은 GC-TOF 질량 분석기로 분석할 때까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.For the extraction of the primary metabolites in the plasma sample of the SLE mother, 50 μl of the frozen stored plasma is put in a tube and then 750 μl of an extraction solvent (methanol: isopropranol: distilled water, 3:3:2, v /v/v) was added. The mixture was sonicated at 4° C. for 10 minutes, centrifuged at 13,200 rpm for 5 minutes, and 750 μl of the supernatant was placed in another tube and dried using a speed vacuum concentrator. The dried extracts were stored frozen at -80°C until analysis by GC-TOF mass spectrometry.
상기 추출한 혈장 시료의 일차대사산물의 더욱 효과적인 분석을 위해 유도체화를 실시하였으며, 이를 위해 우선 40 mg/ml 농도의 메톡시아민 염산 (methoxyamine hydrochloride) 5㎕를 첨가하고 90분간 반응하였다 (200rpm, 30℃). 그 후, 지방산 메틸에스테르 (Fatty acid methyl esters: FAME, C8, C9, C10, C12, C14, C16, C18, C20, C22, C24, C26, C28 및 C30)를 이용하여 머무름 시간 색인지표(internal retention index markers)의 혼합물을 합성하고, C8-C16과 C18-C30은 각각 0.8 mg/ml와 0.4 mg/ml 농도의 클로로포름에 융해시킨 후, 지방산 메틸에스테르 2㎕, N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA + 1% TMCS, Thermo, USA) 45㎕를 추가하여 200 rpm, 37℃의 조건으로 1시간동안 반응하였다.Derivatization was performed for more effective analysis of the primary metabolites of the extracted plasma sample. For this, 5 μl of methoxyamine hydrochloride at a concentration of 40 mg/ml was added and reacted for 90 minutes (200 rpm, 30 ° C). Then, fatty acid methyl esters (Fatty acid methyl esters: FAME, C8, C9, C10, C12, C14, C16, C18, C20, C22, C24, C26, C28 and C30) using the retention time index index (internal retention) index markers), and after dissolving C8-C16 and C18-C30 in chloroform at a concentration of 0.8 mg/ml and 0.4 mg/ml, respectively, 2 μl of fatty acid methyl ester, N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA) + 1% TMCS, Thermo, USA) 45 μl was added and reacted for 1 hour at 200 rpm and 37°C.
(3) 지질 대사체 추출 및 분석 준비(3) Preparation of lipid metabolite extraction and analysis
SLE 산모의 혈장 시료 내 지질 추출을 위해, 상기 냉동 보관 되어 있는 혈장 50 ㎕씩 튜브에 담은 후 225 ㎕의 메탄올과 450 ㎕의 클로로폼을 첨가하여 1시간 동안 반응을 시키고 187.5 ㎕의 증류수를 첨가하고, 5분간 13,200 rpm으로 원심분리하여 하층액을 다른 튜브에 담고 고속진공농축기(speed vacuum concentrator)를 사용하여 건조시켰다. 건조된 추출물은 LC-Orbitrap 질량 분석기로 분석할 때까지 -80℃ 온도에서 냉동 보관하였다.For lipid extraction in the plasma sample of SLE mothers, 50 μl of the frozen plasma was put into a tube, 225 μl of methanol and 450 μl of chloroform were added to react for 1 hour, and 187.5 μl of distilled water was added. , centrifuged at 13,200 rpm for 5 minutes, the lower layer was placed in another tube and dried using a speed vacuum concentrator. The dried extracts were stored frozen at -80°C until analyzed by LC-Orbitrap mass spectrometry.
상기 추출한 혈장 시료의 지질 대사체 샘플의 더욱 효과적인 분석을 위해 재현탁을 실시하였으며, 이를 위해 70% 아세토나이트릴 (Acetonitrile) 50 ㎕를 첨가하여 복원 (reconstitution)을 하였다.Resuspension was performed for more effective analysis of the lipid metabolite sample of the extracted plasma sample, and for this, 50 μl of 70% acetonitrile was added to perform reconstitution.
실시예 2. 시료 내 대사체 검출 및 분석Example 2. Detection and Analysis of Metabolites in Samples
(1) 일차 대사산물의 분석 (초기 동정)(1) Analysis of primary metabolites (initial identification)
기체 크로마토그래피 분석Gas Chromatography Analysis
실시예 1의 혈장 시료에서 추출한 샘플 내 대사체 검출을 위해, 실시예 1-2에서 유도체화한 대사체 샘플 0.5 ㎕를 Automatic Liquid Sampler(Agilent 7693 ALS, Agilent Technologies, Wilmington, DE)를 이용해 기체 크로마토그래피에 주입하였다. 기체 크로마토그래피는 Agilent 7890B gas chromatograph(Agilent Technologies, Wilmington, DE)과 RTX-5Sil MS column(30 m ⅹ 0.25 mm, 0.25 ㎛ film thickness, Restek, Gellefonte, PA)을 이용하였고 첫 1분은 50℃로, 이후 분당 20℃씩 온도를 상승시켜 330℃에 도달한 후 5분 동안 유지하였다. 기체 크로마토그래피의 전재선 (transfer line) 온도는 280℃로 설정하였다.For the detection of metabolites in the samples extracted from the plasma samples of Example 1, 0.5 μl of the metabolite samples derivatized in Examples 1-2 were subjected to gas chromatography using an Automatic Liquid Sampler (Agilent 7693 ALS, Agilent Technologies, Wilmington, DE). injected into the graph. For gas chromatography, an Agilent 7890B gas chromatograph (Agilent Technologies, Wilmington, DE) and an RTX-5Sil MS column (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm film thickness, Restek, Gelefonte, PA) were used and the first minute was at 50°C. , and thereafter, the temperature was increased by 20 °C per minute to reach 330 °C and maintained for 5 minutes. The transfer line temperature of gas chromatography was set to 280°C.
질량 분석기 분석mass spectrometry analysis
실시예 1의 혈장 시료에서 추출한 샘플 내 일차 대사산물 대사체 검출을 위해 질량 분석기를 이용하여 질량 분석을 실시하였다. 질량 분석에는 Pegasus HT time of flight (TOF) MS software 4.50 (LECO, St. Joseph, MI) 프로그램을 기반으로 한 Pegasus HT TOF 질량 분석기를 이용하였으며, 85-500m/z의 질량 범위에서 초당 20 스펙트럼의 속도로 대사체들의 질량 스펙트럼을 확보하였다. 이온소스 (ion source) 의 온도는 250℃로 조정하였으며, 전자 충격 이온화 (electron impact ionization) 는 70 eV로 시행하였다.In order to detect the metabolite of the primary metabolite in the sample extracted from the plasma sample of Example 1, mass spectrometry was performed using a mass spectrometer. For mass spectrometry, a Pegasus HT TOF mass spectrometer based on the Pegasus HT time of flight (TOF) MS software 4.50 (LECO, St. Joseph, MI) program was used. Mass spectra of metabolites were obtained at the rate. The temperature of the ion source was adjusted to 250 °C, and electron impact ionization was performed at 70 eV.
대사체 초기동정Early identification of metabolites
상기 기체 크로마토그래피 및 질량 분석기를 이용하여 분석한 대사체들의 초기동정(annotation)을 위해, Fiehn 라이브러리(2007)/NIST 라이브러리(2012)를 사용하여 스펙트럼(spectrum)의 일치도를 통한 비교분석을 실시하였으며, 이후 표준물질의 스펙트럼(spectrum)과 머무름시간 (retention time) 직접적 비교를 통한 검증을 하였다.For the initial identification (annotation) of metabolites analyzed using the gas chromatography and mass spectrometer, a comparative analysis was performed through the degree of spectral agreement using Fiehn library (2007)/NIST library (2012). , and then verified through direct comparison of the spectrum and retention time of the standard material.
결과적으로 상기 과정들을 통해 혈장 시료에서 105개의 일차대사산물의 대사체들을 검출하였다.As a result, metabolites of 105 primary metabolites were detected in plasma samples through the above procedures.
(2) 지질 대사체의 분석 (초기 동정)(2) Analysis of lipid metabolites (initial identification)
액체 크로마토그래피 분석Liquid chromatography analysis
실시예 1의 혈장 시료에서 추출한 샘플 내 지질 대사체 검출을 위해, 실시예 1-3에서 재현탁한 지질 대사체 샘플 10 ㎕를 액체 크로마토그래피에 주입하여 분리하였다. 액체 크로마토그래피는 UltiMate 3000(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)과 Waters Acquity UPLC BEH C18 Column (2.1 mm ⅹ 150 mm, 1.7 ㎛)을 이용하였고 이동상으로 10mM 포름산 암모늄 (ammonium formate)와 0.2% Formic acid가 포함된 증류수(Solvent A)와 0.2% Formic acid가 포함된 아세토나이트릴 (Solvent B)을 사용하고 350 ㎕/min의 Flow rate으로 다음과 같은 Gradient에서 분석하였다; 0 - 1.0 min, 10% B; 1.0 - 7.5 min, 10% - 75% B; 7.5 - 7.6 min, 75% - 95% B; 7.6 - 10.4 min, 95% B; 10.4 - 10.5 min, 95% - 10% B; 10.5 - 16.0 min, 10% B.For the detection of lipid metabolites in the samples extracted from the plasma samples of Example 1, 10 μl of the lipid metabolite samples resuspended in Examples 1-3 were injected and separated by liquid chromatography. Liquid chromatography was performed using UltiMate 3000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) and Waters Acquity UPLC BEH C18 Column (2.1 mm × 150 mm, 1.7 μm), and 10 mM ammonium formate and 0.2% Formic acid were used as mobile phases. Distilled water (Solvent A) and acetonitrile (Solvent B) containing 0.2% formic acid were used and analyzed at the following gradient at a flow rate of 350 μl/min; 0 - 1.0 min, 10% B; 1.0 - 7.5 min, 10% - 75% B; 7.5 - 7.6 min, 75% - 95% B; 7.6 - 10.4 min, 95% B; 10.4 - 10.5 min, 95% - 10% B; 10.5 - 16.0 min, 10% B.
질량 분석기 분석mass spectrometry analysis
상기 액체크로마토그래피에서 분리한 샘플 내 지질 대사체 검출을 위해 질량 분석기를 이용하여 질량 분석을 실시하였다. 질량 분석에는 Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) 기기를 이용하였으며, 70 - 1000Da의 질량 범위에서 Positive와 Negative 이온화 모드로 대사체들의 질량 스펙트럼을 확보하였다.In order to detect a lipid metabolite in the sample separated by the liquid chromatography, mass spectrometry was performed using a mass spectrometer. For mass spectrometry, a Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) instrument was used, and mass spectra of metabolites were obtained in positive and negative ionization modes in the mass range of 70 - 1000 Da.
대사체 초기동정Early identification of metabolites
상기 액체크로마토그래피 및 질량 분석기를 이용하여 분석한 지질 대사체들의 초기동정(annotation)과 동정(Identification)을 위해 MS-DIAL 소프트웨어와 Lipid Blast 라이브러리를 사용하였다.MS-DIAL software and Lipid Blast library were used for initial identification and identification of lipid metabolites analyzed using liquid chromatography and mass spectrometry.
결과적으로 상기 과정들을 통해 혈장 시료에서 222개의 지질대사체의 대사체들을 검출하였으며, 총 327개 (105개의 일차대사산물과 222개의 지질대사체)의 대사체들을 검출하였다.As a result, 222 metabolites of lipid metabolites were detected in plasma samples through the above procedures, and a total of 327 metabolites (105 primary metabolites and 222 lipid metabolites) were detected.
실시예 3. 대사체 바이오마커 선별Example 3. Selection of metabolite biomarkers
(1) 시료 내 대사체 분포 확인(1) Confirmation of metabolite distribution in the sample
실시예 1 및 실시예 2의 과정을 통해 검출한 총 327개의 대사체들 중 바이오마커 선별을 위한 분석으로, SLE 임산부의 비정상 임신과 정상 임신에 따른 혈장 내 대사체의 분포를 확인하기 위해 부분최소자승판별 (partial least squares discriminant analysis, PLS-DA) 분석을 시행하였고 이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.As an analysis for biomarker selection among a total of 327 metabolites detected through the process of Examples 1 and 2, partial minimum to confirm the distribution of metabolites in plasma according to abnormal pregnancy and normal pregnancy of SLE pregnant women Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) analysis was performed, and the results are shown in FIG. 1 .
도 1에서 보는 바와 같이 SLE 임산부의 비정상 임신과 정상 임신에 따른 혈장 내 대사체 분포에 차이가 있음을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 1 , it was confirmed that there was a difference in the distribution of metabolites in plasma according to abnormal pregnancy and normal pregnancy of SLE pregnant women.
(2) 통계 분석(2) Statistical analysis
또한, 검출한 대사체들의 통계 분석을 위해, IMB SPSS (ver. 25.0)을 이용하여 이분형 로지스틱 회귀분석(binary logistic regression analysis)을 실시하였다. 표 1 및 표 2는 로지스틱 회귀 분석 결과를 나타낸 것으로, SLE 산모의 비정상 임신을 예측하는 일변량분석 (Univariate analysis) 및 다변량분석 (multivariate analyses) 결과를 나타낸 것이다. 표 1 및 표 2에서 Model 1은 검체 채취 당시 고혈압여부로 보정한 것 (adjusted for hypertension at sampling) 이고, Model 2는 검체 채취 당시 고혈압여부와 항인지질항체증후군 여부로 보정한 것 (adjusted for hypertension at sampling and antiphospholipid antibody syndrome) 이다. 표 1에 나타난 바와 같이, 트립토판(Tryptophan)과 리소포스파티딜콜린 C22:5(LysoPC C22:5)을 조합한 변수는 고혈압과 항인지질항체증후군으로 보정하여도 유의하게 비정상 임신 결과를 예측할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 표 2에 나타난 바와 같이, 종래의 임신중독증 예측 바이오마커인 sFlt-1/PlGF는 SLE 임산부에서 고혈압과 항인지질항체증후군으로 보정하였을 때 통계적 유의성이 확인되지 않았다 (sFlt1: soluble fms-like tyrosine kinase-1, PIGF: 태반성장인자 (placental growth factor).In addition, for statistical analysis of the detected metabolites, binary logistic regression analysis was performed using IMB SPSS (ver. 25.0). Tables 1 and 2 show the results of logistic regression analysis, and show the results of univariate analysis and multivariate analysis for predicting abnormal pregnancy in SLE mothers. In Tables 1 and 2,
(Tryptophan and LysoPC 22:5)(1) Metabolites
(Tryptophan and LysoPC 22:5)
(3) 바이오마커 선별(3) biomarker selection
그 후, 분석 결과를 바탕으로 통계적으로 식별 가능한 대사체들을 선별하여 선형방정식을 통하여 새로운 변수를 도출하였다. 구체적으로, 이분형 로지스틱 회귀분석 (Binary logistic regression)을 통해, 상기 실시예 2에서 검출된 327 개 대사체 중에서 SLE 산모의 정상임신과 비정상임신을 가장 잘 나눌 수 있는 대사체를 선별하고자 표 3과 같이 6가지 일차 방정식을 도출하였다.Then, based on the analysis results, statistically identifiable metabolites were selected and new variables were derived through linear equations. Specifically, through binary logistic regression, from among the 327 metabolites detected in Example 2, the metabolites that can best divide the normal and abnormal pregnancy of SLE mothers are shown in Table 3 and Together, six linear equations were derived.
표 3에 나타난 바와 같이, 1단계 및 2단계에서 유의 확률이 0.05 미만으로 (P<0.05) SLE 산모의 정상임신과 비정상임신을 잘 구별할 수 있었다. 상기 3단계 내지 6단계의 경우 유의확률 p<0.05를 만족하지 못하였으며, 3단계 내지 6단계에서 사용된 대사체는 정상 임신 SLE 산모 그룹 및 비정상 임신 SLE 산모 그룹에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.As shown in Table 3, the significance probability of
상기 1단계와 2단계 도출된 일차 방정식을 ROC 분석으로 검증하였다. 1단계 및 2단계 식의 ROC 분석 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4에 나타난 바와 같이, 2단계 식의 AUC가 0.9 이상으로 SLE 산모의 정상임신과 비정상임신을 더욱 잘 구별하는 것을 알 수 있었다.The linear equations derived in
(4) 바이오마커를 이용한 모델 확립(4) Establishment of a model using biomarkers
2단계 일차 방정식이 SLE 산모의 임신 예후를 정확하게 예측할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 2단계 일차 방정식을 이용하여 실시예 1의 SLE 산모의 개별 그룹 (정상 임신 결과를 보인 SLE 산모 그룹, 중등 비정상임신 결과를 보인 SLE 산모 그룹, 및 중증 비정상임신 결과를 보인 SLE 산모 그룹)의 상대 존재비(Relative abundances) 를 2단계 일차 방정식을 이용하여 분석하였고 이를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 y축은 각 그룹의 상대 존재비 (수학식 1에 의한 계산값)이다.In order to determine whether the two-step linear equation can accurately predict the pregnancy prognosis of SLE mothers, individual groups of SLE mothers of Example 1 (SLE mother group with normal pregnancy results, moderate abnormal pregnancy The relative abundances of the SLE mother group with the results and the SLE mother group with the severe abnormal pregnancy results) were analyzed using a two-step linear equation and are shown in FIG. 2 . In FIG. 2 , the y-axis is the relative abundance ratio (calculated by Equation 1) of each group.
도 2에서 보는 바와 같이, SLE 임산부의 정상임신 그룹, 중등 비정상임신 그룹, 및 중증 비정상임신 그룹에서 트립토판(Tryptophan)과 리소포스파티딜콜린 C22:5(LysoPC C22:5)으로 새롭게 만든 변수의 분포의 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 이들을 대사체 바이오마커로 선별하였으며, SLE 산모의 비정상 임신을 예측할 수 있는 식은 하기 수학식 1과 같다. 수학식 1에서 각 변수는 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값이다As shown in Figure 2, the difference in the distribution of variables newly created with tryptophan and lysophosphatidylcholine C22:5 (LysoPC C22:5) in the normal pregnancy group, the moderate abnormal pregnancy group, and the severe abnormal pregnancy group of SLE pregnant women could confirm that there was Therefore, they were selected as metabolite biomarkers, and the equation for predicting abnormal pregnancy of SLE mothers is as shown in
[수학식 1][Equation 1]
비정상 임신의 위험도 = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)Risk of Abnormal Pregnancy = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)
LysoPC C22:5 : 시료 내 대사체 중 리소포스파티딜콜린 수준의 정량값으로서, 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값LysoPC C22:5: A quantitative value of the level of lysophosphatidylcholine among metabolites in the sample, a relative quantitative value when the sum of the peak areas of all detected metabolites is set to 1.
Tryptophan : 시료 내 대사체 중 트립토판 수준의 정량값으로서, 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값Tryptophan: A quantitative value of the tryptophan level among metabolites in the sample, a relative quantitative value when the sum of the peak areas of all detected metabolites is set to 1.
비교예 1: 비정상임신 예측력 평가 (1)Comparative Example 1: Evaluation of predictive power of abnormal pregnancy (1)
실시예 3에서 확립된 비정상임신을 예측하기 위한 수학식 1을 사용하지 않고, 하기 수학식 2와 같이 본 발명의 일 예에 따라 확립된 가중치를 적용하지 않을 경우 비정상임신을 얼마나 잘 판별할 수 있는지 평가하였다.How well can an abnormal pregnancy be determined if the weight established according to an example of the present invention is not applied as in
구체적으로, 실시예 3에서 확립된 각 인자들에 적용된 가중치 중 리소포스파티딜콜린 C22:5의 가중치를 적용하지 않고, 하기 수학식 2와 같이 비정상임신의 위험도를 도출하였다. 수학식 2의 변수는 상기 수학식 1의 변수의 정의와 동일하다.Specifically, without applying the weight of lysophosphatidylcholine C22:5 among the weights applied to each factor established in Example 3, the risk of abnormal pregnancy was derived as shown in
[수학식 2][Equation 2]
비정상임신의 위험도 = 5.55 + (LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)Risk of abnormal pregnancy = 5.55 + (LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)
LysoPC C22:5 : 시료 내 대사체 중 리소포스파티딜콜린 수준의 정량값으로서, 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값LysoPC C22:5: A quantitative value of the level of lysophosphatidylcholine among metabolites in the sample, a relative quantitative value when the sum of the peak areas of all detected metabolites is set to 1.
Tryptophan : 시료 내 대사체 중 트립토판 수준의 정량값으로서, 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값Tryptophan: A quantitative value of the tryptophan level among metabolites in the sample, a relative quantitative value when the sum of the peak areas of all detected metabolites is set to 1.
상기 수학식 2에 따른 비정상 임신에 대한 판별능력을 ROC curve 로 도 4에 나타내었고, AUC 값, 민감도, 특이도, 및 p-value를 표 3에 나타내었다.The ability to discriminate against abnormal pregnancy according to
도 4 및 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 예에 따른 비정상임신의 위험도를 예측하기 위한 변수의 가중치를 적용하지 않는 경우에는 AUC 값이 0.9 미만으로 나타나, 비정상 임신에 대한 판별력이 떨어짐을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 변수의 가중치가 비정상임신의 위험도를 더욱 효과적으로 예측할 수 있음을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 4 and Table 3, when the weight of the variable for predicting the risk of abnormal pregnancy according to an example of the present invention is not applied, the AUC value is less than 0.9, indicating that the discrimination power for abnormal pregnancy is lowered. Could know. Therefore, it was confirmed that the weight of the variable according to an example of the present invention can more effectively predict the risk of abnormal pregnancy.
비교예 2: 비정상임신 예측력 평가 (2)Comparative Example 2: Evaluation of predictive power of abnormal pregnancy (2)
실시예 3에서 확립된 각 인자들에 적용된 가중치 중 트립토판의 가중치를 적용하지 않고, 하기 수학식 3과 같이 비정상임신의 위험도를 도출하였다. 수학식 3의 변수는 상기 수학식 1의 변수의 정의와 동일하다.Among the weights applied to the factors established in Example 3, the weight of tryptophan was not applied, and the risk of abnormal pregnancy was derived as shown in
[수학식 3][Equation 3]
비정상임신의 위험도 = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (Tryptophan)Risk of abnormal pregnancy = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (Tryptophan)
LysoPC C22:5 : 시료 내 대사체 중 리소포스파티딜콜린 수준의 정량값으로서, 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값LysoPC C22:5: A quantitative value of the level of lysophosphatidylcholine among metabolites in the sample, a relative quantitative value when the sum of the peak areas of all detected metabolites is set to 1.
Tryptophan : 시료 내 대사체 중 트립토판 수준의 정량값으로서, 검출된 모든 대사체의 peak area 합을 1로 책정하였을 때의 상대적인 정량값Tryptophan: A quantitative value of the tryptophan level among metabolites in the sample, a relative quantitative value when the sum of the peak areas of all detected metabolites is set to 1.
상기 수학식 3에 따른 비정상 임신에 대한 판별능력을 ROC curve 로 도 4에 나타내었고, AUC 값, 민감도, 특이도, 및 p-value를 표 3에 나타내었다. The ability to discriminate against abnormal pregnancy according to
도 4 및 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 예에 따른 비정상임신의 위험도를 예측하기 위한 변수의 가중치를 적용하지 않는 경우에는 AUC 값이 0.9 미만으로 나타나, 비정상 임신에 대한 판별력이 떨어짐을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 일 예에 따른 변수의 가중치가 비정상임신의 위험도를 더욱 효과적으로 예측할 수 있음을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 4 and Table 3, when the weight of the variable for predicting the risk of abnormal pregnancy according to an example of the present invention is not applied, the AUC value is less than 0.9, indicating that the discrimination power for abnormal pregnancy is lowered. Could know. Therefore, it was confirmed that the weight of the variable according to an example of the present invention can more effectively predict the risk of abnormal pregnancy.
실시예 4. 대사체 바이오마커 검증 및 확립Example 4. Validation and establishment of metabolite biomarkers
실시예 3에서 선별한 대사체 바이오마커를 검증 및 확립하기 위해, 선별된 대사체 바이오마커를 이용한 수학식 1의 모델을 정상 임신 SLE 환자 임산부 21명 및 비정상 임신 SLE 환자 임산부 12명에 적용하였고, 이 때 SLE 임산부의 정상 임신과 비정상 임신에 대한 판별능력을 ROC curve로 나타내었으며, 이를 도 3에 나타내었다. 또한, 실시예 4, 비교예 1, 및 비교예 2 각각에 대하여 True Positive (TP), True Negative (TN), False Positive (FP), False Negative (FN) 를 분류하여 표 5에 나타내었다. 각각에 대한 민감도(Sensitivity) = TP/(TP+FN), 특이도(Specificity) = TN/(TN+FP), AUC 값, 및 p-value를 표 6에 나타내었다.In order to verify and establish the metabolite biomarker selected in Example 3, the model of
도 3에 나타난 바와 같이 AUC 값이 0.944로 나타나 선별된 바이오마커의 정상 임신과 비정상 임신에 대한 판별력이 매우 높음을 확인하였다.As shown in FIG. 3 , the AUC value was 0.944, confirming that the selected biomarker had a very high discriminant ability between normal and abnormal pregnancy.
또한, 표 6에 나타난 바와 같이 본 발명의 일 예에 따른 마커는 AUC 값 0.9 이상의 정확한 SLE 산모의 비정상 임신 예측이 가능하며, 특이도가 90% 이상으로 높은 것을 알 수 있었다.In addition, as shown in Table 6, the marker according to an example of the present invention can accurately predict abnormal pregnancy of SLE mothers with an AUC value of 0.9 or more, and it was found that the specificity was high as 90% or more.
결론적으로, 본 발명을 통해 선별된 대사체 마커들은 신속하고 높은 정확도로 SLE 임산부의 정상 임신과 비정상 임신을 판별할 수 있으며, 향후 환자들을 진단하는데 도움을 줄 수 있는 바이오마커 개발의 초석이 될 것으로 사료된다.In conclusion, the metabolite markers selected through the present invention can discriminate between normal and abnormal pregnancy in SLE pregnant women quickly and with high accuracy, and are expected to be a cornerstone for the development of biomarkers that can help diagnose patients in the future. is fed
Claims (24)
상기 리소포스파티딜콜린 C22:5 및 트립토판 수준을 이용하여 상기 시험 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 단계를 포함하는, 전신성 홍반성 루푸스를 갖는 산모의 비정상 임신의 위험도를 평가하는 방법.quantifying lysophosphatidylcholine C22:5 and tryptophan levels in a plasma sample isolated from a test mother with Systemic lupus erythematosus (SLE); and
A method of assessing the risk of abnormal pregnancy in a mother with systemic lupus erythematosus, comprising the step of using the lysophosphatidylcholine C22:5 and tryptophan levels to assess the risk of abnormal pregnancy in the test mother.
[수학식 1]
비정상 임신의 위험도 = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)
LysoPC C22:5 : 시료 내 대사체 중 리소포스파티딜콜린 C22:5 수준의 정량값
Tryptophan : 시료 내 대사체 중 트립토판 수준의 정량값.The method according to claim 1, wherein the risk of abnormal pregnancy is quantitatively evaluated by Equation 1 below:
[Equation 1]
Risk of Abnormal Pregnancy = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)
LysoPC C22:5: Quantitative value of lysophosphatidylcholine C22:5 level in metabolites in the sample
Tryptophan: Quantitative value of tryptophan level among metabolites in the sample.
상기 정상 임신 산모의 혈장 시료와 상기 비정상 임신 산모의 혈장 시료 내의 대사체 분포를 비교하는 단계; 및
상기 정상 임신 산모의 생물학적 시료와 상기 비정상 임신 산모의 생물학적 시료에서 유의한 차이를 보이는 대사체를 선정하는 단계를 포함하며,
상기 선정된 대사체는 리소포스파티딜콜린 C22:5 및 트립토판인, 전신성 홍반성 루푸스 산모의 비정상 임신 예측용 마커 검출 방법.Preparing a plasma sample of a mother with systemic lupus erythematosus (SLE) having a normal pregnancy and a plasma sample of a mother of a mother with systemic lupus erythematosus who have an abnormal pregnancy;
comparing the distribution of metabolites in the plasma sample of the normal pregnant mother and the plasma sample of the abnormal pregnant mother; and
Selecting a metabolite showing a significant difference between the biological sample of the normal pregnant mother and the biological sample of the abnormal pregnant mother,
The selected metabolites are lysophosphatidylcholine C22:5 and tryptophan, a marker detection method for predicting abnormal pregnancy in mothers with systemic lupus erythematosus.
상기 가중치는 최대 가능성우도 추정 (maximum likelihood estimation), 도구변수추정 (instrumental variable estimation), 보통최소제곱추정 (ordinary least square estimation), 비선형 최소제곱추정 (non-linear least square estimation), 반복가중최소제곱 (iterative weighted least square estimation), 제한된 최대우도추정 (restricted maximum likelihood estimation), 및 미분방정식을 사용하지 않는 제한최대우도추정 (derivative-free restricted maximum likelihood estimation)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 수행되어 부여되는 것인, 방법.The method of claim 13, wherein the metabolite, in consideration of the degree to which the level of the metabolite affects the risk of abnormal pregnancy, weight is given when predicting abnormal pregnancy,
The weights include maximum likelihood estimation, instrumental variable estimation, ordinary least squares estimation, non-linear least squares estimation, and iterative weighted least squares estimation. (Iterative weighted least square estimation), restricted maximum likelihood estimation, and derivative-free restricted maximum likelihood estimation without using differential equations are performed by at least one method selected from the group consisting of A method that is given by becoming.
상기 중등 비정상 임신은 임신 34주 이후에 분만하게 된 임신중독증, 임신 30주 내지 36주 사이의 적응증에 의한 조산, 및 출생체중 5 percentile 미만의 작은 태아 출생으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 상태 또는 증상을 가지는 것이고,
상기 중증 비정상 임신은 자궁 내 태아 사망, 임신 34주 이전에 분만하게 된 임신중독증, 임신 30주 이전에 적응증에 의한 조산, 및 신생아 사망으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 상태 또는 증상을 가지는 것인, 키트.20. The method of claim 19, wherein the abnormal pregnancy is divided into a moderate abnormal pregnancy, and a severe abnormal pregnancy,
The secondary abnormal pregnancy is one or more conditions or symptoms selected from the group consisting of preeclampsia delivered after 34 weeks of pregnancy, premature birth due to indications between 30 and 36 weeks of gestation, and small fetal births of less than 5 percentile of birth weight. is to have
The severe abnormal pregnancy is one or more conditions or symptoms selected from the group consisting of intrauterine fetal death, preeclampsia delivered before 34 weeks of pregnancy, premature birth due to indications before 30 weeks of pregnancy, and neonatal death, kit.
[수학식 1]
비정상 임신의 위험도 = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)
LysoPC C22:5 : 시료 내 대사체 중 리소포스파티딜콜린 C22:5 수준의 정량값
Tryptophan : 시료 내 대사체 중 트립토판 수준의 정량값.The kit according to claim 19, further comprising a calculator for quantifying the risk of abnormal pregnancy using Equation 1 below:
[Equation 1]
Risk of Abnormal Pregnancy = 5.55 + (1816.18*LysoPC C22:5) + (-416.57*Tryptophan)
LysoPC C22:5: Quantitative value of lysophosphatidylcholine C22:5 level in metabolites in the sample
Tryptophan: Quantitative value of tryptophan level among metabolites in the sample.
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